KR20220132588A - 탈최적화된 SARS-CoV-2 및 이의 방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본원에서 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스가 기술된다. 이러한 바이러스는 예를 들어, 코돈 탈최적화 또는 코돈 쌍 편향 탈최적화로 재코딩되었으며 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염의 가능성 또는 심각성을 줄이거나, SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염을 예방하거나, 면역 반응을 유도하거나, SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염을 치료하는 데 유용하다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
이 출원은 2020년 1월 28일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/966,750, 2020년 7월 7일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/048,942, 2020년 9월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/079,337, 및 2020년 9월 17일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/079,853에 대한 35 U.S.C. §119(e)에 따른 우선권 주장을 포함하고, 이 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 보호 면역, 예방 및 치료를 제공하기 위한 백신에 관한 것이다.
배경
본원의 모든 간행물은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 다음 설명은 본 발명을 이해하는 데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 그것은 본원에 제공된 임의의 정보가 선행 기술이거나 현재 청구된 발명과 관련이 있거나 구체적으로 또는 묵시적으로 참조된 임의의 출판물이 선행 기술이라는 것은 인정하지 않는다.
신종 코로나바이러스의 발병은 2019년 12월 중순 중국 중부 우한 시에서 확인되었다. 이전에 2019-nCoV로 지정되고 (그리고 이전에는 우한 코로나바이러스라고도 함), 현재 SARS-CoV-2로 지정된 코로나바이러스의 새로운 변종이 확인되었다. 치명적인 코로나 바이러스는 WHO에 의해 팬데믹으로 선언되었다. 이 바이러스의 공중보건 위기는 2020년 1월 말 현재 수십 명의 목숨을 앗아가고 1000명 이상을 감염시킨 상태에서, 2020년 9월 초 현재 90만 명 이상의 목숨을 앗아가고 2,800만 명 이상을 감염시키는 것으로 급속히 성장했고, 2021년 1월 마지막 주 기준으로 200만 명 이상의 목숨을 앗아가고 1억 명 이상을 감염시켰다. SARS-CoV-2 바이러스는 노인과 만성 신장 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환, 고형 장기 이식으로 면역 저하, 비만, 심각한 심장 질환, 겸상 적혈구 질환 및 제2형 당뇨병과 같은 기저 질환이 있는 사람들에게 특히 위험하다. 따라서, 예방적 및 치료적 치료가 매우 시급하다.
하기 구현예 및 이의 양태는 범위를 제한하지 않고, 예시적이고 설명적인 것으로 의도되는 조성물 및 방법과 함께 기재 및 예시된다.
본 발명의 다양한 구현예는 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며: 상기 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 재코딩되고, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질, 또는 이의 하나 이상의 단편의 아미노산 서열은 동일하게 유지되거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편의 아미노산 서열은 최대 20개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 야생형 SARS-CoV-2일 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 천연 분리주 SARS-CoV-2일 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 GenBank 수탁 번호 MN985325.1의 핵산 서열을 갖는 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 워싱턴 분리주일 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019 분리주 (서열 번호 1)일 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 변이체일 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 영국 변이체, 남아프리카 변이체 및 브라질 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 SARS-CoV-2 변이체일 수 있다.
다양한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 코돈-쌍 편향 (CPB)을 감소시키거나 코돈 사용빈도 편향(codon usage bias)을 감소시킴으로써 재코딩될 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 CpG 또는 UpA 디-뉴클레오티드의 수를 증가시킴으로써 재코딩될 수 있다. 다양한 구현예에서, 각각의 재코딩된 하나 이상의 바이러스 단백질, 또는 각각의 이의 재코딩된 하나 이상의 단편은 -0.05 미만, -0.1 미만, -0.2 미만, -0.3 미만, 또는 -0.4 미만의 코돈 쌍 편향을 가질 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 CPB 탈최적화될 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 코돈 탈최적화될 수 있다.
다양한 구현예에서, 상기 코돈 탈최적화 또는 CPB 탈최적화는 인간에서 빈번하게 사용되는 코돈 또는 CPB에 기초할 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 코돈 탈최적화 또는 CPB 탈최적화는 코로나바이러스에서 빈번하게 사용되는 코돈 또는 CPB에 기초할 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 코돈 탈최적화 또는 CPB 탈최적화는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에서 빈번하게 사용되는 코돈 또는 CPB에 기초할 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 코돈 탈최적화 또는 CPB 탈최적화는 야생형 SARS-CoV-2 코로나바이러스에서 빈번하게 사용되는 코돈 또는 CPB에 기초할 수 있다.
다양한 구현예에서, 상기 재코딩된 뉴클레오티드 서열은 RNA-의존성 RNA 중합효소 (RdRP), RdRP의 단편, 스파이크 단백질, 스파이크 단백질의 단편, 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
다양한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 bp 11294-12709, bp 14641-15903, bp 21656-22306, bp 22505-23905, 및 bp 24110-25381로부터 선택될 수 있는 적어도 하나의 CPB 탈최적화 영역을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 푸린 절단 부위가 제거될 수 있는 재코딩된 스파이크 단백질 또는 스파이크 단백질의 단편을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834, 서열 번호 7, 또는 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1-29,834를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 3' 말단에 하나 이상의 연속적인 아데닌을 추가로 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예는 본 발명의 재코딩된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하는 박테리아 인공 염색체 (BAC)를 제공한다.
본 발명의 다양한 구현예는 본 발명의 재코딩된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 다양한 구현예는 본 발명의 재코딩된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나, 본 발명의 BAC 중 어느 하나, 또는 본 발명의 벡터 중 어느 하나를 포함하는 세포를 제공한다. 다양한 구현예에서, 상기 세포는 베로 세포(Vero cell) 또는 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포일 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예는 본 발명의 재코딩된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나에 의해 암호화된 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 다양한 구현예는 본 발명의 재코딩된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하는 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스를 제공한다.
본 발명의 다양한 구현예는 본 발명의 재코딩된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나에 의해 암호화되는 본 발명의 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함하는 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스를 제공한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 중 어느 하나에서 하나 이상의 바이러스 단백질의 발현은 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스와 비교하여 감소될 수 있다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 이의 바이러스 단백질의 발현 감소는 RdRP, 스파이크 단백질 및 이들의 조합으로부터 선택된 영역을 재코딩하는 결과로서 감소될 수 있다.
다양한 구현예에서, 상기 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 서열 번호 4, 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834, 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834 및 3' 말단에 하나 이상의 연속적인 아데닌을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 상기 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 서열 번호 4, 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834, 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834 및 3' 말단에 하나 이상의 연속적인 아데닌을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예는 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 중 어느 하나를 포함하는, 대상체에서 보호성 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물을 제공한다. 다양한 구현예에서, 상기 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예는 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 중 어느 하나를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 면역 조성물을 제공한다. 다양한 구현예에서, 상기 면역 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예는 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 중 어느 하나, 또는 본 발명의 백신 조성물 중 어느 하나, 또는 본 발명의 면역 조성물 중 어느 하나의 용량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다양한 구현예는 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 중 어느 하나, 또는 본 발명의 백신 조성물 중 어느 하나, 또는 본 발명의 면역 조성물 중 어느 하나의 프라임 용량을 대상체에게 투여하는 단계; 및 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 중 어느 하나, 또는 본 발명의 백신 조성물 중 어느 하나, 또는 본 발명의 면역 조성물 중 어느 하나의 1회 이상의 부스트 용량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법을 제공한다.
다양한 구현예에서, 상기 면역 반응은 보호 면역 반응이다.
다양한 구현예에서, 상기 용량은 예방적 유효 용량 또는 치료적 유효 용량일 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 용량은 약 104-106 PFU일 수 있거나, 프라임 용량은 약 104-106 PFU일 수 있고 1회 이상의 부스트 용량은 약 104-106 PFU일 수 있다.
다양한 구현예에서, 투여는 비강 경로를 통해 이루어질 수 있다. 다양한 구현예에서, 투여는 비강 점적을 통해 이루어질 수 있다. 다양한 구현예에서, 투여는 비강 스프레이를 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예는 면역 반응을 유도하거나, COVID-19의 치료적 또는 예방적 치료를 위해 사용하기 위한 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 본 발명의 백신 조성물, 또는 본 발명의 면역 조성물을 제공한다.
본 발명의 다양한 구현예는 면역 반응을 유도하거나, COVID-19의 치료 또는 예방적 치료를 위해 사용하기 위한 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 본 발명의 백신 조성물, 또는 본 발명의 면역 조성물을 제공하고, 여기서 용법은 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 또는 본 발명의 백신 조성물, 또는 본 발명의 면역 조성물의 프라임 용량, 및 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 또는 본 발명의 백신 조성물, 또는 본 발명의 면역 조성물의 1회 이상의 부스트 용량을 포함한다.
본 발명의 다양한 구현예는 면역 반응을 유도하거나, COVID-19의 치료 또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 본 발명의 백신 조성물, 또는 본 발명의 면역 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 다양한 구현예는 면역 반응을 유도하거나, COVID-19의 치료적 또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 본 발명의 백신 조성물, 또는 본 발명의 면역 조성물의 용도를 제공하고, 상기 의약은 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 또는 본 발명의 백신 조성물, 또는 본 발명의 면역 조성물의 프라임 용량, 및 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 또는 본 발명의 백신 조성물, 또는 본 발명의 면역 조성물의 1회 이상의 부스트 용량을 포함한다.
본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 본 명세서에서 논의된 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 중 어느 하나이다. 본 발명의 백신 조성물은 본 명세서에서 논의된 백신 조성물 중 어느 하나이다. 본 발명의 면역 조성물은 본 명세서에서 논의된 면역 조성물 중 어느 하나이다. 다양한 구현예에서, 상기 면역 반응은 보호 면역 반응이다.
본 발명의 다양한 구현예는 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 또는 이의 하나 이상의 단편의 하나 이상의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 수득하는 단계; 뉴클레오티드 서열을 재코딩하여 하나 이상의 단백질, 또는 이의 하나 이상의 단편의 단백질 발현을 감소시키는 단계; 및 재코딩된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산으로 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 게놈을 치환시켜 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 게놈을 제조하는 단계를 포함하는 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스를 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 재코딩된 뉴클레오티드 서열의 발현은 모 바이러스에 비해 감소한다.
다양한 구현예에서, 상기 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 서열은 야생형 (wt) 바이러스 핵산, 또는 천연 분리주일 수 있다.
다양한 구현예에서, 상기 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 중 어느 하나이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 예로서 본 발명의 구현예의 다양한 특징을 예시하는 첨부 도면과 함께 취해진 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
예시적인 구현예가 참조된 도면에 설명되어 있다. 본원에 개시된 구현예 및 도면은 제한적인 것이 아니라 예시적인 것으로 간주되어야 한다.
도 1은 본 발명의 다양한 구현예에 따른 예시적인 CoV 약독화 및 합성 전략 BAC 클로닝/DNA 형질감염을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 다양한 구현예에 따른 예시적인 CoV 약독화 및 합성 전략 시험관 내 결찰/RNA 형질감염을 나타낸다.
도 3은 베로 E6 세포에서 SARS-CoV-2의 야생형 (왼쪽) 및 CDX-005 (오른쪽) 균주의 플라크 표현형을 도시한다. CDX-005는 야생형 바이러스와 비교하여 베로 E6 세포에서 더 작은 플라크를 생성하고 40% 더 낮은 역가로 성장한다.
도 4는 시리아 골드 햄스터에서 야생형 SARS-COV-2 및 CDX-005의 투여 후 체중 변화를 도시한다.
도 5는 베로 세포에서 wt WA1 및 CDX-005의 성장을 도시한다. 베로 세포를 0.01MOI의 wt WA1 또는 CDX-005로 감염시키고 33℃ 또는 37℃에서 최대 96시간 동안 배양했다. 바이러스를 회수하기 위해 상청액을 수집하였다. 역가는 플라크 형성 검정에 의해 측정되었고 PFU/ml 배양 배지의 로그로서 보고되었다.
도 6a-6d는 햄스터에서 CDX-005의 생체 내 약독화를 도시한다. 햄스터를 5x104 또는 5x103 PFU/ml의 wt WA1, 5x104 PFU/ml CDX-005로 접종했다. 바이러스 RNA를 6a) 후신경구, 6b) 뇌, 및 6c) 폐에서 PI 2일차 및 4일차에 qPCR로 측정하였다. (N=3/그룹; 막대=SEM). 6d) 접종된 햄스터의 왼쪽 폐 조직에서 감염성 바이러스 부하를 TCID50 검정으로 평가하고 TCID50/ml의 log10으로 표현하였다. CDX-005와 wt WA1 처리 그룹 간의 차이는 유의했다 (N=3/그룹; P<0.001; 막대=SEM). 수평선은 LOD를 표시한다.
도 7a-7c는 햄스터에서 CDX-005의 생체 내 약독화를 도시한다. 햄스터를 5x104 또는 5x103 PFU/ml의 wt WA1 또는 5x104 PFU/ml CDX-005로 접종하였다. 7a) 햄스터의 체중을 9일 동안 매일 측정하였다. 중량 변화는 CDX-005와 wt WA1 처리군 사이에서 유의하게 상이하였다 (CDX-005 및 wt WA1 5 x104의 경우 N=10-40/그룹; N=3-12/그룹 wt WA1 5 x103; P<0.001; 막대=SEM). 7b & 7c) 헤마톡실린 및 에오신 염색 폐 절편을 PI 2일차, 4일차 및 6일차에 검사하고 세포 침윤에 대해 점수를 매겼다. (N=3/그룹)
도 8a-8d는 햄스터에서의 효능을 도시한다. 8a) 나이브 햄스터 대조군 혈청 또는 wt WA1 또는 5x104 PFU COVI-VAC (CDX-005) 접종 후 16일차에 햄스터로부터 수집한 혈청으로 스파이크-S1 ELISA를 수행했다. COVI-VAC (CDX-005) 접종된 햄스터에서 스파이크 S1 IgG를 또한 18일차 (WA1 챌린지 후 2일)에 측정하였다. 종점 IgG 역가는 배경보다 5X 높은 희석의 로그로 나타낸다. (N=3/그룹; 막대=SEM) 8b) SARS-CoV-2 WA1에 대한 플라크 감소 중화 역가 (PRNT)는 5x104 또는 5x103 PFU의 wt WA1 또는 5x104 PFU COVI-VAC (CDX-005)로 접종 16일 후에 햄스터의 혈청에서 검사하였다. PRNT는 나이브 햄스터 혈청을 함유하는 웰에 비해 플라크 수를 50, 80 또는 90% 감소시킨 최종 혈청 희석액의 역수이다. (N=3/그룹; 막대=SD); 8c) 백신 접종 후 16일차에 CDX-005 백신 접종한 햄스터 및 나이브 동물을 5x104 PFU wt SARS-CoV-2로 챌린지하였다. 챌린지 후 2일차에 폐를 수확하고 바이러스 부하를 qPCR로 측정하고 qPCR 게놈/조직 ml의 log10으로 표현하였다. (N=3/그룹; 막대=SD). 8d) 햄스터를 비히클, 5x104 PFU의 wt WA1 또는 5x104 COVI-VAC (CDX-005)로 백신 접종하고 접종 후 27일차에 비강 내로 5x104 PFU/ml wt WA1로 챌린지하였다. 챌린지 당일 및 그 후 4일 동안 매일 중량을 기록하였다. (N=5-6일 0-2, N=3일 3-4, 막대=SEM). a)와 b)의 결과는 두 개의 개별 햄스터 연구에서 나온 것이다.
도 9는 아프리카 녹색 원숭이의 약독화를 도시한다. 기관 세척액을 106 PFU wt WA1 또는 CDX-005로 접종 후 4일차 및 6일차에 원숭이로부터 수집하였다. 세척액을 RT-qPCR에 적용하여 바이러스를 검출하였다. N=3/그룹 (4일차) 또는 N=2/그룹 (6일차).
도 10은 아프리카 녹색 원숭이에서 106의 wt SARS-COV2 대 CDX-005 비강 내 용량을 도시한다.
도 11은 베로 세포로부터 수확된 CDX-005의 조 벌크(crude bulk) 역가를 도시한다. 베로 WHO "10-87" 세포를 1.8 x 104 PFU의 CDX-005 (~0.01 MOI)로 접종한 다음 48시간 동안 성장시켰다. 바이러스를 표시된 상이한 계획을 사용하여 수확하였다.
도 1은 본 발명의 다양한 구현예에 따른 예시적인 CoV 약독화 및 합성 전략 BAC 클로닝/DNA 형질감염을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 다양한 구현예에 따른 예시적인 CoV 약독화 및 합성 전략 시험관 내 결찰/RNA 형질감염을 나타낸다.
도 3은 베로 E6 세포에서 SARS-CoV-2의 야생형 (왼쪽) 및 CDX-005 (오른쪽) 균주의 플라크 표현형을 도시한다. CDX-005는 야생형 바이러스와 비교하여 베로 E6 세포에서 더 작은 플라크를 생성하고 40% 더 낮은 역가로 성장한다.
도 4는 시리아 골드 햄스터에서 야생형 SARS-COV-2 및 CDX-005의 투여 후 체중 변화를 도시한다.
도 5는 베로 세포에서 wt WA1 및 CDX-005의 성장을 도시한다. 베로 세포를 0.01MOI의 wt WA1 또는 CDX-005로 감염시키고 33℃ 또는 37℃에서 최대 96시간 동안 배양했다. 바이러스를 회수하기 위해 상청액을 수집하였다. 역가는 플라크 형성 검정에 의해 측정되었고 PFU/ml 배양 배지의 로그로서 보고되었다.
도 6a-6d는 햄스터에서 CDX-005의 생체 내 약독화를 도시한다. 햄스터를 5x104 또는 5x103 PFU/ml의 wt WA1, 5x104 PFU/ml CDX-005로 접종했다. 바이러스 RNA를 6a) 후신경구, 6b) 뇌, 및 6c) 폐에서 PI 2일차 및 4일차에 qPCR로 측정하였다. (N=3/그룹; 막대=SEM). 6d) 접종된 햄스터의 왼쪽 폐 조직에서 감염성 바이러스 부하를 TCID50 검정으로 평가하고 TCID50/ml의 log10으로 표현하였다. CDX-005와 wt WA1 처리 그룹 간의 차이는 유의했다 (N=3/그룹; P<0.001; 막대=SEM). 수평선은 LOD를 표시한다.
도 7a-7c는 햄스터에서 CDX-005의 생체 내 약독화를 도시한다. 햄스터를 5x104 또는 5x103 PFU/ml의 wt WA1 또는 5x104 PFU/ml CDX-005로 접종하였다. 7a) 햄스터의 체중을 9일 동안 매일 측정하였다. 중량 변화는 CDX-005와 wt WA1 처리군 사이에서 유의하게 상이하였다 (CDX-005 및 wt WA1 5 x104의 경우 N=10-40/그룹; N=3-12/그룹 wt WA1 5 x103; P<0.001; 막대=SEM). 7b & 7c) 헤마톡실린 및 에오신 염색 폐 절편을 PI 2일차, 4일차 및 6일차에 검사하고 세포 침윤에 대해 점수를 매겼다. (N=3/그룹)
도 8a-8d는 햄스터에서의 효능을 도시한다. 8a) 나이브 햄스터 대조군 혈청 또는 wt WA1 또는 5x104 PFU COVI-VAC (CDX-005) 접종 후 16일차에 햄스터로부터 수집한 혈청으로 스파이크-S1 ELISA를 수행했다. COVI-VAC (CDX-005) 접종된 햄스터에서 스파이크 S1 IgG를 또한 18일차 (WA1 챌린지 후 2일)에 측정하였다. 종점 IgG 역가는 배경보다 5X 높은 희석의 로그로 나타낸다. (N=3/그룹; 막대=SEM) 8b) SARS-CoV-2 WA1에 대한 플라크 감소 중화 역가 (PRNT)는 5x104 또는 5x103 PFU의 wt WA1 또는 5x104 PFU COVI-VAC (CDX-005)로 접종 16일 후에 햄스터의 혈청에서 검사하였다. PRNT는 나이브 햄스터 혈청을 함유하는 웰에 비해 플라크 수를 50, 80 또는 90% 감소시킨 최종 혈청 희석액의 역수이다. (N=3/그룹; 막대=SD); 8c) 백신 접종 후 16일차에 CDX-005 백신 접종한 햄스터 및 나이브 동물을 5x104 PFU wt SARS-CoV-2로 챌린지하였다. 챌린지 후 2일차에 폐를 수확하고 바이러스 부하를 qPCR로 측정하고 qPCR 게놈/조직 ml의 log10으로 표현하였다. (N=3/그룹; 막대=SD). 8d) 햄스터를 비히클, 5x104 PFU의 wt WA1 또는 5x104 COVI-VAC (CDX-005)로 백신 접종하고 접종 후 27일차에 비강 내로 5x104 PFU/ml wt WA1로 챌린지하였다. 챌린지 당일 및 그 후 4일 동안 매일 중량을 기록하였다. (N=5-6일 0-2, N=3일 3-4, 막대=SEM). a)와 b)의 결과는 두 개의 개별 햄스터 연구에서 나온 것이다.
도 9는 아프리카 녹색 원숭이의 약독화를 도시한다. 기관 세척액을 106 PFU wt WA1 또는 CDX-005로 접종 후 4일차 및 6일차에 원숭이로부터 수집하였다. 세척액을 RT-qPCR에 적용하여 바이러스를 검출하였다. N=3/그룹 (4일차) 또는 N=2/그룹 (6일차).
도 10은 아프리카 녹색 원숭이에서 106의 wt SARS-COV2 대 CDX-005 비강 내 용량을 도시한다.
도 11은 베로 세포로부터 수확된 CDX-005의 조 벌크(crude bulk) 역가를 도시한다. 베로 WHO "10-87" 세포를 1.8 x 104 PFU의 CDX-005 (~0.01 MOI)로 접종한 다음 48시간 동안 성장시켰다. 바이러스를 표시된 상이한 계획을 사용하여 수확하였다.
본원에 인용된 모든 참고 문헌은 완전히 설명된 것처럼 그 전체가 참조로 포함된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3 rd ed., Revised, J. Wiley & Sons (New York, NY 2006); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7 th ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2013); 및 Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4 th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)는 본 출원에서 사용되는 많은 용어에 대한 일반적인 지침을 당업자에게 제공한다.
당업자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 많은 방법 및 재료를 인식할 것이다. 실제로, 본 발명은 기술된 방법 및 재료에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 다음 용어가 하기에 정의된다.
참조된 숫자 표시와 관련하여 사용될 때 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 본원에서 달리 구체적으로 제공되지 않는 한 참조된 숫자 표시에서 그 참조된 숫자 표시의 최대 5%를 더하거나 빼는 것을 의미한다. 예를 들어, "약 50%"라는 언어는 45% 내지 55%의 범위를 포함한다. 다양한 구현예에서, 참조된 숫자 표시와 관련하여 사용될 때 용어 "약"은 청구 범위에 구체적으로 제공된 경우, 참조된 숫자 표시에서 그 참조된 숫자 표시의 최대 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0.5%를 더하거나 빼는 것을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "모 바이러스"는 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 암호화하기 위해 재코딩된 뉴클레오티드 서열이 비교되는 참조 바이러스를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "우한 코로나바이러스" 및 "SARS-CoV-2" 및 "2019-nCoV"는 상호교환 가능하고, 야생형 서열, 천연 분리 서열, 또는 COVID-19를 유발하는 야생형 서열 또는 천연 분리 서열의 돌연변이 형태를 갖는 코로나바이러스를 지칭한다. 돌연변이 형태는 바이러스의 복제 주기 또는 유전 공학을 통해 자연적으로 발생한다.
본원에 사용된 바와 같은 "SARS-CoV-2 변이체"는 인간과 같은 숙주 내에서 복제 및/또는 전파될 때 바이러스의 복제 주기를 통해 자연적으로 발달한 SARS-CoV-2의 돌연변이 형태를 지칭한다. SARS-CoV-2 변이체의 예는 영국 변이체 (20I/501Y.V1, VOC 202012/01, 또는 B.1.1.7로도 알려짐), 남아프리카 변이체 (20H/501Y.V2 또는 B.1.351로도 알려짐), 및 브라질 변이체 (P.1로도 알려짐)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
SARS-CoV-2와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 "천연 분리주"는 숙주 (예를 들어, 인간, 박쥐, 고양이, 돼지, 또는 임의의 다른 숙주) 또는 천연 저장소로부터 분리된 SARS-CoV-2와 같은 바이러스를 지칭한다. 천연 분리주의 서열은 동일하거나 숙주, 예를 들어 인간에서 복제 및/또는 전달될 때 바이러스의 복제 주기를 통해 자연적으로 발생한 돌연변이를 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "우한 코로나바이러스 분리주"는 2020년 1월 10일 제출된, 수탁 ID: EPI_ISL_402119인 SARS-CoV-2의 야생형 분리주를 지칭하고, BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019, 서열 번호 1로도 지칭되고, 이는 그 전체가 완전히 설명된 것처럼 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "워싱턴 코로나바이러스 분리주"는 2020년 7월 5일 기준 GenBank 수탁 번호 MN985325.1인 SARS-CoV-2의 야생형 분리주를 지칭하고, 이는 그 전체가 완전히 설명된 것처럼 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "빈번하게 사용되는 코돈" 또는 "코돈 사용빈도 편향"은 특정 종, 예를 들어, 인간, 코로나바이러스, 또는 SARS-CoV-2에 대한 코딩 DNA에서 동의 코돈(synonymous codon)의 발생 빈도의 차이를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "코돈 쌍 편향"은 특정 종, 예를 들어, 인간, 코로나바이러스, 또는 SARS-CoV-2에서 통계적으로 예측된 것보다 더 많거나 덜 빈번하게 사용되는 동의 코돈 쌍을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "대상체"는 임의의 동물 또는 인공적으로 변형된 동물을 의미한다. 동물은 인간, 인간이 아닌 영장류, 소, 말, 양, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 흰 족제비, 마우스, 래트 및 기니피그와 같은 설치류, 박쥐, 뱀 및 새를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 인공적으로 변형된 동물은 인간 면역계를 가진 SCID 마우스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 대상체는 인간이다.
"바이러스 숙주"는 바이러스가 감염될 수 있는 모든 동물 또는 인공적으로 변형된 동물을 의미한다. 동물은 인간, 인간이 아닌 영장류, 소, 말, 양, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 흰 족제비, 마우스, 래트 및 기니피그와 같은 설치류 및 새를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 인공적으로 변형된 동물은 인간 면역계를 가진 SCID 마우스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다양한 구현예에서, 바이러스 숙주는 포유동물이다. 다양한 구현예에서, 바이러스 숙주는 영장류이다. 다양한 구현예에서, 바이러스 숙주는 인간이다. 조류의 구현예는 닭, 칠면조, 오리 및 거위를 포함하지만 이에 제한되지 않는 가축화된 가금류 종이다.
"예방적 유효 용량"은 바이러스 감염 경향이 있거나 바이러스 관련 장애에 걸리기 쉬운 대상체에 투여될 때, 대상체에서 대상체를 바이러스에 감염되거나 장애로 고통받는 것으로부터 보호하는 면역 반응을 유도하는 백신 또는 바이러스 조성물의 임의의 양이다. 대상체를 "보호"한다는 것은 대상체가 바이러스에 감염될 가능성을 줄이거나 대상체에서 장애의 발병 가능성을 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 10배, 25배, 50배, 또는 100배 감소시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 대상체가 바이러스에 감염될 확률이 1%인 경우, 대상체가 바이러스에 감염될 가능성이 2배 감소하면 대상체가 바이러스에 감염될 확률이 0.5%가 된다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료적 유효 용량"은 백신이 효과적인 장애로 고통받는 대상체에게 투여될 때, 대상체에서 대상체가 장애 및/또는 그 증상의 감소, 관해 또는 퇴행을 겪는 면역 반응을 유도하는 백신 또는 바이러스 조성물의 임의의 양이다. 바람직한 구현예에서, 장애 및/또는 이의 증상의 재발이 예방된다. 다른 바람직한 구현예에서, 대상체는 장애 및/또는 이의 증상이 치유된다.
임의의 본 면역화 및 치료 방법의 특정 구현예는 적어도 하나의 보조제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. "보조제"는 항원의 면역원성을 향상시키고 대상체에서 면역 반응을 부스팅하는데 적합한 임의의 제제를 의미할 것이다. 단백질- 및 핵산-기반 백신 모두와 함께 사용하기에 적합한 미립자 보조제를 포함하는 수많은 보조제, 및 항원과 항원보강제를 조합하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 핵산 기반 백신에 적합한 보조제는 정제된 단백질 또는 핵산 형태로 전달되는 Quil A, 이미퀴모드, 레시퀴모드 및 인터루킨-12를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 단백질 면역화와 함께 사용하기에 적합한 보조제는 명반, 프로인트 불완전 보조제 (FIA), 사포닌, Quil A, 및 QS-21을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
이의 유전자가 재코딩된, 예를 들어, 코돈 탈최적화 또는 코돈 쌍 편향 탈최적화된 SARS-CoV-2 바이러스가 본원에 기술된다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 SARS-CoV-2 바이러스의 바이러스 단백질은 이의 모 SARS-CoV-2 바이러스와 동일한 아미노산 서열을 갖지만; 그러나, 뉴클레오티드 서열은 재코딩되었다. 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열의 감소된 단백질 발현, 약독화 또는 둘 모두를 초래한다. 이들 재코딩된 SARS-CoV-2 바이러스는 백신으로서, 특히 약독화 생백신으로 사용하기에 유용하다.
본 발명자는 wt SARS-CoV-2로부터 합성 고도로 약독화된 생백신 후보, COVI-VAC (CDX-005로도 지칭됨; 예를 들어, 서열 번호 4))를 생성하였다. 임의의 특정한 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 본 발명자는 약독화에 대해 가장 가능성 있는 메커니즘은 번역의 오류를 통해 번역이 느려져 잘못 접힌 단백질이, RNA 2차 구조의 변화, 또는 변경된 조절 신호 모두가 단백질 생산 감소에 기여할 것이라 믿는다. 메커니즘이 무엇이든, 약독화된 COVI-VAC 바이러스는 모든 바이러스 항원을 이의 wt 형태로 제시하여, 광범위한 면역 반응에 대한 잠재력을 제공하고 표적 균주에 유전적 드리프트가 있는 경우에도 효능을 유지할 가능성이 높다. COVI-VAC는 수백 개의 침묵 (동의) 돌연변이가 표현형에 기여하기 때문에 병원성으로의 복귀에 대해 높은 내성을 가질 것으로 예상된다. 본 발명자의 복귀 검사는 후기 계대 바이러스의 대량 서열분석 및 푸린 절단 부위의 잠재적 변화 평가에 의해 평가된 바와 같이 백신이 안정함을 나타낸다.
본 발명자의 햄스터 연구는 COVI-VAC가 이 동물들에게 안전하다는 것을 입증한다. 그것은 고도로 약독화되어, 폐 및 후신경구에서 더 낮은 총 바이러스 부하를 유도하고 뇌에서 완전히 제거하고 wt WA1을 가진 동물보다 COVI-VAC로 접종된 동물의 폐에서 더 낮은 살아있는 바이러스 부하를 유도한다. wt 바이러스와 달리, COVI-VAC는 접종된 햄스터에서 체중 감소 또는 심각한 폐 병리를 유발하지 않았다.
햄스터 연구는 또한 COVI-VAC가 SARS CoV-2로부터 효과적으로 보호한다고 제시한다. Ab 역가의 평가는 혈청 IgG를 유도하고 Ab를 중화시키는 데 있어 wt 바이러스만큼 효과적임을 입증한다. 그것은 wt 챌린지로부터 보호하고; COVI-VAC 접종은 폐 바이러스 역가를 낮추고 뇌의 바이러스에 대해 완전한 보호로 이어진다. COVI-VAC로 접종한 햄스터는 또한 비히클 접종 동물에서 관찰된 체중 감소를 나타내지 않는다. 또한, 질환 강화의 증거가 없다.
함께 본 발명자의 데이터는 COVI-VAC가 현재 동물 및 인간에서 사용하기 위해 개발 중인 중요한 새로운 종류의 약독화 생백신의 일부임을 나타낸다. 천연 아미노산 서열과 유사한 모든 바이러스 항원을 제시하고, 비강 내 투여할 수 있고, 소동물 모델에서 단일 용량으로 안전하고 효과적이며, 복귀에 내성이 있고, 허용 온도에서 높은 역가로 성장할 수 있다. 현재 인체에 대한 안전성과 효능을 시험하기 위한 임상 시험이 진행 중이다.
탈최적화된 CDX-005 (예를 들어, 서열 번호 4) 및 CDX-007 (예를 들어, 서열 번호 7) 생 약독화 백신 후보를 구성하기 위해, 먼저 야생형 WA1 공여자 바이러스의 게놈을 인 실리코(in silico)로 19개의 중첩 단편을 분석하였다. 각 단편은 각 인접 단편과 약 200 bp의 서열 중첩을 공유한다. F1-F19를 RT-PCR로 야생형 WA1 바이러스 RNA의 cDNA로부터 생성하였다. 단편은 생어(Sanger) 시퀀싱에 의해 서열 확인되었다. 그런 다음 본 발명자는 WT WA1 바이러스의 단편 16을 CDX-005의 cDNA 게놈을 생성하기 위해 탈최적화된 스파이크 유전자 서열을 가진 단편 16으로 교환했다. 유사하게, 본 발명자는 WT WA1 바이러스의 단편 14를 CDX-007의 cDNA 게놈을 생성하기 위해 탈최적화된 스파이크 유전자 서열을 가진 단편 14로 교환했다.
다양한 구현예에서, 표적 모 바이러스를 RT-PCR을 통해 각각이 약 50 내지 300 bp 중첩을 갖는 작은 단편으로 분자 분석하고 이들 단편 중 임의의 단편의 교환은 임의의 코돈 또는 코돈 쌍 탈최적화 바이러스의 cDNA 게놈 또는 게놈 단편을 구성하는 데 사용될 수 있는 과정이다. 그런 다음 탈최적화된 카세트가 있는 이 cDNA 게놈은 역유전학을 통해 탈최적화된 바이러스를 복구하는 데 사용할 수 있다.
CDX-005 및 CDX-007의 경우, 공개된 WA1 서열 (베로 세포 계대 4)과 비교하여 본 발명자의 WA1 공여자 바이러스 (베로 세포 계대 6)의 서열에서 한 가지 주목할 만한 차이점을 확인했다. BEI Resources로부터 받은 WA1 바이러스의 Codagenix에서 베로 E6 세포에 대한 2개의 추가 WA1 바이러스 계대 동안, 스파이크 유전자 (게놈 위치 23594-23629)에서 36 nt 결실이 발생했다. 결실은 다염기성 푸린 절단 부위를 포함하는 12개 아미노산 TNSPRRARSVAS (서열 번호 8)를 포함한다. SARS-CoV2 스파이크의 푸린 절단 부위는 인간 숙주에서 SARS-CoV2의 고병원성 표현형의 잠재적인 동인으로 제안되었다. 임의의 어떤 특정한 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 푸린 절단 부위의 부재가 시험관 내 베로 세포에서 SARS-CoV-2 바이러스 성장에 유익하고, 결실이 베로 세포 배양에서 계대하는 동안 진화했다고 믿는다. 본 발명자는 또한 푸린 절단 부위의 부재가 그러한 돌연변이를 지닌 SARS-CoV-2 바이러스의 인간 숙주에서 약독화에 기여할 수 있다고 믿는다. 따라서 본 발명자는 백신 후보 CDX-005, 및 CDX-007로 파생된 푸린 절단 부위 결실을 통합하기로 결정했다. 푸린 절단 부위 결실은 어셈블리 단편 F15에 위치한다.
