JP2023519640A - 脱最適化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ならびにその方法および使用 - Google Patents
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Abstract
改変型SARS-CoV-2コロナウイルスが本明細書に記載される。これらのウイルスは、再コード、例えば、コドン脱最適化またはコドンペアバイアス脱最適化されており、SARS-CoV-2コロナウイルス感染症の可能性もしくは重症度を低減させるため、SARS-CoV-2コロナウイルス感染症を予防するため、免疫応答を誘発するため、またはSARS-CoV-2コロナウイルス感染症を処置するために有用である。TIFF2023519640000087.tif62134
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年1月28日に出願された米国仮特許出願第62/966,750号、2020年7月7日に出願された同第63/048,942号、2020年9月16日に出願された同第63/079,337号、および2020年9月17日に出願された同第63/079,853号に対する35 U.S.C.§119（e）の下での優先権の主張を含み、これら仮特許出願の全体は全て、参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、2020年1月28日に出願された米国仮特許出願第62/966,750号、2020年7月7日に出願された同第63/048,942号、2020年9月16日に出願された同第63/079,337号、および2020年9月17日に出願された同第63/079,853号に対する35 U.S.C.§119（e）の下での優先権の主張を含み、これら仮特許出願の全体は全て、参照により本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明は、改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、免疫応答を誘発するための組成物、ならびに保護免疫、予防および処置を提供するためのワクチンに関する。
本発明は、改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、免疫応答を誘発するための組成物、ならびに保護免疫、予防および処置を提供するためのワクチンに関する。
背景
全ての刊行物は、各個々の刊行物または特許出願が参照により組み入れられることを具体的かつ個々に示されたのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み入れられる。以下の記載は、本発明の理解において有用であり得る情報を含む。それは、本明細書において提供される情報のいずれかが先行技術もしくは現在クレームされる発明に関連すること、または特にもしくは暗黙的に参照される任意の刊行物が先行技術であることの承認ではない。
全ての刊行物は、各個々の刊行物または特許出願が参照により組み入れられることを具体的かつ個々に示されたのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み入れられる。以下の記載は、本発明の理解において有用であり得る情報を含む。それは、本明細書において提供される情報のいずれかが先行技術もしくは現在クレームされる発明に関連すること、または特にもしくは暗黙的に参照される任意の刊行物が先行技術であることの承認ではない。
新規のコロナウイルスの大流行が、中国華中地方の武漢市において2019年12月中旬に同定された。2019-nCoVと以前に呼称され（武漢コロナウイルスとしても以前に知られていた）、現在はSARS-CoV-2と呼称されるコロナウイルスの新たな株が同定された。致死的なコロナウイルスはWHOによりパンデミックとして宣言された。このウイルスの公衆衛生上の危機は急速に拡大し、2020年1月末時点における数十人の死者および千人を超える感染者から、2020年9月初頭時点における900,000人を超える死者および2800万人を超える感染者、そして2021年1月最終週時点における200万人を超える死者および1億人を超える感染者までになった。SARS-CoV-2ウイルスは特に、高齢者ならびに基礎となる医学的状態、例えば、慢性腎臓疾患、慢性閉塞性肺疾患、臓器移植からの免疫不全、肥満症、重篤な心臓状態、鎌状赤血球疾患および2型糖尿病を有する者にとって危険である。よって、予防的および治療的処置が非常に、そして緊急に必要とされている。
以下の態様およびその局面は、範囲を限定することなく例示的および実例的であることが意図される組成物および方法と組み合わせて、記載および説明される。
本発明の様々な態様は、親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片をコードするポリヌクレオチドであって、
前記ポリヌクレオチドが、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、再コードされており、かつ
前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記親SARS-CoV-2コロナウイルスの前記1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列が同じままであるか、あるいは
前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記親SARS-CoV-2コロナウイルスの前記1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列が、最大20アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む、前記ポリヌクレオチドを提供する。
前記ポリヌクレオチドが、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、再コードされており、かつ
前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記親SARS-CoV-2コロナウイルスの前記1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列が同じままであるか、あるいは
前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記親SARS-CoV-2コロナウイルスの前記1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列が、最大20アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む、前記ポリヌクレオチドを提供する。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、野生型SARS-CoV-2であり得る。様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、天然分離株SARS-CoV-2であり得る。様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、GenBankアクセッション番号MN985325.1の核酸配列を有するSARS-CoV-2コロナウイルスのワシントン分離株であり得る。様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、SARS-CoV-2コロナウイルスのBetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019分離株（SEQ ID NO:1）であり得る。様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、SARS-CoV-2バリアントであり得る。様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、英国バリアント、南アフリカバリアント、およびブラジルバリアントからなる群より選択されるSARS-CoV-2バリアントであり得る。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、コドンペアバイアス（CPB）を低減させることまたはコドン使用頻度バイアスを低減させることにより再コードされ得る。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、CpGまたはUpAジヌクレオチドの数を増加させることにより再コードされ得る。様々な態様において、再コードされた1つもしくは複数のウイルスタンパク質の各々、または再コードされた1つもしくは複数のその断片の各々は、-0.05より低い、-0.1より低い、-0.2より低い、-0.3より低い、または-0.4より低いコドンペアバイアスを有し得る。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、CPB脱最適化され得る。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、コドン脱最適化され得る。
様々な態様において、コドン脱最適化またはCPB脱最適化は、ヒトにおいて頻繁に使用されるコドンまたはCPBに基づき得る。様々な態様において、コドン脱最適化またはCPB脱最適化は、コロナウイルスにおいて頻繁に使用されるコドンまたはCPBに基づき得る。様々な態様において、コドン脱最適化またはCPB脱最適化は、SARS-CoV-2コロナウイルスにおいて頻繁に使用されるコドンまたはCPBに基づき得る。様々な態様において、コドン脱最適化またはCPB脱最適化は、野生型SARS-CoV-2コロナウイルスにおいて頻繁に使用されるコドンまたはCPBに基づき得る。
様々な態様において、再コードされたヌクレオチド配列は、RNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRP）、RdRPの断片、スパイクタンパク質、スパイクタンパク質の断片、およびこれらの組合せから選択され得る。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のbp 11294～12709、bp 14641～15903、bp 21656～22306、bp 22505～23905、およびbp 24110～25381から選択され得る少なくとも1つのCPB脱最適化された領域を含み得る。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、再コードされたスパイクタンパク質またはスパイクタンパク質の断片を含み得、フューリン切断部位は排除され得る。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834、SEQ ID NO:7、またはSEQ ID NO:7のヌクレオチド1～29,834の、ヌクレオチド配列を含み得る。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、3’末端における1つまたは複数の連続するアデニンをさらに含み得る。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を含み得る。
本発明の様々な態様は、本発明の再コードされたポリヌクレオチドのいずれか1つを含む、細菌人工染色体（BAC）を提供する。
本発明の様々な態様は、本発明の再コードされたポリヌクレオチドのいずれか1つを含む、ベクターを提供する。
本発明の様々な態様は、本発明の再コードされたポリヌクレオチドのいずれか1つ、本発明のBACのいずれか1つ、または本発明のベクターのいずれか1つを含む、細胞を提供する。様々な態様において、前記細胞は、Vero細胞またはベビーハムスター腎臓（BHK）細胞であり得る。
本発明の様々な態様は、本発明の再コードされたポリヌクレオチドのいずれか1つによりコードされる、ポリペプチドを提供する。
本発明の様々な態様は、本発明の再コードされたポリヌクレオチドのいずれか1つを含む、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスを提供する。
本発明の様々な態様は、本発明の再コードされたポリヌクレオチドのいずれか1つによりコードされる本発明のポリペプチドのいずれか1つを含む、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスを提供する。
様々な態様において、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのいずれか1つにおける1つまたは複数のウイルスタンパク質の発現は、その親SARS-CoV-2コロナウイルスと比較して、低減され得る。
様々な態様において、そのウイルスタンパク質のうちの1つまたは複数の発現における低減は、RdRP、スパイクタンパク質およびこれらの組合せから選択される領域を再コードすることの結果として低減され得る。
様々な態様において、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは、SEQ ID NO:4、またはSEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834、またはSEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834および3’末端における1つもしくは複数の連続するアデニンを有するポリヌクレオチドを含み得る。
様々な態様において、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは、SEQ ID NO:4、またはSEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834、またはSEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834および3’末端における1つもしくは複数の連続するアデニンを有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含み得る。
本発明の様々な態様は、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのいずれか1つを含む、対象において保護免疫応答を誘導するためのワクチン組成物を提供する。様々な態様において、ワクチン組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含み得る。
本発明の様々な態様は、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのいずれか1つを含む、対象において免疫応答を誘発するための免疫組成物を提供する。様々な態様において、免疫組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含み得る。
本発明の様々な態様は、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのいずれか1つ、または本発明のワクチン組成物のいずれか1つ、または本発明の免疫組成物のいずれか1つの、ある用量を、対象に投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘発する方法を提供する。
本発明の様々な態様は、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのいずれか1つ、または本発明のワクチン組成物のいずれか1つ、または本発明の免疫組成物のいずれか1つの、プライム用量を、対象に投与する工程；および、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのいずれか1つ、または本発明のワクチン組成物のいずれか1つ、または本発明の免疫組成物のいずれか1つの、1つまたは複数のブースト用量を、対象に投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘発する方法を提供する。
様々な態様において、免疫応答は、保護免疫応答である。
様々な態様において、用量は、予防有効用量または治療有効用量であり得る。様々な態様において、用量は約104～106 PFUであり得るか、または、プライム用量は約104～106 PFUであり得、かつ1つまたは複数のブースト用量は約104～106 PFUであり得る。
様々な態様において、投与する工程は経鼻経路を介し得る。様々な態様において、投与する工程は点鼻を介し得る。様々な態様において、投与する工程は経鼻スプレーを介し得る。
本発明の様々な態様は、免疫応答の誘発における使用のための、またはCOVID-19の治療的もしくは予防的処置のための、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物を提供する。
本発明の様々な態様は、免疫応答の誘発のため、またはCOVID-19の治療的もしくは予防的処置における使用のためであって、前記使用が、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、または本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物の、プライム用量、および本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、または本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物の、1つまたは複数のブースト用量を含む、前記使用のための本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物を提供する。
本発明の様々な態様は、免疫応答を誘発するための、またはCOVID-19の治療的もしくは予防的処置のための、医薬の製造における本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物の使用を提供する。
本発明の様々な態様は、免疫応答の誘発のための、またはCOVID-19の治療的もしくは予防的処置における使用のための、医薬の製造における本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物の使用であって、前記医薬が、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、または本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物の、プライム用量、および本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、または本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物の、1つまたは複数のブースト用量を含む、前記使用を提供する。
本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは、本明細書に記載される改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのいずれか1つである。本発明のワクチン組成物は、本明細書に記載されるワクチン組成物のいずれか1つである。本発明の免疫組成物は、本明細書に記載される免疫組成物のいずれか1つである。様々な態様において、免疫応答は保護免疫応答である。
本発明の様々な態様は、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスを製造する方法であって、以下：
親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のタンパク質または1つもしくは複数のその断片をコードするヌクレオチド配列を得る工程；
前記1つもしくは複数のタンパク質または1つもしくは複数のその断片のタンパク質発現を低減させるために、前記ヌクレオチド配列を再コードする工程；および、
前記改変型SARS-CoV-2コロナウイルスゲノムを製造するために、前記再コードされたヌクレオチド配列を有する核酸で前記親SARS-CoV-2コロナウイルスゲノムを置換する工程
を含み、
前記再コードされたヌクレオチド配列の発現が、親ウイルスと比較して、低減されている、前記方法を提供する。
親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のタンパク質または1つもしくは複数のその断片をコードするヌクレオチド配列を得る工程；
前記1つもしくは複数のタンパク質または1つもしくは複数のその断片のタンパク質発現を低減させるために、前記ヌクレオチド配列を再コードする工程；および、
前記改変型SARS-CoV-2コロナウイルスゲノムを製造するために、前記再コードされたヌクレオチド配列を有する核酸で前記親SARS-CoV-2コロナウイルスゲノムを置換する工程
を含み、
前記再コードされたヌクレオチド配列の発現が、親ウイルスと比較して、低減されている、前記方法を提供する。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルス配列は、野生型（wt）ウイルス核酸、または天然分離株のものであり得る。
様々な態様において、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのいずれか1つである。
本発明の他の特色および利点は、本発明の態様の様々な特色を例によって説明する、添付の図と組み合わせて解釈される以下の詳細な説明から明らかとなる。
例示的な態様が、参照される図面において図示される。本明細書に開示される態様および図面は、制限的ではなく実例的なものと考えられるべきであることが意図される。
発明の説明
本明細書において参照される全ての参考文献は、全体的に記載されたのと同様に、それらの全体が参照により組み入れられる。他に定義されなければ、本明細書において使用される科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed.,Revised,J.Wiley＆Sons（New York,NY 2006）;March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 7th ed.,J.Wiley＆Sons（New York,NY 2013）;および Sambrook and Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press（Cold Spring Harbor,NY 2012）は、本出願において使用される用語の多くの一般的なガイドを当業者に提供する。
