CN115427073A - 去优化SARS-CoV-2及其方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了修饰的SARS‑CoV‑2冠状病毒。这些病毒已经重新编码，例如，密码子去优化或密码子对偏好去优化，并且适用于降低SARS‑CoV‑2冠状病毒感染的可能性或严重程度，预防SARS‑CoV‑2冠状病毒感染，引发免疫反应，或治疗SARS‑CoV‑2冠状病毒感染。

Description

去优化SARS-CoV-2及其方法和用途
相关申请的交叉引用
本申请包括根据35 U.S.C.§119(e)对2020年1月28日提交的美国临时专利申请号62/966,750、2020年7月7日提交的编号63/048,942、2020年9月16日提交的编号63/079,337和2020年9月17日提交的编号63/079,853的优先权要求，所述专利申请的全部内容特此以引用的方式并入。
技术领域
本发明涉及修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、用于引发免疫反应的组合物和用于提供保护性免疫、预防和治疗的疫苗。
背景技术
本文中的所有公布以引用的方式并入，其引用的程度如同每个个别公布或专利申请具体且单独地指示为以引用的方式并入一般。以下描述包括可适用于理解本发明的信息。不承认本文所提供的信息中的任一个是先前技术或与当前所要求保护的发明有关，或明确或隐含地参考的任何公布是先前技术。
WHO已宣布致命冠状病毒是大流行病。这种病毒的公共卫生危机迅速发展，截至2020年1月底夺走数十人的生命并感染超过一千人，截至2020年9月初夺走超过900,000人的生命并感染超过2800万人，并且截至2021年1月的最后一周，夺走超过200万人的生命并感染超过1亿人。SARS-CoV-2病毒对老年人和患有潜在医学病状(诸如慢性肾病、慢性阻塞性肺病、由于实体器官移植物的免疫功能不全、肥胖、严重的心脏病状、镰状细胞疾病和2型糖尿病)的那些人尤其危险。因此，极度地且迫切地需要预防性和治疗性治疗。
发明内容
结合在范围中意在作为示例性和说明性、非限制性的组合物和方法，描述并说明以下实施方案及其方面。
本发明的多个实施方案提供编码亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的多核苷酸：其中多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，被重新编码，并且其中由多核苷酸所编码的亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的氨基酸序列保持相同，或其中由多核苷酸所编码的亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的氨基酸序列包含至多20个氨基酸取代、添加或缺失。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒可以是野生型SARS-CoV-2。在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒可以是天然分离株SARS-CoV-2。在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒可以是具有GenBank登录号MN985325.1的核酸序列的SARS-CoV-2冠状病毒的华盛顿(Washington)分离株。在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒可以是SARS-CoV-2冠状病毒的BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019分离株(SEQ ID NO:1)。在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒可以是SARS-CoV-2变体。在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒可以是选自由英国变体、南非变体和巴西变体组成的组的SARS-CoV-2变体。
在多个实施方案中，多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比可通过减少密码子对偏好(CPB)或减少密码子使用偏好来重新编码。在多个实施方案中，多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，可通过增加CpG或UpA二核苷酸的数目来重新编码。在多个实施方案中，所述重新编码的一种或多种病毒蛋白中的每一种或所述重新编码病毒蛋白的一个或多个片段中的每一个可具有小于-0.05、小于-0.1、小于-0.2、小于-0.3或小于-0.4的密码子对偏好。在多个实施方案中，多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，可被CPB去优化。在多个实施方案中，多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，可被密码子去优化。
在多个实施方案中，密码子去优化或CPB去优化可基于人中频繁使用的密码子或CPB。在多个实施方案中，密码子去优化或CPB去优化可基于冠状病毒中频繁使用的密码子或CPB。在多个实施方案中，密码子去优化或CPB去优化可基于SARS-CoV-2冠状病毒中频繁使用的密码子或CPB。在多个实施方案中，密码子去优化或CPB去优化可基于野生型SARS-CoV-2冠状病毒中频繁使用的密码子或CPB。
在多个实施方案中，重新编码的核苷酸序列可选自RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)、RdRP的片段、刺突蛋白、刺突蛋白的片段和它们的组合。
在多个实施方案中，多核苷酸可包含至少一个可选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的bp 11294-12709、bp 14641-15903、bp 21656-22306、bp 22505-23905和bp 24110-25381的CPB去优化区域。
在多个实施方案中，多核苷酸可包含重新编码的刺突蛋白或刺突蛋白的片段，其中弗林蛋白酶裂解位点可被消除。
在多个实施方案中，多核苷酸可包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:7的核苷酸1-29,834的核苷酸序列。在多个实施方案中，多核苷酸可在3'端上还包含一个或多个连续腺嘌呤。
在多个实施方案中，多核苷酸可包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
本发明的多个实施方案提供了一种细菌人工染色体(BAC)，其包含本发明的重新编码的多核苷酸中的任一种。
本发明的多个实施方案提供了一种载体，其包含本发明的重新编码的多核苷酸中的任一种。
本发明的多个实施方案提供了一种细胞，其包含本发明的重新编码的多核苷酸中的任一种、本发明的BAC中的任一种或本发明的载体中的任一种。在多个实施方案中，所述细胞可以是Vero细胞或幼仓鼠肾(BHK)细胞。
本发明的多个实施方案提供了一种多肽，其由本发明的重新编码的多核苷酸中的任一种编码。
本发明的多个实施方案提供了一种修饰的SARS-CoV-2冠状病毒，其包含本发明的重新编码的多核苷酸中的任一种。
本发明的多个实施方案提供了一种修饰的SARS-CoV-2冠状病毒，其包含本发明的重新编码的多核苷酸中的任一种所编码的本发明的多肽中的任一种。
在多个实施方案中，其中与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒相比，本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒中的任一种中的一种或多种病毒蛋白的表达可降低。
在多个实施方案中，由于重新编码选自RdRP、刺突蛋白和它们的组合的区域，可减少其病毒蛋白中的一种或多种的表达降低。
在多个实施方案中，修饰的SARS-CoV-2冠状病毒可包含具有SEQ ID NO:4、或SEQID NO:4的核苷酸1-29,834或SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834和3'端上的一个或多个连续腺嘌呤的多核苷酸。
在多个实施方案中，修饰的SARS-CoV-2冠状病毒可包含由具有SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834或SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834和3'端上的一个或多个连续腺嘌呤的多核苷酸编码的多肽。
本发明的多个实施方案提供了一种用于诱导受试者中的保护性免疫反应的疫苗组合物，其包含：本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒中的任一种。在多个实施方案中，所述疫苗组合物可还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
本发明的多个实施方案提供了一种用于引发受试者中免疫反应的免疫组合物，其包含：本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒中的任一种。在多个实施方案中，所述免疫组合物可还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
本发明的多个实施方案提供了一种引发受试者中免疫反应的方法，其包括：向所述受试者施用一剂：本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒中的任一种、或本发明的疫苗组合物中的任一种、或本发明的免疫组合物中的任一种。
本发明的多个实施方案提供了一种引发受试者中免疫反应的方法，其包括：向所述受试者施用初始剂量的本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒中的任一种、或本发明的疫苗组合物中的任一种、或本发明的免疫组合物中的任一种；以及向所述受试者施用一个或多个加强剂量的本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒中的任一种、或本发明的疫苗组合物中的任一种、或本发明的免疫组合物中的任一种。
在多个实施方案中，免疫反应是保护性免疫反应。
在多个实施方案中，剂量可以是预防有效或治疗有效剂量。在多个实施方案中，剂量可以是约104-106PFU，或初始剂量可以是约104-106PFU并且一个或多个加强剂量可以是约104-106PFU。
在多个实施方案中，施用可经由经鼻途径进行。在多个实施方案中，施用可经由鼻用滴剂进行。在多个实施方案中，施用可经由鼻用喷雾进行。
本发明的多个实施方案提供了用于引发免疫反应的本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、本发明的疫苗组合物或本发明的免疫组合物，或提供COVID-19的治疗性或预防性治疗。
本发明的多个实施方案提供了用于引发免疫反应的本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、本发明的疫苗组合物或本发明的免疫组合物，或提供COVID-19的治疗性或预防性治疗，其中用途包含初始剂量的本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、或本发明的疫苗组合物、或本发明的免疫组合物，和一个或多个加强剂量的本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、或本发明的疫苗组合物、或本发明的免疫组合物。
本发明的多个实施方案提供了本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、本发明的疫苗组合物或本发明的免疫组合物在制造用以引发免疫反应的药物中的用途；或提供COVID-19的治疗性或预防性治疗。
本发明的多个实施方案提供了本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、本发明的疫苗组合物或本发明的免疫组合物在制造用以引发免疫反应的药物中的用途；或提供COVID-19的治疗性或预防性治疗，其中药物包含初始剂量的本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、或本发明的疫苗组合物、或本发明的免疫组合物，和一个或多个加强剂量的本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、或本发明的疫苗组合物、或本发明的免疫组合物。
本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒是本文所讨论的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒中的任一种。本发明的疫苗组合物是本文所讨论的疫苗组合物中的任一种。本发明的免疫组合物是本文所讨论的免疫组合物中的任一种。在多个实施方案中，免疫反应是保护性免疫反应。
本发明的多个实施方案提供了一种制备修饰的SARS-CoV-2冠状病毒的方法，其包括：获得编码亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种蛋白或其一个或多个片段的核苷酸序列；重新编码核苷酸序列以减少一种或多种蛋白或其一个或多个片段的蛋白质表达；以及将具有重新编码的核苷酸序列的核酸替换至亲本SARS-CoV-2冠状病毒基因组中以制备修饰的SARS-CoV-2冠状病毒基因组，其中与亲本病毒相比，重新编码的核苷酸序列的表达降低。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒序列可以是野生型(wt)病毒核酸或天然分离株。
在多个实施方案中，修饰的SARS-CoV-2冠状病毒是本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒中的任一种。
根据以下结合附图的详细描述，本发明的其他特征和优点将变得显而易见，所述附图通过实例说明本发明的实施方案的各种特征。
附图说明
在参考图中说明了示例性实施方案。旨在将本文所公开的实施方案和图视为说明性而非限制性的。
图1示出了根据本发明的多个实施方案的示例性CoV减毒和合成策略BAC克隆/DNA转染。
图2示出了根据本发明的多个实施方案的示例性CoV减毒和合成策略体外连接/RNA转染。
图3描绘了SARS-CoV-2的野生型(左)和CDX-005(右)病毒株在Vero E6细胞上的溶菌斑表型。与野生型病毒相比，CDX-005在Vero E6细胞上产生更小的溶菌斑且生长至效价降低40％。
图4描绘了在给药野生型SARS-COV-2和CDX-005之后叙利亚金仓鼠(Syrian Goldhamster)的体重变化。
图5描绘了Vero细胞中野生型WA1和CDX-005的生长。将Vero细胞用0.01MOI的野生型WA1或CDX-005感染并在33℃或37℃下培养至多96小时。收集上清液以回收病毒。通过噬菌斑形成测定来测定滴度并报告为PFU/ml培养基的对数。
图6a-图6d描绘了仓鼠中CDX-005的体内减毒。仓鼠接种有5×104或5×103PFU/ml的野生型WA1、5×104PFU/ml CDX-005。在PI第2天和第4天，在6a)嗅球、6b)大脑和6c)肺中通过qPCR测量病毒RNA。(N＝3/组；条＝SEM)。6d)通过TCID50测定评估接种的仓鼠的左肺组织中的感染性病毒负荷并表示为TCID50/ml的log10。CDX-005与野生型WA1处理组之间的差异是显著的(N＝3/组；P<0.001；条＝SEM)。水平线指示LOD。
图7a-图7c描绘了仓鼠中CDX-005的体内减毒。仓鼠接种有5×104或5×103PFU/ml的野生型WA1或5×104PFU/ml CDX-005。7a)每天测量仓鼠的体重，持续九天。CDX-005与野生型WA1处理组之间的体重变化显著不同(对于CDX-005和野生型WA1 5×104，N＝10-40/组；N＝3-12/组，野生型WA1 5×103；P<0.001；条＝SEM)。7b和7c)在PI第2天、第4天和第6天检查苏木精(Hematoxylin)和曙红(eosin)染色的肺切片并对细胞浸润进行评分。(N＝3/组)
图8a-图8d描绘了仓鼠中的功效。8a)用初试仓鼠对照血清或在用野生型WA1或5×104PFU COVI-VAC(CDX-005)接种后第16天用从仓鼠收集的血清进行Spike-S1 ELISA。在第18天(WA1攻击后两天)也测量了COVI-VAC(CDX-005)接种的仓鼠的Spike S1 IgG。终点IgG滴度示出为比背景高5倍的稀释对数。(N＝3/组；条＝SEM)8b)在接种5×104或5×103PFU的野生型WA1或5×104PFU COVI-VAC(CDX-005)之后16天，在仓鼠血清中测试针对SARS-CoV-2WA1的噬菌斑减少中和滴度(Plaque Reduction Neutralization Titers；PRNT)。PRNT是最后一次血清稀释度的倒数，相对于含有初试仓鼠血清的孔中的那些噬菌斑，其使噬菌斑数目减少了50％、80％或90％。(N＝3/组；条＝SD)；8c)用5×104PFU野生型SARS-CoV-2攻击CDX-005疫苗接种的仓鼠(在疫苗接种后第16天)和初试动物。在攻击后第2天收获肺并且通过qPCR测量病毒负荷并表示为qPCR基因组/ml组织的log10。(N＝3/组；条＝SD)。8d)仓鼠疫苗接种有媒介物、5×104PFU的野生型WA1或5×104COVI-VAC(CDX-005)并在接种后27天用5×104PFU/ml野生型WA1鼻内攻击。在攻击当天记录体重并且之后每天记录体重，持续4天。(N＝5-6，第0-2天，N＝3，第3-4天，条＝SEM)。a)和b)中的结果来自两个单独的仓鼠研究。
图9描绘了非洲绿猴中的减毒。在用106PFU野生型WA1或CDX-005接种后第4天和第6天从猴收集气管灌洗液。对灌洗液进行RT-qPCR以检测病毒。N＝3/组(第4天)或N＝2/组(第6天)。
图10描绘了106的野生型SARS-COV2相对于CDX-005在非洲绿猴中的鼻内剂量。
图11描绘了从Vero细胞收获的CDX-005的粗本体滴度。Vero WHO“10-87”细胞接种有1.8×104PFU的CDX-005(约0.01MOI)，然后生长48小时。使用所示出的不同方案来收获病毒。
具体实施方式
本文所引用的所有参考文献均以全文引用的方式并入，如同将其完全阐述一般。除非另外定义，否则本文所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。Singleton等人,Dictionary of Microbiology and MolecularBiology第3版,修订版,J.Wiley&Sons(New York,NY 2006)；March,Advanced OrganicChemistry Reactions,Mechanisms and Structure第7版,J.Wiley&Sons(New York,NY2013)；以及Sambrook和Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第4版,ColdSpring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2012)为本领域技术人员提供了本申请中所使用的许多术语的一般指导。
本领域技术人员将识别与本文所述的那些方法和材料类似或等效的许多方法和材料，其可用于本发明的实践中。实际上，本发明决不受限于所描述的方法和材料。出于本发明的目的，以下术语定义如下。
除非本文另外明确提供，否则如本文所使用，术语“约”在与参考数值指示结合使用时意指参考数值指示加上或减去所述参考数值指示的至多5％。例如，语言“约50％”涵盖45％至55％的范围。在多个实施方案中，如果在权利要求范围中明确提供，则术语“约”在与参考数值指示结合使用时可意指参考数值指示加上或减去所述参考数值指示的至多4％、3％、2％、1％或0.5％。
如本文所使用的“亲本病毒”是指将重新编码的核苷酸序列与其进行比较以编码相同或类似氨基酸序列的参考病毒。
如本文所使用的“SARS-CoV-2”以及“2019-nCoV”是可互换的，并且是指具有野生型序列、天然分离株序列或野生型序列或天然分离株序列的突变形式的冠状病毒，其导致COVID-19。突变形式通过病毒的复制周期天然产生或通过基因工程改造产生。
如本文所使用的“SARS-CoV-2变体”是指SARS-CoV-2的突变形式，由于其在诸如人的宿主中复制和/或在诸如人的宿主之间传播，所述突变形式已通过病毒的复制周期天然发展。SARS-CoV-2变体的实例包括但不限于英国变体(也称为20I/501Y.V1、VOC 202012/01或B.1.1.7)、南非变体(也称为20H/501Y.V2或B.1.351)和巴西变体(也称为P.1)。
如本文所使用，参见SARS-CoV-2的“天然分离株”是指已从宿主(例如，人、蝙蝠、猫、猪或任何其他宿主)或天然储存宿主分离的病毒，诸如SARS-CoV-2。天然分离株的序列可以是相同的或随着病毒在宿主(例如，人)中复制和/或在宿主(例如，人)之间传播而具有通过病毒的复制周期天然产生的突变。
如本文所使用的“SARS-CoV-2冠状病毒分离株”是指具有2020年1月10日提交的登录ID：EPI_ISL_402119的SARS-CoV-2的野生型分离株，并且也称为BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019，SEQ IDNO:1，其如同以其全文完全阐述一般以引用的方式并入本文。
如本文所使用的“华盛顿冠状病毒分离株”是指截至2020年7月5日具有GenBank登录号MN985325.1的SARS-CoV-2的野生型分离株，其如同以其全文完全阐述一般以引用的方式并入本文。
如本文所使用的“频繁使用的密码子”或“密码子使用偏好”是指同义密码子在编码特定物种(例如，人、冠状病毒或SARS-CoV-2)的DNA中出现频率的差异。
如本文所使用的“密码子对偏好”是指在特定物种(例如，人、冠状病毒或SARS-CoV-2)中比统计学上预测更频繁或较不频繁使用的同义密码子对。
如本文所使用的“受试者”意指任何动物或人工修饰的动物。动物包括但不限于人、非人灵长类动物、牛、马、绵羊、猪、狗、猫、兔、雪貂、啮齿动物(诸如小鼠、大鼠和豚鼠)、蝙蝠、蛇和鸟类。人工修饰的动物包括但不限于具有人免疫系统的SCID小鼠。在优选实施方案中，受试者是人。
“病毒宿主”意指病毒可感染的任何动物或人工修饰的动物。动物包括但不限于人、非人灵长类动物、牛、马、绵羊、猪、狗、猫、兔、雪貂、啮齿动物(诸如小鼠、大鼠和豚鼠)和鸟类。人工修饰的动物包括但不限于具有人免疫系统的SCID小鼠。在多个实施方案中，病毒宿主是哺乳动物。在多个实施方案中，病毒宿主是灵长类动物。在多个实施方案中，病毒宿主是人。鸟类的实施方案是驯养的家禽物种，包括但不限于鸡、火鸡、鸭和鹅。
“预防有效剂量”是施用于易于受病毒感染或易于罹患病毒相关的病症的受试者时，在受试者中诱导保护受试者免于感染病毒或罹患病症的免疫反应的疫苗或病毒组合物的任何量。“保护”受试者意指将受试者感染病毒的可能性降低或将受试者的病症发作的可能性降低至少两倍，优选至少十倍、25倍、50倍或100倍。例如，如果受试者具有1％几率感染病毒，则受试者感染病毒的可能性降低两倍将导致受试者具有0.5％几率感染病毒。
如本文所使用，“治疗有效剂量”是当施用于罹患对疫苗有效的病症的受试者时，在受试者中诱导导致受试者经历病症和/或其症状的减少、缓解或消退的免疫反应的疫苗或病毒组合物的任何量。在优选实施方案中，防止病症和/或其症状的复发。在其他优选实施方案中，治愈受试者的病症和/或其症状。
本发明的免疫接种和治疗方法中的任一种的某些实施方案还包括向受试者施用至少一种佐剂。“佐剂”应意指适于增强抗原的免疫原性并增强受试者的免疫反应的任何剂。适于与基于蛋白质的疫苗和基于核酸的疫苗两者一起使用的包括颗粒状佐剂的诸多佐剂，以及将佐剂与抗原组合的方法是本领域技术人员众所周知的。用于基于核酸的疫苗的合适的佐剂包括但不限于以纯化蛋白质或核酸形式递送的Quil A、咪喹莫特(imiquimod)、雷西莫特(resiquimod)和白细胞介素-12。适于与蛋白质免疫接种一起使用的佐剂包括但不限于明矾、弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant；FIA)、皂苷、Quil A和QS-21。
本文描述了SARS-CoV-2病毒，其中其基因已重新编码，例如密码子去优化或密码子对偏好去优化。在多个实施方案中，本发明的SARS-CoV-2病毒的病毒蛋白具有与其亲本SARS-CoV-2病毒相同的氨基酸序列；然而，已重新编码核苷酸序列。根据本发明的核苷酸序列的重新编码导致蛋白质表达降低、减毒或两者。这些重新编码的SARS-CoV-2病毒适用作疫苗，并且特别是用作减毒活疫苗。
从野生型SARS-CoV-2产生合成的高度减毒活疫苗候选株，COVI-VAC(也称为CDX-005；例如，SEQ ID NO:4)。虽然不希望受任何特定理论约束，但相信最可能的减毒机制是翻译减慢，通过翻译中导致蛋白质错误折叠的错误、RNA二级结构中的变化或调节信号改变均可能造成蛋白质产生减少。无论机制如何，减毒的COVI-VAC病毒以其野生型形式呈递每一种病毒抗原，从而提供广泛免疫反应的潜力并且使得即使在目标病毒株中存在基因漂变仍可能保留功效。由于数百个沉默(同义)突变促成表型，因此预期COVI-VAC对病原性的逆转具有高度抗性。逆转测试指示，如通过晚期传代病毒的整体测序和评价弗林蛋白酶裂解位点中的潜在变化所评估，疫苗是稳定的。
仓鼠研究证明，COVI-VAC在这些动物中是安全的。其是高度减毒的，在肺和嗅球中诱导较低的总病毒负荷并在大脑中将其完全消除，并且在接种有COVI-VAC的动物的肺中诱导比接种有野生型WA1的那些动物更低的活病毒负荷。不同于野生型病毒，COVI-VAC在接种的仓鼠中不会诱导体重减轻或显著的肺病变。
仓鼠研究还表明，COVI-VAC有效地防止SARS CoV-2。Ab滴度的评估证明，其在诱导血清IgG和中和Ab方面与野生型病毒一样有效。其针对野生型攻击具有保护作用；接种COVI-VAC导致肺病毒滴度降低并全面保护大脑免受病毒的影响。接种有COVI-VAC的仓鼠也没有表现出在媒介物接种的动物中所观察到的体重减轻。此外，没有疾病增强的证据。
综合数据表明，COVI-VAC是目前正开发用于动物和人中的一类重要的新型减毒活疫苗的一部分。其呈递所有类似于其天然氨基酸序列的病毒抗原，可鼻内施用，在小动物模型中单剂量是安全且有效的，对逆转具有抗性，并且可在允许的温度下生长至高滴度。当前正在进行临床试验以测试其在人中的安全性和功效。
为了构建去优化CDX-005(例如，SEQ ID NO:4)和CDX-007(例如，SEQ ID NO:7)减毒活疫苗候选株，首先将野生型WA1供体病毒的基因组在计算机上解析为19个重叠片段。每个片段与每个相邻片段共用大约200bp的序列重叠。F1-F19通过RT-PCR由野生型WA1病毒RNA的cDNA产生。片段是通过桑格测序(Sanger sequencing)确认的序列。然后将WT WA1病毒的片段16交换为具有去优化刺突蛋白基因序列的片段16以产生CDX-005的cDNA基因组。类似地，将WT WA1病毒的片段14交换为具有去优化刺突蛋白基因序列的片段14以产生CDX-007的cDNA基因组。
在多个实施方案中，将目标亲本病毒分子解析为各自具有约50至300bp的小片段经由RT-PCR重叠并且这些片段中的任一个的交换是可用于构建任何密码子或密码子对去优化病毒的cDNA基因组或基因组片段的过程。具有去优化盒的cDNA基因组然后可用于经由反向遗传学回收去优化病毒。
对于CDX-005和CDX-007，鉴定出WA1供体病毒(Vero细胞第6代)的序列与已公布的WA1序列(Vero细胞第4代)相比的一个显著差异。在从BEI资源接收到的WA1病毒的Codagenix的Vero E6细胞上的两次额外WA1病毒传代期间，刺突蛋白基因中出现36nt缺失(基因组位置23594-23629)。缺失涵盖包括多碱基弗林蛋白酶裂解位点的12个氨基酸TNSPRRARSVAS(SEQ ID NO:8)。已提出SARS-CoV2刺突蛋白中的弗林蛋白酶裂解位点作为人宿主中SARS-CoV2的高度病原性表型的潜在驱动因素。虽然不希望受任何特定理论约束，但相信弗林蛋白酶裂解的缺失对SARS-CoV-2病毒在Vero细胞中体外生长有益，并且缺失在Vero细胞培养物中的传代期间进化。进一步相信，弗林蛋白酶裂解位点的缺失可导致携带此类突变的SARS-CoV-2病毒在人宿主中的减毒。因此决定将衍生的弗林蛋白酶裂解位点缺失掺入到疫苗候选株CDX-005和CDX-007中。弗林蛋白酶裂解位点缺失位于组装片段F15。
本发明至少部分地基于前述内容和如本文所述的其他信息。
在多个实施方案中，本发明的SARS-CoV-2病毒的病毒蛋白具有与其亲本SARS-CoV-2病毒相同的氨基酸序列，但具有至多约20个氨基酸缺失、取代或添加。然而，已重新编码核苷酸序列，其导致蛋白质表达降低、减毒或两者。在多个实施方案中，本发明的SARS-CoV-2病毒的病毒蛋白具有与其亲本SARS-CoV-2病毒相同的氨基酸序列，但具有至多10个氨基酸缺失、取代或添加；然而，已重新编码核苷酸序列，其导致蛋白质表达降低、减毒或两者。在多个实施方案中，本发明的SARS-CoV-2病毒的病毒蛋白具有与其亲本SARS-CoV-2病毒相同的氨基酸序列，但在1-5个氨基酸缺失、取代或添加之间。在多个实施方案中，本发明的SARS-CoV-2病毒的病毒蛋白具有与其亲本SARS-CoV-2病毒相同的氨基酸序列，但在6-10个氨基酸缺失、取代或添加之间。在多个实施方案中，本发明的SARS-CoV-2病毒的病毒蛋白具有与其亲本SARS-CoV-2病毒相同的氨基酸序列，但在11-15个氨基酸缺失、取代或添加之间。在多个实施方案中，本发明的SARS-CoV-2病毒的病毒蛋白具有与其亲本SARS-CoV-2病毒相同的氨基酸序列，但在16-20个氨基酸缺失、取代或添加之间。然而，此外，已重新编码核苷酸序列，其导致蛋白质表达降低、减毒或两者。在多个实施方案中，本发明的SARS-CoV-2病毒的病毒蛋白具有与其亲本SARS-CoV-2病毒相同的氨基酸序列，但具有12个氨基酸缺失、取代或添加；然而，已重新编码核苷酸序列，其导致蛋白质表达降低、减毒或两者。在多个实施方案中，氨基酸缺失、取代或添加是由在亲本SARS-CoV-2病毒序列的核酸序列的polyA尾之前的核酸缺失、取代或添加造成的。
在多个实施方案中，本发明的SARS-CoV-2病毒的病毒蛋白具有与其亲本SARS-CoV-2病毒相同的氨基酸序列，但具有12个氨基酸缺失。在多个实施方案中，本发明的SARS-CoV-2病毒的病毒蛋白具有与其亲本SARS-CoV-2病毒相同的氨基酸序列，但具有1-5个氨基酸缺失、或6-10个氨基酸缺失、或11-15个氨基酸缺失、或16-20个氨基酸缺失。在多个实施方案中，氨基酸缺失在消除弗林蛋白酶裂解位点的刺突蛋白中。在多个特定实施方案中，本发明的SARS-CoV-2病毒的病毒蛋白具有与其亲本SARS-CoV-2病毒相同的氨基酸序列，但具有导致刺突蛋白上的弗林蛋白酶裂解位点消除的12个氨基酸缺失。在多个实施方案中，氨基酸缺失、取代或添加是由在亲本SARS-CoV-2病毒序列的核酸序列的polyA尾之前的核酸缺失、取代或添加造成的。
在多个实施方案中，对编码SARS-CoV-2病毒的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)蛋白的核酸进行重新编码。在其他实施方案中，对编码SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白的核酸(也称为S基因)进行重新编码。在另其他实施方案中，对SARS-CoV-2病毒的RdRP和刺突蛋白两者进行重新编码。在多个实施方案中，重新编码的刺突蛋白包含消除弗林蛋白酶裂解位点的核苷酸缺失；例如，具有SEQ ID NO:5的36个核苷酸序列。
根据本文所讨论的公开内容，通过本领域技术人员已经或可对本发明的减毒病毒的RdRP和/或刺突蛋白编码序列进行重新编码。根据本发明的多个实施方案，核苷酸取代在RdRP和/或刺突蛋白编码序列中的多个位置中被工程改造，其中取代将复数个同义密码子引入到基因组中。在某些实施方案中，同义密码子取代改变基因组中的密码子偏好、密码子对偏好、不频繁的密码子或不频繁出现的密码子对的密度、RNA二级结构、CG和/或TA(或UA)二核苷酸含量、C+G含量、翻译移码位点、翻译暂停位点、存在或不存在微小RNA识别序列或它们的任何组合。密码子取代可在整个RdRP和/或刺突蛋白编码序列中分布的多个位置中，或在受限于RdRP和/或刺突蛋白编码序列的一部分的多个位置中被工程改造。由于所涉及的大量缺陷(即，核苷酸取代)，因此本发明允许生产稳定减毒的病毒和活疫苗。
如以下进一步讨论，在一些实施方案中，病毒编码序列通过用在SARS-CoV-2冠状病毒宿主(例如，人、蛇、蝙蝠)中较不频繁使用的同义密码子取代一个或多个密码子来重新编码。在一些实施方案中，病毒编码序列通过用在冠状病毒(例如，SARS-CoV-2冠状病毒)中较不频繁使用的同义密码子取代一个或多个密码子来重新编码。在某些实施方案中，被同义密码子取代的密码子的数目为至少5个。在一些实施方案中，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450或500个密码子被宿主中较不频繁使用的同义密码子取代。在某些实施方案中，修饰序列包含至少20个被较不频繁使用的同义密码子取代的密码子。在某些实施方案中，修饰序列包含至少50个被较不频繁使用的同义密码子取代的密码子。在某些实施方案中，修饰序列包含至少100个被较不频繁使用的同义密码子取代的密码子。在某些实施方案中，修饰序列包含至少250个被较不频繁使用的同义密码子取代的密码子。在某些实施方案中，修饰序列包含至少500个被较不频繁使用的同义密码子取代的密码子。
例如，对于重新编码的刺突蛋白，被宿主中较不频繁使用的同义密码子取代的密码子的数目为至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500个密码子。
例如，对于重新编码的RdRP蛋白，被宿主中较不频繁使用的同义密码子取代的密码子的数目为至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或300个密码子。
在一些实施方案中，同义密码子的取代是用病毒宿主(例如，人)中频率较低的那些密码子进行的。病毒宿主的其他实例包括但不限于上文提及的那些。在一些实施方案中，同义密码子的取代是用病毒自身(例如，SARS-CoV-2冠状病毒)中频率较低的那些密码子进行的。
在其中与亲本病毒上的对应序列相比，修饰序列包含增加数目的CpG或UpA二核苷酸的实施方案中，与对应序列相比，增加约15-55个CpG或UpA二核苷酸。在多个实施方案中，与对应序列相比，增加约15、20、25、30、35、40、45或55个CpG或UpA二核苷酸。在一些实施方案中，与对应序列相比，CpG或UpA二核苷酸相比于对应序列的增加数目为约10-75、15-25、25-50或50-75个CpG或UpA二核苷酸。