본 발명은 적어도 부분적으로 전술한 내용과 본원에 설명된 추가 정보에 기초한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 SARS-CoV-2 바이러스의 바이러스 단백질은 이의 모 SARS-CoV-2 바이러스와 동일한 아미노산 서열을 갖지만 최대 약 20개 아미노산 결실(들), 치환(들), 또는 부가(들)가 있다. 그러나, 뉴클레오티드 서열이 재코딩되어, 단백질 발현 감소, 약독화 또는 둘 모두를 초래한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 SARS-CoV-2 바이러스의 바이러스 단백질은 이의 모 SARS-CoV-2 바이러스와 동일한 아미노산 서열을 갖지만 최대 약 10개 아미노산 결실(들), 치환(들), 또는 부가(들)가 있지만; 그러나, 뉴클레오티드 서열이 재코딩되어, 단백질 발현 감소, 약독화 또는 둘 모두를 초래한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 SARS-CoV-2 바이러스의 바이러스 단백질은 이의 모 SARS-CoV-2 바이러스와 동일한 아미노산 서열을 갖지만 1-5개 아미노산 결실, 치환 또는 부가를 갖는다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 SARS-CoV-2 바이러스의 바이러스 단백질은 이의 모 SARS-CoV-2 바이러스와 동일한 아미노산 서열을 갖지만 6-10개 아미노산 결실, 치환 또는 부가를 갖는다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 SARS-CoV-2 바이러스의 바이러스 단백질은 이의 모 SARS-CoV-2 바이러스와 동일한 아미노산 서열을 갖지만 11-15개 아미노산 결실, 치환 또는 부가를 갖는다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 SARS-CoV-2 바이러스의 바이러스 단백질은 이의 모 SARS-CoV-2 바이러스와 동일한 아미노산 서열을 갖지만 16-20개의 아미노산 결실, 치환 또는 부가를 갖는다. 그러나 다시, 뉴클레오티드 서열이 재코딩되어 단백질 발현 감소, 약독화 또는 둘 모두를 초래한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 SARS-CoV-2 바이러스의 바이러스 단백질은 이의 모 SARS-CoV-2 바이러스와 동일한 아미노산 서열을 갖지만 12개의 아미노산 결실, 치환 또는 부가를 갖고; 그러나 뉴클레오티드 서열이 재코딩되어, 단백질 발현 감소, 약독화 또는 둘 모두를 초래한다. 다양한 구현예에서, 아미노산 결실, 치환 또는 부가는 모 SARS-CoV-2 바이러스 서열의 핵산 서열의 폴리A 꼬리 앞의 핵산 결실(들), 치환(들) 또는 부가(들)로부터 발생한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 SARS-CoV-2 바이러스의 바이러스 단백질은 이의 모 SARS-CoV-2 바이러스와 동일한 아미노산 서열을 갖지만 12개의 아미노산 결실을 갖는다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 SARS-CoV-2 바이러스의 바이러스 단백질은 이의 모 SARS-CoV-2 바이러스와 동일한 아미노산 서열을 갖지만 1-5개 아미노산 결실, 또는 6-10개 아미노산 결실, 또는 11-15개 아미노산 결실, 또는 16-20개 아미노산 결실을 갖는다. 다양한 구현예에서, 아미노산 결실은 푸린 절단 부위를 제거하는 스파이크 단백질에 있다. 다양한 특정 구현예에서, 본 발명의 SARS-CoV-2 바이러스의 바이러스 단백질은 이의 모 SARS-CoV-2 바이러스와 동일한 아미노산 서열을 갖지만 스파이크 단백질 상의 푸린 절단 부위의 제거를 초래하는 12개 아미노산 결실을 갖는다. 다양한 구현예에서, 아미노산 결실, 치환, 또는 부가는 모 SARS-CoV-2 바이러스 서열의 핵산 서열의 폴리A 꼬리 앞의 핵산 결실(들), 치환(들) 또는 부가(들)로부터 발생한다.
다양한 구현예에서, SARS-CoV-2 바이러스의 RNA-의존성 RNA 중합효소 (RdRP) 단백질을 암호화하는 핵산이 재코딩된다. 다른 구현예에서, SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 단백질을 암호화하는 핵산 (S 유전자로도 알려짐)이 재코딩된다. 또 다른 구현예에서, SARS-CoV-2 바이러스의 RdRP 및 스파이크 단백질 둘 모두가 재코딩된다. 다양한 구현예에서, 재코딩된 스파이크 단백질은 푸린 절단 부위를 제거하는 뉴클레오티드의 결실; 예를 들어, 서열 번호 5를 갖는 36개 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 약독화된 바이러스의 RdRP 및/또는 스파이크 단백질 인코딩 서열의 재코딩은 본원에 논의된 개시내용에 비추어 당업자에 의해 이루어졌거나 이루어질 수 있다. 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 뉴클레오티드 치환은 RdRP 및/또는 스파이크 단백질 코딩 서열의 다중 위치에서 조작되며, 여기서 치환은 게놈 내로 복수의 동의 코돈을 도입한다. 특정 구현예에서, 동의 코돈 치환은 게놈에서 코돈 편향, 코돈 쌍 편향, 드물게 발생하는 코돈 또는 드물게 발생하는 코돈 쌍의 밀도, RNA 2차 구조, CG 및/또는 TA (또는 UA) 디뉴클레오티드 함량, C+G 함량, 번역 프레임이동 부위, 번역 정지 부위, 마이크로RNA 인식 서열의 존재 또는 부재 또는 이들의 임의의 조합을 변경한다. 코돈 치환은 RdRP 및/또는 스파이크 단백질 코딩 서열 전체에 걸쳐 분포된 다중 위치, 또는 RdRP 및/또는 스파이크 단백질 코딩 서열의 일부로 제한된 다중 위치에 조작될 수 있다. 관련된 다수의 결함 (즉, 뉴클레오티드 치환)으로 인해, 본 발명은 안정적으로 약독화된 바이러스 및 생백신의 생산을 가능하게 한다.
하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 바이러스 코딩 서열은 하나 이상의 코돈을 SARS-CoV-2 코로나바이러스 숙주 (예를 들어, 인간, 뱀, 박쥐)에서 덜 빈번하게 사용되는 동의 코돈으로 치환함으로써 재코딩된다. 일부 구현예에서 바이러스 코딩 서열은 하나 이상의 코돈을 코로나바이러스; 예를 들어, SARS-CoV-2 코로나바이러스에서 덜 빈번하게 사용되는 동의 코돈으로 치환함으로써 재코딩된다. 특정 구현예에서, 동의 코돈으로 치환된 코돈의 수는 적어도 5이다. 일부 구현예에서, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개의 코돈이 숙주에서 덜 빈번하게 사용되는 동의 코돈으로 대체된다. 특정 구현예에서, 변형된 서열은 덜 빈번하게 사용되는 동의 코돈으로 치환된 적어도 20개의 코돈을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 서열은 덜 빈번하게 사용되는 동의 코돈으로 치환된 적어도 50개의 코돈을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 서열은 덜 빈번하게 사용되는 동의 코돈으로 치환된 적어도 100개의 코돈을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 서열은 덜 빈번하게 사용되는 동의 코돈으로 치환된 적어도 250개의 코돈을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 서열은 덜 빈번하게 사용되는 동의 코돈으로 치환된 적어도 500개의 코돈을 포함한다.
예를 들어, 재코딩된 스파이크 단백질의 경우, 숙주에서 덜 빈번하게 사용되는 동의 코돈으로 치환된 코돈의 수는 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개의 코돈이다.
예를 들어, 재코딩된 RdRP 단백질의 경우, 숙주에서 덜 빈번하게 사용되는 동의 코돈으로 치환된 코돈의 수는 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 또는 300개의 코돈이다.
일부 구현예에서, 동의 코돈의 치환은 바이러스 숙주; 예를 들어, 인간에서 덜 빈번한 것으로 된다. 바이러스 숙주의 다른 예는 상기 언급된 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 동의 코돈의 치환은 바이러스 자체; 예를 들어, SARS-CoV-2 코로나바이러스에서 덜 빈번한 것으로 된다.
변형된 서열이 모 바이러스 상의 상응하는 서열과 비교하여 증가된 수의 CpG 또는 UpA 디-뉴클레오티드를 포함하는 구현예에서, 증가는 상응하는 서열과 비교하여 약 15-55 CpG 또는 UpA 디-뉴클레오티드의 증가이다. 다양한 구현예에서, 증가는 상응하는 서열과 비교하여 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 55 CpG 또는 UpA 디-뉴클레오티드의 증가이다. 일부 구현예에서, 상응하는 서열과 비교하여 증가된 수의 CpG 또는 UpA 디-뉴클레오티드는 상응하는 서열과 비교하여 약 10-75, 15-25, 25-50, 또는 50-75 CpG 또는 UpA 디-뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 바이러스 코돈 쌍은 코돈-쌍 편향을 감소 (즉, 그 값을 낮추기 위해)하도록 재코딩된다. 특정 구현예에서, 코돈-쌍 편향은 코돈 쌍을 더 낮은 코돈 쌍 점수를 갖는 코돈 쌍으로 치환함으로써 코돈-쌍 편향을 줄이고 줄일 수 있는 코돈-쌍 점수를 갖는 RdRP 및/또는 스파이크 코딩 서열에서 코돈 쌍을 확인함으로써 감소된다. 일부 구현예에서, 코돈 쌍의 이러한 치환은 서열의 기존 코돈을 재배열하는 형태를 취한다. 일부 이러한 구현예에서, 코돈 쌍의 서브세트는 동의 코돈의 서브세트를 재배열함으로써 치환된다. 다른 구현예에서, 코돈 쌍은 재배열된 동의 코돈의 수를 최대화함으로써 치환된다. 코돈의 재배열은 전체 바이러스 코딩 서열에 대해 감소된 (더 음성으로 만드는) 코돈-쌍 편향을 초래하고, 재배열은 많은 위치에서 감소된 CPS를 초래하는 반면, 다른 위치에서는 수반되는 CPS 증가가 있을 수 있지만, 평균적으로, 코돈 쌍 점수, 따라서 변형된 서열의 CPB는 감소함을 유의한다. 일부 구현예에서, 코돈 또는 코돈-쌍의 재코딩은 RdRP 및/또는 스파이크 코딩 서열의 G+C 함량의 변경을 고려할 수 있다. 일부 구현예에서, 코돈 또는 코돈-쌍의 재코딩은 RdRP 및/또는 스파이크 코딩 서열에서 CG 및/또는 TA 디뉴클레오티드의 빈도를 변경하는 것을 고려할 수 있다.
특정 구현예에서, 재코딩된 RdRP 및/또는 스파이크 단백질-암호화 서열은 -0.1 미만, 또는 -0.2 미만, 또는 -0.3 미만, 또는 -0.4 미만의 코돈 쌍 편향을 갖는다. 일부 구현예에서, 재코딩된 RdRP 및/또는 스파이크 단백질-암호화 서열은 -0.05 미만, 또는 -0.06 미만, 또는 -0.07 미만, 또는 -0.08 미만, 또는 -0.09 미만, 또는 -0.1 미만, 또는 -0.11 미만, 또는 -0.12 미만, 또는 -0.13 미만, 또는 -0.14 미만, 또는 -0.15 미만, 또는 -0.16 미만, 또는 -0.17 미만, 또는 -0.18 미만, 또는 -0.19 미만, 또는 -0.2 미만, 또는 -0.25 미만, 또는 -0.3 미만, 또는 -0.35 미만, 또는 -0.4 미만, 또는 -0.45 미만, 또는 -0.5 미만의 코돈 쌍 편향을 갖는다.
특정 구현예에서, 재코딩된 RdRP 및/또는 스파이크 단백질 암호화 서열의 코돈 쌍 편향은 그것이 유래된 모 RdRP 및/또는 스파이크 단백질 암호화 서열 (예를 들어, 모 서열 RdRP 및/또는 스파이크 단백질 암호화 서열, 야생형 서열 RdRP 및/또는 스파이크 단백질 암호화 서열)과 비교하여 적어도 0.1, 또는 적어도 0.2, 또는 적어도 0.3, 또는 적어도 0.4 만큼 감소된다. 특정 구현예에서, RdRP 및/또는 스파이크 단백질-암호화 서열의 동의 코돈의 재배열은 그것이 유래된 모 RdRP 및/또는 스파이크 단백질 암호화 서열과 비교하여 적어도 0.1, 또는 적어도 0.2, 또는 적어도 0.3, 또는 적어도 0.4의 코돈-쌍 편향 감소를 제공한다. 특정 구현예에서, 재코딩된 RdRP 및/또는 스파이크 단백질-암호화 서열의 코돈 쌍 편향은 모 바이러스 상의 상응하는 서열과 비교하여 적어도 0.05, 또는 적어도 0.06, 또는 적어도 0.07, 또는 적어도 0.08, 또는 적어도 0.09, 또는 적어도 0.1, 또는 적어도 0.11, 또는 적어도 0.12, 또는 적어도 0.13, 또는 적어도 0.14, 또는 적어도 0.15, 또는 적어도 0.16, 또는 적어도 0.17, 또는 적어도 0.18, 또는 적어도 0.19, 또는 적어도 0.2, 또는 적어도 0.25, 또는 적어도 0.3, 또는 적어도 0.35, 또는 적어도 0.4, 또는 적어도 0.45, 또는 적어도 0.5 만큼 감소된다. 특정 구현예에서, 그것은 계산이 만들어지는 비교에 상응하는 서열; 예를 들어, 야생형 바이러스의 상응하는 서열 (예를 들어, 야생형 바이러스 상의 RdRP 및/또는 스파이크 단백질-암호화 서열)이다.
일반적으로, 이러한 치환 및 변경은 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않고 암호화된 바이러스 단백질의 발현을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명은 또한 보존적일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 암호화된 단백질에서 비동의성 코돈의 치환 및 아미노산 치환을 초래하는 RdRP 및/또는 스파이크 코딩 서열의 변경을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 치환 및 변경은 아미노산 결실, 부가, 치환을 초래하는 치환 또는 변경을 추가로 포함한다. 예를 들어, 스파이크 단백질은 푸린 절단 부위의 제거를 초래하는 36개 뉴클레오티드 결실로 재코딩될 수 있다.
대부분의 아미노산은 하나 이상의 코돈에 의해 암호화된다. 표 1의 유전자 코드를 참조. 예를 들어, 알라닌은 GCU, GCC, GCA, 및 GCG에 의해 암호화된다. 3개의 아미노산 (Leu, Ser, 및 Arg)은 6개의 다른 코돈에 의해 암호화되는 반면, Trp 및 Met만 고유한 코돈을 갖는다. "동의" 코돈은 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈이다. 따라서, 예를 들어, CUU, CUC, CUA, CUG, UUA, 및 UUG는 Leu를 코딩하는 동의 코돈이다. 동의 코돈은 동일한 빈도로 사용되지 않는다. 일반적으로, 특정 유기체에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈은 동족 tRNA가 풍부한 코돈이며, 이러한 코돈을 사용하면 단백질 번역의 속도 및/또는 정확도가 향상된다. 반대로, 드물게 사용되는 코돈에 대한 tRNA는 상대적으로 낮은 수준에서 발견되며, 희귀 코돈을 사용하면 번역 속도 및/또는 정확도가 감소하는 것으로 생각된다.
표 1. 유전자 코드
a 특정 아미노산을 암호화하는 각 코돈의 첫 번째 뉴클레오티드는 맨 왼쪽 열에 표시되고; 두 번째 뉴클레오티드는 맨 위 행에 표시되며; 세 번째 뉴클레오티드는 맨 오른쪽 열에 표시된다.
코돈 편향
본원에 사용된 바와 같이, "희귀" 코돈은 해당 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용되는 코돈보다 상당히 낮은 빈도로 mRNA에 존재하는 특정 아미노산을 암호화하는 적어도 2개의 동의 코돈 중 하나이다. 따라서, 희귀 코돈은 가장 빈번하게 사용되는 코돈보다 약 2배 낮은 빈도로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 희귀 코돈은 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용되는 코돈보다 적어도 3배, 더욱 바람직하게는 적어도 5배 더 낮은 빈도로 존재한다. 반대로, "빈번한" 코돈은 해당 아미노산에 대해 가장 적게 사용되는 코돈보다 훨씬 더 높은 빈도로 mRNA에 존재하는 특정 아미노산을 암호화하는 적어도 2개의 동의 코돈 중 하나이다. 빈번한 코돈은 아미노산에 대해 가장 적게 사용되는 코돈보다 약 2배, 바람직하게는 적어도 3배, 더욱 바람직하게는 적어도 5배 더 높은 빈도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 인간 유전자는 40%의 시간 동안 류신 코돈 CTG를 사용하지만, 동의 CTA는 7%의 시간만 사용한다 (표 2 참조). 따라서, CTG는 빈번한 코돈인 반면 CTA는 희귀 코돈이다. 이러한 사용 빈도와 대략 일치하게, CTG를 인식하는 tRNA에 대한 유전자의 게놈에는 6개의 사본이 있는 반면 CTA를 인식하는 tRNA에 대한 유전자 사본은 2개뿐이다. 유사하게, 인간 유전자는 세린에 대해 빈번한 코돈 TCT 및 TCC를 각각 18% 및 22%의 시간을 사용하지만 희귀 코돈 TCG는 5%의 시간만 사용한다. TCT와 TCC는 게놈에 10개의 유전자 사본이 있는 동일한 tRNA에 의해 워블을 통해 판독되는 반면 TCG는 4개 사본만 있는 tRNA에 의해 판독된다. 매우 활발하게 번역되는 mRNA는 가장 빈번한 코돈만을 사용하도록 강하게 편향되어 있다는 것은 잘 알려져 있다. 이들은 리보솜 단백질 및 해당 효소에 대한 유전자를 포함한다. 반면에 상대적으로 풍부하지 않은 단백질의 mRNA는 희귀 코돈을 사용할 수 있다.
표 2. 호모 사피엔스의 코돈 사용량 (출처: www.kazusa.or.jp/codon/)
고도로 발현된 유전자가 빈번한 코돈을 사용하는 경향을 "코돈 편향"이라고 한다. 리보솜 단백질에 대한 유전자는 61개 코돈 중 가장 빈번하게 사용되는 20~25개의 코돈만을 사용하고, 높은 코돈 편향 (1에 가까운 코돈 편향)을 갖는 반면, 제대로 발현되지 않은 유전자는 61개의 코돈을 모두 사용하고 거의 또는 코돈 편향이 없다 (0에 가까운 코돈 편향). 빈번하게 사용되는 코돈은 동족 tRNA가 더 많이 발현되는 코돈이며, 이러한 코돈을 사용하면 번역이 더 빠르게, 더 정확하게, 또는 둘 다 진행될 수 있다고 생각된다.
코돈 쌍 편향
또한, 주어진 유기체는 주어진 코돈 A의 가장 가까운 코돈 이웃에 대한 선호도를 가지며, 이를 코돈 쌍 활용(codon pair utilization)의 편향이라고 한다. 기존 코돈을 변경하지 않고 코돈 쌍 편향의 변경은 단백질 합성 및 단백질 생산 속도에 영향을 줄 수 있다.
코돈 쌍 편향은 8개의 다른 코돈 쌍에 의해 암호화될 수 있는 아미노산 쌍 Ala-Glu를 고려하여 설명할 수 있다. 각 개별 코돈의 빈도 (표 2에 표시됨) 이외의 요인이 코돈 쌍의 빈도에 영향을 미치지 않는 경우, 8개의 암호화 각각의 예상 빈도는 2개의 관련 코돈의 빈도를 곱하여 계산할 수 있다. 예를 들어, 이 계산에 의해 코돈 쌍 GCA-GAA는 모든 Ala-Glu 코딩 쌍 중 0.097의 빈도로 발생할 것으로 예상된다 (0.23×0.42; 표 2의 빈도에 기초함). 각 코돈 쌍의 예상(가상) 빈도를 인간 게놈에서 실제로 관찰된 빈도와 관련시키기 위해 총 14,795개의 인간 유전자를 포함하는 일관되게 주석이 달린 인간 코딩 영역의 공통 CDS (CCDS) 데이터베이스를 사용하였다. 이 유전자 세트는 인간 코딩 서열의 가장 포괄적인 대표이다. 이 유전자 세트를 사용하여, 코돈의 발생 횟수를 동일한 아미노산을 코딩하는 모든 동의 코돈의 수로 나누어 코돈 사용 빈도를 재계산했다. 예상대로 빈도는 표 2에 나와 있는 것과 같이 이전에 발표된 빈도와 밀접하게 연관되어 있다. 약간의 빈도 변동은 84949개의 인간 코딩 서열이 계산에 포함된 (인간 유전자의 실제 수보다 훨씬 많음) Kazusa DNA Research Institute (www.kazusa.or.jp/codon/codon.html)의 코돈 사용 데이터베이스에 의해 제공된 데이터에서 오버샘플링 효과로 인한 것이다. 따라서 계산된 코돈 빈도를 먼저 두 개의 관련 코돈의 빈도를 서로 곱한 다음 (표 3 예상 빈도 참조), 이 결과를 (전체에서 CCDS 데이터 세트에서) 관찰된 빈도를 문제의 코돈 쌍에 의해 암호화된 아미노산 쌍과 곱함으로써 예상 코돈 쌍 빈도를 계산하는 데 사용하였다. 코돈 쌍 GCA-GAA의 예에서, 이 두 번째 계산은 0.098의 예상 빈도를 제공한다 (Kazusa 데이터 세트를 사용한 첫 번째 계산의 0.097과 비교). 마지막으로, 14,795개의 인간 유전자 세트에서 관찰된 실제 코돈 쌍 빈도는 세트에서 각 코돈 쌍의 총 발생 수를 세고 동일한 코드를 코딩하는 세트의 모든 동의 코딩 쌍의 수로 나눔으로써 결정되었다 (표 3; 관찰 빈도). 14,795개의 인간 유전자 세트를 기반으로 한 완전한 3721개 (612) 코돈 쌍 세트에 대한 빈도 및 관찰/예상 값이 표 3에 제공된다.
표 3. 아미노 쌍 Ala-Glu로 예시된 코돈 쌍 점수
코돈 쌍의 관찰 빈도/예상 빈도의 비율이 1보다 크면 코돈 쌍이 과도하게 표시된다고 한다. 비율이 1보다 작으면 과소 표시된다고 한다. 예에서, 코돈 쌍 GCA-GAA는 1.65배 과대 표시되는 반면 코딩 쌍 GCC-GAA는 5배 이상 과소 표시된다.
다른 많은 코돈 쌍은 매우 강한 편향을 나타낸다; 일부 쌍은 과소 표시되는 반면, 다른 쌍은 과다 표시된다. 예를 들어, 코돈 쌍 GCCGAA (AlaGlu) 및 GATCTG (AspLeu)는 3 내지 6배 과소 표시되는 반면 (바람직한 쌍은 각각 GCAGAG 및 GACCTG임), 코돈 쌍 GCCAAG (AlaLys) 및 AATGAA (AsnGlu)는 약 2배 이상 과도하게 표시된다. 코돈의 쌍 편향은 아미노산 쌍의 빈도나 개별 코돈의 빈도와 관련이 없다는 점에 주목해야 한다. 예를 들어, 과소 표시되는 쌍 GATCTG (AspLeu)는 가장 빈번한 Leu 코돈, (CTG)을 사용한다.
아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이, 코돈 쌍 편향은 코딩 서열의 전체 길이에 걸쳐 평균화된 코딩 서열의 각 코돈 쌍에 대한 점수를 고려한다. 본 발명에 따르면, 코돈 쌍 편향은 하기에 의해 결정된다.
따라서, 코딩 서열에 대한 유사한 코돈 쌍 편향은 예를 들어 코딩 서열의 전체 길이에 걸쳐 서브서열에 걸쳐 최소화된 코돈 쌍 점수 또는 적당히 감소된 코돈 쌍 점수에 의해 얻어질 수 있다.
코돈 쌍 편향의 계산
가능한 3721개 비-"정지" 함유 코돈 쌍 (예를 들어, GTT-GCT)의 모든 개별 코돈 쌍은 유전자 "트레이닝 세트"에 대해 특정한 할당된 "코돈 쌍 점수," 또는 "CPS"를 갖는다. 주어진 코돈 쌍의 CPS는 이 유전자 세트 (이 예에서는 인간 게놈)에서 예상되는 수에 대한 관찰된 발생 수의 로그 비율로 정의된다. 특정 코돈 쌍의 실제 발생 횟수 (또는 특정 아미노산 쌍이 특정 코돈 쌍에 의해 암호화될 가능성)를 결정하는 것은 단순히 특정 코딩 서열 세트에서 코돈 쌍의 실제 발생 횟수를 계산하는 문제이다. 그러나 예상 숫자를 결정하려면 추가 계산이 필요하다. 예상 숫자는 거트만(Gutman) 및 하트필드(Hatfield)와 유사하게 아미노산 빈도 및 코돈 편향 모두에 독립적이도록 계산된다. 즉, 특정 코돈에 의해 아미노산이 암호화되는 횟수의 상대적인 비율을 기반으로 예상 빈도를 계산한다. CPS 값이 양수이면 주어진 코돈 쌍이 통계적으로 과도하게 표시됨을 의미하고 CPS가 음수이면 해당 쌍이 인간 게놈에서 통계적으로 과소 표시되었음을 나타낸다.
인간 맥락 내에서 이러한 계산을 수행하기 위해, 총 14,795개의 유전자를 포함하는 일관되게 주석이 달린 인간 코딩 영역의 가장 최근의 공통 CDS (CCDS) 데이터베이스를 사용하였다. 이 데이터 세트는 코돈 및 코돈 쌍, 따라서 게놈 규모에서 아미노산 및 아미노산 쌍 빈도를 제공했다.
Federov et al. (2002)의 패러다임을 Gutman 및 Hatfield (1989)의 접근 방식을 더욱 향상시키는 데 사용하였다. 이것은 특정 아미노산 쌍을 암호화하는 이웃 코돈의 비무작위 연관 및 코돈 빈도와 무관하게 주어진 코돈 쌍의 예상 빈도를 계산할 수 있게 했다. CPB를 계산하기 위해 사용된 상세한 방정식은 WO 2008/121992 및 WO 2011/044561에 개시되어 있으며, 이들은 참고로 포함된다.
계산에서, Pij는 이의 동의 그룹에서 NO(Pij)의 빈도로 발생하는 코돈 쌍이다. Ci 및 Cj는 Pij 포함하는 2개의 코돈이며, 각각 동의 그룹에서 빈도 F(Ci) 및 F(Cj)로 발생한다. 보다 명시적으로, F(Ci)는 상응하는 아미노산 Xi가 모든 코딩 영역에 걸쳐 코돈 Ci에 의해 코딩되는 빈도이고 F(Ci)=NO(Cj)/NO(Xi), 여기서 NO(Ci) 및 NO(Xi)는 각각 코돈 Ci 및 아미노산 Xi의 관찰된 발생 수이다. 이에 따라 F(Cj)가 계산된다. 또한, NO(Xij)는 모든 코딩 영역에 걸친 아미노산 쌍 Xij의 발생 수이다. Pij의 코돈 쌍 편향 점수 S(Pij)는 Ne(Pij)의 예상 발생 횟수에 대한 관찰된 빈도 No(Pij)의 로그 승산비로 계산되었다.
상기 식을 사용하여, 전체 인간 CCDS 데이터 세트를 사용하여 계산된 해당 게놈 Ne(Pij) 값과 비교할 때 개별 코딩 서열의 개별 코돈 쌍이 과대 또는 과소 표시되는지 여부를 결정했다. 이 계산은 인간 코딩 영역에서 과대 표현된 코돈 쌍에 대해 양의 S(Pij) 점수 값 및 과소 표현된 코돈 쌍에 대한 음성 값을 초래했다.
개별 코딩 서열의 "조합된" 코돈 쌍 편향은 다음 식에 따라 모든 코돈 쌍 점수를 평균화하여 계산되었다:
따라서 전체 코딩 영역의 코돈 쌍 편향은 영역을 포함하는 모든 개별 코돈 쌍 점수를 더하고 이 합을 코딩 서열의 길이로 나눔으로써 계산된다.
코돈 쌍 편향의 계산, 코돈-쌍 편향을 변경하기 위한 알고리즘 구현.
코돈 쌍 편향을 정량화하기 위한 알고리즘이 개발되었다. 모든 가능한 개별 코돈 쌍에 "코돈 쌍 점수" 또는 "CPS"가 주어졌다. CPS는 모든 인간 코딩 영역에 대한 각 코돈 쌍의 예상 발생 횟수에 대해 관찰된 비율의 자연 로그로 정의되며, 여기서 인간은 재코딩될 인스턴트 백신 바이러스의 숙주 종을 나타낸다.
특정 코돈 쌍의 관찰된 발생 계산은 간단하지만 (유전자 세트 내의 실제 수), 예상되는 코돈 쌍 발생 수는 추가 계산이 필요하다. 본 발명자는 거트만 및 하트필드와 유사하게 아미노산 빈도 및 코돈 편향 모두에 독립적인 이 예상 수를 계산한다. 즉, 특정 코돈에 의해 아미노산이 암호화되는 횟수의 상대적인 비율을 기반으로 예상 빈도를 계산한다. CPS 값이 양수이면 주어진 코돈 쌍이 통계적으로 과도하게 표시됨을 의미하고 CPS가 음수이면 해당 쌍이 인간 게놈에서 통계적으로 과소 표시되었음을 나타낸다.
이러한 계산된 CPS를 사용하여, 모든 코딩 영역은 코돈 쌍 점수의 평균을 취하여 전체 유전자에 대한 코돈 쌍 편향 (CPB)을 제공함으로써 과대 또는 과소 대표된 코돈 쌍을 사용하는 것으로 평가될 수 있다.
CPB는 표시되고 플롯된 방정식을 사용하여 주석이 달린 모든 인간 유전자에 대해 계산되었다. 그래프의 각 점은 단일 인간 유전자의 CPB에 해당한다. 분포의 피크는 0.07의 양성 코돈 쌍 편향을 가지며, 이는 주석이 달린 모든 인간 유전자에 대한 평균 점수이다. 또한 음성 코돈 쌍 편향을 가진 유전자는 거의 없다. 그런 다음 CPB를 정의하고 계산하기 위해 설정된 방정식을 사용하여 이 편향을 조작했다.
코돈-쌍 편향을 줄이기 위한 알고리즘.
단백질-암호화 서열의 재코딩은 예를 들어, 구배 하강법, 또는 모의 어닐링 또는 기타 최소화 루틴을 사용하여 컴퓨터의 도움을 받거나 받지 않고 수행할 수 있다. 출발 서열에 있는 코돈을 재배열하는 절차의 예는 다음 단계로 나타낼 수 있다:
1) 야생형 바이러스 게놈 서열을 얻는 단계.
2) 약독화된 설계를 표적으로 하는 단백질 코딩 서열을 선택하는 단계.
3) 비코딩 기능을 갖는, 알려진 또는 추측된 DNA 분절 잠그는(lock down) 단계.
4) 재설계된 단백질의 나머지 아미노산에 대해 원하는 코돈 분포를 선택하는 단계.
5) 적어도 두 개의 동의 잠기지 않은(unlocked) 코돈 위치를 무작위로 섞고 코돈 쌍 점수를 계산하는 단계.
6) 모의 어닐링 절차를 선택적으로 사용하여 코돈 쌍 점수를 추가로 감소 (또는 증가)시키는 단계.
7) 과도한 2차 구조 및 원치 않는 제한 부위에 대한 결과 설계 검사:
● 예인 경우 -> 단계 (5)로 이동하거나 문제 영역을 야생형 서열로 교체하여 설계를 수정하고 단계 (8)로 이동.
8) 바이러스 설계에 해당하는 DNA 서열을 합성하는 단계.
9) 바이러스 작제물을 만들고 바이러스 표현형을 평가하는 단계:
● 너무 약화된 경우 하위 클론 작제물을 준비하고 9로 이동;
● 약독화가 충분하지 않으면 2로 이동.
코돈 쌍 편향을 감소시키는 것에 의한 바이러스의 약독화는 WO 2008/121992 및 WO 2011/044561에 개시되어 있으며, 이는 완전히 설명된 것처럼 참고로 포함된다.
야생형 SARS-CoV-2 게놈 서열 (또는 COVID-19를 유발하는 야생형 서열의 돌연변이 형태)에 포매된 전장 SARS-CoV-2 게놈 서열 또는 코돈 쌍 탈최적화된 서열을 얻는 방법은 예를 들어, BAC 벡터를 사용하여 감염성 cDNA 클론을 구성하거나, 중첩 확장 PCR 전략을 사용하거나, 긴 PCR 기반 융합 전략을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
재코딩된 폴리뉴클레오티드
본 발명의 다양한 구현예는 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편을 암호화하는 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 재코딩되고, 여기서 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질, 또는 이의 하나 이상의 단편의 아미노산 서열은 동일하게 유지된다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질, 또는 이의 하나 이상의 단편의 아미노산 서열은 모 SARS-CoV-2 바이러스 서열의 핵산 서열의 폴리A 꼬리 앞에 동일하게 유지된다.
본 발명의 다양한 구현예는 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 재코딩되고, 여기서 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편의 아미노산 서열은 최대 20개의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편의 아미노산 서열은 모 SARS-CoV-2 바이러스 서열의 핵산 서열의 폴리A 꼬리 앞에 최대 20 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다.
본 발명의 다양한 구현예는 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 재코딩되고, 여기서 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편의 아미노산 서열은 최대 10개의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편의 아미노산 서열은 모 SARS-CoV-2 바이러스 서열의 핵산 서열의 폴리A 꼬리 앞에 최대 10개의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다.
본 발명의 다양한 구현예는 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편을 암호화하는 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 재코딩되고, 여기서 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편의 아미노산 서열은 최대 12개의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편의 아미노산 서열은 모 SARS-CoV-2 바이러스 서열의 핵산 서열의 폴리A 꼬리 앞에 최대 12개의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다.
다양한 구현예에서, 아미노산 서열은 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 다양한 구현예에서, 아미노산 서열은 1-5, 6-10, 11-15, 또는 16-20개의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 다양한 구현예에서, 아미노산 결실, 치환, 또는 부가는 모 SARS-CoV-2 바이러스 서열의 핵산 서열의 폴리A 꼬리 앞의 핵산 결실(들), 치환(들) 또는 부가(들)로부터 발생한다.
다양한 구현예에서, 아미노산 서열은 12개의 아미노산 결실을 포함한다. 다양한 구현예에서, 아미노산 서열은 1-5, 6-10, 11-15, 또는 16-20개의 아미노산 결실을 포함한다. 다양한 구현예에서, 아미노산 치환, 부가, 또는 결실은 재코딩된 서열에서 하나 이상의 점 돌연변이로 인한 것일 수 있다. 다양한 구현예에서, 아미노산 결실, 치환, 또는 부가는 모 SARS-CoV-2 바이러스 서열의 핵산 서열의 폴리A 꼬리 앞의 핵산 결실(들), 치환(들) 또는 부가(들)로부터 발생한다.
따라서, 이들 재코딩된 폴리뉴클레오티드 (핵산 결실(들), 치환(들) 또는 부가(들)이 있거나 없음)에 대한 다양한 구현예에서, 재코딩된 폴리뉴클레오티드는 폴리A 꼬리에 대해 상이한 길이를 가질 수 있다; 예를 들어, 3' 말단에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 또는 54개의 연속적인 아데노신; 또는 예를 들어, 3' 말단에 1-6, 7-12, 13-18, 19-24, 25-30, 31-36, 37-42, 43-48, 또는 49-54개의 연속적인 아데노신; 또는 3' 말단에 예를 들어, 9-37, 12-34, 15-33, 18-30, 또는 21-27개의 연속적인 아데노신; 또는 예를 들어, 3' 말단에 19-25개의 연속적인 아데노신.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 코돈-쌍 편향 (CPB)을 줄이거나 코돈 사용빈도 편향을 줄임으로써 재코딩된다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 CpG 또는 UpA 디-뉴클레오티드의 수를 증가시킴으로써 재코딩된다.
다양한 구현예에서, 각각의 재코딩된 하나 이상의 바이러스 단백질, 또는 각각의 재코딩된 하나 이상의 이의 단편은 -0.05 미만, -0.1 미만, -0.2 미만, -0.3 미만, 또는 -0.4 미만의 코돈 쌍 편향을 갖는다.
특정 구현예에서, 재코딩된 바이러스 단백질은 RdRP 및/또는 스파이크 단백질이고 각각의 재코딩된 바이러스 단백질 또는 이의 단편은 -0.05 미만, 또는 -0.06 미만, 또는 -0.07 미만, 또는 -0.08 미만, 또는 -0.09 미만, 또는 -0.1 미만, 또는 -0.11 미만, 또는 -0.12 미만, 또는 -0.13 미만, 또는 -0.14 미만, 또는 -0.15 미만, 또는 -0.16 미만, 또는 -0.17 미만, 또는 -0.18 미만, 또는 -0.19 미만, 또는 -0.2 미만, 또는 -0.25 미만, 또는 -0.3 미만, 또는 -0.35 미만, 또는 -0.4 미만, 또는 -0.45 미만, 또는 -0.5 미만의 코돈 쌍 편향을 갖는다.