本明細書において参照される全ての参考文献は、全体的に記載されたのと同様に、それらの全体が参照により組み入れられる。他に定義されなければ、本明細書において使用される科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed.,Revised,J.Wiley＆Sons（New York,NY 2006）;March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 7th ed.,J.Wiley＆Sons（New York,NY 2013）;および Sambrook and Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press（Cold Spring Harbor,NY 2012）は、本出願において使用される用語の多くの一般的なガイドを当業者に提供する。
当業者は、本発明の実施において使用され得る、本明細書に記載のものと類似または同等の多くの方法および材料を認識するであろう。実際に、本発明は、記載される方法および材料に何ら限定されない。本発明の目的のために、以下の用語が以下において定義される。
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、参照される数値的表示との繋がりで使用される場合、本明細書において他に特に提供されなければ、参照される数値的表示に、その参照される数値的表示の最大5％をプラスまたはマイナスしたものを意味する。例えば、「約50％」という表現は45％～55％の範囲をカバーする。様々な態様において、「約」という用語は、参照される数値的表示との繋がりで使用される場合、請求項において特に提供される場合、参照される数値的表示に、その参照される数値的表示の最大4％、3％、2％、1％、または0.5％をプラスまたはマイナスしたものを意味し得る。
「親ウイルス」は、本明細書において使用される場合、再コードされたヌクレオチド配列が、同じまたは類似したアミノ酸配列をコードすることについて比較される、参照ウイルスを指す。
「武漢コロナウイルス」および「SARS-CoV-2」および「2019-nCoV」は、本明細書において使用される場合、交換可能であり、COVID-19を引き起こす野生型配列、天然分離株配列、または野生型配列もしくは天然分離株配列の突然変異体形態を有するコロナウイルスを指す。突然変異体形態は、ウイルスの複製サイクルを通じて天然に、または遺伝子操作を通じて生じる。
「SARS-CoV-2バリアント」は、本明細書において使用される場合、複製の際および/または宿主（例えばヒト）の間の伝染の際に、ウイルスの複製サイクルを通じて天然に発生したSARS-CoV-2の突然変異体形態を指す。SARS-CoV-2バリアントの例としては、英国バリアント（20I/501Y.V1、VOC 202012/01、またはB.1.1.7としても公知）、南アフリカバリアント（20H/501Y.V2またはB.1.351としても公知）、およびブラジルバリアント（P.1としても公知）が挙げられるがこれらに限定されない。
「天然分離株」は、SARS-CoV-2に関して本明細書において使用される場合、宿主（例えば、ヒト、コウモリ、ネコ、ブタ、もしくは任意の他の宿主）または天然の保因源から単離されたSARS-CoV-2などのウイルスを指す。天然分離株の配列は、同一であるか、または複製の際および/もしくは宿主（例えばヒト）の間の伝染の際に、ウイルスの複製サイクルを通じて天然に生じた突然変異を有し得る。
「武漢コロナウイルス分離株」は、本明細書において使用される場合、2020年1月10日に提出された、アクセッションID:EPI＿ISL＿402119を有するSARS-CoV-2の野生型分離株を指し、これはBetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019、SEQ ID NO:1としても参照され、全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる。
「Washingtonコロナウイルス分離株」は、本明細書において使用される場合、2020年7月5日時点のGenBankアクセッション番号MN985325.1を有するSARS-CoV-2の野生型分離株を指し、これは全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる。
「頻繁に使用されるコドン」または「コドン使用頻度バイアス」は、本明細書において使用される場合、特定の種、例えば、ヒト、コロナウイルス、またはSARS-CoV-2のための、コーディングDNAにおける同義コドンの出現の頻度における差異を指す。
「コドンペアバイアス」は、本明細書において使用される場合、特定の種、例えば、ヒト、コロナウイルス、またはSARS-CoV-2において、統計的に予測されるよりも高いまたは低い頻度で使用される、同義コドンペアを指す。
「対象」は、本明細書において使用される場合、任意の動物または人工的に改変された動物を意味する。動物としては、ヒト、非ヒト霊長動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、齧歯動物、例えばマウス、ラットおよびモルモット、コウモリ、ヘビ、ならびに鳥が挙げられるがこれらに限定されない。人工的に改変された動物としては、ヒト免疫系を有するSCIDマウスが挙げられるがこれに限定されない。好ましい態様において、対象はヒトである。
「ウイルス宿主」は、ウイルスが感染できる任意の動物または人工的に改変された動物を意味する。動物としては、ヒト、非ヒト霊長動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、齧歯動物、例えばマウス、ラットおよびモルモット、ならびに鳥が挙げられるがこれらに限定されない。人工的に改変された動物としては、ヒト免疫系を有するSCIDマウスが挙げられるがこれに限定されない。様々な態様において、ウイルス宿主は哺乳動物である。様々な態様において、ウイルス宿主は霊長動物である。様々な態様において、ウイルス宿主はヒトである。鳥の態様は、家畜化された家禽種であり、これにはニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、およびガチョウが含まれるがこれらに限定されない。
「予防有効用量」は、ウイルス感染症に罹りやすいまたはウイルス関連障害に罹患しやすい対象に投与された場合に、ウイルスに感染することまたは障害に罹患することから対象を保護する免疫応答を対象において誘導する、ワクチンまたはウイルス組成物の任意の量である。対象を「保護」することは、少なくとも2倍、好ましくは少なくとも10倍、25倍、50倍、または100倍、対象がウイルスに感染する可能性を低減させ、または対象において障害の開始の可能性を低下させることを意味する。例えば、対象がウイルスに感染する1％の可能性を有する場合、対象がウイルスに感染する可能性における2倍の低減は、ウイルスに感染する0.5％の可能性を対象が有することを結果としてもたらす。
本明細書において使用される場合、「治療有効用量」は、ワクチンが有効である障害に罹患した対象に投与された場合に、対象が障害および/またはその症状の低減、軽快または退縮を経験することを引き起こす免疫応答を対象において誘導する、ワクチンまたはウイルス組成物の任意の量である。好ましい態様において、障害および/またはその症状の再発が予防される。他の好ましい態様において、対象は障害および/またはその症状を治癒される。
本免疫化および治療方法のいずれかのある特定の態様は、対象に少なくとも1つのアジュバントを投与する工程をさらに含む。「アジュバント」は、対象において抗原の免疫原性を増強し、免疫応答を増強するために好適な任意の剤を意味する。タンパク質ベースおよび核酸ベースの両方の、ワクチンとの使用のために好適な、粒子状アジュバントを含む多数のアジュバント、ならびにアジュバントを抗原と組み合わせる方法は、当業者に周知である。核酸ベースのワクチンのための好適なアジュバントとしては、Quil A、イミキモド、レシキモド、および精製されたタンパク質または核酸の形態で送達されるインターロイキン-12が挙げられるがこれらに限定されない。タンパク質免疫化との使用のために好適なアジュバントとしては、ミョウバン、フロイント不完全アジュバント（FIA）、サポニン、Quil A、およびQS-21が挙げられるがこれらに限定されない。
その遺伝子が再コードされている、例えば、コドン脱最適化されているまたはコドンペアバイアス脱最適化されている、SARS-CoV-2ウイルスが、本明細書に記載される。様々な態様において、本発明のSARS-CoV-2ウイルスのウイルスタンパク質は、その親SARS-CoV-2ウイルスと同じアミノ酸配列を有するが、ヌクレオチド配列が再コードされている。本発明によるヌクレオチド配列の再コーディングは、低減されたタンパク質発現、弱毒化、またはその両方を結果としてもたらす。これらの再コードされたSARS-CoV-2ウイルスは、ワクチンとして、および特に、生弱毒化ワクチンとしての使用のためのワクチンとして有用である。
本発明者らは、合成され高度に弱毒化された生ワクチン候補、COVI-VAC（CDX-005としても参照される；例えば、SEQ ID NO:4））を、wt SARS-CoV-2から生成した。いかなる特定の理論によっても縛られることを望まないが、最も可能性の高い弱毒化の機序は翻訳の緩慢化であると考えられ、ミスフォールディングしたタンパク質に繋がる翻訳におけるエラー、RNA二次構造における変化、または調節シグナルの変化を通じ、これらは全て、低減されたタンパク質産生に寄与し得ると考えている。どのような機序であれ、弱毒化されたCOVI-VACウイルスは、あらゆるウイルス抗原をそのwt形態で提示して、広い免疫応答の潜在能力を提供し、標的株において遺伝学的ドリフトがある場合であっても、有効性を保持する可能性を高くしている。数百のサイレント（同義）突然変異が表現型に寄与するため、COVI-VACは病原性への復帰に対して、高度に抵抗性であることが予測される。後期継代ウイルスのバルクシークエンシングによる評価およびフューリン切断部位における潜在的な変化の評価で、ワクチンが安定であることを、本発明者らの復帰試験は示している。
本発明者らのハムスター研究は、COVI-VACがこれらの動物において安全であることを実証する。それは高度に弱毒化されており、肺および嗅球においてより低い総ウイルス負荷を誘導し、脳においてそれを完全に妨げ、wt WA1の場合よりもCOVI-VACを接種された動物の肺において、より低い生ウイルス負荷を誘導する。wtウイルスとは異なり、COVI-VACは、接種されたハムスターにおいて、体重喪失も重大な肺病理も誘導しなかった。
COVI-VACが、SARS CoV-2から有効に保護することもまた、前記ハムスター研究は示唆する。それが血清IgGおよび中和Abの誘導においてwtウイルスと同様に有効であることを、Ab力価の評価は実証する。それは、wtのチャレンジに対して保護的であり；COVI-VACの接種は、より低い肺ウイルス力価と、脳におけるウイルスからの完全な保護とに繋がる。COVI-VACを接種されたハムスターはまた、ビヒクル接種動物において観察された体重喪失を、呈することはなかった。さらに、疾患増強の証拠もない。
以上を合わせると、COVI-VACは、動物およびヒトにおける使用のために現在開発されている弱毒生ワクチンの重要な新たなクラスの部分であることを本発明者らのデータは示す。それは、ネイティブなアミノ酸配列に類似した全てのウイルス抗原を提示し、鼻腔内に投与することができ、単回用量で小動物モデルにおいて安全かつ有効であり、復帰に対して抵抗性であり、許容的な温度において高い力価まで増殖させることができる。ヒトにおけるその安全性および有効性を試験するための臨床試験が現在行われている。
脱最適化されたCDX-005（例えば、SEQ ID NO:4）およびCDX-007（例えば、SEQ ID NO:7）弱毒生ワクチン候補を構築するために、最初に野生型WA1ドナーウイルスのゲノムをインシリコでパーシングして、19のオーバーラップする断片とした。各断片は、各隣接する断片と約200bpの配列オーバーラップを共有する。F1～F19を、野生型WA1ウイルスRNAのcDNAからRT-PCRにより生成した。断片の配列をサンガーシークエンシングにより確認した。次にWT WA1ウイルスの断片16を、脱最適化されたスパイク遺伝子配列を有する断片16に交換して、CDX-005のcDNAゲノムを生成した。同様に、WT WA1ウイルスの断片14を、脱最適化されたスパイク遺伝子配列を有する断片14に交換して、CDX-007のcDNAゲノムを生成した。
様々な態様において、RT-PCRを介する、約50～300bpのオーバーラップを各々有する小さい断片への標的親ウイルスの分子パーシングおよびこれらの任意の断片の交換は、任意のコドン、またはコドンペア脱最適化されたウイルスのcDNAゲノムまたはゲノム断片を構築するために使用され得るプロセスである。脱最適化されたカセットを有するこのcDNAゲノムを次に使用して、リバースジェネティクスを介して脱最適化されたウイルスを回収することができる。
CDX-005およびCDX-007について、以前に報告されたWA1配列（Vero細胞継代4）と比較して、本発明者らのWA1ドナーウイルスの配列（Vero細胞継代6）において1つの顕著な差異を同定した。BEI Resourcesから受領したWA1ウイルスのCodagenixにおけるVero E6細胞での2回の追加のWA1ウイルス継代の間に、36ntの欠失がスパイク遺伝子（ゲノム位置23594～23629）中で起こった。欠失は、多塩基のフューリン切断部位を含む、12アミノ酸
を包含する。SARS-CoV2スパイク中のフューリン切断部位は、ヒト宿主におけるSARS-CoV2の高度に病原性の表現型の潜在的なドライバーとして提唱されている。いかなる特定の理論によっても縛られることを望まないが、フューリン切断部の非存在は、インビトロでのVero細胞中のSARS-CoV-2ウイルス増殖に対して有益であり、欠失はVero細胞培養中の継代の間に進んだと本発明者らは考える。フューリン切断部位の非存在は、そのような突然変異を持つSARS-CoV-2ウイルスのヒト宿主中での弱毒化に寄与し得ると本発明者らはさらに考える。本発明者らはしたがって、誘導されたフューリン切断部位の欠失を本発明者らのワクチン候補CDX-005、およびCDX-007に組み込むことを決定した。フューリン切断部位の欠失はアセンブリー断片F15に位置する。
本発明は、少なくとも部分的に、上記、および本明細書に記載されるさらなる情報に基づく。
様々な態様において、本発明のSARS-CoV-2ウイルスのウイルスタンパク質は、最大約20アミノ酸の欠失、置換、または付加を有する以外は、その親SARS-CoV-2ウイルスと同じアミノ酸配列を有する。しかしながら、ヌクレオチド配列は再コードされており、これは低減されたタンパク質発現、弱毒化、またはその両方を結果としてもたらす。様々な態様において、本発明のSARS-CoV-2ウイルスのウイルスタンパク質は、最大10アミノ酸の欠失、置換、または付加を有する以外は、その親SARS-CoV-2ウイルスと同じアミノ酸配列を有し；しかしながら、ヌクレオチド配列は再コードされており、これは低減されたタンパク質発現、弱毒化、またはその両方を結果としてもたらす。様々な態様において、本発明のSARS-CoV-2ウイルスのウイルスタンパク質は、1～5アミノ酸の欠失、置換、または付加を有する以外は、その親SARS-CoV-2ウイルスと同じアミノ酸配列を有する。様々な態様において、本発明のSARS-CoV-2ウイルスのウイルスタンパク質は、6～10アミノ酸の欠失、置換、または付加を有する以外は、その親SARS-CoV-2ウイルスと同じアミノ酸配列を有する。様々な態様において、本発明のSARS-CoV-2ウイルスのウイルスタンパク質は、その親SARS-CoV-2ウイルスと同じアミノ酸配列を有するが、11～15アミノ酸の欠失、置換、または付加を有する。様々な態様において、本発明のSARS-CoV-2ウイルスのウイルスタンパク質は、16～20アミノ酸の欠失、置換、または付加を有する以外は、その親SARS-CoV-2ウイルスと同じアミノ酸配列を有する。ここでもまた、しかしながら、ヌクレオチド配列は再コードされており、これは低減されたタンパク質発現、弱毒化、またはその両方を結果としてもたらす。様々な態様において、本発明のSARS-CoV-2ウイルスのウイルスタンパク質は、12アミノ酸の欠失、置換、または付加を有する以外は、その親SARS-CoV-2ウイルスと同じアミノ酸配列を有し；しかしながら、ヌクレオチド配列は再コードされており、これは低減されたタンパク質発現、弱毒化、またはその両方を結果としてもたらす。様々な態様において、アミノ酸の欠失、置換、または付加は、親SARS-CoV-2ウイルス配列の核酸配列のポリAテイルの前の核酸の欠失、置換または付加の結果としてもたらされる。
様々な態様において、本発明のSARS-CoV-2ウイルスのウイルスタンパク質は、12アミノ酸の欠失を有する以外は、その親SARS-CoV-2ウイルスと同じアミノ酸配列を有する。様々な態様において、本発明のSARS-CoV-2ウイルスのウイルスタンパク質は、1～5アミノ酸の欠失、または6～10アミノ酸の欠失、または11～15アミノ酸の欠失、または16～20アミノ酸の欠失を有する以外は、その親SARS-CoV-2ウイルスと同じアミノ酸配列を有する。様々な態様において、アミノ酸の欠失は、フューリン切断部位を排除するスパイクタンパク質中のものである。様々な特定の態様において、本発明のSARS-CoV-2ウイルスのウイルスタンパク質は、スパイクタンパク質上のフューリン切断部位の排除を結果としてもたらす12アミノ酸の欠失を有する以外は、その親SARS-CoV-2ウイルスと同じアミノ酸配列を有する。様々な態様において、アミノ酸の欠失、置換、または付加は、親SARS-CoV-2ウイルス配列の核酸配列のポリAテイルの前の核酸の欠失、置換または付加の結果としてもたらされる。
様々な態様において、SARS-CoV-2ウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRP）タンパク質をコードする核酸は再コードされる。他の態様において、SARS-CoV-2ウイルスのスパイクタンパク質をコードする核酸（S遺伝子としても公知）は再コードされる。さらに他の態様において、SARS-CoV-2ウイルスのRdRPおよびスパイクタンパク質の両方は再コードされる。様々な態様において、再コードされたスパイクタンパク質は、フューリン切断部位（例えば、SEQ ID NO:5を有する36ヌクレオチド）の配列を排除する、ヌクレオチドの欠失を含む。
本発明の弱毒化ウイルスのRdRPおよび/またはスパイクタンパク質コーディング配列の再コーディングは、本明細書に記載される開示に照らして当業者により為されているまたは為され得る。本発明の様々な態様によれば、ヌクレオチド置換は、RdRPおよび/またはスパイクタンパク質コーディング配列中の複数の位置において操作され、置換は複数の同義コドンをゲノムに導入する。ある特定の態様において、同義コドン置換は、ゲノム中の、コドンバイアス、コドンペアバイアス、頻度の低いコドンもしくは低い頻度で存在するコドンペアの密度、RNA二次構造、CGおよび/もしくはTA（もしくはUA）ジヌクレオチド含有量、C＋G含有量、翻訳フレームシフト部位、翻訳休止部位、microRNA認識配列の存在もしくは非存在またはこれらの任意の組合せを変更する。コドン置換は、RdRPおよび/もしくはスパイクタンパク質コーディング配列の全体を通じて分布した複数の位置、またはRdRPおよび/もしくはスパイクタンパク質コーディング配列の部分に制約された複数の位置において操作されてもよい。伴われる多数の欠陥（すなわち、ヌクレオチド置換）のため、本発明は、安定的に弱毒化されたウイルスおよび生ワクチンの製造を可能とする。
以下にさらに記載されるように、一部の態様において、ウイルスコーディング配列は、1つまたは複数のコドンを、SARS-CoV-2コロナウイルス宿主（例えば、ヒト、ヘビ、コウモリ）においてより低い頻度で使用される同義コドンで置換することにより再コードされる。一部の態様において、ウイルスコーディング配列は、1つまたは複数のコドンを、コロナウイルス（例えば、SARS-CoV-2コロナウイルス）においてより低い頻度で使用される同義コドンで置換することにより再コードされる。ある特定の態様において、同義コドンで置換されるコドンの数は少なくとも5個である。一部の態様において、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450、または500個のコドンは、宿主において低い頻度で使用される同義コドンで置換される。ある特定の態様において、改変型配列は、より低い頻度で使用される同義コドンで置換された少なくとも20個のコドンを含む。ある特定の態様において、改変型配列は、より低い頻度で使用される同義コドンで置換された少なくとも50個のコドンを含む。ある特定の態様において、改変型配列は、より低い頻度で使用される同義コドンで置換された少なくとも100個のコドンを含む。ある特定の態様において、改変型配列は、より低い頻度で使用される同義コドンで置換された少なくとも250個のコドンを含む。ある特定の態様において、改変型配列は、より低い頻度で使用される同義コドンで置換された少なくとも500個のコドンを含む。
例えば、再コードされたスパイクタンパク質について、宿主においてより低い頻度で使用される同義コドンで置換されたコドンの数は、少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、または500個のコドンである。
例えば、再コードされたRdRPタンパク質について、宿主においてより低い頻度で使用される同義コドンで置換されたコドンの数は、少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、または300個のコドンである。
一部の態様において、同義コドンの置換は、ウイルス宿主（例えば、ヒト）においてより低い頻度のもので為される。ウイルス宿主の他の例としては、上記のものが挙げられるがこれらに限定されない。一部の態様において、同義コドンの置換は、ウイルス自体（例えば、SARS-CoV-2コロナウイルス）においてより低い頻度のもので為される。
改変型配列が、親ウイルス上の対応する配列と比較して、CpGまたはUpAジヌクレオチドの数の増加を含む態様において、増加は、対応する配列と比較して、約15～55個のCpGまたはUpAジヌクレオチドの増加である。様々な態様において、増加は、対応する配列と比較して、約15、20、25、30、35、40、45、または55個のCpGまたはUpAジヌクレオチドの増加である。一部の態様において、対応する配列と比較したCpGまたはUpAジヌクレオチドの数の増加は、対応する配列と比較した約10～75、15～25、25～50、または50～75個のCpGまたはUpAジヌクレオチドである。