在一些实施方案中，病毒密码子对被重新编码以减少(即，降低密码子对偏好的值)密码子对偏好。在某些实施方案中，通过在RdRP和/或刺突蛋白编码序列中鉴定具有可降低的密码子对得分的密码子对并通过用具有较低密码子对得分的密码子对取代密码子对来减少密码子对偏好来减少密码子对偏好。在一些实施方案中，密码子对的这种取代采用重排序列的现有密码子的形式。在一些此类实施方案中，通过重排同义密码子的子集来取代密码子对的子集。在其他实施方案中，通过使重排同义密码子的数目最大化来取代密码子对。应指出，虽然密码子的重排导致整个病毒编码序列的密码子对偏好减少(使负值更大)，并且重排导致许多位置处的CPS降低，但在其他位置处可能伴随CPS增加，但平均而言，密码子对得分，并且因此修饰序列的CPB降低。在一些实施方案中，密码子或密码子对的重新编码可考虑改变RdRP和/或刺突蛋白编码序列的G+C含量。在一些实施方案中，密码子或密码子对的重新编码可考虑改变RdRP和/或刺突蛋白编码序列中的CG和/或TA二核苷酸的频率。
在某些实施方案中，重新编码的RdRP和/或刺突蛋白编码序列具有小于-0.1、或小于-0.2、或小于-0.3或小于-0.4的密码子对偏好。在一些实施方案中，重新编码的RdRP和/或刺突蛋白编码序列具有小于-0.05、或小于-0.06、或小于-0.07、或小于-0.08、或小于-0.09、或小于-0.1、或小于-0.11、或小于-0.12、或小于-0.13、或小于-0.14、或小于-0.15、或小于-0.16、或小于-0.17、或小于-0.18、或小于-0.19、或小于-0.2、或小于-0.25、或小于-0.3、或小于-0.35、或小于-0.4、或小于-0.45或小于-0.5的密码子对偏好。
在某些实施方案中，与其所衍生自的亲本RdRP和/或刺突蛋白编码序列(例如，亲本序列RdRP和/或刺突蛋白编码序列、野生型序列RdRP和/或刺突蛋白编码序列)相比，重新编码的RdRP和/或刺突蛋白编码序列的密码子对偏好减少了至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4。在某些实施方案中，与其所衍生自的亲本RdRP和/或刺突蛋白编码序列相比，RdRP和/或刺突蛋白编码序列的同义密码子的重排提供至少0.1、或至少0.2、或至少0.3或至少0.4的密码子对偏好减少。在某些实施方案中，与亲本病毒上的对应序列相比，重新编码的RdRP和/或刺突蛋白编码序列的密码子对偏好减少了至少0.05、或至少0.06、或至少0.07、或至少0.08、或至少0.09、或至少0.1、或至少0.11、或至少0.12、或至少0.13、或至少0.14、或至少0.15、或至少0.16、或至少0.17、或至少0.18、或至少0.19、或至少0.2、或至少0.25、或至少0.3、或至少0.35、或至少0.4、或至少0.45、或至少0.5。在某些实施方案中，比较从中要进行计算的对应序列；例如，野生型病毒的对应序列(例如，野生型病毒上的RdRP和/或刺突蛋白编码序列)。
通常，进行这些取代和改变并降低被编码的病毒蛋白质的表达而无需改变被编码的蛋白质的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明还包括导致非同义密码子的取代和被编码的蛋白质中的氨基酸取代的RdRP和/或刺突蛋白编码序列中的改变，其可能是保守的，也可能不是保守的。在一些实施方案中，这些取代和改变还包括导致氨基酸缺失、添加、取代的取代或改变。例如，刺突蛋白可被导致弗林蛋白酶裂解位点消除的36个核苷酸缺失重新编码。
大多数氨基酸由多于一种密码子编码。参见表1中的遗传密码。例如，丙氨酸由GCU、GCC、GCA和GCG编码。三种氨基酸(Leu、Ser和Arg)由六种不同密码子编码，而仅Trp和Met具有唯一的密码子。“同义”密码子是编码相同氨基酸的密码子。因此，例如，CUU、CUC、CUA、CUG、UUA和UUG是编码Leu的同义密码子。同义密码子不以相同频率使用。一般而言，特定生物体中最频繁使用的密码子是其中同源tRNA丰富的那些密码子，并且使用这些密码子会提高蛋白质翻译的速率和/或准确性。相反，在相对较低水平下发现很少使用的密码子的tRNA，并且认为使用稀有密码子会降低翻译速率和/或准确性。
表1.遗传密码
Figure GDA0003924434880000201
a编码特定氨基酸的每个密码子中的第一个核苷酸示于最左列中；第二个核苷酸示于顶部行中；并且第三个核苷酸示于最右列中。
密码子偏好
如本文所使用，“稀有”密码子是至少两种编码特定氨基酸的同义密码子之一，所述特定氨基酸以显著低于所述氨基酸最频繁使用的密码子的频率存在于mRNA中。因此，稀有密码子可以最频繁使用的密码子的约1/2的频率存在。优选地，稀有密码子以氨基酸的最频繁使用的密码子的至少1/3，更优选至少1/5的频率存在。相反，“常见”密码子是至少两种编码特定氨基酸的同义密码子之一，所述特定氨基酸以显著高于所述氨基酸最不频繁使用的密码子的频率存在于mRNA中。常见密码子可以氨基酸的最不频繁使用的密码子的约2倍、优选至少3倍、更优选至少5倍的频率存在。例如，人类基因使用亮氨酸密码子CTG的时间为40％，但使用同义CTA的时间仅为7％(参见表2)。因此，CTG是常见密码子，而CTA是稀有密码子。与这些使用频率大致一致，识别CTG的tRNA的基因的基因组中存在6个拷贝，而识别CTA的tRNA的基因仅存在2个拷贝。类似地，人类基因使用丝氨酸的常见密码子TCT和TCC的时间分别为18％和22％，但稀有密码子TCG的时间仅为5％。TCT和TCC通过同一个tRNA经由摆动读取，所述tRNA在基因组中具有其基因的10个拷贝，而TCG通过仅具有4个拷贝的tRNA读取。众所周知，那些翻译非常活跃的mRNA很大程度上偏向于仅使用最常见的密码子。这包括核糖体蛋白和糖酵解酶的基因。另一方面，相对不丰富的蛋白质的mRNA可能使用稀有密码子。
表2.智人中的密码子使用(来源:www.kazusa.or.jp/codon/)
Figure GDA0003924434880000211
Figure GDA0003924434880000221
高度表达的基因使用常见密码子的倾向称作“密码子偏好”。核糖体蛋白的基因仅可使用61个密码子中的最常见的20至25个，并且具有高密码子偏好(密码子偏好接近1)，而表达不佳的基因可使用所有61个密码子，并且几乎没有或没有密码子偏好(密码子偏好接近0)。据认为，频繁使用的密码子是其中表达较大量的同源tRNA的密码子，并且这些密码子的使用使得翻译进行得更快速或更准确或两者。
密码子对偏好
另外，给定生物体对给定密码子A的最近密码子邻居具有偏好，称为密码子对利用的偏好。密码子对偏好的变化在不改变现有密码子的情况下可能影响蛋白质合成和蛋白质产生的速率。
密码子对偏好可通过考虑氨基酸对Ala-Glu来说明，所述氨基酸对可由8个不同密码子对编码。如果除每个个别密码子的频率(如表2中所示)以外没有因素对密码子对的频率负责，则8个编码中的每一个的预期频率可通过使两个相关密码子的频率相乘来计算。例如，通过这种计算，预期密码子对GCA-GAA将以0.097的频率出现在所有Ala-Glu编码对中(0.23×0.42；基于表2中的频率)。为了使每个密码子对的预期(假设)频率与人类基因组中的实际观察频率相关，使用一致注释的人编码区的Consensus CDS(CCDS)数据库，其含有总计14,795个人类基因。这组基因是人编码序列的最全面代表。使用这组基因，密码子使用的频率通过密码子的出现次数除以编码相同氨基酸的所有同义密码子的数目来重新计算。如所预期，频率与先前公布的频率(诸如表2中给出的频率)紧密相关。轻微的频率变化可能是由于Kazusa DNA研究机构密码子使用数据库(www.kazusa.or.jp/codon/codon.html)提供的数据中的过采样效应，其中计算中包括84949个人编码序列(远大于人类基因的实际数目)。通过首先将两个相关密码子的频率彼此相乘(参见表3预期频率)，并且然后将这个结果与观察频率(在整个CCDS数据集中)相乘来将由此计算的密码子频率然后用于计算预期密码子对频率，其中由所讨论的密码子对编码的氨基酸对会出现。在密码子对GCA-GAA的实例中，这第二次计算给出的预期频率为0.098(相比于使用Kazusa数据集的第一次计算中的0.097)。最后，如在14,795个人类基因集中观察到的实际密码子对频率通过对所述集合中每个密码子对的总出现次数进行计数并将其除以编码相同氨基酸对的集合中所有同义编码对的数目来测定(表3；观察频率)。基于14,795个人类基因集，如表3在此提供3721(612)个密码子对全集的频率和观察/预期值。
表3.由氨基对Ala-Glu例示的密码子对得分
Figure GDA0003924434880000231
如果密码子对的观察频率/预期频率的比大于一，则密码子对称为过表达(overrepresented)。如果比小于一，则其称为低表达(underrepresented)。在实例中，密码子对GCA-GAA过表达1.65倍，而编码对GCC-GAA低表达超过5倍。
许多其他密码子对显示出极强偏好；一些对低表达，而其他对过表达。例如，密码子对GCCGAA(AlaGlu)和GATCTG(AspLeu)低表达三至六倍(优选的对分别是GCAGAG和GACCTG)，而密码子对GCCAAG(AlaLys)和AATGAA(AsnGlu)过表达约两倍。值得注意的是，密码子对偏好与氨基酸对的频率无关，也与个别密码子的频率无关。例如，低表达对GATCTG(AspLeu)恰好使用最常见的Leu密码子(CTG)。
如下文更充分地讨论，密码子对偏好考虑编码序列中每个密码子对在编码序列的整个长度上平均化的得分。根据本发明，密码子对偏好通过以下测定
Figure GDA0003924434880000241
因此，编码序列的类似密码子对偏好可例如通过使子序列上的密码子对得分降至最低或使编码序列的全长上的密码子对得分适度降低来获得。
密码子对偏好的计算
可能含有3721个非“STOP”的密码子对(例如，GTT-GCT)的每一个个别密码子对都携带指定的“密码子对得分”或对给定的基因“训练集”具有特异性的“CPS”。给定密码子对的CPS定义为观察到的出现次数相对于在此基因集(在这个实例中为人类基因组)中将预期出现的次数的对数比。确定特定密码子对的实际出现次数(或换言之，特定氨基酸对由特定密码子对编码的可能性)只是计算特定编码序列集中密码子对的实际出现次数的问题。然而，确定预期次数需要额外计算。类似于Gutman和Hatfield，计算预期次数以便不依赖于氨基酸频率和密码子偏好两者。即，预期频率是基于氨基酸由特定密码子编码的次数的相对比例来计算的。正CPS值表示给定密码子对在统计学上过表达，并且负CPS指示所述对在人类基因组中在统计学上低表达。
为了在人背景下进行这些计算，使用一致注释的人编码区的最新Consensus CDS(CCDS)数据库，其含有总计14,795个基因。这个数据集提供密码子和密码子对，并且因此以基因组规模提供氨基酸和氨基酸对频率。
Federov等人的范例(2002)用于进一步增强Gutman和Hatfield的方法(1989)。这允许计算给定密码子对的预期频率，而与密码子频率和编码特定氨基酸对的相邻密码子的非随机缔合无关。用于计算CPB的详细等式公开于WO 2008/121992和WO 2011/044561中，所述专利以引用的方式并入。
Figure GDA0003924434880000251
在计算中，Pij是在其同义组中以NO(Pij)的频率出现的密码子对。Ci和Cj是包含Pij的两个密码子，其分别在其同义组中以频率F(Ci)和F(Cj)出现。更明确地，F(Ci)是对应氨基酸Xi在整个所有编码区中由密码子Ci编码的频率，并且F(Ci)＝NO(Cj)/NO(Xi)，其中NO(Ci)和NO(Xi)分别是所观察到的密码子Ci和氨基酸Xi的出现次数。相应地计算F(Cj)。此外，NO(Xij)是氨基酸对Xij在整个所有编码区中的出现次数。Pij的密码子对偏好得分S(Pij)计算为观察频率No(Pij)相对于Ne(Pij)的预期出现次数的对数-比值比。
使用上式，然后确定个别编码序列中的个别密码子对在与通过使用整个人CCDS数据集计算的对应基因组Ne(Pij)值相比时是否过表达或低表达。此计算产生人编码区中过表达密码子对的正S(Pij)得分值和低表达密码子对的负值。
个别编码序列的“组合”密码子对偏好通过对根据下式的所有密码子对得分取平均值来计算：
Figure GDA0003924434880000261
因此，整个编码区的密码子对偏好通过将包含所述区的所有个别密码子对得分相加并将这个总和除以编码序列的长度来计算。
计算密码子对偏好，实施改变密码子对偏好的算法。
开发算法以量化密码子对偏好。向每一个可能的个别密码子对给予“密码子对得分”或“CPS”。CPS定义为在所有人编码区上每个密码子对的所观察到的出现次数相对于预期出现次数的比的自然对数，其中人代表待重新编码的本发明的疫苗病毒的宿主物种。
Figure GDA0003924434880000262
尽管对特定密码子对的所观察到的出现的计算是简单的(基因集内的实际计数)，但密码子对的预期出现次数需要额外计算。计算这个预期次数而与氨基酸频率和密码子偏好两者无关，类似于Gutman和Hatfield。即，预期频率是基于氨基酸由特定密码子编码的次数的相对比例来计算的。正CPS值表示给定密码子对在统计学上过表达，并且负CPS指示所述对在人类基因组中在统计学上低表达。
使用这些所计算的CPS，通过对密码子对得分取平均值，然后可将任何编码区评定为使用过表达或低表达的密码子对，从而给出整个基因的密码子对偏好(CPB)。
Figure GDA0003924434880000271
已使用所示出和绘制的等式计算了所有注释人类基因的CPB。图中的每个点对应于单一人类基因的CPB。分布峰具有0.07的正密码子对偏好，其是所有注释人类基因的平均得分。此外，存在极少具有负密码子对偏好的基因。然后使用定义和计算CPB而建立的等式来操作这种偏好。
用于减少密码子对偏好的算法。
可在有或没有于计算机的帮助下，使用例如梯度下降或模拟退火或其他最小化程序来进行蛋白质编码序列的重新编码。重排存在于起始序列中的密码子的程序的实例可由以下步骤表示：
1)获得野生型病毒基因组序列。
2)选择靶向减毒设计的蛋白质编码序列。
3)用非编码功能锁定已知或推测的DNA片段。
4)为重新设计的蛋白质中的其余氨基酸选择所需密码子分布。
5)对至少两个同义解锁密码子位置进行随机混洗并计算密码子对得分。
6)任选地采用模拟退火程序来进一步降低(或增加)密码子对得分。
7)检查所得设计是否存在过多二级结构和不需要的限制位点：
·如果是->转至步骤(5)或通过用野生型序列替换有问题的区域来校正设计并转至步骤(8)。
8)合成对应于病毒设计的DNA序列。
9)创建病毒构建体并评估病毒表型：
·如果过于减毒，则制备亚克隆构建体并转至9；
·如果减毒不充分，则转至2。
通过减少密码子对偏好来对病毒进行减毒公开于WO2008/121992和WO 2011/044561中，所述专利如同完全阐述一般以引用的方式并入。
获得嵌入在野生型SARS-CoV-2基因组序列(或其引起COVID-19的野生型序列的突变形式)中的全长SARS-CoV-2基因组序列或密码子对去优化序列的方法可包括例如使用BAC载体，使用重叠延伸PCR策略或基于长PCR的融合策略来构建感染性cDNA克隆。
重新编码的多核苷酸
本发明的多个实施方案提供编码亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的多核苷酸，其中多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，被重新编码，并且其中由多核苷酸编码的亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的氨基酸序列保持相同。在多个实施方案中，在亲本SARS-CoV-2病毒序列的核酸序列的polyA尾之前，由多核苷酸编码的亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的氨基酸序列保持相同。
本发明的多个实施方案提供编码亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的多核苷酸，其中多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，被重新编码，并且其中由多核苷酸编码的亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的氨基酸序列包含至多20个氨基酸取代、添加或缺失。在多个实施方案中，在亲本SARS-CoV-2病毒序列的核酸序列的polyA尾之前，由多核苷酸编码的亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的氨基酸序列包含至多20个氨基酸取代、添加或缺失。
本发明的多个实施方案提供编码亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的多核苷酸，其中多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，被重新编码，并且其中由多核苷酸编码的亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的氨基酸序列包含至多10个氨基酸取代、添加或缺失。在多个实施方案中，在亲本SARS-CoV-2病毒序列的核酸序列的polyA尾之前，由多核苷酸编码的亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的氨基酸序列包含至多10个氨基酸取代、添加或缺失。
本发明的多个实施方案提供编码亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的多核苷酸，其中多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，被重新编码，并且其中由多核苷酸编码的亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的氨基酸序列包含至多12个氨基酸取代、添加或缺失。在多个实施方案中，在亲本SARS-CoV-2病毒序列的核酸序列的polyA尾之前，由多核苷酸编码的亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的氨基酸序列包含至多12个氨基酸取代、添加或缺失。
在多个实施方案中，氨基酸序列包含至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代、添加或缺失。在多个实施方案中，氨基酸序列包含1-5、6-10、11-15或16-20个氨基酸取代、添加或缺失。在多个实施方案中，氨基酸缺失、取代或添加是由在亲本SARS-CoV-2病毒序列的核酸序列的polyA尾之前的核酸缺失、取代或添加造成的。
在多个实施方案中，氨基酸序列包含12个氨基酸缺失。在多个实施方案中，氨基酸序列包含1-5、6-10、11-15或16-20个氨基酸缺失。在多个实施方案中，氨基酸取代、添加或缺失可归因于重新编码的序列中的一个或多个点突变。在多个实施方案中，氨基酸缺失、取代或添加是由在亲本SARS-CoV-2病毒序列的核酸序列的polyA尾之前的核酸缺失、取代或添加造成的。
因此，在这些重新编码的多核苷酸(具有或不具有核酸缺失、取代或添加)的多个实施方案中，重新编码的多核苷酸针对polyA尾可具有不同长度；例如在3'端上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54个连续腺嘌呤；或例如在3'端上1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48或49-54个连续腺嘌呤；或例如在3'端上9-37、12-34、15-33、18-30或21-27个连续腺嘌呤；或例如在3'端上19-25个连续腺嘌呤。
在多个实施方案中，多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，通过减少密码子对偏好(CPB)或减少密码子使用偏好来重新编码。
在多个实施方案中，多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，通过增加CpG或UpA二核苷酸的数目来重新编码。
在多个实施方案中，重新编码的一种或多种病毒蛋白中的每一种或所述重新编码病毒蛋白的一个或多个片段中的每一个具有小于-0.05、小于-0.1、小于-0.2、小于-0.3或小于-0.4的密码子对偏好。
在某些实施方案中，重新编码的病毒蛋白是RdRP和/或刺突蛋白，并且重新编码的病毒蛋白或其片段中的每一者具有小于-0.05、或小于-0.06、或小于-0.07、或小于-0.08、或小于-0.09、或小于-0.1、或小于-0.11、或小于-0.12、或小于-0.13、或小于-0.14、或小于-0.15、或小于-0.16、或小于-0.17、或小于-0.18、或小于-0.19、或小于-0.2、或小于-0.25、或小于-0.3、或小于-0.35、或小于-0.4、或小于-0.45或小于-0.5的密码子对偏好。
在某些实施方案中，重新编码的病毒蛋白是RdRP和/或刺突蛋白，并且重新编码的病毒蛋白或其片段中的每一者与亲本序列上的对应序列相比减少了至少0.05、或至少0.06、或至少0.07、或至少0.08、或至少0.09、或至少0.1、或至少0.11、或至少0.12、或至少0.13、或至少0.14、或至少0.15、或至少0.16、或至少0.17、或至少0.18、或至少0.19、或至少0.2、或至少0.25、或至少0.3、或至少0.35、或至少0.4、或至少0.45或至少0.5。在某些实施方案中，比较从中要进行计算的亲本序列上的对应序列；例如，野生型病毒的对应序列。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是野生型SARS-CoV-2冠状病毒。在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是天然分离株SARS-CoV-2冠状病毒。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是SARS-CoV-2冠状病毒的野生型BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019分离株。在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是SARS-CoV-2冠状病毒的野生型华盛顿分离株(GenBank：MN985325.1)，如同以其全文完全阐述一般在此供参考。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是野生型SARS-CoV-2冠状病毒序列的突变形式。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是SARS-CoV-2变体。在多个实施方案中，SARS-CoV-2变体为英国变体、南非变体或巴西变体。
英国变体的实例包括但不限于GenBank登录号MW462650(SARS-CoV-2/human/USA/MN-MDH-2252/2020)、MW463056(SARS-CoV-2/human/USA/FL-BPHL-2270/2020)和MW440433(SARS-CoV-2/human/USA/NY-Wadsworth-291673-01/2020)，全部截至2021年1月19日，如同以其全文完全阐述一般全部以引用的方式并入本文。英国变体的额外实例包括但不限于GISAID ID号EPI_ISL_778842(hCoV-19/USA/TX-CDC-9KXP-8438/2020；2020-12-28)、EPI_ISL_802609(hCoV-19/USA/CA-CDC-STM-050/2020；2020-12-28)、EPI_ISL_802647(hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-043/2020；2020-12-26)、EPI_ISL_832014(hCoV-19/USA/UT-UPHL-2101178518/2020；2020-12-31)、EPI_ISL_850618(hCoV-19/USA/IN-CDC-STM-183/2020；2020-12-31)和EPI_ISL_850960(hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-A100002/2021；2021-01-04)，全部截至2021年1月20日，并且如同以其全文完全阐述一般全部以引用的方式并入本文。
南非变体的实例包括但不限于GISAID ID号EPI_ISL_766709(hCoV-19/Sweden/20-13194/2020；2020-12-24)、EPI_ISL_768828(hCoV-19/France/PAC-NRC2933/2020；2020-12-22)、EPI_ISL_770441(hCoV-19/England/205280030/2020；2020-12-24)和EPI_ISL_819798(hCoV-19/England/OXON-F440A7/2020；2020-12-18)，全部截至2021年1月20日，并且如同以其全文完全阐述一般全部以引用的方式并入本文。
巴西变体的实例包括但不限于GISAID ID号EPI_ISL_677212(hCoV-19/USA/VA-DCLS-2187/2020；2020-11-12)、EPI_ISL_723494(hCoV-19/USA/VA-DCLS-2191/2020；2020-11-12)、EPI_ISL_845768(hCoV-19/USA/GA-EHC-458R/2021；2021-01-05)、EPI_ISL_848196(hCoV-19/Canada/LTRI-1192/2020；2020-12-24)和EPI_ISL_848197(hCoV-19/Canada/LTRI-1258/2020；2020-12-24)，全部截至2021年1月20日，并且如同以其全文完全阐述一般全部以引用的方式并入本文。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是先前修饰的病毒核酸或先前减毒的病毒核酸。
在多个实施方案中，多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，被CPB去优化。在多个实施方案中，多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，被密码子去优化。
在多个实施方案中，密码子去优化或CPB去优化是基于人中频繁使用的密码子或CPB。在多个实施方案中，密码子去优化或CPB去优化是基于冠状病毒中频繁使用的密码子或CPB。在多个实施方案中，密码子去优化或CPB去优化是基于SARS-CoV-2冠状病毒中频繁使用的密码子或CPB。在多个实施方案中，密码子去优化或CPB去优化是基于野生型SARS-CoV-2冠状病毒中频繁使用的密码子或CPB。
在多个实施方案中，多核苷酸包含选自RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)、RdRP的片段、刺突蛋白、刺突蛋白的片段和它们的组合的重新编码的核苷酸序列。在多个实施方案中，多核苷酸包含核苷酸缺失，其导致消除弗林蛋白酶裂解位点的刺突蛋白中的氨基酸缺失。虽然不希望受任何特定理论约束，但本发明人相信消除弗林蛋白酶裂解位点将是疫苗和/或免疫组合物的安全性的驱动因素之一。
在多个实施方案中，多核苷酸包含至少一个选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的bp11294-12709、bp 14641-15903、bp 21656-22306、bp 22505-23905和bp 24110-25381的CPB去优化区域。
在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:3(Wuhan-CoV_101K)。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:3的核苷酸1-29,877(例如，无polyA尾)。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:3的核苷酸1-29,877和3'端上的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54个连续腺嘌呤。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:3的核苷酸1-29,877和3'端上的1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48或49-54个连续腺嘌呤。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQID NO:3的核苷酸1-29,877和3'端上的9-37、12-34、15-33、18-30或21-27个连续腺嘌呤。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:3的核苷酸1-29,877和3'端上的19-25个连续腺嘌呤。
在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:4。SEQ ID NO:4是与野生型WA-1序列(GenBank：MN985325.1，如同完全阐述一般以引用的方式并入本文)相比的去优化序列(例如，CDX-005)。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834(例如，无polyA尾)。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834和3'端上的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54个连续腺嘌呤。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834和3'端上的1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48或49-54个连续腺嘌呤。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834和3'端上的9-37、12-34、15-33、18-30或21-27个连续腺嘌呤。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834和3'端上的19-25个连续腺嘌呤。
在多个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:6(重新编码的刺突蛋白)。
载体、细胞、多肽
多个实施方案提供了一种包含本发明的多核苷酸的细菌人工染色体(BAC)。本发明的多核苷酸是如本文所讨论的重新编码的多肽。
多个实施方案提供了一种包含本发明的多核苷酸的载体。本发明的多核苷酸是如本文所讨论的重新编码的多肽。
一种细胞，其包含本发明的载体。载体是如本文所讨论的那些。
在多个实施方案中，细胞是Vero细胞、海拉细胞(HeLa Cell)、幼仓鼠肾(BHK)细胞、MA104细胞、293T细胞、BSR-T7细胞、MRC-5细胞、CHO细胞或PER.C6细胞。在特定实施方案中，细胞是Vero细胞或幼仓鼠肾(BHK)细胞。
多个实施方案提供了一种由本发明的多核苷酸编码的多肽。本发明的多核苷酸是如本文所讨论的重新编码的多肽。多肽表现出不同于野生型SARS-CoV-2病毒所编码的多肽或SARS-CoV-2变体所编码的多肽的特性。例如，如本文所讨论的由重新编码的多核苷酸和去优化多核苷酸编码的多肽可对病毒发挥减毒特性。
修饰的病毒
本发明的多个实施方案提供了一种修饰的SARS-CoV-2冠状病毒，其包含由本发明的多核苷酸编码的多肽。本发明的多核苷酸是如本文所讨论的重新编码的多肽。
本发明的多个实施方案提供了一种修饰的SARS-CoV-2冠状病毒，其包含本发明的多核苷酸。本发明的多核苷酸是本文所讨论的重新编码的多肽中的任一种。
在多个实施方案中，其病毒蛋白中的一种或多种的表达与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒相比是降低的。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是野生型SARS-CoV-2冠状病毒。在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是天然分离株SARS-CoV-2冠状病毒。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是SARS-CoV-2冠状病毒的野生型BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019分离株。在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是SARS-CoV-2冠状病毒的野生型华盛顿分离株(GenBank：MN985325.1)，如同以其全文完全阐述一般在此供参考。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是野生型SARS-CoV-2冠状病毒序列的突变形式。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是SARS-CoV-2变体。在多个实施方案中，SARS-CoV-2变体为英国变体、南非变体或巴西变体。
英国变体的实例包括但不限于GenBank登录号MW462650(SARS-CoV-2/human/USA/MN-MDH-2252/2020)、MW463056(SARS-CoV-2/human/USA/FL-BPHL-2270/2020)和MW440433(SARS-CoV-2/human/USA/NY-Wadsworth-291673-01/2020)，全部截至2021年1月19日，如同以其全文完全阐述一般全部以引用的方式并入本文。英国变体的额外实例包括但不限于GISAID ID号EPI_ISL_778842(hCoV-19/USA/TX-CDC-9KXP-8438/2020；2020-12-28)、EPI_ISL_802609(hCoV-19/USA/CA-CDC-STM-050/2020；2020-12-28)、EPI_ISL_802647(hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-043/2020；2020-12-26)、EPI_ISL_832014(hCoV-19/USA/UT-UPHL-2101178518/2020；2020-12-31)、EPI_ISL_850618(hCoV-19/USA/IN-CDC-STM-183/2020；2020-12-31)和EPI_ISL_850960(hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-A100002/2021；2021-01-04)，全部截至2021年1月20日，并且如同以其全文完全阐述一般全部以引用的方式并入本文。
南非变体的实例包括但不限于GISAID ID号EPI_ISL_766709(hCoV-19/Sweden/20-13194/2020；2020-12-24)、EPI_ISL_768828(hCoV-19/France/PAC-NRC2933/2020；2020-12-22)、EPI_ISL_770441(hCoV-19/England/205280030/2020；2020-12-24)和EPI_ISL_819798(hCoV-19/England/OXON-F440A7/2020；2020-12-18)，全部截至2021年1月20日，并且如同以其全文完全阐述一般全部以引用的方式并入本文。