특정 구현예에서, 재코딩된 바이러스 단백질은 RdRP 및/또는 스파이크 단백질이고 각각의 재코딩된 바이러스 단백질 또는 이의 단편은 모 서열상의 상응하는 서열과 비교하여 적어도 0.05, 또는 적어도 0.06, 또는 적어도 0.07, 또는 적어도 0.08, 또는 적어도 0.09, 또는 적어도 0.1, 또는 적어도 0.11, 또는 적어도 0.12, 또는 적어도 0.13, 또는 적어도 0.14, 또는 적어도 0.15, 또는 적어도 0.16, 또는 적어도 0.17, 또는 적어도 0.18, 또는 적어도 0.19, 또는 적어도 0.2, 또는 적어도 0.25, 또는 적어도 0.3, 또는 적어도 0.35, 또는 적어도 0.4, 또는 적어도 0.45, 또는 적어도 0.5만큼 감소된다. 특정 구현예에서, 그것은 계산이 이루어질 모 서열상의 비교 상응 서열; 예를 들어, 야생형 바이러스의 상응하는 서열이다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 야생형 SARS-CoV-2 코로나바이러스이다. 다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 천연 분리주 SARS-CoV-2 코로나바이러스이다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 야생형 BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019 분리주이다. 다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 야생형 워싱턴 분리주이고 (GenBank: MN985325.1), 그 전체가 완전하게 기재된 것처럼 본원에 참조로 포함된다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 야생형 SARS-CoV-2 코로나바이러스 서열의 돌연변이 형태이다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 변이체이다. 다양한 구현예에서, SARS-CoV-2 변이체는 영국 변이체, 남아프리카 변이체, 또는 브라질 변이체이다.
영국 변이체의 예는 GenBank 수탁 번호 MW462650 (SARS-CoV-2/human/USA/MN-MDH-2252/2020), MW463056 (SARS-CoV-2/human/USA/FL-BPHL-2270/2020), 및 MW440433 (SARS-CoV-2/human/USA/NY-Wadsworth-291673-01/2020)를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 모두 2021년 1월 19일 기준으로, 그 전체가 완전하게 기재된 것처럼 본원에 참조로 모두 포함된다. 영국 변이체의 추가 예는 GISAID ID 번호 EPI_ISL_778842 (hCoV-19/USA/TX-CDC-9KXP-8438/2020; 2020-12-28), EPI_ISL_802609 (hCoV-19/USA/CA-CDC-STM-050/2020; 2020-12-28), EPI_ISL_802647 (hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-043/2020; 2020-12-26), EPI_ISL_832014 (hCoV-19/USA/UT-UPHL-2101178518/2020; 2020-12-31), EPI_ISL_850618 (hCoV-19/USA/IN-CDC-STM-183/2020; 2020-12-31), 및 EPI_ISL_850960 (hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-A100002/2021; 2021-01-04)를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 모두 2021년 1월 20일 기준으로, 그 전체가 완전하게 기재된 것처럼 본원에 참조로 모두 포함된다.
남아프리카 변이체의 예는 GISAID ID 번호 EPI_ISL_766709 (hCoV-19/Sweden/20-13194/2020; 2020-12-24), EPI_ISL_768828 (hCoV-19/France/PAC-NRC2933/2020; 2020-12-22), EPI_ISL_770441 (hCoV-19/England/205280030/2020; 2020-12-24), 및 EPI_ISL_819798 (hCoV-19/England/OXON-F440A7/2020; 2020-12-18)를 포함하지만 이에 제한되지 않고 모두 2021년 1월 20일 기준으로, 그 전체가 완전하게 기재된 것처럼 본원에 참조로 모두 포함된다.
브라질 변이체의 예는 GISAID ID 번호 EPI_ISL_677212 (hCoV-19/USA/VA-DCLS-2187/2020; 2020-11-12), EPI_ISL_723494 (hCoV-19/USA/VA-DCLS-2191/2020; 2020-11-12), EPI_ISL_845768 (hCoV-19/USA/GA-EHC-458R/2021; 2021-01-05), EPI_ISL_848196 (hCoV-19/Canada/LTRI-1192/2020; 2020-12-24), 및 EPI_ISL_848197 (hCoV-19/Canada/LTRI-1258/2020; 2020-12-24)를 포함하지만 이에 제한되지 않고 모두 2021년 1월 20일 기준으로, 그 전체가 완전하게 기재된 것처럼 본원에 참조로 모두 포함된다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 이전에 변형된 바이러스 핵산, 또는 이전에 약독화된 바이러스 핵산이다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 CPB 탈최적화된다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 코돈 탈최적화된다.
다양한 구현예에서, 코돈 탈최적화 또는 CPB 탈최적화는 인간에서 빈번하게 사용되는 코돈 또는 CPB를 기반으로 한다. 다양한 구현예에서, 코돈 탈최적화 또는 CPB 탈최적화는 코로나바이러스에서 빈번하게 사용되는 코돈 또는 CPB를 기반으로 한다. 다양한 구현예에서, 코돈 탈최적화 또는 CPB 탈최적화는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에서 빈번하게 사용되는 코돈 또는 CPB를 기반으로 한다. 다양한 구현예에서, 코돈 탈최적화 또는 CPB 탈최적화는 야생형 SARS-CoV-2 코로나바이러스에서 빈번하게 사용되는 코돈 또는 CPB를 기반으로 한다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA-의존성 RNA 중합효소 (RdRP), RdRP의 단편, 스파이크 단백질, 스파이크 단백질의 단편, 및 이들의 조합으로부터 선택된 재코딩된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 푸린 절단 부위를 제거하는 스파이크 단백질에서 아미노산의 결실을 초래하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라는 것은 아니지만, 본 발명자들은 푸린 절단 부위를 제거하는 것이 백신 및/또는 면역 조성물의 안전성 동인 중 하나가 될 것이라고 믿는다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 bp 11294-12709, bp 14641-15903, bp 21656-22306, bp 22505-23905, 및 bp 24110-25381로부터 선택된 적어도 하나의 CPB 탈최적화된 영역을 포함한다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3 (Wuhan-CoV_101K)을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 1-29,877을 포함한다 (예를 들어, 폴리A 꼬리가 없음). 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 1-29,877 및 3' 말단에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 또는 54개의 연속적인 아데노신을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 1-29,877 및 3' 말단에 1-6, 7-12, 13-18, 19-24, 25-30, 31-36, 37-42, 43-48, 또는 49-54개의 연속적인 아데노신을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 1-29,877 및 3' 말단에 9-37, 12-34, 15-33, 18-30, 또는 21-27개의 연속적인 아데노신을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 1-29,877 및 3' 말단에 19-25개의 연속적인 아데노신을 포함한다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4를 포함한다. 서열 번호 4는 야생형 WA-1 서열과 비교하여 탈최적화된 서열이다 (GenBank: MN985325.1 완전히 기술된 것처럼 본원에 참조로 포함됨) (예를 들어, CDX-005). 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834를 포함한다 (예를 들어, 폴리A 꼬리가 없음). 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834 및 3' 말단에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 또는 54개의 연속적인 아데노신을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4의 1-29,834 및 3’말단에 1-6, 7-12, 13-18, 19-24, 25-30, 31-36, 37-42, 43-48, 또는 49-54개의 연속적인 아데노신을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834 및 3' 말단에 9-37, 12-34, 15-33, 18-30, 또는 21-27개의 연속적인 아데노신을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834 및 3' 말단에 19-25개의 연속적인 아데노신을 포함한다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 6 (재코딩된 스파이크 단백질)을 암호화한다.
벡터, 세포, 폴리펩티드
다양한 구현예는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 박테리아 인공 염색체 (BAC)를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본원에서 논의된 바와 같은 재코딩된 폴리펩티드이다.
다양한 구현예는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본원에서 논의된 바와 같은 재코딩된 폴리펩티드이다.
본 발명의 벡터를 포함하는 세포. 벡터는 본원에서 논의된 바와 같은 것들이다.
다양한 구현예에서, 세포는 베로 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, MA104 세포, 293T 세포, BSR-T7 세포, MRC-5 세포, CHO 세포, 또는 PER.C6 세포이다. 특정 구현예에서, 세포는 베로 세포 또는 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포이다.
다양한 구현예는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본원에서 논의된 바와 같은 재코딩된 폴리펩티드이다. 폴리펩티드는 야생형 SARS-CoV-2 바이러스에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 또는 SARS-CoV-2 변이체에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 상이한 특성을 나타낸다. 예를 들어, 본원에서 논의된 바와 같이 재코딩된 폴리뉴클레오티드 및 탈최적화된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드는 바이러스에 약독화 특성을 발휘할 수 있다.
변형된 바이러스
본 발명의 다양한 구현예는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함하는 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본원에서 논의된 바와 같은 재코딩된 폴리펩티드이다.
본 발명의 다양한 구현예는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본원에서 논의된 재코딩된 폴리펩티드 중 어느 하나이다.
다양한 구현예에서, 이의 바이러스 단백질 중 하나 이상의 발현은 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스와 비교하여 감소된다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 야생형 SARS-CoV-2 코로나바이러스이다. 다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 천연 분리주 SARS-CoV-2 코로나바이러스이다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 야생형 BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019 분리주이다. 다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 야생형 워싱턴 분리주이고 (GenBank: MN985325.1), 그 전체가 완전하게 기재된 것처럼 본원에 참조로 포함된다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 야생형 SARS-CoV-2 코로나바이러스 서열의 돌연변이 형태이다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 변이체이다. 다양한 구현예에서, SARS-CoV-2 변이체는 영국 변이체, 남아프리카 변이체, 또는 브라질 변이체이다.
영국 변이체의 예는 GenBank 수탁 번호 MW462650 (SARS-CoV-2/human/USA/MN-MDH-2252/2020), MW463056 (SARS-CoV-2/human/USA/FL-BPHL-2270/2020), 및 MW440433 (SARS-CoV-2/human/USA/NY-Wadsworth-291673-01/2020)을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 모두 2021년 1월 19일 기준으로, 그 전체가 완전히 설명된 것처럼 본원에서 참조로 포함된다. 영국 변이체의 추가 예는 GISAID ID 번호 EPI_ISL_778842 (hCoV-19/USA/TX-CDC-9KXP-8438/2020; 2020-12-28), EPI_ISL_802609 (hCoV-19/USA/CA-CDC-STM-050/2020; 2020-12-28), EPI_ISL_802647 (hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-043/2020; 2020-12-26), EPI_ISL_832014 (hCoV-19/USA/UT-UPHL-2101178518/2020; 2020-12-31), EPI_ISL_850618 (hCoV-19/USA/IN-CDC-STM-183/2020; 2020-12-31), 및 EPI_ISL_850960 (hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-A100002/2021; 2021-01-04)을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 모두 2021년 1월 20일 기준으로, 그 전체가 완전히 설명된 것처럼 본원에서 참조로 모두 포함된다.
남아프리카 변이체의 예는 GISAID ID 번호 EPI_ISL_766709 (hCoV-19/Sweden/20-13194/2020; 2020-12-24), EPI_ISL_768828 (hCoV-19/France/PAC-NRC2933/2020; 2020-12-22), EPI_ISL_770441 (hCoV-19/England/205280030/2020; 2020-12-24), 및 EPI_ISL_819798 (hCoV-19/England/OXON-F440A7/2020; 2020-12-18)을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 모두 2021년 1월 20일 기준으로, 그 전체가 완전히 설명된 것처럼 본원에서 참조로 모두 포함된다.
브라질 변이체의 예는 GISAID ID 번호 EPI_ISL_677212 (hCoV-19/USA/VA-DCLS-2187/2020; 2020-11-12), EPI_ISL_723494 (hCoV-19/USA/VA-DCLS-2191/2020; 2020-11-12), EPI_ISL_845768 (hCoV-19/USA/GA-EHC-458R/2021; 2021-01-05), EPI_ISL_848196 (hCoV-19/Canada/LTRI-1192/2020; 2020-12-24), 및 EPI_ISL_848197 (hCoV-19/Canada/LTRI-1258/2020; 2020-12-24)을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 모두 2021년 1월 20일 기준으로, 그 전체가 완전히 설명된 것처럼 본원에서 참조로 모두 포함된다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 이전에 변형된 바이러스 핵산, 또는 이전에 약독화된 바이러스 핵산이다.
다양한 구현예에서 이의 바이러스 단백질 중 하나 이상의 발현 감소는 선택된 RdRP 단백질, 스파이크 단백질, 및 이들의 조합 영역을 재코딩한 결과로서 감소된다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편을 암호화하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 재코딩되고, 여기서 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질, 또는 이의 하나 이상의 단편의 아미노산 서열은 동일하게 유지된다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편을 암호화하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 재코딩되고, 여기서 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편의 아미노산 서열은 최대 15개의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 다양한 구현예에서, 아미노산 서열은 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 다양한 구현예에서, 아미노산 서열은 12개의 아미노산 결실을 포함한다. 다양한 구현예에서, 아미노산 서열은 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 또는 13-15개의 아미노산 결실을 포함한다. 아미노산 치환, 부가, 또는 결실은 재코딩된 서열에서 하나 이상의 점 돌연변이로 인한 것일 수 있다. 다양한 구현예에서, 아미노산 결실, 치환, 또는 부가는 모 SARS-CoV-2 바이러스 서열의 핵산 서열의 폴리A 꼬리 앞의 핵산 결실(들), 치환(들) 또는 부가(들)로부터 발생한다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 코돈-쌍 편향 (CPB)을 감소시키거나 코돈 사용빈도 편향을 감소시킴으로써 재코딩된다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 CpG 또는 UpA 디-뉴클레오티드의 수를 증가시킴으로써 재코딩된다.
다양한 구현예에서, 각각의 재코딩된 하나 이상의 바이러스 단백질, 또는 각각의 재코딩된 이의 하나 이상의 단편은 -0.05 미만, -0.1 미만, -0.2 미만, -0.3 미만, 또는 -0.4 미만의 코돈 쌍 편향을 갖는다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 야생형 SARS-CoV-2 코로나바이러스이다. 다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 천연 분리주 SARS-CoV-2 코로나바이러스이다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 야생형 BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019 분리주이다. 다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 야생형 워싱턴 분리주이고 (GenBank: MN985325.1), 그 전체가 완전하게 기재된 것처럼 본원에 참조로 포함된다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 야생형 SARS-CoV-2 코로나바이러스 서열의 돌연변이 형태이다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 변이체이다. 다양한 구현예에서, SARS-CoV-2 변이체는 영국 변이체, 남아프리카 변이체, 또는 브라질 변이체이다.
영국 변이체의 예는 GenBank 수탁 번호 MW462650 (SARS-CoV-2/human/USA/MN-MDH-2252/2020), MW463056 (SARS-CoV-2/human/USA/FL-BPHL-2270/2020), 및 MW440433 (SARS-CoV-2/human/USA/NY-Wadsworth-291673-01/2020)를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 모두 2021년 1월 19일 기준으로, 그 전체가 완전히 설명된 것처럼 본원에서 참조로 모두 포함된다. 영국 변이체의 추가 예는 GISAID ID 번호 EPI_ISL_778842 (hCoV-19/USA/TX-CDC-9KXP-8438/2020; 2020-12-28), EPI_ISL_802609 (hCoV-19/USA/CA-CDC-STM-050/2020; 2020-12-28), EPI_ISL_802647 (hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-043/2020; 2020-12-26), EPI_ISL_832014 (hCoV-19/USA/UT-UPHL-2101178518/2020; 2020-12-31), EPI_ISL_850618 (hCoV-19/USA/IN-CDC-STM-183/2020; 2020-12-31), 및 EPI_ISL_850960 (hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-A100002/2021; 2021-01-04)를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 모두 2021년 1월 20일 기준으로, 그 전체가 완전히 설명된 것처럼 본원에서 참조로 모두 포함된다.
남아프리카 변이체의 예는 GISAID ID 번호 EPI_ISL_766709 (hCoV-19/Sweden/20-13194/2020; 2020-12-24), EPI_ISL_768828 (hCoV-19/France/PAC-NRC2933/2020; 2020-12-22), EPI_ISL_770441 (hCoV-19/England/205280030/2020; 2020-12-24), 및 EPI_ISL_819798 (hCoV-19/England/OXON-F440A7/2020; 2020-12-18)를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 모두 2021년 1월 20일 기준으로, 그 전체가 완전히 설명된 것처럼 본원에서 참조로 모두 포함된다.
브라질 변이체의 예는 GISAID ID 번호 EPI_ISL_677212 (hCoV-19/USA/VA-DCLS-2187/2020; 2020-11-12), EPI_ISL_723494 (hCoV-19/USA/VA-DCLS-2191/2020; 2020-11-12), EPI_ISL_845768 (hCoV-19/USA/GA-EHC-458R/2021; 2021-01-05), EPI_ISL_848196 (hCoV-19/Canada/LTRI-1192/2020; 2020-12-24), 및 EPI_ISL_848197 (hCoV-19/Canada/LTRI-1258/2020; 2020-12-24)를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 모두 2021년 1월 20일 기준으로, 그 전체가 완전히 설명된 것처럼 본원에서 참조로 모두 포함된다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 이전에 변형된 바이러스 핵산, 또는 이전에 약독화된 바이러스 핵산이다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 CPB 탈최적화된다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 코돈 탈최적화된다.
다양한 구현예에서, 코돈 탈최적화 또는 CPB 탈최적화는 인간에서 빈번하게 사용되는 코돈 또는 CPB를 기반으로 한다. 다양한 구현예에서, 코돈 탈최적화 또는 CPB 탈최적화는 코로나바이러스에서 빈번하게 사용되는 코돈 또는 CPB를 기반으로 한다. 다양한 구현예에서, 코돈 탈최적화 또는 CPB 탈최적화는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에서 빈번하게 사용되는 코돈 또는 CPB를 기반으로 한다. 다양한 구현예에서, 코돈 탈최적화 또는 CPB 탈최적화는 야생형 SARS-CoV-2 코로나바이러스에서 빈번하게 사용되는 코돈 또는 CPB를 기반으로 한다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA-의존성 RNA 중합효소 (RdRP), RdRP의 단편, 스파이크 단백질, 스파이크 단백질의 단편, 및 이들의 조합으로부터 선택된 재코딩된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 푸린 절단 부위를 제거하는 스파이크 단백질에서 아미노산의 결실을 초래하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라는 것은 아니지만, 본 발명자들은 푸린 절단 부위를 제거하는 것이 백신 및/또는 면역 조성물의 안전성 동인 중 하나가 될 것이라고 믿는다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 bp 11294-12709, bp 14641-15903, bp 21656-22306, bp 22505-23905, 및 bp 24110-25381로부터 선택된 적어도 하나의 CPB 탈최적화된 영역을 포함한다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3 (Wuhan-CoV_101K)을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 1-29,877을 포함한다 (예를 들어, 폴리A 꼬리가 없음). 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 1-29,877 및 3' 말단에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 또는 54개의 연속적인 아데노신을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 1-29,877 및 3' 말단에 1-6, 7-12, 13-18, 19-24, 25-30, 31-36, 37-42, 43-48, 또는 49-54개의 연속적인 아데노신을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 1-29,877 및 3' 말단에 9-37, 12-34, 15-33, 18-30, 또는 21-27개의 연속적인 아데노신을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 1-29,877 및 3' 말단에 19-25개의 연속적인 아데노신을 포함한다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4를 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834를 포함한다 (예를 들어, 폴리A 꼬리가 없음). 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834 및 3' 말단에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 또는 54개의 연속적인 아데노신을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4의 1-29,834 및 3' 말단에 1-6, 7-12, 13-18, 19-24, 25-30, 31-36, 37-42, 43-48, 또는 49-54개의 연속적인 아데노신을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834 및 3' 말단에 9-37, 12-34, 15-33, 18-30, 또는 21-27개의 연속적인 아데노신을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834 및 3' 말단에 19-25개의 연속적인 아데노신을 포함한다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 7을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1-29,834를 포함한다 (예를 들어, 폴리A 꼬리가 없음). 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1-29,834 및 3' 말단에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 또는 54개의 연속적인 아데노신을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 7의 1-29,834 및 3' 말단에 1-6, 7-12, 13-18, 19-24, 25-30, 31-36, 37-42, 43-48, 또는 49-54개의 연속적인 아데노신을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1-29,834 및 3' 말단에 9-37, 12-34, 15-33, 18-30, 또는 21-27개의 연속적인 아데노신을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1-29,834 및 3’말단에 19-25개의 연속적인 아데노신을 포함한다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 6 (재코딩된 스파이크 단백질)을 암호화한다.
면역 및/또는 백신 조성물
다양한 구현예는 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 면역 조성물을 제공한다. 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 본원에서 논의된 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 중 하나이다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 약독화 생바이러스이다. 일부 구현예에서 면역 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 허용 가능한 부형제 또는 담체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 안정화제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 보조제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 조성물은 수크로스, 글리신 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 수크로스 (5%) 및 약 글리신 (5%)을 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 허용 가능한 담체 또는 부형제는 당, 아미노산, 계면활성제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예에서, 아미노산은 약 5% w/v의 농도이다. 적합한 아미노산의 비제한적인 예는 아르기닌 및 히스티딘을 포함한다. 적합한 담체의 비제한적인 예는 젤라틴 및 인간 혈청 알부민을 포함한다. 적합한 계면활성제의 비제한적인 예는 0.01-0.05%의 매우 낮은 농도의 폴리소르베이트 80과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 103-107 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 104-106 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 103 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 104 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 105 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 106 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서 면역 조성물은 약 107 PFU의 투여량으로 제공된다.
다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 5x103 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 5x104 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 5x105 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 5x106 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 5x107 PFU의 투여량으로 제공된다.
다양한 구현예는 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물을 제공한다. 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 본원에서 논의된 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 중 하나이다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 약독화 생바이러스이다. 일부 구현예에서 백신 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 안정화제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 백신 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 보조제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 백신 조성물은 수크로스, 글리신 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물은 수크로스 (5%) 및 글리신 (5%)을 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 허용 가능한 담체 또는 부형제는 당, 아미노산, 계면활성제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예에서, 아미노산은 약 5% w/v의 농도이다. 적합한 아미노산의 비제한적인 예는 아르기닌 및 히스티딘을 포함한다. 적합한 담체의 비제한적인 예는 젤라틴 및 인간 혈청 알부민을 포함한다. 적합한 계면활성제의 비제한적인 예는 0.01-0.05%의 매우 낮은 농도의 폴리소르베이트 80과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
다양한 구현예에서, 백신 조성물은 약 103-107 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서 백신 조성물은 약 104-106 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물은 약 103 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물은 약 104 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물은 약 105 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물은 약 106 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물은 약 107 PFU의 투여량으로 제공된다.
다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 5x103 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 5x104 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 5x105 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 5x106 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 5x107 PFU의 투여량으로 제공된다.
다양한 구현예는 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스를 포함하는, 대상체에서 보호 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물을 제공한다. 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 본원에서 논의된 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 중 하나이다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 약독화 생바이러스이다. 일부 구현예에서 백신 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 백신 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 보조제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 백신 조성물은 수크로스, 글리신 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물은 수크로스 (5%) 및 글리신 (5%)을 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 허용 가능한 담체 또는 부형제는 당, 아미노산, 계면활성제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예에서, 아미노산은 약 5% w/v의 농도이다. 적합한 아미노산의 비제한적인 예는 아르기닌 및 히스티딘을 포함한다. 적합한 담체의 비제한적인 예는 젤라틴 및 인간 혈청 알부민을 포함한다. 적합한 계면활성제의 비제한적인 예는 0.01-0.05%의 매우 낮은 농도의 폴리소르베이트 80과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
다양한 구현예에서, 백신 조성물은 약 103-107 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물은 약 104-106 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물은 약 103 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물은 약 104 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물은 약 105 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물은 약 106 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물은 약 107 PFU의 투여량으로 제공된다.
다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 5x103 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 5x104 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 5x105 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 5x106 PFU의 투여량으로 제공된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 약 5x107 PFU의 투여량으로 제공된다.
대상체에서 면역 반응 (또는 보호 면역 반응)을 유도하거나 대상체를 바이러스 관련 질환으로부터 예방하거나 질환에 걸릴 가능성을 줄이기 위해 사용되는 경우 본 발명의 약독화된 바이러스는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 조성물의 형태로 대상체에게 투여될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제는 당업자에게 공지되어 있으며 0.01-0.1M 및 바람직하게는 0.05M 인산염 완충액, 인산염 완충 식염수 (PBS), DMEM, L-15, PBS 중 10-25% 수크로스 용액, DMEM 중 10-25% 수크로스 용액, 또는 0.9% 식염수 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 담체는 또한 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 수성 담체는 물, 알코올/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 식염수 및 완충 매질을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르이다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 포도당, 포도당 및 염화나트륨, 링거 젖산 및 고정 오일을 포함한다. 정맥 내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 링거 포도당을 기반으로 하는 것과 같은 전해질 보충제 등을 포함한다. 고체 조성물은 무독성 고체 담체, 예를 들어 글루코스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체, 탄산나트륨, 젤라틴, 재조합 인간 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민 및/또는 탄산마그네슘을 포함할 수 있다. 폐 및/또는 비강 내 전달과 같은 에어로졸 투여의 경우, 제제 또는 조성물은 바람직하게는 무독성 계면활성제, 예를 들어, C6 내지 C22 지방산 또는 천연 글리세라이드의 에스테르 또는 부분 에스테르, 및 추진제와 함께 제형화된다. 비강 내 전달을 용이하게 하기 위해 레시틴과 같은 추가 담체가 포함될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 소량의 습윤제 또는 유화제와 같은 보조 물질, 보존제 및 예를 들어, 들어 항균제, 항산화제 및 킬레이트제와 같은 기타 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 활성 성분의 유효 기간 및/또는 유효성을 향상시킨다. 인스턴트 조성물은 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 대상체에게 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다.
다양한 구현예에서, 백신 조성물 또는 면역 조성물은 정맥 내로, 또는 척수강매로, 피하로, 근육 내로, 피내로 또는 비강 내로 전달을 위해 제형화된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물 또는 면역 조성물은 비강 내 전달을 위해 제형화된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물 또는 면역 조성물은 점비액 또는 비강 스프레이를 통한 전달을 위해 제형화된다.
본 발명의 조성물을 사용하는 방법.
다양한 구현예는 대상체에게 본 발명의 면역 조성물의 용량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 면역 조성물은 본원에서 논의된 면역 조성물 중 임의의 하나이다. 다양한 구현예에서, 용량은 예방적 유효 또는 치료적 유효 용량이다.
다양한 구현예에서, 면역 조성물은 정맥 내로, 또는 척추강 내로, 피하로, 근육 내로, 피내로 또는 비강 내로 투여된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 비강 내 투여된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물은 점비액 또는 비강 스프레이를 통해 투여된다.
다양한 구현예는 본 발명의 백신 조성물의 용량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 백신 조성물은 본원에서 논의된 백신 조성물 중 임의의 하나이다. 다양한 구현예에서, 면역 반응은 보호 면역 반응이다. 다양한 구현예에서, 용량은 예방적 유효 또는 치료적 유효 용량이다.
다양한 구현예에서, 백신 조성물은 정맥 내로, 또는 경막 내로, 피하로, 근육 내로, 피내로 또는 비강 내로 투여된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물은 비강 내 투여된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물은 점비액 또는 비강 스프레이를 통해 투여된다.
다양한 구현예는 대상체에게 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 용량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 본원에서 논의된 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 중 하나이다. 다양한 구현예에서, 면역 반응은 보호 면역 반응이다. 다양한 구현예에서, 용량은 예방적 유효 또는 치료적 유효 용량이다.
다양한 구현예에서, 용량은 약 103-107 PFU이다. 다양한 구현예에서, 용량은 약 104-106 PFU이다. 다양한 구현예에서, 용량은 약 103 PFU이다. 다양한 구현예에서, 용량은 약 104 PFU이다. 다양한 구현예에서, 용량은 약 105 PFU이다. 다양한 구현예에서, 용량은 약 106 PFU이다. 다양한 구현예에서, 용량은 약 107 PFU이다.
다양한 구현예에서, 용량은 약 5x103 PFU이다. 다양한 구현예에서, 용량은 약 5x104 PFU이다. 다양한 구현예에서, 용량은 약 5x105 PFU이다. 다양한 구현예에서, 용량은 약 5x106 PFU이다. 다양한 구현예에서, 용량은 약 5x107 PFU이다.
다양한 구현예에서, 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 정맥 내로, 또는 척수강매로, 피하로, 근육 내로, 피내로 또는 비강 내로 투여된다. 다양한 구현예에서, 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 비강 내 투여된다. 다양한 구현예에서, 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 점비액 또는 비강 스프레이를 통해 투여된다.
다양한 구현예는 대상체에게 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 프라임 용량을 투여하는 단계; 및 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 1회 이상의 부스트 용량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 본원에서 논의된 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 중 하나이다. 다양한 구현예에서, 용량은 예방적 유효 또는 치료적 유효 용량이다.
다양한 구현예에서, 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 프라임 용량 및/또는 1회 이상의 부스트 용량은 정맥 내로, 또는 척수강매로, 피하로, 근육 내로, 피내로 또는 비강 내로 투여된다. 다양한 구현예에서, 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 프라임 용량 및/또는 1회 이상의 부스트 용량은 비강 내 투여된다. 다양한 구현예에서, 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 프라임 용량 및/또는 1회 이상의 부스트 용량은 점비액 또는 비강 스프레이를 통해 투여된다.
다양한 구현예는 대상체에게 본 발명의 면역 조성물의 프라임 용량을 투여하는 단계; 및 본 발명의 면역 조성물의 1회 이상의 부스트 용량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 면역 조성물은 본원에서 논의된 면역 조성물 중 임의의 하나이다. 다양한 구현예에서, 용량은 예방적 유효 또는 치료적 유효 용량이다.
다양한 구현예에서, 면역 조성물의 프라임 용량 및/또는 1회 이상의 부스트 용량은 정맥 내로, 또는 경막 내로, 피하로, 근육 내로, 피내로 또는 비강 내로 투여된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물의 프라임 용량 및/또는 1회 이상의 부스트 용량은 비강 내 투여된다. 다양한 구현예에서, 면역 조성물의 프라임 용량 및/또는 1회 이상의 부스트 용량은 점비액 또는 비강 스프레이를 통해 투여된다.
다양한 구현예는 대상체에게 본 발명의 백신 조성물의 프라임 용량을 투여하는 단계; 및 본 발명의 백신 조성물의 1회 이상의 부스트 용량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 백신 조성물은 본원에서 논의된 백신 조성물 중 임의의 하나이다. 다양한 구현예에서, 용량은 예방적 유효 또는 치료적 유효 용량이다.
다양한 구현예에서, 백신 조성물의 프라임 용량 및/또는 1회 이상의 부스트 용량은 정맥 내로, 또는 경막 내로, 피하로, 근육 내로, 피내로 또는 비강 내로 투여된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물의 프라임 용량 및/또는 1회 이상의 부스트 용량은 비강 내 투여된다. 다양한 구현예에서, 백신 조성물의 프라임 용량 및/또는 1회 이상의 부스트 용량은 점비액 또는 비강 스프레이를 통해 투여된다.
프라임 투여량과 부스트 투여량 사이의 시기는 예를 들어 감염 또는 질환의 단계 (예를 들어, 비감염, 감염, 감염 후 일수), 및 환자의 건강에 따라 달라질 수 있다. 다양한 구현예에서, 1회 이상의 부스트 용량은 프라임 용량 후 약 2주에 투여된다. 즉, 프라임 용량을 투여하고 약 2주 후에 부스트 용량을 투여한다. 다양한 구현예에서, 1회 이상의 부스트 용량은 프라임 용량 후 약 4주에 투여된다. 다양한 구현예에서, 1회 이상의 부스트 용량은 프라임 용량 후 약 6주에 투여된다. 다양한 구현예에서, 1회 이상의 부스트 용량은 프라임 용량 후 약 8주에 투여된다. 다양한 구현예에서, 1회 이상의 부스트 용량은 프라임 용량 후 약 12주에 투여된다. 다양한 구현예에서, 1회 이상의 부스트 용량은 프라임 용량 후 약 1-12주에 투여된다.
다양한 구현예에서, 1회 이상의 부스트 용량이 하나의 부스트 용량으로 제공될 수 있다. 다른 구현예에서, 1회 이상의 부스트 용량이 주기적으로 부스트 용량으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 분기마다, 4개월마다, 6개월마다, 매년, 2년마다, 3년마다, 4년마다, 5년마다, 6년마다, 7년마다, 8년마다, 9년마다, 또는 10년마다 제공될 수 있다.
다양한 구현예에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 각각 약 103-107 PFU이다. 다양한 구현예에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 각각 약 104-106 PFU이다. 다양한 구현예에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 각각 약 103 PFU이다. 다양한 구현예에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 각각 약 104 PFU이다. 다양한 구현예에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 각각 약 105 PFU이다. 다양한 구현예에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 각각 약 106 PFU이다. 다양한 구현예에서, 용량은 약 107 PFU이다.
다양한 구현예에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 각각 약 5x103 PFU이다. 다양한 구현예에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 각각 약 5x104 PFU이다. 다양한 구현예에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 각각 약 5x105 PFU이다. 다양한 구현예에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 각각 약 5x106 PFU이다. 다양한 구현예에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 각각 약 5x107 PFU이다.
다양한 구현예에서, 프라임 용량 및 부스트 용량에 대한 투여량은 동일하다.
다양한 구현예에서, 투여량은 프라임 투여량과 부스트 투여량 사이에서 변할 수 있다. 비제한적 예로서, 프라임 용량은 부스트 용량과 비교하여 더 적은 수의 바이러스 카피를 포함할 수 있다. 예를 들어, 프라임 용량은 약 103 PFU이고 부스트 용량은 약 104-106 PFU이거나, 프라임 용량은 약 104이고 부스트 용량은 약 105-107 PFU이다.
부스트 용량이 주기적으로 투여되는 다양한 구현예에서, 후속 부스트 용량은 제1 부스트 용량보다 적을 수 있다.
또 다른 비제한적 예로서, 프라임 용량은 부스트 용량과 비교하여 더 많은 바이러스 카피를 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 면역 반응은 보호 면역 반응이다.
다양한 구현예에서, 용량은 예방적 유효 또는 치료적 유효 용량이다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 본 발명의 면역 조성물 또는 본 발명의 백신 조성물의 비강 내 투여는 대상체에게 코를 풀고 머리를 뒤로 기울이도록 지시하는 단계; 선택적으로, 조성물이 코 외부로 또는 목구멍 아래로 떨어지는 것을 피하기 위해 대상체에게 머리의 위치를 변경하도록 지시하는 단계; 투여량을 포함하는 약 0.25mL를 각각의 콧구멍에 투여하는 단계; 대상체에게 부드럽게 코를 스니프(sniff)하도록 지시하는 단계; 대상체에게 일정 시간; 예를 들어 약 60분 동안 코를 풀지 말라고 지시하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체는 임의의 면역억제제를 복용하지 않는다. 다양한 구현예에서, 대상체는 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 본 발명의 면역 조성물 또는 본 발명의 백신 조성물의 투여 약 180일, 150일, 120일, 90일, 75일, 60일, 45일, 30일, 15일 또는 7일 전에 임의의 면역억제 약물을 복용하지 않는다. 다양한 구현예에서, 대상체는 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 본 발명의 면역 조성물 또는 본 발명의 백신 조성물의 투여 후 약 1일, 7일, 14일, 30일, 45일, 60일, 75일, 90일, 120일, 150일, 180일, 9개월, 12개월, 15개월, 18개월, 21개월, 또는 24개월 동안 임의의 면역억제 약물을 복용하지 않는다.
면역억제제 (하기를 포함하지만 이에 제한되지 않음: 코르티코스테로이드 (예를 들어, 프레드니손 (델타손, 오라손), 부데소니드 (엔토코트 EC), 프레드니솔론 (밀리프레드)), 칼시뉴린 억제제 (예를 들어, 사이클로스포린 (네오랄, 샌드뮨, 상시아), 타크로리무스 (아스타그라프 XL, 엔바르수스 XR, 프로그라프), 라파마이신 (mTOR) 억제제의 기계적 표적 (예를 들어, 시롤리무스 (라파무네), 에베롤리무스 (아피니토르, 조트리스)), 이노신 일인산 탈수소효소 (IMDH) 억제제, (예를 들어, 아자티오프린 (아자산, 이무란), 레플루노마이드 (아라바), 미코페놀레이트 (셀셉트, 마이포틱)), 생물학제제 (예를 들어, 아바타셉트 (오렌시아), 아달리무맙 (휴미라), 아나킨라 (키네렛), 세르톨리주맙 (심지아), 에타너셉트 (엔브렐), 골리무맙 (심포니), 인플릭시맙 (레미케이드), 익세키주맙 (탈츠), 나탈리주맙 (티사브리), 리툭시맙 (리툭산), 세쿠키누맙 (코센틱스), 토실리주맙 (악템라), 우스테키누맙 (스텔라라), 베돌리주맙 (엔티비오)), 단일클론 항체 (예를 들어, 바실릭시맙 (시물렉트), 다클리주맙 (진브리타), 무로모나브 (오르토클론 OKT3)).