一部の態様において、ウイルスコドンペアは、コドンペアバイアスを低減させる（すなわち、その値を低下させる）ように再コードされる。ある特定の態様において、コドンペアバイアスは、低減され得るコドンペアスコアを有するRdRPおよび/またはスパイクコーディング配列中のコドンペアを同定することにより、およびコドンペアを、より低いコドンペアスコアを有するコドンペアで置換することによってコドンペアバイアスを低減させることにより、低減される。一部の態様において、コドンペアのこの置換は、配列の既存のコドンを再編成するという形態を取る。一部のそのような態様において、コドンペアのサブセットは、同義コドンのサブセットを再編成することにより置換される。他の態様において、コドンペアは、再編成された同義コドンの数を最大化することにより置換される。コドンの再編成は、全体的にウイルスコーディング配列について低減された（より大きい負とされた）コドンペアバイアスに繋がり、また再編成は多くの位置において減少したCPSを結果としてもたらすが、他の位置において付随するCPSの増加があることがあり、しかし平均で、改変された配列のコドンペアスコア、およびそのためCPBは低減されることが留意される。一部の態様において、コドンまたはコドンペアの再コーディングは、RdRPおよび/またはスパイクコーディング配列のG＋C含有量を変更することを考慮に入れ得る。一部の態様において、コドンまたはコドンペアの再コーディングは、RdRPおよび/またはスパイクコーディング配列中のCGおよび/またはTAジヌクレオチドの頻度を変更することを考慮に入れ得る。
ある特定の態様において、再コードされたRdRPおよび/またはスパイクタンパク質コーディング配列は、-0.1より低い、または-0.2より低い、または-0.3より低い、または-0.4より低いコドンペアバイアスを有する。一部の態様において、再コードされたRdRPおよび/またはスパイクタンパク質コーディング配列は、-0.05より低い、または-0.06より低い、または-0.07より低い、または-0.08より低い、または-0.09より低い、または-0.1より低い、または-0.11より低い、または-0.12より低い、または-0.13より低い、または-0.14より低い、または-0.15より低い、または-0.16より低い、または-0.17より低い、または-0.18より低い、または-0.19より低い、または-0.2より低い、または-0.25より低い、または-0.3より低い、または-0.35より低い、または-0.4より低い、または-0.45より低い、または-0.5より低いコドンペアバイアスを有する。
ある特定の態様において、再コードされたRdRPおよび/またはスパイクタンパク質コーディング配列のコドンペアバイアスは、その由来となる親RdRPおよび/またはスパイクタンパク質コーディング配列（例えば、親配列RdRPおよび/またはスパイクタンパク質コーディング配列、野生型配列RdRPおよび/またはスパイクタンパク質コーディング配列）と比較して、少なくとも0.1、または少なくとも0.2、または少なくとも0.3、または少なくとも0.4だけ低減される。ある特定の態様において、RdRPおよび/またはスパイクタンパク質コーディング配列の同義コドンの再編成は、その由来となる親RdRPおよび/またはスパイクタンパク質コーディング配列と比較して、少なくとも0.1、または少なくとも0.2、または少なくとも0.3、または少なくとも0.4のコドンペアバイアスの低減を提供する。ある特定の態様において、再コードされたRdRPおよび/またはスパイクタンパク質コーディング配列のコドンペアバイアスは、親ウイルス上の対応する配列と比較して、少なくとも0.05、または少なくとも0.06、または少なくとも0.07、または少なくとも0.08、または少なくとも0.09、または少なくとも0.1、または少なくとも0.11、または少なくとも0.12、または少なくとも0.13、または少なくとも0.14、または少なくとも0.15、または少なくとも0.16、または少なくとも0.17、または少なくとも0.18、または少なくとも0.19、または少なくとも0.2、または少なくとも0.25、または少なくとも0.3、または少なくとも0.35、または少なくとも0.4、または少なくとも0.45、または少なくとも0.5低減される。ある特定の態様において、それは、算出が為される対応する配列、例えば、野生型ウイルスの対応する配列（例えば、野生型ウイルス上のRdRPおよび/またはスパイクタンパク質コーディング配列）との比較である。
通常、これらの置換および変更は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変更することなく為され、コードされるウイルスタンパク質の発現を低減させる。ある特定の態様において、本発明はまた、保存的であってもそうでなくてもよい、コードされるタンパク質中の非同義コドンの置換およびアミノ酸置換を結果としてもたらす、RdRPおよび/またはスパイクコーディング配列中の変更を含む。一部の態様において、これらの置換および変更は、アミノ酸の欠失、付加、置換を結果としてもたらす置換または変更をさらに含む。例えば、スパイクタンパク質は、フューリン切断部位の排除を結果としてもたらす36ヌクレオチドの欠失を有するように再コードされ得る。
ほとんどのアミノ酸は1つより多くのコドンによりコードされる。表1における遺伝コードを参照。例えば、アラニンは、GCU、GCC、GCA、およびGCGによりコードされる。3つのアミノ酸（Leu、Ser、およびArg）は6つの異なるコドンによりコードされ、TrpおよびMetのみが独特のコドンを有する。「同義」コドンは、同じアミノ酸をコードするコドンである。そのため、例えば、CUU、CUC、CUA、CUG、UUA、およびUUGは、Leuをコードする同義コドンである。同義コドンは等しい頻度で使用されない。一般に、特定の生物において最も頻繁に使用されるコドンは、コグネイトtRNAが豊富に存在するコドンであり、これらのコドンの使用はタンパク質翻訳の速度および/または正確性を増強する。反対に、ほとんど使用されないコドンのためのtRNAは相対的に低いレベルで見出され、希少コドンの使用は、翻訳の速度および/または正確性を低減させると考えられる。
（表１）遺伝コード
a 特定のアミノ酸をコードする各コドン中の第1のヌクレオチドは最も左の列に示され、第2のヌクレオチドは上の行に示され、第3のヌクレオチドは最も右の列に示される。
コドンバイアス
本明細書において使用される場合、「希少」コドンは、特定のアミノ酸のために最も頻繁に使用されるコドンよりも有意に低い頻度でmRNA中に存在するそのアミノ酸をコードする、少なくとも2つの同義コドンのうちの1つである。そのため、希少コドンは、最も頻繁に使用されるコドンよりも約2倍低い頻度で存在し得る。好ましくは、希少コドンは、アミノ酸のための最も頻繁に使用されるコドンよりも、少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも5倍低い頻度で存在する。反対に、「高頻度」コドンは、特定のアミノ酸のために最も低い頻度で使用されるコドンよりも有意に高い頻度でmRNA中に存在するそのアミノ酸をコードする、少なくとも2つの同義コドンのうちの1つである。高頻度コドンは、アミノ酸のための最も低い頻度で使用されるコドンよりも、約2倍、好ましくは少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも5倍高い頻度で存在し得る。例えば、ヒト遺伝子は、ロイシンコドンCTGを40％の割合で使用するが、同義のCTAを7％の割合でしか使用しない（表2を参照）。そのため、CTGは高頻度コドンである一方、CTAは希少コドンである。使用のこれらの頻度と大まかに合致して、CTGを認識するtRNAの遺伝子のためにはゲノム中に6つのコピーがある一方、CTAを認識するtRNAの遺伝子には2つのコピーのみが存在する。同様に、ヒト遺伝子は、セリンのために、高頻度コドンTCTおよびTCCをそれぞれ18％および22％の割合で使用するが、希少コドンTCGは5％の割合でしか使用しない。TCTおよびTCCは、ゆらぎを介して、ゲノム中に10コピーのその遺伝子を有する同じtRNAにより読まれ、TCGは、4つのコピーしか有しないtRNAにより読まれる。非常に活発に翻訳されるmRNAは、最も高い頻度のコドンのみを使用するように強くバイアスされていることが周知である。これは、リボソームタンパク質および解糖酵素のための遺伝子を含む。他方、相対的に豊富でないタンパク質のためのmRNAは希少コドンを使用し得る。
本明細書において使用される場合、「希少」コドンは、特定のアミノ酸のために最も頻繁に使用されるコドンよりも有意に低い頻度でmRNA中に存在するそのアミノ酸をコードする、少なくとも2つの同義コドンのうちの1つである。そのため、希少コドンは、最も頻繁に使用されるコドンよりも約2倍低い頻度で存在し得る。好ましくは、希少コドンは、アミノ酸のための最も頻繁に使用されるコドンよりも、少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも5倍低い頻度で存在する。反対に、「高頻度」コドンは、特定のアミノ酸のために最も低い頻度で使用されるコドンよりも有意に高い頻度でmRNA中に存在するそのアミノ酸をコードする、少なくとも2つの同義コドンのうちの1つである。高頻度コドンは、アミノ酸のための最も低い頻度で使用されるコドンよりも、約2倍、好ましくは少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも5倍高い頻度で存在し得る。例えば、ヒト遺伝子は、ロイシンコドンCTGを40％の割合で使用するが、同義のCTAを7％の割合でしか使用しない（表2を参照）。そのため、CTGは高頻度コドンである一方、CTAは希少コドンである。使用のこれらの頻度と大まかに合致して、CTGを認識するtRNAの遺伝子のためにはゲノム中に6つのコピーがある一方、CTAを認識するtRNAの遺伝子には2つのコピーのみが存在する。同様に、ヒト遺伝子は、セリンのために、高頻度コドンTCTおよびTCCをそれぞれ18％および22％の割合で使用するが、希少コドンTCGは5％の割合でしか使用しない。TCTおよびTCCは、ゆらぎを介して、ゲノム中に10コピーのその遺伝子を有する同じtRNAにより読まれ、TCGは、4つのコピーしか有しないtRNAにより読まれる。非常に活発に翻訳されるmRNAは、最も高い頻度のコドンのみを使用するように強くバイアスされていることが周知である。これは、リボソームタンパク質および解糖酵素のための遺伝子を含む。他方、相対的に豊富でないタンパク質のためのmRNAは希少コドンを使用し得る。
（表２）ホモサピエンスにおけるコドン用法（ソース：www.kazusa.or.jp/codon/）
高発現される遺伝子が高頻度コドンを使用する傾向は「コドンバイアス」と呼ばれる。リボソームタンパク質のための遺伝子は、61個のコドンのうちの20～25個の最も頻度の高いもののみを使用する可能性があり、高いコドンバイアスを有し（1に近いコドンバイアス）、発現が乏しい遺伝子は、61個全てのコドンを使用する可能性があり、ほとんどまたは全くコドンバイアスを有しない（0に近いコドンバイアス）。頻繁に使用されるコドンは、より大量のコグネイトtRNAが発現されるコドンであり、またこれらのコドンの使用は、翻訳がより迅速に、もしくはより正確に、またはその両方で進行することを可能とすると考えられる。
コドンペアバイアス
追加的に、所与の生物は、所与のコドンAの最も近接したコドンネイバーに対する選好性を有し、これはコドンペア利用におけるバイアスと称される。既存のコドンを変化させることのない、コドンペアバイアスの変化は、タンパク質合成の速度およびタンパク質の製造に影響を及ぼし得る。
追加的に、所与の生物は、所与のコドンAの最も近接したコドンネイバーに対する選好性を有し、これはコドンペア利用におけるバイアスと称される。既存のコドンを変化させることのない、コドンペアバイアスの変化は、タンパク質合成の速度およびタンパク質の製造に影響を及ぼし得る。
コドンペアバイアスは、8つの異なるコドンペアによりコードされ得るアミノ酸ペアAla-Gluを考慮することにより説明され得る。（表2に示されるような）各個々のコドンの頻度以外の要因がコドンペアの頻度の原因とならない場合、8つのエンコーディングのそれぞれの予測される頻度は、2つの関連するコドンの頻度を掛けることにより計算され得る。例えば、この計算により、コドンペアGCA-GAAは、全てのAla-Gluコーディングペアのうち0.097の頻度（0.23×0.42；表2における頻度に基づく）で起こると予測される。各コドンペアの予測される（仮説上の）頻度をヒトゲノムにおいて実際に観察される頻度に関連付けるために、合計で14,795個のヒト遺伝子を含有する一貫して注釈付されたヒトコーディング領域のコンセンサスCDS（CCDS）データベースを使用した。遺伝子のこのセットは、ヒトコーディング配列の最も包括的な表現である。遺伝子のこのセットを使用して、コドン使用の頻度を、コドンの出現の数を同じアミノ酸をコードする全ての同義コドンの数で割ることにより再計算した。予測されたように、頻度は、以前に報告されたもの、例えば表2に与えられるものと密接に相関した。軽微な頻度バリエーションは、84949個のヒトコーディング配列（ヒト遺伝子の実際の数よりもはるかに多い）が計算に含まれたKazusa DNA Research Institute（www.kazusa.or.jp/codon/codon.html）におけるコドン用法データベースにより提供されたデータにおけるオーバーサンプリング効果に起因する可能性がある。そのように計算されたコドン頻度を次に使用して、最初に2つの関連するコドンの頻度を互いに掛け（表3の予測される頻度を参照）、次にこの結果に、問題とするコドンペアによりコードされるアミノ酸ペアが起こる観察された頻度（CCDSデータセット全体中）を掛けることにより、予測されるコドンペア頻度を計算した。コドンペアGCA-GAAの例において、この第2の計算は、（Kazusaデータセットを使用する第1の計算における0.097と比較して）0.098の予測される頻度を与える。最後に、14,795個のヒト遺伝子のセットにおいて観察されるような実際のコドンペア頻度を、セット中の各コドンペアの出現の総数をカウントし、それを同じアミノ酸ペアをコードするセット中の全ての同義コーディングペアの数で割ることにより決定した（表3；観察された頻度）。14,795個のヒト遺伝子のセットに基づく、3721（612）個のコドンペアの完全なセットについての頻度および観察/予測された値を、表3として本明細書に提供する。
（表３）アミノペアAla-Gluにより例示されるコドンペアスコア
コドンペアの観察された頻度/予測された頻度の比が1より大きい場合、コドンペアは過剰提示されていると言われる。比が1より小さい場合、それは過小提示されていると言われる。例において、コドンペアGCA-GAAは1.65倍過剰提示されており、コーディングペアGCC-GAAは5倍より大きく過小提示されている。
多くの他のコドンペアは非常に強いバイアスを示し；一部のペアは過小提示されており、他のペアは過剰提示されている。例えば、コドンペアGCCGAA（AlaGlu）およびGATCTG（AspLeu）は3～6倍過小提示されており（好ましいペアはそれぞれGCAGAGおよびGACCTGである）、コドンペアGCCAAG（AlaLys）およびAATGAA（AsnGlu）は約2倍過剰提示されている。コドンペアバイアスは、アミノ酸のペアの頻度とも、個々のコドンの頻度とも関係ない、ということは注目に値する。例えば、過小提示されたペアGATCTG（AspLeu）は、最も頻繁なLeuコドン（CTG）を使用している。
以下においてより十分に記載されるように、コドンペアバイアスは、コーディング配列の全長にわたり平均されたコーディング配列中の各コドンペアのスコアを考慮に入れる。本発明によれば、コドンペアバイアスは、
により決定される。
よって、コーディング配列についての類似したコドンペアバイアスは、例えば、部分配列に対する最小化されたコドンペアスコアまたはコーディング配列の全長に対する適度に減少されたコドンペアスコアにより得られ得る。
コドンペアバイアスの計算
可能な3721個の非「終止」含有コドンペアのあらゆる個々のコドンペア（例えば、GTT-GCT）は、遺伝子の所与の「トレーニングセット」に特有の、割り当てられた「コドンペアスコア」つまり「CPS」を持つ。所与のコドンペアのCPSは、遺伝子のこのセット（この例ではヒトゲノム）において予測された数に対する、出現の観察された数の対数比として定義される。特定のコドンペアの出現の実際の数（または換言すれば特定のアミノ酸ペアが特定のコドンペアによりコードされている可能性）の決定は単純に、コーディング配列の特定のセット中のコドンペアの出現の実際の数をカウントすることである。予測される数の決定は、しかしながら、追加の計算を要求する。予測される数は、Gutman and Hatfieldと同様にアミノ酸頻度およびコドンバイアスの両方から独立するように計算される。すなわち、予測される頻度は、アミノ酸が特有のコドンによりコードされる回数の相対的な割合に基づいて計算される。正のCPS値は所与のコドンペアが統計的に過剰提示されていることを表し、負のCPSはペアがヒトゲノムにおいて統計的に過小提示されていることを示す。
可能な3721個の非「終止」含有コドンペアのあらゆる個々のコドンペア（例えば、GTT-GCT）は、遺伝子の所与の「トレーニングセット」に特有の、割り当てられた「コドンペアスコア」つまり「CPS」を持つ。所与のコドンペアのCPSは、遺伝子のこのセット（この例ではヒトゲノム）において予測された数に対する、出現の観察された数の対数比として定義される。特定のコドンペアの出現の実際の数（または換言すれば特定のアミノ酸ペアが特定のコドンペアによりコードされている可能性）の決定は単純に、コーディング配列の特定のセット中のコドンペアの出現の実際の数をカウントすることである。予測される数の決定は、しかしながら、追加の計算を要求する。予測される数は、Gutman and Hatfieldと同様にアミノ酸頻度およびコドンバイアスの両方から独立するように計算される。すなわち、予測される頻度は、アミノ酸が特有のコドンによりコードされる回数の相対的な割合に基づいて計算される。正のCPS値は所与のコドンペアが統計的に過剰提示されていることを表し、負のCPSはペアがヒトゲノムにおいて統計的に過小提示されていることを示す。
ヒトの文脈においてこれらの計算を行うために、合計で14,795個の遺伝子を含有する、一貫して注釈付されたヒトコーディング領域の最も最近のコンセンサスCDS（CCDS）データベースを使用した。このデータセットは、コドンおよびコドンペア、ならびにそのためアミノ酸およびアミノ酸ペアの頻度をゲノムスケールで提供した。
Federov et al.（2002）のパラダイムを使用して、Gutman and Hatfield（1989）のアプローチをさらに増強した。これは、特定のアミノ酸ペアをコードする隣接するコドンのコドン頻度および非ランダムな連合性から独立して所与のコドンペアの予測される頻度の計算を可能とした。CPBを計算するために使用した詳細な式は、参照により組み入れられるWO 2008/121992およびWO 2011/044561に開示されている。
この計算において、Pijは、その同義群中でNO（Pij）の頻度で出現するコドンペアである。CiおよびCjは、それらの同義群中でそれぞれ頻度F（Ci）およびF（Cj）で出現する、Pijを含む2つのコドンである。より明示的には、F（Ci）は、対応するアミノ酸Xiが全てのコーディング領域を通じてコドンCiによりコードされる頻度であり、F（Ci）＝NO（Cj）/NO（Xi）であり、ここでNO（Ci）およびNO（Xi）は、それぞれコドンCiおよびアミノ酸Xiの出現の観察される数である。F（Cj）はそれに応じて計算される。さらに、NO（Xij）は、全てのコーディング領域を通じたアミノ酸ペアXijの出現の数である。PijのコドンペアバイアススコアS（Pij）を、Ne（Pij）の出現の予測される数に対する観察される頻度No（Pij）の対数オッズ比として計算した。
上記の式を使用して、ヒトCCDSデータセット全体を使用することにより計算された対応するゲノムNe（Pij）値と比較した場合に、個々のコーディング配列中の個々のコドンペアが過剰提示または過小提示されたかどうかを次に決定した。この計算は、ヒトコーディング領域中の過剰提示されたコドンペアについて正のS（Pij）スコア値、および過小提示されたコドンペアについて負の値を結果としてもたらした。
以下の式：
にしたがって全てのコドンペアスコアを平均することにより、個々のコーディング配列の「組み合わせた」コドンペアバイアスを計算した。
コーディング領域全体のコドンペアバイアスはそのため、領域を構成する個々のコドンペアスコアの全てを加え、この和をコーディング配列の長さで割ることにより計算される。
コドンペアバイアスの計算、コドンペアバイアスを変更するためのアルゴリズムの実行
コドンペアバイアスを定量化するためのアルゴリズムを開発した。あらゆる可能な個々のコドンペアに「コドンペアスコア」つまり「CPS」を与えた。CPSは、全てのヒトコーディング領域にかけての各コドンペアの出現の予測される数に対する観察される数の比の自然対数として定義され、ヒトは、再コードされるべき本ワクチンウイルスの宿主種となる。
コドンペアバイアスを定量化するためのアルゴリズムを開発した。あらゆる可能な個々のコドンペアに「コドンペアスコア」つまり「CPS」を与えた。CPSは、全てのヒトコーディング領域にかけての各コドンペアの出現の予測される数に対する観察される数の比の自然対数として定義され、ヒトは、再コードされるべき本ワクチンウイルスの宿主種となる。
特定のコドンペアの観察される出現の計算は直接的であるが（遺伝子セット内の実際の数）、コドンペアの出現の予測される数は追加の計算を要する。本発明者らは、Gutman and Hatfieldに類似して、アミノ酸頻度およびコドンバイアスの両方から独立するようにこの予測される数を計算する。すなわち、予測される頻度は、アミノ酸が特有のコドンによりコードされる回数の相対的な割合に基づいて計算される。正のCPS値は所与のコドンペアが統計的に過剰提示されていることを表し、負のCPSはペアがヒトゲノムにおいて統計的に過小提示されていることを示す。
これらの計算されたCPSを使用して、コドンペアスコアの平均を取ること、そのため遺伝子全体についてコドンペアバイアス（CPB）を与えることにより、過剰または過小提示されたコドンペアの使用として任意のコーディング領域を次に評価することができる。
示される式を使用して全ての注釈付されたヒト遺伝子についてCPBを計算し、プロットした。グラフ中の各点は単一のヒト遺伝子のCPBに対応する。分布のピークは0.07の正のコドンペアバイアスを有し、これは全ての注釈付されたヒト遺伝子についての平均スコアである。また、負のコドンペアバイアスを有する非常に少数の遺伝子がある。CPBを定義および計算するために確立された式を次に使用してこのバイアスを操作した。