巴西变体的实例包括但不限于GISAID ID号EPI_ISL_677212(hCoV-19/USA/VA-DCLS-2187/2020；2020-11-12)、EPI_ISL_723494(hCoV-19/USA/VA-DCLS-2191/2020；2020-11-12)、EPI_ISL_845768(hCoV-19/USA/GA-EHC-458R/2021；2021-01-05)、EPI_ISL_848196(hCoV-19/Canada/LTRI-1192/2020；2020-12-24)和EPI_ISL_848197(hCoV-19/Canada/LTRI-1258/2020；2020-12-24)，全部截至2021年1月20日，并且如同以其全文完全阐述一般全部以引用的方式并入本文。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是先前修饰的病毒核酸或先前减毒的病毒核酸。
在多个实施方案中，由于重新编码所选择的RdRP蛋白、刺突蛋白和它们的组合的区域，减少其病毒蛋白中的一种或多种的表达降低。
在多个实施方案中，多核苷酸编码亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段，其中多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，被重新编码，并且其中由多核苷酸编码的亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的氨基酸序列保持相同。
在多个实施方案中，多核苷酸编码亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段，其中多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，被重新编码，并且其中由多核苷酸编码的亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的氨基酸序列包含至多15个氨基酸取代、添加或缺失。在多个实施方案中，氨基酸序列包含至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代、添加或缺失。在多个实施方案中，氨基酸序列包含12个氨基酸缺失。在多个实施方案中，氨基酸序列包含1-3、4-6、7-9、10-12或13-15个氨基酸缺失。氨基酸取代、添加或缺失可归因于重新编码的序列中的一个或多个点突变。在多个实施方案中，氨基酸缺失、取代或添加是由在亲本SARS-CoV-2病毒序列的核酸序列的polyA尾之前的核酸缺失、取代或添加造成的。
在多个实施方案中，多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，通过减少密码子对偏好(CPB)或减少密码子使用偏好来重新编码。
在多个实施方案中，多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，通过增加CpG或UpA二核苷酸的数目来重新编码。
在多个实施方案中，重新编码的一种或多种病毒蛋白中的每一种或所述重新编码病毒蛋白的一个或多个片段中的每一个具有小于-0.05、小于-0.1、小于-0.2、小于-0.3或小于-0.4的密码子对偏好。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是野生型SARS-CoV-2冠状病毒。在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是天然分离株SARS-CoV-2冠状病毒。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是SARS-CoV-2冠状病毒的野生型BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019分离株。在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是SARS-CoV-2冠状病毒的野生型华盛顿分离株(GenBank：MN985325.1)，如同以其全文完全阐述一般在此供参考。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是野生型SARS-CoV-2冠状病毒序列的突变形式。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是SARS-CoV-2变体。在多个实施方案中，SARS-CoV-2变体为英国变体、南非变体或巴西变体。
英国变体的实例包括但不限于GenBank登录号MW462650(SA RS-CoV-2/human/USA/MN-MDH-2252/2020)、MW463056(SARS-Co V-2/human/USA/FL-BPHL-2270/2020)和MW440433(SARS-CoV-2/human/USA/NY-Wadsworth-291673-01/2020)，全部截至2021年1月19日，如同以其全文完全阐述一般全部以引用的方式并入本文。英国变体的额外实例包括但不限于GISAID ID号EPI_ISL_778842(hCoV-19/USA/TX-CDC-9KXP-8438/2020；2020-12-28)、EPI_ISL_802609(hCoV-19/USA/CA-CDC-STM-050/2020；2020-12-28)、EPI_ISL_802647(hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-043/2020；2020-12-26)、EPI_ISL_832014(hCoV-19/USA/UT-UPHL-2101178518/2020；2020-12-31)、EPI_ISL_850618(hCoV-19/USA/IN-CDC-STM-183/2020；2020-12-31)和EPI_ISL_850960(hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-A100002/2021；2021-01-04)，全部截至2021年1月20日，并且如同以其全文完全阐述一般全部以引用的方式并入本文。
南非变体的实例包括但不限于GISAID ID号EPI_ISL_766709(hCoV-19/Sweden/20-13194/2020；2020-12-24)、EPI_ISL_768828(hCoV-19/France/PAC-NRC2933/2020；2020-12-22)、EPI_ISL_770441(hCoV-19/England/205280030/2020；2020-12-24)和EPI_ISL_819798(hCoV-19/England/OXON-F440A7/2020；2020-12-18)，全部截至2021年1月20日，并且如同以其全文完全阐述一般全部以引用的方式并入本文。
巴西变体的实例包括但不限于GISAID ID号EPI_ISL_677212(hCoV-19/USA/VA-DCLS-2187/2020；2020-11-12)、EPI_ISL_723494(hCoV-19/USA/VA-DCLS-2191/2020；2020-11-12)、EPI_ISL_845768(hCoV-19/USA/GA-EHC-458R/2021；2021-01-05)、EPI_ISL_848196(hCoV-19/Canada/LTRI-1192/2020；2020-12-24)和EPI_ISL_848197(hCoV-19/Canada/LTRI-1258/2020；2020-12-24)，全部截至2021年1月20日，并且如同以其全文完全阐述一般全部以引用的方式并入本文。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是先前修饰的病毒核酸或先前减毒的病毒核酸。
在多个实施方案中，多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，被CPB去优化。在多个实施方案中，多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，被密码子去优化。
在多个实施方案中，密码子去优化或CPB去优化是基于人中频繁使用的密码子或CPB。在多个实施方案中，密码子去优化或CPB去优化是基于冠状病毒中频繁使用的密码子或CPB。在多个实施方案中，密码子去优化或CPB去优化是基于SARS-CoV-2冠状病毒中频繁使用的密码子或CPB。在多个实施方案中，密码子去优化或CPB去优化是基于野生型SARS-CoV-2冠状病毒中频繁使用的密码子或CPB。
在多个实施方案中，多核苷酸包含选自RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)、RdRP的片段、刺突蛋白、刺突蛋白的片段和它们的组合的重新编码的核苷酸序列。在多个实施方案中，多核苷酸包含核苷酸缺失，其导致消除弗林蛋白酶裂解位点的刺突蛋白中的氨基酸缺失。虽然不希望受任何特定理论约束，但本发明人相信消除弗林蛋白酶裂解位点将是疫苗和/或免疫组合物的安全性的驱动因素之一。
在多个实施方案中，多核苷酸包含至少一个选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的bp11294-12709、bp 14641-15903、bp 21656-22306、bp 22505-23905和bp 24110-25381的CPB去优化区域。
在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:3(Wuhan-CoV_101K)。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:3的核苷酸1-29,877(例如，无polyA尾)。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:3的核苷酸1-29,877和3'端上的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54个连续腺嘌呤。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ IDNO:3的核苷酸1-29,877和3'端上的1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48或49-54个连续腺嘌呤。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ IDNO:3的核苷酸1-29,877和3'端上的9-37、12-34、15-33、18-30或21-27个连续腺嘌呤。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:3的核苷酸1-29,877和3'端上的19-25个连续腺嘌呤。
在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:4。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834(例如，无polyA尾)。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834和3'端上的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54个连续腺嘌呤。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:4的1-29,834和3'端上的1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48或49-54个连续腺嘌呤。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834和3'端上的9-37、12-34、15-33、18-30或21-27个连续腺嘌呤。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834和3'端上的19-25个连续腺嘌呤。
在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:7。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:7的核苷酸1-29,834(例如，无polyA尾)。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:7的核苷酸1-29,834和3'端上的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54个连续腺嘌呤。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:7的1-29,834和3'端上的1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48或49-54个连续腺嘌呤。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:7的核苷酸1-29,834和3'端上的9-37、12-34、15-33、18-30或21-27个连续腺嘌呤。在多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:7的核苷酸1-29,834和3'端上的19-25个连续腺嘌呤。
在多个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:6(重新编码的刺突蛋白)。
免疫和/或疫苗组合物
多个实施方案提供了一种用于诱导受试者中的免疫反应的免疫组合物，其包含：本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒。修饰的SARS-CoV-2冠状病毒是本文所讨论的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒中的任一种。在多个实施方案中，本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒是减毒活病毒。在一些实施方案中，免疫组合物还包含如本文所述的可接受的赋形剂或载剂。在一些实施方案中，免疫组合物还包含如本文所述的稳定剂。在一些实施方案中，免疫组合物还包含如本文所述的佐剂。在一些实施方案中，免疫组合物还包含蔗糖、甘氨酸或两者。在多个实施方案中，免疫组合物还包含蔗糖(约5％)和甘氨酸(约5％)。在多个实施方案中，可接受的载剂或赋形剂选自由以下组成的组：糖、氨基酸、表面活性剂和它们的组合。在多个实施方案中，氨基酸的浓度为约5％w/v。合适的氨基酸的非限制性实例包括精氨酸和组氨酸。合适的载剂的非限制性实例包括明胶和人血清白蛋白。合适的表面活性剂的非限制性实例包括非离子表面活性剂，诸如0.01％-0.05％的极低浓度的聚山梨醇酯80。
在多个实施方案中，以约103-107PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约104-106PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约103PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约104PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约105PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约106PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约107PFU的剂量提供免疫组合物。
在多个实施方案中，以约5×103PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约5×104PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约5×105PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约5×106PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约5×107PFU的剂量提供免疫组合物。
多个实施方案提供了一种用于诱导受试者中的免疫反应的疫苗组合物，其包含：本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒。修饰的SARS-CoV-2冠状病毒是本文所讨论的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒中的任一种。在多个实施方案中，本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒是减毒活病毒。在一些实施方案中，疫苗组合物还包含如本文所述的可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方案中，免疫组合物还包含如本文所述的稳定剂。在一些实施方案中，疫苗组合物还包含如本文所述的佐剂。在一些实施方案中，疫苗组合物还包含蔗糖、甘氨酸或两者。在多个实施方案中，疫苗组合物还包含蔗糖(5％)和甘氨酸(5％)。在多个实施方案中，可接受的载剂或赋形剂选自由以下组成的组：糖、氨基酸、表面活性剂和它们的组合。在多个实施方案中，氨基酸的浓度为约5％w/v。合适的氨基酸的非限制性实例包括精氨酸和组氨酸。合适的载剂的非限制性实例包括明胶和人血清白蛋白。合适的表面活性剂的非限制性实例包括非离子表面活性剂，诸如0.01％-0.05％的极低浓度的聚山梨醇酯80。
在多个实施方案中，以约103-107PFU的剂量提供疫苗组合物。在多个实施方案中，以约104-106PFU的剂量提供疫苗组合物。在多个实施方案中，以约103PFU的剂量提供疫苗组合物。在多个实施方案中，以约104PFU的剂量提供疫苗组合物。在多个实施方案中，以约105PFU的剂量提供疫苗组合物。在多个实施方案中，以约106PFU的剂量提供疫苗组合物。在多个实施方案中，以约107PFU的剂量提供疫苗组合物。
在多个实施方案中，以约5×103PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约5×104PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约5×105PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约5×106PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约5×107PFU的剂量提供免疫组合物。
多个实施方案提供了一种用于诱导受试者中的保护性免疫反应的疫苗组合物，其包含：本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒。修饰的SARS-CoV-2冠状病毒是本文所讨论的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒中的任一种。在多个实施方案中，本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒是减毒活病毒。在一些实施方案中，疫苗组合物还包含如本文所述的可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方案中，疫苗组合物还包含如本文所述的佐剂。在一些实施方案中，疫苗组合物还包含蔗糖、甘氨酸或两者。在多个实施方案中，疫苗组合物还包含蔗糖(5％)和甘氨酸(5％)。在多个实施方案中，可接受的载剂或赋形剂选自由以下组成的组：糖、氨基酸、表面活性剂和它们的组合。在多个实施方案中，氨基酸的浓度为约5％w/v。合适的氨基酸的非限制性实例包括精氨酸和组氨酸。合适的载剂的非限制性实例包括明胶和人血清白蛋白。合适的表面活性剂的非限制性实例包括非离子表面活性剂，诸如0.01％-0.05％的极低浓度的聚山梨醇酯80。
在多个实施方案中，以约103-107PFU的剂量提供疫苗组合物。在多个实施方案中，以约104-106PFU的剂量提供疫苗组合物。在多个实施方案中，以约103PFU的剂量提供疫苗组合物。在多个实施方案中，以约104PFU的剂量提供疫苗组合物。在多个实施方案中，以约105PFU的剂量提供疫苗组合物。在多个实施方案中，以约106PFU的剂量提供疫苗组合物。在多个实施方案中，以约107PFU的剂量提供疫苗组合物。
在多个实施方案中，以约5×103PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约5×104PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约5×105PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约5×106PFU的剂量提供免疫组合物。在多个实施方案中，以约5×107PFU的剂量提供免疫组合物。
应理解，本发明的减毒病毒，在用于引发受试者中免疫反应(或保护性免疫反应)或预防受试者罹患病毒相关的疾病或降低罹患病毒相关的疾病的可能性的情况下，可以另外包含药学上可接受的载剂或赋形剂的组合物的形式向受试者施用。药学上可接受的载剂和赋形剂是本领域技术人员已知的并且包括但不限于以下中的一种或多种：0.01-0.1M和优选0.05M磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、DMEM、L-15、含10％-25％蔗糖溶液的PBS、含10％-25％蔗糖溶液的DMEM或0.9％盐水。此类载剂还包括水性或非水性溶液、混悬液和乳液。水性载剂包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液、盐水和缓冲介质。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏油或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的那些补充剂)等。固体组合物可包含无毒性固体载剂，诸如像葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素或纤维素衍生物、碳酸钠、明胶、重组人血清白蛋白、人血清白蛋白和/或碳酸镁。对于以气溶胶形式施用，诸如对于肺部和/或鼻内递送，剂或组合物优选与无毒性表面活性剂(例如C6至C22脂肪酸的酯或偏酯或天然甘油酯)和推进剂一起配制。可包括诸如卵磷脂的额外载剂以有助于鼻内递送。药学上可接受的载剂或赋形剂还可包含少量辅助物质(诸如湿润剂或乳化剂)、防腐剂和其他添加剂(诸如像抗微生物剂、抗氧化剂和螯合剂)，其增强活性成分的保质期和/或有效性。如本领域所众所周知，可配制本发明的组合物以便在向受试者施用之后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。
在多个实施方案中，疫苗组合物或免疫组合物被配制用于静脉内或鞘内、皮下、肌肉内、皮内或鼻内递送。在多个实施方案中，疫苗组合物或免疫组合物被配制用于鼻内递送。在多个实施方案中，疫苗组合物或免疫组合物被配制用于经由鼻用滴剂或鼻用喷雾递送。
使用本发明的组合物的方法。
多个实施方案提供了一种引发受试者中免疫反应的方法，其包括：向受试者施用一剂本发明的免疫组合物。免疫组合物是本文所讨论的免疫组合物中的任一种。在多个实施方案中，剂量是预防有效或治疗有效剂量。
在多个实施方案中，免疫组合物静脉内或鞘内、皮下、肌肉内、皮内或鼻内施用。在多个实施方案中，免疫组合物鼻内施用。在多个实施方案中，免疫组合物经由鼻用滴剂或鼻用喷雾施用。
多个实施方案提供了一种引发受试者中免疫反应的方法，其包括：向受试者施用一剂本发明的疫苗组合物。疫苗组合物是本文所讨论的疫苗组合物中的任一种。在多个实施方案中，免疫反应是保护性免疫反应。在多个实施方案中，剂量是预防有效或治疗有效剂量。
在多个实施方案中，疫苗组合物静脉内或鞘内、皮下、肌肉内、皮内或鼻内施用。在多个实施方案中，疫苗组合物鼻内施用。在多个实施方案中，疫苗组合物经由鼻用滴剂或鼻用喷雾施用。
多个实施方案提供了一种引发受试者中免疫反应的方法，其包括：向受试者施用一剂本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒。修饰的SARS-CoV-2冠状病毒是本文所讨论的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒中的任一种。在多个实施方案中，免疫反应是保护性免疫反应。在多个实施方案中，剂量是预防有效或治疗有效剂量。
在多个实施方案中，剂量为约103-107PFU。在多个实施方案中，剂量为约104-106PFU。在多个实施方案中，剂量为约103PFU。在多个实施方案中，剂量为约104PFU。在多个实施方案中，剂量为约105PFU。在多个实施方案中，剂量为约106PFU。在多个实施方案中，剂量为约107PFU。
在多个实施方案中，剂量为约5×103PFU。在多个实施方案中，剂量为约5×104PFU。在多个实施方案中，剂量为约5×105PFU。在多个实施方案中，剂量为约5×106PFU。在多个实施方案中，剂量为约5×107PFU。
在多个实施方案中，修饰的SARS-CoV-2冠状病毒静脉内或鞘内、皮下、肌肉内、皮内或鼻内施用。在多个实施方案中，修饰的SARS-CoV-2冠状病毒鼻内施用。在多个实施方案中，修饰的SARS-CoV-2冠状病毒经由鼻用滴剂或鼻用喷雾施用。
多个实施方案提供了一种引发受试者中免疫反应的方法，其包括：向受试者施用初始剂量的本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒；以及向受试者施用一个或多个加强剂量的本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒。修饰的SARS-CoV-2冠状病毒是本文所讨论的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒中的任一种。在多个实施方案中，剂量是预防有效或治疗有效剂量。
在多个实施方案中，初始剂量和/或一个或多个加强剂量的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒静脉内或鞘内、皮下、肌肉内、皮内或鼻内施用。在多个实施方案中，初始剂量和/或一个或多个加强剂量的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒鼻内施用。在多个实施方案中，初始剂量和/或一个或多个加强剂量的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒经由鼻用滴剂或鼻用喷雾施用。
多个实施方案提供了一种引发受试者中免疫反应的方法，其包括：向受试者施用初始剂量的本发明的免疫组合物；以及向受试者施用一个或多个加强剂量的本发明的免疫组合物。免疫组合物是本文所讨论的免疫组合物中的任一种。在多个实施方案中，剂量是预防有效或治疗有效剂量。
在多个实施方案中，初始剂量和/或一个或多个加强剂量的免疫组合物静脉内或鞘内、皮下、肌肉内、皮内或鼻内施用。在多个实施方案中，初始剂量和/或一个或多个加强剂量的免疫组合物鼻内施用。在多个实施方案中，初始剂量和/或一个或多个加强剂量的免疫组合物经由鼻用滴剂或鼻用喷雾施用。
多个实施方案提供了一种引发受试者中免疫反应的方法，其包括：向受试者施用初始剂量的本发明的疫苗组合物；以及向受试者施用一个或多个加强剂量的本发明的疫苗组合物。疫苗组合物是本文所讨论的疫苗组合物中的任一种。在多个实施方案中，剂量是预防有效或治疗有效剂量。
在多个实施方案中，初始剂量和/或一个或多个加强剂量的疫苗组合物静脉内或鞘内、皮下、肌肉内、皮内或鼻内施用。在多个实施方案中，初始剂量和/或一个或多个加强剂量的疫苗组合物鼻内施用。在多个实施方案中，初始剂量和/或一个或多个加强剂量的疫苗组合物经由鼻用滴剂或鼻用喷雾施用。
初始和加强剂量之间的时机可例如根据感染或疾病的阶段(例如，未感染、感染、感染后数天)和患者的健康状况而变化。在多个实施方案中，在初始剂量之后约2周施用一个或多个加强剂量。即，施用初始剂量并且此后约两周，施用加强剂量。在多个实施方案中，在初始剂量之后约4周施用一个或多个加强剂量。在多个实施方案中，在初始剂量之后约6周施用一个或多个加强剂量。在多个实施方案中，在初始剂量之后约8周施用一个或多个加强剂量。在多个实施方案中，在初始剂量之后约12周施用一个或多个加强剂量。在多个实施方案中，在初始剂量之后约1-12周施用一个或多个加强剂量。
在多个实施方案中，一个或多个加强剂量可以一种加强剂量形式给予。在其他实施方案中，一个或多个加强剂量可以加强剂量形式周期性地给予。例如，所述加强剂量可每季度、每4个月、每6个月、每年、每2年、每3年、每4年、每5年、每6年、每7年、每8年、每9年或每10年给予一次。
在多个实施方案中，初始剂量和加强剂量各自为约103-107PFU。在多个实施方案中，初始剂量和加强剂量各自为约104-106PFU。在多个实施方案中，初始剂量和加强剂量各自为约103PFU。在多个实施方案中，初始剂量和加强剂量各自为约104PFU。在多个实施方案中，初始剂量和加强剂量各自为约105PFU。在多个实施方案中，初始剂量和加强剂量各自为约106PFU。在多个实施方案中，剂量为约107PFU。
在多个实施方案中，初始剂量和加强剂量各自为约5×103PFU。在多个实施方案中，初始剂量和加强剂量各自为约5×104PFU。在多个实施方案中，初始剂量和加强剂量各自为约5×105PFU。在多个实施方案中，初始剂量和加强剂量各自为约5×106PFU。在多个实施方案中，初始剂量和加强剂量各自为约5×107PFU。
在多个实施方案中，初始剂量和加强剂量的剂量是相同的。
在多个实施方案中，剂量量可在初始剂量与加强剂量之间变化。作为非限制性实例，与加强剂量相比，初始剂量可含有更少的病毒拷贝。例如，初始剂量为约103PFU并且加强剂量为约104-106PFU，或初始剂量为约104并且加强剂量为约105-107PFU。
在多个实施方案中，其中周期性地施用加强剂量，后续加强剂量可低于第一加强剂量。
作为另一个非限制性实例，与加强剂量相比，初始剂量可含有更多病毒拷贝。
在多个实施方案中，免疫反应是保护性免疫反应。
在多个实施方案中，剂量是预防有效或治疗有效剂量。
在多个实施方案中，本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、本发明的免疫组合物或本发明的疫苗组合物的鼻内施用包括：指示受试者擤鼻涕并向后仰头；任选地，指示受试者改变头部的位置以避免组合物滴落在鼻子外部或喉咙下方；将约0.25mL(包含剂量)施用于每个鼻孔中；指示受试者轻轻地嗅；以及指示受试者在一段时间内不要擤鼻涕；例如约60分钟。
在一些实施方案中，受试者未服用任何免疫抑制药物。在多个实施方案中，受试者在施用本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、本发明的免疫组合物或本发明的疫苗组合物之前约180天、150天、120天、90天、75天、60天、45天、30天、15天或7天未服用任何免疫抑制药物。在多个实施方案中，受试者在施用本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、本发明的免疫组合物或本发明的疫苗组合物之后约1天、7天、14天、30天、45天、60天、75天、90天、120天、150天、180天、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月或24个月内不服用任何免疫抑制药物。
免疫抑制药物(包括但不限于以下：皮质类固醇(例如，泼尼松(prednisone)(Deltasone、Orasone)、布地奈德(budesonide)(Entocort EC)、泼尼松龙(prednisolone)(Millipred))、钙调神经磷酸酶抑制剂(例如，环孢素(cyclosporine)(Neoral、Sandimmune、SangCya)、他克莫司(tacrolimus)(Astagraf XL、Envarsus XR、Prograf)、雷帕霉素机制靶点(Mechanistic target of rapamycin；mTOR)抑制剂(例如，西罗莫司(sirolimus)(Rapamune)、依维莫司(everolimus)(Afinitor、Zortress))、肌苷单磷酸脱氢酶(IMDH)抑制剂(例如，硫唑嘌呤(azathioprine)(Azasan、Imuran)、来氟米特(leflunomide)(Arava)、霉酚酸酯(CellCept、Myfortic))、生物制剂(例如，阿巴西普(abatacept)(Orencia)、阿达木单抗(adalimumab)(Humira)、阿那白滞素(anakinra)(Kineret)、赛妥珠单抗(certolizumab)(Cimzia)、依那西普(etanercept)(Enbrel)、戈利木单抗(golimumab)(Simponi)、英利昔单抗(infliximab)(Remicade)、依克珠单抗(ixekizumab)(Taltz)、那他珠单抗(natalizumab)(Tysabri)、利妥昔单抗(rituximab)(Rituxan)、苏金单抗(secukinumab)(Cosentyx)、托珠单抗(tocilizumab)(Actemra)、乌司奴单抗(ustekinumab)(Stelara)、维多珠单抗(vedolizumab)(Entyvio))、单克隆抗体(例如，巴利昔单抗(basiliximab)(Simulect)、达利珠单抗(daclizumab)(Zinbryta)、莫罗莫那(muromonab)(Orthoclone OKT3)))。
医疗用途
本发明的多个实施方案提供了用于引发免疫反应的本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、本发明的疫苗组合物或本发明的免疫组合物，或提供了COVID-19的治疗性或预防性治疗。
本发明的多个实施方案提供了用于引发免疫反应的本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、本发明的疫苗组合物或本发明的免疫组合物，或提供了COVID-19的治疗性或预防性治疗，其中用途包括初始剂量的本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、或本发明的疫苗组合物、或本发明的免疫组合物，和一个或多个加强剂量的本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、或本发明的疫苗组合物、或本发明的免疫组合物。
本发明的多个实施方案提供了本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、本发明的疫苗组合物或本发明的免疫组合物的在制造用于引发免疫反应的药物中的用途；或提供了COVID-19的治疗性或预防性治疗。