의학적 용도
본 발명의 다양한 구현예는 면역 반응을 유도하거나, COVID-19의 치료적 또는 예방적 치료를 위해 사용하기 위한 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 본 발명의 백신 조성물, 또는 본 발명의 면역 조성물을 제공한다.
본 발명의 다양한 구현예는 면역 반응을 유도하거나, COVID-19의 치료적 또는 예방적 치료를 위해 사용하기 위한 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 본 발명의 백신 조성물, 또는 본 발명의 면역 조성물을 제공하고, 여기서 용법은 프라임 용량의 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 또는 본 발명의 백신 조성물, 또는 본 발명의 면역 조성물, 및 1회 이상의 부스트 용량의 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 또는 본 발명의 백신 조성물, 또는 본 발명의 면역 조성물을 포함한다.
본 발명의 다양한 구현예는 면역 반응을 유도하거나, COVID-19의 치료적 또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 본 발명의 백신 조성물, 또는 본 발명의 면역 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 다양한 구현예는 면역 반응을 유도하거나, COVID-19의 치료적 또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 본 발명의 백신 조성물, 또는 본 발명의 면역 조성물의 용도를 제공하고, 여기서 의약은 프라임 용량의 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 또는 본 발명의 백신 조성물, 또는 본 발명의 면역 조성물, 및 1회 이상의 부스트 용량의 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 또는 본 발명의 백신 조성물, 또는 본 발명의 면역 조성물을 포함한다.
본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 본원에 논의된 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 중 임의의 하나이다. 본 발명의 백신 조성물은 본원에서 논의된 백신 조성물 중 임의의 하나이다. 본 발명의 면역 조성물은 본원에서 논의된 면역 조성물 중 임의의 하나이다.
다양한 구현예에서, 면역 반응은 보호 면역 반응이다.
제조 방법
다양한 구현예는 하기 단계를 포함하는, 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스를 제조하는 방법을 제공하고: 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 또는 이의 하나 이상의 단편의 하나 이상의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 수득하는 단계; 하나 이상의 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편의 단백질 발현을 감소시키기 위해 뉴클레오티드 서열을 재코딩하는 단계, 및 재코딩된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 게놈으로 치환하여 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 게놈을 제조하는 단계, 여기서 재코딩된 뉴클레오티드 서열의 발현은 모 바이러스에 비해 감소된다.
다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 야생형 (wt) 바이러스 핵산이다. 다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 천연 분리주 바이러스 핵산이다. 다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 이전에 변형된 바이러스 핵산, 또는 이전에 약독화된 바이러스 핵산이다. 다양한 구현예에서, 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 변이체이다.
다양한 구현예에서, 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 게놈의 제조는 클로닝 숙주를 사용하는 것을 포함한다.
다양한 구현예에서, 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 게놈의 제조는 BAC 벡터를 사용하여 감염성 cDNA 클론을 구성하거나, 중첩 확장 PCR 전략 또는 장기 PCR 기반 융합 전략을 사용하는 것을 포함한다.
다양한 구현예에서, 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 게놈은 결실, 치환 및 부가를 포함하는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 하나 이상은 1-5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, 또는 91-100개 돌연변이일 수 있다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 단백질, 또는 이의 하나 이상의 단편의 단백질 발현을 감소시키기 위해 뉴클레오티드 서열을 재코딩하는 것은 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 코돈-쌍 편향 (CPB)을 줄이거나, 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 코돈 사용빈도 편향을 줄이거나, 본원에서 논의되는 바와 같이, 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 CpG 또는 UpA 디-뉴클레오티드의 수를 증가시키는 방식이다.
약독화된 바이러스 생성
본 발명의 다양한 구현예는 바이러스 게놈을 포함하는 벡터로 세포 집단을 형질감염시키는 단계; 세포 배양물에서 세포 집단을 적어도 1회 계대배양하는 단계; 세포 배양물로부터 상청액을 수집하는 단계를 포함하는 약독화물을 생성하는 방법을 제공한다.
다양한 구현예에서, 방법은 상청액을 농축하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 방법은 세포 집단을 2 내지 15회 계대배양하는 단계; 및 세포 집단의 세포 배양물로부터 상청액을 수집하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, 방법은 세포 집단을 2 내지 10회 계대배양하는 단계; 및 세포 집단의 세포 배양물로부터 상청액을 수집하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, 방법은 세포 집단을 2 내지 7회 계대배양하는 단계; 및 세포 집단의 세포 배양물로부터 상청액을 수집하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, 방법은 세포 집단을 2 내지 5회 계대배양하는 단계; 및 세포 집단의 세포 배양물로부터 상청액을 수집하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서 방법은 세포 집단을 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 10회 계대배양하는 단계; 및 세포 집단의 세포 배양물로부터 상청액을 수집하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, 세포 배양물로부터 상청액을 수집하는 단계는 세포 집단의 각 계대 동안 수행된다. 다른 구현예에서, 세포 배양물로부터 상청액을 수집하는 단계는 세포 집단의 하나 이상의 계대 동안 수행된다. 예를 들어, 다른 계대마다, 두 계대마다, 세 계대마다 등 할 수 있다.
키트
본 발명은 또한 대상체에게 백신을 접종하거나, 대상체에서 면역 반응을 유도하거나, 보호 면역 반응을 유도하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 면역 반응을 유도하거나 보호 면역 반응을 유도하는 본 발명의 방법을 실행하는데 유용하다. 키트는 본 발명의 조성물 중 하나 이상을 포함하는 재료 또는 구성요소의 집합체이다. 따라서, 일부 구현예에서 키트는 본원에서 논의된 변형된 SARS-CoV-2 바이러스 중 임의의 하나, 본원에서 논의된 면역 조성물 중 임의의 하나, 또는 본 발명의 본원에서 논의된 백신 조성물 중 임의의 하나를 포함하는 조성물을 함유한다. 따라서, 일부 구현예에서 키트는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 면역 조성물, 또는 백신 조성물을 포함하는 조성물의 단위화된 단일 투여량을 함유하고; 예를 들어, 각 바이알은 약 103-107 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 또는 더 구체적으로, 104-106 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 104 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 105 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 또는 106 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스; 또는 더 구체적으로, 5x104-5x106 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 5x104 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 5x105 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 또는 5x106 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스의 용량에 충분히 함유한다. 다양한 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 면역 조성물, 또는 백신 조성물을 포함하는 조성물의 다중 투여량을 함유하고; 예를 들어, 키트가 바이알당 10회 투여량을 포함하는 경우, 각 바이알은 약 10 x 103-107 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 또는 더 구체적으로, 10 x 104-106 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 10 x 104 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 10 x 105 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 또는 10 x 106 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 또는 더 구체적으로, 50x104-50x106 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 50x104 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 50x105 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 또는 50x106 PFU의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스를 함유한다.
본 발명의 키트에 구성된 구성요소의 정확한 특성은 의도된 목적에 따라 다르다. 예를 들어, 일부 구현예는 대상체에게 백신을 접종할 목적으로, 면역 반응을 유도하거나 대상체에서 보호 면역 반응을 유도하도록 구성된다. 한 구현예에서, 키트는 특히 포유동물 대상체를 예방적으로 치료할 목적으로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 키트는 특히 인간 대상체를 예방적으로 치료할 목적으로 구성된다. 추가 구현예에서, 키트는 농장 동물, 가축, 및 실험 동물과 같지만 이에 제한되지 않는 대상체를 치료하는 수의학적 적용을 위해 구성된다.
사용 지침이 키트에 포함될 수 있다. "사용 지침"은 일반적으로 대상체에게 백신 접종을 하거나, 대상체에서 면역 반응을 유도하거나, 보호 면역 반응을 유도하는 것과 같이 원하는 결과에 영향을 미치기 위해 키트의 구성 요소를 사용하는 데 사용되는 기술을 설명하는 유형의 표현을 포함한다. 예를 들어, 비강 투여의 경우, 사용 지침은 대상체에게 코를 풀고 머리를 뒤로 기울이라는 지침, 조성물이 코 외부 또는 아래로 떨어지는 것을 방지하기 위해 머리를 재위치하라는 지침, 각 콧구멍으로의 투여량을 포함하는 약 0.25mL를 투여하기 위한 지침; 대상체에게 부드럽게 코를 스니프하도록 하는 지침 및/또는 일정 기간; 예를 들어, 약 60분 동안 코를 풀지 않도록 하는 지침을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 추가 지침에는 대상에 대한 면역억제제를 복용하지 말라는 지침이 포함될 수 있다.
선택적으로 키트는 희석제, 완충제, 약학적으로 허용 가능한 담체, 주사기, 점적기, 카테터, 도포기, 피펫팅 또는 측정 도구, 붕대 재료 또는 당업자가 쉽게 인식할 수 있는 기타 유용한 도구와 같은 기타 유용한 구성요소도 함유한다.
키트에 조립된 재료 또는 구성요소는 조작성과 유용성을 보존하는 편리하고 적절한 방식으로 보관된 의사에게 제공될 수 있다. 예를 들어, 구성요소는 용해, 탈수 또는 동결건조된 형태일 수 있고; 이들은 실온, 냉장 또는 냉동 온도에서 제공될 수 있다. 구성요소는 일반적으로 적절한 패키징 재료(들)에 함유된다. 본원에 사용된 바와 같이, 문구 "패키징 재료"는 본 발명의 조성물 등과 같은 키트의 내용물을 수용하는데 사용되는 하나 이상의 물리적 구조를 지칭한다. 패키징 재료는 알려진 방법으로 구성되며, 바람직하게는 무균, 무오염 환경을 제공한다. 키트에 사용된 패키징 재료는 백신에 일반적으로 사용되는 포장재이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "패키지"는 개별 키트 구성요소를 보유할 수 있는 적합한 유리, 플라스틱, 종이, 호일 등과 같은 고체 매트릭스 또는 재료를 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 패키지는 본원에 기술된 본 발명의 변형된 SARS-CoV-2 바이러스, 면역 조성물, 또는 백신 조성물을 함유하는 적합한 양의 본 발명의 조성물을 함유하는 데 사용되는 유리 바이알일 수 있다. 패키징 재료는 일반적으로 키트 및/또는 구성요소의 내용물 및/또는 목적을 나타내는 외부 표지가 있다.
서열
서열 번호 2 - BsaI 및 BsmBI 부위를 녹아웃; 기존 BsaI를 녹아웃: a17973g (Arg AGA에서 AGG로), c24106 t (Asp GAC에서 GAT로); 기존 BsmBI 부위를 녹아웃: c2197t (Asp GAC에서 GAT로), a9754g (Arg AGA에서 AGG로), g17331a (Glu GAG에서 GAA로) 시키도록 변형된, 제한 부위-변형된 참조 서열
ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAACTTTAAAATCTGTGTGGCTGTCACTCGGCTGCATGCTTAGTGCACTCACGCAGTATAATTAATAACTAATTACTGTCGTTGACAGGACACGAGTAACTCGTCTATCTTCTGCAGGCTGCTTACGGTTTCGTCCGTGTTGCAGCCGATCATCAGCACATCTAGGTTTCGTCCGGGTGTGACCGAAAGGTAAGATGGAGAGCCTTGTCCCTGGTTTCAACGAGAAAACACACGTCCAACTCAGTTTGCCTGTTTTACAGGTTCGCGACGTGCTCGTACGTGGCTTTGGAGACTCCGTGGAGGAGGTCTTATCAGAGGCACGTCAACATCTTAAAGATGGCACTTGTGGCTTAGTAGAAGTTGAAAAAGGCGTTTTGCCTCAACTTGAACAGCCCTATGTGTTCATCAAACGTTCGGATGCTCGAACTGCACCTCATGGTCATGTTATGGTTGAGCTGGTAGCAGAACTCGAAGGCATTCAGTACGGTCGTAGTGGTGAGACACTTGGTGTCCTTGTCCCTCATGTGGGCGAAATACCAGTGGCTTACCGCAAGGTTCTTCTTCGTAAGAACGGTAATAAAGGAGCTGGTGGCCATAGTTACGGCGCCGATCTAAAGTCATTTGACTTAGGCGACGAGCTTGGCACTGATCCTTATGAAGATTTTCAAGAAAACTGGAACACTAAACATAGCAGTGGTGTTACCCGTGAACTCATGCGTGAGCTTAACGGAGGGGCATACACTCGCTATGTCGATAACAACTTCTGTGGCCCTGATGGCTACCCTCTTGAGTGCATTAAAGACCTTCTAGCACGTGCTGGTAAAGCTTCATGCACTTTGTCCGAACAACTGGACTTTATTGACACTAAGAGGGGTGTATACTGCTGCCGTGAACATGAGCATGAAATTGCTTGGTACACGGAACGTTCTGAAAAGAGCTATGAATTGCAGACACCTTTTGAAATTAAATTGGCAAAGAAATTTGACACCTTCAATGGGGAATGTCCAAATTTTGTATTTCCCTTAAATTCCATAATCAAGACTATTCAACCAAGGGTTGAAAAGAAAAAGCTTGATGGCTTTATGGGTAGAATTCGATCTGTCTATCCAGTTGCGTCACCAAATGAATGCAACCAAATGTGCCTTTCAACTCTCATGAAGTGTGATCATTGTGGTGAAACTTCATGGCAGACGGGCGATTTTGTTAAAGCCACTTGCGAATTTTGTGGCACTGAGAATTTGACTAAAGAAGGTGCCACTACTTGTGGTTACTTACCCCAAAATGCTGTTGTTAAAATTTATTGTCCAGCATGTCACAATTCAGAAGTAGGACCTGAGCATAGTCTTGCCGAATACCATAATGAATCTGGCTTGAAAACCATTCTTCGTAAGGGTGGTCGCACTATTGCCTTTGGAGGCTGTGTGTTCTCTTATGTTGGTTGCCATAACAAGTGTGCCTATTGGGTTCCACGTGCTAGCGCTAACATAGGTTGTAACCATACAGGTGTTGTTGGAGAAGGTTCCGAAGGTCTTAATGACAACCTTCTTGAAATACTCCAAAAAGAGAAAGTCAACATCAATATTGTTGGTGACTTTAAACTTAATGAAGAGATCGCCATTATTTTGGCATCTTTTTCTGCTTCCACAAGTGCTTTTGTGGAAACTGTGAAAGGTTTGGATTATAAAGCATTCAAACAAATTGTTGAATCCTGTGGTAATTTTAAAGTTACAAAAGGAAAAGCTAAAAAAGGTGCCTGGAATATTGGTGAACAGAAATCAATACTGAGTCCTCTTTATGCATTTGCATCAGAGGCTGCTCGTGTTGTACGATCAATTTTCTCCCGCACTCTTGAAACTGCTCAAAATTCTGTGCGTGTTTTACAGAAGGCCGCTATAACAATACTAGATGGAATTTCACAGTATTCACTGAGACTCATTGATGCTATGATGTTCACATCTGATTTGGCTACTAACAATCTAGTTGTAATGGCCTACATTACAGGTGGTGTTGTTCAGTTGACTTCGCAGTGGCTAACTAACATCTTTGGCACTGTTTATGAAAAACTCAAACCCGTCCTTGATTGGCTTGAAGAGAAGTTTAAGGAAGGTGTAGAGTTTCTTAGAGAtGGTTGGGAAATTGTTAAATTTATCTCAACCTGTGCTTGTGAAATTGTCGGTGGACAAATTGTCACCTGTGCAAAGGAAATTAAGGAGAGTGTTCAGACATTCTTTAAGCTTGTAAATAAATTTTTGGCTTTGTGTGCTGACTCTATCATTATTGGTGGAGCTAAACTTAAAGCCTTGAATTTAGGTGAAACATTTGTCACGCACTCAAAGGGATTGTACAGAAAGTGTGTTAAATCCAGAGAAGAAACTGGCCTACTCATGCCTCTAAAAGCCCCAAAAGAAATTATCTTCTTAGAGGGAGAAACACTTCCCACAGAAGTGTTAACAGAGGAAGTTGTCTTGAAAACTGGTGATTTACAACCATTAGAACAACCTACTAGTGAAGCTGTTGAAGCTCCATTGGTTGGTACACCAGTTTGTATTAACGGGCTTATGTTGCTCGAAATCAAAGACACAGAAAAGTACTGTGCCCTTGCACCTAATATGATGGTAACAAACAATACCTTCACACTCAAAGGCGGTGCACCAACAAAGGTTACTTTTGGTGATGACACTGTGATAGAAGTGCAAGGTTACAAGAGTGTGAATATCACTTTTGAACTTGATGAAAGGATTGATAAAGTACTTAATGAGAAGTGCTCTGCCTATACAGTTGAACTCGGTACAGAAGTAAATGAGTTCGCCTGTGTTGTGGCAGATGCTGTCATAAAAACTTTGCAACCAGTATCTGAATTACTTACACCACTGGGCATTGATTTAGATGAGTGGAGTATGGCTACATACTACTTATTTGATGAGTCTGGTGAGTTTAAATTGGCTTCACATATGTATTGTTCTTTCTACCCTCCAGATGAGGATGAAGAAGAAGGTGATTGTGAAGAAGAAGAGTTTGAGCCATCAACTCAATATGAGTATGGTACTGAAGATGATTACCAAGGTAAACCTTTGGAATTTGGTGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTACTATTCAAACAATTGTTGAGGTTCAACCTCAATTAGAGATGGAACTTACACCAGTTGTTCAGACTATTGAAGTGAATAGTTTTAGTGGTTATTTAAAACTTACTGACAATGTATACATTAAAAATGCAGACATTGTGGAAGAAGCTAAAAAGGTAAAACCAACAGTGGTTGTTAATGCAGCCAATGTTTACCTTAAACATGGAGGAGGTGTTGCAGGAGCCTTAAATAAGGCTACTAACAATGCCATGCAAGTTGAATCTGATGATTACATAGCTACTAATGGACCACTTAAAGTGGGTGGTAGTTGTGTTTTAAGCGGACACAATCTTGCTAAACACTGTCTTCATGTTGTCGGCCCAAATGTTAACAAAGGTGAAGACATTCAACTTCTTAAGAGTGCTTATGAAAATTTTAATCAGCACGAAGTTCTACTTGCACCATTATTATCAGCTGGTATTTTTGGTGCTGACCCTATACATTCTTTAAGAGTTTGTGTAGATACTGTTCGCACAAATGTCTACTTAGCTGTCTTTGATAAAAATCTCTATGACAAACTTGTTTCAAGCTTTTTGGAAATGAAGAGTGAAAAGCAAGTTGAACAAAAGATCGCTGAGATTCCTAAAGAGGAAGTTAAGCCATTTATAACTGAAAGTAAACCTTCAGTTGAACAGAGAAAACAAGATGATAAGAAAATCAAAGCTTGTGTTGAAGAAGTTACAACAACTCTGGAAGAAACTAAGTTCCTCACAGAAAACTTGTTACTTTATATTGACATTAATGGCAATCTTCATCCAGATTCTGCCACTCTTGTTAGTGACATTGACATCACTTTCTTAAAGAAAGATGCTCCATATATAGTGGGTGATGTTGTTCAAGAGGGTGTTTTAACTGCTGTGGTTATACCTACTAAAAAGGCTGGTGGCACTACTGAAATGCTAGCGAAAGCTTTGAGAAAAGTGCCAACAGACAATTATATAACCACTTACCCGGGTCAGGGTTTAAATGGTTACACTGTAGAGGAGGCAAAGACAGTGCTTAAAAAGTGTAAAAGTGCCTTTTACATTCTACCATCTATTATCTCTAATGAGAAGCAAGAAATTCTTGGAACTGTTTCTTGGAATTTGCGAGAAATGCTTGCACATGCAGAAGAAACACGCAAATTAATGCCTGTCTGTGTGGAAACTAAAGCCATAGTTTCAACTATACAGCGTAAATATAAGGGTATTAAAATACAAGAGGGTGTGGTTGATTATGGTGCTAGATTTTACTTTTACACCAGTAAAACAACTGTAGCGTCACTTATCAACACACTTAACGATCTAAATGAAACTCTTGTTACAATGCCACTTGGCTATGTAACACATGGCTTAAATTTGGAAGAAGCTGCTCGGTATATGAGATCTCTCAAAGTGCCAGCTACAGTTTCTGTTTCTTCACCTGATGCTGTTACAGCGTATAATGGTTATCTTACTTCTTCTTCTAAAACACCTGAAGAACATTTTATTGAAACCATCTCACTTGCTGGTTCCTATAAAGATTGGTCCTATTCTGGACAATCTACACAACTAGGTATAGAATTTCTTAAGAGAGGTGATAAAAGTGTATATTACACTAGTAATCCTACCACATTCCACCTAGATGGTGAAGTTATCACCTTTGACAATCTTAAGACACTTCTTTCTTTGAGAGAAGTGAGGACTATTAAGGTGTTTACAACAGTAGACAACATTAACC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서열 번호 3 - 탈최적화된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 (Wuhan-CoV_101K) (BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019를 참조하여 탈최적화). 탈최적화된 영역: 11294-12709, 14641-15903 (nsp12 (예를 들어, RNA-의존성 RNA 중합효소 "RdRP") 도메인), 21656-22306 (스파이크 시작), 22505-23905 (스파이크 중간), 24110-25381 (스파이크 말단).
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서열 번호 4 (스파이크 단백질에 36개 뉴클레오티드 결실이 있는, 워싱턴 분리주 (GenBank: MN985325.1)를 참조하여 탈최적화).
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다양한 구현예에서, 서열 번호 4와 관련하여, 돌연변이는 3009 T에서 A로 (Ile에서 Lys로): [3009 : 3009]; 9199 C에서 T 침묵으로: [9199 : 9199]; 11524 C에서 T 침묵으로: [11524 : 11524]; 16388 G에서 A로 (Ser에서 Asn으로): [16388 : 16388]; 21846 t에서 C로 (Ile에서 Thr로): [21846 : 21846]; 22296 g에서 A로 (Arg에서 His로): [22296 : 22296]; 24201 T에서 C로 (Val에서 Ala로): [24237 : 24237]; 및/또는 actaattctcctcggcgggcacgtagtgtagctagt (서열 번호 5)의 36 nt 추가: [23594]에서 발생한다.
서열 번호 6 (USA/WA1/2020 야생형 스파이크와 비교하여 재코딩된 스파이크 단백질).
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASIEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALRRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGVALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
서열 번호 7 - (탈최적화된 SARS-CoV-2); 29853bp, 푸린 절단 부위 제거됨
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실시예
다음 실시예는 청구된 발명을 더 잘 설명하기 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 특정 물질이 언급된 범위 내에서, 이는 단지 예시를 위한 것이며 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 능력을 행사하지 않고 동등한 수단 또는 반응물을 개발할 수 있다.
실시예 1
중첩 PCR
단계 1: PCR 및 겔 정제. 프라이머 및 주형. T7 프로모터로부터 시작
단편 0에 pCMV를 포함하기 위해
단계 2: 중첩 PCR
먼저 4-5개 조각을 중첩시켜야 할 수 있다 - 생성물을 정제한 다음 - 전장 게놈을 얻기 위해 중첩시킨다.
단계 3:
옵션 1: 시험관 내 전사에 직접 사용 / 중첩 PCR 생성물로서 저장;
옵션 2: pCC1BAC 벡터로 클로닝
CoV 게놈을 pCC1BAC 벡터로 클로닝하기 위해, #1883 및 1890을 단편0 및 단편 19를 증폭하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머로 사용하고, 뿐만 아니라 중첩 후 최종 증폭한다. NEB 골든 게이트 조립을 사용하여 pCC1BAC를 운반하는 Bsa I로 조립.
Bsa I 부위를 통해 (골든 게이트 클론 키트부터) pGGA 벡터로 클로닝한 다음, Bsa I 부위를 통해 pCC1BAC 벡터로 클로닝
기존 pCC1-CysS-CD 플라스미드로부터 얻은 pCC1BAC 및 변경 필요 - "pCC1BAC 변경" 참조
단계 1: PCR 및 겔 정제
프라이머 및 주형 - T7 프로모터로부터 시작하기 위해
정렬된 단편 0에서 pCMV를 포함하기 위해
단계 2: NEB 골든 게이트 조립 키트를 사용하여 바이러스 게놈을 4개의 큰 단편으로 pGGA로 조립
단편 0 (또는 1)-4, 5-9, 10-14 및 15-19.
NEB 골든 게이트 조립 키트 메뉴를 따른다
단계 3 다음 단계 조립을 위한 pGGA 클론의 PCR 바이러스 단편 (또한 새로운 Bsa I 부위 도입)
단계 3.1: PCR를 통한 Bsa I 재도입 및 겔 정제 (개별)
단계 3.2 NEB 골든 게이트 조립 키트를 사용하여 4개의 큰 단편을 pCC1BAC로 조립
모든 단편을 pCC1BAC 벡터로 직접 조립
단계 1: PCR 및 겔 정제
단계 2: NEB 골든 게이트 조립 키트 메뉴에 따라 pCC1BAC 벡터에서 전체 바이러스 게놈 조립
NEBuilder HiFi DNA 조립
단계 1: PCR 및 겔 정제. 실시예 1과 동일. 단편 0 및 단편 19의 경우, pCC1BAC의 5' 및 3' 말단 및 PCR에 대체 프라이머를 사용해야 한다.
pCC1BAC와 바이러스 게놈 간 교차의 경우
5' 교차
3' 교차
단계 2: NEBuilder HiFi 메뉴를 따라 조립
pCC1BAC 벡터의 변형. pCC1BAC가 pCC1-CysS-CD 플라스미드로부터 얻은 경우 백본. 내부 Bsa I 및 Bsm BI 부위를 운반한다. 이 변형은 이러한 부위를 제거하는 것이다. 또한 2 Not I 부위와 nt8104-8139(?) 사이 영역을 제거한다.
단계 1: PCR 및 겔 정제
* 다음 조립 단계를 용이하게 하려면, 1851 또는 1852 대신에 1893, 1861 대신에 1894를 사용할 수 있다.
단계 2: 중첩 PCR. 이 방법의 경우 - NEBuilder, 대체 프라이머를 사용한다.
실시예 2
절차
RT-PCR
코로나바이러스 균주 2019-nCoV/USA-WA1/2020 ("WA1") (BEI Resources NR-52281, 로트 70034262)은 CDC의 베로 (CCL81)에 대한 3 계대와 BEI의 베로 E6에 대한 1 계대 후에 BEI Resources에 의해 배포되었다. 4 계대 후 전체 바이러스 게놈 서열은 CDC에 의해 결정되었으며 그것이 유래된 임상 표본 (GenBank 수탁 MN985325)과 비교하여 뉴클레오티드 차이가 없는 것으로 밝혀졌다 (Harcourt et al., 2020). 수령 즉시, WA1을 37℃에서 2% FBS를 함유하는 DMEM의 베로 E6 세포에 대한 추가 2 계대로 증폭시켰다.
표준 프로토콜에 따라 트리졸 시약 (Thermo Fisher)으로 추출하여 바이러스 게놈 RNA를 정제하기 위해 계대 6 WA1 바이러스를 사용했다. 간단히 말해서, 1x 10^7 PFU/ml의 역가를 갖는 0.5ml 바이러스 샘플을 동일한 부피의 트리졸로 추출하였다. 절차는 이전에 SARS-CoV2 바이러스 감염성을 완전히 비활성화하기 위한 4개의 개별 실험에서 검증되었다. 0.1ml 클로로포름을 첨가하여 상 분리한 후, 수성 상의 RNA를 동일한 부피의 이소프로판올로 침전시켰다. 침전된 RNA를 70% 에탄올로 세척하고, 건조하고, 20ul RNA 분해효소가 없는 물에 재현탁시켰다.
바이러스 cDNA 생성
야생형 cDNA를 SuperScript IV First Strand 합성 시스템을 사용하여 합성하였다. 각 반응에서, 튜브 #1에 대한 총 반응 부피는 13 μl로 다음과 같이 설정되었다:
1. 50μM 올리고 d(T)20: 1ul
2. 50ng/μl 임의의 6량체: 1μl
3. 10mM dNTP: 1μl
4. WT RNA: 2-10 μl
5. H2O: 13μl로 첨가
샘플을 혼합하고 65℃에서 5분 동안 배양한 다음, 즉시 얼음 위에 1분 동안 두었다. 총 반응 부피가 7 μl인 또 다른 튜브 (튜브 #2)를 준비했다:
1. 5x 완충액: 4μl
2. 100mM DTT: 1μl
3. Rnase 억제제 (40U/μl): 1μl
4. SuperScript IV 효소: 1μl
튜브 #1과 튜브 #2를 총 반응 부피가 20μl 가 되도록 혼합하고, 23℃에서 10분, 50℃에서 50분, 그리고 80℃에서 10분간 배양하여 cDNA를 생성했다.
중첩 중합효소 연쇄 반응
Q5 High-Fidelity 2x 마스터 혼합물 (NEB, Ipswich, Massachusetts)을 사용하여 cDNA에서 게놈 단편을 증폭했다.
새로 만든 cDNA 1 μl, 0.5 μM 농도의 정방향 및 역방향 프라이머 (표 4에 상세히 나옴) 1 μl, 10 μl의 2x Q5 마스터 혼합물 및 H2O를 함유하는 20 μl 반응물. 반응 매개변수는 다음과 같다: 반응 개시 98℃ 30초, 이어서 30주기의 10초 동안 98℃, 30초 동안 60℃, 및 1분 동안 65℃ 및 65℃에서 5분 동안 최종 확장. 총 19개의 게놈 단편, 단편 19 (약 1.2 Kb)을 제외하고 모두 약 1.8Kb가 얻어졌으며, 이는 특정 프라이머를 사용하여 이들 중 임의의 두 개 사이에 200bp 중첩 영역이 있는 전체 바이러스 게놈을 포함한다 (표 4). 앰플리콘은 아가로스 겔 전기영동 (도 2a)으로 확인하고 QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 정제했다. 용출은 Nanodrop으로 정량화했다.
Q5® High-Fidelity DNA 중합효소 (NEB, Ipswich, Massachusetts)를 사용하여 전체 COVID-19 게놈을 재구성했다.
우선, 전체 게놈을 재구성하기 위해 모든 19개의 게놈 단편을 모두 중첩 반응에 사용하였다. 간단히 말해서, 30-40 ng의 각 DNA 단편 (모든 조각의 몰 비율은 1:1임), 10μl 5x 반응 완충액, 1μl 10mM dNTP, 0.5μl Q5 중합효소 및 H2O를 최종 부피 50 μl 가 되도록 혼합한다. 반응은 하기 조건에서 수행하였다: 30초 동안 98℃, 및 72℃에서 16분 30초, 10주기.
다음으로, 2μl 중첩 반응 생성물을 4μl 5x 반응 완충액, 1μl 10mM dNTP, 0.5 μM인 1 μl의 각 측방 프라이머, 0.2μl Q5 중합효소 및 H2O와 혼합하여 최종 부피가 20 μl가 되도록 하고 PCR을 다음과 같이 수행하였다: 반응 개시를 위해 98℃ 30초, 이어서 15주기의 10초 동안 98℃, 45초 동안 60℃, 및 16분 30초 동안 72℃, 및 65℃에서 5초간 최종 연장. 결과를 확인하기 위해, 5μl PCR 생성물을 0.4% 아가로스 겔에서 시각화했다 (도 2b).
표 4
시험관 내 전사
전장 PCR로부터 증폭된 DNA 주형은 RNA 작업 전에 3M 아세트산나트륨의 존재하에 에탄올 침전에 이어 기존의 페놀/클로로포름 추출을 사용하여 정제되었다. 일부 수정과 함께 제조업체의 지침에 따라 HiScribe T7 전사 키트 (New England Biolabs)를 사용하여 RNA 전사체를 시험관 내에서 합성했다. 20 μl 반응은 500 ng DNA 주형 및 2.4 μl 50 mM GTP를 첨가하여 설정되었다 (cap 아날로그 대 -GTP 비율은 1:1임). 반응물을 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 그런 다음 RNA를 침전시키고 염화리튬 침전에 의해 정제하고 70% 에탄올로 1회 세척하였다. N 유전자 DNA 주형은 또한 특정 정방향 프라이머 (2320-N-F: GAAtaatacgactcactataggGACGTTCGTGTTGTTTTAGATTTCATCTAAACG (서열 번호 162)를 사용하여 cDNA로부터 PCR에 의해 제조되었으며, 소문자 서열은 T7 프로모터를 나타내고; 밑줄 친 서열은 N 유전자 ORF의 5' NTR 업스트림) 및 역방향 프라이머 (2130-N-R, tttttttttttttttttttttGTCATTCTCCTAAGAAGCTATTAAAATCACATGG (서열 번호 163))를 나타낸다.
RNA 전기천공법에 의한 베로 E6 세포의 형질감염
베로 E6 세포는 ATTC (CRL-1586)에서 얻었고 10% FBS가 보충된 DMEM 고 포도당에서 유지되었다. 바이러스 RNA를 형질감염시키기 위해, 10μg의 정제된 전장 게놈 RNA 전사체와 5ug의 캡핑된 WA1-N mRNA를 제조사의 지침에 따라 Maxcyte ATX 시스템을 사용하여 베로 E6 세포에 전기천공하였다. 간단히 말해서, 3-4 x 106 베로 E6 세포를 Maxcyte 전기천공 완충액에서 한 번 세척하고 동일한 100 μl에 재현탁했다. 세포 현탁액을 RNA 샘플과 부드럽게 혼합하고, RNA/세포 혼합물을 Maxcyte OC-100 처리 어셈블리로 옮겼다. 사전 프로그래밍된 베로 세포 전기천공 프로토콜을 사용하여 전기천공을 수행했다. 37C/5%CO2에서 형질감염된 세포를 30분 회수한 후, 세포를 따뜻한 DMEM/10% FBS에 재현탁하고 다양한 접종 밀도 (전체 세포의 1/2, 1/3, 1/6)에서 3개의 T25 플라스크에 분배했다. 형질감염된 세포를 37℃/5%CO2에서 6일 동안 또는 CPE가 나타날 때까지 배양했다. 감염 배지를 2일, 4일 및 6일에 수집하고 2일 및 4일에 완전히 배지를 교체했다 (DMEM/5%FBS). 생성된 바이러스는 4-6일 사이에 최대 바이러스 생성으로 형질감염 후 2일 만에 플라크 분석에 의해 검출할 수 있었다.
스톡 바이러스의 계대 및 베로 E6 세포에서 SARS-CoV-2의 플라크 적정
연속 10배 희석액을 DMEM/2%FBS에서 제조하였다. 0.5ml의 각 희석액을 80% 융합성인 베로 E6 세포의 12-웰에 첨가했다. 37℃에서 1시간 배양한 후, 접종물을 제거하고, 1x DMEM, 0.3% 검 트라간트, 2% FBS 및 1x 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는, 2 ml의 반고체 오버레이를 웰당 추가했다. 37℃/5%CO2에서 3 또는 4일 배양 후, 오버레이를 제거하고, PBS로 웰을 부드럽게 헹군 다음 고정하고 크리스탈 바이올렛으로 염색했다.
시험관 내 전사에서 얻은 RNA는 wt WA1 및 CDX-005로 베로 E6 세포를 형질감염시키고 베로 E6 세포에서 적정된 살아있는 바이러스를 회수하는 데 사용되었다. 3일 동안 배양한 후, 플라크 검정을 염색하였다.
다단계 바이러스 성장 역학
베로 세포 (WHO 10-87)는 거의 포화 상태에 도달할 때까지 5% 소 태아 혈청 (FBS)이 포함된 1ml DMEM을 함유하는 12 웰 플레이트에서 3일 동안 성장되었다. 감염 전에, 사용된 세포 배양 배지를 1% FBS 및 30 PFU의 표시된 바이러스 (0.0001 MOI)를 함유하는 0.5ml의 신선한 DMEM으로 교체했다. 33℃ 또는 37℃/5% CO2에서 1시간 배양 후, 접종물을 버리고, 세포 단층을 1ml 둘베코 PBS로 한 번 세척한 다음, 1% FBS를 함유하는 1ml DMEM를 첨가하였다. 감염된 세포를 0, 6, 24, 48, 또는 72시간 동안 33℃ 또는 37℃에서 배양했다. 표시된 시점에서, 세포 및 상청액을 수집하고 (시점당 하나의 웰), -80C에서 1회 동결 및 해동하였다. 용해물의 감염성 바이러스 역가는 37℃에서 베로 E6의 플라크 검정에 의해 결정되었다.
결과
개별 게놈 단편 1-19의 생성 및 중첩 PCR에 의해 생성된 전체 게놈 DNA는 0.4% 아가로스 겔에서 볼 수 있는 명확한 밴드와 함께 잘 진행되었다 (도 2a).