コドンペアバイアスを低減させるためのアルゴリズム
タンパク質コーディング配列の再コーディングは、例えば、勾配降下法、またはシミュレーテッドアニーリング、または他の最小化ルーチンを使用して、コンピュータの補助を用いてまたは用いずに行われ得る。出発配列中に存在するコドンを再編成する手順の例は、以下の工程により表される：
1）野生型ウイルスゲノム配列を得る。
2）弱毒化設計のために標的化するタンパク質コーディング配列を選択する。
3）非コーディング機能を有する既知のまたは推量されるDNAセグメントをロックダウンする。
4）再設計されたタンパク質中の残りのアミノ酸のための所望のコドン分布を選択する。
5）少なくとも2つの同義のロックされていないコドンの位置のランダムなシャッフルを行い、コドンペアスコアを計算する。
6）任意でシミュレーテッドアニーリング手順を用いてコドンペアスコアをさらに低減させる（または増加させる）。
7）過度の二次構造および望ましくない制限部位について、結果としてもたらされた設計を検査する：
・該当する場合、工程（5）に行くか、または問題がある領域を野生型配列で置き換えることにより設計を矯正し、工程（8）に行く。
8）ウイルス設計に対応するDNA配列を合成する。
9）ウイルス構築物を作り、ウイルス表現型を評価する：
・弱毒化され過ぎている場合、サブクローン構築物を調製し、9に行く；
・弱毒化が不十分の場合、2に行く。
タンパク質コーディング配列の再コーディングは、例えば、勾配降下法、またはシミュレーテッドアニーリング、または他の最小化ルーチンを使用して、コンピュータの補助を用いてまたは用いずに行われ得る。出発配列中に存在するコドンを再編成する手順の例は、以下の工程により表される：
1）野生型ウイルスゲノム配列を得る。
2）弱毒化設計のために標的化するタンパク質コーディング配列を選択する。
3）非コーディング機能を有する既知のまたは推量されるDNAセグメントをロックダウンする。
4）再設計されたタンパク質中の残りのアミノ酸のための所望のコドン分布を選択する。
5）少なくとも2つの同義のロックされていないコドンの位置のランダムなシャッフルを行い、コドンペアスコアを計算する。
6）任意でシミュレーテッドアニーリング手順を用いてコドンペアスコアをさらに低減させる（または増加させる）。
7）過度の二次構造および望ましくない制限部位について、結果としてもたらされた設計を検査する：
・該当する場合、工程（5）に行くか、または問題がある領域を野生型配列で置き換えることにより設計を矯正し、工程（8）に行く。
8）ウイルス設計に対応するDNA配列を合成する。
9）ウイルス構築物を作り、ウイルス表現型を評価する：
・弱毒化され過ぎている場合、サブクローン構築物を調製し、9に行く；
・弱毒化が不十分の場合、2に行く。
コドンペアバイアスを低減させることによるウイルスの弱毒化は、完全に記載されたかのように参照により組み入れられるWO 2008/121992およびWO 2011/044561に開示されている。
野生型SARS-CoV-2ゲノム配列（またはCOVID-19を引き起こす野生型配列の突然変異体形態）中に埋め込まれた全長SARS-CoV-2ゲノム配列またはコドンペア脱最適化配列を得る方法は、例えば、感染性cDNAクローンを構築すること、BACベクターを使用すること、オーバーラップ伸長PCR戦略を使用すること、またはロングPCRベースの融合戦略を含み得る。
再コードされたポリヌクレオチド
本発明の様々な態様は、親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片をコードするポリヌクレオチドであって、
前記ポリヌクレオチドが、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、再コードされており、かつ
前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記親SARS-CoV-2コロナウイルスの前記1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列が同じままである、前記ポリヌクレオチドを提供する。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドによりコードされる親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列は、親SARS-CoV-2ウイルス配列の核酸配列のポリAテイルの前が同じままである。
本発明の様々な態様は、親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片をコードするポリヌクレオチドであって、
前記ポリヌクレオチドが、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、再コードされており、かつ
前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記親SARS-CoV-2コロナウイルスの前記1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列が同じままである、前記ポリヌクレオチドを提供する。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドによりコードされる親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列は、親SARS-CoV-2ウイルス配列の核酸配列のポリAテイルの前が同じままである。
本発明の様々な態様は、親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片をコードするポリヌクレオチドであって、
前記ポリヌクレオチドが、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、再コードされており、かつ
前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記親SARS-CoV-2コロナウイルスの前記1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列が最大20アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む、前記ポリヌクレオチドを提供する。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドによりコードされる親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列は、親SARS-CoV-2ウイルス配列の核酸配列のポリAテイルの前に最大20アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む。
前記ポリヌクレオチドが、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、再コードされており、かつ
前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記親SARS-CoV-2コロナウイルスの前記1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列が最大20アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む、前記ポリヌクレオチドを提供する。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドによりコードされる親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列は、親SARS-CoV-2ウイルス配列の核酸配列のポリAテイルの前に最大20アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む。
本発明の様々な態様は、親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片をコードするポリヌクレオチドであって、
前記ポリヌクレオチドが、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、再コードされており、かつ
前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記親SARS-CoV-2コロナウイルスの前記1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列が最大10アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む、前記ポリヌクレオチドを提供する。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドによりコードされる親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列は、親SARS-CoV-2ウイルス配列の核酸配列のポリAテイルの前に最大10アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む。
前記ポリヌクレオチドが、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、再コードされており、かつ
前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記親SARS-CoV-2コロナウイルスの前記1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列が最大10アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む、前記ポリヌクレオチドを提供する。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドによりコードされる親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列は、親SARS-CoV-2ウイルス配列の核酸配列のポリAテイルの前に最大10アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む。
本発明の様々な態様は、親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片をコードするポリヌクレオチドであって、
前記ポリヌクレオチドが、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、再コードされており、かつ
前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記親SARS-CoV-2コロナウイルスの前記1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列が最大12アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む、前記ポリヌクレオチドを提供する。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドによりコードされる親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列は、親SARS-CoV-2ウイルス配列の核酸配列のポリAテイルの前に最大12アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む。
前記ポリヌクレオチドが、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、再コードされており、かつ
前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記親SARS-CoV-2コロナウイルスの前記1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列が最大12アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む、前記ポリヌクレオチドを提供する。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドによりコードされる親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列は、親SARS-CoV-2ウイルス配列の核酸配列のポリAテイルの前に最大12アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む。
様々な態様において、アミノ酸配列は、最大2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む。様々な態様において、アミノ酸配列は、1～5、6～10、11～15、または16～20アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む。様々な態様において、アミノ酸の欠失、置換、または付加は、親SARS-CoV-2ウイルス配列の核酸配列のポリAテイルの前の核酸の欠失、置換または付加の結果としてもたらされる。
様々な態様において、アミノ酸配列は12アミノ酸の欠失を含む。様々な態様において、アミノ酸配列は、1～5、6～10、11～15、または16～20アミノ酸の欠失を含む。様々な態様において、アミノ酸の置換、付加、または欠失は、再コードされた配列中の1つまたは複数の点突然変異に起因し得る。様々な態様において、アミノ酸の欠失、置換、または付加は、親SARS-CoV-2ウイルス配列の核酸配列のポリAテイルの前の核酸の欠失、置換または付加の結果としてもたらされる。
そのため、これらの再コードされたポリヌクレオチド（核酸の欠失、置換または付加を有するか、または有しない）の様々な態様において、再コードされたポリヌクレオチドは、異なる長さのポリAテイル；例えば、3’末端における1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、もしくは54個の連続するアデニン；または例えば、3’末端における1～6、7～12、13～18、19～24、25～30、31～36、37～42、43～48、もしくは49～54個の連続するアデニン；または例えば、3’末端における9～37、12～34、15～33、18～30、もしくは21～27個の連続するアデニン；または例えば、3’末端における19～25個の連続するアデニンを有し得る。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、コドンペアバイアス（CPB）を低減させることまたはコドン使用頻度バイアスを低減させることにより再コードされる。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、CpGまたはUpAジヌクレオチドの数を増加させることにより再コードされる。
様々な態様において、再コードされた1つもしくは複数のウイルスタンパク質の各々、または再コードされた1つもしくは複数のその断片の各々は、-0.05より低い、-0.1より低い、-0.2より低い、-0.3より低い、または-0.4より低いコドンペアバイアスを有する。
ある特定の態様において、再コードされたウイルスタンパク質はRdRPおよび/またはスパイクタンパク質であり、かつ再コードされたウイルスタンパク質またはその断片の各々は、-0.05より低い、または-0.06より低い、または-0.07より低い、または-0.08より低い、または-0.09より低い、または-0.1より低い、または-0.11より低い、または-0.12より低い、または-0.13より低い、または-0.14より低い、または-0.15より低い、または-0.16より低い、または-0.17より低い、または-0.18より低い、または-0.19より低い、または-0.2より低い、または-0.25より低い、または-0.3より低い、または-0.35より低い、または-0.4より低い、または-0.45より低い、または-0.5より低いコドンペアバイアスを有する。
ある特定の態様において、再コードされたウイルスタンパク質はRdRPおよび/またはスパイクタンパク質であり、かつ再コードされたウイルスタンパク質またはその断片の各々は、親配列上の対応する配列と比較して、少なくとも0.05、または少なくとも0.06、または少なくとも0.07、または少なくとも0.08、または少なくとも0.09、または少なくとも0.1、または少なくとも0.11、または少なくとも0.12、または少なくとも0.13、または少なくとも0.14、または少なくとも0.15、または少なくとも0.16、または少なくとも0.17、または少なくとも0.18、または少なくとも0.19、または少なくとも0.2、または少なくとも0.25、または少なくとも0.3、または少なくとも0.35、または少なくとも0.4、または少なくとも0.45、または少なくとも0.5低減される。ある特定の態様において、それは、算出が為される親配列上の対応する配列；例えば、野生型ウイルスの対応する配列との比較である。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、野生型SARS-CoV-2コロナウイルスである。様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、天然分離株SARS-CoV-2コロナウイルスである。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、SARS-CoV-2コロナウイルスの野生型BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019分離株である。様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる、SARS-CoV-2コロナウイルスの野生型ワシントン分離株（GenBank:MN985325.1）である。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、野生型SARS-CoV-2コロナウイルス配列の突然変異体形態である。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、SARS-CoV-2バリアントである。様々な態様において、SARS-CoV-2バリアントは、英国バリアント、南アフリカバリアント、またはブラジルバリアントである。
英国バリアントの例としては、いずれも2021年1月19日時点のものであり、いずれも全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号MW462650（SARS-CoV-2/human/USA/MN-MDH-2252/2020）、MW463056（SARS-CoV-2/human/USA/FL-BPHL-2270/2020）、およびMW440433（SARS-CoV-2/human/USA/NY-Wadsworth-291673-01/2020）が挙げられるがこれらに限定されない。英国バリアントの追加の例としては、いずれも2021年1月20日時点のものであり、いずれも全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる、GISAID ID番号EPI＿ISL＿778842（hCoV-19/USA/TX-CDC-9KXP-8438/2020;2020-12-28）、EPI＿ISL＿802609（hCoV-19/USA/CA-CDC-STM-050/2020;2020-12-28）、EPI＿ISL＿802647（hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-043/2020;2020-12-26）、EPI＿ISL＿832014（hCoV-19/USA/UT-UPHL-2101178518/2020;2020-12-31）、EPI＿ISL＿850618（hCoV-19/USA/IN-CDC-STM-183/2020;2020-12-31）、およびEPI＿ISL＿850960（hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-A100002/2021;2021-01-04）が挙げられるがこれらに限定されない。
南アフリカバリアントの例としては、いずれも2021年1月20日時点のものであり、いずれも全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる、GISAID ID番号EPI＿ISL＿766709（hCoV-19/Sweden/20-13194/2020;2020-12-24）、EPI＿ISL＿768828（hCoV-19/France/PAC-NRC2933/2020;2020-12-22）、EPI＿ISL＿770441（hCoV-19/England/205280030/2020;2020-12-24）、およびEPI＿ISL＿819798（hCoV-19/England/OXON-F440A7/2020;2020-12-18）が挙げられるがこれらに限定されない。
ブラジルバリアントの例としては、いずれも2021年1月20日時点のものであり、いずれも全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる、GISAID ID番号EPI＿ISL＿677212（hCoV-19/USA/VA-DCLS-2187/2020;2020-11-12）、EPI＿ISL＿723494（hCoV-19/USA/VA-DCLS-2191/2020;2020-11-12）、EPI＿ISL＿845768（hCoV-19/USA/GA-EHC-458R/2021;2021-01-05）、EPI＿ISL＿848196（hCoV-19/Canada/LTRI-1192/2020;2020-12-24）、およびEPI＿ISL＿848197（hCoV-19/Canada/LTRI-1258/2020;2020-12-24）が挙げられるがこれらに限定されない。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、以前に改変されたウイルス核酸、または以前に弱毒化されたウイルス核酸である。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、CPB脱最適化される。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、コドン脱最適化される。