本发明的多个实施方案提供了本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、本发明的疫苗组合物或本发明的免疫组合物在制造用于引发免疫反应的药物中的用途；或提供了COVID-19的治疗性或预防性治疗，其中药物包含初始剂量的本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、或本发明的疫苗组合物、或本发明的免疫组合物，和一个或多个加强剂量的本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、或本发明的疫苗组合物、或本发明的免疫组合物。
本发明的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒是本文所讨论的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒中的任一种。本发明的疫苗组合物是本文所讨论的疫苗组合物中的任一种。本发明的免疫组合物是本文所讨论的免疫组合物中的任一种。
在多个实施方案中，免疫反应是保护性免疫反应。
制备方法
多个实施方案提供了一种制备修饰的SARS-CoV-2冠状病毒的方法，其包括：获得编码亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种蛋白或其一个或多个片段的核苷酸序列；重新编码核苷酸序列以降低一种或多种蛋白或其一个或多个片段的蛋白质表达，以及将具有重新编码的核苷酸序列的核酸替换至亲本SARS-CoV-2冠状病毒基因组中以制备修饰的SARS-CoV-2冠状病毒基因组，其中重新编码的核苷酸序列的表达与亲本病毒相比是降低的。
在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是野生型(wt)病毒核酸。在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是天然分离株病毒核酸。在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是先前修饰的病毒核酸或先前减毒的病毒核酸。在多个实施方案中，亲本SARS-CoV-2冠状病毒是SARS-CoV-2变体。
在多个实施方案中，制备修饰的SARS-CoV-2冠状病毒基因组包括使用克隆宿主。
在多个实施方案中，制备修饰的SARS-CoV-2冠状病毒基因组包括使用BAC载体、使用重叠延伸PCR策略或基于长PCR的融合策略来构建感染性cDNA克隆。
在多个实施方案中，修饰的SARS-CoV-2冠状病毒基因组还包含一个或多个突变，所述突变包括缺失、取代和添加。一个或多个可以是1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50、51-60、61-70、71-80、81-90或91-100个突变。
在多个实施方案中，重新编码核苷酸序列以降低一种或多种蛋白质或其一个或多个片段的蛋白质表达是通过与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，减少密码子对偏好(CPB)；与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，减少密码子使用偏好；或与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，增加CpG或UpA二核苷酸的数目来实现的，如本文所讨论。
减毒病毒产生
本发明的多个实施方案提供了一种产生减毒的方法，其包括：用包含病毒基因组的载体转染细胞群；在细胞培养物中将细胞群传代至少一次；从细胞培养物收集上清液。
在多个实施方案中，方法还包括浓缩上清液。
在多个实施方案中，方法包括将细胞群传代2至15次；以及从细胞群的细胞培养物收集上清液。在多个实施方案中，方法包括将细胞群传代2至10次；以及从细胞群的细胞培养物收集上清液。在多个实施方案中，方法包括将细胞群传代2至7次；以及从细胞群的细胞培养物收集上清液。在多个实施方案中，方法包括将细胞群传代2至5次；以及从细胞群的细胞培养物收集上清液。在多个实施方案中，方法包括将细胞群传代2、3、4、5、6、7、8或10次；以及从细胞群的细胞培养物收集上清液。在多个实施方案中，从细胞培养物收集上清液是在细胞群的每次传代期间进行的。在其他实施方案中，从细胞培养物收集上清液是在细胞群的一次或多次传代期间进行的。例如，所述从细胞培养物收集上清液可每隔一次传代进行一次；每两次传代、每三次传代等进行一次。
药盒
本发明还涉及一种对受试者接种疫苗、引发免疫反应或引发受试者中保护性免疫反应的药盒。药盒适用于实践本发明的引发免疫反应或引发保护性免疫反应的方法。药盒是材料或组分的组合，包括本发明的组合物中的至少一种。因此，在一些实施方案中，药盒含有本发明的包括本文所讨论的修饰的SARS-CoV-2病毒中的任一种、本文所讨论的免疫组合物中的任一种或本文所讨论的疫苗组合物中的任一种的组合物。因此，在一些实施方案中，药盒含有组合单一剂量的组合物，其包括如本文所述的本发明的修饰的SARS-CoV-2病毒、免疫组合物或疫苗组合物；例如每个小瓶含有足够剂量的约103-107PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒，或更特别地，104-106PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒、104PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒、105PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒或106PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒；或更特别地，5×104-5×106PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒、5×104PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒、5×105PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒或5×106PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒。在多个实施方案中，药盒含有多个剂量的组合物，其包括如本文所述的本发明的修饰的SARS-CoV-2病毒、免疫组合物或疫苗组合物；例如，如果药盒含有10个剂量/小瓶，则每个小瓶含有约10×103-107PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒，或更特别地，10×104-106PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒、10×104PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒、10×105PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒或10×106PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒，或更特别地50×104-50×106PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒、50×104PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒、50×105PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒或50×106PFU的修饰的SARS-CoV-2病毒。
在本发明的药盒中配置的组分的确切性质取决于其预期目的。例如，一些实施方案出于对受试者接种疫苗的目的而配置、经配置用以引发免疫反应或用以引发受试者中保护性免疫反应。在一个实施方案中，药盒尤其出于预防性治疗哺乳动物受试者的目的而配置。在另一实施方案中，药盒尤其出于预防性治疗人受试者的目的而配置。在其他实施方案中，药盒被配置用于兽医应用，治疗诸如但不限于农畜、家畜和实验室动物的受试者。
药盒中可包括使用说明书。“使用说明书”通常包括有形表达，其描述在使用药盒的组分以实现所需结果时要采用的技术，诸如对受试者接种疫苗、引发免疫反应或引发受试者中保护性免疫反应。例如，对于经鼻施用，使用说明书可包括但不限于指示受试者擤鼻涕并向后仰头，指示受试者改变头部的位置以避免组合物滴落在鼻子外部或喉咙下方，指示将约0.25mL(包含剂量)施用于每个鼻孔中；指示受试者轻轻地嗅，和/或指示受试者在一段时间内不要擤鼻涕；例如约60分钟。其他说明书可包括指示受试者不服用任何免疫抑制药物。
任选地，药盒还含有其他有用组分，诸如稀释剂、缓冲液、药学上可接受的载剂、注射器、滴管、导管、涂药器、移液或测量工具、绷带材料或如本领域技术人员将容易识别的其他有用的用具。
可向医师提供药盒中组装的材料或组分，其以保持其可操作性和实用性的任何方便和合适的方式储存。例如，组分可呈溶解、脱水或冻干形式；其可在室温、冷藏温度或冷冻温度下提供。组分通常含于合适的封装材料中。如本文所采用，短语“封装材料”是指用于容纳药盒的内含物(诸如本发明组合物等)的一种或多种物理结构。封装材料通过已知方法构建，优选用以提供无菌、无污染物环境。药盒中所采用的封装材料是通常用于疫苗中的那些封装材料。如本文所使用，术语“封装”是指能够容纳个别药盒组分的合适的固体基质或材料，诸如玻璃、塑胶、纸、箔等。因此，例如，封装可以是用于含有合适量的本发明的组合物的玻璃小瓶，所述本发明的组合物含有如本文所述的本发明的修饰的SARS-CoV-2病毒、免疫组合物或疫苗组合物。封装材料通常具有外部标签，其指示药盒和/或其组分的内含物和/或目的。
序列
SEQ ID NO:2-限制性位点修饰的参考序列，被修饰以敲除BsaI和BsmBI位点；敲除现有BsaI：a17973g(Arg AGA至AGG)、c24106t(Asp GAC至GAT)；敲除现有BsmBI位点：c2197t(Asp GAC至GAT)、a9754g(Arg AGA至AGG)、g17331a(Glu GAG至GAA)。
Figure GDA0003924434880000561
Figure GDA0003924434880000571
Figure GDA0003924434880000581
Figure GDA0003924434880000591
Figure GDA0003924434880000601
Figure GDA0003924434880000611
Figure GDA0003924434880000621
Figure GDA0003924434880000631
Figure GDA0003924434880000641
Figure GDA0003924434880000651
Figure GDA0003924434880000661
Figure GDA0003924434880000671
Figure GDA0003924434880000681
Figure GDA0003924434880000691
SEQ ID NO:3-去优化SARS-CoV-2冠状病毒(Wuhan-CoV_101K)(参考BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019的去优化)。去优化区域：11294-12709、14641-15903(nsp12(例如，RNA依赖性RNA聚合酶“RdRP”)结构域)、21656-22306(刺突蛋白开始)、22505-23905(刺突蛋白中部)、24110-25381(刺突蛋白末端)。
Figure GDA0003924434880000701
Figure GDA0003924434880000711
Figure GDA0003924434880000721
Figure GDA0003924434880000731
Figure GDA0003924434880000741
Figure GDA0003924434880000751
Figure GDA0003924434880000761
Figure GDA0003924434880000771
Figure GDA0003924434880000781
Figure GDA0003924434880000791
Figure GDA0003924434880000801
Figure GDA0003924434880000811
Figure GDA0003924434880000821
Figure GDA0003924434880000831
SEQ ID NO:4(参考华盛顿分离株(GenBank：MN985325.1)的去优化，刺突蛋白中具有36个核苷酸缺失)。
Figure GDA0003924434880000841
Figure GDA0003924434880000851
Figure GDA0003924434880000861
Figure GDA0003924434880000871
Figure GDA0003924434880000881
Figure GDA0003924434880000891
Figure GDA0003924434880000901
Figure GDA0003924434880000911
Figure GDA0003924434880000921
在多个实施方案中，参考SEQ ID NO:4，突变发生在3009T至A(Ile至Lys)：[3009:3009]；9199C至T沉默：[9199:9199]；11524C至T沉默：[11524:11524]；16388G至A(Ser至Asn)：[16388:16388]；21846t至C(Ile至Thr)：[21846:21846]；22296g至A(Arg至His)：[22296:22296]；24201T至C(Val至Ala)：[24237:24237]；和/或actaattctcctcggcgggcacgtagtgtagctagt(SEQ ID NO:5)的36nt添加：[23594]。
SEQ ID NO:6(与USA/WA1/2020野生型刺突蛋白相比的重新编码的刺突蛋白)。
Figure GDA0003924434880000931
SEQ ID NO:7-(去优化SARS-CoV-2)；29853bp，弗林蛋白酶裂解位点被去除
Figure GDA0003924434880000941
Figure GDA0003924434880000951
Figure GDA0003924434880000961
Figure GDA0003924434880000971
Figure GDA0003924434880000981
Figure GDA0003924434880000991
实施例
提供以下实施例以更好地说明要求保护的发明而不应解释为限制本发明的范围。就提及特定材料而言，仅出于说明的目的并不旨在限制本发明。在不发挥创造性能力且不脱离本发明的范围的情况下，本领域技术人员可开发等效手段或反应物。
实施例1
重叠PCR
步骤1：PCR和凝胶纯化。引物和模板。从T7启动子开始
Figure GDA0003924434880001001
Figure GDA0003924434880001011
包括片段0中的pCMV
Figure GDA0003924434880001012
Figure GDA0003924434880001021
步骤2：重叠PCR
可能需要首先重叠4-5个片段-纯化产物-然后重叠以得到全长基因组。
步骤3：
选项1：作为重叠PCR产物直接用于体外转录/储存；
选项2：克隆至pCC1BAC载体中
为了将CoV基因组克隆至pCC1BAC载体中，使用#1883和1890作为正向和反向引物用于扩增片段0和片段19，以及在重叠之后进行最终扩增。使用NEB Golden gate组装与携带pCC1BAC的Bsa I进行组装。
Figure GDA0003924434880001022
通过Bsa I位点克隆至pGGA载体(来自Golden gate克隆试剂盒)中，然后通过BsaI位点克隆至pCC1BAC载体中
获自现有pCC1-CysS-CD质粒的pCC1BAC并且需要修饰-参见“pCC1BAC修饰”
步骤1：PCR和凝胶纯化
引物和模板-从T7启动子开始
Figure GDA0003924434880001031
Figure GDA0003924434880001041
Figure GDA0003924434880001051
包括有序片段0中的pCMV
Figure GDA0003924434880001052
步骤2：使用NEB Golden gate组装试剂盒将病毒基因组组装成4个大片段至pGGA中
片段0(或1)-4、5-9、10-14和15-19。
遵循NEB Golden gate组装试剂盒菜单
步骤3对来自pGGA克隆的PCR病毒片段进行下一步组装(也引入新的Bsa I位点)
步骤3.1：通过PCR和凝胶纯化(单独地)再引入Bsa I
Figure GDA0003924434880001053
Figure GDA0003924434880001061
步骤3.2：使用NEB Golden Gate组装试剂盒将4个大片段组装至pCC1BAC中
将所有片段直接组装至pCC1BAC载体中
步骤1：PCR和凝胶纯化
Figure GDA0003924434880001062
Figure GDA0003924434880001071
Figure GDA0003924434880001081
Figure GDA0003924434880001091
步骤2：遵循NEB Golden gate组装试剂盒菜单在pCC1BAC载体中组装全病毒基因组
NEBuilder HiFi DNA组装
步骤1：PCR和凝胶纯化。与实施例1相同。对于片段0和片段19，需要使用PCR和pCC1BAC的5'和3'端的替代引物。
对于pCC1BAC与病毒基因组之间的交叉
5'交叉点
Figure GDA0003924434880001092
3'交叉点
Figure GDA0003924434880001101
步骤2：遵循NEBuilder HiFi菜单进行组装
pCC1BAC载体的修饰。如果pCC1BAC获自pCC1-CysS-CD质粒，则是主链。其携带内部Bsa I和Bsm BI位点。这种修饰是为了去除这些位点。其还去除了2个Not I位点之间的区域和nt8104-8139(？)。
步骤1：PCR和凝胶纯化
Figure GDA0003924434880001102
Figure GDA0003924434880001111
*为了便于以下组装步骤，可使用1893代替1851或1852，使用1894代替1861。
步骤2：重叠PCR。对于这种方法-NEBuilder，使用替代引物。
实施例2
程序
RT-PCR
冠状病毒病毒株2019-nCoV/USA-WA1/2020(“WA1”)(BEI Resources NR-52281，批号70034262)在CDC的Vero(CCL81)上传代3次，并在BEI Resources的Vero E6上传代一次之后由BEI Resources分布。4次传代之后的全病毒基因组序列通过CDC测定并发现与其所衍生自的临床试样(Genbank登录号MN985325)相比，不含有核苷酸差异(Harcourt等人,2020)。在接受后，WA1在37℃下在含有2％FBS的DMEM中通过在Vero E6细胞上再传代两次来扩增。
根据标准方案，通过用Trizol试剂(Thermo Fisher)进行提取，将第6代WA1病毒用于纯化病毒基因组RNA。简言之，用等体积的Trizol提取滴度为1×10^7PFU/ml的0.5ml病毒样品。程序先前已在完全灭活SARS-CoV2病毒感染性的四个单独实验中得到验证。在通过添加0.1ml氯仿进行相分离之后，用等体积的异丙醇沉淀水相中的RNA。将沉淀的RNA在70％乙醇中洗涤、干燥并重悬于20ul无RNA酶的水中。
病毒cDNA产生
使用SuperScript IV第一链合成系统来合成野生型cDNA。在每个反应中，如下设置总反应体积为13μl的1号试管：
1. 50μM寡核苷酸d(T)20：1ul
2. 50ng/μl随机六聚体：1μl
3. 10mM dNTP：1μl
4.WT RNA：2-10μl
5.H2O：添加至13μl
将样品混合并在65℃下孵育5分钟，然后立即置于冰上1分钟。
制备另一试管(2号试管)，总反应体积为7μl：
1. 5×缓冲液：4μl
2. 100mM DTT：1μl
3.RNA酶抑制剂(40U/μl)：1μl
4.SuperScript IV酶：1μl
将1号试管和2号试管混合，总反应体积为20μl，并且在23℃下孵育10分钟，随后在50℃下孵育50分钟，并且在80℃下孵育10分钟以产生cDNA。
重叠聚合酶链反应
Q5高保真2×主混合物(NEB，Ipswich，Massachusetts)用于从cDNA扩增基因组片段。
20μl反应含有1μl新鲜制备的cDNA、浓度为0.5μM的1μl正向和反向引物(详述于表4中)、10μl的2×Q5主混合物和H2O。反应参数如下：98℃30秒以开始反应，随后98℃持续10秒、60℃持续30秒和65℃持续1min，进行30个循环，并且最终在65℃下延伸持续5min。获得总计19个基因组片段，除片段19(约1.2Kb)以外，全部为约1.8Kb，使用特定引物来覆盖全病毒基因组，其中任两者之间具有200bp重叠区域(表4)。扩增子通过琼脂糖凝胶电泳(图2A)验证并使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。通过Nanodrop量化洗脱液。
Figure GDA0003924434880001132
高保真DNA聚合酶(NEB，Ipswich，Massachusetts)用于重构整个COVID-19基因组。
首先，所有19个基因组片段用于重叠反应中以重构全基因组。简言之，制备含有30-40ng的每个DNA片段(所有片段之间的摩尔比为1:1)、10μl 5×反应缓冲液、1μl 10mMdNTP、0.5μl Q5聚合酶和H2O至最终体积为50μl的混合物。反应在以下条件下进行：98℃持续30秒，并且72℃持续16分钟30秒，持续10个循环。
接下来，将2μl重叠反应产物与4μl 5×反应缓冲液、1μl 10mM dNTP、1μl 0.5μM的每个侧接引物、0.2μl Q5聚合酶和H2O混合至最终体积为20μl并且如下进行PCR：98℃30秒以开始反应，随后98℃持续10秒，60℃持续45秒，并且72℃持续16分钟30秒，进行15个循环，并且最终在65℃下延伸持续5min。为了检查结果，使5μl PCR产物在0.4％琼脂糖凝胶上可视化(图2B)。
表4
Figure GDA0003924434880001131
Figure GDA0003924434880001141
Figure GDA0003924434880001151
体外转录
在进行RNA操作之前，从全长PCR扩增的DNA模板使用常规苯酚/氯仿提取，随后在3M乙酸钠的存在下进行乙醇沉淀来进行纯化。根据制造商说明书，使用HiScribe T7转录试剂盒(New EnglandBiolabs)体外合成RNA转录物，进行一些修饰。通过添加500ng DNA模板和2.4μl 50mM GTP(cap类似物与GTP的比为1:1)来建立20μl反应。将反应在37℃下孵育3小时。然后将RNA沉淀并通过氯化锂沉淀来纯化并用70％乙醇洗涤一次。N基因DNA模板也使用特定正向引物(2320-N-F：GAAtaatacgactcactataggGACGTTCGTGT TGTTTTAGATTTCATCTAAACG(SEQ ID NO:162)，小写字母序列代表T7启动子；带下划线的序列代表N基因ORF的5'NTR上游)和反向引物(2130-N-R，tttttttttttttttttttttGTCATTCTCCTAAGAAGCTATTAAAATCACATGG(SEQ ID NO:163))从cDNA通过PCR来制备。
通过RNA电穿孔转染Vero E6细胞
Vero E6细胞获自ATTC(CRL-1586)，并维持在补充有10％ FBS的DMEM高葡萄糖中。为了转染病毒RNA，根据制造商说明书，使用Maxcyte ATX系统将10μg的纯化全长基因组RNA转录物与5ug的封端WA1-N mRNA一起电穿孔至Vero E6细胞中。简言之，将3-4×106个VeroE6细胞在Maxcyte电穿孔缓冲液中洗涤一次并重悬于100μl的相同缓冲液中。将细胞悬浮液与RNA样品轻轻混合，并且将RNA/细胞混合物转移至Maxcyte OC-100加工组装中。使用预定程序的Vero细胞电穿孔方案进行电穿孔。在37℃/5％ CO2下回收转染细胞30分钟之后，将细胞重悬于温DMEM/10％ FBS中并以各种接种密度(总细胞的1/2、1/3、1/6)分布于三个T25方瓶中。将转染细胞在37℃/5％ CO2下孵育6天或直至出现CPE。在第2天、第4天和第6天收集感染培养基，其中在第2天和第4天完全更换培养基(DMEM/5％ FBS)。早在转染后2天就可通过噬菌斑测定检测产生的病毒，在第4-6天之间产生病毒峰值。
Vero E6细胞中储备病毒的传代和SARS-CoV-2的噬菌斑滴定
在DMEM/2％ FBS中制备10倍连续稀释液。将0.5ml的每种稀释液添加至80％汇合度的Vero E6细胞的12孔中。在37℃下孵育1小时之后，去除接种物，并且每孔添加2ml的半固体覆盖层，其含有1×DMEM、0.3％黄蓍胶、2％ FBS和1×青霉素/链霉素。在37℃/5％CO2下孵育3或4天之后，去除覆盖层，将孔用PBS轻轻冲洗，随后固定并用结晶紫染色。
获自体外转录的RNA用于用野生型WA1和CDX-005转染Vero E6细胞并回收Vero E6细胞中滴定的活病毒。在孵育3天之后，对噬菌斑测定进行染色。
多步病毒生长动力学
Vero细胞(WHO 10-87)在含有含5％胎牛血清(FBS)的1ml DMEM的12孔板中生长3天直至其达到接近汇合。在感染之前，用含有1％ FBS和30PFU的指示病毒(0.0001MOI)的0.5ml新鲜DMEM替换废细胞培养基。在33℃或37℃/5％ CO2下孵育1小时之后，丢弃接种物，用1ml达尔伯克氏(Dulbecco's)PBS洗涤细胞单层一次，随后添加1ml含有1％ FBS的DMEM。将感染细胞在33℃或37℃下孵育0、6、24、48或72小时。在指示时间点处，收集细胞和上清液(每个时间点一个孔)，在-80C下冷冻一次并解冻。通过在37℃下在Vero E6上进行噬菌斑测定来测定裂解物中的感染性病毒滴度。
结果
个别基因组片段1-19的产生和通过重叠PCR产生的全基因组DNA进展顺利良好，在0.4％琼脂糖凝胶上可见清晰的条带(图2A)。
体外转录产生的RNA用于用S-WWW(WT)和S-WWD转染Vero E6细胞并回收在Vero E6细胞中滴定的活病毒。在孵育3天之后，对噬菌斑测定进行染色并观察到在部分刺突蛋白去优化S-WWD候选株(图3)中所观察到的较小的噬菌斑，并且最终滴度降低40％。
实施例3
CDX-005主病毒种原(preMVS)的开发如下：从感染的、表征的Vero E6细胞(ATCCCRL-1586批号70010177)提取SARS-COV-2BetaCoV/USA/WA1/2020(GenBank：MN985325.1)的RNA并使用可商购获得的试剂和试剂盒通过RT-PCR转化为19个重叠DNA片段。重叠PCR用于将19个1.8kb野生型基因组片段与一个去优化刺突蛋白基因盒缝合在一起。具体地说，Spike ORF的1,272个核苷酸是从基因组位置24115-25387去优化的人密码子对，相对于亲本WA1/2020病毒，导致283个沉默突变变化。将所得全长cDNA体外转录以制备全长病毒RNA。在石溪大学(Stony Brook University；NY)的新的BSL-3实验室中进行病毒回收，所述实验室于2020年4月首次投入使用，其中项目是实验室中唯一进行的项目。然后在表征的VeroE6细胞(批号70010177)中电穿孔这种病毒RNA。这产生CDX-005病毒(图3)，随后在Vero E6细胞上再传代一次以得到第1代P1(批号1-060820-9-1)。P1材料用于下文所描述的仓鼠研究中。
实施例4
为了产生适于进入GMP的种子病毒(preMVS)，P1批次在表征的10-87WHO Vero细胞(批号：563173-MCB1，COA和表征测试)中在Codagenix传代，所述细胞补充有来源于新西兰(New Zealand)的合格2％胎牛血清(FBS)。所得病毒通过离心澄清，无菌过滤并填充至2ml冷冻小瓶中以得到滴度为5×105 2.6×106pfu/ml的preMVS(批号1-061720-1)。将preMVS送至BioReliance(Glasgow，UK)以在BSL3下进行无菌和支原体测试。此外，使产生1-061720-1的Vero培养物再生长两天至完全细胞病变效应，然后在美国宾夕法尼亚州马尔文市的查尔斯河实验室(Charles River Laboratories,Malvern,PA,USA)进行装瓶以进行全面的、基于分子的外源病毒测试，包括猿猴、人、猪和牛病毒(表5)。
表5.CDX-005preMVS的外源病毒测试面板。
Figure GDA0003924434880001181
原始种毒(Master Seed Virus；MSV)用作I期试验材料并且是cGMP制造的。CDX-005将在Vero(ATCC CCL-81)细胞系中产生，并且使用合格的方法进行测试并释放用于临床测试的产物。CDX-005的制剂目前在III期试验中用于其鼻内、减毒活流感疫苗，已经证明其提供稳定性和安全性。制造过程如下所示。
CDX-005的制造过程
Figure GDA0003924434880001182
Figure GDA0003924434880001191
实施例5A
WHO关于COVID-19建模的特设专家工作组得出结论，恒河猴和雪貂两者似乎复制轻度至中度人类疾病，但最新研究(Chan,Sia)表明，叙利亚金仓鼠可以是复制这种感染更严重肺部表现的更有用的模型。
为了探究CDX-005的体内特性，转向叙利亚金仓鼠。当前动物模型的近期调查指示，这些仓鼠最能重演人COVID-19疾病的特征。SARS-CoV-2在仓鼠肺中有效复制，从而引起鼻内感染之后严重的病理性病变。在SARS-CoV-2接种之后第2天和第5天，病毒抗原存在于鼻粘膜、支气管上皮和肺实变区域中，即在第7天已清除。临床体征包括呼吸急促、体重减轻、肺/呼吸道组织病理学变化、肠道受累、脾和淋巴萎缩以及病毒攻击一周内的细胞因子活化。感染仓鼠可感染圈养于同一笼子中的其他仓鼠，并且在攻击后第14天检测到中和抗体(Ab)。
本发明人评价了在BSL-3下仓鼠模型中的CDX-005P1(批号1-060820-9-1)相比于WT BetaCoV/USA/WA1/2020的减毒。此外，在疫苗接种后14天用WT的攻击将检查是否存在疫苗增强。
三十六只5-8周龄雄性仓鼠在第0天(每组12只)通过鼻内滴管给药0.05ml的标称剂量为5×104PFU/ml或5×103PFU/ml的野生型WA1/2020SARS-CoV-2或5×104PFU/ml CDX-005并且随后持续2、4、14和16天。终点包括每天两次笼侧观察，每天一次体重观察和每天两次温度观察直至第5天，然后每天一次直至第14天。将在给药后第2、4和6天通过qPCR和TCID50来测量鼻部洗液、肺组织、大脑和肾脏中的病毒负荷。右肺、右肾和右脑半球将在同一时间点固定进行组织病理学检查。在第14天，用CDX-005给药的其余3只动物将用5×104PFU/ml野生型WA1/2020攻击并将在第16天测量鼻部洗液、肺、大脑和肾脏病毒负荷以及相同器官的组织病理学。
表6.评价叙利亚金仓鼠中的CDX-005
评价叙利亚金仓鼠中的CDX-005
Figure GDA0003924434880001201
这项研究的测量接种后6天的体重减轻的初始数据示于图4中。与野生型相比，CDX-005似乎显著减毒。用标称剂量为5×104的CDX-005给药的仓鼠经历平均4.1％的体重增加，然而，用标称剂量为5×104和5×103的野生型SARS-CoV-2给药的仓鼠经历平均-2.5％的体重减轻。正在进行剂量的反向滴定以确定这项研究中递送的准确剂量。
假定仓鼠体重大约为0.1kg，将5×104的仓鼠疫苗剂量外推至70kg人将等效于3.5×107的剂量，所述剂量高于可能要测试的最大临床剂量。
此外，在疫苗接种后14天用WT的攻击检查是否存在疫苗增强。
最后，了解小样品大小；然而，大流行性的紧急性质以及BSL-3空间稀缺和这种明显减毒的证明应支持在健康低风险成人中测试CDX-005，所述成人即使感染野生型SARS-CoV-2，也通常具有无症状感染。
单一5.0×104PFU剂量的CDX-005在给药后16天对野生型攻击具有保护性。这种药理学剂量导致未分布至大脑或肾脏并且在组织病理学发现极少的情况下有限分布至肺。
由于COVID-19疾病与肺部、嗅觉和神经功能障碍相关，因此测量均质化肺、嗅球和大脑中的病毒负荷。通过qPCR测量的总病毒RNA接近或低于在接种CDX-005的仓鼠中接种后(PI)第2天和第4天在肺、嗅球和大脑中的检测极限。相比之下，在两个时间的所有三种组织中，在野生型WA1感染的仓鼠中检测到了病毒RNA(图6a-图6c)。为了测试是否存在感染性病毒，在PI第2、4和6天对肺匀浆进行TCID50测定(图6d)。截至第4天，在任一剂量下接种有CDX-005的动物的肺中的感染性病毒负荷相对于野生型WA1感染的动物低接近10,000倍(N＝3/组；独立样本的因子ANOVA为P<0.01)(图6d)。因此，CDX-005在体内相对于野生型WA1是高度减毒的。
为了评价CDX-005的安全性，在接种之后九天监测仓鼠的体重变化。接种有CDX-005的仓鼠在此期间经历体重增加，而在任一剂量下接种有野生型WA1的那些仓鼠经历体重减轻(图7a)。仅在PI第9天，野生型WA1处理的动物恢复至其起始体重(图7a)。混合模型ANOVA指示CDX-005与野生型WA1处理组之间的变化显著不同(P<0.001)。
还对肺、大脑和肾脏进行组织学检查。将福尔马林固定的石蜡切片用苏木精和伊红染色并且由盲法委员会认证的兽医病理学家进行光学显微评价(N＝3/组)。在0-5病理学评级量表上对多个参数进行评分。在施用野生型WA1或CDX-005的仓鼠的大脑和肾脏切片中未注意到变化。与在患有COVID-19的人的肺中发现的病理性细胞浸润一致，然而，在感染野生型WA1的仓鼠中发现肺泡和/或血管周或细支气管周混合细胞浸润、细支气管或支气管上皮坏死伴有中性粒细胞浸润至内腔中和血管周水肿偶尔伴有细支气管或支气管上皮增生(图7b-图7c)。相比之下，在接种CDX-005的仓鼠中，在PI第6天时，肺病理学受限于极少肺泡至轻度血管周或细支气管周混合细胞浸润(图7b-图7c)。
为了评估CDX-005作为疫苗的功效，测量了其诱导针对野生型WA1的Ab的能力。首先，进行ELISA以确定来自初试(空白)仓鼠和接种有野生型WA1或CDX-005的那些仓鼠的血清中针对SARS-CoV-2Spike S1的IgG滴度。与野生型WA1类似，CDX-005接种诱导强烈抗Spike S1 Ab反应(图8a)。然后在PI第16天通过噬菌斑减少中和滴度(PRNT)测试接种仓鼠的血清中针对野生型WA1病毒的中和Ab的存在。计算了血清稀释度至多1280倍的50％、80％和90％中和(抑制噬菌斑形成)(图8a)。所有接种CDX-005的仓鼠在类似于通过野生型WA1接种诱导的那些的水平下产生中和Ab滴度(图8b)。