시험관 내 전사는 베로 E6 세포를 S-WWW (WT) 및 S-WWD로 형질감염시키고 베로 E6 세포에서 적정된 살아있는 바이러스를 회수하는 데 사용되는 RNA를 생성했다. 3일 동안 배양한 후, 플라크 검정을 염색하였고 부분적으로 스파이크가 탈최적화된 S-WWD 후보에서 관찰된 더 작은 플라크 (도 3)와 40% 감소된 최종 역가를 관찰했다.
실시예 3
CDX-005 프리마스터 바이러스 시드 (preMVS)는 다음과 같이 개발되었다: SARS-COV-2 BetaCoV/USA/WA1/2020 (GenBank: MN985325.1)의 RNA를 감염된, 특성화된 베로 E6 세포 (ATCC CRL-1586 로트 # 70010177)로부터 추출하고 시판되는 시약 및 키트를 사용하여 RT-PCR로 19개의 중첩 DNA 단편으로 전환하였다. 중첩 PCR을 사용하여 19개의 1.8kb wt 게놈 단편을 하나의 탈최적화된 스파이크 유전자 카세트와 함께 스티칭했다. 구체적으로, 스파이크 ORF의 1,272개 뉴클레오티드는 게놈 위치 24115-25387에서 탈최적화된 인간 코돈 쌍으로 모 WA1/2020 바이러스에 비해 283개의 침묵 돌연변이가 발생했다. 생성된 전장 cDNA는 전장 바이러스 RNA를 만들기 위해 시험관 내에서 전사되었다. 바이러스 회복은 2020년 4월에 처음으로 위임된 스토니 브룩 대학교 (NY)의 새로운 BSL-3 실험실에서 수행되었고, 본 발명자의 프로젝트느 실험실에서 발생한 유일한 프로젝트이다. 그런 다음 이 바이러스 RNA를 특성화된 베로 E6 세포 (로트 # 70010177)에 전기천공하였다. 이는 CDX-005 바이러스 (도 3)를 생성하였으며, 이 바이러스는 베로 E6 세포에서 추가로 계대되어 계대 1, P1 (로트 # 1-060820-9-1)이 생성되었다. P1 물질을 아래에 설명된 햄스터 연구에 사용하였다.
실시예 4
GMP에 진입하기에 적합한 시드 바이러스 (preMVS)를 생산하기 위해, P1 로트는 Codagenix에서 뉴질랜드에서 공급된 적격한 2% 소 태아 혈청(FBS)으로 보충된 특성화된 10-87 WHO 베로 세포 (로트: 563173-MCB1, COA 및 특성화 테스트)에서 계대되었다. 생성된 바이러스를 원심분리에 의해 정화하고 멸균 여과하고 2 ml 냉동 바이알에 충전하여 5x105 2.6x106 pfu/ml의 역가를 갖는 preMVS (로트 # 1-061720-1)를 생성했다. preMVS는 BSL3에 따른 무균 및 마이코플라스마 검사를 위해 BioReliance (Glasgow, UK)로 보내진다. 또한, 1-061720-1을 생산한 베로 배양물을 추가 2일 동안 성장시켜 완전한 세포변성 효과를 낸 다음 바이알에 넣어 Charles River Laboratories, Malvern, PA, USA (표 5)에서 유인원, 인간, 돼지 및 소 바이러스를 포함한 포괄적인 분자 기반 외래성 바이러스 검사를 수행한다.
표 5. CDX-005 preMVS에 대한 외래성 바이러스 검사 패널.
마스터 시드 바이러스 (MSV)를 1상 시험 물질로 사용하고 cGMP로 제조된다. CDX-005는 베로 (ATCC CCL-81) 세포주에서 생산될 예정이며, 적격한 방법을 사용하여 시험하고 임상 시험을 위한 제품을 출시한다. CDX-005에 대한 제형은 안정성과 안전성을 제공하는 것으로 나타난 3상 시험에서 비강 내, 약독화 생 인플루엔자 백신에 사용되었다. 제조 공정은 하기와 같다.
CDX-005 제조 공정
실시예 5A
COVID-19 모델링에 대한 WHO 임시 전문가 워킹 그룹은 붉은 털 원숭이와 흰 족제비 모두 경증에서 중등도의 인간 질환을 재현하는 것으로 보이지만 더 최근의 연구 (Chan, Sia)가 시리아 골든 햄스터가 이 감염의 더 심각한 폐 증상을 복제하기에 더 유용한 모델일 수 있음을 시사하는 것으로 결론을 내렸다.
CDX-005의 생체 내 특성을 조사하기 위해 본 발명자는 시리아 골든 햄스터로 눈을 돌렸다. 현재 동물 모델에 대한 최근 조사는 이 햄스터가 인간 COVID-19 질환의 특성을 가장 잘 요약한다는 것을 나타낸다. SARS-CoV-2는 햄스터 폐에서 효율적으로 복제되어 비강 감염 후 심각한 병리학적 병변을 일으킨다. 바이러스 항원은 SARS-CoV-2 접종 후 2차 및 5일차에 비점막, 기관지 상피 및 폐 경화 부위에 존재하며, 이는 7일차에 제거된다. 임상 징후는 빠른 호흡, 체중 감소, 폐/기도의 조직병리학적 변화, 장 침범, 비장 및 림프구 위축, 바이러스 챌린지 1주일 이내에 사이토카인 활성화를 포함한다. 감염된 햄스터는 같은 케이지에 수용된 다른 햄스터를 감염시킬 수 있으며, 중화 항체 (Ab)는 챌린지 후 14일차에 검출된다.
본 발명자들은 BSL-3 하의 햄스터 모델에서 WT BetaCoV/USA/WA1/2020과 비교하여 CDX-005 P1 (로트 # 1-060820-9-1)의 약독화를 평가했다. 또한, 백신 접종 14일 후 WT에 대한 본 발명자의 챌린지는 백신 강화의 존재/부재를 조사할 것이다.
5-8주령의 수컷 햄스터 36마리에게 0일차 (그룹당 12마리) 비강 점적기로 5x104 PFU/ml 또는 5x103 PFU/ml의 야생형 WA1/2020 SARS-CoV-2 또는 5x104 PFU/ml CDX-005의 공칭 용량 0.05 ml를 투여하고 2, 4, 14 및 16일 동안 추적했다. 종점에는 1일 2회 케이지 측 관찰, 매일 체중 및 5일까지 1일 2회 및 14일까지 매일 온도가 포함된다. 바이러스 부하는 투약 후 2일, 4일 및 6일에 비강 세척, 폐 조직, 뇌 및 신장에서 qPCR 및 TCID50에 의해 측정될 것이다. 오른쪽 폐, 오른쪽 신장 및 오른쪽 뇌 반구가 동일한 시점에 조직병리학적 검사를 위해 고정될 것이다. 14일차에, CDX-005가 투여된 나머지 3마리의 동물은 5x104 PFU/ml 야생형 WA1/2020으로 챌린지될 것이고 비강 세척, 폐, 뇌 및 신장 바이러스 부하가 16일에 같은 기관의 조직병리학과 함께 측정될 것이다.
표 6. 시리아 골드 햄스터에서 CDX-005의 평가.
이 연구에서 접종 후 6일 동안 체중 감소를 측정하는 초기 데이터는 도 4에 나타낸다. CDX-005는 야생형에 비해 상당히 약독화된 것으로 보인다. 명목 용량의 5x104의 CDX-005를 투여받은 햄스터는 평균 4.1%의 체중 증가를 경험한 반면, 5x104 및 5 x103의 명목 용량으로 야생형 SARS-Cov-2를 투여한 햄스터는 평균 -2.5%의 체중 감소를 경험했다. 이 연구에서 전달된 정확한 용량을 결정하기 위해 진행 중인 용량의 역적정.
대략적인 햄스터 체중이 0.1kg이라고 가정할 때, 5 x 104의 햄스터 백신 용량을 외삽하면 70kg 인간에 대해 3.5 x 107의 용량에 동등할 것이고, 이는 시험될 가능성이 있는 최대 임상 용량보다 높다.
또한, 백신 접종 후 14일차에 WT에 대한 본 발명자의 챌린지는 백신 강화의 존재/부재를 조사한다.
마지막으로, 본 발명자는 작은 표본 크기임을 인정하지만; 그러나 BSL-3 공간 부족과 결합된 대유행의 긴급한 특성과 이러한 현저한 약독화의 입증은 야생형 SARS-CoV-2 에도 종종 무증상 감염이 있는 건강한 저위험 성인에서 CDX-005를 시험하는 것을 지지해야 한다.
단일 5.0Х104 PFU 용량의 CDX-005는 투약 후 16일에 야생형 챌린지로부터 보호적이었다. 이 약리학적 용량은 뇌 또는 신장에 분포하지 않았고 조직병리학적 소견이 최소인 폐에 제한된 분포를 초래했다.
COVID-19 질환은 폐, 후각 및 신경 기능 장애와 관련이 있기 때문에, 균질화된 폐, 후신경구 및 뇌에서 바이러스 부하를 측정했다. qPCR에 의해 측정된 총 바이러스 RNA는 CDX-005 접종된 햄스터에서 접종 후 (PI) 2일차 및 4일차에 폐, 후신경구, 및 뇌에서 검출 한계에 가깝거나 낮았다. 대조적으로, 바이러스 RNA는 두 시점 모두의 세 조직 모두에서 wt WA1 감염된 햄스터에서 검출되었다 (도 6a-c). 감염성 바이러스가 존재하는지 검사하기 위해, 접종 후 2일차, 4일차 및 6일차에 폐 균질액에 대해 TCID50 분석을 수행했다 (도 6d). 4일까지, 감염성 바이러스 부하는 두 용량에서 wt WA1-감염 동물에 비해 CDX-005로 접종된 동물의 폐에서 거의 10,000배 더 낮았다 (N=3/그룹; 독립 샘플에 대한 요인 분산 분석에 의한 P<0.01) (도 6d). 따라서, CDX-005는 생체 내에서 wt WA1에 비해 크게 약독화된다.
CDX-005의 안전성을 평가하기 위해, 접종 후 9일 동안 햄스터의 체중 변화를 모니터링하였다. CDX-005를 접종한 햄스터는 이 기간 동안 체중 증가를 경험한 반면, 두 용량 모두에서 wt WA1을 접종한 햄스터는 체중 감소를 경험했다 (도 7a). 접종 후 9일차에서만 wt WA1 처리된 동물이 시작 체중으로 돌아왔다 (도 7a). 혼합 모델 ANOVA는 변화가 CDX-005와 wt WA1 처리군 사이에서 유의하게 다른 것으로 나타났다 (P<0.001).
본 발명자는 또한 폐, 뇌 및 신장의 조직학적 검사를 수행했다. 포르말린 고정 파라핀 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고 맹검 면허 인증 수의병리학자 (그룹당 N=3)에 의해 광학 현미경 평가를 수행했다. 다중 매개변수를 0-5 병리학 등급 척도로 점수를 매겼다. wt WA1 또는 CDX-005를 투여한 햄스터의 뇌 및 신장 절편에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. COVID-19에 걸린 사람의 폐에서 발견되는 병리학적 세포 침윤과 일치하지만, 폐포 및/또는 혈관주위 또는 세기관지주위 혼합 세포 침윤, 호중구 내강으로 침윤된 세기관지 또는 기관지 상피의 괴사, 및 때때로 증식을 동반하는 혈관주위 부종 세기관지 또는 기관지 상피의 증가는 wt WA1에 감염된 햄스터에서 관찰되었다 (도 7b-c). 대조적으로, 폐 병리는 CDX-005 접종된 햄스터에서 접종 후 6일에 최소 폐포 내지 경증의 혈관주위 또는 기관지주위 혼합 세포 침윤으로 제한되었다 (도 7b-c).
백신으로서의 CDX-005의 효능을 평가하기 위해, wt WA1에 대한 Ab를 유도하는 능력을 측정했다. 먼저, 나이브 (모의) 햄스터 및 wt WA1 또는 CDX-005를 접종한 햄스터의 혈청에서 SARS-CoV-2 스파이크 S1에 대한 IgG 역가를 결정하기 위해 ELISA를 수행했다. wt WA1과 마찬가지로, CDX-005 접종은 강력한 항-스파이크 S1 Ab 반응을 유도했다 (도 8a). 그런 다음 접종 후 16일에 플라크 감소 중화 역가 (PRNT)에 의한 접종된 햄스터의 혈청 내 wt WA1 바이러스에 대한 중화 Ab의 존재를 시험하였다. 본 발명자는 최대 1280배의 혈청 희석으로 50, 80, 및 90 퍼센트 중화 (플라크 형성 억제)를 계산했다 (도 8a). 모든 CDX-005 접종된 햄스터는 wt WA1 접종에 의해 유도된 것과 유사한 수준에서 중화 Ab 역가를 생성했다 (도 8b).
마지막으로, 챌린지 연구에서 CDX-005의 효능을 측정했다. 햄스터에게 단일 용량의 5x104 PFU CDX-005를 비강 내 (IN) 백신 접종한 다음, 접종 후 16일에 5x104 PFU wt WA1로 IN 챌린지했다. 폐를 18일차 (챌린지 후 2일차)에 수확하고, qRT-PCR로 바이러스 부하를 측정했다. 챌린지 wt WA1 바이러스의 바이러스 부하는 백신 접종을 하지 않은 햄스터에 비해 백신 접종을 받은 CDX-005의 폐에서 10,000배 이상 감소하여, 백신의 효능을 입증했다 (도 8c). SARS-CoV-2 바이러스가 챌린지된 모의 접종된 햄스터의 뇌에서 검출된 반면, CDX-005 보호 동물에서는 검출되지 않았다 (도 8c). 후신경구에서의 수준은 두 그룹에서 통계적으로 다르지 않았다 (도 8c). 따라서, CDX-005는 보호를 제공했으며 챌린지 시 백신에 의해 유발된 질병 증강의 증거는 없었다. 본 발명자는 또한 챌린지 후 2일차에 CDX-005 접종된 햄스터에서 IgG Ab 수준이 높게 유지된다는 것을 발견했다 (도 8a).
실시예 5B
햄스터 연구
COVID-19 모델링에 대한 WHO 임시 전문가 워킹 그룹은 붉은털 원숭이 및 흰족제비 모두 경증에서 중등도의 인간 질환을 재현하는 것으로 결론지었지만, 보다 최근의 연구는 시리아 골든 햄스터는 이 감염의 더 심각한 폐 증상을 복제하는 데 더 유용한 모델일 수 있음을 시사한다.1-3 따라서, Codagenix는 현재 BSL-3 하 햄스터 모델에서 WA1과 비교하여 CDX-005 P1 (로트 # 1-060820-9-1)의 약독화를 평가하고 있다. 모든 동물 연구는 IIT 연구소 IACUC 승인 프로토콜에 따라 수행되었다.
5-6주령 36마리의 수컷 시리아 햄스터 (Charles Rivers)가 연구에 활용되었다. 챌린지를 위해, 햄스터를 복강 내 주사를 통해 케타민 (100 mg/kg) 및 자일라진 (10 mg/kg)으로 마취하고 5x104 PFU/ml 또는 5x103 PFU/ml의 wt WA1 SARS-CoV-2 또는 5x104 PFU/ml CDX-005의 공칭 용량 0.05 ml로 0일차 (그룹당 12마리)에 비강내 접종했다. 동물을 8일차까지 1일 2회 관찰하고 체중을 매일 수집한 다음 16-18일차부터 매일 수집했다. 16일차에, 3마리의 CDX-005 접종된 동물에게 5x104 PFU/ml wt WA1을 비강 내로 챌린지하였다. 5x104 PFU/ml (N=3) 또는 5x103 PFU/ml (N=3)의 wt WA1을 접종한 6마리의 나이브 햄스터를 대조군으로 사용하였다. 두 가지 접종 용량에서 역가가 겹치므로 이 두 그룹을 결합했다.
중량
이 36마리의 햄스터와 추가로 58마리 (암컷 절반/수컷 절반) 5-6주령 시리아 골든 햄스터 (Charles Rivers)를 사용하여 체중 감소로 평가된 햄스터 건강에 대한 CDX-005 및 wt WA1 접종의 효과를 연구했다. (이러한 추가 햄스터는 현재 다른 CDX-005 및 wt WA1 매개 효과에 대해 평가되고 있다.) 총 40마리의 5 x 104 PFU CDX-005, 40마리의 5 x 104 PFU wt WA1, 및 12마리의 5 x 103 PFU wt WA1를 최대 9일 동안 매일 칭량했다. N은 다양한 날 접종 후 일차에 다른 종점을 위해 동물을 희생시켰기 때문에 각 그룹에 대해 시간이 지남에 따라 감소했다. 5 x 104 PFU CDX-005 및 5 x 104 PFU wt WA1에 대한 최소 N은 10이고 5 x 103 PFU wt WA1에 대해 3이었다.
조직 수확
접종 후 2, 4, 6일차에 각 그룹에서 3마리의 햄스터와 18일에 16일차에 챌린지받은 동물로부터 3마리의 햄스터를 150 mg/kg의 뷰타나시아 정맥 주사에 의해 안락사시켰다. 바이러스 부하 측정을 위해 왼쪽 폐를 수집했다. 바이러스 부하를 측정하기 위해, 16일차에 챌린지받은 동물에서 18일차에 조직 균질화기 (Omni 균질화기)를 사용하여 항생제가 포함된 DMEM에서 폐를 10% w/v로 균질화했다. 본 발명자는 비강 세척을 시도했지만 이 작은 동물에서 재현 가능한 세척을 얻는 데 실패했다.
조직병리학
조직병리학은 맹검 면허가 있는 수의 병리학자에 의해 수행되었다. 폐, 뇌, 신장은 포르말린 고정하고, 탈수시키고, 파라핀 포매하고, 헤마톡실린 및 에오신 염색을 하였다. 광학 현미경 평가는 맹검 면허 인증 수의 병리학자에 의해 수행되었다. 각 조직은 여러 병리학적 매개변수에 따라 등급이 매겨졌고 절편은 0=정상, 1=최소, 2=경미, 3=보통, 4=뚜렷, 또는 5=심각으로 점수가 매겨졌다. 모든 조직의 평가에는 세포 침윤의 평가가 포함되었다. 각 기관에 대해 적어도 5개의 절편을 검사하고 점수를 평균화했다.
바이러스 부하
바이러스 부하를 수확된 조직에서 qPCR 및 TCID50로 측정하였다. 바이러스 부하를 측정하기 위해, 조직은 비드 밀 균질화기 (Omni)를 사용하여 항생제가 포함된 DMEM에서10% w/v로 균질화되었다. 감염성 바이러스 역가는 베로 E6 세포에서 폐 균질액의 10배 연속 희석액을 적정하는 50% 조직 배양 감염 용량 (TCID50) 분석에 의해 결정되었으며 ml당 log10 TCID50 단위로 표시된다. 제조사의 프로토콜에 따라 Quick-RNA 바이러스 키트 (Zymo Research)를 사용하여 100μl의 뇌 균질액에서 RNA를 추출했다. qRT-PCR을 다음 PCR 주기 조건을 사용하는 iTaq 1- 단계 범용 프로브 키트 (Bio-Rad)를 사용하여 수행하였다: 95℃에서 15초, 60℃에서 15초 및 72℃에서 20초의 40주기.
항체 - 플라크 감소 중화 역가
접종 후 16일에 수집된 햄스터 혈청을 56C에서 30분 동안 열 불활성화시켰다. 50ul 2배 연속 희석은 1:5의 초기 희석으로 시작하여, 96-웰 U-바닥 플레이트의 DMEM/1% FBS에서 수행되었다. 50ul DMEM/1% FBS 중 대략 30 PFU의 SARS-CoV-2 Washington/1/2020을 혈청 희석액에 첨가하고 혼합하여, 중화 웰의 최종 부피를 100ul, 총 초기 혈청 희석액을 1:10로 만들었다. 희석 플레이트를 37℃/5% CO2에서 1시간 동안 배양했다.
베로 E6 세포 (DMEM/5%FBS에 하루 전에 접종)의 융합성 단층을 포함하는 24-웰 플레이트의 세포 성장 배지를 제거하고 150ul의 새로운 DMEM/1%FBS를 첨가한 후, 100ul의 각 중화 반응물을 첨가했다. 37℃/5% CO2에서 1시간 바이러스 흡착 후, 0.75ml 반고체 오버레이를 1 ml의 총 부피에서 1 X DMEM, 1.75% FBS,0.3% 검 트라간트, 1x 페니실린 + 스트렙토마이신의 최종 농도를 위해 24 웰 플레이트에 첨가하였다. 24 웰 플레이트를 플라크 형성을 위해 37℃에서 48시간 동안 배양했다. 플라크는 50% 메탄올/4% 포름알데히드 중 1% 크리스탈 바이올렛으로 세포 단층을 고정하고 염색하여 시각화했다. 플라크 감소 중화 역가 (PRNT) 50, 80, 90은 플라크 수를 비-중화 웰 (나이브 햄스터 혈청 함유)에서 플라크 수에 비해 사전 정의된 컷오프 (50%, 80%, 90%)만큼 감소시킨 최종 혈청 희석액의 역수로 결정되었다. 가장 낮은 희석도 (1:10)에서 중화에 실패한 혈청은 5의 역가를 할당하고, 가장 높은 시험 혈청 희석도 (1:1280)에서 중화한 혈청은 ≥1280의 역가를 할당했다.
항체 - IgG ELISA
96개의 웰 플레이트를 4℃에서 밤새 50ng/ml BSA/0.05M 탄산염/중탄산염 완충액 pH9.6에서 30ng/웰로 SARS-CoV-2(2019-nCoV) 스파이크 S1-His (Sino Biological)로 코팅하였다. 플레이트를 PBS 중 10% 염소 혈청으로 37℃에서 2시간 차단하고, 세척 완충액 (PBS 중 0.1% Tween 20)으로 4회 세척한 다음 PBS 중 10% 염소 혈청/0.05% Tween-20에서 연속 희석된 혈청 (1:10 시작 희석 및 이후 2배)과 함께 배양하고 37℃에서 1시간 배양했다. 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척한 다음 37℃에서 1시간 동안 1:10,000 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 접합 친화성 순수 염소 항-시리안 햄스터 IgG (H & L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)과 함께 배양했다. 배양 후, 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척하고 비색 반응을 위해 Thermo Scientific OPD (o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드)를 첨가하였다. 25 ℃의 암실에서 10분 동안 배양한 후, 50ml 2.5M 황산 용액을 첨가하여 반응을 중단하고 생성된 흡광도를 490 nm에서 마이크로플레이트 판독기로 판독했다. 상이한 그룹들 사이의 상대적인 IgG 수준을 보고하고 OPD 비색 반응 생성물의 강도가 배경 (혈청 없음) 대조군 강도보다 5배 높은 농도에 도달한 희석의 로그로서 비교하였다.
실시예 6
CDX-005 특성
wt WA1 바이러스에 비해 스파이크 유전자에 CDX-005는 283개의 침묵 돌연변이를 함유하고 CDX-007은 149개의 침묵 돌연변이를 포함한다. 생성된 전장 wt WA1 및 탈최적화된 cDNA는 시험관 내에서 전사하여 베로 E6 세포에 전기천공된 전장 바이러스 RNA를 제조했다. 형질감염된 세포를 6일 동안 또는 CPE가 나타날 때까지 배양하였다. 감염 배지를 2일차, 4일차 및 6일차에 수집했다. 바이러스 역가는 베로 E6 세포에 대한 플라크 검정에 의해 결정되었다. 플라크는 4-6일차에 최대 바이러스 생성과 함께 형질감염 후 빠르면 2일차에 볼 수 있었다. CDX-005 및 CDX-007에 의해 형성된 플라크는 wt 보다 작지만 둘 다 베로 E6 세포에서 강력하게 성장하여, 스케일업 제조에 적합함을 나타낸다. 따라서, 다른 SAVE 백신과 마찬가지로, 약독화 정도가 다른 여러 백신 후보를 신속하게 생성할 수 있었다.
CDX-005가 CDX-007보다 더 탈최적화되고 더 약독화지만 생체 내 안전성을 최대화하기 위해 대규모로 생산할 수 있을 만큼 충분히 강력하게 성장하기 때문에 추가 연구를 위해 선택했다. CDX-005에서, 1,272개 뉴클레오티드의 스파이크 ORF가 인간 세포에 대해 탈최적화된 코돈 쌍이 되어 283개의 침묵 돌연변이가 생성되었다. 다염기 푸린 절단 부위를 추가된 약독화 및 안전성을 위해 스파이크 단백질에서 제거하였다.
본 발명자는 2020년 4분기까지 대규모 백신 생산을 시작할 수 있도록 GMP 특성화된 동물 기원이 없는 (AOF) 베로 (WHO-10-87) 세포에서 CDX-005에 대한 성장 최적화 연구를 수행했다. 37℃에서 보다 33℃에서 성장이 CDX-005 및 wt WA1 모두에 대해 더 높은 역가를 야기한다. 바이러스의 80-90%가 피크에서 결합된, 세포변성 효과 (CPE) 전 바이러스 피크가 관찰되었다. 역학은 다르지만, 유사한 바이러스 역가가 0.01 MOI 및 0.0001 MOI에서 달성될 수 있다.
본 발명자는 또한 바이러스 수확을 위한 최적의 조건을 조사했다. 베로 WHO 10-87 세포를 37℃/5% CO2에서 5% 소 태아 혈청 (FBS)이 있는 DMEM으로 성장시켰다. 33℃의 배양액에서 CDX-005로 감염 후 48시간 후, 도 11에 설명된 방식을 사용하여 세포 및 상청액을 수확했다.
데이터는 33℃에서 0.01 MOI 감염 후 48시간이 대부분의 CDX-005가 세포와 연관되어 있지만 (~80-90%) 베로 세포로부터 바이러스 복구가 간단하다는 것을 입증한다. 저장성 용해는 CDX-005를 수확하는 효과적인 수단이며, 넓은 용해 창은 이 방법이 약간의 유연성이 도움이 될 수 있는 규모가 조정된 배치에서 실현 가능함을 시사한다.
동결/해동 용해도 효과적이며 FBS는 필요하지도 않고 유익하지도 않다. 이는 감염 중 FBS가 베로 세포 과증식으로 이어져 바이러스 수율을 감소시킬 수 있고 FDA는 무혈청 생산을 선호하기 때문에 모두 바람직하다. 또한 주목할 만하게, FBS 가 적어도 두 번의 동결/해동 주기 후에 안정화를 거의 제공하지 않거나 전혀 제공하지 않기 때문에 CDX-005는 일반 DMEM에서 동결할 때 안정적인 것으로 보인다. 따라서, 최적의 수확 시기에, 33℃ 또는 37℃에서 성장하든, 2-3 x 107 PFU/ml의 CDX-005의 조 벌크 역가, 또는 약 106 PFU/cm2 성장 표면적이 일상적으로 관찰된다.
이러한 연구를 바탕으로 본 발명자는 현재 베로 (WHO-10-87) 세포에 33℃에서 0.01 MOI를 접종하여 CDX-005를 성장시킨다. 본 발명자는 영국에서 인간을 대상으로 한 최초 연구를 위해 5% 수크로스 및 5% 글리신이 포함된 DMEM의 백신 제형을 선택하고 시험했다. 이 제형에서, CDX-005는 -80℃에서 적어도 3회의 동결-해동 주기 및 1개월 동안 안정하다 (지금까지 시험된 가장 긴 보관 기간).
마지막으로, CDX-005의 게놈 안정성을 평가하는 첫 번째 단계로, 베로 (WHO 10-87) 세포에서 바이러스를 전파한 후 바이러스 계대 1-6을 서열분석했다. 데이터는 바이러스가 매우 안정적임을 나타낸다. 계대 6의 서열분석은 하위집단을 나타내지 않았다. 본 발명자는 9개의 계대를 성장시키고 수확했으며 현재 9번 계대를 서열분석하고 있다. 본원에서 설명하는 작업을 시작할 때 10번 계대의 수확 및 서열분석을 완료할 것이다.
실시예 7
혈청 IgG 항체 ELISA 및 PRNT 검정에 의한 SARS-CoV-2 (wt WA1) 및 CDX-005의 면역원성 평가.
Th1/Th2: SARS-CoV-2-특이적 T 세포는 비교적 일찍 존재하며 감염된 개체에서 시간이 지남에 따라 증가한다. 가장 강한 T 세포 반응은 스파이크 (S) 표면 당단백질에 대한 것으로 보이며, SARS-CoV-2-특이적 T 세포는 Th2 및 Th17 사이토카인이 검출되지만 주로 효과기 및 Th1 사이토카인을 생성한다. Th1 및 T-세포독성 림프구가 SARS-CoV-2의 가장 큰 영향을 받는 면역 세포이며, T-세포 반응 및 Th1/Th2 균형이 부분적으로 COVID-19 중증도를 결정할 수 있다고 제안되었다. 일반적으로 Th1 반응이 약화된 고령자의 경우, 면역계가 바이러스 부하에 대응하기 위해 Th2 반응을 일으키게 되어, Th2 반응의 모든 부정적인 영향을 생성하여 임상 양상을 심각하게 악화시킬 수 있다. 흥미롭게도, SARS-CoV-2에 대한 T 세포 반응은 성인 및 어린이에서도 다르다. COVID-19가 발병한 어린이가 아닌 성인은 D 관련 항원 (DR)을 발현하는 활성화된 CD4 및 CD8 세포의 수 및 혈장 IL-12, IL-1β, 및 CXCL9 수준이 증가했음을 보여준다. 이는 어린이에 비해 감염된 성인에서 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응의 현저한 Th1 분극화를 시사한다. CDX-005는 다른 백신 종류와 달리 T 세포 반응을 유도하여 면역 반응을 높일 수 있는 살아있는 바이러스이기 때문에, FDA의 지시에 따라 Th1/Th2 균형을 연구하는 것이 특히 중요하다.
FDA에서 지정한 대로, Th1/Th2 인자 인터페론 감마 (IFNγ), 인터루킨 12 (IL-12), 종양 괴사 인자 알파 (TNFβ), IL4, IL10, 및 변형 성장 인자 베타 (TGFβ)에 대한 폐 조직의 mRNA 수준을 측정할 것이다. 조직 균질물은 공개된 햄스터 특이적 프라이머 및 조건을 사용하여 qPCR에 의해 분석된다. 분석은 표준 사내 절차를 사용하여 Bioqual에서 수행된다.
본 발명자는 이들이 어리기 때문에 (그러나 어린 동물(juvenile animal)은 아님) wt WA1 및 CDX-005 접종 모두가 주로 Th1 반응을 유도할 것으로 예상한다. 본 발명자는 챌린지와 비교하여 초기 접종에 대한 다른 반응이 있을 것이며 이러한 차이가 SARS-CoV-2에 의해 생성된 면역 반응의 특성에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 것으로 기대한다.
실시예 8
qPCR에 의한 Th1/Th2 균형에 대한 SARS-CoV-2 (wt WA1) 및 CDX-005의 영향 평가
효능: 본 발명자는 후기 계대 CDX-005 백신 효능을 평가하기 위해 표준 챌린지 연구를 수행할 것이다. 5 x 104 PFU CDX-005 또는 비히클을 접종한 햄스터는 27일차에 ~1.0 x 105 TCID50 wt WA1로 챌린지된다. 27일차는 다른 햄스터 연구 및 자체 데이터를 기반으로 선택되었다. 3마리의 모의 챌린지된 동물이 동시 음성 대조군으로 포함되며, 챌린지된 동물을 희생할 세 가지 시점 각각에 대해 하나씩 포함된다. 또한, 챌린지 후 2일차 및 4일차의 희생 선택은 공개된 데이터 및 자체 데이터를 기반으로 한다. 본 발명자는 FDA의 제안 및 SARS-CoV-2 유도 면역 반응을 더 잘 이해하기 위해 이후 시점을 포함했다. 햄스터 혈청 및 조직 분석에는 접종만을 받은 햄스터와 동일한 프로토콜을 사용한 동일한 분석이 포함된다.
본 발명자는 후기 계대 CDX-005 접종이 조기 계대 바이러스와 유사한 챌린지에 대한 보호를 제공할 것으로 기대한다. 데이터는 CDX-005 백신 접종이 2일차 qPCR 폐 역가를 적어도 5,000배 감소시켜, 매우 효과적임을 시사한다. 초기 계대배양 CDX-005와 비교하여 후기 계대배양의 효능이 100배 이상 손실되거나 안전성 측정 (즉, 생체분포, 조직병리학 또는 약독화)의 상당한 차이가 있는 경우 추가 조사가 필요하다. FDA에 알리고 다음 단계를 결정하기 위해 그들과 협력할 것이다.
실시예 9
CDX-005를 최초 인간 임상 시험으로 가기 위한 서막으로, 본 발명자는 백신에 대한 비-인간 영장류의 반응을 조사했다. 본 발명자는 15마리의 아프리카 녹색 원숭이에게 106 PFU wt WA1을 6마리, 106 PFU CDX-005를 6마리, 둘베코 PBS를 3마리 접종하였다. 본 발명자의 결과는 wt WA1 및 CDX-005 접종 동물의 세척액에서 바이러스 역가가 접종 후 4일에 유사했지만, 바이러스 역가는 wt WA1에서 높게 유지되었지만 CDX-005 접종된 원숭이에서는 검출할 수 없을 정도로 급락했음을 보여준다. 이 데이터는 SARS-CoV-2 백신으로서의 CDX-005의 잠재력을 추가로 입증하였다.
실시예 10
COVI-VAC의 안전성 및 면역원성을 평가하는 건강한 젊은 성인을 대상으로 한 최초-인간, 무작위, 이중 맹검, 위약 대조, 용량 증량 연구
COVI-VAC는 COVID-19 예방을 위한 CDX-005가 포함된 약독화 생백신이다. 약독화된 바이러스는 바이러스 스파이크 단백질을 암호화하는 유전자에서 인간 코돈 쌍 탈최적화된 핵산 서열 및 스파이크 유전자에서 푸린 절단 부위의 결실을 갖는 283개의 설계된 침묵 돌연변이를 보유한다. 또한 베로 세포에서 바이러스 복구 과정에서 선별된 2개의 침묵 돌연변이 및 5개의 비침묵 돌연변이를 보유한다.
1차 연구 목표는 점비액으로 투여되는 대략 5x104, 5x105, 및 5x106 플라크 형성 단위 (PFU)의 1 또는 2회 용량에서 COVI-VAC의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이다. 종료점은 다음과 같다: 각 투여 후 14일 동안의 반응성 사건; 1일 내지 57일까지의 부작용 (AE); 1일차 내지 400일차까지 의학적 주의 AE (MAAE), 신규 발병 만성 질환 (NCI), 심각한 AE (SAE).
2차 연구 목표는 점비액으로 투여된 COVI-VAC의 체액성 면역원성을 평가하는 것이다. 종료점은 다음과 같다: 1, 15, 29, 43, 57, 120, 210, 및 400일차에 수집된 혈청에서 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 측정된 면역글로불린 G (IgG) 역가; 1, 15, 29, 43, 57, 120, 210, 및 400일차에 수집된 혈청에서 미세중화 분석에 의해 측정된 중화 항체 수준.
탐색 목표 및 종료점은 다음과 같다:
● 비점액에 의해 투여된 COVI-VAC 후 백신 바이러스 배출의 크기 및 기간을 측정: 비인두 면봉 샘플에서 정량적 중합효소 연쇄 반응 (qPCR) 분석에 의해 평가된 카피 수/mL; 4/5일차 및 14/15일차에 수집된 대변 샘플의 배양 결과;
● 점비액으로 투여된 COVI-VAC의 세포 면역원성을 평가; 점비액으로 투여된 COVI-VAC의 점막 면역원성을 평가: 1, 8, 29, 및 36일차에 수집된 전체 치사 바이러스 자극된 말초혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 인터페론-감마 (IFN-γ) 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISpot)으로 측정된 점 형성 단위 (SFU)/106 세포;
● 점비액으로 투여된 COVI-VAC의 점막 면역원성을 평가: 1, 15, 29, 43, 및 57일차에 수집된 코 심지 샘플에서 ELISA로 측정된 면역글로불린 A (IgA) 역가;
● 점비액으로 COVI-VAC를 투여한 후 SARS-CoV-2 감염으로 인한 것을 포함하여 호흡기 질환의 발병률을 측정: 다중 PCR 호흡기 패널의 결과 (SARS-CoV-2를 포함); 호흡기 MAAE가 있는 대상체에서 다중 PCR 호흡기 패널의 결과 (SARS-CoV-2를 포함); 및
● 백신 바이러스의 유전적 안정성 평가: 비인두 면봉 샘플에서 백신 바이러스의 서열 분석
이 연구는 18세에서 30세 사이의 건강한 성인을 대상으로 COVI-VAC의 안전성과 면역원성을 평가하기 위한 무작위 배정, 이중 맹검, 위약 대조, 용량 증량, 임상 1상 시험이다. 잠재적인 대상체는 사이트의 일반 선별 프로세스를 사용하여 선별되며 이 선별을 통과한 개인은 투여 1~2일 전 (-2/-1일차) 검역소에 입원하여 사전 동의를 제공한다. 그런 다음 그들은 1일차에 무작위화되기 전에 이 연구에 대한 적격성에 대해 선별될 것이다. 모든 연구 포함 기준을 충족하고 배제 기준을 충족하지 않는 대략 48명의 대상체가 3개의 증량-용량 코호트에 등록되고 3:3:2 비율로 각 코호트 내에서 무작위화되어 아래 표에 표시된 대로 COVI-VAC /위약 (정상 식염수) 2회 용량을 투여받는다.