様々な態様において、コドン脱最適化またはCPB脱最適化は、ヒトにおいて頻繁に使用されるコドンまたはCPBに基づく。様々な態様において、コドン脱最適化またはCPB脱最適化は、コロナウイルスにおいて頻繁に使用されるコドンまたはCPBに基づく。様々な態様において、コドン脱最適化またはCPB脱最適化は、SARS-CoV-2コロナウイルスにおいて頻繁に使用されるコドンまたはCPBに基づく。様々な態様において、コドン脱最適化またはCPB脱最適化は、野生型SARS-CoV-2コロナウイルスにおいて頻繁に使用されるコドンまたはCPBに基づく。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、RNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRP）、RdRPの断片、スパイクタンパク質、スパイクタンパク質の断片、およびこれらの組合せから選択される再コードされたヌクレオチド配列を含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、フューリン切断部位を排除する、スパイクタンパク質中のアミノ酸の欠失を結果としてもたらす、ヌクレオチドの欠失を含む。いかなる特定の理論によっても縛られることを望まないが、フューリン切断部位を排除することは、ワクチンおよび/または免疫組成物の安全性のドライバーの1つであると本発明者らは考える。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のbp 11294～12709、bp 14641～15903、bp 21656～22306、bp 22505～23905、およびbp 24110～25381から選択される少なくとも1つのCPB脱最適化された領域を含む。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3（Wuhan-CoV＿101K）を含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3のヌクレオチド1～29,877（例えば、ポリAテイルなし）を含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3のヌクレオチド1～29,877および3’末端における1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、または54個の連続するアデニンを含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3のヌクレオチド1～29,877および3’末端における1～6、7～12、13～18、19～24、25～30、31～36、37～42、43～48、または49～54個の連続するアデニンを含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3のヌクレオチド1～29,877および3’末端における9～37、12～34、15～33、18～30、または21～27個の連続するアデニンを含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3のヌクレオチド1～29,877および3’末端における19～25個の連続するアデニンを含む。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4を含む。SEQ ID NO:4は、野生型WA-1配列（完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられるGenBank:MN985325.1）と比較して、脱最適化された配列である（例えば、CDX-005）。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834（例えば、ポリAテイルなし）を含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834および3’末端における1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、または54個の連続するアデニンを含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4の1～29,834および3’末端における1～6、7～12、13～18、19～24、25～30、31～36、37～42、43～48、または49～54個の連続するアデニンを含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834および3’末端における9～37、12～34、15～33、18～30、または21～27個の連続するアデニンを含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834および3’末端における19～25個の連続するアデニンを含む。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:6（再コードされたスパイクタンパク質）をコードする。
ベクター、細胞、ポリペプチド
様々な態様は、本発明のポリヌクレオチドを含む細菌人工染色体（BAC）を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される再コードされたポリペプチドである。
様々な態様は、本発明のポリヌクレオチドを含む細菌人工染色体（BAC）を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される再コードされたポリペプチドである。
様々な態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される再コードされたポリペプチドである。
本発明のベクターを含む細胞。ベクターは、本明細書に記載されるベクターである。
様々な態様において、細胞は、Vero細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、MA104細胞、293T細胞、BSR-T7細胞、MRC-5細胞、CHO細胞、またはPER.C6細胞である。特定の態様において、細胞はVero細胞またはベビーハムスター腎臓（BHK）細胞である。
様々な態様は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される再コードされたポリペプチドである。ポリペプチドは、野生型SARS-CoV-2ウイルスによりコードされるポリペプチド、またはSARS-CoV-2バリアントによりコードされるポリペプチドとは異なる特性を呈する。例えば、本明細書に記載される再コードされたポリヌクレオチドおよび脱最適化されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、ウイルスに対する弱毒化特性を発揮し得る。
改変型ウイルス
本発明の様々な態様は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む改変型SARS-CoV-2コロナウイルスを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される再コードされたポリペプチドである。
本発明の様々な態様は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む改変型SARS-CoV-2コロナウイルスを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される再コードされたポリペプチドである。
本発明の様々な態様は、本発明のポリヌクレオチドを含む改変型SARS-CoV-2コロナウイルスを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される再コードされたポリペプチドのいずれか1つである。
様々な態様において、そのウイルスタンパク質のうちの1つまたは複数の発現は、その親SARS-CoV-2コロナウイルスと比較して、低減される。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、野生型SARS-CoV-2コロナウイルスである。様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、天然分離株SARS-CoV-2コロナウイルスである。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、SARS-CoV-2コロナウイルスの野生型BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019分離株である。様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる、SARS-CoV-2コロナウイルスの野生型ワシントン分離株（GenBank:MN985325.1）である。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、野生型SARS-CoV-2コロナウイルス配列の突然変異体形態である。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、SARS-CoV-2バリアントである。様々な態様において、SARS-CoV-2バリアントは、英国バリアント、南アフリカバリアント、またはブラジルバリアントである。
英国バリアントの例としては、いずれも2021年1月19日時点のものであり、いずれも全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号MW462650（SARS-CoV-2/human/USA/MN-MDH-2252/2020）、MW463056（SARS-CoV-2/human/USA/FL-BPHL-2270/2020）、およびMW440433（SARS-CoV-2/human/USA/NY-Wadsworth-291673-01/2020）が挙げられるがこれらに限定されない。英国バリアントの追加の例としては、いずれも2021年1月20日時点のものであり、いずれも全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる、GISAID ID番号EPI＿ISL＿778842（hCoV-19/USA/TX-CDC-9KXP-8438/2020;2020-12-28）、EPI＿ISL＿802609（hCoV-19/USA/CA-CDC-STM-050/2020;2020-12-28）、EPI＿ISL＿802647（hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-043/2020;2020-12-26）、EPI＿ISL＿832014（hCoV-19/USA/UT-UPHL-2101178518/2020;2020-12-31）、EPI＿ISL＿850618（hCoV-19/USA/IN-CDC-STM-183/2020;2020-12-31）、およびEPI＿ISL＿850960（hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-A100002/2021;2021-01-04）が挙げられるがこれらに限定されない。
南アフリカバリアントの例としては、いずれも2021年1月20日時点のものであり、いずれも全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる、GISAID ID番号EPI＿ISL＿766709（hCoV-19/Sweden/20-13194/2020;2020-12-24）、EPI＿ISL＿768828（hCoV-19/France/PAC-NRC2933/2020;2020-12-22）、EPI＿ISL＿770441（hCoV-19/England/205280030/2020;2020-12-24）、およびEPI＿ISL＿819798（hCoV-19/England/OXON-F440A7/2020;2020-12-18）が挙げられるがこれらに限定されない。
ブラジルバリアントの例としては、いずれも2021年1月20日時点のものであり、いずれも全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる、GISAID ID番号EPI＿ISL＿677212（hCoV-19/USA/VA-DCLS-2187/2020;2020-11-12）、EPI＿ISL＿723494（hCoV-19/USA/VA-DCLS-2191/2020;2020-11-12）、EPI＿ISL＿845768（hCoV-19/USA/GA-EHC-458R/2021;2021-01-05）、EPI＿ISL＿848196（hCoV-19/Canada/LTRI-1192/2020;2020-12-24）、およびEPI＿ISL＿848197（hCoV-19/Canada/LTRI-1258/2020;2020-12-24）が挙げられるがこれらに限定されない。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、以前に改変されたウイルス核酸、または以前に弱毒化されたウイルス核酸である。
様々な態様において、そのウイルスタンパク質のうちの1つまたは複数の発現における低減は、RdRPタンパク質、スパイクタンパク質およびこれらの組合せから選択される領域を再コードすることの結果として、低減されている。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片をコードし、前記ポリヌクレオチドは、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、再コードされており、かつ前記ポリヌクレオチドによりコードされる親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列は同じままである。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片をコードし、前記ポリヌクレオチドは、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、再コードされており、かつ前記ポリヌクレオチドによりコードされる親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列は、最大15アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む。様々な態様において、アミノ酸配列は、最大2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む。様々な態様において、アミノ酸配列は12アミノ酸の欠失を含む。様々な態様において、アミノ酸配列は、1～3、4～6、7～9、10～12、または13～15アミノ酸の欠失を含む。アミノ酸の置換、付加、または欠失は、再コードされた配列中の1つまたは複数の点突然変異に起因し得る。様々な態様において、アミノ酸の欠失、置換、または付加は、親SARS-CoV-2ウイルス配列の核酸配列のポリAテイルの前の核酸の欠失、置換または付加の結果としてもたらされる。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、コドンペアバイアス（CPB）を低減させることまたはコドン使用頻度バイアスを低減させることにより再コードされる。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、CpGまたはUpAジヌクレオチドの数を増加させることにより再コードされる。
様々な態様において、再コードされた1つもしくは複数のウイルスタンパク質の各々、または再コードされた1つもしくは複数のその断片の各々は、-0.05より低い、-0.1より低い、-0.2より低い、-0.3より低い、または-0.4より低いコドンペアバイアスを有する。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、野生型SARS-CoV-2コロナウイルスである。様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、天然分離株SARS-CoV-2コロナウイルスである。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、SARS-CoV-2コロナウイルスの野生型BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019分離株である。様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる、SARS-CoV-2コロナウイルスの野生型ワシントン分離株（GenBank:MN985325.1）である。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、野生型SARS-CoV-2コロナウイルス配列の突然変異体形態である。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、SARS-CoV-2バリアントである。様々な態様において、SARS-CoV-2バリアントは、英国バリアント、南アフリカバリアント、またはブラジルバリアントである。
英国バリアントの例としては、いずれも2021年1月19日時点のものであり、いずれも全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号MW462650（SARS-CoV-2/human/USA/MN-MDH-2252/2020）、MW463056（SARS-CoV-2/human/USA/FL-BPHL-2270/2020）、およびMW440433（SARS-CoV-2/human/USA/NY-Wadsworth-291673-01/2020）が挙げられるがこれらに限定されない。英国バリアントの追加の例としては、いずれも2021年1月20日時点のものであり、いずれも全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる、GISAID ID番号EPI＿ISL＿778842（hCoV-19/USA/TX-CDC-9KXP-8438/2020;2020-12-28）、EPI＿ISL＿802609（hCoV-19/USA/CA-CDC-STM-050/2020;2020-12-28）、EPI＿ISL＿802647（hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-043/2020;2020-12-26）、EPI＿ISL＿832014（hCoV-19/USA/UT-UPHL-2101178518/2020;2020-12-31）、EPI＿ISL＿850618（hCoV-19/USA/IN-CDC-STM-183/2020;2020-12-31）、およびEPI＿ISL＿850960（hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-A100002/2021;2021-01-04）が挙げられるがこれらに限定されない。
南アフリカバリアントの例としては、いずれも2021年1月20日時点のものであり、いずれも全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる、GISAID ID番号EPI＿ISL＿766709（hCoV-19/Sweden/20-13194/2020;2020-12-24）、EPI＿ISL＿768828（hCoV-19/France/PAC-NRC2933/2020;2020-12-22）、EPI＿ISL＿770441（hCoV-19/England/205280030/2020;2020-12-24）、およびEPI＿ISL＿819798（hCoV-19/England/OXON-F440A7/2020;2020-12-18）が挙げられるがこれらに限定されない。
ブラジルバリアントの例としては、いずれも2021年1月20日時点のものであり、いずれも全体が完全に記載されたかのように参照により本明細書に組み入れられる、GISAID ID番号EPI＿ISL＿677212（hCoV-19/USA/VA-DCLS-2187/2020;2020-11-12）、EPI＿ISL＿723494（hCoV-19/USA/VA-DCLS-2191/2020;2020-11-12）、EPI＿ISL＿845768（hCoV-19/USA/GA-EHC-458R/2021;2021-01-05）、EPI＿ISL＿848196（hCoV-19/Canada/LTRI-1192/2020;2020-12-24）、およびEPI＿ISL＿848197（hCoV-19/Canada/LTRI-1258/2020;2020-12-24）が挙げられるがこれらに限定されない。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、以前に改変されたウイルス核酸、または以前に弱毒化されたウイルス核酸である。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、CPB脱最適化される。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、コドン脱最適化される。