最后，测量了攻击研究中CDX-005的功效。仓鼠鼻内(IN)接种单剂量的5×104PFUCDX-005，然后在PI第16天用5×104PFU野生型WA1进行IN攻击。在第18天(攻击后第2天)收获肺，并且通过qRT-PCR测量病毒负荷。与未接种的仓鼠相比，接种CDX-005的肺中攻击性野生型WA1病毒的病毒负荷减少了超过10,000倍，从而证明疫苗的功效(图8c)。尽管在攻击空白接种的仓鼠的大脑中检测到SARS-CoV-2病毒，但在CDX-005保护的动物中未检测到(图8c)。嗅球中的水平在两组中无统计学差异(图8c)。因此，CDX-005赋予保护作用并且没有在攻击后疫苗诱导的疾病增强的证据。还发现，在攻击后第2天，接种CDX-005的仓鼠中IgG Ab水平仍然较高(图8a)。
实施例5B
仓鼠研究
WHO关于COVID-19建模的特设专家工作组得出结论，恒河猴和雪貂两者似乎复制轻度至中度人类疾病，但最新研究表明，叙利亚金仓鼠可以是复制这种感染更严重肺部表现的更有用的模型。1-3因此，Codagenix当前评价在BSL-3下的仓鼠模型中的CDX-005P1(批号1-060820-9-1)相比于WA1的减毒。根据IIT研究机构IACUC批准的方案进行所有动物研究。
三十六只5-6周龄雄性叙利亚仓鼠(Charles Rivers)用于研究。为了攻击，仓鼠经由腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)进行麻醉并在第0天(12只/组)鼻内接种0.05ml的标称剂量为5×104PFU/ml或5×103PFU/ml的野生型WA1 SARS-CoV-2或5×104PFU/ml CDX-005。每天两次观察动物并且每天收集体重直至第8天，然后从第16天-第18天每天收集体重。在第16天，用5×104PFU/ml野生型WA1对三只接种CDX-005的动物进行鼻内攻击。接种有5×104PFU/ml(N＝3)或5×103PFU/ml(N＝3)的野生型WA1的六只初试仓鼠充当对照。将这些两组组合，因为两个接种剂量的滴度重叠。
体重
使用这些36只仓鼠和额外58只(一半雌性/一半雄性)5-6周龄叙利亚金仓鼠(Charles Rivers)来研究CDX-005和野生型WA1接种对仓鼠健康状况的影响，如通过体重减轻所评估。(目前正针对其他CDX-005和野生型WA1介导的效应对这些额外仓鼠进行评价)。每天称重总计四十份5×104PFU CDX-005、四十份5×104PFU野生型WA1和十二份5×103PFU野生型WA1，持续至多九天。每个组中的N随时间推移减小，因为在PI的不同天数为了其他终点而处死动物。对于5×104PFU CDX-005和5×104PFU野生型WA1的最小N为10并且对于5×103PFU野生型WA1为3。
组织收获
在接种后第2、4、6天，通过静脉内注射150mg/kg的Beuthanasia，对来自每个组的三只仓鼠和第18天来自第16天攻击的动物的三只仓鼠进行安乐死。收集左肺用于病毒负荷测定。为了测量病毒负荷，在第18天，在第16天攻击的动物中，使用组织均质机(Omni均质机)在含抗生素的DMEM中以10％w/v对肺进行均质化。尝试进行鼻腔洗涤，但在这些小动物中未成功获得可重复的洗液。
组织病理学
由盲法特许兽医病理学家进行组织病理学。肺、大脑和肾经福尔马林固定、脱水、包埋于石蜡中并用苏木精和伊红染色。由盲法委员会认证的兽医病理学家进行光学显微评价。每个组织根据多个病理参数进行分级并且切片评分为0＝正常，1＝极微，2＝轻度，3＝中度，4＝显著或5＝严重。所有组织的评价包括细胞浸润的评估。每个器官检查至少五个切片并对评分取平均值。
病毒负荷
通过qPCR和TCID50来测量所收获组织中的病毒负荷。为了测量病毒负荷，使用珠磨机均质机(Omni)在含抗生素的DMEM中以10％w/v对组织进行均质化。感染性病毒滴度通过50％组织培养感染剂量(TCID50)测定滴定Vero E6细胞上肺匀浆的10倍连续稀释液来测定并以log10 TCID50单位/ml表示。根据制造商方案，使用Quick-RNA病毒试剂盒(ZymoResearch)从100μl的大脑匀浆提取RNA。使用iTaq 1-步骤通用探针试剂盒(Bio-Rad)，使用以下PCR循环条件进行qRT-PCR：95℃下15s，60℃下15s和72℃下20s，进行40个循环。
抗体-噬菌斑减少中和滴度
将在PI第16天收集的仓鼠血清在56℃下热灭活30'。以1:5的初始稀释度开始，在96孔U底板中，以DMEM/1％ FBS进行50ul两倍连续稀释。将含大约30PFU的SARS-CoV-2Washington/1/2020的50ul DMEM/1％ FBS添加至血清稀释液中并混合，使中和孔中的最终体积达到100ul，并且总初始血清稀释度达到1:10。将稀释板在37℃/5％ CO2下孵育一小时。
去除含有Vero E6细胞的汇合单层的24孔板上的细胞生长培养基(前一天接种在DMEM/5％ FBS中)，并且添加150ul新鲜DMEM/1％ FBS，随后添加100ul的每个中和反应。在37℃/5％ CO2下吸附病毒一小时之后，将0.75ml半固体覆盖层添加至24孔板中，最终浓度为1X DMEM、1.75％ FBS、0.3％黄蓍胶、1×青霉素+链霉素，总体积为1ml。将24孔板在37℃下孵育48小时以允许噬菌斑形成。通过固定并用含1％结晶紫的50％甲醇/4％甲醛染色细胞单层来使噬菌斑可视化。将噬菌斑减少中和滴度(PRNT)50、80、90确定为最后血清稀释度的倒数，相对于未中和孔(含有初试仓鼠血清)中的噬菌斑数目，所述血清稀释度将噬菌斑数目减少了预定截止值(50％、80％、90％)。指定在最低稀释度(1:10)下未能中和的血清的滴度为5，并且指定在最高测试血清稀释度(1:1280)下中和的血清的滴度≥1280。
抗体-IgG ELISA
在4℃下，在50ng/ml BSA/0.05M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH 9.6中用SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike S1-His(Sino Biological)以30ng/孔涂覆九十六孔板过夜。将培养板在37℃下用含10％山羊血清的PBS封闭2小时，用洗涤缓冲液(含0.1％ Tween 20的PBS)洗涤四次，然后用连续稀释血清(1:10起始稀释度并且之后为两倍)在含10％山羊血清/0.05％ Tween-20的PBS中孵育并在37℃下孵育1小时。将培养板用洗涤缓冲液洗涤四次，然后在37℃下用1:10,000辣根过氧化物酶(HRP)缀合的亲和力纯山羊抗叙利亚仓鼠IgG(H&L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)孵育1小时。在孵育之后，将培养板用洗涤缓冲液洗涤四次并添加Thermo Scientific OPD(邻苯二胺二盐酸盐)进行比色反应。在25℃下在黑暗中孵育10min之后，通过添加50ml 2.5M硫酸溶液来停止反应并在酶标仪上于490nm下读取所得吸光度。报告不同组中的相对IgG水平并将其作为OPD比色反应产物的强度达到高于背景(无血清)对照强度五倍时的稀释度的对数进行比较。
实施例6
CDX-005特征
CDX-005含有283个并且CDX-007含有149个与野生型WA1病毒相关的刺突蛋白基因中的沉默突变。将所得全长野生型WA1和去优化cDNA体外转录以制备电穿孔至Vero E6细胞中的全长病毒RNA。将转染细胞孵育6天或直至出现CPE。在第2、4和6天收集感染培养基。通过Vero E6细胞上的噬菌斑测定确定病毒滴度。早在转染后第2天就可见噬菌斑，在第4-6天产生病毒峰值。尽管由CDX-005和CDX-007形成的噬菌斑小于野生型，但两者在Vero E6细胞中稳固生长，表明其适用于大规模制造。因此，与其他SAVE疫苗一样，能够快速产生具有不同减毒程度的多种疫苗候选株。
由于CDX-005比CDX-007更去优化且更减毒，但稳固生长足以大规模生产，以使体内安全性最大化，因此选择其用于进一步研究。在CDX-005中，针对人细胞对Spike ORF的1,272个核苷酸进行密码子对去优化，从而产生283个沉默突变。从刺突蛋白去除多碱基弗林蛋白酶裂解位点以增加减毒和安全性。
在GMP表征的无动物源(AOF)Vero(WHO-10-87)细胞中进行CDX-005的生长优化研究，使得可在2020年第4季度开始大规模疫苗生产。在33℃下生长导致CDX-005和野生型WA1两者的滴度均高于在观察细胞病变效应(CPE)之前在37℃下病毒峰值的滴度，其中80％-90％的病毒在峰值处是与细胞相关的。尽管动力学不同，但可在0.01MOI和0.0001MOI下实现类似病毒滴度。
还探究了病毒收获的最佳条件。Vero WHO 10-87细胞在37℃/5％CO2下于含5％胎牛血清(FBS)的DMEM中生长。在33℃的培养物中用CDX-005感染后48h，使用描述于图11中的方案收获细胞和上清液。
数据显示，在33℃下0.01MOI感染之后48小时，大部分CDX-005是细胞相关的(约80％-90％)，但从Vero细胞回收病毒是直接的。低渗裂解是收获CDX-005的有效手段，并且宽裂解窗表明这种方法将在其中一些灵活性可能是有益的规模化批量中是可行的。
冷冻/解冻裂解也是有效的并且FBS没有必要也没有益处。这都是合乎需要的，因为在感染期间FBS可能导致Vero细胞过度生长，降低病毒产率，而FDA偏好无血清生产。另外值得注意的是，当在普通DMEM中冷冻时CDX-005似乎是稳定的，因为FBS至少在两个冷冻/解冻循环之后几乎没有或没有提供稳定性。因此，在最佳收集时机的情况下，无论是否在33℃或37℃下生长，通常观察到2-3×107PFU/ml的CDX-005的粗本体滴度，或约106PFU/cm2生长表面积。
基于这些研究，目前通过在33℃下以0.01MOI接种Vero(WHO-10-87)细胞来使CDX-005生长。已经选择并测试了含5％蔗糖和5％甘氨酸的DMEM的疫苗制剂以用于在英国的首次人体研究。在这种制剂中，CDX-005在-80℃下稳定至少三个冷冻-解冻循环和一个月(迄今为止最长测试储存持续时间)。
最后，作为评估CDX-005的基因组稳定性的第一步，对病毒于Vero(WHO 10-87)细胞上繁殖之后的第1-6代病毒进行测序。数据指示病毒极其稳定。第6代的测序揭露无亚群。已生长且收获九代且目前对第9代进行测序。将通过开始此处所描述的操作来完成第10代的收获和测序。
实施例7
通过血清IgG抗体ELISA和PRNT测定评估SARS-CoV-2(野生型WA1)和CDX-005的免疫原性。
Th1/Th2：SARS-CoV-2特异性T细胞在感染个体中相对较早地存在并随时间推移而增加。尽管检测到Th2和Th17细胞因子，但最强T细胞反应似乎是针对刺突蛋白(S)表面糖蛋白，并且SARS-CoV-2特异性T细胞主要产生效应子和Th1细胞介素。已经提出Th1和T细胞毒性淋巴球是受SARS-CoV-2影响最大的免疫细胞，并且提出T细胞反应和Th1/Th2平衡可部分决定COVID-19的严重程度。在通常抑制Th1反应的老年人中，可迫使免疫系统进入Th2反应以抵消病毒负荷，产生Th2反应的所有负面影响，从而严重加重临床表现。有趣的是，T细胞对SARS-CoV-2的反应在成人和儿童中也不同。发展出COVID-19的成人(而非儿童)显示出表达D相关抗原(DR)和血浆IL-12、IL-1β和CXCL9水平的活化CD4和CD8细胞的数目增加。这些表明与儿童相比，在感染成人中针对SARS-CoV-2的免疫反应具有显著的Th1极化。由于CDX-005是活病毒，其不同于其他疫苗类别可通过诱导T细胞反应来增强免疫反应，因此按照FDA指导研究Th1/Th2平衡尤为重要。
如由FDA所指定，将测量肺组织中Th1/Th2因子干扰素γ(IFNγ)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNFβ)、IL4、IL10和转化生长因子β(TGFβ)的mRNA水平。将使用已公布的仓鼠特异性引物和条件通过qPCR分析组织匀浆。将使用标准内部程序在Bioqual进行测定。
预计野生型WA1和CDX-005接种两者将诱导主要Th1反应，因为这些将是年轻的(但并非幼年动物)。预计与攻击相比，对初始接种的反应将有所不同并且那些差异可提供对由SARS-CoV-2产生的免疫反应性质的深刻理解。
实施例8
通过qPCR评估SARS-CoV-2(野生型WA1)和CDX-005对Th1/Th2平衡的影响
功效：将进行标准攻击研究以评估晚期传代CDX-005疫苗功效。接种有5×104PFUCDX-005或媒介物的仓鼠将在第27天用约1.0×105TCID50野生型WA1攻击。第27天是基于其他仓鼠研究和自有数据所选择的。将包括三只空白攻击的动物作为同期阴性对照，各自为三个时间点处的同期阴性对照，将在所述时间点处死受攻击的动物。同样，在攻击后第2天和第4天处死的选择是基于已公布的数据和自有数据。已在FDA的建议下纳入了一个较晚时间点，以更好地理解SARS-CoV-2诱导的免疫反应。仓鼠血清和组织的分析将包括使用与仅接受接种物的仓鼠相同的方案的相同分析。
预计晚期传代CDX-005接种将提供针对类似于早期传代病毒的攻击的保护作用。数据表明，CDX-005疫苗接种是高效的，使第2天qPCR肺滴度降低至少5,000倍。相对于早期传代CDX-005，晚期传代的功效丧失超过100倍或安全性的指标(即，生物分布、组织病理学或减毒)的显著差异将需要进一步检查。将通知FDA并与其一起决定下一步骤。
实施例9
作为将CDX-005转移到首次用于人体临床试验的前奏，检查了非人灵长类动物对疫苗的反应。已对十五只非洲绿猴进行鼻内接种，六只用106PFU野生型WA1，六只用106PFUCDX-005并且三只用达尔伯克氏PBS。发现显示，虽然在PI第4天接种野生型WA1和CDX-005的动物的灌洗液中的病毒滴度类似，但在野生型WA1中病毒滴度保持较高，但在接种CDX-005的猴中直线下降至不可检测。这些数据进一步展示了CDX-005作为SARS-CoV-2疫苗的潜力。
实施例10
评价COVI-VAC的安全性和免疫原性的健康年轻成人中的首次用于人体、随机、双盲、安慰剂对照、剂量递增研究
COVI-VAC是具有CDX-005的活减毒疫苗，用于预防COVID-19。减毒病毒携带283个设计的沉默突变，所述突变在编码病毒刺突蛋白的基因中具有人密码子对去优化核酸序列和刺突基因中弗林蛋白酶裂解位点的缺失。另外，其携带在Vero细胞的病毒回收过程期间所选择的2个沉默突变和5个非沉默突变。
主要研究目标是评估通过鼻滴剂施用的1或2个剂量为大约5×104、5×105和5×106噬菌斑形成单位(PFU)的COVI-VAC的安全性和耐受性。终点是：每个剂量之后14天的反应原性事件；第1天至第57天的不良事件(AE)；从第1天至第400天的就医AE(MAAE)、新发慢性病(NCI)、严重AE(SAE)。
次要研究目标是评估通过鼻滴剂施用的COVI-VAC的体液免疫原性。终点是：在第1、15、29、43、57、120、210和400天收集的血清中通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量的免疫球蛋白G(IgG)滴度；在第1、15、29、43、57、120、210和400天收集的血清中通过微量中和测定测量的中和抗体水平。
探索性目标和终点包括：
·测量在通过鼻滴剂施用的COVI-VAC之后疫苗病毒排出的程度和持续时间：如在鼻咽拭子样品中通过定量聚合酶链反应(qPCR)测定所评估的拷贝数/mL；第4/5天和第14/15天收集的粪便样品的培养结果；
·评估通过鼻滴剂施用的COVI-VAC的细胞免疫原性；评估通过鼻滴剂施用的COVI-VAC的粘膜免疫原性：在第1、8、29和36天收集的全杀灭病毒刺激的外周血单核细胞(PBMC)中通过干扰素γ(IFN-γ)酶联免疫吸附斑点测定(ELISpot)测量的斑点形成单位(SFU)/106个细胞；
·评估通过鼻滴剂施用的COVI-VAC的粘膜免疫原性：在第1、15、29、43和57天收集的鼻芯(nasal wick)样品中通过ELISA测量的免疫球蛋白A(IgA)滴度；
·在通过鼻滴剂施用的COVI-VAC之后，测量呼吸道疾病的发病率，包括由于SARS-CoV-2感染引起的发病率：多重PCR呼吸面板(包括SARS-CoV-2)的结果；具有呼吸道MAAE的受试者中的多重PCR呼吸面板(包括SARS-CoV-2)的结果；以及
·评估疫苗病毒的遗传稳定性：鼻咽拭子样品的疫苗病毒的序列分析
这项研究是评价18至30岁的健康成人中COVI-VAC的安全性和免疫原性的1期、随机、双盲、安慰剂对照、剂量递增临床试验。将使用现场通用筛选方法对潜在受试者进行筛选，并且通过这项筛选的个体将在给药前1至2天(第-2/-1天)进入检疫单位并提供知情同意书。然后在第1天随机分组之前，将针对这项研究的适用性对其进行筛选。满足所有研究纳入且无排除标准的大约48名受试者将入组3个递增剂量队列并以3:3:2比率在每个队列内随机分配以接受2剂如下表中所示的COVI-VAC/安慰剂(生理盐水)。
Figure GDA0003924434880001311
队列1将包括3名受试者的标记组(2名活性剂，1名安慰剂)。安全审查委员会(SRC)将在队列1中的其余受试者给药之前审查这些3名受试者直至第8天的盲法安全性数据。
除非受试者经历临床上显著症状或持续病毒感染的证据，或已由实验室单位告知检疫单位受试者正以高于风险管理计划(基于第14/42天鼻咽拭子样品)中记录的低传播风险的水平排出疫苗病毒，否则受试者将留在检疫单位直至第1次给药后14天(并且如果在住院环境中施用，则在第2次给药后)并且将在第15天(并且如果适用，则在第43天)出院。这些受试者将继续被限制在检疫单位中直至qPCR测定结果与低传播风险一致(样品将每天收集两次)。
SRC还将审查直至第15天的盲法安全性数据和直至至少第8天的盲法鼻咽拭子排出数据以确定受试者队列是否在第2次给药之后的14天内将被限制在检疫单位中或将在第29天出院并随后视为门诊患者。如果将受试者视为门诊患者，则SRC还将使用这些数据来决定受试者在第2次给药之后的第一周的哪2天将返回至单位进行就诊。如果将受试者视为住院患者，则SRC还将确定鼻咽拭子样品收集的频率(不超过每天两次)。
在COVI-VAC/安慰剂给药之后的14天内，每个受试者将每天在日记中记录反应原性(局部事件、全身性事件和温度)。
从签署知情同意书(ICF)至第57天，将记录所有AE和伴随药物。此后至研究结束(第400天)，仅将记录MAAE、NCI、SAE、免疫抑制药物、血液制品和疫苗。将在第1次给药之前和第8、36和57天收集用于安全性实验室测试(血液学、生物化学、凝血、尿分析)的样品。将在第2/1天进行全面身体检查并将在第1天和第29天给药前；每次给药之后2小时；在检疫单位时的第2/30、4/32、8/36和15/43天和给药期的每次门诊就诊时进行靶向和症状驱动的身体检查。将在第1天和第29天给药前；每次给药之后2小时；在检疫单位时的第2/30、4/32、8/36和15/43天；和给药期的每次门诊就诊时测量峰值呼气流量(PEF)和生命体征(包括氧饱和度)。将在第1次给药之前和第2、8和57天进行心电图(ECG)。将在第1次给药之后的14至22天(在第15天与第22天之间)进行胸部X射线。
在第1和29天和第15、43、57、120、210和400天给药前，将从每个受试者收集血清样品以用于评价由ELISA测量的IgG滴度和由微量中和测量的中和抗体水平。将在第1和29天和第8和36天给药前从每个受试者收集全血样品并进行处理以分离PBMC，以供通过IFN-γELISpot评价T细胞反应。
在检疫单位(除仅第1天给药后以外，仅第29天给药前，如果受试者在门诊基础上允许第2次给药，并且仅在第15/43天收集1个样品)和在如第2次给药之后确定的门诊就诊时将从每个受试者每天两次收集鼻咽拭子样品(第2次给药之后可降低频率)，以测量疫苗病毒的浓度，用于通过qPCR测定评估排出。一旦获得个别受试者的阴性结果，则可不再测试受试者的后续样品。将保留具有疫苗病毒排出证据的样品以供潜在病毒测序。将在第4或5天和第14或15天收集来自粪便的拭子样品以测量疫苗病毒滴度。
将在第1和29天和第15、43和57天给药前从每个受试者收集鼻芯样品以通过ELISA测量IgA，用于评价粘膜免疫反应。
如果受试者经历与病毒性呼吸道感染相符的急性症状，则将收集鼻咽拭子样品用于多重PCR呼吸面板(包括SARS-CoV-2)。
将保留对SARS-CoV-2呈阳性的任何样品用于分析以确定其是野生型SARS-CoV-2还是疫苗病毒。
每个受试者将参与研究大约13个月，包括筛选期。研究结束定义为参与研究的最后一名受试者的最后一次就诊日期。研究进行的预期持续时间为大约17个月，假设入组受试者4个月。
COVI-VAC通过鼻滴剂施用，至多2剂，间隔28天。SARS-CoV-2的最小感染剂量是未知的，但动物模型在104至106PFU的剂量下产生可重复的感染。在叙利亚仓鼠模型中耐受良好的COVI-VAC剂量的基于体重的外推使得在70kg人中为大约3.5×107PFU的剂量。这项研究所选择的剂量水平很可能耐受良好并且足以评价COVI-VAC的活性。
分析
安全性：第1天至第57天具有AE(包括MAAE、NCI和SAE)的受试者数目(百分比)将针对每个监管活动医学字典(MedDRA)系统器官类别和优选术语以及按组进行汇总。第1天至第400天具有MAAE、具有NCI和具有SAE的受试者数目(百分比)将以类似方式汇总。还将汇总根据严重程度和与临床试验用药(IMP)的关系而具有AE的受试者数目(百分比)。将提供AE、MAAE、NCI和SAE的清单。在每个剂量之后具有局部和反应原性全身性事件的受试者数目(百分比)将按组进行汇总。反应原性事件也将根据严重程度进行汇总。
连续参数(安全性实验室测试、PEF和生命体征)的汇总统计量将按组呈现如下：给药前、给药后和给药前至给药后评估的变化。在研究疫苗接种之后，具有疫苗接种后安全性实验室值或生命体征值记录为新异常(即，毒性等级相对于基线值增加并且严重程度等级为中度或更高的事件)的受试者数目和百分比将被制成表格。将制备根据严重程度等级将每个受试者的给药前和给药后安全性实验室值交叉制表的移位表。
将呈现针对身体检查、ECG和胸部X射线的具有正常、非临床上显著异常和临床上显著异常解释的受试者数目和百分比的汇总。
免疫原性：用于评估对COVI-VAC的体液免疫反应的所关注的主要变量是IgG滴度和中和抗体水平。以下指标及其95％ CI将按组汇总：
·基线和第15、29、43、57、120、210和400天的几何平均值
·第15、29、43、57、120、210和400天的应答速率
细胞和粘膜免疫反应数据将在相关样品收集时间点以相同方式汇总。
排出：将通过计数和根据时间点的阳性百分比以及中位值汇总鼻咽和粪便拭子样品的疫苗病毒排出数据。对于鼻咽拭子结果，将按组呈现疫苗病毒排出的中值、四分位距、最小和最大持续时间。
呼吸道病毒发病率：将列出有症状受试者和相关症状的多重PCR呼吸面板(包括SARS-CoV-2)结果。
Figure GDA0003924434880001351
Figure GDA0003924434880001361
Figure GDA0003924434880001371
Figure GDA0003924434880001381
评估
安全性
安全性的评价是这项研究的主要目标。安全性评估是早期临床试验的标准并且符合FDA关于预防性疫苗临床试验的指南[FDA 2007]。另外，由于野生型感染中可见炎性后遗症和高凝状态，因此安全性实验室研究还将包括C反应蛋白、IL-6和TNF、d-二聚体和高灵敏度肌钙蛋白-T。
生命体征评估将包括脉搏血氧饱和度，并且还将记录峰值流量以评估亚临床呼吸道损伤。
另外，在第一次给药CodaVax-COVID/安慰剂之后的2至3周将进行胸部X射线以监测受试者的亚临床肺部炎症。显现胸部成像在COVID-19的早期检测中的效用的证据。在意大利当地严格检疫之后，立即对无症状个体和COVID-19的临床疑似度低的有症状个体进行胸部X射线筛选，显示异常发现率很高。在评价患有SARS-COV-2的无症状个体中阳性胸部成像发现的比例的近期临床研究综合分析中，作者得出结论，无症状病例可具有阳性胸部成像并且有必要对具有放射性发现的无症状个体进行密切临床监测，因为其中相当大百分比出现症状。
免疫原性
结合和中和血清抗体是最频繁评估的疫苗生物标志物，但细胞和粘膜免疫可在预防感染和疾病以及降低持续传播的风险中起重要作用和同等或甚至更重要的作用。在这项研究中，血清结合和中和抗体将测量为次要终点并且如通过IFN-γELISpot所测量的粘膜IgA和T细胞反应作为探索性终点。
排出
仓鼠研究的结果指示疫苗病毒的携带将是短暂的。将获得鼻咽拭子样品用于qPCR以确定载体在施用部位持续多长时间。迄今为止公开的数据指示，胃肠道排出比上呼吸道排出开始较晚且持续较长，尽管其意义尚不明确。在这项研究中将收集直肠拭子样品用于噬菌斑测定以评价感染性病毒的胃肠道排出。
受试者群体
出于这项研究的目的，将纳入标准和排除标准设置如下。总体上施用于群体的实际标准可不同。除非权利要求中明确规定，否则这些纳入和排除标准不应解释为对权利要求的限制。
纳入标准
满足所有以下标准的受试者可包括在研究中：
1.在签署ICF当天，年龄在18至30岁(包含端点)之间的男性和女性
2.健康状况良好，无临床上显著医学病状的病史或当前证据，特别参考但不限于高血压、糖尿病、血栓栓塞病症、冠心病、慢性阻塞性肺病，并且无临床上显著测试异常，其将干扰如通过病史、身体检查、生命体征(包括氧饱和度)、ECG、肺活量测定法和如通过研究人员确定的安全实验室测试所定义的受试者安全性
3.总体重≥50kg和身体质量指数(BMI)≥18.0kg/m2且≤28.0kg/m2(在肌肉健康受试者的BMI可向上偏移的情况下，在研究人员判断下BMI的上限可升高至≤30kg/m2)
4.阴性滥用药物、可替宁和酒精筛选(除非由处方药物解释)
5.尚未以手术方式绝育的女性的阴性妊娠测试
6.阴性COVID清除测试
7.愿意遵守减轻疫苗病毒传播风险的条件(以下条件是最低标准，但如果公共卫生当局推荐更高的标准用于减轻SARS-CoV-2传播，则可能会增加)：
·意图防止研究药物的人际传播的卫生措施包括但不限于在每次IMP给药之后至少14天内用肥皂或手消毒剂频繁洗手、呼吸道卫生和咳嗽礼仪
·在每次IMP给药之后至少14天内，在公共区域中或与其他人接触时佩戴外科口罩
·在每次IMP给药之后至少14天内，将所有用于收集呼吸道分泌物的组织和材料密封于初级容器中并放置在儿童或动物无法接触到的次级容器内
·在每次IMP给药之后至少14天内不与易受攻击的个体密切接触。易受攻击的个体包括但不限于以下：
о≥65岁的人
о≤1岁的儿童
о疗养院的居民和工人
о患有诸如以下的严重慢性医学病状的任何年龄的人：
-慢性肺病(例如，重度哮喘、慢性阻塞性肺病)
-慢性心血管疾病(例如，心肌病、充血性心脏衰竭、心脏手术、缺血性心脏病、已知解剖缺陷)
-病态肥胖
-胰岛素依赖型或2型糖尿病
-在过去5年期间由于慢性代谢疾病(例如，肾功能不全、血红蛋白病)而进行的医疗随访或住院治疗
-免疫抑制
-癌症
-神经和神经发育性病状(例如，脑瘫、癫痫症、中风、癫痫发作)
о怀孕或试图怀孕的女性
о在COVID-19大流行期间定义为易受攻击的任何其他人
8.具有生育潜力的女性受试者必须使用一种高效的避孕形式。在最后一次IMP给药之后，避孕用途必须持续至少90天。高效避孕如下文所描述：
·已确立使用下文描述的激素避孕方法(在第1天之前≥14天)。当使用激素避孕方法时，男性伴侣必须使用具有杀精子剂的避孕套：
о与抑制排卵相关的组合(含有雌激素和孕激素)激素避孕：
-口服
-阴道内
-经皮
о与抑制排卵相关的仅孕激素的激素避孕：
-口服
-可注射
-可植入
·子宫内节育器
·子宫内激素释放系统
·双侧输卵管结扎
·男性绝育(具有精液中不存在精子的适当输精管结扎术后记录)，其中输精管结扎的男性是所述女性的唯一伴侣
·真正禁欲-禁欲仅在定义为在与研究治疗相关的整个风险期内避免异性性交时才视为非常有效的方法。需要关于临床试验的持续时间和受试者的优选和通常生活方式来评价禁欲的可靠性。
9.男性受试者必须同意以下避孕要求，并且在最后一次IMP给药之后至少90天内连续使用：
·使用具有杀精子剂的避孕套以防止女性伴侣怀孕或防止任何伴侣(男性和女性)暴露于IMP
·对男性进行绝育，其中适当的输精管结扎术后记录精液中不存在精子(请注意，将仍需要使用具有杀精子剂的避孕套以防止伴侣暴露)。这仅适用于参与研究的男性。
·另外，对于具有生育潜力的女性伴侣，所述伴侣必须使用另一避孕形式，诸如上文针对女性受试者所提及的高效方法中的一种。
·真正禁欲-禁欲仅在定义为在与研究治疗相关的整个风险期内避免异性性交时才视为非常有效的方法。需要关于临床试验的持续时间和受试者的优选和通常生活方式来评价禁欲的可靠性。
10.除以上避孕要求之外，男性受试者必须同意在最后一次IMP给药之后至少90天内不捐赠精子。
11.愿意在整个研究期间参与并遵守研究的所有方面，包括对研究单位的所有访视
12.提供书面知情同意书
排除标准
满足以下标准中的任一个的受试者将从研究排除：
1.血红蛋白A1c≥6.0％或42mmol/mol
2. 1秒内用力呼气量(FEV1)<80％预测值
3.在第1天起28天内暗示上呼吸道或下呼吸道感染的迹象和症状(包括发热或持续咳嗽)
4.怀孕、可能怀孕或哺乳期女性
5.已怀孕至晚期妊娠或在过去6个月内分娩的女性
6.在最后一次IMP给药之后90天内计划怀孕(受试者或伴侣)
7.重复静脉切开术的静脉通道不足
8.确诊或疑似SARS-CoV-2感染的病史
9.在接触之后14天内与任何随后确认感染SARS-CoV-2的受试者接触
10.用吸入剂治疗的喘息病史
11.曾经导致住院的呼吸道症状，包括喘息
12.已知支气管对病毒的高反应性
13.任何以实质性方式改变鼻或鼻咽的解剖结构的可干扰研究的目标的显著异常，并且尤其是鼻评估或病毒攻击中的任一种(可包括历史性鼻息肉，但排除引起当前和显著症状和/或最后一个月需要常规治疗的较大鼻息肉)
14.在第1天之前的最近3个月内流鼻血(大量鼻出血)的任何临床上显著病史或由于任何先前情况下流鼻血而住院的病史
15.在第1天之前的3个月内进行任何鼻腔或鼻窦手术
16.鼻腔手术或鼻腔烧灼术的病史
17.自身免疫或脱髓鞘疾病的病史
18.贝尔麻痹(Bell's palsy)的病史
19.过去10年的精神病、精神疾病住院、临床相关抑郁或自杀未遂的病史
20.癫痫(儿童高热惊厥除外)、痴呆或进行性神经疾病的病史
21.感染后或疫苗后神经后遗症的病史，包括格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome)
22.免疫反应严重的病史
23.如通过研究人员所评估，全身性过敏反应的病史或严重过敏反应的病史或对任何食物或药物的显著不耐受性
24.已知或疑似恶性肿瘤，除非黑素瘤皮肤癌和研究人员认为极不可能复发的其他早期手术切除的恶性肿瘤
25.免疫缺陷，包括在第1天之前的90天内使用皮质类固醇(包括鼻内类固醇)、烷基化药物、抗代谢物、辐射、免疫调节生物制剂或其他免疫调节疗法或计划在研究期间使用这些中的任一种(允许在皮肤上使用的轻度至中度效能的局部类固醇乳膏)
26.在第1天之前的30天内任何其他不稳定或需要更换药物的慢性医学病状
27.接受任何得到许可的或研究性冠状病毒疫苗或接种SARS-CoV-2
28.在第1天之前的12个月内接受≥3IMP
29.在第1天之前的90天或5个半衰期(以较长者为准)内参与呼吸道病毒的病毒攻击研究
30.在第1天之前的90天或5个半衰期(以较长者为准)内接受IMP
31.在第1天之前的90天内接受输血或血液制品或在研究期间计划使用
32.在第1天之前的90天内接受鼻内疫苗
33.在第1天之前的30天内接受任何疫苗、结核病皮肤测试或过敏抗原接种或计划接受直至第57天
34.在第1天之前的30天内接受鼻内类固醇或在第1天之前的7天内接受任何其他鼻内药物(包括非处方药物，但不包括生理盐水)
35.当前使用用于预防或治疗COVID-19的任何药物
36.计划住院或手术程序直至第57天
37.经常或当前使用鼻内违禁药物
38.酒精成瘾的病史或存在酒精成瘾或过度饮酒(每周摄入>28个单位酒精；1单位是半杯啤酒，一小杯葡萄酒或一定量的烈酒)
39.过度摄入含有黄嘌呤的物质(例如，每天摄入>5杯含咖啡因的饮料，例如，咖啡、茶、可乐)。
40.当前任何类型(例如，香烟、电子烟、大麻)的吸烟者
41.吸烟史≥5包/年或在第1天之前的最近30天内任意吸烟
42.在第-2天或第-1天入院之前的48小时内剧烈运动
43.在第1天之前的90天内献血≥470mL
44.如通过研究人员所确定的临床上显著ECG异常
45.HIV、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒或活性甲型肝炎病毒感染的阳性结果
46.在研究人员的判断下，任何医学、精神病学或社会状况或职业或其他职责将干扰或充当对方案依从性、安全性(包括反应原性)评估或受试者给予知情同意书的能力的禁忌
47.研究人员认为导致受试者将不能够应对检疫要求的任何原因
48.与研究相关的Codagenix、供应商或研究地点的雇员或雇员的直系亲属
未能满足纳入和排除标准的受试者可与试验委托者协商由研究人员酌情再次筛选，并且如果他们此后满足纳入和排除标准，则可参与研究。
暂时延迟标准
对于满足以下标准中的任一个的任何受试者，将延迟施用COVI-VAC/安慰剂：
1.在过去3天内流鼻血(鼻出血)
2.在过去3天内出现上呼吸道感染或发热(主观或客观)或不适的症状
可抑制IMP的正确施用或对日记数据的解释的任何症状迹象(例如，温度≥38℃、鼻充血、流鼻涕)
本发明的多个实施方案描述于上文具体实施方式中。尽管这些描述直接描述以上实施方案，但应理解，本领域技术人员可设想对本文所示出和描述的具体实施方案的修改和/或变化。在本说明书的范围内的任何此类修改或变化也旨在包括在其中。除非明确指出，否则本发明人的意图是本说明书和权利要求中的词语和短语被给予对适用领域中普通技术人员而言普通且习惯的含义。
已呈现本申请人在提交本申请时已知的本发明的多个实施方案的前述描述并且旨在出于说明和描述的目的。本说明书不旨在是详尽的或将本发明限制于所公开的精确形式，并且鉴于以上教导内容，许多修改和变化是可能的。所描述的实施方案用以解释本发明的原理及其实际应用，并且用以使本领域技术人员能够在多个实施方案中利用本发明并且各种修改适合于所涵盖的特定用途。因此，旨在本发明不受限于实行本发明所公开的特定实施方案。
尽管已经示出和描述了本发明的特定实施方案，但对本领域技术人员将显而易见的是，基于本文中的教导内容，可在不背离本发明及其更广泛方面的情况下作出变化和修改，并且因此，随附权利要求应在其范围内涵盖在本发明的真正精神和范围内的所有此类变化和修改。本领域技术人员应理解，一般而言，本文所使用的术语通常预期作为“开放式”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于(including but notlimited to)”，术语“具有”应解释为“具有至少”，术语“包括(includes)”应解释为“包括但不限于(includes but is not limited to)”等)。
如本文所使用，术语“包含(comprising/comprises)”在提及组合物、方法及其相应组分时使用，无论其是否是有用的，所述组合物、方法及其相应组分对实施方案而言是有用的，而对于包含未规定要素而言是开放的。本领域技术人员应理解，一般而言，本文所使用的术语通常预期作为“开放式”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“具有至少”，术语“包括”应解释为“包括但不限于”等)。尽管本文中使用开放式术语“包含”作为诸如包括、含有或具有的术语的同义词来描述和要求保护本发明，但本发明或其实施方案可替代地使用诸如“由……组成”或“基本上由……组成”的替代术语来描述。
序列表
<110> 科达金尼克斯有限公司(CODAGENIX INC.)