코호트 1에는 3명의 대상체 (2명의 활성, 1명의 위약)의 감시 그룹이 포함될 것이다. 안전성 검토 위원회 (SRC)는 코호트 1의 나머지 대상체에게 투여하기 전에 8일까지 이들 3명의 대상체에 대한 맹검 안전성 데이터를 검토할 것이다.
대상체는 투여 1 (및 입원 환자 환경에서 투여되는 경우 투여 2) 후 14일까지 검역소에 남아 있으며 대상체가 임상적으로 유의한 증상이나 진행 중인 증거를 경험하거나 위험 관리 계획 (14/42일차 비인두 면봉 샘플 기준)에 문서화된 낮은 전염 위험 이상의 수준에서 대상체가 백신 바이러스를 퍼뜨리고 있다는 것을 실험실 단위에서 검역소에 알리지 않는 한 15일차 (및 해당하는 경우 43일차)에 퇴원한다. 이 대상체들은 qPCR 분석 결과가 낮은 전염 위험과 일치할 때까지 검역소에 계속 감금될 것이다 (샘플은 매일 2회 수집된다).
SRC는 또한 15일차까지 맹검 안전성 데이터와 8일차까지 맹검 비인두 면봉 배출 데이터를 검토하여 대상체의 코호트가 투여 2 후 14일 동안 검역소에 감금될 것인지 또는 29일차에 퇴원하고 이후 외래환자로 볼 것인지를 결정한다. 대상체가 외래 환자로 간주되는 경우, SRC는 또한 이러한 데이터를 사용하여 투여 2 후 첫 주 2일에 대상체가 방문을 위해 단위로 돌아올 것인지 결정할 것이다. 대상체를 입원환자로 보는 경우 SRC는 비인두 면봉 샘플 수집 빈도도 결정한다 (하루에 두 번 이하).
각 대상체는 COVI-VAC/위약 투여 후 14일 동안 매일 일기에 반응성 (국소적 사건, 전신적 사건 및 온도)을 기록할 것이다.
모든 AE 및 수반되는 약물은 사전 동의서 (ICF) 서명부터 57일차까지 기록될 것이다. 그 후 연구 종료 (400일)까지 MAAE, NCI, SAE, 면역억제 약물, 혈액 제품 및 백신만 기록된다. 안전성 실험실 시험 (혈액학, 생화학, 응고, 소변 검사)를 위한 샘플은 투여 1 투여 전과 8, 36 및 57일차에 수집된다. 완전한 신체 검사는 2/1일차에 수행되고, 표적 및 증상 기반 신체 검사는 1일 및 29일에 투여 전; 각 투여 후 2시간; 검역소에 있는 동안 2/30, 4/32, 8/36, 및 15/43일차에, 및 투약 기간 동안 각 외래 환자 방문 시 수행된다. 최대 호기 유량 (PEF) 및 활력 징후 (산소 포화도 포함)는 1일차 및 29일차에 투여 전; 각 투여 후 2시간; 검역소에 있는 동안 2/30, 4/32, 8/36, 및 15/43일차에; 및 투약 기간 동안 각 외래 환자 방문 시 측정된다. 심전도 (ECG)는 투여 1 전 및 2, 8 및 57일차에 수행된다. 흉부 X-선은 투여 1 후 14 내지 22 일 (15 내지 22일차)에 수행된다.
ELISA에 의해 측정된 IgG 역가 및 1일 및 29일차 투여 전 및 15, 43, 57, 120, 210 및 400일차에 미세중화에 의해 측정된 중화 항체 수준의 평가를 위해 혈청 샘플을 각 대상체로부터 수집할 것이다. 전혈 샘플은 1일 및 29일차 투여 전 및 8일 및 36일차에 IFN-γ ELISpot에 의한 T-세포 반응 평가를 위해 각 대상체로부터 수집하고 PBMC를 단리하도록 처리된다.
qPCR 분석에 의한 배출 평가를 위한 백신 바이러스의 농도를 측정하기 위해 검역소에 있는 동안 (대상체가 투여 2에 대해 외래 환자로 입원한 경우 1일차에만 투여 후, 29일차에만 투여 전 하는 경우 제외, 및 15/43일차에만 1개의 샘플) 및 투여 2 후에 결정된 외래 환자 방문 시 각 대상체로부터 비인두 면봉 샘플을 매일 2회 (투여 2 이후에 빈도가 감소할 수 있음) 수집한다. 개별 대상체에 대한 음성 결과가 얻어지면 해당 대상체에 대한 이후 샘플은 시험되지 않을 수 있다. 백신 바이러스 배출의 증거가 있는 샘플은 잠재적인 바이러스 서열 분석을 위해 보관된다. 4일 또는 5일 및 14일 또는 15일에 대변에서 채취한 면봉 샘플을 수집하여 백신 바이러스 역가를 측정한다.
코 심지 샘플은 1일 및 29일 및 15일, 43일 및 57일에 투여 전 점막 면역 반응의 평가를 위해 ELISA에 의한 IgA 측정을 위해 각 대상체로부터 수집될 것이다.
대상체가 바이러스성 호흡기 감염과 호환되는 급성 증상을 경험하는 경우, 다중 PCR 호흡기 패널 (SARS-CoV-2 포함)을 위해 비인두 면봉 샘플을 수집한다.
SARS-CoV-2에 대해 양성인 모든 샘플은 야생형 SARS-CoV-2 또는 백신 바이러스인지 결정하기 위한 분석을 위해 보관된다.
각 대상체는 선별 기간을 포함하여 약 13개월 동안 연구에 참여할 것이다. 연구 종료는 연구에 참여한 마지막 대상체의 마지막 방문 날짜로 정의된다. 연구 수행의 예상 기간은 대상체를 등록하는 데 4개월을 가정할 때 약 17개월이다.
COVI-VAC는 28일 간격으로 최대 2회 점비액으로 투여된다. SARS-CoV-2의 최소 감염 용량은 알려져 있지 않지만, 동물 모델에서는 104 내지 106 PFU의 용량에서 재현 가능한 감염이 발생한다. 시리아 햄스터 모델에서 잘 용인되었던 COVI-VAC 용량의 중량 기반 외삽은 70 kg 인간에서 대략 3.5Х107 PFU의 용량을 야기한다. 이 연구를 위해 선택된 용량 수준은 내약성이 우수하고 COVI-VAC의 활성 평가에 충분할 것이다.
분석
안전성: 1일차부터 57일차까지 AE (MAAE, NCI, 및 SAE를 포함)가 있는 대상체의 수 (백분율)는 각 규제 활동에 대한 의학 사전 (MedDRA) 시스템 기관 부류 및 선호 용어에 대해 그룹별로 요약된다. 1일차부터 400일차까지 MAAE, NCI, 및 SAE 가 있는 대상체의 수 (백분율)가 유사한 방식으로 요약된다. 중증도 및 임상시험용 의약품 (IMP)과의 관계에 따른 AE를 갖는 대상체의 수 (백분율)도 요약된다. AE, MAAE, NCI, 및 SAE의 목록이 제공된다. 각 투여 후 국소 및 반응원성 전신 사건이 있는 대상체의 수 (백분율)는 그룹별로 요약된다. 반응성 사건은 또한 심각도에 따라 요약될 것이다.
연속 매개변수 (안전 실험실 테스트, PEF 및 활력 징후)에 대한 요약 통계는 다음과 같이 그룹별로 제공된다: 투여 전, 투여 후 및 투여 전에서 투여 후 평가로의 변화. 연구 백신 접종 후 백신 접종 후 안전성 실험실 값 또는 활력 징후 값이 새로 비정상으로 기록된 대상체의 수 및 백분율 (즉, 기준 값에 비해 독성 등급이 증가하고 중증도 등급이 중등도 이상인 사건)은 표로 작성될 것이다. 중증도 등급에 따라 각 대상체의 투여 전 및 투여 후 안전성 실험실 값을 교차 도표화하는 교대표가 준비될 것이다.
신체 검사, ECG 및 흉부 X-선에 대해 정상, 비정상적으로 임상적으로 유의하지 않은 비정상 및 임상적으로 유의미한 해석이 비정상인 대상체의 수 및 백분율에 대한 요약이 제시된다.
면역원성: COVI-VAC에 대한 체액성 면역 반응 평가를 위한 관심 주요 변수는 IgG 역가 및 중화항체 수준이다. 다음 측정값과 95% CI가 그룹별로 요약된다:
● 기준선 및 15, 29, 43, 57, 120, 210 및 400일차의 기하 평균
● 15, 29, 43, 57, 120, 210, 및 400일차의 응답자 비율
세포 및 점막 면역 반응 데이터는 관련 샘플 수집 시점에서 동일한 방식으로 요약된다.
배출: 비인두 및 대변 면봉 샘플로부터의 백신 바이러스 배출 데이터는 중앙값과 함께 시점별로 수 및 양성 퍼센트로 요약된다. 백신 바이러스 배출의 중앙값, 사분위수 범위, 최소 및 최대 기간은 비인두 면봉 결과에 대해 그룹별로 제시될 것이다.
호흡기 바이러스 발생률: 증상이 있는 대상체의 다중 PCR 호흡기 패널 (SARS-CoV-2를 포함) 결과 및 관련 증상이 나열된다.
평가
안전성
안전성 평가는 이 연구의 주요 목표이다. 안전성 평가는 초기 단계 임상 시험의 표준이며 예방 백신 임상 시험에 대한 FDA 지침 [FDA 2007]을 따른다. 또한, 야생형 감염에서 볼 수 있는 염증성 후유증 및 과응고 가능성 때문에, 안전성 실험실 연구에는 C-반응성 단백질, IL-6 및 TNF, d-이량체 및 고감도 트로포닌-T도 포함된다.
활력 징후 평가는 맥박 산소 측정법을 포함하고 최대 유량도 기록되어 무증상 호흡 장애를 평가한다.
또한, CodaVax-COVID/위약의 첫 번째 투여 후 2 내지 3주 후에 흉부 X-선을 수행하여 무증상 폐 염증에 대해 대상체를 모니터링할 것이다. COVID-19의 조기 발견에서 흉부 영상의 유용성에 대한 증거가 나오고 있다. 이탈리아에서 엄격한 지역 격리 직후 COVID-19에 대한 임상적 의심이 적은 무증상자와 유증상자의 흉부 X-선 검사에서 이상 소견이 높은 비율을 보였다. SARS-COV-2에 감염된 무증상 개인에서 양성 흉부 영상 소견의 비율을 평가하는 임상 연구의 최근 메타 분석에서, 저자들은 무증상 사례에서 양성 흉부 영상을 가질 수 있으며 방사선 소견이 있는 무증상 개체에 대한 면밀한 임상 모니터링이 그들 중 상당수가 증상을 나타내기 때문에 필요하다고 결론지었다.
면역원성
결합 및 중화 혈청 항체는 가장 자주 평가되는 백신 바이오마커이지만 세포 및 점막 면역이 감염 및 질병을 예방하고 진행 중인 전파의 위험을 줄이는 데 동등하거나 훨씬 더 중요한 역할을 할 수 있다. 이 연구에서 혈청 결합 및 중화 항체는 2차 종료점으로 측정되고 점막 IgA 및 T-세포 반응은 탐색적 종료점으로 IFN-γ ELISpot에 의해 측정된다.
배출
햄스터 연구 결과에 따르면 백신 바이러스의 운반은 일시적인 것으로 나타났다. 벡터가 투여 부위에서 얼마나 오래 지속되는지를 결정하기 위해 qPCR을 위해 비인두 면봉 샘플을 얻을 것이다. 현재까지 발표된 데이터에 따르면 위장관 배출이 더 늦게 시작되고 상기도 배출보다 더 오래 지속되지만 의미는 불분명하다. 직장 면봉 샘플은 감염성 바이러스의 위장 배출을 평가하기 위한 플라크 검정을 위해 이 연구에서 수집될 것이다.
대상체 집단
본 연구의 목적상, 포함 기준과 제외 기준은 다음과 같이 설정하였다. 전체적인 인구에 대한 실제 투여 기준은 다를 수 있다. 이러한 포함 및 제외 기준은 청구범위에 구체적으로 제공되지 않는 한 청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
포함 기준
하기 기준을 모두 충족하는 대상체는 연구에 포함될 수 있다:
1. ICF 서명 당일 만 18세 이상 30세 이하 남녀
2. 고혈압, 당뇨병, 혈전색전성 질환, 관상동맥 심장병, 만성 폐쇄성 폐질환과 관련하여 이에 국한되지 않는, 임상적으로 유의한 의학적 상태의 병력 또는 현재 증거가 없고, 병력, 신체 검사, 활력 징후 (산소 포화도 포함), ECG, 폐활량 측정, 및 조사자가 결정한 안전 실험실 검사에 의해 정의된 대상체 안전을 방해하는 임상적으로 유의한 검사 이상이 없는 건강한 상태
3. 총 체중 ≥50 kg 및 체질량 지수 (BMI) ≥18.0 kg/m2 내지 ≤28.0 kg/m2 (BMI의 상한선은 BMI가 위쪽으로 편향될 수 있는 근육질의 건강한 대상체와 같은 경우에 연구자의 재량에 따라 ≤30 kg/m2로 증가될 수 있다)
4. 약물 남용, 코티닌 및 알코올 검사의 음성 (처방된 약물로 설명되지 않는 한)
5. 외과적으로 불임수술을 받지 않은 여성에 대한 임신 검사 음성
6. COVID 클리어 검사결과 음성
7. 백신 바이러스 전파 위험을 완화하기 위한 조건 준수 의지 (다음 조건은 최소 표준이지만 공중 보건 당국이 SARS-CoV-2 전파 완화에 대해 더 높은 표준을 권장하는 경우 증가할 수 있음):
● 각 IMP 투여 후 적어도 14일 동안 비누 또는 손 소독제로 빈번한 손 씻기, 호흡기 위생, 기침 예절을 포함하되 이에 국한되지 않는 연구 약물의 대인 전염을 방지하기 위한 위생 조치
● 각 IMP 투여 후 적어도 14일 동안 공공 장소에서 또는 다른 사람과 접촉할 때 수술용 마스크 착용
● 각 IMP 투여 후 적어도 14일 동안 호흡기 분비물을 수집하는 데 사용되는 모든 조직 및 물질을 1차 용기에 밀봉하고 어린이나 동물이 접근할 수 없는 2차 용기에 보관
● 각 IMP 투여 후 적어도 14일 동안 취약한 개인과의 긴밀한 접촉이 하지 않음. 취약한 개인은 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다:
o 65세 이상인 사람
o 1세 이하 어린이
o 요양원의 거주자와 근로자
o 다음과 같은 심각한 만성 질환이 있는 모든 연령의 사람:
- 만성 폐질환 (예를 들어, 중증 천식, 만성 폐쇄성 폐질환)
- 만성 심혈관 질환 (예를 들어, 심근병증, 울혈성 심부전, 심장 수술, 허혈성 심장 질환, 알려진 해부학적 결함)
- 병적 비만
- 인슐린-의존성 또는 2형 당뇨병
- 만성 대사 질환 (예를 들어, 신장 기능 장애, 혈색소병증)으로 인해 지난 5년 동안 의학적 추적 관찰 또는 입원
- 면역억제
- 암
- 신경학적 및 신경발달 병태 (예를 들어, 뇌성마비, 간질, 뇌졸중, 발작)
o 임신 중이거나 임신을 시도하는 여성
o COVID-19 전염병 동안 취약한 것으로 정의된 기타 모든 사람
8. 가임기 여성 대상체는 한 가지 형태의 매우 효과적인 피임법을 사용해야 한다. 피임법은 마지막 IMP 투여 후 최소 90일 동안 계속해야 한다. 매우 효과적인 피임법은 다음과 같다:
● 아래에 설명된 호르몬 피임법의 확립된 사용 (1일차 전 ≥14 일 동안). 호르몬 피임법을 사용할 때 남성 파트너는 살정제가 포함된 콘돔을 사용해야 한다:
o 배란 억제와 관련된 복합 (에스트로겐 및 프로게스토겐 함유) 호르몬 피임:
- 경구
- 질내
- 경피
o 배란 억제와 관련된 프로게스테론 단독 호르몬 피임법:
- 경구
- 주사 가능
- 이식 가능
● 자궁내 장치
● 자궁 내 호르몬 방출 시스템
● 양측 난관 결찰
● 정관 절제술을 받은 남성이 해당 여성의 유일한 파트너인 남성 불임 수술 (정관 수술 후 사정액에 정자가 없다는 적절한 문서 포함)
● 실제 금욕 - 성적 금욕은 연구 치료와 관련된 전체 위험 기간 동안 이성애 성교를 자제하는 것으로 정의되는 경우에만 매우 효과적인 방법으로 간주된다. 성적 금욕의 신뢰성은 임상 시험 기간 및 대상체의 선호 및 일상 생활 방식과 관련하여 평가되어야 한다.
9. 남성 대상체는 마지막 IMP 투여 후 적어도 90일 동안 계속 사용하면서 아래의 피임 요건에 동의해야 한다:
● 여성 파트너의 임신을 방지하거나 파트너 (남성 및 여성)가 IMP에 노출되는 것을 방지하기 위해 살정제가 포함된 콘돔 사용
● 사정액에 정자가 없다는 적절한 정관 절제술 후 문서가 있는 남성 불임 수술 (파트너 노출을 방지하기 위해 살정제가 있는 콘돔을 사용해야 한다는 점이 여전히 요구된다는 것에 유의). 이는 연구에 참여하는 남성에게만 적용된다.
● 또한 가임기 여성 파트너의 경우 해당 파트너는 여성 대상에 대해 위에서 언급한 매우 효과적인 방법 중 하나와 같은 다른 형태의 피임법을 사용해야 한다.
● 실제 금욕 - 성적 금욕은 연구 치료와 관련된 전체 위험 기간 동안 이성애 성교를 자제하는 것으로 정의되는 경우에만 매우 효과적인 방법으로 간주된다. 성적 금욕의 신뢰성은 임상 시험 기간 및 대상체의 선호 및 일상 생활 방식과 관련하여 평가되어야 한다.
10. 상기 피임 요구사항 외에도, 남성 대상체는 마지막 IMP 투여 후 적어도 90일 동안 정자를 기증하지 않는 데 동의해야 한다.
11. 연구 부서에 대한 모든 방문을 포함하여 전체 연구 기간 동안 연구의 모든 양태에 참여하고 준수할 의향
12. 서면 동의서 제공
제외 기준
하기 기준 중 하나를 충족하는 대상체는 연구에서 제외된다:
1. 헤모글로빈 A1c ≥6.0% 또는 42 mmol/mol
2. 1초 동안의 강제 호기량 (FEV1) <80% 예측값
3. 1일차로부터 28일 이내에 상기도 또는 하기도 감염을 암시하는 징후 또는 증상 (발열 또는 지속적인 기침 포함)
4. 임산부, 임신 가능성이 있는 여성 또는 수유 중인 여성
5. 임신 후기까지 임신했거나 최근 6개월 이내에 출산한 여성
6. 마지막 IMP 투여 후 90일 이내에 임신 (대상체 또는 파트너) 계획
7. 반복적인 정맥 절개를 위한 부적절한 정맥 접근
8. SARS-CoV-2 감염이 확인되거나 의심되는 병력
9. 접촉 후 14일 이내에 SARS-CoV-2 감염이 확인된 개인과의 접촉
10. 흡입기(들)로 치료한 천명의 병력
11. 천명을 포함한 호흡기 증상으로 입원한 적이 있는 경우
12. 바이러스에 대한 알려진 기관지 과민성
13. 연구의 목적, 특히 비강 평가 또는 바이러스 챌린지를 방해할 수 있는 실질적인 방식으로 코 또는 비인두의 해부학을 변경하는 모든 중대한 이상 (과거의 비용종도 포함될 수 있지만 현재의 비용종을 유발하는 큰 비용종 및 지난 1개월 동안의 중대한 증상 및/또는 정기적인 치료가 필요한 경우 제외)
14. 1일차 전 지난 3개월 이내에 임상적으로 유의한 비혈 (대량 코피)의 병력 또는 이전 경우의 비혈로 인해 입원한 병력
15. 1일차 전 3개월 이내에 모든 비강 또는 부비동 수술
16. 코 수술 또는 코 소작의 병력
17. 자가면역 또는 탈수초 질환의 병력
18. 벨 마비(Bell's palsy)의 병력
19. 지난 10년 동안 정신병의 병력, 정신 질환으로 인한 입원, 임상적으로 관련된 우울증 또는 자살 시도
20. 발작 (소아 열성 발작 제외), 치매 또는 진행성 신경 질환의 병력
21. 길랭-바레 증후군을 포함한 감염 후 또는 백신 후 신경학적 후유증의 병력
22. 예방접종에 대한 심각한 반응의 병력
23. 아나필락시스의 병력 또는 조사자에 의해 평가된 바와 같이, 임의의 식품 또는 약물에 대한 심각한 알레르기 반응 또는 상당한 과민증의 병력
24. 비흑색종 피부암 및 조사자가 재발 가능성이 극히 낮다고 간주하는 기타 초기 단계의 외과적 절제 악성 종양을 제외하고 알려지거나 의심되는 악성 종양
25. 1일차 전 90일 이내에 코르티코스테로이드 (비강 내 스테로이드 포함), 알킬화 약물, 대사 억제제, 방사선, 면역 조절 생물제제 또는 기타 면역 조절 요법의 사용 또는 연구 기간 동안 이들 중 임의의 것의 계획된 사용을 포함하는 면역 결핍 (국소 스테로이드 크림 피부에 사용되는 경미하거나 중등도의 효능이 허용됨)
26. 1일차 전 30일 이내에 안정되지 않거나 약물 변경이 필요한 기타 만성 의학적 병태
27. 허가를 받았거나 조사 중인 코로나바이러스 백신 또는 SARS-CoV-2 접종
28. 1일차 전 12개월 이내에 3개 이상의 IMP를 받은 경우
29. 1일차 전 90일 이내 또는 5회 반감기 (둘 중 더 긴 것) 이내에 호흡기 바이러스에 대한 바이러스 챌린지 연구에 참여
30. 1일차 전 90일 이내 또는 5회 반감기 (둘 중 더 긴 것) 이내에 IMP를 받은 경우
31. 1일차 전 90일 이내에 수혈 또는 혈액 제제의 수령 또는 연구 동안 계획된 사용
32. 1일차 전 90일 이내에 비강내 백신 접종
33. 1일차 전 30일 이내에 백신, 결핵 피부 검사 또는 알레르기 항원 접종을 받거나 57일차까지 예정된 수령
34. 1일차 전 30일 이내에 비강내 스테로이드 또는 1일차 전 7일 이내에 다른 비강내 약물 (일반의약품 포함, 식염수 제외)의 수령
35. COVID-19의 예방 또는 치료를 위한 모든 약물의 현재 사용
36. 57일차까지 계획된 입원 또는 수술 절차
37. 비강 내 불법 약물의 정기적 또는 현재 사용
38. 알코올 중독의 병력 또는 존재, 또는 과도한 알코올 사용 (주당 섭취 > 28단위 알코올; 1단위는 맥주 반 잔, 와인 작은 잔, 또는 어느 정도의 주정)
39. 크산틴 함유 물질의 과도한 섭취 (예를 들어, 매일 섭취 >5컵의 카페인 함유 음료, 예를 들어, 커피, 차, 콜라).
40. 모든 유형의 현재 흡연자 (예를 들어, 담배, 전자 담배, 마리화나)
41. 5갑년 이상의 흡연력이 있거나 1일차 전 지난 30일 동안 흡연한 적이 있는 경우
42. -2일차 또는 -1일차 입원 전 48시간 동안 격렬한 운동
43. 1일차 전 90일 이내에 ≥470 mL의 헌혈
44. 조사자에 의해 결정된 임상적으로 유의한 ECG 이상
45. HIV, B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스 또는 활동성 A형 간염 바이러스 감염에 대한 양성 결과
46. 조사자의 판단으로, 프로토콜 준수, 안전성 평가 (반응원성 포함), 또는 대상체의 사전 동의 능력을 방해하거나 금기로 작용할 의학적, 정신적 또는 사회적 상태 또는 직업적 또는 기타 책임
47. 조사자의 의견에서 대상체가 검역 요건에 대처할 수 없을 것이라는 우려를 제기하는 모든 이유
48. Codagenix, 공급업체 또는 연구와 관련된 연구 사이트의 직원 또는 직원의 직계 친척
포함 및 제외 기준을 충족하지 못하는 대상체는 후원자와 협의하여 연구자의 재량에 따라 재선별될 수 있고, 나중에 포함 및 제외 기준을 충족하는 경우 연구에 참여할 수 있다.
임시 지연 기준
COVI-VAC/ 위약의 투여는 다음 기준 중 하나를 충족하는 대상체에 대해 연기된다:
1. 지난 3일 이내의 비혈 (코피)
2. 지난 3일 이내에 상기도 감염 또는 발열 (주관적 또는 객관적) 또는 권태감의 증상
IMP의 적절한 투여 또는 일기 데이터의 해석을 방해할 수 있는 모든 증상의 징후 (예를 들어, 체온 ≥38℃, 코막힘, 콧물)
본 발명의 다양한 구현예는 상세한 설명에서 상기 설명되어 있다. 이러한 설명이 위의 구현예를 직접 설명하지만, 당업자는 본원에 도시되고 설명된 특정 구현예에 대한 수정 및/또는 변형을 생각할 수 있음을 이해해야 한다. 이 설명의 범위에 속하는 그러한 수정 또는 변형도 본원에 포함되도록 의도된다. 구체적으로 언급되지 않는 한, 명세서 및 청구범위의 단어 및 구에 해당 기술(들)의 통상의 기술자에게 통상적이고 익숙한 의미를 부여하는 것이 본 발명자의 의도이다.
출원 당시 출원인에게 알려진 본 발명의 다양한 구현예에 대한 전술한 설명이 제시되었으며 이는 예시 및 설명을 목적으로 한 것이다. 본 설명은 본 발명을 개시된 정확한 형태로 완전하게 제한하거나 제한하려는 것이 아니며, 상기 교시에 비추어 많은 수정 및 변형이 가능하다. 설명된 구현예는 본 발명의 원리 및 그 실제 적용을 설명하고, 당업자가 다양한 구현에서 그리고 고려되는 특정 용도에 적합한 다양한 수정으로 본 발명을 활용할 수 있도록 하는 역할을 한다. 따라서, 본 발명은 본 발명을 수행하기 위해 개시된 특정 구현예로 제한되지 않는 것으로 의도된다.
본 발명의 특정 구현예가 도시되고 설명되었지만 본 명세서의 교시에 기초하여, 본 발명 및 이의 더 넓은 양태를 벗어나지 않고 변경 및 수정이 이루어질 수 있고, 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 정신 및 범위 내에 있는 모든 변경 및 수정을 그 범위 내에 포함해야 한다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어는 일반적으로 "개방된" 용어로 의도된다는 것을 당업자는 이해할 것이다 (예를 들어, 용어 "포함하는(inclduing)"은 "포함하지만 이에 제한되지 않는"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 가지고 있는"으로 해석되어야 하고, 용어 "포함하다"는 포함하지만 이에 제한되지 않는다" 등으로 해석되어야 한다).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는(comprising)" 또는 "포함하는(comprises)"은 구현예에 유용하지만 유용하든 그렇지 않든 불특정 요소를 포함할 수 있는 조성물, 방법 및 이의 각각의 구성요소(들)와 관련하여 사용된다. 일반적으로 본원에 사용된 용어는 일반적으로 "개방된" 용어로 의도된다는 것을 당업자는 이해할 것이다 (예를 들어, 용어 "포함하는(including)"은 "포함하지만 이에 제한되지 않는"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 가지고 있는"으로 해석되어야 하고, 용어 "포함하다(includes)"는 포함하지만 이에 제한되지 않는다" 등으로 해석되어야 한다). 포함하는, 함유하는, 또는 갖는 것과 같은 용어의 동의 개방형 용어 "포함하는"이 본 발명을 설명하고 청구하기 위해 본 명세서에서 사용되지만, 본 발명 또는 그 구현예는 대안적으로. "~로 구성된" 또는 "본질적으로 구성되는"과 같은 대체 용어를 사용하여 설명될 수 있다."
SEQUENCE LISTING
<110> CODAGENIX INC.