様々な態様において、コドン脱最適化またはCPB脱最適化は、ヒトにおいて頻繁に使用されるコドンまたはCPBに基づく。様々な態様において、コドン脱最適化またはCPB脱最適化は、コロナウイルスにおいて頻繁に使用されるコドンまたはCPBに基づく。様々な態様において、コドン脱最適化またはCPB脱最適化は、SARS-CoV-2コロナウイルスにおいて頻繁に使用されるコドンまたはCPBに基づく。様々な態様において、コドン脱最適化またはCPB脱最適化は、野生型SARS-CoV-2コロナウイルスにおいて頻繁に使用されるコドンまたはCPBに基づく。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、RNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRP）、RdRPの断片、スパイクタンパク質、スパイクタンパク質の断片、およびこれらの組合せから選択される再コードされたヌクレオチド配列を含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、フューリン切断部位を排除する、スパイクタンパク質中のアミノ酸の欠失を結果としてもたらす、ヌクレオチドの欠失を含む。いかなる特定の理論によっても縛られることを望まないが、フューリン切断部位を排除することは、ワクチンおよび/または免疫組成物の安全性のドライバーの1つであると本発明者らは考える。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のbp 11294～12709、bp 14641～15903、bp 21656～22306、bp 22505～23905、およびbp 24110～25381から選択される少なくとも1つのCPB脱最適化された領域を含む。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3（Wuhan-CoV＿101K）を含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3のヌクレオチド1～29,877（例えば、ポリAテイルなし）を含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3のヌクレオチド1～29,877および3’末端における1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、または54個の連続するアデニンを含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3のヌクレオチド1～29,877および3’末端における1～6、7～12、13～18、19～24、25～30、31～36、37～42、43～48、または49～54個の連続するアデニンを含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3のヌクレオチド1～29,877および3’末端における9～37、12～34、15～33、18～30、または21～27個の連続するアデニンを含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3のヌクレオチド1～29,877および3’末端における19～25個の連続するアデニンを含む。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4を含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834（例えば、ポリAテイルなし）を含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834および3’末端における1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、または54個の連続するアデニンを含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4の1～29,834および3’末端における1～6、7～12、13～18、19～24、25～30、31～36、37～42、43～48、または49～54個の連続するアデニンを含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834および3’末端における9～37、12～34、15～33、18～30、または21～27個の連続するアデニンを含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834および3’末端における19～25個の連続するアデニンを含む。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:7を含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:7のヌクレオチド1～29,834（例えば、ポリAテイルなし）を含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:7のヌクレオチド1～29,834および3’末端における1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、または54個の連続するアデニンを含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:7の1～29,834および3’末端における1～6、7～12、13～18、19～24、25～30、31～36、37～42、43～48、または49～54個の連続するアデニンを含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:7のヌクレオチド1～29,834および3’末端における9～37、12～34、15～33、18～30、または21～27個の連続するアデニンを含む。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:7のヌクレオチド1～29,834および3’末端における19～25個の連続するアデニンを含む。
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:6（再コードされたスパイクタンパク質）をコードする。
免疫および/またはワクチン組成物
様々な態様は、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスを含む、対象において免疫応答を誘導するための免疫組成物を提供する。改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは、本明細書に記載される改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのいずれか1つである。様々な態様において、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは生弱毒化ウイルスである。一部の態様において、免疫組成物は、本明細書に記載される、許容される賦形剤または担体をさらに含む。一部の態様において、免疫組成物は、本明細書に記載される安定化剤をさらに含む。一部の態様において、免疫組成物は、本明細書に記載されるアジュバントをさらに含む。一部の態様において、免疫組成物は、スクロース、グリシン、またはその両方をさらに含む。様々な態様において、免疫組成物は、スクロース（約5％）およびグリシン（約5％）をさらに含む。様々な態様において、許容される担体または賦形剤は、糖、アミノ酸、界面活性剤およびこれらの組合せからなる群より選択される。様々な態様において、アミノ酸は約5％ w/vの濃度である。好適なアミノ酸の非限定的な例としては、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられる。好適な担体の非限定的な例としては、ゼラチンおよびヒト血清アルブミンが挙げられる。好適な界面活性剤の非限定的な例としては、非イオン性界面活性剤、例えば0.01～0.05％の非常に低濃度のポリソルベート80が挙げられる。
様々な態様は、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスを含む、対象において免疫応答を誘導するための免疫組成物を提供する。改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは、本明細書に記載される改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのいずれか1つである。様々な態様において、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは生弱毒化ウイルスである。一部の態様において、免疫組成物は、本明細書に記載される、許容される賦形剤または担体をさらに含む。一部の態様において、免疫組成物は、本明細書に記載される安定化剤をさらに含む。一部の態様において、免疫組成物は、本明細書に記載されるアジュバントをさらに含む。一部の態様において、免疫組成物は、スクロース、グリシン、またはその両方をさらに含む。様々な態様において、免疫組成物は、スクロース（約5％）およびグリシン（約5％）をさらに含む。様々な態様において、許容される担体または賦形剤は、糖、アミノ酸、界面活性剤およびこれらの組合せからなる群より選択される。様々な態様において、アミノ酸は約5％ w/vの濃度である。好適なアミノ酸の非限定的な例としては、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられる。好適な担体の非限定的な例としては、ゼラチンおよびヒト血清アルブミンが挙げられる。好適な界面活性剤の非限定的な例としては、非イオン性界面活性剤、例えば0.01～0.05％の非常に低濃度のポリソルベート80が挙げられる。
様々な態様において、免疫組成物は、約103～107 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約104～106 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約103 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約104 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約105 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約106 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約107 PFUの投薬量で提供される。
様々な態様において、免疫組成物は、約5×103 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約5×104 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約5×105 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約5×106 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約5×107 PFUの投薬量で提供される。
様々な態様は、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスを含む、対象において免疫応答を誘導するためのワクチン組成物を提供する。改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは、本明細書に記載される改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのいずれか1つである。様々な態様において、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは生弱毒化ウイルスである。一部の態様において、ワクチン組成物は、本明細書に記載される、許容される担体または賦形剤をさらに含む。一部の態様において、免疫組成物は、本明細書に記載される安定化剤をさらに含む。一部の態様において、ワクチン組成物は、本明細書に記載されるアジュバントをさらに含む。一部の態様において、ワクチン組成物は、スクロース、グリシン、またはその両方をさらに含む。様々な態様において、ワクチン組成物は、スクロース（5％）およびグリシン（5％）をさらに含む。様々な態様において、許容される担体または賦形剤は、糖、アミノ酸、界面活性剤およびこれらの組合せからなる群より選択される。様々な態様において、アミノ酸は約5％ w/vの濃度である。好適なアミノ酸の非限定的な例としては、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられる。好適な担体の非限定的な例としては、ゼラチンおよびヒト血清アルブミンが挙げられる。好適な界面活性剤の非限定的な例としては、非イオン性界面活性剤、例えば0.01～0.05％の非常に低濃度のポリソルベート80が挙げられる。
様々な態様において、ワクチン組成物は、約103～107 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、ワクチン組成物は、約104～106 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、ワクチン組成物は、約103 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、ワクチン組成物は、約104 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、ワクチン組成物は、約105 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、ワクチン組成物は、約106 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、ワクチン組成物は、約107 PFUの投薬量で提供される。
様々な態様において、免疫組成物は、約5×103 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約5×104 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約5×105 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約5×106 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約5×107 PFUの投薬量で提供される。
様々な態様は、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスを含む、対象において保護免疫応答を誘導するためのワクチン組成物を提供する。改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは、本明細書に記載される改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのいずれか1つである。様々な態様において、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは生弱毒化ウイルスである。一部の態様において、ワクチン組成物は、本明細書に記載される、許容される担体または賦形剤をさらに含む。一部の態様において、ワクチン組成物は、本明細書に記載されるアジュバントをさらに含む。一部の態様において、ワクチン組成物は、スクロース、グリシン、またはその両方をさらに含む。様々な態様において、ワクチン組成物は、スクロース（5％）およびグリシン（5％）をさらに含む。様々な態様において、許容される担体または賦形剤は、糖、アミノ酸、界面活性剤およびこれらの組合せからなる群より選択される。様々な態様において、アミノ酸は約5％ w/vの濃度である。好適なアミノ酸の非限定的な例としては、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられる。好適な担体の非限定的な例としては、ゼラチンおよびヒト血清アルブミンが挙げられる。好適な界面活性剤の非限定的な例としては、非イオン性界面活性剤、例えば0.01～0.05％の非常に低濃度のポリソルベート80が挙げられる。
様々な態様において、ワクチン組成物は、約103～107 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、ワクチン組成物は、約104～106 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、ワクチン組成物は、約103 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、ワクチン組成物は、約104 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、ワクチン組成物は、約105 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、ワクチン組成物は、約106 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、ワクチン組成物は、約107 PFUの投薬量で提供される。
様々な態様において、免疫組成物は、約5×103 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約5×104 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約5×105 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約5×106 PFUの投薬量で提供される。様々な態様において、免疫組成物は、約5×107 PFUの投薬量で提供される。
本発明の弱毒化ウイルスは、対象において免疫応答（もしくは保護免疫応答）を誘発するためまたは対象をウイルス関連疾患から予防するもしくは対象がそれに罹患する可能性を低減させるために使用される場合、薬学的に許容される担体または賦形剤を追加的に含む組成物の形態で対象に投与され得ることが理解されるべきである。薬学的に許容される担体および賦形剤は当業者に公知であり、0.01～0.1Mおよび好ましくは0.05Mのリン酸緩衝液、リン酸緩衝化食塩水（PBS）、DMEM、L-15、PBS中の10～25％のスクロース溶液、DMEM中の10～25％のスクロース溶液、または0.9％の食塩水の1つまたは複数が挙げられるがこれらに限定されない。そのような担体としてはまた、水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルションが挙げられる。水性担体としては、水、アルコール性/水性溶液、エマルションまたは懸濁液、食塩水および緩衝化媒体が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液および固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充液、電解質補充液、例えばリンゲルのデキストロースに基づくものなどが挙げられる。固体組成物は、非毒性固体担体、例えば、グルコース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロースまたはセルロース誘導体、炭酸ナトリウム、ゼラチン、組換えヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、および/または炭酸マグネシウムなどを含んでもよい。例えば肺および/または鼻腔内送達などのための、エアロゾル中での投与のために、剤または組成物は、好ましくは、非毒性界面活性剤、例えば、C6～C22脂肪酸または天然グリセリドのエステルまたは部分エステル、および噴射剤と共に製剤化される。鼻腔内送達を促すために追加の担体、例えばレシチンが含まれてもよい。薬学的に許容される担体または賦形剤は、活性成分の貯蔵寿命および/または有効性を増強する、微量の助剤物質、例えば湿潤剤または乳化剤、防腐剤ならびに他の添加剤、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤およびキレート剤をさらに含み得る。本組成物は、当該技術分野において周知のように、対象への投与後に活性成分の迅速な、持続的なまたは遅延された放出を提供するように製剤化され得る。
様々な態様において、ワクチン組成物または免疫組成物は、静脈内、または髄腔内、皮下、筋肉内、皮内または鼻腔内への送達のために製剤化される。様々な態様において、ワクチン組成物または免疫組成物は、鼻腔内への送達のために製剤化される。様々な態様において、ワクチン組成物または免疫組成物は、点鼻薬または経鼻スプレーを介した送達のために製剤化される。
本発明の組成物を使用する方法
様々な態様は、対象において免疫応答を誘発する方法であって、対象に本発明の免疫組成物のある用量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。免疫組成物は、本明細書に記載される免疫組成物のいずれか1つである。様々な態様において、用量は予防有効用量または治療有効用量である。
様々な態様は、対象において免疫応答を誘発する方法であって、対象に本発明の免疫組成物のある用量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。免疫組成物は、本明細書に記載される免疫組成物のいずれか1つである。様々な態様において、用量は予防有効用量または治療有効用量である。
様々な態様において、免疫組成物は、静脈内に、または髄腔内に、皮下に、筋肉内に、皮内にまたは鼻腔内に投与される。様々な態様において、免疫組成物は、鼻腔内に投与される。様々な態様において、免疫組成物は、点鼻薬または経鼻スプレーを介して投与される。
様々な態様は、対象において免疫応答を誘発する方法であって、対象に本発明のワクチン組成物のある用量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。ワクチン組成物は、本明細書に記載されるワクチン組成物のいずれか1つである。様々な態様において、免疫応答は保護免疫応答である。様々な態様において、用量は予防有効用量または治療有効用量である。
様々な態様において、ワクチン組成物は、静脈内に、または髄腔内に、皮下に、筋肉内に、皮内にまたは鼻腔内に投与される。様々な態様において、ワクチン組成物は、鼻腔内に投与される。様々な態様において、ワクチン組成物は、点鼻薬または経鼻スプレーを介して投与される。
様々な態様は、対象において免疫応答を誘発する方法であって、対象に本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのある用量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは、本明細書に記載される改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのいずれか1つである。様々な態様において、免疫応答は保護免疫応答である。様々な態様において、用量は予防有効用量または治療有効用量である。
様々な態様において、用量は約103～107 PFUである。様々な態様において、用量は約104～106 PFUである。様々な態様において、用量は約103 PFUである。様々な態様において、用量は約104 PFUである。様々な態様において、用量は約105 PFUである。様々な態様において、用量は約106 PFUである。様々な態様において、用量は約107 PFUである。
様々な態様において、用量は約5×103 PFUである。様々な態様において、用量は約5×104 PFUである。様々な態様において、用量は約5×105 PFUである。様々な態様において、用量は約5×106 PFUである。様々な態様において、用量は約5×107 PFUである。