斯特芬·穆勒(MUELLER, Steffen)
约翰·罗伯特·科尔曼(COLEMAN, John Robert)
王颖(WANG, Ying)
杨晨(YANG, Chen)
<120> 去优化SARS-CoV-2及其方法和用途
<130> 064955-000015WO00
<150> 62/966,750
<151> 2020-01-28
<150> 63/048,942
<151> 2020-07-07
<150> 63/079,337
<151> 2020-09-16
<150> 63/079,853
<151> 2020-09-17
<160> 164
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29891
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120
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acgttcggat gctcgaactg cacctcatgg tcatgttatg gttgagctgg tagcagaact 540
cgaaggcatt cagtacggtc gtagtggtga gacacttggt gtccttgtcc ctcatgtggg 600
cgaaatacca gtggcttacc gcaaggttct tcttcgtaag aacggtaata aaggagctgg 660
tggccatagt tacggcgccg atctaaagtc atttgactta ggcgacgagc ttggcactga 720
tccttatgaa gattttcaag aaaactggaa cactaaacat agcagtggtg ttacccgtga 780
actcatgcgt gagcttaacg gaggggcata cactcgctat gtcgataaca acttctgtgg 840
ccctgatggc taccctcttg agtgcattaa agaccttcta gcacgtgctg gtaaagcttc 900
atgcactttg tccgaacaac tggactttat tgacactaag aggggtgtat actgctgccg 960
tgaacatgag catgaaattg cttggtacac ggaacgttct gaaaagagct atgaattgca 1020
gacacctttt gaaattaaat tggcaaagaa atttgacacc ttcaatgggg aatgtccaaa 1080
ttttgtattt cccttaaatt ccataatcaa gactattcaa ccaagggttg aaaagaaaaa 1140
gcttgatggc tttatgggta gaattcgatc tgtctatcca gttgcgtcac caaatgaatg 1200
caaccaaatg tgcctttcaa ctctcatgaa gtgtgatcat tgtggtgaaa cttcatggca 1260
gacgggcgat tttgttaaag ccacttgcga attttgtggc actgagaatt tgactaaaga 1320
aggtgccact acttgtggtt acttacccca aaatgctgtt gttaaaattt attgtccagc 1380
atgtcacaat tcagaagtag gacctgagca tagtcttgcc gaataccata atgaatctgg 1440
cttgaaaacc attcttcgta agggtggtcg cactattgcc tttggaggct gtgtgttctc 1500
ttatgttggt tgccataaca agtgtgccta ttgggttcca cgtgctagcg ctaacatagg 1560
ttgtaaccat acaggtgttg ttggagaagg ttccgaaggt cttaatgaca accttcttga 1620
aatactccaa aaagagaaag tcaacatcaa tattgttggt gactttaaac ttaatgaaga 1680
gatcgccatt attttggcat ctttttctgc ttccacaagt gcttttgtgg aaactgtgaa 1740
aggtttggat tataaagcat tcaaacaaat tgttgaatcc tgtggtaatt ttaaagttac 1800
aaaaggaaaa gctaaaaaag gtgcctggaa tattggtgaa cagaaatcaa tactgagtcc 1860
tctttatgca tttgcatcag aggctgctcg tgttgtacga tcaattttct cccgcactct 1920
tgaaactgct caaaattctg tgcgtgtttt acagaaggcc gctataacaa tactagatgg 1980
aatttcacag tattcactga gactcattga tgctatgatg ttcacatctg atttggctac 2040
taacaatcta gttgtaatgg cctacattac aggtggtgtt gttcagttga cttcgcagtg 2100
gctaactaac atctttggca ctgtttatga aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga 2160
agagaagttt aaggaaggtg tagagtttct tagagacggt tgggaaattg ttaaatttat 2220
ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa 2280
ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc 2340
tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca 2400
ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc 2460
tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt 2520
aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga 2580
agctgttgaa gctccattgg ttggtacacc agtttgtatt aacgggctta tgttgctcga 2640
aatcaaagac acagaaaagt actgtgccct tgcacctaat atgatggtaa caaacaatac 2700
cttcacactc aaaggcggtg caccaacaaa ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga 2760
agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt 2820
acttaatgag aagtgctctg cctatacagt tgaactcggt acagaagtaa atgagttcgc 2880
ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc 2940
actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg 3000
tgagtttaaa ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga 3060
agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga 3120
agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga 3180
agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga 3240
cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt 3300
agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt 3360
aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt 3420
aaaaccaaca gtggttgtta atgcagccaa tgtttacctt aaacatggag gaggtgttgc 3480
aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc 3540
tactaatgga ccacttaaag tgggtggtag ttgtgtttta agcggacaca atcttgctaa 3600
acactgtctt catgttgtcg gcccaaatgt taacaaaggt gaagacattc aacttcttaa 3660
gagtgcttat gaaaatttta atcagcacga agttctactt gcaccattat tatcagctgg 3720
tatttttggt gctgacccta tacattcttt aagagtttgt gtagatactg ttcgcacaaa 3780
tgtctactta gctgtctttg ataaaaatct ctatgacaaa cttgtttcaa gctttttgga 3840
aatgaagagt gaaaagcaag ttgaacaaaa gatcgctgag attcctaaag aggaagttaa 3900
gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat 3960
caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa 4020
cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag 4080
tgacattgac atcactttct taaagaaaga tgctccatat atagtgggtg atgttgttca 4140
agagggtgtt ttaactgctg tggttatacc tactaaaaag gctggtggca ctactgaaat 4200
gctagcgaaa gctttgagaa aagtgccaac agacaattat ataaccactt acccgggtca 4260
gggtttaaat ggttacactg tagaggaggc aaagacagtg cttaaaaagt gtaaaagtgc 4320
cttttacatt ctaccatcta ttatctctaa tgagaagcaa gaaattcttg gaactgtttc 4380
ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg 4440
tgtggaaact aaagccatag tttcaactat acagcgtaaa tataagggta ttaaaataca 4500
agagggtgtg gttgattatg gtgctagatt ttacttttac accagtaaaa caactgtagc 4560
gtcacttatc aacacactta acgatctaaa tgaaactctt gttacaatgc cacttggcta 4620
tgtaacacat ggcttaaatt tggaagaagc tgctcggtat atgagatctc tcaaagtgcc 4680
agctacagtt tctgtttctt cacctgatgc tgttacagcg tataatggtt atcttacttc 4740
ttcttctaaa acacctgaag aacattttat tgaaaccatc tcacttgctg gttcctataa 4800
agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga 4860
taaaagtgta tattacacta gtaatcctac cacattccac ctagatggtg aagttatcac 4920
ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac 4980
aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca 5040
acagtttggt ccaacttatt tggatggagc tgatgttact aaaataaaac ctcataattc 5100
acatgaaggt aaaacatttt atgttttacc taatgatgac actctacgtg ttgaggcttt 5160
tgagtactac cacacaactg atcctagttt tctgggtagg tacatgtcag cattaaatca 5220
cactaaaaag tggaaatacc cacaagttaa tggtttaact tctattaaat gggcagataa 5280
caactgttat cttgccactg cattgttaac actccaacaa atagagttga agtttaatcc 5340
acctgctcta caagatgctt attacagagc aagggctggt gaagctgcta acttttgtgc 5400
acttatctta gcctactgta ataagacagt aggtgagtta ggtgatgtta gagaaacaat 5460
gagttacttg tttcaacatg ccaatttaga ttcttgcaaa agagtcttga acgtggtgtg 5520
taaaacttgt ggacaacagc agacaaccct taagggtgta gaagctgtta tgtacatggg 5580
cacactttct tatgaacaat ttaagaaagg tgttcagata ccttgtacgt gtggtaaaca 5640
agctacaaaa tatctagtac aacaggagtc accttttgtt atgatgtcag caccacctgc 5700
tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca 5760
gtgtggtcac tataaacata taacttctaa agaaactttg tattgcatag acggtgcttt 5820
acttacaaag tcctcagaat acaaaggtcc tattacggat gttttctaca aagaaaacag 5880
ttacacaaca accataaaac cagttactta taaattggat ggtgttgttt gtacagaaat 5940
tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat 6000
tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg 6060
tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc 6120
aagagagctt aaagttacat ttttccctga cttaaatggt gatgtggtgg ctattgatta 6180
taaacactac acaccctctt ttaagaaagg agctaaattg ttacataaac ctattgtttg 6240
gcatgttaac aatgcaacta ataaagccac gtataaacca aatacctggt gtatacgttg 6300
tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga 6360
cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt 6420
ggaaaatcct accatacaga aagacgttct tgagtgtaat gtgaaaacta ccgaagttgt 6480
aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca 6540
cacagatcta atggctgctt atgtagacaa ttctagtctt actattaaga aacctaatga 6600
attatctaga gtattaggtt tgaaaaccct tgctactcat ggtttagctg ctgttaatag 6660
tgtcccttgg gatactatag ctaattatgc taagcctttt cttaacaaag ttgttagtac 6720
aactactaac atagttacac ggtgtttaaa ccgtgtttgt actaattata tgccttattt 6780
ctttacttta ttgctacaat tgtgtacttt tactagaagt acaaattcta gaattaaagc 6840
atctatgccg actactatag caaagaatac tgttaagagt gtcggtaaat tttgtctaga 6900
ggcttcattt aattatttga agtcacctaa tttttctaaa ctgataaata ttataatttg 6960
gtttttacta ttaagtgttt gcctaggttc tttaatctac tcaaccgctg ctttaggtgt 7020
tttaatgtct aatttaggca tgccttctta ctgtactggt tacagagaag gctatttgaa 7080
ctctactaat gtcactattg caacctactg tactggttct ataccttgta gtgtttgtct 7140
tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc 7200
atcttttaaa tgggatttaa ctgcttttgg cttagttgca gagtggtttt tggcatatat 7260
tcttttcact aggtttttct atgtacttgg attggctgca atcatgcaat tgtttttcag 7320
ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt 7380
acaaatggcc ccgatttcag ctatggttag aatgtacatc ttctttgcat cattttatta 7440
tgtatggaaa agttatgtgc atgttgtaga cggttgtaat tcatcaactt gtatgatgtg 7500
ttacaaacgt aatagagcaa caagagtcga atgtacaact attgttaatg gtgttagaag 7560
gtccttttat gtctatgcta atggaggtaa aggcttttgc aaactacaca attggaattg 7620
tgttaattgt gatacattct gtgctggtag tacatttatt agtgatgaag ttgcgagaga 7680
cttgtcacta cagtttaaaa gaccaataaa tcctactgac cagtcttctt acatcgttga 7740
tagtgttaca gtgaagaatg gttccatcca tctttacttt gataaagctg gtcaaaagac 7800
ttatgaaaga cattctctct ctcattttgt taacttagac aacctgagag ctaataacac 7860
taaaggttca ttgcctatta atgttatagt ttttgatggt aaatcaaaat gtgaagaatc 7920
atctgcaaaa tcagcgtctg tttactacag tcagcttatg tgtcaaccta tactgttact 7980
agatcaggca ttagtgtctg atgttggtga tagtgcggaa gttgcagtta aaatgtttga 8040
tgcttacgtt aatacgtttt catcaacttt taacgtacca atggaaaaac tcaaaacact 8100
agttgcaact gcagaagctg aacttgcaaa gaatgtgtcc ttagacaatg tcttatctac 8160
ttttatttca gcagctcggc aagggtttgt tgattcagat gtagaaacta aagatgttgt 8220
tgaatgtctt aaattgtcac atcaatctga catagaagtt actggcgata gttgtaataa 8280
ctatatgctc acctataaca aagttgaaaa catgacaccc cgtgaccttg gtgcttgtat 8340
tgactgtagt gcgcgtcata ttaatgcgca ggtagcaaaa agtcacaaca ttgctttgat 8400
atggaacgtt aaagatttca tgtcattgtc tgaacaacta cgaaaacaaa tacgtagtgc 8460
tgctaaaaag aataacttac cttttaagtt gacatgtgca actactagac aagttgttaa 8520
tgttgtaaca acaaagatag cacttaaggg tggtaaaatt gttaataatt ggttgaagca 8580
gttaattaaa gttacacttg tgttcctttt tgttgctgct attttctatt taataacacc 8640
tgttcatgtc atgtctaaac atactgactt ttcaagtgaa atcataggat acaaggctat 8700
tgatggtggt gtcactcgtg acatagcatc tacagatact tgttttgcta acaaacatgc 8760
tgattttgac acatggttta gccagcgtgg tggtagttat actaatgaca aagcttgccc 8820
attgattgct gcagtcataa caagagaagt gggttttgtc gtgcctggtt tgcctggcac 8880
gatattacgc acaactaatg gtgacttttt gcatttctta cctagagttt ttagtgcagt 8940
tggtaacatc tgttacacac catcaaaact tatagagtac actgactttg caacatcagc 9000
ttgtgttttg gctgctgaat gtacaatttt taaagatgct tctggtaagc cagtaccata 9060
ttgttatgat accaatgtac tagaaggttc tgttgcttat gaaagtttac gccctgacac 9120
acgttatgtg ctcatggatg gctctattat tcaatttcct aacacctacc ttgaaggttc 9180
tgttagagtg gtaacaactt ttgattctga gtactgtagg cacggcactt gtgaaagatc 9240
agaagctggt gtttgtgtat ctactagtgg tagatgggta cttaacaatg attattacag 9300
atctttacca ggagttttct gtggtgtaga tgctgtaaat ttacttacta atatgtttac 9360
accactaatt caacctattg gtgctttgga catatcagca tctatagtag ctggtggtat 9420
tgtagctatc gtagtaacat gccttgccta ctattttatg aggtttagaa gagcttttgg 9480
tgaatacagt catgtagttg cctttaatac tttactattc cttatgtcat tcactgtact 9540
ctgtttaaca ccagtttact cattcttacc tggtgtttat tctgttattt acttgtactt 9600
gacattttat cttactaatg atgtttcttt tttagcacat attcagtgga tggttatgtt 9660
cacaccttta gtacctttct ggataacaat tgcttatatc atttgtattt ccacaaagca 9720
tttctattgg ttctttagta attacctaaa gagacgtgta gtctttaatg gtgtttcctt 9780
tagtactttt gaagaagctg cgctgtgcac ctttttgtta aataaagaaa tgtatctaaa 9840
gttgcgtagt gatgtgctat tacctcttac gcaatataat agatacttag ctctttataa 9900
taagtacaag tattttagtg gagcaatgga tacaactagc tacagagaag ctgcttgttg 9960
tcatctcgca aaggctctca atgacttcag taactcaggt tctgatgttc tttaccaacc 10020
accacaaacc tctatcacct cagctgtttt gcagagtggt tttagaaaaa tggcattccc 10080
atctggtaaa gttgagggtt gtatggtaca agtaacttgt ggtacaacta cacttaacgg 10140
tctttggctt gatgacgtag tttactgtcc aagacatgtg atctgcacct ctgaagacat 10200
gcttaaccct aattatgaag atttactcat tcgtaagtct aatcataatt tcttggtaca 10260
ggctggtaat gttcaactca gggttattgg acattctatg caaaattgtg tacttaagct 10320
taaggttgat acagccaatc ctaagacacc taagtataag tttgttcgca ttcaaccagg 10380
acagactttt tcagtgttag cttgttacaa tggttcacca tctggtgttt accaatgtgc 10440
tatgaggccc aatttcacta ttaagggttc attccttaat ggttcatgtg gtagtgttgg 10500
ttttaacata gattatgact gtgtctcttt ttgttacatg caccatatgg aattaccaac 10560
tggagttcat gctggcacag acttagaagg taacttttat ggaccttttg ttgacaggca 10620
aacagcacaa gcagctggta cggacacaac tattacagtt aatgttttag cttggttgta 10680
cgctgctgtt ataaatggag acaggtggtt tctcaatcga tttaccacaa ctcttaatga 10740
ctttaacctt gtggctatga agtacaatta tgaacctcta acacaagacc atgttgacat 10800
actaggacct ctttctgctc aaactggaat tgccgtttta gatatgtgtg cttcattaaa 10860
agaattactg caaaatggta tgaatggacg taccatattg ggtagtgctt tattagaaga 10920
tgaatttaca ccttttgatg ttgttagaca atgctcaggt gttactttcc aaagtgcagt 10980
gaaaagaaca atcaagggta cacaccactg gttgttactc acaattttga cttcactttt 11040
agttttagtc cagagtactc aatggtcttt gttctttttt ttgtatgaaa atgccttttt 11100
accttttgct atgggtatta ttgctatgtc tgcttttgca atgatgtttg tcaaacataa 11160
gcatgcattt ctctgtttgt ttttgttacc ttctcttgcc actgtagctt attttaatat 11220
ggtctatatg cctgctagtt gggtgatgcg tattatgaca tggttggata tggttgatac 11280
tagtttgtct ggttttaagc taaaagactg tgttatgtat gcatcagctg tagtgttact 11340
aatccttatg acagcaagaa ctgtgtatga tgatggtgct aggagagtgt ggacacttat 11400
gaatgtcttg acactcgttt ataaagttta ttatggtaat gctttagatc aagccatttc 11460
catgtgggct cttataatct ctgttacttc taactactca ggtgtagtta caactgtcat 11520
gtttttggcc agaggtattg tttttatgtg tgttgagtat tgccctattt tcttcataac 11580
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ttacttagtt tctacacagg agtttagata tatgaattca cagggactac tcccacccaa 11760
gaatagcata gatgccttca aactcaacat taaattgttg ggtgttggtg gcaaaccttg 11820
tatcaaagta gccactgtac agtctaaaat gtcagatgta aagtgcacat cagtagtctt 11880
actctcagtt ttgcaacaac tcagagtaga atcatcatct aaattgtggg ctcaatgtgt 11940
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agaaatgctg gacaacaggg caaccttaca agctatagcc tcagagttta gttcccttcc 12120
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ttctgaagtt gttcttaaaa agttgaagaa gtctttgaat gtggctaaat ctgaatttga 12240
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gcttttcact atgcttagaa agttggataa tgatgcactc aacaacatta tcaacaatgc 12420
aagagatggt tgtgttccct tgaacataat acctcttaca acagcagcca aactaatggt 12480
tgtcatacca gactataaca catataaaaa tacgtgtgat ggtacaacat ttacttatgc 12540
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caacacaaca aagggaggta ggtttgtact tgcactgtta tccgatttac aggatttgaa 12840
atgggctaga ttccctaaga gtgatggaac tggtactatc tatacagaac tggaaccacc 12900
ttgtaggttt gttacagaca cacctaaagg tcctaaagtg aagtatttat actttattaa 12960
aggattaaac aacctaaata gaggtatggt acttggtagt ttagctgcca cagtacgtct 13020
acaagctggt aatgcaacag aagtgcctgc caattcaact gtattatctt tctgtgcttt 13080
tgctgtagat gctgctaaag cttacaaaga ttatctagct agtgggggac aaccaatcac 13140
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ccacatagat catccaaatc ctaaaggatt ttgtgactta aaaggtaagt atgtacaaat 13320
acctacaact tgtgctaatg accctgtggg ttttacactt aaaaacacag tctgtaccgt 13380
ctgcggtatg tggaaaggtt atggctgtag ttgtgatcaa ctccgcgaac ccatgcttca 13440
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ccgtgcggca caggcactag tactgatgtc gtatacaggg cttttgacat ctacaatgat 13560
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acattaaaag aaatacttgt cacatacaat tgttgtgatg atgattattt caataaaaag 13920
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ttaatgccta tattaacctt gaccagggct ttaactgcag agtcacatgt tgacactgac 14220
ttaacaaagc cttacattaa gtgggatttg ttaaaatatg acttcacgga agagaggtta 14280
aaactctttg accgttattt taaatattgg gatcagacat accacccaaa ttgtgttaac 14340
tgtttggatg acagatgcat tctgcattgt gcaaacttta atgttttatt ctctacagtg 14400
ttcccaccta caagttttgg accactagtg agaaaaatat ttgttgatgg tgttccattt 14460
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ttacatagct ctagacttag ttttaaggaa ttacttgtgt atgctgctga ccctgctatg 14580
cacgctgctt ctggtaatct attactagat aaacgcacta cgtgcttttc agtagctgca 14640
cttactaaca atgttgcttt tcaaactgtc aaacccggta attttaacaa agacttctat 14700
gactttgctg tgtctaaggg tttctttaag gaaggaagtt ctgttgaatt aaaacacttc 14760
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ccaacaatgt gtgatatcag acaactacta tttgtagttg aagttgttga taagtacttt 14880
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ttcaactcca ggcagcagta ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga 28920
tgctgctctt gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtctgg 28980
taaaggccaa caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcttctaa 29040
gaagcctcgg caaaaacgta ctgccactaa agcatacaat gtaacacaag ctttcggcag 29100
acgtggtcca gaacaaaccc aaggaaattt tggggaccag gaactaatca gacaaggaac 29160
tgattacaaa cattggccgc aaattgcaca atttgccccc agcgcttcag cgttcttcgg 29220
aatgtcgcgc attggcatgg aagtcacacc ttcgggaacg tggttgacct acacaggtgc 29280
catcaaattg gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc tgaataagca 29340
tattgacgca tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaagaaggc 29400
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gggaggactt gaaagagcca ccacattttc accgaggcca cgcggagtac gatcgagtgt 29760
acagtgaaca atgctaggga gagctgccta tatggaagag ccctaatgtg taaaattaat 29820
tttagtagtg ctatccccat gtgattttaa tagcttctta ggagaatgac aaaaaaaaaa 29880
aaaaaaaaaa a 29891
<210> 2
<211> 29891
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS CoV-2
<400> 2
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120
cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180
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gacacctttt gaaattaaat tggcaaagaa atttgacacc ttcaatgggg aatgtccaaa 1080
ttttgtattt cccttaaatt ccataatcaa gactattcaa ccaagggttg aaaagaaaaa 1140
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caaccaaatg tgcctttcaa ctctcatgaa gtgtgatcat tgtggtgaaa cttcatggca 1260
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aatactccaa aaagagaaag tcaacatcaa tattgttggt gactttaaac ttaatgaaga 1680
gatcgccatt attttggcat ctttttctgc ttccacaagt gcttttgtgg aaactgtgaa 1740
aggtttggat tataaagcat tcaaacaaat tgttgaatcc tgtggtaatt ttaaagttac 1800
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tgaaactgct caaaattctg tgcgtgtttt acagaaggcc gctataacaa tactagatgg 1980
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taacaatcta gttgtaatgg cctacattac aggtggtgtt gttcagttga cttcgcagtg 2100
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ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc 2940
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agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga 3180
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gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat 3960
caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa 4020
cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag 4080
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agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga 4860
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ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac 4980
aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca 5040
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tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca 5760
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tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat 6000
tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg 6060
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atctgcaaaa tcagcgtctg tttactacag tcagcttatg tgtcaaccta tactgttact 7980
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ggaagccaat atggatcaag aatcctttgg tggtgcatcg tgttgtctgt actgccgttg 13260
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ggattggcaa ctataaatta aacacagacc attccagtag cagtgacaat attgctttgc 27180
ttgtacagta agtgacaaca gatgtttcat ctcgttgact ttcaggttac tatagcagag 27240
atattactaa ttattatgag gacttttaaa gtttccattt ggaatcttga ttacatcata 27300
aacctcataa ttaaaaattt atctaagtca ctaactgaga ataaatattc tcaattagat 27360
gaagagcaac caatggagat tgattaaacg aacatgaaaa ttattctttt cttggcactg 27420
ataacactcg ctacttgtga gctttatcac taccaagagt gtgttagagg tacaacagta 27480
cttttaaaag aaccttgctc ttctggaaca tacgagggca attcaccatt tcatcctcta 27540
gctgataaca aatttgcact gacttgcttt agcactcaat ttgcttttgc ttgtcctgac 27600
ggcgtaaaac acgtctatca gttacgtgcc agatcagttt cacctaaact gttcatcaga 27660
caagaggaag ttcaagaact ttactctcca atttttctta ttgttgcggc aatagtgttt 27720
ataacacttt gcttcacact caaaagaaag acagaatgat tgaactttca ttaattgact 27780
tctatttgtg ctttttagcc tttctgctat tccttgtttt aattatgctt attatctttt 27840
ggttctcact tgaactgcaa gatcataatg aaacttgtca cgcctaaacg aacatgaaat 27900
ttcttgtttt cttaggaatc atcacaactg tagctgcatt tcaccaagaa tgtagtttac 27960
agtcatgtac tcaacatcaa ccatatgtag ttgatgaccc gtgtcctatt cacttctatt 28020
ctaaatggta tattagagta ggagctagaa aatcagcacc tttaattgaa ttgtgcgtgg 28080
atgaggctgg ttctaaatca cccattcagt acatcgatat cggtaattat acagtttcct 28140
gtttaccttt tacaattaat tgccaggaac ctaaattggg tagtcttgta gtgcgttgtt 28200
cgttctatga agacttttta gagtatcatg acgttcgtgt tgttttagat ttcatctaaa 28260
cgaacaaact aaaatgtctg ataatggacc ccaaaatcag cgaaatgcac cccgcattac 28320
gtttggtgga ccctcagatt caactggcag taaccagaat ggagaacgca gtggggcgcg 28380
atcaaaacaa cgtcggcccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcaccgctct 28440
cactcaacat ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc caattaacac 28500
caatagcagt ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg 28560
tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat ttctactacc taggaactgg 28620
gccagaagct ggacttccct atggtgctaa caaagacggc atcatatggg ttgcaactga 28680
gggagccttg aatacaccaa aagatcacat tggcacccgc aatcctgcta acaatgctgc 28740
aatcgtgcta caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagaagggag 28800
cagaggcggc agtcaagcct cttctcgttc ctcatcacgt agtcgcaaca gttcaagaaa 28860
ttcaactcca ggcagcagta ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga 28920
tgctgctctt gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtctgg 28980
taaaggccaa caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcttctaa 29040
gaagcctcgg caaaaacgta ctgccactaa agcatacaat gtaacacaag ctttcggcag 29100
acgtggtcca gaacaaaccc aaggaaattt tggggaccag gaactaatca gacaaggaac 29160
tgattacaaa cattggccgc aaattgcaca atttgccccc agcgcttcag cgttcttcgg 29220
aatgtcgcgc attggcatgg aagtcacacc ttcgggaacg tggttgacct acacaggtgc 29280
catcaaattg gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc tgaataagca 29340
tattgacgca tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaagaaggc 29400
tgatgaaact caagccttac cgcagagaca gaagaaacag caaactgtga ctcttcttcc 29460
tgctgcagat ttggatgatt tctccaaaca attgcaacaa tccatgagca gtgctgactc 29520
aactcaggcc taaactcatg cagaccacac aaggcagatg ggctatataa acgttttcgc 29580
ttttccgttt acgatatata gtctactctt gtgcagaatg aattctcgta actacatagc 29640
acaagtagat gtagttaact ttaatctcac atagcaatct ttaatcagtg tgtaacatta 29700
gggaggactt gaaagagcca ccacattttc accgaggcca cgcggagtac gatcgagtgt 29760
acagtgaaca atgctaggga gagctgccta tatggaagag ccctaatgtg taaaattaat 29820
tttagtagtg ctatccccat gtgattttaa tagcttctta ggagaatgac aaaaaaaaaa 29880
aaaaaaaaaa a 29891
<210> 3
<211> 29891
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120
cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180
ttctgcaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt 240
cgtccgggtg tgaccgaaag gtaagatgga gagccttgtc cctggtttca acgagaaaac 300
acacgtccaa ctcagtttgc ctgttttaca ggttcgcgac gtgctcgtac gtggctttgg 360
agactccgtg gaggaggtct tatcagaggc acgtcaacat cttaaagatg gcacttgtgg 420
cttagtagaa gttgaaaaag gcgttttgcc tcaacttgaa cagccctatg tgttcatcaa 480
acgttcggat gctcgaactg cacctcatgg tcatgttatg gttgagctgg tagcagaact 540
cgaaggcatt cagtacggtc gtagtggtga gacacttggt gtccttgtcc ctcatgtggg 600
cgaaatacca gtggcttacc gcaaggttct tcttcgtaag aacggtaata aaggagctgg 660
tggccatagt tacggcgccg atctaaagtc atttgactta ggcgacgagc ttggcactga 720
tccttatgaa gattttcaag aaaactggaa cactaaacat agcagtggtg ttacccgtga 780
actcatgcgt gagcttaacg gaggggcata cactcgctat gtcgataaca acttctgtgg 840
ccctgatggc taccctcttg agtgcattaa agaccttcta gcacgtgctg gtaaagcttc 900
atgcactttg tccgaacaac tggactttat tgacactaag aggggtgtat actgctgccg 960
tgaacatgag catgaaattg cttggtacac ggaacgttct gaaaagagct atgaattgca 1020
gacacctttt gaaattaaat tggcaaagaa atttgacacc ttcaatgggg aatgtccaaa 1080
ttttgtattt cccttaaatt ccataatcaa gactattcaa ccaagggttg aaaagaaaaa 1140
gcttgatggc tttatgggta gaattcgatc tgtctatcca gttgcgtcac caaatgaatg 1200
caaccaaatg tgcctttcaa ctctcatgaa gtgtgatcat tgtggtgaaa cttcatggca 1260
gacgggcgat tttgttaaag ccacttgcga attttgtggc actgagaatt tgactaaaga 1320
aggtgccact acttgtggtt acttacccca aaatgctgtt gttaaaattt attgtccagc 1380
atgtcacaat tcagaagtag gacctgagca tagtcttgcc gaataccata atgaatctgg 1440
cttgaaaacc attcttcgta agggtggtcg cactattgcc tttggaggct gtgtgttctc 1500
ttatgttggt tgccataaca agtgtgccta ttgggttcca cgtgctagcg ctaacatagg 1560
ttgtaaccat acaggtgttg ttggagaagg ttccgaaggt cttaatgaca accttcttga 1620
aatactccaa aaagagaaag tcaacatcaa tattgttggt gactttaaac ttaatgaaga 1680
gatcgccatt attttggcat ctttttctgc ttccacaagt gcttttgtgg aaactgtgaa 1740
aggtttggat tataaagcat tcaaacaaat tgttgaatcc tgtggtaatt ttaaagttac 1800
aaaaggaaaa gctaaaaaag gtgcctggaa tattggtgaa cagaaatcaa tactgagtcc 1860
tctttatgca tttgcatcag aggctgctcg tgttgtacga tcaattttct cccgcactct 1920
tgaaactgct caaaattctg tgcgtgtttt acagaaggcc gctataacaa tactagatgg 1980
aatttcacag tattcactga gactcattga tgctatgatg ttcacatctg atttggctac 2040
taacaatcta gttgtaatgg cctacattac aggtggtgtt gttcagttga cttcgcagtg 2100
gctaactaac atctttggca ctgtttatga aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga 2160
agagaagttt aaggaaggtg tagagtttct tagagatggt tgggaaattg ttaaatttat 2220
ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa 2280
ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc 2340
tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca 2400
ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc 2460
tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt 2520
aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga 2580
agctgttgaa gctccattgg ttggtacacc agtttgtatt aacgggctta tgttgctcga 2640
aatcaaagac acagaaaagt actgtgccct tgcacctaat atgatggtaa caaacaatac 2700
cttcacactc aaaggcggtg caccaacaaa ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga 2760
agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt 2820
acttaatgag aagtgctctg cctatacagt tgaactcggt acagaagtaa atgagttcgc 2880
ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc 2940
actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg 3000
tgagtttaaa ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga 3060
agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga 3120
agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga 3180
agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga 3240
cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt 3300
agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt 3360
aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt 3420
aaaaccaaca gtggttgtta atgcagccaa tgtttacctt aaacatggag gaggtgttgc 3480
aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc 3540
tactaatgga ccacttaaag tgggtggtag ttgtgtttta agcggacaca atcttgctaa 3600
acactgtctt catgttgtcg gcccaaatgt taacaaaggt gaagacattc aacttcttaa 3660
gagtgcttat gaaaatttta atcagcacga agttctactt gcaccattat tatcagctgg 3720
tatttttggt gctgacccta tacattcttt aagagtttgt gtagatactg ttcgcacaaa 3780
tgtctactta gctgtctttg ataaaaatct ctatgacaaa cttgtttcaa gctttttgga 3840
aatgaagagt gaaaagcaag ttgaacaaaa gatcgctgag attcctaaag aggaagttaa 3900
gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat 3960
caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa 4020
cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag 4080
tgacattgac atcactttct taaagaaaga tgctccatat atagtgggtg atgttgttca 4140
agagggtgtt ttaactgctg tggttatacc tactaaaaag gctggtggca ctactgaaat 4200
gctagcgaaa gctttgagaa aagtgccaac agacaattat ataaccactt acccgggtca 4260
gggtttaaat ggttacactg tagaggaggc aaagacagtg cttaaaaagt gtaaaagtgc 4320
cttttacatt ctaccatcta ttatctctaa tgagaagcaa gaaattcttg gaactgtttc 4380
ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg 4440
tgtggaaact aaagccatag tttcaactat acagcgtaaa tataagggta ttaaaataca 4500
agagggtgtg gttgattatg gtgctagatt ttacttttac accagtaaaa caactgtagc 4560
gtcacttatc aacacactta acgatctaaa tgaaactctt gttacaatgc cacttggcta 4620
tgtaacacat ggcttaaatt tggaagaagc tgctcggtat atgagatctc tcaaagtgcc 4680
agctacagtt tctgtttctt cacctgatgc tgttacagcg tataatggtt atcttacttc 4740
ttcttctaaa acacctgaag aacattttat tgaaaccatc tcacttgctg gttcctataa 4800
agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga 4860
taaaagtgta tattacacta gtaatcctac cacattccac ctagatggtg aagttatcac 4920
ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac 4980
aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca 5040
acagtttggt ccaacttatt tggatggagc tgatgttact aaaataaaac ctcataattc 5100
acatgaaggt aaaacatttt atgttttacc taatgatgac actctacgtg ttgaggcttt 5160
tgagtactac cacacaactg atcctagttt tctgggtagg tacatgtcag cattaaatca 5220
cactaaaaag tggaaatacc cacaagttaa tggtttaact tctattaaat gggcagataa 5280
caactgttat cttgccactg cattgttaac actccaacaa atagagttga agtttaatcc 5340
acctgctcta caagatgctt attacagagc aagggctggt gaagctgcta acttttgtgc 5400
acttatctta gcctactgta ataagacagt aggtgagtta ggtgatgtta gagaaacaat 5460
gagttacttg tttcaacatg ccaatttaga ttcttgcaaa agagtcttga acgtggtgtg 5520
taaaacttgt ggacaacagc agacaaccct taagggtgta gaagctgtta tgtacatggg 5580
cacactttct tatgaacaat ttaagaaagg tgttcagata ccttgtacgt gtggtaaaca 5640
agctacaaaa tatctagtac aacaggagtc accttttgtt atgatgtcag caccacctgc 5700
tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca 5760
gtgtggtcac tataaacata taacttctaa agaaactttg tattgcatag acggtgcttt 5820
acttacaaag tcctcagaat acaaaggtcc tattacggat gttttctaca aagaaaacag 5880
ttacacaaca accataaaac cagttactta taaattggat ggtgttgttt gtacagaaat 5940
tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat 6000
tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg 6060
tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc 6120
aagagagctt aaagttacat ttttccctga cttaaatggt gatgtggtgg ctattgatta 6180
taaacactac acaccctctt ttaagaaagg agctaaattg ttacataaac ctattgtttg 6240
gcatgttaac aatgcaacta ataaagccac gtataaacca aatacctggt gtatacgttg 6300
tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga 6360
cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt 6420
ggaaaatcct accatacaga aagacgttct tgagtgtaat gtgaaaacta ccgaagttgt 6480
aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca 6540
cacagatcta atggctgctt atgtagacaa ttctagtctt actattaaga aacctaatga 6600
attatctaga gtattaggtt tgaaaaccct tgctactcat ggtttagctg ctgttaatag 6660
tgtcccttgg gatactatag ctaattatgc taagcctttt cttaacaaag ttgttagtac 6720
aactactaac atagttacac ggtgtttaaa ccgtgtttgt actaattata tgccttattt 6780
ctttacttta ttgctacaat tgtgtacttt tactagaagt acaaattcta gaattaaagc 6840
atctatgccg actactatag caaagaatac tgttaagagt gtcggtaaat tttgtctaga 6900
ggcttcattt aattatttga agtcacctaa tttttctaaa ctgataaata ttataatttg 6960
gtttttacta ttaagtgttt gcctaggttc tttaatctac tcaaccgctg ctttaggtgt 7020
tttaatgtct aatttaggca tgccttctta ctgtactggt tacagagaag gctatttgaa 7080
ctctactaat gtcactattg caacctactg tactggttct ataccttgta gtgtttgtct 7140
tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc 7200
atcttttaaa tgggatttaa ctgcttttgg cttagttgca gagtggtttt tggcatatat 7260
tcttttcact aggtttttct atgtacttgg attggctgca atcatgcaat tgtttttcag 7320
ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt 7380
acaaatggcc ccgatttcag ctatggttag aatgtacatc ttctttgcat cattttatta 7440
tgtatggaaa agttatgtgc atgttgtaga cggttgtaat tcatcaactt gtatgatgtg 7500
ttacaaacgt aatagagcaa caagagtcga atgtacaact attgttaatg gtgttagaag 7560
gtccttttat gtctatgcta atggaggtaa aggcttttgc aaactacaca attggaattg 7620
tgttaattgt gatacattct gtgctggtag tacatttatt agtgatgaag ttgcgagaga 7680
cttgtcacta cagtttaaaa gaccaataaa tcctactgac cagtcttctt acatcgttga 7740
tagtgttaca gtgaagaatg gttccatcca tctttacttt gataaagctg gtcaaaagac 7800
ttatgaaaga cattctctct ctcattttgt taacttagac aacctgagag ctaataacac 7860
taaaggttca ttgcctatta atgttatagt ttttgatggt aaatcaaaat gtgaagaatc 7920
atctgcaaaa tcagcgtctg tttactacag tcagcttatg tgtcaaccta tactgttact 7980
agatcaggca ttagtgtctg atgttggtga tagtgcggaa gttgcagtta aaatgtttga 8040
tgcttacgtt aatacgtttt catcaacttt taacgtacca atggaaaaac tcaaaacact 8100
agttgcaact gcagaagctg aacttgcaaa gaatgtgtcc ttagacaatg tcttatctac 8160
ttttatttca gcagctcggc aagggtttgt tgattcagat gtagaaacta aagatgttgt 8220
tgaatgtctt aaattgtcac atcaatctga catagaagtt actggcgata gttgtaataa 8280
ctatatgctc acctataaca aagttgaaaa catgacaccc cgtgaccttg gtgcttgtat 8340
tgactgtagt gcgcgtcata ttaatgcgca ggtagcaaaa agtcacaaca ttgctttgat 8400
atggaacgtt aaagatttca tgtcattgtc tgaacaacta cgaaaacaaa tacgtagtgc 8460
tgctaaaaag aataacttac cttttaagtt gacatgtgca actactagac aagttgttaa 8520
tgttgtaaca acaaagatag cacttaaggg tggtaaaatt gttaataatt ggttgaagca 8580
gttaattaaa gttacacttg tgttcctttt tgttgctgct attttctatt taataacacc 8640
tgttcatgtc atgtctaaac atactgactt ttcaagtgaa atcataggat acaaggctat 8700
tgatggtggt gtcactcgtg acatagcatc tacagatact tgttttgcta acaaacatgc 8760
tgattttgac acatggttta gccagcgtgg tggtagttat actaatgaca aagcttgccc 8820
attgattgct gcagtcataa caagagaagt gggttttgtc gtgcctggtt tgcctggcac 8880
gatattacgc acaactaatg gtgacttttt gcatttctta cctagagttt ttagtgcagt 8940
tggtaacatc tgttacacac catcaaaact tatagagtac actgactttg caacatcagc 9000
ttgtgttttg gctgctgaat gtacaatttt taaagatgct tctggtaagc cagtaccata 9060
ttgttatgat accaatgtac tagaaggttc tgttgcttat gaaagtttac gccctgacac 9120
acgttatgtg ctcatggatg gctctattat tcaatttcct aacacctacc ttgaaggttc 9180
tgttagagtg gtaacaactt ttgattctga gtactgtagg cacggcactt gtgaaagatc 9240
agaagctggt gtttgtgtat ctactagtgg tagatgggta cttaacaatg attattacag 9300
atctttacca ggagttttct gtggtgtaga tgctgtaaat ttacttacta atatgtttac 9360
accactaatt caacctattg gtgctttgga catatcagca tctatagtag ctggtggtat 9420
tgtagctatc gtagtaacat gccttgccta ctattttatg aggtttagaa gagcttttgg 9480
tgaatacagt catgtagttg cctttaatac tttactattc cttatgtcat tcactgtact 9540
ctgtttaaca ccagtttact cattcttacc tggtgtttat tctgttattt acttgtactt 9600
gacattttat cttactaatg atgtttcttt tttagcacat attcagtgga tggttatgtt 9660
cacaccttta gtacctttct ggataacaat tgcttatatc atttgtattt ccacaaagca 9720
tttctattgg ttctttagta attacctaaa gaggcgtgta gtctttaatg gtgtttcctt 9780
tagtactttt gaagaagctg cgctgtgcac ctttttgtta aataaagaaa tgtatctaaa 9840
gttgcgtagt gatgtgctat tacctcttac gcaatataat agatacttag ctctttataa 9900
taagtacaag tattttagtg gagcaatgga tacaactagc tacagagaag ctgcttgttg 9960
tcatctcgca aaggctctca atgacttcag taactcaggt tctgatgttc tttaccaacc 10020
accacaaacc tctatcacct cagctgtttt gcagagtggt tttagaaaaa tggcattccc 10080
atctggtaaa gttgagggtt gtatggtaca agtaacttgt ggtacaacta cacttaacgg 10140
tctttggctt gatgacgtag tttactgtcc aagacatgtg atctgcacct ctgaagacat 10200
gcttaaccct aattatgaag atttactcat tcgtaagtct aatcataatt tcttggtaca 10260
ggctggtaat gttcaactca gggttattgg acattctatg caaaattgtg tacttaagct 10320
taaggttgat acagccaatc ctaagacacc taagtataag tttgttcgca ttcaaccagg 10380
acagactttt tcagtgttag cttgttacaa tggttcacca tctggtgttt accaatgtgc 10440
tatgaggccc aatttcacta ttaagggttc attccttaat ggttcatgtg gtagtgttgg 10500
ttttaacata gattatgact gtgtctcttt ttgttacatg caccatatgg aattaccaac 10560
tggagttcat gctggcacag acttagaagg taacttttat ggaccttttg ttgacaggca 10620
aacagcacaa gcagctggta cggacacaac tattacagtt aatgttttag cttggttgta 10680
cgctgctgtt ataaatggag acaggtggtt tctcaatcga tttaccacaa ctcttaatga 10740
ctttaacctt gtggctatga agtacaatta tgaacctcta acacaagacc atgttgacat 10800
actaggacct ctttctgctc aaactggaat tgccgtttta gatatgtgtg cttcattaaa 10860
agaattactg caaaatggta tgaatggacg taccatattg ggtagtgctt tattagaaga 10920
tgaatttaca ccttttgatg ttgttagaca atgctcaggt gttactttcc aaagtgcagt 10980
gaaaagaaca atcaagggta cacaccactg gttgttactc acaattttga cttcactttt 11040
agttttagtc cagagtactc aatggtcttt gttctttttt ttgtatgaaa atgccttttt 11100
accttttgct atgggtatta ttgctatgtc tgcttttgca atgatgtttg tcaaacataa 11160
gcatgcattt ctctgtttgt ttttgttacc ttctcttgcc actgtagctt attttaatat 11220
ggtctatatg cctgctagtt gggtgatgcg tattatgaca tggttggata tggttgatac 11280
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ataaacgaac ttatggattt gtttatgaga atcttcacaa ttggaactgt aactttgaag 25440
caaggtgaaa tcaaggatgc tactccttca gattttgttc gcgctactgc aacgataccg 25500
atacaagcct cactcccttt cggatggctt attgttggcg ttgcacttct tgctgttttt 25560
cagagcgctt ccaaaatcat aaccctcaaa aagagatggc aactagcact ctccaagggt 25620
gttcactttg tttgcaactt gctgttgttg tttgtaacag tttactcaca ccttttgctc 25680
gttgctgctg gccttgaagc cccttttctc tatctttatg ctttagtcta cttcttgcag 25740
agtataaact ttgtaagaat aataatgagg ctttggcttt gctggaaatg ccgttccaaa 25800
aacccattac tttatgatgc caactatttt ctttgctggc atactaattg ttacgactat 25860
tgtatacctt acaatagtgt aacttcttca attgtcatta cttcaggtga tggcacaaca 25920
agtcctattt ctgaacatga ctaccagatt ggtggttata ctgaaaaatg ggaatctgga 25980
gtaaaagact gtgttgtatt acacagttac ttcacttcag actattacca gctgtactca 26040
actcaattga gtacagacac tggtgttgaa catgttacct tcttcatcta caataaaatt 26100
gttgatgagc ctgaagaaca tgtccaaatt cacacaatcg acggttcatc cggagttgtt 26160
aatccagtaa tggaaccaat ttatgatgaa ccgacgacga ctactagcgt gcctttgtaa 26220
gcacaagctg atgagtacga acttatgtac tcattcgttt cggaagagac aggtacgtta 26280
atagttaata gcgtacttct ttttcttgct ttcgtggtat tcttgctagt tacactagcc 26340
atccttactg cgcttcgatt gtgtgcgtac tgctgcaata ttgttaacgt gagtcttgta 26400
aaaccttctt tttacgttta ctctcgtgtt aaaaatctga attcttctag agttcctgat 26460
cttctggtct aaacgaacta aatattatat tagtttttct gtttggaact ttaattttag 26520
ccatggcaga ttccaacggt actattaccg ttgaagagct taaaaagctc cttgaacaat 26580
ggaacctagt aataggtttc ctattcctta catggatttg tcttctacaa tttgcctatg 26640
ccaacaggaa taggtttttg tatataatta agttaatttt cctctggctg ttatggccag 26700
taactttagc ttgttttgtg cttgctgctg tttacagaat aaattggatc accggtggaa 26760
ttgctatcgc aatggcttgt cttgtaggct tgatgtggct cagctacttc attgcttctt 26820
tcagactgtt tgcgcgtacg cgttccatgt ggtcattcaa tccagaaact aacattcttc 26880
tcaacgtgcc actccatggc actattctga ccagaccgct tctagaaagt gaactcgtaa 26940
tcggagctgt gatccttcgt ggacatcttc gtattgctgg acaccatcta ggacgctgtg 27000
acatcaagga cctgcctaaa gaaatcactg ttgctacatc acgaacgctt tcttattaca 27060
aattgggagc ttcgcagcgt gtagcaggtg actcaggttt tgctgcatac agtcgctaca 27120
ggattggcaa ctataaatta aacacagacc attccagtag cagtgacaat attgctttgc 27180
ttgtacagta agtgacaaca gatgtttcat ctcgttgact ttcaggttac tatagcagag 27240
atattactaa ttattatgag gacttttaaa gtttccattt ggaatcttga ttacatcata 27300
aacctcataa ttaaaaattt atctaagtca ctaactgaga ataaatattc tcaattagat 27360
gaagagcaac caatggagat tgattaaacg aacatgaaaa ttattctttt cttggcactg 27420
ataacactcg ctacttgtga gctttatcac taccaagagt gtgttagagg tacaacagta 27480
cttttaaaag aaccttgctc ttctggaaca tacgagggca attcaccatt tcatcctcta 27540
gctgataaca aatttgcact gacttgcttt agcactcaat ttgcttttgc ttgtcctgac 27600
ggcgtaaaac acgtctatca gttacgtgcc agatcagttt cacctaaact gttcatcaga 27660
caagaggaag ttcaagaact ttactctcca atttttctta ttgttgcggc aatagtgttt 27720
ataacacttt gcttcacact caaaagaaag acagaatgat tgaactttca ttaattgact 27780
tctatttgtg ctttttagcc tttctgctat tccttgtttt aattatgctt attatctttt 27840
ggttctcact tgaactgcaa gatcataatg aaacttgtca cgcctaaacg aacatgaaat 27900
ttcttgtttt cttaggaatc atcacaactg tagctgcatt tcaccaagaa tgtagtttac 27960
agtcatgtac tcaacatcaa ccatatgtag ttgatgaccc gtgtcctatt cacttctatt 28020
ctaaatggta tattagagta ggagctagaa aatcagcacc tttaattgaa ttgtgcgtgg 28080
atgaggctgg ttctaaatca cccattcagt acatcgatat cggtaattat acagtttcct 28140
gtttaccttt tacaattaat tgccaggaac ctaaattggg tagtcttgta gtgcgttgtt 28200
cgttctatga agacttttta gagtatcatg acgttcgtgt tgttttagat ttcatctaaa 28260
cgaacaaact aaaatgtctg ataatggacc ccaaaatcag cgaaatgcac cccgcattac 28320
gtttggtgga ccctcagatt caactggcag taaccagaat ggagaacgca gtggggcgcg 28380
atcaaaacaa cgtcggcccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcaccgctct 28440
cactcaacat ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc caattaacac 28500
caatagcagt ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg 28560
tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat ttctactacc taggaactgg 28620
gccagaagct ggacttccct atggtgctaa caaagacggc atcatatggg ttgcaactga 28680
gggagccttg aatacaccaa aagatcacat tggcacccgc aatcctgcta acaatgctgc 28740
aatcgtgcta caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagaagggag 28800
cagaggcggc agtcaagcct cttctcgttc ctcatcacgt agtcgcaaca gttcaagaaa 28860
ttcaactcca ggcagcagta ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga 28920
tgctgctctt gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtctgg 28980
taaaggccaa caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcttctaa 29040
gaagcctcgg caaaaacgta ctgccactaa agcatacaat gtaacacaag ctttcggcag 29100
acgtggtcca gaacaaaccc aaggaaattt tggggaccag gaactaatca gacaaggaac 29160
tgattacaaa cattggccgc aaattgcaca atttgccccc agcgcttcag cgttcttcgg 29220
aatgtcgcgc attggcatgg aagtcacacc ttcgggaacg tggttgacct acacaggtgc 29280
catcaaattg gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc tgaataagca 29340
tattgacgca tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaagaaggc 29400
tgatgaaact caagccttac cgcagagaca gaagaaacag caaactgtga ctcttcttcc 29460
tgctgcagat ttggatgatt tctccaaaca attgcaacaa tccatgagca gtgctgactc 29520
aactcaggcc taaactcatg cagaccacac aaggcagatg ggctatataa acgttttcgc 29580
ttttccgttt acgatatata gtctactctt gtgcagaatg aattctcgta actacatagc 29640
acaagtagat gtagttaact ttaatctcac atagcaatct ttaatcagtg tgtaacatta 29700
gggaggactt gaaagagcca ccacattttc accgaggcca cgcggagtac gatcgagtgt 29760
acagtgaaca atgctaggga gagctgccta tatggaagag ccctaatgtg taaaattaat 29820
tttagtagtg ctatccccat gtgattttaa tagcttctta ggagaatgac aaaaaaaaaa 29880
aaaaaaaaaa a 29891
<210> 4
<211> 29855
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120
cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180
ttctgcaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt 240
cgtccgggtg tgaccgaaag gtaagatgga gagccttgtc cctggtttca acgagaaaac 300
acacgtccaa ctcagtttgc ctgttttaca ggttcgcgac gtgctcgtac gtggctttgg 360
agactccgtg gaggaggtct tatcagaggc acgtcaacat cttaaagatg gcacttgtgg 420
cttagtagaa gttgaaaaag gcgttttgcc tcaacttgaa cagccctatg tgttcatcaa 480
acgttcggat gctcgaactg cacctcatgg tcatgttatg gttgagctgg tagcagaact 540
cgaaggcatt cagtacggtc gtagtggtga gacacttggt gtccttgtcc ctcatgtggg 600
cgaaatacca gtggcttacc gcaaggttct tcttcgtaag aacggtaata aaggagctgg 660
tggccatagt tacggcgccg atctaaagtc atttgactta ggcgacgagc ttggcactga 720
tccttatgaa gattttcaag aaaactggaa cactaaacat agcagtggtg ttacccgtga 780
actcatgcgt gagcttaacg gaggggcata cactcgctat gtcgataaca acttctgtgg 840
ccctgatggc taccctcttg agtgcattaa agaccttcta gcacgtgctg gtaaagcttc 900
atgcactttg tccgaacaac tggactttat tgacactaag aggggtgtat actgctgccg 960
tgaacatgag catgaaattg cttggtacac ggaacgttct gaaaagagct atgaattgca 1020
gacacctttt gaaattaaat tggcaaagaa atttgacacc ttcaatgggg aatgtccaaa 1080
ttttgtattt cccttaaatt ccataatcaa gactattcaa ccaagggttg aaaagaaaaa 1140
gcttgatggc tttatgggta gaattcgatc tgtctatcca gttgcgtcac caaatgaatg 1200
caaccaaatg tgcctttcaa ctctcatgaa gtgtgatcat tgtggtgaaa cttcatggca 1260
gacgggcgat tttgttaaag ccacttgcga attttgtggc actgagaatt tgactaaaga 1320
aggtgccact acttgtggtt acttacccca aaatgctgtt gttaaaattt attgtccagc 1380
atgtcacaat tcagaagtag gacctgagca tagtcttgcc gaataccata atgaatctgg 1440
cttgaaaacc attcttcgta agggtggtcg cactattgcc tttggaggct gtgtgttctc 1500
ttatgttggt tgccataaca agtgtgccta ttgggttcca cgtgctagcg ctaacatagg 1560
ttgtaaccat acaggtgttg ttggagaagg ttccgaaggt cttaatgaca accttcttga 1620
aatactccaa aaagagaaag tcaacatcaa tattgttggt gactttaaac ttaatgaaga 1680
gatcgccatt attttggcat ctttttctgc ttccacaagt gcttttgtgg aaactgtgaa 1740
aggtttggat tataaagcat tcaaacaaat tgttgaatcc tgtggtaatt ttaaagttac 1800
aaaaggaaaa gctaaaaaag gtgcctggaa tattggtgaa cagaaatcaa tactgagtcc 1860
tctttatgca tttgcatcag aggctgctcg tgttgtacga tcaattttct cccgcactct 1920
tgaaactgct caaaattctg tgcgtgtttt acagaaggcc gctataacaa tactagatgg 1980
aatttcacag tattcactga gactcattga tgctatgatg ttcacatctg atttggctac 2040
taacaatcta gttgtaatgg cctacattac aggtggtgtt gttcagttga cttcgcagtg 2100
gctaactaac atctttggca ctgtttatga aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga 2160
agagaagttt aaggaaggtg tagagtttct tagagacggt tgggaaattg ttaaatttat 2220
ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa 2280
ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc 2340
tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca 2400
ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc 2460
tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt 2520
aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga 2580
agctgttgaa gctccattgg ttggtacacc agtttgtatt aacgggctta tgttgctcga 2640
aatcaaagac acagaaaagt actgtgccct tgcacctaat atgatggtaa caaacaatac 2700
cttcacactc aaaggcggtg caccaacaaa ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga 2760
agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt 2820
acttaatgag aagtgctctg cctatacagt tgaactcggt acagaagtaa atgagttcgc 2880
ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc 2940
actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg 3000
tgagtttata ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga 3060
agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga 3120
agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga 3180
agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga 3240
cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt 3300
agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt 3360
aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt 3420
aaaaccaaca gtggttgtta atgcagccaa tgtttacctt aaacatggag gaggtgttgc 3480
aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc 3540
tactaatgga ccacttaaag tgggtggtag ttgtgtttta agcggacaca atcttgctaa 3600
acactgtctt catgttgtcg gcccaaatgt taacaaaggt gaagacattc aacttcttaa 3660
gagtgcttat gaaaatttta atcagcacga agttctactt gcaccattat tatcagctgg 3720
tatttttggt gctgacccta tacattcttt aagagtttgt gtagatactg ttcgcacaaa 3780
tgtctactta gctgtctttg ataaaaatct ctatgacaaa cttgtttcaa gctttttgga 3840
aatgaagagt gaaaagcaag ttgaacaaaa gatcgctgag attcctaaag aggaagttaa 3900
gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat 3960
caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa 4020
cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag 4080
tgacattgac atcactttct taaagaaaga tgctccatat atagtgggtg atgttgttca 4140
agagggtgtt ttaactgctg tggttatacc tactaaaaag gctggtggca ctactgaaat 4200
gctagcgaaa gctttgagaa aagtgccaac agacaattat ataaccactt acccgggtca 4260
gggtttaaat ggttacactg tagaggaggc aaagacagtg cttaaaaagt gtaaaagtgc 4320
cttttacatt ctaccatcta ttatctctaa tgagaagcaa gaaattcttg gaactgtttc 4380
ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg 4440
tgtggaaact aaagccatag tttcaactat acagcgtaaa tataagggta ttaaaataca 4500
agagggtgtg gttgattatg gtgctagatt ttacttttac accagtaaaa caactgtagc 4560
gtcacttatc aacacactta acgatctaaa tgaaactctt gttacaatgc cacttggcta 4620
tgtaacacat ggcttaaatt tggaagaagc tgctcggtat atgagatctc tcaaagtgcc 4680
agctacagtt tctgtttctt cacctgatgc tgttacagcg tataatggtt atcttacttc 4740
ttcttctaaa acacctgaag aacattttat tgaaaccatc tcacttgctg gttcctataa 4800
agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga 4860
taaaagtgta tattacacta gtaatcctac cacattccac ctagatggtg aagttatcac 4920
ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac 4980
aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca 5040
acagtttggt ccaacttatt tggatggagc tgatgttact aaaataaaac ctcataattc 5100
acatgaaggt aaaacatttt atgttttacc taatgatgac actctacgtg ttgaggcttt 5160
tgagtactac cacacaactg atcctagttt tctgggtagg tacatgtcag cattaaatca 5220
cactaaaaag tggaaatacc cacaagttaa tggtttaact tctattaaat gggcagataa 5280
caactgttat cttgccactg cattgttaac actccaacaa atagagttga agtttaatcc 5340
acctgctcta caagatgctt attacagagc aagggctggt gaagctgcta acttttgtgc 5400
acttatctta gcctactgta ataagacagt aggtgagtta ggtgatgtta gagaaacaat 5460
gagttacttg tttcaacatg ccaatttaga ttcttgcaaa agagtcttga acgtggtgtg 5520
taaaacttgt ggacaacagc agacaaccct taagggtgta gaagctgtta tgtacatggg 5580
cacactttct tatgaacaat ttaagaaagg tgttcagata ccttgtacgt gtggtaaaca 5640
agctacaaaa tatctagtac aacaggagtc accttttgtt atgatgtcag caccacctgc 5700
tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca 5760
gtgtggtcac tataaacata taacttctaa agaaactttg tattgcatag acggtgcttt 5820
acttacaaag tcctcagaat acaaaggtcc tattacggat gttttctaca aagaaaacag 5880
ttacacaaca accataaaac cagttactta taaattggat ggtgttgttt gtacagaaat 5940
tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat 6000
tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg 6060
tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc 6120
aagagagctt aaagttacat ttttccctga cttaaatggt gatgtggtgg ctattgatta 6180
taaacactac acaccctctt ttaagaaagg agctaaattg ttacataaac ctattgtttg 6240
gcatgttaac aatgcaacta ataaagccac gtataaacca aatacctggt gtatacgttg 6300
tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga 6360
cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt 6420
ggaaaatcct accatacaga aagacgttct tgagtgtaat gtgaaaacta ccgaagttgt 6480
aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca 6540
cacagatcta atggctgctt atgtagacaa ttctagtctt actattaaga aacctaatga 6600
attatctaga gtattaggtt tgaaaaccct tgctactcat ggtttagctg ctgttaatag 6660
tgtcccttgg gatactatag ctaattatgc taagcctttt cttaacaaag ttgttagtac 6720
aactactaac atagttacac ggtgtttaaa ccgtgtttgt actaattata tgccttattt 6780
ctttacttta ttgctacaat tgtgtacttt tactagaagt acaaattcta gaattaaagc 6840
atctatgccg actactatag caaagaatac tgttaagagt gtcggtaaat tttgtctaga 6900
ggcttcattt aattatttga agtcacctaa tttttctaaa ctgataaata ttataatttg 6960
gtttttacta ttaagtgttt gcctaggttc tttaatctac tcaaccgctg ctttaggtgt 7020
tttaatgtct aatttaggca tgccttctta ctgtactggt tacagagaag gctatttgaa 7080
ctctactaat gtcactattg caacctactg tactggttct ataccttgta gtgtttgtct 7140
tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc 7200
atcttttaaa tgggatttaa ctgcttttgg cttagttgca gagtggtttt tggcatatat 7260
tcttttcact aggtttttct atgtacttgg attggctgca atcatgcaat tgtttttcag 7320
ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt 7380
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gtccttttat gtctatgcta atggaggtaa aggcttttgc aaactacaca attggaattg 7620
tgttaattgt gatacattct gtgctggtag tacatttatt agtgatgaag ttgcgagaga 7680
cttgtcacta cagtttaaaa gaccaataaa tcctactgac cagtcttctt acatcgttga 7740
tagtgttaca gtgaagaatg gttccatcca tctttacttt gataaagctg gtcaaaagac 7800
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taaaggttca ttgcctatta atgttatagt ttttgatggt aaatcaaaat gtgaagaatc 7920
atctgcaaaa tcagcgtctg tttactacag tcagcttatg tgtcaaccta tactgttact 7980
agatcaggca ttagtgtctg atgttggtga tagtgcggaa gttgcagtta aaatgtttga 8040
tgcttacgtt aatacgtttt catcaacttt taacgtacca atggaaaaac tcaaaacact 8100
agttgcaact gcagaagctg aacttgcaaa gaatgtgtcc ttagacaatg tcttatctac 8160
ttttatttca gcagctcggc aagggtttgt tgattcagat gtagaaacta aagatgttgt 8220
tgaatgtctt aaattgtcac atcaatctga catagaagtt actggcgata gttgtaataa 8280
ctatatgctc acctataaca aagttgaaaa catgacaccc cgtgaccttg gtgcttgtat 8340
tgactgtagt gcgcgtcata ttaatgcgca ggtagcaaaa agtcacaaca ttgctttgat 8400
atggaacgtt aaagatttca tgtcattgtc tgaacaacta cgaaaacaaa tacgtagtgc 8460
tgctaaaaag aataacttac cttttaagtt gacatgtgca actactagac aagttgttaa 8520
tgttgtaaca acaaagatag cacttaaggg tggtaaaatt gttaataatt ggttgaagca 8580
gttaattaaa gttacacttg tgttcctttt tgttgctgct attttctatt taataacacc 8640
tgttcatgtc atgtctaaac atactgactt ttcaagtgaa atcataggat acaaggctat 8700
tgatggtggt gtcactcgtg acatagcatc tacagatact tgttttgcta acaaacatgc 8760
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gatattacgc acaactaatg gtgacttttt gcatttctta cctagagttt ttagtgcagt 8940
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ttgtgttttg gctgctgaat gtacaatttt taaagatgct tctggtaagc cagtaccata 9060
ttgttatgat accaatgtac tagaaggttc tgttgcttat gaaagtttac gccctgacac 9120
acgttatgtg ctcatggatg gctctattat tcaatttcct aacacctacc ttgaaggttc 9180
tgttagagtg gtaacaacct ttgattctga gtactgtagg cacggcactt gtgaaagatc 9240
agaagctggt gtttgtgtat ctactagtgg tagatgggta cttaacaatg attattacag 9300
atctttacca ggagttttct gtggtgtaga tgctgtaaat ttacttacta atatgtttac 9360
accactaatt caacctattg gtgctttgga catatcagca tctatagtag ctggtggtat 9420
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ttatcagact cagcaatcca tcattgccta cactatgtca cttggtgcag aaaattcagt 23640
tgcttactct aataactcta ttgccatacc cacaaatttt actattagtg ttaccacaga 23700
aattctacca gtgtctatga ccaagacatc agtagattgt acaatgtaca tttgtggtga 23760
ttcaactgaa tgcagcaatc ttttgttgca atatggcagt ttttgtacac aattaaaccg 23820
tgctttaact ggaatagctg ttgaacaaga caaaaacacc caagaagttt ttgcacaagt 23880
caaacaaatt tacaaaacac caccaattaa agattttggt ggttttaatt tttcacaaat 23940
attaccagat ccatcaaaac caagcaagag gtcatttatt gaagatctac ttttcaacaa 24000
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ccaatttaat tccgctatcg gtaagattca ggattcattg tctagtactg ctagtgcact 24360
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acagtttact cacacctttt gctcgttgct gctggccttg aagccccttt tctctatctt 25680
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tcagactatt accagctgta ctcaactcaa ttgagtacag acactggtgt tgaacatgtt 26040
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tttgtcttct acaatttgcc tatgccaaca ggaataggtt tttgtatata attaagttaa 26640
ttttcctctg gctgttatgg ccagtaactt tagcttgttt tgtgcttgct gctgtttaca 26700
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<211> 36
<212> DNA
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<400> 5
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<210> 6