MUELLER, Steffen
COLEMAN, John Robert
WANG, Ying
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<120> DEOPTIMIZED SARS-CoV-2 AND METHODS AND USES THEREOF
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<150> 62/966,750
<151> 2020-01-28
<150> 63/048,942
<151> 2020-07-07
<150> 63/079,337
<151> 2020-09-16
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attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120
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ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc 2460
tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt 2520
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aatcaaagac acagaaaagt actgtgccct tgcacctaat atgatggtaa caaacaatac 2700
cttcacactc aaaggcggtg caccaacaaa ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga 2760
agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt 2820
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ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc 2940
actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg 3000
tgagtttaaa ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga 3060
agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga 3120
agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga 3180
agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga 3240
cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt 3300
agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt 3360
aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt 3420
aaaaccaaca gtggttgtta atgcagccaa tgtttacctt aaacatggag gaggtgttgc 3480
aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc 3540
tactaatgga ccacttaaag tgggtggtag ttgtgtttta agcggacaca atcttgctaa 3600
acactgtctt catgttgtcg gcccaaatgt taacaaaggt gaagacattc aacttcttaa 3660
gagtgcttat gaaaatttta atcagcacga agttctactt gcaccattat tatcagctgg 3720
tatttttggt gctgacccta tacattcttt aagagtttgt gtagatactg ttcgcacaaa 3780
tgtctactta gctgtctttg ataaaaatct ctatgacaaa cttgtttcaa gctttttgga 3840
aatgaagagt gaaaagcaag ttgaacaaaa gatcgctgag attcctaaag aggaagttaa 3900
gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat 3960
caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa 4020
cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag 4080
tgacattgac atcactttct taaagaaaga tgctccatat atagtgggtg atgttgttca 4140
agagggtgtt ttaactgctg tggttatacc tactaaaaag gctggtggca ctactgaaat 4200
gctagcgaaa gctttgagaa aagtgccaac agacaattat ataaccactt acccgggtca 4260
gggtttaaat ggttacactg tagaggaggc aaagacagtg cttaaaaagt gtaaaagtgc 4320
cttttacatt ctaccatcta ttatctctaa tgagaagcaa gaaattcttg gaactgtttc 4380
ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg 4440
tgtggaaact aaagccatag tttcaactat acagcgtaaa tataagggta ttaaaataca 4500
agagggtgtg gttgattatg gtgctagatt ttacttttac accagtaaaa caactgtagc 4560
gtcacttatc aacacactta acgatctaaa tgaaactctt gttacaatgc cacttggcta 4620
tgtaacacat ggcttaaatt tggaagaagc tgctcggtat atgagatctc tcaaagtgcc 4680
agctacagtt tctgtttctt cacctgatgc tgttacagcg tataatggtt atcttacttc 4740
ttcttctaaa acacctgaag aacattttat tgaaaccatc tcacttgctg gttcctataa 4800
agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga 4860
taaaagtgta tattacacta gtaatcctac cacattccac ctagatggtg aagttatcac 4920
ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac 4980
aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca 5040
acagtttggt ccaacttatt tggatggagc tgatgttact aaaataaaac ctcataattc 5100
acatgaaggt aaaacatttt atgttttacc taatgatgac actctacgtg ttgaggcttt 5160
tgagtactac cacacaactg atcctagttt tctgggtagg tacatgtcag cattaaatca 5220
cactaaaaag tggaaatacc cacaagttaa tggtttaact tctattaaat gggcagataa 5280
caactgttat cttgccactg cattgttaac actccaacaa atagagttga agtttaatcc 5340
acctgctcta caagatgctt attacagagc aagggctggt gaagctgcta acttttgtgc 5400
acttatctta gcctactgta ataagacagt aggtgagtta ggtgatgtta gagaaacaat 5460
gagttacttg tttcaacatg ccaatttaga ttcttgcaaa agagtcttga acgtggtgtg 5520
taaaacttgt ggacaacagc agacaaccct taagggtgta gaagctgtta tgtacatggg 5580
cacactttct tatgaacaat ttaagaaagg tgttcagata ccttgtacgt gtggtaaaca 5640
agctacaaaa tatctagtac aacaggagtc accttttgtt atgatgtcag caccacctgc 5700
tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca 5760
gtgtggtcac tataaacata taacttctaa agaaactttg tattgcatag acggtgcttt 5820
acttacaaag tcctcagaat acaaaggtcc tattacggat gttttctaca aagaaaacag 5880
ttacacaaca accataaaac cagttactta taaattggat ggtgttgttt gtacagaaat 5940
tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat 6000
tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg 6060
tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc 6120
aagagagctt aaagttacat ttttccctga cttaaatggt gatgtggtgg ctattgatta 6180
taaacactac acaccctctt ttaagaaagg agctaaattg ttacataaac ctattgtttg 6240
gcatgttaac aatgcaacta ataaagccac gtataaacca aatacctggt gtatacgttg 6300
tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga 6360
cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt 6420
ggaaaatcct accatacaga aagacgttct tgagtgtaat gtgaaaacta ccgaagttgt 6480
aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca 6540
cacagatcta atggctgctt atgtagacaa ttctagtctt actattaaga aacctaatga 6600
attatctaga gtattaggtt tgaaaaccct tgctactcat ggtttagctg ctgttaatag 6660
tgtcccttgg gatactatag ctaattatgc taagcctttt cttaacaaag ttgttagtac 6720
aactactaac atagttacac ggtgtttaaa ccgtgtttgt actaattata tgccttattt 6780
ctttacttta ttgctacaat tgtgtacttt tactagaagt acaaattcta gaattaaagc 6840
atctatgccg actactatag caaagaatac tgttaagagt gtcggtaaat tttgtctaga 6900
ggcttcattt aattatttga agtcacctaa tttttctaaa ctgataaata ttataatttg 6960
gtttttacta ttaagtgttt gcctaggttc tttaatctac tcaaccgctg ctttaggtgt 7020
tttaatgtct aatttaggca tgccttctta ctgtactggt tacagagaag gctatttgaa 7080
ctctactaat gtcactattg caacctactg tactggttct ataccttgta gtgtttgtct 7140
tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc 7200
atcttttaaa tgggatttaa ctgcttttgg cttagttgca gagtggtttt tggcatatat 7260
tcttttcact aggtttttct atgtacttgg attggctgca atcatgcaat tgtttttcag 7320
ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt 7380
acaaatggcc ccgatttcag ctatggttag aatgtacatc ttctttgcat cattttatta 7440
tgtatggaaa agttatgtgc atgttgtaga cggttgtaat tcatcaactt gtatgatgtg 7500
ttacaaacgt aatagagcaa caagagtcga atgtacaact attgttaatg gtgttagaag 7560
gtccttttat gtctatgcta atggaggtaa aggcttttgc aaactacaca attggaattg 7620
tgttaattgt gatacattct gtgctggtag tacatttatt agtgatgaag ttgcgagaga 7680
cttgtcacta cagtttaaaa gaccaataaa tcctactgac cagtcttctt acatcgttga 7740
tagtgttaca gtgaagaatg gttccatcca tctttacttt gataaagctg gtcaaaagac 7800
ttatgaaaga cattctctct ctcattttgt taacttagac aacctgagag ctaataacac 7860
taaaggttca ttgcctatta atgttatagt ttttgatggt aaatcaaaat gtgaagaatc 7920
atctgcaaaa tcagcgtctg tttactacag tcagcttatg tgtcaaccta tactgttact 7980
agatcaggca ttagtgtctg atgttggtga tagtgcggaa gttgcagtta aaatgtttga 8040
tgcttacgtt aatacgtttt catcaacttt taacgtacca atggaaaaac tcaaaacact 8100
agttgcaact gcagaagctg aacttgcaaa gaatgtgtcc ttagacaatg tcttatctac 8160
ttttatttca gcagctcggc aagggtttgt tgattcagat gtagaaacta aagatgttgt 8220
tgaatgtctt aaattgtcac atcaatctga catagaagtt actggcgata gttgtaataa 8280
ctatatgctc acctataaca aagttgaaaa catgacaccc cgtgaccttg gtgcttgtat 8340
tgactgtagt gcgcgtcata ttaatgcgca ggtagcaaaa agtcacaaca ttgctttgat 8400
atggaacgtt aaagatttca tgtcattgtc tgaacaacta cgaaaacaaa tacgtagtgc 8460
tgctaaaaag aataacttac cttttaagtt gacatgtgca actactagac aagttgttaa 8520
tgttgtaaca acaaagatag cacttaaggg tggtaaaatt gttaataatt ggttgaagca 8580
gttaattaaa gttacacttg tgttcctttt tgttgctgct attttctatt taataacacc 8640
tgttcatgtc atgtctaaac atactgactt ttcaagtgaa atcataggat acaaggctat 8700
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tgattttgac acatggttta gccagcgtgg tggtagttat actaatgaca aagcttgccc 8820
attgattgct gcagtcataa caagagaagt gggttttgtc gtgcctggtt tgcctggcac 8880
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tggtaacatc tgttacacac catcaaaact tatagagtac actgactttg caacatcagc 9000
ttgtgttttg gctgctgaat gtacaatttt taaagatgct tctggtaagc cagtaccata 9060
ttgttatgat accaatgtac tagaaggttc tgttgcttat gaaagtttac gccctgacac 9120
acgttatgtg ctcatggatg gctctattat tcaatttcct aacacctacc ttgaaggttc 9180
tgttagagtg gtaacaactt ttgattctga gtactgtagg cacggcactt gtgaaagatc 9240
agaagctggt gtttgtgtat ctactagtgg tagatgggta cttaacaatg attattacag 9300
atctttacca ggagttttct gtggtgtaga tgctgtaaat ttacttacta atatgtttac 9360
accactaatt caacctattg gtgctttgga catatcagca tctatagtag ctggtggtat 9420
tgtagctatc gtagtaacat gccttgccta ctattttatg aggtttagaa gagcttttgg 9480
tgaatacagt catgtagttg cctttaatac tttactattc cttatgtcat tcactgtact 9540
ctgtttaaca ccagtttact cattcttacc tggtgtttat tctgttattt acttgtactt 9600
gacattttat cttactaatg atgtttcttt tttagcacat attcagtgga tggttatgtt 9660
cacaccttta gtacctttct ggataacaat tgcttatatc atttgtattt ccacaaagca 9720
tttctattgg ttctttagta attacctaaa gagacgtgta gtctttaatg gtgtttcctt 9780
tagtactttt gaagaagctg cgctgtgcac ctttttgtta aataaagaaa tgtatctaaa 9840
gttgcgtagt gatgtgctat tacctcttac gcaatataat agatacttag ctctttataa 9900
taagtacaag tattttagtg gagcaatgga tacaactagc tacagagaag ctgcttgttg 9960
tcatctcgca aaggctctca atgacttcag taactcaggt tctgatgttc tttaccaacc 10020
accacaaacc tctatcacct cagctgtttt gcagagtggt tttagaaaaa tggcattccc 10080
atctggtaaa gttgagggtt gtatggtaca agtaacttgt ggtacaacta cacttaacgg 10140
tctttggctt gatgacgtag tttactgtcc aagacatgtg atctgcacct ctgaagacat 10200
gcttaaccct aattatgaag atttactcat tcgtaagtct aatcataatt tcttggtaca 10260
ggctggtaat gttcaactca gggttattgg acattctatg caaaattgtg tacttaagct 10320
taaggttgat acagccaatc ctaagacacc taagtataag tttgttcgca ttcaaccagg 10380
acagactttt tcagtgttag cttgttacaa tggttcacca tctggtgttt accaatgtgc 10440
tatgaggccc aatttcacta ttaagggttc attccttaat ggttcatgtg gtagtgttgg 10500
ttttaacata gattatgact gtgtctcttt ttgttacatg caccatatgg aattaccaac 10560
tggagttcat gctggcacag acttagaagg taacttttat ggaccttttg ttgacaggca 10620
aacagcacaa gcagctggta cggacacaac tattacagtt aatgttttag cttggttgta 10680
cgctgctgtt ataaatggag acaggtggtt tctcaatcga tttaccacaa ctcttaatga 10740
ctttaacctt gtggctatga agtacaatta tgaacctcta acacaagacc atgttgacat 10800
actaggacct ctttctgctc aaactggaat tgccgtttta gatatgtgtg cttcattaaa 10860
agaattactg caaaatggta tgaatggacg taccatattg ggtagtgctt tattagaaga 10920
tgaatttaca ccttttgatg ttgttagaca atgctcaggt gttactttcc aaagtgcagt 10980
gaaaagaaca atcaagggta cacaccactg gttgttactc acaattttga cttcactttt 11040
agttttagtc cagagtactc aatggtcttt gttctttttt ttgtatgaaa atgccttttt 11100
accttttgct atgggtatta ttgctatgtc tgcttttgca atgatgtttg tcaaacataa 11160
gcatgcattt ctctgtttgt ttttgttacc ttctcttgcc actgtagctt attttaatat 11220
ggtctatatg cctgctagtt gggtgatgcg tattatgaca tggttggata tggttgatac 11280
tagtttgtct ggttttaagc taaaagactg tgttatgtat gcatcagctg tagtgttact 11340
aatccttatg acagcaagaa ctgtgtatga tgatggtgct aggagagtgt ggacacttat 11400
gaatgtcttg acactcgttt ataaagttta ttatggtaat gctttagatc aagccatttc 11460
catgtgggct cttataatct ctgttacttc taactactca ggtgtagtta caactgtcat 11520
gtttttggcc agaggtattg tttttatgtg tgttgagtat tgccctattt tcttcataac 11580
tggtaataca cttcagtgta taatgctagt ttattgtttc ttaggctatt tttgtacttg 11640
ttactttggc ctcttttgtt tactcaaccg ctactttaga ctgactcttg gtgtttatga 11700
ttacttagtt tctacacagg agtttagata tatgaattca cagggactac tcccacccaa 11760
gaatagcata gatgccttca aactcaacat taaattgttg ggtgttggtg gcaaaccttg 11820
tatcaaagta gccactgtac agtctaaaat gtcagatgta aagtgcacat cagtagtctt 11880
actctcagtt ttgcaacaac tcagagtaga atcatcatct aaattgtggg ctcaatgtgt 11940
ccagttacac aatgacattc tcttagctaa agatactact gaagcctttg aaaaaatggt 12000
ttcactactt tctgttttgc tttccatgca gggtgctgta gacataaaca agctttgtga 12060
agaaatgctg gacaacaggg caaccttaca agctatagcc tcagagttta gttcccttcc 12120
atcatatgca gcttttgcta ctgctcaaga agcttatgag caggctgttg ctaatggtga 12180
ttctgaagtt gttcttaaaa agttgaagaa gtctttgaat gtggctaaat ctgaatttga 12240
ccgtgatgca gccatgcaac gtaagttgga aaagatggct gatcaagcta tgacccaaat 12300
gtataaacag gctagatctg aggacaagag ggcaaaagtt actagtgcta tgcagacaat 12360
gcttttcact atgcttagaa agttggataa tgatgcactc aacaacatta tcaacaatgc 12420
aagagatggt tgtgttccct tgaacataat acctcttaca acagcagcca aactaatggt 12480
tgtcatacca gactataaca catataaaaa tacgtgtgat ggtacaacat ttacttatgc 12540
atcagcattg tgggaaatcc aacaggttgt agatgcagat agtaaaattg ttcaacttag 12600
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ggccaattct gctgtcaaat tacagaataa tgagcttagt cctgttgcac tacgacagat 12720
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ttgtaggttt gttacagaca cacctaaagg tcctaaagtg aagtatttat actttattaa 12960
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tgctgtagat gctgctaaag cttacaaaga ttatctagct agtgggggac aaccaatcac 13140
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acctacaact tgtgctaatg accctgtggg ttttacactt aaaaacacag tctgtaccgt 13380
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attgcaacat gtgactggac aaatgctggt gattacattt tagctaacac ctgtactgaa 16620
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gatatagttg tctttgatga aatttcaatg gccacaaatt atgatttgag tgttgtcaat 17400
gccagattac gtgctaagca ctatgtgtac attggcgacc ctgctcaatt acctgcacca 17460
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gttgacactg tgagtgcttt ggtttatgat aataagctta aagcacataa agacaaatca 17640
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tacaaaatgc aaagaatgct attagaaaag tgtgaccttc aaaattatgg tgatagtgca 20760
acattaccta aaggcataat gatgaatgtc gcaaaatata ctcaactgtg tcaatattta 20820
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tgtgcaactg tacatacagc taataaatgg gatctcatta ttagtgatat gtacgaccct 21060
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acagtgaaca atgctaggga gagctgccta tatggaagag ccctaatgtg taaaattaat 29820
tttagtagtg ctatccccat gtgattttaa tagcttctta ggagaatgac aaaaaaaaaa 29880
aaaaaaaaaa a 29891
<210> 2
<211> 29891
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS CoV-2
<400> 2
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120
cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180
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aggtgccact acttgtggtt acttacccca aaatgctgtt gttaaaattt attgtccagc 1380
atgtcacaat tcagaagtag gacctgagca tagtcttgcc gaataccata atgaatctgg 1440
cttgaaaacc attcttcgta agggtggtcg cactattgcc tttggaggct gtgtgttctc 1500
ttatgttggt tgccataaca agtgtgccta ttgggttcca cgtgctagcg ctaacatagg 1560
ttgtaaccat acaggtgttg ttggagaagg ttccgaaggt cttaatgaca accttcttga 1620
aatactccaa aaagagaaag tcaacatcaa tattgttggt gactttaaac ttaatgaaga 1680
gatcgccatt attttggcat ctttttctgc ttccacaagt gcttttgtgg aaactgtgaa 1740
aggtttggat tataaagcat tcaaacaaat tgttgaatcc tgtggtaatt ttaaagttac 1800
aaaaggaaaa gctaaaaaag gtgcctggaa tattggtgaa cagaaatcaa tactgagtcc 1860
tctttatgca tttgcatcag aggctgctcg tgttgtacga tcaattttct cccgcactct 1920
tgaaactgct caaaattctg tgcgtgtttt acagaaggcc gctataacaa tactagatgg 1980
aatttcacag tattcactga gactcattga tgctatgatg ttcacatctg atttggctac 2040
taacaatcta gttgtaatgg cctacattac aggtggtgtt gttcagttga cttcgcagtg 2100
gctaactaac atctttggca ctgtttatga aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga 2160
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ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa 2280
ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc 2340
tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca 2400
ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc 2460
tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt 2520
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cttcacactc aaaggcggtg caccaacaaa ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga 2760
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acttaatgag aagtgctctg cctatacagt tgaactcggt acagaagtaa atgagttcgc 2880
ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc 2940
actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg 3000
tgagtttaaa ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga 3060
agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga 3120
agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga 3180
agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga 3240
cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt 3300
agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt 3360
aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt 3420
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aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc 3540
tactaatgga ccacttaaag tgggtggtag ttgtgtttta agcggacaca atcttgctaa 3600
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tatttttggt gctgacccta tacattcttt aagagtttgt gtagatactg ttcgcacaaa 3780
tgtctactta gctgtctttg ataaaaatct ctatgacaaa cttgtttcaa gctttttgga 3840
aatgaagagt gaaaagcaag ttgaacaaaa gatcgctgag attcctaaag aggaagttaa 3900
gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat 3960
caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa 4020
cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag 4080
tgacattgac atcactttct taaagaaaga tgctccatat atagtgggtg atgttgttca 4140
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gggtttaaat ggttacactg tagaggaggc aaagacagtg cttaaaaagt gtaaaagtgc 4320
cttttacatt ctaccatcta ttatctctaa tgagaagcaa gaaattcttg gaactgtttc 4380
ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg 4440
tgtggaaact aaagccatag tttcaactat acagcgtaaa tataagggta ttaaaataca 4500
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agctacagtt tctgtttctt cacctgatgc tgttacagcg tataatggtt atcttacttc 4740
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agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga 4860
taaaagtgta tattacacta gtaatcctac cacattccac ctagatggtg aagttatcac 4920
ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac 4980
aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca 5040
acagtttggt ccaacttatt tggatggagc tgatgttact aaaataaaac ctcataattc 5100
acatgaaggt aaaacatttt atgttttacc taatgatgac actctacgtg ttgaggcttt 5160
tgagtactac cacacaactg atcctagttt tctgggtagg tacatgtcag cattaaatca 5220
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caactgttat cttgccactg cattgttaac actccaacaa atagagttga agtttaatcc 5340
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ttacacaaca accataaaac cagttactta taaattggat ggtgttgttt gtacagaaat 5940
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tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc 6120
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tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga 6360
cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt 6420
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aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca 6540
cacagatcta atggctgctt atgtagacaa ttctagtctt actattaaga aacctaatga 6600
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tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc 7200
atcttttaaa tgggatttaa ctgcttttgg cttagttgca gagtggtttt tggcatatat 7260
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ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt 7380
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ttacaaacgt aatagagcaa caagagtcga atgtacaact attgttaatg gtgttagaag 7560
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tgttaattgt gatacattct gtgctggtag tacatttatt agtgatgaag ttgcgagaga 7680
cttgtcacta cagtttaaaa gaccaataaa tcctactgac cagtcttctt acatcgttga 7740
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atctgcaaaa tcagcgtctg tttactacag tcagcttatg tgtcaaccta tactgttact 7980
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tgcttacgtt aatacgtttt catcaacttt taacgtacca atggaaaaac tcaaaacact 8100
agttgcaact gcagaagctg aacttgcaaa gaatgtgtcc ttagacaatg tcttatctac 8160
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tgaatgtctt aaattgtcac atcaatctga catagaagtt actggcgata gttgtaataa 8280
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atggaacgtt aaagatttca tgtcattgtc tgaacaacta cgaaaacaaa tacgtagtgc 8460
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gttaattaaa gttacacttg tgttcctttt tgttgctgct attttctatt taataacacc 8640
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tggtaacatc tgttacacac catcaaaact tatagagtac actgactttg caacatcagc 9000
ttgtgttttg gctgctgaat gtacaatttt taaagatgct tctggtaagc cagtaccata 9060
ttgttatgat accaatgtac tagaaggttc tgttgcttat gaaagtttac gccctgacac 9120
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taagtacaag tattttagtg gagcaatgga tacaactagc tacagagaag ctgcttgttg 9960
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gcttaaccct aattatgaag atttactcat tcgtaagtct aatcataatt tcttggtaca 10260
ggctggtaat gttcaactca gggttattgg acattctatg caaaattgtg tacttaagct 10320
taaggttgat acagccaatc ctaagacacc taagtataag tttgttcgca ttcaaccagg 10380
acagactttt tcagtgttag cttgttacaa tggttcacca tctggtgttt accaatgtgc 10440
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ttttaacata gattatgact gtgtctcttt ttgttacatg caccatatgg aattaccaac 10560
tggagttcat gctggcacag acttagaagg taacttttat ggaccttttg ttgacaggca 10620
aacagcacaa gcagctggta cggacacaac tattacagtt aatgttttag cttggttgta 10680
cgctgctgtt ataaatggag acaggtggtt tctcaatcga tttaccacaa ctcttaatga 10740
ctttaacctt gtggctatga agtacaatta tgaacctcta acacaagacc atgttgacat 10800
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tgaatttaca ccttttgatg ttgttagaca atgctcaggt gttactttcc aaagtgcagt 10980
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gcatgcattt ctctgtttgt ttttgttacc ttctcttgcc actgtagctt attttaatat 11220
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tagtttgtct ggttttaagc taaaagactg tgttatgtat gcatcagctg tagtgttact 11340
aatccttatg acagcaagaa ctgtgtatga tgatggtgct aggagagtgt ggacacttat 11400
gaatgtcttg acactcgttt ataaagttta ttatggtaat gctttagatc aagccatttc 11460
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tggtaataca cttcagtgta taatgctagt ttattgtttc ttaggctatt tttgtacttg 11640
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ttaatgccta tattaacctt gaccagggct ttaactgcag agtcacatgt tgacactgac 14220
ttaacaaagc cttacattaa gtgggatttg ttaaaatatg acttcacgga agagaggtta 14280
aaactctttg accgttattt taaatattgg gatcagacat accacccaaa ttgtgttaac 14340
tgtttggatg acagatgcat tctgcattgt gcaaacttta atgttttatt ctctacagtg 14400
ttcccaccta caagttttgg accactagtg agaaaaatat ttgttgatgg tgttccattt 14460
gtagtttcaa ctggatacca cttcagagag ctaggtgttg tacataatca ggatgtaaac 14520
ttacatagct ctagacttag ttttaaggaa ttacttgtgt atgctgctga ccctgctatg 14580
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ccaacaatgt gtgatatcag acaactacta tttgtagttg aagttgttga taagtacttt 14880
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atgttaaaaa ctgtttatag tgatgtagaa aaccctcacc ttatgggttg ggattatcct 15300
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aactcaggcc taaactcatg cagaccacac aaggcagatg ggctatataa acgttttcgc 29580
ttttccgttt acgatatata gtctactctt gtgcagaatg aattctcgta actacatagc 29640
acaagtagat gtagttaact ttaatctcac atagcaatct ttaatcagtg tgtaacatta 29700
gggaggactt gaaagagcca ccacattttc accgaggcca cgcggagtac gatcgagtgt 29760
acagtgaaca atgctaggga gagctgccta tatggaagag ccctaatgtg taaaattaat 29820
tttagtagtg ctatccccat gtgattttaa tagcttctta ggagaatgac aaaaaaaaaa 29880
aaaaaaaaaa a 29891
<210> 3
<211> 29891
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 3
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120
cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180
ttctgcaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt 240
cgtccgggtg tgaccgaaag gtaagatgga gagccttgtc cctggtttca acgagaaaac 300
acacgtccaa ctcagtttgc ctgttttaca ggttcgcgac gtgctcgtac gtggctttgg 360
agactccgtg gaggaggtct tatcagaggc acgtcaacat cttaaagatg gcacttgtgg 420
cttagtagaa gttgaaaaag gcgttttgcc tcaacttgaa cagccctatg tgttcatcaa 480
acgttcggat gctcgaactg cacctcatgg tcatgttatg gttgagctgg tagcagaact 540
cgaaggcatt cagtacggtc gtagtggtga gacacttggt gtccttgtcc ctcatgtggg 600
cgaaatacca gtggcttacc gcaaggttct tcttcgtaag aacggtaata aaggagctgg 660
tggccatagt tacggcgccg atctaaagtc atttgactta ggcgacgagc ttggcactga 720
tccttatgaa gattttcaag aaaactggaa cactaaacat agcagtggtg ttacccgtga 780
actcatgcgt gagcttaacg gaggggcata cactcgctat gtcgataaca acttctgtgg 840
ccctgatggc taccctcttg agtgcattaa agaccttcta gcacgtgctg gtaaagcttc 900
atgcactttg tccgaacaac tggactttat tgacactaag aggggtgtat actgctgccg 960
tgaacatgag catgaaattg cttggtacac ggaacgttct gaaaagagct atgaattgca 1020
gacacctttt gaaattaaat tggcaaagaa atttgacacc ttcaatgggg aatgtccaaa 1080
ttttgtattt cccttaaatt ccataatcaa gactattcaa ccaagggttg aaaagaaaaa 1140
gcttgatggc tttatgggta gaattcgatc tgtctatcca gttgcgtcac caaatgaatg 1200
caaccaaatg tgcctttcaa ctctcatgaa gtgtgatcat tgtggtgaaa cttcatggca 1260
gacgggcgat tttgttaaag ccacttgcga attttgtggc actgagaatt tgactaaaga 1320
aggtgccact acttgtggtt acttacccca aaatgctgtt gttaaaattt attgtccagc 1380
atgtcacaat tcagaagtag gacctgagca tagtcttgcc gaataccata atgaatctgg 1440
cttgaaaacc attcttcgta agggtggtcg cactattgcc tttggaggct gtgtgttctc 1500
ttatgttggt tgccataaca agtgtgccta ttgggttcca cgtgctagcg ctaacatagg 1560
ttgtaaccat acaggtgttg ttggagaagg ttccgaaggt cttaatgaca accttcttga 1620
aatactccaa aaagagaaag tcaacatcaa tattgttggt gactttaaac ttaatgaaga 1680
gatcgccatt attttggcat ctttttctgc ttccacaagt gcttttgtgg aaactgtgaa 1740
aggtttggat tataaagcat tcaaacaaat tgttgaatcc tgtggtaatt ttaaagttac 1800
aaaaggaaaa gctaaaaaag gtgcctggaa tattggtgaa cagaaatcaa tactgagtcc 1860
tctttatgca tttgcatcag aggctgctcg tgttgtacga tcaattttct cccgcactct 1920
tgaaactgct caaaattctg tgcgtgtttt acagaaggcc gctataacaa tactagatgg 1980
aatttcacag tattcactga gactcattga tgctatgatg ttcacatctg atttggctac 2040
taacaatcta gttgtaatgg cctacattac aggtggtgtt gttcagttga cttcgcagtg 2100
gctaactaac atctttggca ctgtttatga aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga 2160
agagaagttt aaggaaggtg tagagtttct tagagatggt tgggaaattg ttaaatttat 2220
ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa 2280
ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc 2340
tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca 2400
ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc 2460
tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt 2520
aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga 2580
agctgttgaa gctccattgg ttggtacacc agtttgtatt aacgggctta tgttgctcga 2640
aatcaaagac acagaaaagt actgtgccct tgcacctaat atgatggtaa caaacaatac 2700
cttcacactc aaaggcggtg caccaacaaa ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga 2760
agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt 2820
acttaatgag aagtgctctg cctatacagt tgaactcggt acagaagtaa atgagttcgc 2880
ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc 2940
actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg 3000
tgagtttaaa ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga 3060
agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga 3120
agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga 3180
agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga 3240
cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt 3300
agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt 3360
aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt 3420
aaaaccaaca gtggttgtta atgcagccaa tgtttacctt aaacatggag gaggtgttgc 3480
aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc 3540
tactaatgga ccacttaaag tgggtggtag ttgtgtttta agcggacaca atcttgctaa 3600
acactgtctt catgttgtcg gcccaaatgt taacaaaggt gaagacattc aacttcttaa 3660
gagtgcttat gaaaatttta atcagcacga agttctactt gcaccattat tatcagctgg 3720
tatttttggt gctgacccta tacattcttt aagagtttgt gtagatactg ttcgcacaaa 3780
tgtctactta gctgtctttg ataaaaatct ctatgacaaa cttgtttcaa gctttttgga 3840
aatgaagagt gaaaagcaag ttgaacaaaa gatcgctgag attcctaaag aggaagttaa 3900
gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat 3960
caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa 4020
cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag 4080
tgacattgac atcactttct taaagaaaga tgctccatat atagtgggtg atgttgttca 4140
agagggtgtt ttaactgctg tggttatacc tactaaaaag gctggtggca ctactgaaat 4200
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gggtttaaat ggttacactg tagaggaggc aaagacagtg cttaaaaagt gtaaaagtgc 4320
cttttacatt ctaccatcta ttatctctaa tgagaagcaa gaaattcttg gaactgtttc 4380
ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg 4440
tgtggaaact aaagccatag tttcaactat acagcgtaaa tataagggta ttaaaataca 4500
agagggtgtg gttgattatg gtgctagatt ttacttttac accagtaaaa caactgtagc 4560
gtcacttatc aacacactta acgatctaaa tgaaactctt gttacaatgc cacttggcta 4620
tgtaacacat ggcttaaatt tggaagaagc tgctcggtat atgagatctc tcaaagtgcc 4680
agctacagtt tctgtttctt cacctgatgc tgttacagcg tataatggtt atcttacttc 4740
ttcttctaaa acacctgaag aacattttat tgaaaccatc tcacttgctg gttcctataa 4800
agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga 4860
taaaagtgta tattacacta gtaatcctac cacattccac ctagatggtg aagttatcac 4920
ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac 4980
aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca 5040
acagtttggt ccaacttatt tggatggagc tgatgttact aaaataaaac ctcataattc 5100
acatgaaggt aaaacatttt atgttttacc taatgatgac actctacgtg ttgaggcttt 5160
tgagtactac cacacaactg atcctagttt tctgggtagg tacatgtcag cattaaatca 5220
cactaaaaag tggaaatacc cacaagttaa tggtttaact tctattaaat gggcagataa 5280
caactgttat cttgccactg cattgttaac actccaacaa atagagttga agtttaatcc 5340
acctgctcta caagatgctt attacagagc aagggctggt gaagctgcta acttttgtgc 5400
acttatctta gcctactgta ataagacagt aggtgagtta ggtgatgtta gagaaacaat 5460
gagttacttg tttcaacatg ccaatttaga ttcttgcaaa agagtcttga acgtggtgtg 5520
taaaacttgt ggacaacagc agacaaccct taagggtgta gaagctgtta tgtacatggg 5580
cacactttct tatgaacaat ttaagaaagg tgttcagata ccttgtacgt gtggtaaaca 5640
agctacaaaa tatctagtac aacaggagtc accttttgtt atgatgtcag caccacctgc 5700
tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca 5760
gtgtggtcac tataaacata taacttctaa agaaactttg tattgcatag acggtgcttt 5820
acttacaaag tcctcagaat acaaaggtcc tattacggat gttttctaca aagaaaacag 5880
ttacacaaca accataaaac cagttactta taaattggat ggtgttgttt gtacagaaat 5940
tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat 6000
tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg 6060
tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc 6120
aagagagctt aaagttacat ttttccctga cttaaatggt gatgtggtgg ctattgatta 6180
taaacactac acaccctctt ttaagaaagg agctaaattg ttacataaac ctattgtttg 6240
gcatgttaac aatgcaacta ataaagccac gtataaacca aatacctggt gtatacgttg 6300
tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga 6360
cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt 6420
ggaaaatcct accatacaga aagacgttct tgagtgtaat gtgaaaacta ccgaagttgt 6480
aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca 6540
cacagatcta atggctgctt atgtagacaa ttctagtctt actattaaga aacctaatga 6600
attatctaga gtattaggtt tgaaaaccct tgctactcat ggtttagctg ctgttaatag 6660
tgtcccttgg gatactatag ctaattatgc taagcctttt cttaacaaag ttgttagtac 6720
aactactaac atagttacac ggtgtttaaa ccgtgtttgt actaattata tgccttattt 6780
ctttacttta ttgctacaat tgtgtacttt tactagaagt acaaattcta gaattaaagc 6840
atctatgccg actactatag caaagaatac tgttaagagt gtcggtaaat tttgtctaga 6900
ggcttcattt aattatttga agtcacctaa tttttctaaa ctgataaata ttataatttg 6960
gtttttacta ttaagtgttt gcctaggttc tttaatctac tcaaccgctg ctttaggtgt 7020
tttaatgtct aatttaggca tgccttctta ctgtactggt tacagagaag gctatttgaa 7080
ctctactaat gtcactattg caacctactg tactggttct ataccttgta gtgtttgtct 7140
tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc 7200
atcttttaaa tgggatttaa ctgcttttgg cttagttgca gagtggtttt tggcatatat 7260
tcttttcact aggtttttct atgtacttgg attggctgca atcatgcaat tgtttttcag 7320
ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt 7380
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tgttaattgt gatacattct gtgctggtag tacatttatt agtgatgaag ttgcgagaga 7680
cttgtcacta cagtttaaaa gaccaataaa tcctactgac cagtcttctt acatcgttga 7740
tagtgttaca gtgaagaatg gttccatcca tctttacttt gataaagctg gtcaaaagac 7800
ttatgaaaga cattctctct ctcattttgt taacttagac aacctgagag ctaataacac 7860
taaaggttca ttgcctatta atgttatagt ttttgatggt aaatcaaaat gtgaagaatc 7920
atctgcaaaa tcagcgtctg tttactacag tcagcttatg tgtcaaccta tactgttact 7980
agatcaggca ttagtgtctg atgttggtga tagtgcggaa gttgcagtta aaatgtttga 8040
tgcttacgtt aatacgtttt catcaacttt taacgtacca atggaaaaac tcaaaacact 8100
agttgcaact gcagaagctg aacttgcaaa gaatgtgtcc ttagacaatg tcttatctac 8160
ttttatttca gcagctcggc aagggtttgt tgattcagat gtagaaacta aagatgttgt 8220
tgaatgtctt aaattgtcac atcaatctga catagaagtt actggcgata gttgtaataa 8280
ctatatgctc acctataaca aagttgaaaa catgacaccc cgtgaccttg gtgcttgtat 8340
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atggaacgtt aaagatttca tgtcattgtc tgaacaacta cgaaaacaaa tacgtagtgc 8460
tgctaaaaag aataacttac cttttaagtt gacatgtgca actactagac aagttgttaa 8520
tgttgtaaca acaaagatag cacttaaggg tggtaaaatt gttaataatt ggttgaagca 8580
gttaattaaa gttacacttg tgttcctttt tgttgctgct attttctatt taataacacc 8640
tgttcatgtc atgtctaaac atactgactt ttcaagtgaa atcataggat acaaggctat 8700
tgatggtggt gtcactcgtg acatagcatc tacagatact tgttttgcta acaaacatgc 8760
tgattttgac acatggttta gccagcgtgg tggtagttat actaatgaca aagcttgccc 8820
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gatattacgc acaactaatg gtgacttttt gcatttctta cctagagttt ttagtgcagt 8940
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tgttagagtg gtaacaactt ttgattctga gtactgtagg cacggcactt gtgaaagatc 9240
agaagctggt gtttgtgtat ctactagtgg tagatgggta cttaacaatg attattacag 9300
atctttacca ggagttttct gtggtgtaga tgctgtaaat ttacttacta atatgtttac 9360
accactaatt caacctattg gtgctttgga catatcagca tctatagtag ctggtggtat 9420
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tgaatacagt catgtagttg cctttaatac tttactattc cttatgtcat tcactgtact 9540
ctgtttaaca ccagtttact cattcttacc tggtgtttat tctgttattt acttgtactt 9600
gacattttat cttactaatg atgtttcttt tttagcacat attcagtgga tggttatgtt 9660
cacaccttta gtacctttct ggataacaat tgcttatatc atttgtattt ccacaaagca 9720
tttctattgg ttctttagta attacctaaa gaggcgtgta gtctttaatg gtgtttcctt 9780
tagtactttt gaagaagctg cgctgtgcac ctttttgtta aataaagaaa tgtatctaaa 9840
gttgcgtagt gatgtgctat tacctcttac gcaatataat agatacttag ctctttataa 9900
taagtacaag tattttagtg gagcaatgga tacaactagc tacagagaag ctgcttgttg 9960
tcatctcgca aaggctctca atgacttcag taactcaggt tctgatgttc tttaccaacc 10020
accacaaacc tctatcacct cagctgtttt gcagagtggt tttagaaaaa tggcattccc 10080
atctggtaaa gttgagggtt gtatggtaca agtaacttgt ggtacaacta cacttaacgg 10140
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ggctggtaat gttcaactca gggttattgg acattctatg caaaattgtg tacttaagct 10320
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acagactttt tcagtgttag cttgttacaa tggttcacca tctggtgttt accaatgtgc 10440
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tggagttcat gctggcacag acttagaagg taacttttat ggaccttttg ttgacaggca 10620
aacagcacaa gcagctggta cggacacaac tattacagtt aatgttttag cttggttgta 10680
cgctgctgtt ataaatggag acaggtggtt tctcaatcga tttaccacaa ctcttaatga 10740
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actaggacct ctttctgctc aaactggaat tgccgtttta gatatgtgtg cttcattaaa 10860
agaattactg caaaatggta tgaatggacg taccatattg ggtagtgctt tattagaaga 10920
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gaaaagaaca atcaagggta cacaccactg gttgttactc acaattttga cttcactttt 11040
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accttttgct atgggtatta ttgctatgtc tgcttttgca atgatgtttg tcaaacataa 11160
gcatgcattt ctctgtttgt ttttgttacc ttctcttgcc actgtagctt attttaatat 11220
ggtctatatg cctgctagtt gggtgatgcg tattatgaca tggttggata tggttgatac 11280
tagtttgtct ggttttaaac ttaaggattg tgttatgtac gctagtgccg ttgtgttatt 11340
gattcttatg actgctagaa cagtttatga cgacggagct agacgcgttt ggacacttat 11400
gaacgtactt acactcgtat ataaggtata ttatggtaac gcactcgatc aggctatatc 11460
tatgtgggca ttgattatat ccgttacgtc taattattca ggcgtagtta ctacagttat 11520
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gttatcagtg ttacagcaat tgagagtcga atctagttct aagttatggg ctcaatgcgt 11940
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tgctgtagat gctgctaaag cttacaaaga ttatctagct agtgggggac aaccaatcac 13140
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ggaagccaat atggatcaag aatcctttgg tggtgcatcg tgttgtctgt actgccgttg 13260
ccacatagat catccaaatc ctaaaggatt ttgtgactta aaaggtaagt atgtacaaat 13320
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ctgcggtatg tggaaaggtt atggctgtag ttgtgatcaa ctccgcgaac ccatgcttca 13440
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ataacacttt gcttcacact caaaagaaag acagaatgat tgaactttca ttaattgact 27780
tctatttgtg ctttttagcc tttctgctat tccttgtttt aattatgctt attatctttt 27840
ggttctcact tgaactgcaa gatcataatg aaacttgtca cgcctaaacg aacatgaaat 27900
ttcttgtttt cttaggaatc atcacaactg tagctgcatt tcaccaagaa tgtagtttac 27960
agtcatgtac tcaacatcaa ccatatgtag ttgatgaccc gtgtcctatt cacttctatt 28020
ctaaatggta tattagagta ggagctagaa aatcagcacc tttaattgaa ttgtgcgtgg 28080
atgaggctgg ttctaaatca cccattcagt acatcgatat cggtaattat acagtttcct 28140
gtttaccttt tacaattaat tgccaggaac ctaaattggg tagtcttgta gtgcgttgtt 28200
cgttctatga agacttttta gagtatcatg acgttcgtgt tgttttagat ttcatctaaa 28260
cgaacaaact aaaatgtctg ataatggacc ccaaaatcag cgaaatgcac cccgcattac 28320
gtttggtgga ccctcagatt caactggcag taaccagaat ggagaacgca gtggggcgcg 28380
atcaaaacaa cgtcggcccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcaccgctct 28440
cactcaacat ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc caattaacac 28500
caatagcagt ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg 28560
tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat ttctactacc taggaactgg 28620
gccagaagct ggacttccct atggtgctaa caaagacggc atcatatggg ttgcaactga 28680
gggagccttg aatacaccaa aagatcacat tggcacccgc aatcctgcta acaatgctgc 28740
aatcgtgcta caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagaagggag 28800
cagaggcggc agtcaagcct cttctcgttc ctcatcacgt agtcgcaaca gttcaagaaa 28860
ttcaactcca ggcagcagta ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga 28920
tgctgctctt gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtctgg 28980
taaaggccaa caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcttctaa 29040
gaagcctcgg caaaaacgta ctgccactaa agcatacaat gtaacacaag ctttcggcag 29100
acgtggtcca gaacaaaccc aaggaaattt tggggaccag gaactaatca gacaaggaac 29160
tgattacaaa cattggccgc aaattgcaca atttgccccc agcgcttcag cgttcttcgg 29220
aatgtcgcgc attggcatgg aagtcacacc ttcgggaacg tggttgacct acacaggtgc 29280
catcaaattg gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc tgaataagca 29340
tattgacgca tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaagaaggc 29400
tgatgaaact caagccttac cgcagagaca gaagaaacag caaactgtga ctcttcttcc 29460
tgctgcagat ttggatgatt tctccaaaca attgcaacaa tccatgagca gtgctgactc 29520
aactcaggcc taaactcatg cagaccacac aaggcagatg ggctatataa acgttttcgc 29580
ttttccgttt acgatatata gtctactctt gtgcagaatg aattctcgta actacatagc 29640
acaagtagat gtagttaact ttaatctcac atagcaatct ttaatcagtg tgtaacatta 29700
gggaggactt gaaagagcca ccacattttc accgaggcca cgcggagtac gatcgagtgt 29760
acagtgaaca atgctaggga gagctgccta tatggaagag ccctaatgtg taaaattaat 29820
tttagtagtg ctatccccat gtgattttaa tagcttctta ggagaatgac aaaaaaaaaa 29880
aaaaaaaaaa a 29891
<210> 4
<211> 29855
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 4
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120
cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180
ttctgcaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt 240
cgtccgggtg tgaccgaaag gtaagatgga gagccttgtc cctggtttca acgagaaaac 300
acacgtccaa ctcagtttgc ctgttttaca ggttcgcgac gtgctcgtac gtggctttgg 360
agactccgtg gaggaggtct tatcagaggc acgtcaacat cttaaagatg gcacttgtgg 420
cttagtagaa gttgaaaaag gcgttttgcc tcaacttgaa cagccctatg tgttcatcaa 480
acgttcggat gctcgaactg cacctcatgg tcatgttatg gttgagctgg tagcagaact 540
cgaaggcatt cagtacggtc gtagtggtga gacacttggt gtccttgtcc ctcatgtggg 600
cgaaatacca gtggcttacc gcaaggttct tcttcgtaag aacggtaata aaggagctgg 660
tggccatagt tacggcgccg atctaaagtc atttgactta ggcgacgagc ttggcactga 720
tccttatgaa gattttcaag aaaactggaa cactaaacat agcagtggtg ttacccgtga 780
actcatgcgt gagcttaacg gaggggcata cactcgctat gtcgataaca acttctgtgg 840
ccctgatggc taccctcttg agtgcattaa agaccttcta gcacgtgctg gtaaagcttc 900
atgcactttg tccgaacaac tggactttat tgacactaag aggggtgtat actgctgccg 960
tgaacatgag catgaaattg cttggtacac ggaacgttct gaaaagagct atgaattgca 1020
gacacctttt gaaattaaat tggcaaagaa atttgacacc ttcaatgggg aatgtccaaa 1080
ttttgtattt cccttaaatt ccataatcaa gactattcaa ccaagggttg aaaagaaaaa 1140