様々な態様において、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは、静脈内に、または髄腔内に、皮下に、筋肉内に、皮内にまたは鼻腔内に投与される。様々な態様において、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは、鼻腔内に投与される。様々な態様において、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは、点鼻薬または経鼻スプレーを介して投与される。
様々な態様は、対象において免疫応答を誘発する方法であって、以下：
本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのプライム用量を対象に投与する工程；および
本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスの1つまたは複数のブースト用量を対象に投与する工程
を含む、前記方法を提供する。
改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは、本明細書に記載される改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのいずれか1つである。様々な態様において、用量は予防有効用量または治療有効用量である。
本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのプライム用量を対象に投与する工程；および
本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスの1つまたは複数のブースト用量を対象に投与する工程
を含む、前記方法を提供する。
改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは、本明細書に記載される改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのいずれか1つである。様々な態様において、用量は予防有効用量または治療有効用量である。
様々な態様において、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのプライム用量および/または1つもしくは複数のブースト用量は、静脈内に、または髄腔内に、皮下に、筋肉内に、皮内にまたは鼻腔内に投与される。様々な態様において、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのプライム用量および/または1つもしくは複数のブースト用量は、鼻腔内に投与される。様々な態様において、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのプライム用量および/または1つもしくは複数のブースト用量は、点鼻薬または経鼻スプレーを介して投与される。
様々な態様は、対象において免疫応答を誘発する方法であって、以下：
本発明の免疫組成物のプライム用量を対象に投与する工程；および
本発明の免疫組成物の1つまたは複数のブースト用量を対象に投与する工程
を含む、前記方法を提供する。
免疫組成物は、本明細書に記載される免疫組成物のいずれか1つである。様々な態様において、用量は予防有効用量または治療有効用量である。
本発明の免疫組成物のプライム用量を対象に投与する工程；および
本発明の免疫組成物の1つまたは複数のブースト用量を対象に投与する工程
を含む、前記方法を提供する。
免疫組成物は、本明細書に記載される免疫組成物のいずれか1つである。様々な態様において、用量は予防有効用量または治療有効用量である。
様々な態様において、免疫組成物のプライム用量および/または1つもしくは複数のブースト用量は、静脈内に、または髄腔内に、皮下に、筋肉内に、皮内にまたは鼻腔内に投与される。様々な態様において、免疫組成物のプライム用量および/または1つもしくは複数のブースト用量は、鼻腔内に投与される。様々な態様において、免疫組成物のプライム用量および/または1つもしくは複数のブースト用量は、点鼻薬または経鼻スプレーを介して投与される。
様々な態様は、対象において免疫応答を誘発する方法であって、以下：
本発明のワクチン組成物のプライム用量を対象に投与する工程；および
本発明のワクチン組成物の1つまたは複数のブースト用量を対象に投与する工程
を含む、前記方法を提供する。
ワクチン組成物は、本明細書に記載されるワクチン組成物のいずれか1つである。様々な態様において、用量は予防有効用量または治療有効用量である。
本発明のワクチン組成物のプライム用量を対象に投与する工程；および
本発明のワクチン組成物の1つまたは複数のブースト用量を対象に投与する工程
を含む、前記方法を提供する。
ワクチン組成物は、本明細書に記載されるワクチン組成物のいずれか1つである。様々な態様において、用量は予防有効用量または治療有効用量である。
様々な態様において、ワクチン組成物のプライム用量および/または1つもしくは複数のブースト用量は、静脈内に、または髄腔内に、皮下に、筋肉内に、皮内にまたは鼻腔内に投与される。様々な態様において、ワクチン組成物のプライム用量および/または1つもしくは複数のブースト用量は、鼻腔内に投与される。様々な態様において、ワクチン組成物のプライム用量および/または1つもしくは複数のブースト用量は、点鼻薬または経鼻スプレーを介して投与される。
プライムおよびブースト投薬の間のタイミングは、例えば、感染または疾患のステージ（例えば、非感染、感染、感染後の日数）、および患者の健康状態に依存して変動し得る。様々な態様において、1つまたは複数のブースト用量は、プライム用量の約2週後に投与される。すなわち、プライム用量が投与され、その約2週後にブースト用量が投与される。様々な態様において、1つまたは複数のブースト用量は、プライム用量の約4週後に投与される。様々な態様において、1つまたは複数のブースト用量は、プライム用量の約6週後に投与される。様々な態様において、1つまたは複数のブースト用量は、プライム用量の約8週後に投与される。様々な態様において、1つまたは複数のブースト用量は、プライム用量の約12週後に投与される。様々な態様において、1つまたは複数のブースト用量は、プライム用量の約1～12週後に投与される。
様々な態様において、1つまたは複数のブースト用量は、1つのブースト用量として与えられ得る。他の態様において、1つまたは複数のブースト用量は、定期的にブースト用量として与えられ得る。例えば、それは、3か月毎、4か月毎、6か月毎、1年毎、2年毎、3年毎、4年毎、5年毎、6年毎、7年毎、8年毎、9年毎、または10年毎に与えられ得る。
様々な態様において、プライム用量およびブースト用量は各々、約103～107 PFUである。様々な態様において、プライム用量およびブースト用量は各々、約104～106 PFUである。様々な態様において、プライム用量およびブースト用量は各々、約103 PFUである。様々な態様において、プライム用量およびブースト用量は各々、約104 PFUである。様々な態様において、プライム用量およびブースト用量は各々、約105 PFUである。様々な態様において、プライム用量およびブースト用量は各々、約106 PFUである。様々な態様において、用量は約107 PFUである。
様々な態様において、プライム用量およびブースト用量は各々、約5×103 PFUである。様々な態様において、プライム用量およびブースト用量は各々、約5×104 PFUである。様々な態様において、プライム用量およびブースト用量は各々、約5×105 PFUである。様々な態様において、プライム用量およびブースト用量は各々、約5×106 PFUである。様々な態様において、プライム用量およびブースト用量は各々、約5×107 PFUである。
様々な態様において、プライム用量およびブースト用量のための投薬量は同じである。
様々な態様において、投薬量はプライムおよびブースト投薬の間で変動し得る。非限定的な例として、プライム用量は、ブースト用量と比較して、より少ないコピーのウイルスを含有し得る。例えば、プライム用量は約103 PFUであり、ブースト用量は約104～106 PFUである、または、プライム用量は約104、ブースト用量は約105～107 PFUである。
ブースト用量が定期的に投与される様々な態様において、その後のブースト用量は最初のブースト用量よりも少ないものであり得る。
別の非限定的な例として、プライム用量は、ブースト用量と比較して、より多いコピーのウイルスを含有し得る。
様々な態様において、免疫応答は保護免疫応答である。
様々な態様において、用量は予防有効用量または治療有効用量である。
様々な態様において、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、本発明の免疫組成物または本発明のワクチン組成物の鼻腔内投与は、以下：
鼻をかみ、頭部を後ろに傾けるように、対象に指示する工程；
任意で、頭部の位置を変えて、組成物が鼻の外側または咽頭の下に落ちることを回避するように、対象に指示する工程；
投薬量を含む約0.25mLを各鼻孔中に投与する工程；
穏やかに鼻から吸うように対象に指示する工程；および
一定の期間（例えば、約60分）にわたり、鼻をかまないように対象に指示する工程
を含む。
鼻をかみ、頭部を後ろに傾けるように、対象に指示する工程；
任意で、頭部の位置を変えて、組成物が鼻の外側または咽頭の下に落ちることを回避するように、対象に指示する工程；
投薬量を含む約0.25mLを各鼻孔中に投与する工程；
穏やかに鼻から吸うように対象に指示する工程；および
一定の期間（例えば、約60分）にわたり、鼻をかまないように対象に指示する工程
を含む。
一部の態様において、対象はいかなる免疫抑制用医薬品も摂取していない。様々な態様において、対象は、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、本発明の免疫組成物または本発明のワクチン組成物の投与前に、約180日、150日、120日、90日、75日、60日、45日、30日、15日または7日、いかなる免疫抑制医薬品も摂取していない。様々な態様において、対象は、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、本発明の免疫組成物または本発明のワクチン組成物の投与後に、約1日、7日、14日、30日、45日、60日、75日、90日、120日、150日、180日、9か月、12か月、15か月、18か月、21か月、または24か月にわたり、いかなる免疫抑制医薬品も摂取しない。
免疫抑制用医薬品（以下：コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン（Deltasone、Orasone）、ブデソニド（Entocort EC）、プレドニゾロン（Millipred））、カルシニューリン阻害剤（例えば、サイクロスポリン（Neoral、Sandimmune、SangCya）、タクロリムス（Astagraf XL、Envarsus XR、Prograf）、ラパマイシン機構的標的（Mechanistic target of rapamycin;mTOR）阻害剤（例えば、シロリムス（Rapamune）、エベロリムス（Afinitor、Zortress））、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（IMDH）阻害剤、（例えば、アザチオプリン（Azasan、Imuran）、レフルノミド（Arava）、ミコフェノール酸塩（CellCept、Myfortic））、バイオロジクス（例えば、アバタセプト（Orencia）、アダリムマブ（Humira）、アナキンラ（Kineret）、セルトリズマブ（Cimzia）、エタネルセプト（Enbrel）、ゴリムマブ（Simponi）、インフリキシマブ（Remicade）、イキセキズマブ（Taltz）、ナタリズマブ（Tysabri）、リツキシマブ（Rituxan）、セクキヌマブ（Cosentyx）、トシリズマブ（Actemra）、ウステキヌマブ（Stelara）、ベドリズマブ（Entyvio））、モノクローナル抗体（例えば、バシリキシマブ（Simulect）、ダクリズマブ（Zinbryta）、ムロモナブ（Orthoclone OKT3）が挙げられるがこれらに限定されない）。
医療用途
本発明の様々な態様は、免疫応答の誘発における使用のための、またはCOVID-19の治療的もしくは予防的処置のための、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物を提供する。
本発明の様々な態様は、免疫応答の誘発における使用のための、またはCOVID-19の治療的もしくは予防的処置のための、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物を提供する。
本発明の様々な態様は、免疫応答の誘発のため、またはCOVID-19の治療的もしくは予防的処置における使用のためであって、前記使用が、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、または本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物の、プライム用量、および本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、または本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物の、1つまたは複数のブースト用量を含む、前記使用のための本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物を提供する。
本発明の様々な態様は、免疫応答を誘発するための、またはCOVID-19の治療的もしくは予防的処置のための医薬の製造における本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物の使用を提供する。
本発明の様々な態様は、免疫応答の誘発のための、またはCOVID-19の治療的もしくは予防的処置における使用のための、医薬の製造における本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物の使用であって、前記医薬が、本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、または本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物の、プライム用量、および本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、または本発明のワクチン組成物、または本発明の免疫組成物の、1つまたは複数のブースト用量を含む、前記使用を提供する。
本発明の改変型SARS-CoV-2コロナウイルスは、本明細書に記載される改変型SARS-CoV-2コロナウイルスのいずれか1つである。本発明のワクチン組成物は、本明細書に記載されるワクチン組成物のいずれか1つである。本発明の免疫組成物は、本明細書に記載される免疫組成物のいずれか1つである。
様々な態様において、免疫応答は保護免疫応答である。
製造方法
様々な態様は、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスを製造する方法であって、以下：
親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のタンパク質または1つもしくは複数のその断片をコードするヌクレオチド配列を得る工程；
前記1つもしくは複数のタンパク質または1つもしくは複数のその断片のタンパク質発現を低減させるために、前記ヌクレオチド配列を再コードする工程；および
前記改変型SARS-CoV-2コロナウイルスゲノムを製造するために、前記再コードされたヌクレオチド配列を有する核酸で前記親SARS-CoV-2コロナウイルスゲノムを置換する工程
を含み、
前記再コードされたヌクレオチド配列の発現が、親ウイルスと比較して、低減されている、前記方法を提供する。
様々な態様は、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスを製造する方法であって、以下：
親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のタンパク質または1つもしくは複数のその断片をコードするヌクレオチド配列を得る工程；
前記1つもしくは複数のタンパク質または1つもしくは複数のその断片のタンパク質発現を低減させるために、前記ヌクレオチド配列を再コードする工程；および
前記改変型SARS-CoV-2コロナウイルスゲノムを製造するために、前記再コードされたヌクレオチド配列を有する核酸で前記親SARS-CoV-2コロナウイルスゲノムを置換する工程
を含み、
前記再コードされたヌクレオチド配列の発現が、親ウイルスと比較して、低減されている、前記方法を提供する。
様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、野生型（wt）ウイルス核酸である。様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、天然分離株ウイルス核酸である。様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスは、以前に改変されたウイルス核酸、または以前に弱毒化されたウイルス核酸である。様々な態様において、親SARS-CoV-2コロナウイルスはSARS-CoV-2バリアントである。
様々な態様において、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスゲノムの製造は、クローニング宿主を使用することを含む。
様々な態様において、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスゲノムの製造は、感染性cDNAクローンを構築すること、BACベクターを使用すること、オーバーラップ伸長PCR戦略を使用すること、またはロングPCRベースの融合戦略を含む。
様々な態様において、改変型SARS-CoV-2コロナウイルスゲノムは、欠失、置換および付加を含めて、1つまたは複数の突然変異をさらに含む。1つまたは複数は、1～5、6～10、11～15、16～20、21～25、26～30、31～35、36～40、41～45、46～50、51～60、61～70、71～80、81～90、または91～100個の突然変異であり得る。
様々な態様において、ヌクレオチド配列を再コードして、1つもしくは複数のタンパク質、または1つもしくは複数のその断片のタンパク質発現を低減させる工程は、本明細書に記載されるように、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、コドンペアバイアス（CPB）を低減させること、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、コドン使用頻度バイアスを低減させること、またはその親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、CpGまたはUpAジヌクレオチドの数を増加させることによって為される。
弱毒化ウイルスの生成
本発明の様々な態様は、弱毒化されたものを生成する方法であって、以下：
ウイルスゲノムを含むベクターで細胞の集団にトランスフェクションする工程；
細胞培養物中の細胞の集団を少なくとも1回継代する工程；
細胞培養物から上清を収集する工程
を含む、前記方法を提供する。
本発明の様々な態様は、弱毒化されたものを生成する方法であって、以下：
ウイルスゲノムを含むベクターで細胞の集団にトランスフェクションする工程；
細胞培養物中の細胞の集団を少なくとも1回継代する工程；
細胞培養物から上清を収集する工程
を含む、前記方法を提供する。
様々な態様において、前記方法は、上清を濃縮する工程をさらに含む。
様々な態様において、前記方法は、細胞の集団を2～15回継代する工程；および細胞の集団の細胞培養物から上清を収集する工程を含む。様々な態様において、前記方法は、細胞の集団を2～10回継代する工程；および細胞の集団の細胞培養物から上清を収集する工程を含む。様々な態様において、前記方法は、細胞の集団を2～7回継代する工程；および細胞の集団の細胞培養物から上清を収集する工程を含む。様々な態様において、前記方法は、細胞の集団を2～5回継代する工程；および細胞の集団の細胞培養物から上清を収集する工程を含む。様々な態様において、前記方法は、細胞の集団を2、3、4、5、6、7、8、または10回継代する工程；および細胞の集団の細胞培養物から上清を収集する工程を含む。様々な態様において、細胞培養物から上清を収集する工程は、細胞の集団の各継代の間に行われる。他の態様において、細胞培養物から上清を収集する工程は、細胞の集団の1回または複数回の継代の間に行われる。例えば、それは、1回おきの継代；2回毎の継代、3回毎の継代などに行われ得る。
キット
本発明はまた、対象にワクチン接種するため、免疫応答を誘発するため、または対象において保護免疫応答を誘発するための、キットに向けられている。前記キットは、免疫応答を誘発するか、または保護免疫応答を誘発する本発明の方法を実施するために有用である。前記キットは、本発明の組成物の少なくとも1つを含む、材料または構成要素の集合体である。そのため、一部の態様において、前記キットは、本明細書に記載される改変型SARS-CoV-2ウイルスのいずれか1つを含む組成物、本明細書に記載される免疫組成物のいずれか1つ、または本発明の本明細書に記載されるワクチン組成物のいずれか1つを含有する。そのため、一部の態様において、前記キットは、本明細書に記載される本発明の改変型SARS-CoV-2ウイルスを含む組成物、免疫組成物、またはワクチン組成物の、利用される単回投薬量を含有し；例えば、各バイアルは、約103～107 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、またはより特には、104～106 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、104 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、105 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、または106 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス；またはより特には、5×104～5×106 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、5×104 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、5×105 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、または5×106 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルスのために十分な用量を含有する。様々な態様において、キットは、本明細書に記載される本発明の改変型SARS-CoV-2ウイルスを含む組成物、免疫組成物、またはワクチン組成物の、複数回投薬量を含有し；例えば、キットがバイアル当たり10回の投薬量を含有する場合、各バイアルは、約10×103～107 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、またはより特には、10×104～106 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、10×104 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、10×105 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、または10×106 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、またはより特には、50×104～50×106 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、50×104 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、50×105 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、または50×106 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルスを含有する。