<211> 1261
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
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Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
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Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
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Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Ile Glu
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Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
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Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
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Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
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195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
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Leu Leu Ala Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly
675 680 685
Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr
690 695 700
Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr
705 710 715 720
Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu
725 730 735
Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn
740 745 750
Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu
755 760 765
Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp
770 775 780
Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro
785 790 795 800
Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu
805 810 815
Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile
820 825 830
Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val
835 840 845
Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala
850 855 860
Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Val
865 870 875 880
Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly
885 890 895
Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala
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Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser
915 920 925
Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala
930 935 940
Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala
945 950 955 960
Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu
965 970 975
Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu
980 985 990
Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala
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Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly
1010 1015 1020
Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met
1025 1030 1035
Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val
1040 1045 1050
Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala
1055 1060 1065
Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe
1070 1075 1080
Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr
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Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn
1100 1105 1110
Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro
1115 1120 1125
Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr
1130 1135 1140
Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser
1145 1150 1155
Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg
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Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
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Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr
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Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val
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Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys
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Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp
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Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1250 1255 1260
<210> 7
<211> 29853
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120
cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180
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agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt 2820
acttaatgag aagtgctctg cctatacagt tgaactcggt acagaagtaa atgagttcgc 2880
ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc 2940
actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg 3000
tgagtttaaa ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga 3060
agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga 3120
agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga 3180
agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga 3240
cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt 3300
agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt 3360
aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt 3420
aaaaccaaca gtggttgtta atgcagccaa tgtttacctt aaacatggag gaggtgttgc 3480
aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc 3540
tactaatgga ccacttaaag tgggtggtag ttgtgtttta agcggacaca atcttgctaa 3600
acactgtctt catgttgtcg gcccaaatgt taacaaaggt gaagacattc aacttcttaa 3660
gagtgcttat gaaaatttta atcagcacga agttctactt gcaccattat tatcagctgg 3720
tatttttggt gctgacccta tacattcttt aagagtttgt gtagatactg ttcgcacaaa 3780
tgtctactta gctgtctttg ataaaaatct ctatgacaaa cttgtttcaa gctttttgga 3840
aatgaagagt gaaaagcaag ttgaacaaaa gatcgctgag attcctaaag aggaagttaa 3900
gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat 3960
caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa 4020
cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag 4080
tgacattgac atcactttct taaagaaaga tgctccatat atagtgggtg atgttgttca 4140
agagggtgtt ttaactgctg tggttatacc tactaaaaag gctggtggca ctactgaaat 4200
gctagcgaaa gctttgagaa aagtgccaac agacaattat ataaccactt acccgggtca 4260
gggtttaaat ggttacactg tagaggaggc aaagacagtg cttaaaaagt gtaaaagtgc 4320
cttttacatt ctaccatcta ttatctctaa tgagaagcaa gaaattcttg gaactgtttc 4380
ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg 4440
tgtggaaact aaagccatag tttcaactat acagcgtaaa tataagggta ttaaaataca 4500
agagggtgtg gttgattatg gtgctagatt ttacttttac accagtaaaa caactgtagc 4560
gtcacttatc aacacactta acgatctaaa tgaaactctt gttacaatgc cacttggcta 4620
tgtaacacat ggcttaaatt tggaagaagc tgctcggtat atgagatctc tcaaagtgcc 4680
agctacagtt tctgtttctt cacctgatgc tgttacagcg tataatggtt atcttacttc 4740
ttcttctaaa acacctgaag aacattttat tgaaaccatc tcacttgctg gttcctataa 4800
agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga 4860
taaaagtgta tattacacta gtaatcctac cacattccac ctagatggtg aagttatcac 4920
ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac 4980
aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca 5040
acagtttggt ccaacttatt tggatggagc tgatgttact aaaataaaac ctcataattc 5100
acatgaaggt aaaacatttt atgttttacc taatgatgac actctacgtg ttgaggcttt 5160
tgagtactac cacacaactg atcctagttt tctgggtagg tacatgtcag cattaaatca 5220
cactaaaaag tggaaatacc cacaagttaa tggtttaact tctattaaat gggcagataa 5280
caactgttat cttgccactg cattgttaac actccaacaa atagagttga agtttaatcc 5340
acctgctcta caagatgctt attacagagc aagggctggt gaagctgcta acttttgtgc 5400
acttatctta gcctactgta ataagacagt aggtgagtta ggtgatgtta gagaaacaat 5460
gagttacttg tttcaacatg ccaatttaga ttcttgcaaa agagtcttga acgtggtgtg 5520
taaaacttgt ggacaacagc agacaaccct taagggtgta gaagctgtta tgtacatggg 5580
cacactttct tatgaacaat ttaagaaagg tgttcagata ccttgtacgt gtggtaaaca 5640
agctacaaaa tatctagtac aacaggagtc accttttgtt atgatgtcag caccacctgc 5700
tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca 5760
gtgtggtcac tataaacata taacttctaa agaaactttg tattgcatag acggtgcttt 5820
acttacaaag tcctcagaat acaaaggtcc tattacggat gttttctaca aagaaaacag 5880
ttacacaaca accataaaac cagttactta taaattggat ggtgttgttt gtacagaaat 5940
tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat 6000
tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg 6060
tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc 6120
aagagagctt aaagttacat ttttccctga cttaaatggt gatgtggtgg ctattgatta 6180
taaacactac acaccctctt ttaagaaagg agctaaattg ttacataaac ctattgtttg 6240
gcatgttaac aatgcaacta ataaagccac gtataaacca aatacctggt gtatacgttg 6300
tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga 6360
cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt 6420
ggaaaatcct accatacaga aagacgttct tgagtgtaat gtgaaaacta ccgaagttgt 6480
aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca 6540
cacagatcta atggctgctt atgtagacaa ttctagtctt actattaaga aacctaatga 6600
attatctaga gtattaggtt tgaaaaccct tgctactcat ggtttagctg ctgttaatag 6660
tgtcccttgg gatactatag ctaattatgc taagcctttt cttaacaaag ttgttagtac 6720
aactactaac atagttacac ggtgtttaaa ccgtgtttgt actaattata tgccttattt 6780
ctttacttta ttgctacaat tgtgtacttt tactagaagt acaaattcta gaattaaagc 6840
atctatgccg actactatag caaagaatac tgttaagagt gtcggtaaat tttgtctaga 6900
ggcttcattt aattatttga agtcacctaa tttttctaaa ctgataaata ttataatttg 6960
gtttttacta ttaagtgttt gcctaggttc tttaatctac tcaaccgctg ctttaggtgt 7020
tttaatgtct aatttaggca tgccttctta ctgtactggt tacagagaag gctatttgaa 7080
ctctactaat gtcactattg caacctactg tactggttct ataccttgta gtgtttgtct 7140
tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc 7200
atcttttaaa tgggatttaa ctgcttttgg cttagttgca gagtggtttt tggcatatat 7260
tcttttcact aggtttttct atgtacttgg attggctgca atcatgcaat tgtttttcag 7320
ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt 7380
acaaatggcc ccgatttcag ctatggttag aatgtacatc ttctttgcat cattttatta 7440
tgtatggaaa agttatgtgc atgttgtaga cggttgtaat tcatcaactt gtatgatgtg 7500
ttacaaacgt aatagagcaa caagagtcga atgtacaact attgttaatg gtgttagaag 7560
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tgttaattgt gatacattct gtgctggtag tacatttatt agtgatgaag ttgcgagaga 7680
cttgtcacta cagtttaaaa gaccaataaa tcctactgac cagtcttctt acatcgttga 7740
tagtgttaca gtgaagaatg gttccatcca tctttacttt gataaagctg gtcaaaagac 7800
ttatgaaaga cattctctct ctcattttgt taacttagac aacctgagag ctaataacac 7860
taaaggttca ttgcctatta atgttatagt ttttgatggt aaatcaaaat gtgaagaatc 7920
atctgcaaaa tcagcgtctg tttactacag tcagcttatg tgtcaaccta tactgttact 7980
agatcaggca ttagtgtctg atgttggtga tagtgcggaa gttgcagtta aaatgtttga 8040
tgcttacgtt aatacgtttt catcaacttt taacgtacca atggaaaaac tcaaaacact 8100
agttgcaact gcagaagctg aacttgcaaa gaatgtgtcc ttagacaatg tcttatctac 8160
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ctatatgctc acctataaca aagttgaaaa catgacaccc cgtgaccttg gtgcttgtat 8340
tgactgtagt gcgcgtcata ttaatgcgca ggtagcaaaa agtcacaaca ttgctttgat 8400
atggaacgtt aaagatttca tgtcattgtc tgaacaacta cgaaaacaaa tacgtagtgc 8460
tgctaaaaag aataacttac cttttaagtt gacatgtgca actactagac aagttgttaa 8520
tgttgtaaca acaaagatag cacttaaggg tggtaaaatt gttaataatt ggttgaagca 8580
gttaattaaa gttacacttg tgttcctttt tgttgctgct attttctatt taataacacc 8640
tgttcatgtc atgtctaaac atactgactt ttcaagtgaa atcataggat acaaggctat 8700
tgatggtggt gtcactcgtg acatagcatc tacagatact tgttttgcta acaaacatgc 8760
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tggtaacatc tgttacacac catcaaaact tatagagtac actgactttg caacatcagc 9000
ttgtgttttg gctgctgaat gtacaatttt taaagatgct tctggtaagc cagtaccata 9060
ttgttatgat accaatgtac tagaaggttc tgttgcttat gaaagtttac gccctgacac 9120
acgttatgtg ctcatggatg gctctattat tcaatttcct aacacctacc ttgaaggttc 9180
tgttagagtg gtaacaactt ttgattctga gtactgtagg cacggcactt gtgaaagatc 9240
agaagctggt gtttgtgtat ctactagtgg tagatgggta cttaacaatg attattacag 9300
atctttacca ggagttttct gtggtgtaga tgctgtaaat ttacttacta atatgtttac 9360
accactaatt caacctattg gtgctttgga catatcagca tctatagtag ctggtggtat 9420
tgtagctatc gtagtaacat gccttgccta ctattttatg aggtttagaa gagcttttgg 9480
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ctgtttaaca ccagtttact cattcttacc tggtgtttat tctgttattt acttgtactt 9600
gacattttat cttactaatg atgtttcttt tttagcacat attcagtgga tggttatgtt 9660
cacaccttta gtacctttct ggataacaat tgcttatatc atttgtattt ccacaaagca 9720
tttctattgg ttctttagta attacctaaa gagacgtgta gtctttaatg gtgtttcctt 9780
tagtactttt gaagaagctg cgctgtgcac ctttttgtta aataaagaaa tgtatctaaa 9840
gttgcgtagt gatgtgctat tacctcttac gcaatataat agatacttag ctctttataa 9900
taagtacaag tattttagtg gagcaatgga tacaactagc tacagagaag ctgcttgttg 9960
tcatctcgca aaggctctca atgacttcag taactcaggt tctgatgttc tttaccaacc 10020
accacaaacc tctatcacct cagctgtttt gcagagtggt tttagaaaaa tggcattccc 10080
atctggtaaa gttgagggtt gtatggtaca agtaacttgt ggtacaacta cacttaacgg 10140
tctttggctt gatgacgtag tttactgtcc aagacatgtg atctgcacct ctgaagacat 10200
gcttaaccct aattatgaag atttactcat tcgtaagtct aatcataatt tcttggtaca 10260
ggctggtaat gttcaactca gggttattgg acattctatg caaaattgtg tacttaagct 10320
taaggttgat acagccaatc ctaagacacc taagtataag tttgttcgca ttcaaccagg 10380
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tggagttcat gctggcacag acttagaagg taacttttat ggaccttttg ttgacaggca 10620
aacagcacaa gcagctggta cggacacaac tattacagtt aatgttttag cttggttgta 10680
cgctgctgtt ataaatggag acaggtggtt tctcaatcga tttaccacaa ctcttaatga 10740
ctttaacctt gtggctatga agtacaatta tgaacctcta acacaagacc atgttgacat 10800
actaggacct ctttctgctc aaactggaat tgccgtttta gatatgtgtg cttcattaaa 10860
agaattactg caaaatggta tgaatggacg taccatattg ggtagtgctt tattagaaga 10920
tgaatttaca ccttttgatg ttgttagaca atgctcaggt gttactttcc aaagtgcagt 10980
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agttttagtc cagagtactc aatggtcttt gttctttttt ttgtatgaaa atgccttttt 11100
accttttgct atgggtatta ttgctatgtc tgcttttgca atgatgtttg tcaaacataa 11160
gcatgcattt ctctgtttgt ttttgttacc ttctcttgcc actgtagctt attttaatat 11220
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tagtttgtct ggttttaagc taaaagactg tgttatgtat gcatcagctg tagtgttact 11340
aatccttatg acagcaagaa ctgtgtatga tgatggtgct aggagagtgt ggacacttat 11400
gaatgtcttg acactcgttt ataaagttta ttatggtaat gctttagatc aagccatttc 11460
catgtgggct cttataatct ctgttacttc taactactca ggtgtagtta caactgtcat 11520
gtttttggcc agaggtattg tttttatgtg tgttgagtat tgccctattt tcttcataac 11580
tggtaataca cttcagtgta taatgctagt ttattgtttc ttaggctatt tttgtacttg 11640
ttactttggc ctcttttgtt tactcaaccg ctactttaga ctgactcttg gtgtttatga 11700
ttacttagtt tctacacagg agtttagata tatgaattca cagggactac tcccacccaa 11760
gaatagcata gatgccttca aactcaacat taaattgttg ggtgttggtg gcaaaccttg 11820
tatcaaagta gccactgtac agtctaaaat gtcagatgta aagtgcacat cagtagtctt 11880
actctcagtt ttgcaacaac tcagagtaga atcatcatct aaattgtggg ctcaatgtgt 11940
ccagttacac aatgacattc tcttagctaa agatactact gaagcctttg aaaaaatggt 12000
ttcactactt tctgttttgc tttccatgca gggtgctgta gacataaaca agctttgtga 12060
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tgtcatacca gactataaca catataaaaa tacgtgtgat ggtacaacat ttacttatgc 12540
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 106
tcaggtggtc tcgaggaact atatcctcga ccaattctca tgtttg 46
<210> 107
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 107
tcaggtggtc tcggcgatga gctcggactt c 31
<210> 108
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
tcaggtggtc tcgtcgctaa taacgctttc ccgaattcga gc 42
<210> 109
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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tcaggtggtc tcggcttata tagacctccc acc 33
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<211> 47
<212> DNA
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<223> 合成构建体
<400> 110
tcaggtggtc tcgaagcaga taatacgact cactattatt aaaggtt 47
<210> 111
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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tcaggtggtc tcgaaccttc tccaacaaca cc 32
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 112
tcaggtggtc tccggttccg aaggtcttaa tgacaacctt cttgaaatac 50
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<211> 32
<212> DNA
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<223> 合成构建体
<400> 113
tcaggtggtc tcccttgctc ttcttcaggt tg 32
<210> 114
<211> 49
<212> DNA
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<223> 合成构建体
<400> 114
tcaggtggtc tcccaagaag aagattggtt agatgatgat agtcaacaa 49
<210> 115
<211> 32
<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 115
tcaggtggtc tccataggaa ccagcaagtg ag 32
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<211> 39
<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 116
tcaggtggtc tcgctataaa gattggtcct attctggac 39
<210> 117
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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tcaggtggtc tcgtttagat cttcgcaggc a 31
<210> 118
<211> 39
<212> DNA
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<223> 合成构建体
<400> 118
tcaggtggtc tcctaaaacc agtctctgaa gaagtagtg 39
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<211> 36
<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
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tcaggtggtc tcccatcaga cactaatgcc tgatct 36
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<212> DNA
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<223> 合成构建体
<400> 120
tcaggtggtc tccgatgttg gtgatagtgc gg 32
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<211> 37
<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 121
tcaggtggtc tcctaaataa cagaataaac accaggt 37
<210> 122
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 122
tcaggtggtc tcgtttactt gtacttgaca ttttatctta ctaatgatgt ttct 54
<210> 123
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 123
tcaggtggtc tcgagagaag gtaacaaaaa caaaca 36
<210> 124
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 124
tcaggtggtc tcgctcttgc cactgtagct tattttaata tggtctat 48
<210> 125
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
tcaggtggtc tcgagtacaa acctacctcc ctttgttgtg tt 42
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 126
tcaggtggtc tcctacttgc actgttatcc ga 32
<210> 127
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
tcaggtggtc tccggtggga acactgtaga gaataaaaca ttaaagtt 48
<210> 128
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 128
tcaggtggtc tcgcacctac aagttttgga cc 32
<210> 129
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 129
tcaggtggtc tcgtcataag tgtaccatct gtttttacga 40
<210> 130
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 130
tcaggtggtc tccatgattg aacggttcgt gt 32
<210> 131
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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tcaggtggtc tccaccaaag cactcacagt gtca 34
<210> 132
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 132
tcaggtggtc tcgtggttta tgataataag cttaaagcac 40
<210> 133
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 133
tcaggtggtc tcgcaattcc aaaataggca tacac 35
<210> 134
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 134
tcaggtggtc tccattgcaa tgtcgataga tatcctgcta a 41
<210> 135
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 135
tcaggtggtc tccgcgacat tcatcattat gcc 33
<210> 136
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 136
tcaggtggtc tcgtcgcaaa atatactcaa ctgtgtcaat atttaaacac 50
<210> 137
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 137
tcaggtggtc tcgtcattat attttaatag aaaagtccta ggttga 46
<210> 138
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 138
tcaggtggtc tcgatgaaaa tggaaccatt acagat 36
<210> 139
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 139
tcaggtggtc tcgtgcttgg ttttgatgga tctgg 35
<210> 140
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 140
tcaggtggtc tcgagcaaga ggtcatttat tgaagatct 39
<210> 141
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 141
tcaggtggtc tcgtttttga gggttatgat tttgga 36
<210> 142
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 142
tcaggtggtc tccaaaagag atggcaacta gcactctcca aggg 44
<210> 143
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 143
tcaggtggtc tcctgtcact tactgtacaa gcaaagc 37
<210> 144
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 144
tcaggtggtc tcggacaaca gatgtttcat ctcgttgact t 41
<210> 145
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 145
tcaggtggtc tcgtctgctc ccttctgcgt agaag 35
<210> 146
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 146
tcaggtggtc tcgcagaggc ggcagtcaag c 31
<210> 147
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 147
tcaggtggtc tcgtcctcct ttcagcaaaa aacc 34
<210> 148
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 148
gtccgagctc atcgctaata acgctttccc gaattcgagc 40
<210> 149
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 149
gctcgaattc gggaaagcgt tattagcgat gagctcggac 40
<210> 150
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 150
cgtctcaagt gtaccaagtc ttctcgacca attctcatgt ttgacag 47
<210> 151
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 151
aaggaaaaaa gcggccgccc gggccg 26
<210> 152
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 152
aaggaaaaaa gcggccgctc gaccaattct catgtttgac agc 43
<210> 153
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 153
ctcacccagg gattggctga tacgaaaaac atattctc 38
<210> 154
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 154
gagaatatgt ttttcgtatc agccaatccc tgggtgag 38
<210> 155
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 155
cttacgtgcc gatcaacgac tcattttcgc caaaagttgg 40
<210> 156
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 156
ccaacttttg gcgaaaatga gtcgttgatc ggcacgtaag 40
<210> 157
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 157
ggatggctca ggcatcgtgt ctctgaaaat cgactggatc 40
<210> 158
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 158
gatccagtcg attttcagag acacgatgcc tgagccatcc 40
<210> 159
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 159
cttaacctgg acaggtcacg tgttccaact gagtgtatag 40
<210> 160
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 160
ctatacactc agttggaaca cgtgacctgt ccaggttaag 40
<210> 161
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 161
aattttgacg tcgttattag cgatgagctc ggacttcc 38
<210> 162
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 162
gaataatacg actcactata gggacgttcg tgttgtttta gatttcatct aaacg 55
<210> 163
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 163
tttttttttt tttttttttt tgtcattctc ctaagaagct attaaaatca catgg 55
<210> 164
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 164
gataatacga ctcactatag attaaaggtt tataccttcc caggtaac 48

Claims (48)

1.一种多核苷酸，其编码亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段：
其中所述多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，其被重新编码，并且
其中所述多核苷酸所编码的所述亲本SARS-CoV-2冠状病毒的所述一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的氨基酸序列保持相同，或
其中所述多核苷酸所编码的所述亲本SARS-CoV-2冠状病毒的所述一种或多种病毒蛋白或其一个或多个片段的氨基酸序列包含至多20个氨基酸取代、添加或缺失。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述亲本SARS-CoV-2冠状病毒是野生型SARS-CoV-2。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述亲本SARS-CoV-2冠状病毒是天然分离株SARS-CoV-2。
4.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述亲本SARS-CoV-2冠状病毒是具有GenBank登录号MN985325.1的核酸序列的SARS-CoV-2冠状病毒的华盛顿分离株。
5.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述亲本SARS-CoV-2冠状病毒是SARS-CoV-2冠状病毒的BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019分离株(SEQ ID NO:1)。
6.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述亲本SARS-CoV-2冠状病毒是SARS-CoV-2变体。
7.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述亲本SARS-CoV-2冠状病毒是选自由英国变体、南非变体和巴西变体组成的组的SARS-CoV-2变体。
8.如权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，通过减少密码子对偏好(CPB)或减少密码子使用偏好来重新编码。
9.如权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，通过增加CpG或UpA二核苷酸的数目来重新编码。
10.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述重新编码的一种或多种病毒蛋白中的每一种或所述重新编码病毒蛋白的一个或多个片段中的每一个具有小于-0.05、小于-0.1、小于-0.2、小于-0.3或小于-0.4的密码子对偏好。
11.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，被CPB去优化。
12.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒多核苷酸相比，被密码子去优化。
13.如权利要求11-12中任一项所述的多核苷酸，其中所述密码子去优化或CPB去优化基于人中频繁使用的密码子或CPB。
14.如权利要求11-12中任一项所述的多核苷酸，其中所述密码子去优化或CPB去优化基于冠状病毒中频繁使用的密码子或CPB。
15.如权利要求11-12中任一项所述的多核苷酸，其中所述密码子去优化或CPB去优化基于SARS-CoV-2冠状病毒中频繁使用的密码子或CPB。
16.如权利要求11-12中任一项所述的多核苷酸，其中所述密码子去优化或CPB去优化基于野生型SARS-CoV-2冠状病毒中频繁使用的密码子或CPB。
17.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其包含选自RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)、RdRP的片段、刺突蛋白、刺突蛋白的片段和它们的组合的重新编码的核苷酸序列。
18.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其包含至少一个选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的bp 11294-12709、bp14641-15903、bp 21656-22306、bp 22505-23905和bp24110-25381的CPB去优化区域。
19.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其包含重新编码的刺突蛋白或刺突蛋白的片段，其中弗林蛋白酶裂解位点被消除。
20.如权利要求1所述的多核苷酸，其具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:7的核苷酸1-29,834。
21.如权利要求20所述的多核苷酸，其在3'端上还包含一个或多个连续腺嘌呤。
22.如权利要求1所述的多核苷酸，其具有SEQ ID NO:3。
23.一种细菌人工染色体(BAC)，其包含如权利要求1-22中任一项所述的多核苷酸。
24.一种载体，其包含如权利要求1-22中任一项所述的多核苷酸。
25.一种细胞，其包含如权利要求1-22中任一项所述的多核苷酸、如权利要求23所述的BAC或如权利要求24所述的载体。
26.如权利要求25所述的细胞，其中所述细胞是Vero细胞或幼仓鼠肾(BHK)细胞。
27.一种多肽，其由如权利要求1-22中任一项所述的多核苷酸编码。
28.一种修饰的SARS-CoV-2冠状病毒，其包含如权利要求1-22中任一项所述的多核苷酸。
29.一种修饰的SARS-CoV-2冠状病毒，其包含由如权利要求1-22中任一项所述的多核苷酸编码的多肽。
30.如权利要求28或权利要求29所述的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒，其中其病毒蛋白中的一种或多种的表达与其亲本SARS-CoV-2冠状病毒相比是降低的。
31.如权利要求28-30中任一项所述的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒，其中其病毒蛋白中的一种或多种的表达降低由于重新编码选自RdRP、刺突蛋白和它们的组合的区域而减少。
32.一种修饰的SARS-CoV-2冠状病毒，其包含具有SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834或SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834和3'端上的一个或多个连续腺嘌呤的多核苷酸。
33.一种修饰的SARS-CoV-2冠状病毒，其包含由具有SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834或SEQ ID NO:4的核苷酸1-29,834和3'端上的一个或多个连续腺嘌呤的多核苷酸编码的多肽。
34.一种用于诱导受试者中保护性免疫反应的疫苗组合物，其包含：
如权利要求28-33中任一项所述的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒。
35.如权利要求34所述的疫苗组合物，其还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
36.一种用于引发受试者中免疫反应的免疫组合物，其包含：
如权利要求28-33中任一项所述的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒。
37.如权利要求36所述的免疫组合物，其还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
38.一种引发受试者中免疫反应的方法，其包括：
向所述受试者施用一剂：
如权利要求28-33中任一项所述的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒，或
如权利要求34或权利要求35所述的疫苗组合物，或
如权利要求36或权利要求37所述的免疫组合物。
39.一种引发受试者中免疫反应的方法，其包括：
向所述受试者施用初始剂量的如权利要求28-33中任一项所述的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、或如权利要求34或权利要求35所述的疫苗组合物、或如权利要求36或权利要求37所述的免疫组合物；以及
向所述受试者施用一个或多个加强剂量的如权利要求28-33中任一项所述的修饰的SARS-CoV-2冠状病毒、或如权利要求34或权利要求35所述的疫苗组合物、或如权利要求36或权利要求37所述的免疫组合物。
40.如权利要求38-39中任一项所述的方法，其中所述免疫反应是保护性免疫反应。
41.如权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述剂量是预防有效或治疗有效剂量。
42.如权利要求38-41中任一项所述的方法，其中施用经由经鼻途径进行。
43.如权利要求38-41中任一项所述的方法，其中施用经由鼻用滴剂进行。
44.如权利要求38-41中任一项所述的方法，其中施用经由鼻用喷雾进行。
45.如权利要求38-45中任一项所述的方法，其中所述剂量为约104-106PFU，或所述初始剂量为约104-106PFU并且所述一个或多个加强剂量为约104-106PFU。
46.一种制备修饰的SARS-CoV-2冠状病毒的方法，其包括：
获得编码亲本SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种蛋白或其一个或多个片段的核苷酸序列；
重新编码所述核苷酸序列以降低所述一种或多种蛋白或其所述一个或多个片段的蛋白质表达；以及
将具有所述重新编码的核苷酸序列的核酸替换至所述亲本SARS-CoV-2冠状病毒基因组中以制备所述修饰的SARS-CoV-2冠状病毒基因组，
其中所述重新编码的核苷酸序列的表达与所述亲本病毒相比是降低的。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述亲本SARS-CoV-2冠状病毒序列是野生型(wt)病毒核酸。
48.如权利要求46所述的方法，其中所述修饰的SARS-CoV-2冠状病毒是权利要求28-33中的任一项。
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