gcttgatggc tttatgggta gaattcgatc tgtctatcca gttgcgtcac caaatgaatg 1200
caaccaaatg tgcctttcaa ctctcatgaa gtgtgatcat tgtggtgaaa cttcatggca 1260
gacgggcgat tttgttaaag ccacttgcga attttgtggc actgagaatt tgactaaaga 1320
aggtgccact acttgtggtt acttacccca aaatgctgtt gttaaaattt attgtccagc 1380
atgtcacaat tcagaagtag gacctgagca tagtcttgcc gaataccata atgaatctgg 1440
cttgaaaacc attcttcgta agggtggtcg cactattgcc tttggaggct gtgtgttctc 1500
ttatgttggt tgccataaca agtgtgccta ttgggttcca cgtgctagcg ctaacatagg 1560
ttgtaaccat acaggtgttg ttggagaagg ttccgaaggt cttaatgaca accttcttga 1620
aatactccaa aaagagaaag tcaacatcaa tattgttggt gactttaaac ttaatgaaga 1680
gatcgccatt attttggcat ctttttctgc ttccacaagt gcttttgtgg aaactgtgaa 1740
aggtttggat tataaagcat tcaaacaaat tgttgaatcc tgtggtaatt ttaaagttac 1800
aaaaggaaaa gctaaaaaag gtgcctggaa tattggtgaa cagaaatcaa tactgagtcc 1860
tctttatgca tttgcatcag aggctgctcg tgttgtacga tcaattttct cccgcactct 1920
tgaaactgct caaaattctg tgcgtgtttt acagaaggcc gctataacaa tactagatgg 1980
aatttcacag tattcactga gactcattga tgctatgatg ttcacatctg atttggctac 2040
taacaatcta gttgtaatgg cctacattac aggtggtgtt gttcagttga cttcgcagtg 2100
gctaactaac atctttggca ctgtttatga aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga 2160
agagaagttt aaggaaggtg tagagtttct tagagacggt tgggaaattg ttaaatttat 2220
ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa 2280
ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc 2340
tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca 2400
ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc 2460
tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt 2520
aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga 2580
agctgttgaa gctccattgg ttggtacacc agtttgtatt aacgggctta tgttgctcga 2640
aatcaaagac acagaaaagt actgtgccct tgcacctaat atgatggtaa caaacaatac 2700
cttcacactc aaaggcggtg caccaacaaa ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga 2760
agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt 2820
acttaatgag aagtgctctg cctatacagt tgaactcggt acagaagtaa atgagttcgc 2880
ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc 2940
actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg 3000
tgagtttata ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga 3060
agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga 3120
agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga 3180
agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga 3240
cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt 3300
agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt 3360
aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt 3420
aaaaccaaca gtggttgtta atgcagccaa tgtttacctt aaacatggag gaggtgttgc 3480
aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc 3540
tactaatgga ccacttaaag tgggtggtag ttgtgtttta agcggacaca atcttgctaa 3600
acactgtctt catgttgtcg gcccaaatgt taacaaaggt gaagacattc aacttcttaa 3660
gagtgcttat gaaaatttta atcagcacga agttctactt gcaccattat tatcagctgg 3720
tatttttggt gctgacccta tacattcttt aagagtttgt gtagatactg ttcgcacaaa 3780
tgtctactta gctgtctttg ataaaaatct ctatgacaaa cttgtttcaa gctttttgga 3840
aatgaagagt gaaaagcaag ttgaacaaaa gatcgctgag attcctaaag aggaagttaa 3900
gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat 3960
caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa 4020
cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag 4080
tgacattgac atcactttct taaagaaaga tgctccatat atagtgggtg atgttgttca 4140
agagggtgtt ttaactgctg tggttatacc tactaaaaag gctggtggca ctactgaaat 4200
gctagcgaaa gctttgagaa aagtgccaac agacaattat ataaccactt acccgggtca 4260
gggtttaaat ggttacactg tagaggaggc aaagacagtg cttaaaaagt gtaaaagtgc 4320
cttttacatt ctaccatcta ttatctctaa tgagaagcaa gaaattcttg gaactgtttc 4380
ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg 4440
tgtggaaact aaagccatag tttcaactat acagcgtaaa tataagggta ttaaaataca 4500
agagggtgtg gttgattatg gtgctagatt ttacttttac accagtaaaa caactgtagc 4560
gtcacttatc aacacactta acgatctaaa tgaaactctt gttacaatgc cacttggcta 4620
tgtaacacat ggcttaaatt tggaagaagc tgctcggtat atgagatctc tcaaagtgcc 4680
agctacagtt tctgtttctt cacctgatgc tgttacagcg tataatggtt atcttacttc 4740
ttcttctaaa acacctgaag aacattttat tgaaaccatc tcacttgctg gttcctataa 4800
agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga 4860
taaaagtgta tattacacta gtaatcctac cacattccac ctagatggtg aagttatcac 4920
ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac 4980
aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca 5040
acagtttggt ccaacttatt tggatggagc tgatgttact aaaataaaac ctcataattc 5100
acatgaaggt aaaacatttt atgttttacc taatgatgac actctacgtg ttgaggcttt 5160
tgagtactac cacacaactg atcctagttt tctgggtagg tacatgtcag cattaaatca 5220
cactaaaaag tggaaatacc cacaagttaa tggtttaact tctattaaat gggcagataa 5280
caactgttat cttgccactg cattgttaac actccaacaa atagagttga agtttaatcc 5340
acctgctcta caagatgctt attacagagc aagggctggt gaagctgcta acttttgtgc 5400
acttatctta gcctactgta ataagacagt aggtgagtta ggtgatgtta gagaaacaat 5460
gagttacttg tttcaacatg ccaatttaga ttcttgcaaa agagtcttga acgtggtgtg 5520
taaaacttgt ggacaacagc agacaaccct taagggtgta gaagctgtta tgtacatggg 5580
cacactttct tatgaacaat ttaagaaagg tgttcagata ccttgtacgt gtggtaaaca 5640
agctacaaaa tatctagtac aacaggagtc accttttgtt atgatgtcag caccacctgc 5700
tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca 5760
gtgtggtcac tataaacata taacttctaa agaaactttg tattgcatag acggtgcttt 5820
acttacaaag tcctcagaat acaaaggtcc tattacggat gttttctaca aagaaaacag 5880
ttacacaaca accataaaac cagttactta taaattggat ggtgttgttt gtacagaaat 5940
tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat 6000
tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg 6060
tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc 6120
aagagagctt aaagttacat ttttccctga cttaaatggt gatgtggtgg ctattgatta 6180
taaacactac acaccctctt ttaagaaagg agctaaattg ttacataaac ctattgtttg 6240
gcatgttaac aatgcaacta ataaagccac gtataaacca aatacctggt gtatacgttg 6300
tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga 6360
cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt 6420
ggaaaatcct accatacaga aagacgttct tgagtgtaat gtgaaaacta ccgaagttgt 6480
aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca 6540
cacagatcta atggctgctt atgtagacaa ttctagtctt actattaaga aacctaatga 6600
attatctaga gtattaggtt tgaaaaccct tgctactcat ggtttagctg ctgttaatag 6660
tgtcccttgg gatactatag ctaattatgc taagcctttt cttaacaaag ttgttagtac 6720
aactactaac atagttacac ggtgtttaaa ccgtgtttgt actaattata tgccttattt 6780
ctttacttta ttgctacaat tgtgtacttt tactagaagt acaaattcta gaattaaagc 6840
atctatgccg actactatag caaagaatac tgttaagagt gtcggtaaat tttgtctaga 6900
ggcttcattt aattatttga agtcacctaa tttttctaaa ctgataaata ttataatttg 6960
gtttttacta ttaagtgttt gcctaggttc tttaatctac tcaaccgctg ctttaggtgt 7020
tttaatgtct aatttaggca tgccttctta ctgtactggt tacagagaag gctatttgaa 7080
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tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc 7200
atcttttaaa tgggatttaa ctgcttttgg cttagttgca gagtggtttt tggcatatat 7260
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ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt 7380
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tgttaattgt gatacattct gtgctggtag tacatttatt agtgatgaag ttgcgagaga 7680
cttgtcacta cagtttaaaa gaccaataaa tcctactgac cagtcttctt acatcgttga 7740
tagtgttaca gtgaagaatg gttccatcca tctttacttt gataaagctg gtcaaaagac 7800
ttatgaaaga cattctctct ctcattttgt taacttagac aacctgagag ctaataacac 7860
taaaggttca ttgcctatta atgttatagt ttttgatggt aaatcaaaat gtgaagaatc 7920
atctgcaaaa tcagcgtctg tttactacag tcagcttatg tgtcaaccta tactgttact 7980
agatcaggca ttagtgtctg atgttggtga tagtgcggaa gttgcagtta aaatgtttga 8040
tgcttacgtt aatacgtttt catcaacttt taacgtacca atggaaaaac tcaaaacact 8100
agttgcaact gcagaagctg aacttgcaaa gaatgtgtcc ttagacaatg tcttatctac 8160
ttttatttca gcagctcggc aagggtttgt tgattcagat gtagaaacta aagatgttgt 8220
tgaatgtctt aaattgtcac atcaatctga catagaagtt actggcgata gttgtaataa 8280
ctatatgctc acctataaca aagttgaaaa catgacaccc cgtgaccttg gtgcttgtat 8340
tgactgtagt gcgcgtcata ttaatgcgca ggtagcaaaa agtcacaaca ttgctttgat 8400
atggaacgtt aaagatttca tgtcattgtc tgaacaacta cgaaaacaaa tacgtagtgc 8460
tgctaaaaag aataacttac cttttaagtt gacatgtgca actactagac aagttgttaa 8520
tgttgtaaca acaaagatag cacttaaggg tggtaaaatt gttaataatt ggttgaagca 8580
gttaattaaa gttacacttg tgttcctttt tgttgctgct attttctatt taataacacc 8640
tgttcatgtc atgtctaaac atactgactt ttcaagtgaa atcataggat acaaggctat 8700
tgatggtggt gtcactcgtg acatagcatc tacagatact tgttttgcta acaaacatgc 8760
tgattttgac acatggttta gtcagcgtgg tggtagttat actaatgaca aagcttgccc 8820
attgattgct gcagtcataa caagagaagt gggttttgtc gtgcctggtt tgcctggcac 8880
gatattacgc acaactaatg gtgacttttt gcatttctta cctagagttt ttagtgcagt 8940
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acgttatgtg ctcatggatg gctctattat tcaatttcct aacacctacc ttgaaggttc 9180
tgttagagtg gtaacaacct ttgattctga gtactgtagg cacggcactt gtgaaagatc 9240
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gacattttat cttactaatg atgtttcttt tttagcacat attcagtgga tggttatgtt 9660
cacaccttta gtacctttct ggataacaat tgcttatatc atttgtattt ccacaaagca 9720
tttctattgg ttctttagta attacctaaa gagacgtgta gtctttaatg gtgtttcctt 9780
tagtactttt gaagaagctg cgctgtgcac ctttttgtta aataaagaaa tgtatctaaa 9840
gttgcgtagt gatgtgctat tacctcttac gcaatataat agatacttag ctctttataa 9900
taagtacaag tattttagtg gagcaatgga tacaactagc tacagagaag ctgcttgttg 9960
tcatctcgca aaggctctca atgacttcag taactcaggt tctgatgttc tttaccaacc 10020
accacaaacc tctatcacct cagctgtttt gcagagtggt tttagaaaaa tggcattccc 10080
atctggtaaa gttgagggtt gtatggtaca agtaacttgt ggtacaacta cacttaacgg 10140
tctttggctt gatgacgtag tttactgtcc aagacatgtg atctgcacct ctgaagacat 10200
gcttaaccct aattatgaag atttactcat tcgtaagtct aatcataatt tcttggtaca 10260
ggctggtaat gttcaactca gggttattgg acattctatg caaaattgtg tacttaagct 10320
taaggttgat acagccaatc ctaagacacc taagtataag tttgttcgca ttcaaccagg 10380
acagactttt tcagtgttag cttgttacaa tggttcacca tctggtgttt accaatgtgc 10440
tatgaggccc aatttcacta ttaagggttc attccttaat ggttcatgtg gtagtgttgg 10500
ttttaacata gattatgact gtgtctcttt ttgttacatg caccatatgg aattaccaac 10560
tggagttcat gctggcacag acttagaagg taacttttat ggaccttttg ttgacaggca 10620
aacagcacaa gcagctggta cggacacaac tattacagtt aatgttttag cttggttgta 10680
cgctgctgtt ataaatggag acaggtggtt tctcaatcga tttaccacaa ctcttaatga 10740
ctttaacctt gtggctatga agtacaatta tgaacctcta acacaagacc atgttgacat 10800
actaggacct ctttctgctc aaactggaat tgccgtttta gatatgtgtg cttcattaaa 10860
agaattactg caaaatggta tgaatggacg taccatattg ggtagtgctt tattagaaga 10920
tgaatttaca ccttttgatg ttgttagaca atgctcaggt gttactttcc aaagtgcagt 10980
gaaaagaaca atcaagggta cacaccactg gttgttactc acaattttga cttcactttt 11040
agttttagtc cagagtactc aatggtcttt gttctttttt ttgtatgaaa atgccttttt 11100
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gcatgcattt ctctgtttgt ttttgttacc ttctcttgcc actgtagctt attttaatat 11220
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catgtgggct cttataatct ctgttacttc taactactca ggtgtagtta caactgtcat 11520
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ttactttggc ctcttttgtt tactcaaccg ctactttaga ctgactcttg gtgtttatga 11700
ttacttagtt tctacacagg agtttagata tatgaattca cagggactac tcccacccaa 11760
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actctcagtt ttgcaacaac tcagagtaga atcatcatct aaattgtggg ctcaatgtgt 11940
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accttcttca tctacaataa aattgttgat gagcctgaag aacatgtcca aattcacaca 26100
atcgacggtt catccggagt tgttaatcca gtaatggaac caatttatga tgaaccgacg 26160
acgactacta gcgtgccttt gtaagcacaa gctgatgagt acgaacttat gtactcattc 26220
gtttcggaag agacaggtac gttaatagtt aatagcgtac ttctttttct tgctttcgtg 26280
gtattcttgc tagttacact agccatcctt actgcgcttc gattgtgtgc gtactgctgc 26340
aatattgtta acgtgagtct tgtaaaacct tctttttacg tttactctcg tgttaaaaat 26400
ctgaattctt ctagagttcc tgatcttctg gtctaaacga actaaatatt atattagttt 26460
ttctgtttgg aactttaatt ttagccatgg cagattccaa cggtactatt accgttgaag 26520
agcttaaaaa gctccttgaa caatggaacc tagtaatagg tttcctattc cttacatgga 26580
tttgtcttct acaatttgcc tatgccaaca ggaataggtt tttgtatata attaagttaa 26640
ttttcctctg gctgttatgg ccagtaactt tagcttgttt tgtgcttgct gctgtttaca 26700
gaataaattg gatcaccggt ggaattgcta tcgcaatggc ttgtcttgta ggcttgatgt 26760
ggctcagcta cttcattgct tctttcagac tgtttgcgcg tacgcgttcc atgtggtcat 26820
tcaatccaga aactaacatt cttctcaacg tgccactcca tggcactatt ctgaccagac 26880
cgcttctaga aagtgaactc gtaatcggag ctgtgatcct tcgtggacat cttcgtattg 26940
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catcacgaac gctttcttat tacaaattgg gagcttcgca gcgtgtagca ggtgactcag 27060
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atttggaatc ttgattacat cataaacctc ataattaaaa atttatctaa gtcactaact 27300
gagaataaat attctcaatt agatgaagag caaccaatgg agattgatta aacgaacatg 27360
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catttcacca agaatgtagt ttacagtcat gtactcaaca tcaaccatat gtagttgatg 27960
acccgtgtcc tattcacttc tattctaaat ggtatattag agtaggagct agaaaatcag 28020
cacctttaat tgaattgtgc gtggatgagg ctggttctaa atcacccatt cagtacatcg 28080
atatcggtaa ttatacagtt tcctgttcac cttttacaat taattgccag gaacctaaat 28140
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tactgcgtct tggttcaccg ctctcactca acatggcaag gaagacctta aattccctcg 28440
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<211> 36
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
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Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Ile Glu
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Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
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Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
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Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
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Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
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Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
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Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
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500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
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Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
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Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
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Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
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Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
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Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Val
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885 890 895
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Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser
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1100 1105 1110
Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro
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Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr
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Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg
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<211> 29853
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 7
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gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120
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gagttacttg tttcaacatg ccaatttaga ttcttgcaaa agagtcttga acgtggtgtg 5520
taaaacttgt ggacaacagc agacaaccct taagggtgta gaagctgtta tgtacatggg 5580
cacactttct tatgaacaat ttaagaaagg tgttcagata ccttgtacgt gtggtaaaca 5640
agctacaaaa tatctagtac aacaggagtc accttttgtt atgatgtcag caccacctgc 5700
tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca 5760
gtgtggtcac tataaacata taacttctaa agaaactttg tattgcatag acggtgcttt 5820
acttacaaag tcctcagaat acaaaggtcc tattacggat gttttctaca aagaaaacag 5880
ttacacaaca accataaaac cagttactta taaattggat ggtgttgttt gtacagaaat 5940
tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat 6000
tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg 6060
tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc 6120
aagagagctt aaagttacat ttttccctga cttaaatggt gatgtggtgg ctattgatta 6180
taaacactac acaccctctt ttaagaaagg agctaaattg ttacataaac ctattgtttg 6240
gcatgttaac aatgcaacta ataaagccac gtataaacca aatacctggt gtatacgttg 6300
tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga 6360
cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt 6420
ggaaaatcct accatacaga aagacgttct tgagtgtaat gtgaaaacta ccgaagttgt 6480
aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca 6540
cacagatcta atggctgctt atgtagacaa ttctagtctt actattaaga aacctaatga 6600
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tgtcccttgg gatactatag ctaattatgc taagcctttt cttaacaaag ttgttagtac 6720
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ctttacttta ttgctacaat tgtgtacttt tactagaagt acaaattcta gaattaaagc 6840
atctatgccg actactatag caaagaatac tgttaagagt gtcggtaaat tttgtctaga 6900
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tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc 7200
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ttacaaacgt aatagagcaa caagagtcga atgtacaact attgttaatg gtgttagaag 7560
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taaaggttca ttgcctatta atgttatagt ttttgatggt aaatcaaaat gtgaagaatc 7920
atctgcaaaa tcagcgtctg tttactacag tcagcttatg tgtcaaccta tactgttact 7980
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tgcttacgtt aatacgtttt catcaacttt taacgtacca atggaaaaac tcaaaacact 8100
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tgaatgtctt aaattgtcac atcaatctga catagaagtt actggcgata gttgtaataa 8280
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tgactgtagt gcgcgtcata ttaatgcgca ggtagcaaaa agtcacaaca ttgctttgat 8400
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tgctaaaaag aataacttac cttttaagtt gacatgtgca actactagac aagttgttaa 8520
tgttgtaaca acaaagatag cacttaaggg tggtaaaatt gttaataatt ggttgaagca 8580
gttaattaaa gttacacttg tgttcctttt tgttgctgct attttctatt taataacacc 8640
tgttcatgtc atgtctaaac atactgactt ttcaagtgaa atcataggat acaaggctat 8700
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tggtaacatc tgttacacac catcaaaact tatagagtac actgactttg caacatcagc 9000
ttgtgttttg gctgctgaat gtacaatttt taaagatgct tctggtaagc cagtaccata 9060
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tgttagagtg gtaacaactt ttgattctga gtactgtagg cacggcactt gtgaaagatc 9240
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atctttacca ggagttttct gtggtgtaga tgctgtaaat ttacttacta atatgtttac 9360
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tgtagctatc gtagtaacat gccttgccta ctattttatg aggtttagaa gagcttttgg 9480
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tagtactttt gaagaagctg cgctgtgcac ctttttgtta aataaagaaa tgtatctaaa 9840
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agttttagtc cagagtactc aatggtcttt gttctttttt ttgtatgaaa atgccttttt 11100
accttttgct atgggtatta ttgctatgtc tgcttttgca atgatgtttg tcaaacataa 11160
gcatgcattt ctctgtttgt ttttgttacc ttctcttgcc actgtagctt attttaatat 11220
ggtctatatg cctgctagtt gggtgatgcg tattatgaca tggttggata tggttgatac 11280
tagtttgtct ggttttaagc taaaagactg tgttatgtat gcatcagctg tagtgttact 11340
aatccttatg acagcaagaa ctgtgtatga tgatggtgct aggagagtgt ggacacttat 11400
gaatgtcttg acactcgttt ataaagttta ttatggtaat gctttagatc aagccatttc 11460
catgtgggct cttataatct ctgttacttc taactactca ggtgtagtta caactgtcat 11520
gtttttggcc agaggtattg tttttatgtg tgttgagtat tgccctattt tcttcataac 11580
tggtaataca cttcagtgta taatgctagt ttattgtttc ttaggctatt tttgtacttg 11640
ttactttggc ctcttttgtt tactcaaccg ctactttaga ctgactcttg gtgtttatga 11700
ttacttagtt tctacacagg agtttagata tatgaattca cagggactac tcccacccaa 11760
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tatcaaagta gccactgtac agtctaaaat gtcagatgta aagtgcacat cagtagtctt 11880
actctcagtt ttgcaacaac tcagagtaga atcatcatct aaattgtggg ctcaatgtgt 11940
ccagttacac aatgacattc tcttagctaa agatactact gaagcctttg aaaaaatggt 12000
ttcactactt tctgttttgc tttccatgca gggtgctgta gacataaaca agctttgtga 12060
agaaatgctg gacaacaggg caaccttaca agctatagcc tcagagttta gttcccttcc 12120
atcatatgca gcttttgcta ctgctcaaga agcttatgag caggctgttg ctaatggtga 12180
ttctgaagtt gttcttaaaa agttgaagaa gtctttgaat gtggctaaat ctgaatttga 12240
ccgtgatgca gccatgcaac gtaagttgga aaagatggct gatcaagcta tgacccaaat 12300
gtataaacag gctagatctg aggacaagag ggcaaaagtt actagtgcta tgcagacaat 12360
gcttttcact atgcttagaa agttggataa tgatgcactc aacaacatta tcaacaatgc 12420
aagagatggt tgtgttccct tgaacataat acctcttaca acagcagcca aactaatggt 12480
tgtcatacca gactataaca catataaaaa tacgtgtgat ggtacaacat ttacttatgc 12540
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gactggtatg attttgtaga aaacccagat atattacgcg tatacgccaa cttaggtgaa 13980
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ttaacaaagc cttacattaa gtgggatttg ttaaaatatg acttcacgga agagaggtta 14280
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tgtttggatg acagatgcat tctgcattgt gcaaacttta atgttttatt ctctacagtg 14400
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ttacatagct ctagacttag ttttaaggaa ttacttgtgt atgctgctga ccctgctatg 14580
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cttactaaca atgttgcttt tcaaactgtc aaacccggta attttaacaa agacttctat 14700
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 35
gcaaagaatg ctattagaaa agtgtgac 28
<210> 36
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 36
gatagattcc tttttctaca gtgaaggatt tc 32
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 37
gactcctggt gattcttctt cag 23
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 38
ctctagcagc aatatcacca agg 23
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 39
gcacaagtca aacaaattta caaaacac 28
<210> 40
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 40
caaaaggtgt gagtaaactg ttacaaac 28
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 41
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<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 42
gaggtttatg atgtaatcaa gattccaaat gg 32
<210> 43
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 43
gctacaggat tggcaactat aaattaaac 29
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 44
ccattctagc aggagaagtt cc 22
<210> 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 45
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<210> 46
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 46
tttttttttt tttttttttt tttttgtcat tctcctaaga agctattaaa atc 53
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<211> 23
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
<400> 47
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<210> 48
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 48
aattttgacg tcgatcccgt tgacattgat tattgac 37
<210> 49
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 49
ccacacagat tttaaagttc gtttagag 28
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
<400> 50
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
<400> 51
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
<400> 52
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<210> 53
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
<400> 54
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<210> 55
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
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tatgcgggtc tcggtcttaa tgacaacctt cttgaaatac 40
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
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<210> 57
<211> 40
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 57
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<210> 58
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 58
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<210> 59
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 59
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
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<210> 62
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 62
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
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<210> 65
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
<400> 65
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<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
<400> 66
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<210> 67
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
<400> 67
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 68
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<210> 69
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
<400> 69
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 70
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 71
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<210> 72
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 72
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 73
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<210> 74
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 74
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<210> 75
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 75
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<210> 76
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 76
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<210> 77
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 77
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 78
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 79
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<210> 80
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 80
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<210> 81
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 81
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<210> 82
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 82
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 83
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 84
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 85
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
<400> 86
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 87
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 88
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 89
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
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<210> 91
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 91
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 92
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<210> 93
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 93
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<210> 94
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 94
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<210> 95
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 95
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<210> 96
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
<400> 97
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<210> 98
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 98
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
<400> 99
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 100
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 102
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
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<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
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<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 106
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<211> 31
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 108
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<211> 33
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 109
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<210> 110
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 110
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<210> 111
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 111
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<210> 112
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 112
tcaggtggtc tccggttccg aaggtcttaa tgacaacctt cttgaaatac 50
<210> 113
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 113
tcaggtggtc tcccttgctc ttcttcaggt tg 32
<210> 114
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 114
tcaggtggtc tcccaagaag aagattggtt agatgatgat agtcaacaa 49
<210> 115
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 115
tcaggtggtc tccataggaa ccagcaagtg ag 32
<210> 116
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 116
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<210> 117
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 117
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<210> 118
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 118
tcaggtggtc tcctaaaacc agtctctgaa gaagtagtg 39
<210> 119
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 119
tcaggtggtc tcccatcaga cactaatgcc tgatct 36
<210> 120
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 120
tcaggtggtc tccgatgttg gtgatagtgc gg 32
<210> 121
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 121
tcaggtggtc tcctaaataa cagaataaac accaggt 37
<210> 122
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 122
tcaggtggtc tcgtttactt gtacttgaca ttttatctta ctaatgatgt ttct 54
<210> 123
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 123
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<210> 124
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 124
tcaggtggtc tcgctcttgc cactgtagct tattttaata tggtctat 48
<210> 125
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 125
tcaggtggtc tcgagtacaa acctacctcc ctttgttgtg tt 42
<210> 126
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 126
tcaggtggtc tcctacttgc actgttatcc ga 32
<210> 127
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 127
tcaggtggtc tccggtggga acactgtaga gaataaaaca ttaaagtt 48
<210> 128
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 128
tcaggtggtc tcgcacctac aagttttgga cc 32
<210> 129
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 129
tcaggtggtc tcgtcataag tgtaccatct gtttttacga 40
<210> 130
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 130
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tcaggtggtc tcgtcattat attttaatag aaaagtccta ggttga 46
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tcaggtggtc tcgtgcttgg ttttgatgga tctgg 35
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<400> 140
tcaggtggtc tcgagcaaga ggtcatttat tgaagatct 39
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<400> 141
tcaggtggtc tcgtttttga gggttatgat tttgga 36
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
<400> 142
tcaggtggtc tccaaaagag atggcaacta gcactctcca aggg 44
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<223> synthetic construct
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tcaggtggtc tcctgtcact tactgtacaa gcaaagc 37
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<223> synthetic construct
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tcaggtggtc tcggacaaca gatgtttcat ctcgttgact t 41
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tcaggtggtc tcgtctgctc ccttctgcgt agaag 35
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<223> synthetic construct
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tcaggtggtc tcgcagaggc ggcagtcaag c 31
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tcaggtggtc tcgtcctcct ttcagcaaaa aacc 34
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<213> Artificial Sequence
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gtccgagctc atcgctaata acgctttccc gaattcgagc 40
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gctcgaattc gggaaagcgt tattagcgat gagctcggac 40
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<400> 150
cgtctcaagt gtaccaagtc ttctcgacca attctcatgt ttgacag 47
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<400> 151
aaggaaaaaa gcggccgccc gggccg 26
<210> 152
<211> 43
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<213> Artificial Sequence
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<400> 152
aaggaaaaaa gcggccgctc gaccaattct catgtttgac agc 43
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ctcacccagg gattggctga tacgaaaaac atattctc 38
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gagaatatgt ttttcgtatc agccaatccc tgggtgag 38
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cttacgtgcc gatcaacgac tcattttcgc caaaagttgg 40
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ccaacttttg gcgaaaatga gtcgttgatc ggcacgtaag 40
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<400> 157
ggatggctca ggcatcgtgt ctctgaaaat cgactggatc 40
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gatccagtcg attttcagag acacgatgcc tgagccatcc 40
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cttaacctgg acaggtcacg tgttccaact gagtgtatag 40
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<400> 160
ctatacactc agttggaaca cgtgacctgt ccaggttaag 40
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aattttgacg tcgttattag cgatgagctc ggacttcc 38
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<211> 55
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<220>
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<400> 162
gaataatacg actcactata gggacgttcg tgttgtttta gatttcatct aaacg 55
<210> 163
<211> 55
<212> DNA
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<220>
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<400> 163
tttttttttt tttttttttt tgtcattctc ctaagaagct attaaaatca catgg 55
<210> 164
<211> 48
<212> DNA
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<220>
<223> synthetic construct
<400> 164
gataatacga ctcactatag attaaaggtt tataccttcc caggtaac 48
Claims (48)
- 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서,
상기 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 재코딩되고, 그리고
상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질, 또는 이의 하나 이상의 단편의 아미노산 서열은 동일하게 유지되거나, 또는
상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편의 아미노산 서열은 최대 20개의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함하는 폴리뉴클레오티드. - 제1항에 있어서, 상기 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 야생형 SARS-CoV-2인, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 천연 분리주 SARS-CoV-2인, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 GenBank 수탁 번호 MN985325.1의 핵산 서열을 갖는 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 워싱턴 분리주인, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019 분리주 (서열 번호 1)인, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 변이체인, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 영국 변이체, 남아프리카 변이체 및 브라질 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 SARS-CoV-2 변이체인, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 코돈-쌍 편향 (CPB)을 감소시키거나 코돈 사용빈도 편향(codon usage bias)을 감소시킴으로써 재코딩되는 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 CpG 또는 UpA 디-뉴클레오티드의 수를 증가시킴으로써 재코딩되는 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 재코딩된 하나 이상의 바이러스 단백질, 또는 각각의 재코딩된 이의 하나 이상의 단편이 -0.05 미만, -0.1 미만, -0.2 미만, -0.3 미만, 또는 -0.4 미만의 코돈 쌍 편향을 갖는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 CPB 탈최적화된, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 코돈 탈최적화된, 폴리뉴클레오티드.
- 제11항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코돈 탈최적화 또는 CPB 탈최적화는 인간에서 빈번하게 사용되는 코돈 또는 CPB를 기반으로 하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 제11항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코돈 탈최적화 또는 CPB 탈최적화는 코로나바이러스에서 빈번하게 사용되는 코돈 또는 CPB를 기반으로 하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 제11항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코돈 탈최적화 또는 CPB 탈최적화는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에서 빈번하게 사용되는 코돈 또는 CPB를 기반으로 하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 제11항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코돈 탈최적화 또는 CPB 탈최적화는 야생형 SARS-CoV-2 코로나바이러스에서 빈번하게 사용되는 코돈 또는 CPB를 기반으로 하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, RNA-의존성 RNA 중합효소 (RdRP), RdRP의 단편, 스파이크 단백질, 스파이크 단백질의 단편, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 재코딩된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 bp 11294-12709, bp 14641-15903, bp 21656-22306, bp 22505-23905, 및 bp 24110-25381로부터 선택되는 적어도 하나의 CPB 탈최적화된 영역을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 푸린 절단 부위가 제거된 재코딩된 스파이크 단백질 또는 스파이크 단백질의 단편을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 서열 번호 4, 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834, 서열 번호 7, 또는 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1-29,834를 갖는, 폴리뉴클레오티드.
- 제20항에 있어서, 3' 말단에 하나 이상의 연속적인 아데노신을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 서열 번호 3을 갖는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 박테리아 인공 염색체 (BAC).
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제23항의 BAC, 또는 제24항의 벡터를 포함하는 세포.
- 제25항에 있어서, 상기 세포가 베로 세포(Vero cell) 또는 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포인, 세포.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드를 포함하는 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스.
- 제28항 또는 제29항에 있어서, 이의 바이러스 단백질 중 하나 이상의 발현이 이의 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스와 비교하여 감소된 것인, 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스.
- 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이의 바이러스 단백질 중 하나 이상의 발현 감소가 RdRP, 스파이크 단백질 및 이들의 조합으로부터 선택된 영역의 재코딩의 결과로서 감소된 것인, 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스.
- 서열 번호 4, 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834, 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834 및 3' 말단에 하나 이상의 연속적인 아데노신을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스.
- 서열 번호 4, 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834, 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1-29,834, 및 3' 말단에 하나 이상의 연속적인 아데노신을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드를 포함하는 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스.
- 하기를 포함하는 대상체에서 보호 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물:
제28항 내지 제33항 중 어느 하나의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스. - 제34항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는, 백신 조성물.
- 하기를 포함하는 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 면역 조성물:
제28항 내지 제33항 중 어느 하나의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스. - 제36항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는, 면역 조성물.
- 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
대상체에게 하기의 용량을 투여하는 단계:
제28항 내지 제33항 중 어느 하나의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 또는
제34항 또는 제35항의 백신 조성물, 또는
제36항 또는 제37항의 면역 조성물. - 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
대상체에게 프라임 용량의 제28항 내지 제33항 중 어느 하나의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 또는 제34항 또는 제35항의 백신 조성물, 또는 제36항 또는 제37항의 면역 조성물을 투여하는 단계; 및
대상체에게 1회 이상의 부스트 용량의 제28항 내지 제33항 중 어느 하나의 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 또는 제34항 또는 제35항의 백신 조성물, 또는 제36항 또는 제37항의 면역 조성물을 투여하는 단계. - 제38항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응이 보호 면역 반응인, 방법.
- 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용량이 예방적 유효 또는 치료적 유효 용량인, 방법.
- 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 비강 경로를 통한 것인, 방법.
- 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 비강 점적을 통한 것인, 방법.
- 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 비강 스프레이를 통한 것인, 방법.
- 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용량이 약 104-106 PFU이거나, 프라임 용량이 약 104-106 PFU이고, 그리고 1회 이상의 부스트 용량이 약 104-106 PFU인, 방법.
- 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스를 제조하는 방법으로서,
모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 또는 이의 하나 이상의 단편의 하나 이상의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 수득하는 단계;
뉴클레오티드 서열을 재코딩하여 하나 이상의 단백질, 이의 하나 이상의 단편의 단백질 발현을 감소시키는 단계; 및
변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 게놈을 제조하기 위해 재코딩된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 게놈으로 치환하는 단계를 포함하며,
여기서 재코딩된 뉴클레오티드 서열의 발현은 모 바이러스에 비해 감소되는, 방법. - 제46항에 있어서, 상기 모 SARS-CoV-2 코로나바이러스 서열이 야생형 (wt) 바이러스 핵산인, 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 변형된 SARS-CoV-2 코로나바이러스가 제28항 내지 제33항 중 어느 하나인, 방법.
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