本発明はまた、対象にワクチン接種するため、免疫応答を誘発するため、または対象において保護免疫応答を誘発するための、キットに向けられている。前記キットは、免疫応答を誘発するか、または保護免疫応答を誘発する本発明の方法を実施するために有用である。前記キットは、本発明の組成物の少なくとも1つを含む、材料または構成要素の集合体である。そのため、一部の態様において、前記キットは、本明細書に記載される改変型SARS-CoV-2ウイルスのいずれか1つを含む組成物、本明細書に記載される免疫組成物のいずれか1つ、または本発明の本明細書に記載されるワクチン組成物のいずれか1つを含有する。そのため、一部の態様において、前記キットは、本明細書に記載される本発明の改変型SARS-CoV-2ウイルスを含む組成物、免疫組成物、またはワクチン組成物の、利用される単回投薬量を含有し；例えば、各バイアルは、約103～107 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、またはより特には、104～106 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、104 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、105 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、または106 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス；またはより特には、5×104～5×106 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、5×104 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、5×105 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、または5×106 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルスのために十分な用量を含有する。様々な態様において、キットは、本明細書に記載される本発明の改変型SARS-CoV-2ウイルスを含む組成物、免疫組成物、またはワクチン組成物の、複数回投薬量を含有し；例えば、キットがバイアル当たり10回の投薬量を含有する場合、各バイアルは、約10×103～107 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、またはより特には、10×104～106 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、10×104 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、10×105 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、または10×106 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、またはより特には、50×104～50×106 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、50×104 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、50×105 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルス、または50×106 PFUの改変型SARS-CoV-2ウイルスを含有する。
本発明のキット中に構成される構成要素の正確な性質は、その意図される目的に依存する。例えば、一部の態様は、対象にワクチン接種する目的のため、免疫応答を誘発するため、または対象において保護免疫応答を誘発するために、構成される。1つの態様において、キットは特に、哺乳動物対象を予防的に処置する目的のために構成される。別の態様において、キットは特に、ヒト対象を予防的に処置する目的のために構成される。さらなる態様において、キットは、対象、以下に限定されないが例えば、農用動物、家畜動物、および実験動物を処置する獣医学的応用のために構成される。
使用のための指示書がキット中に含められてもよい。「使用のための指示書」は、典型的には、所望のアウトカムをもたらすため、例えば対象にワクチン接種するため、免疫応答を誘発するため、または対象において保護免疫応答を誘発するための、キットの構成要素の使用において用いられる技術を記載する有形表現物を含む。例えば、経鼻投与のために、使用のための指示書は、以下：
対象が鼻をかみ、頭部を後ろに傾けるための指示書；
対象が頭部の位置を変えて、組成物が鼻の外側または咽頭の下に落ちることを回避するための指示書；
投薬量を含む約0.25mLを各鼻孔中に投与するための指示書；
対象が穏やかに鼻から吸うための指示書；および/または
対象が一定の期間（例えば、約60分）にわたり、鼻をかまないための指示書
を含み得るがこれらに限定されない。さらなる指示書は、対象がいかなる免疫抑制用医薬品も摂取しないための指示書を含み得る。
対象が鼻をかみ、頭部を後ろに傾けるための指示書；
対象が頭部の位置を変えて、組成物が鼻の外側または咽頭の下に落ちることを回避するための指示書；
投薬量を含む約0.25mLを各鼻孔中に投与するための指示書；
対象が穏やかに鼻から吸うための指示書；および/または
対象が一定の期間（例えば、約60分）にわたり、鼻をかまないための指示書
を含み得るがこれらに限定されない。さらなる指示書は、対象がいかなる免疫抑制用医薬品も摂取しないための指示書を含み得る。
任意で、キットはまた、他の有用な構成要素、例えば、希釈剤、緩衝剤、薬学的に許容される担体、シリンジ、ドロッパー、カテーテル、アプリケーター、ピペッティングもしくは測定ツール、バンデージ材料または当業者に容易に認識されるような他の有用な用具を含有する。
キット中に集合させた材料または構成要素は、それらの実行可能性および有用性を保存する任意の好都合なおよび好適なやり方で貯蔵されて実務者に提供され得る。例えば、構成要素は、溶解、脱水、または凍結乾燥形態であり得；それらは、室温、冷蔵温度または凍結温度で提供され得る。構成要素は、典型的には、好適なパッケージング材料中に含有される。本明細書において用いられる場合、「パッケージング材料」という語句は、キットの内容物、例えば本発明の組成物などを収容するために使用される1つまたは複数の物理的構造物を指す。パッケージング材料は、好ましくは無菌の、夾雑物がない環境を提供する、公知の方法により構築される。キットにおいて用いられるパッケージング材料は、ワクチンにおいて慣習的に利用されるものである。本明細書において使用される場合、「パッケージ」という用語は、個々のキット構成要素を保持する能力を有する好適な固体マトリックスまたは材料、例えばガラス、プラスチック、紙、およびホイルなどを指す。そのため、例えば、パッケージは、本明細書に記載される本発明の改変型SARS-CoV-2ウイルスを含有する本発明の組成物、免疫組成物、またはワクチン組成物の好適な量を含有するために使用されるガラスバイアルであり得る。パッケージング材料は、一般に、キットおよび/またはその構成要素の内容物および/または目的を示す外的な標識を有する。
配列
SEQ ID NO:2 - BsaIおよびBsmBI部位をノックアウトするように改変された制限部位改変参照配列；ノックアウトされた既存のBsaI：a17973g（Arg AGAをAGGへ）、c24106 t（Asp GACをGATへ）；ノックアウトされた既存のBsmBI部位：c2197t（Asp GACをGATへ）、a9754g（Arg AGAをAGGへ）、g17331a（Glu GAGをGAAへ）。
SEQ ID NO:2 - BsaIおよびBsmBI部位をノックアウトするように改変された制限部位改変参照配列；ノックアウトされた既存のBsaI：a17973g（Arg AGAをAGGへ）、c24106 t（Asp GACをGATへ）；ノックアウトされた既存のBsmBI部位：c2197t（Asp GACをGATへ）、a9754g（Arg AGAをAGGへ）、g17331a（Glu GAGをGAAへ）。
SEQ ID NO:3 - 脱最適化されたSARS-CoV-2コロナウイルス（Wuhan-CoV＿101K）（BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019と比べて脱最適化されている）。脱最適化された領域：11294～12709、14641～15903（nsp12（例えば、RNA依存性RNAポリメラーゼ「RdRP」）ドメイン）、21656～22306（スパイク開始部）、22505～23905（スパイク中央部）、24110～25381（スパイク終端部）。
SEQ ID NO:4（ワシントン分離株（GenBank:MN985325.1）と比べて脱最適化されている；スパイクタンパク質中に36ヌクレオチドの欠失を有する）。
様々な態様において、SEQ ID NO:4に関して、突然変異は、以下において存在する：
3009 TからAへ（IleからLysへ）：［3009:3009］；
9199 CからTへサイレント：［9199:9199］；
11524 CからTへサイレント：［11524:11524］；
16388 GからAへ（SerからAsnへ）：［16388:16388］；
21846 tからCへ（IleからThrへ）：［21846:21846］；
22296 gからAへ（ArgからHisへ）：［22296:22296］；
24201 TからCへ（ValからAlaへ）：［24237:24237］；および/または
の36ntの付加：［23594］。
3009 TからAへ（IleからLysへ）：［3009:3009］；
9199 CからTへサイレント：［9199:9199］；
11524 CからTへサイレント：［11524:11524］；
16388 GからAへ（SerからAsnへ）：［16388:16388］；
21846 tからCへ（IleからThrへ）：［21846:21846］；
22296 gからAへ（ArgからHisへ）：［22296:22296］；
24201 TからCへ（ValからAlaへ）：［24237:24237］；および/または
SEQ ID NO:6（USA/WA1/2020野生型スパイクと比較して、再コードされたスパイクタンパク質）。
SEQ ID NO:7 -（脱最適化されたSARS-CoV-2）； 29853bp、フューリン切断部位の除去。
以下の実施例は、請求項の発明をより良好に説明するために提供され、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。特有の材料が言及される場合、それは単に実例の目的のためであり、本発明を限定することは意図されない。当業者は、発明的能力を発揮することなく、本発明の範囲から離れることなく、同等の手段または反応物を開発することができる。
実施例1
オーバーラッピングPCR
工程1：PCRおよびゲル精製。プライマーおよび鋳型。T7プロモーターからの開始のため。
オーバーラッピングPCR
工程1：PCRおよびゲル精製。プライマーおよび鋳型。T7プロモーターからの開始のため。
断片0中にpCMVを含めるため。
工程2：オーバーラッピングPCR。
最初に4～5片をオーバーラップさせ、生成物を精製し、次に全長ゲノムを得るようにオーバーラップさせる必要があり得る。
最初に4～5片をオーバーラップさせ、生成物を精製し、次に全長ゲノムを得るようにオーバーラップさせる必要があり得る。
工程3：
オプション1：インビトロ転写のための直接的な使用/オーバーラッピングPCR生成物としての貯蔵；
オプション2：pCC1BACベクターへのクローニング。
オプション1：インビトロ転写のための直接的な使用/オーバーラッピングPCR生成物としての貯蔵；
オプション2：pCC1BACベクターへのクローニング。
CoVゲノムをpCC1BACベクターにクローニングするために、断片0および断片19を増幅するためならびにオーバーラッピング後の最終増幅において、フォワードおよびリバースプライマーとして＃1883および1890を使用する。NEB Golden gate assemblyを使用してBsa I保有pCC1BACと集合させる。
Bsa I部位を通じてpGGAベクター（Golden gate clone kitから）にクローニングし、次にBsa I部位を通じてpCC1BACベクターにクローニングする
pCC1BACは既存のpCC1-CysS-CDプラスミドから得られ、改変が必要である。「pCC1BACの改変」を参照。
pCC1BACは既存のpCC1-CysS-CDプラスミドから得られ、改変が必要である。「pCC1BACの改変」を参照。
工程1：PCRおよびゲル精製。
プライマーおよび鋳型-T7プロモーターから開始するため。
プライマーおよび鋳型-T7プロモーターから開始するため。
順序づけされた断片0中にpCMVを含めるため。
工程2：NEB Golden gate assembly kitを使用してウイルスゲノムを4つの大きい断片に、pGGAにアセンブリーさせる。
断片0（または1）～4、5～9、10～14および15～19。
NEB Golden gate assembly kitのメニューに従う。
断片0（または1）～4、5～9、10～14および15～19。
NEB Golden gate assembly kitのメニューに従う。
工程3：次の工程のアセンブリーのためにpGGAクローンからのウイルス断片をPCRする（新たなBsa I部位の導入も行う）。
工程3.1：PCRを通じたBsa Iの再導入およびゲル精製（個々）。
工程3.2：NEB Golden Gate Assembly kitを使用して4つの大きい断片をpCC1BAC中に集合させる。
全ての断片をpCC1BACベクター中に直接的に集合させる
工程1：PCRおよびゲル精製。
工程1：PCRおよびゲル精製。
工程2：NEB Golden gate assembly kitのメニューにしたがって全長ウイルスゲノムをpCC1BACベクター中にアセンブリーさせる。
NEBuilder HiFi DNAアセンブリー
工程1：PCRおよびゲル精製。実施例1と同様。断片0および断片19のために、PCR用ならびにpCC1BACの5’および3’末端用の、代替的なプライマーを使用する必要がある。
工程1：PCRおよびゲル精製。実施例1と同様。断片0および断片19のために、PCR用ならびにpCC1BACの5’および3’末端用の、代替的なプライマーを使用する必要がある。
pCC1BACとウイルスゲノムとの間のインターセクションのため。
5’インターセクション
3’インターセクション
5’インターセクション
工程2：アセンブリーはNEBuilder HiFiのメニューに従う。
pCC1BACベクターの改変。pCC1BACがpCC1-CysS-CDプラスミドから得られる場合の骨格。それは内部Bsa IおよびBsm BI部位を有する。この改変は、これらの部位を除去するためである。それはまた、2つのNot I部位の間の領域、およびnt8104～8139（？）を除去する。
pCC1BACベクターの改変。pCC1BACがpCC1-CysS-CDプラスミドから得られる場合の骨格。それは内部Bsa IおよびBsm BI部位を有する。この改変は、これらの部位を除去するためである。それはまた、2つのNot I部位の間の領域、およびnt8104～8139（？）を除去する。
工程1：PCRおよびゲル精製。
＊以後のアセンブリー工程を促すために、1851または1852の代わりに1893を使用することができ、1861の代わりに1894を使用することができる。
工程2：オーバーラッピングPCR。この方法-NEBuilderのために、代替的なプライマーを使用する。
実施例2
手順
RT-PCR
コロナウイルス株2019-nCoV/USA-WA1/2020（「WA1」）（BEI Resources NR-52281、Lot 70034262）は、CDCにおけるVero（CCL81）での3継代およびBEI ResourcesにおけるVero E6での1継代後に、BEI Resourcesにより配給された。4継代後の全長ウイルスゲノム配列をCDCにより決定したところ、受領時の、その由来となる臨床検体（GenBankアクセッションMN985325）であるWA1と比較して、ヌクレオチドに差異（Harcourt et al.,2020）を含有しないことが見出された。2％のFBSを含有するDMEM中、37℃でのVero E6細胞におけるさらなる2継代により増幅させた。
手順
RT-PCR
コロナウイルス株2019-nCoV/USA-WA1/2020（「WA1」）（BEI Resources NR-52281、Lot 70034262）は、CDCにおけるVero（CCL81）での3継代およびBEI ResourcesにおけるVero E6での1継代後に、BEI Resourcesにより配給された。4継代後の全長ウイルスゲノム配列をCDCにより決定したところ、受領時の、その由来となる臨床検体（GenBankアクセッションMN985325）であるWA1と比較して、ヌクレオチドに差異（Harcourt et al.,2020）を含有しないことが見出された。2％のFBSを含有するDMEM中、37℃でのVero E6細胞におけるさらなる2継代により増幅させた。
継代数6のWA1ウイルスを使用し、標準的なプロトコールにしたがってTrizol試薬（Thermo Fisher）を用いる抽出によりウイルスゲノムRNAを精製した。簡潔に述べれば、1×10＾7 PFU/mlの力価を有する0.5mlのウイルス試料を、等体積のTrizolで抽出した。この手順は、SARS-CoV2ウイルスの感染力を完全に不活性化することが4つの別々の実験において以前に検証されていた。0.1mlのクロロホルムの添加による相分離後に、水性相中のRNAを等体積のイソプロパノールで沈殿させた。沈殿したRNAを70％のエタノール中で洗浄し、乾燥させ、20ulのRNAseフリー水に再懸濁した。
ウイルスcDNAの生成
SuperScript IV First Strand Synthesis systemを使用して野生型cDNAを合成した。各反応において、チューブ＃1についての13μlの総反応体積を、以下のように準備した：
1. 50μMのオリゴd（T）20：1ul
2. 50ng/μlのランダム六量体：1μl
3. 10mMのdNTP：1μl
4. WT RNA：2～10μl
5. H2O：13μlまで加える。
SuperScript IV First Strand Synthesis systemを使用して野生型cDNAを合成した。各反応において、チューブ＃1についての13μlの総反応体積を、以下のように準備した：
1. 50μMのオリゴd（T）20：1ul
2. 50ng/μlのランダム六量体：1μl
3. 10mMのdNTP：1μl
4. WT RNA：2～10μl
5. H2O：13μlまで加える。
試料を混合し、65℃で5分間インキュベートし、次に直ちに氷上に1分間置いた。7μlの総反応体積を有する、別のチューブ（チューブ＃2）を調製した：
1. 5x緩衝液：4μl
2. 100mMのDTT：1μl
3. Rnase阻害剤（40U/μl）：1μl
4. SuperScript IV酵素：1μl。
1. 5x緩衝液：4μl
2. 100mMのDTT：1μl
3. Rnase阻害剤（40U/μl）：1μl
4. SuperScript IV酵素：1μl。
チューブ＃1およびチューブ＃2を混合して20μlの総反応体積とし、23℃で10分間、続いて50℃で50分間、および80℃で10分間インキュベートしてcDNAを生成させた。
オーバーラッピングポリメラーゼ連鎖反応
Q5 High-Fidelity 2x Master Mixture（NEB、Ipswich、Massachusetts）を使用して、ゲノム断片をcDNAから増幅した。
Q5 High-Fidelity 2x Master Mixture（NEB、Ipswich、Massachusetts）を使用して、ゲノム断片をcDNAから増幅した。
20μlの反応液は、1μlの新たに作製されたcDNA、0.5μMの濃度の1μlのフォワードおよびリバースプライマー（表4に詳述される）、10μlの2x Q5 master mixtureおよびH2Oを含有する。反応パラメーターは以下の通りであった：反応を開始させるために98℃で30秒、続いて98℃で10秒間、60℃で30秒間、および65℃で1分間を30サイクル、ならびに65℃で5分間の最終伸長。断片19（約1.2Kb）を除いていずれも約1.8Kbの計19のゲノム断片が得られ、これらは特異的なプライマー（表4）を使用して、これらのうちの任意の2つの間の200bpのオーバーラップ領域を伴いウイルスゲノム全体をカバーする。アンプリコンをアガロースゲル電気泳動（図2A）により検証し、QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen）を使用して精製した。溶出をNanodropにより定量化した。
Q5（登録商標）High-Fidelity DNA Polymerase（NEB、Ipswich、Massachusetts）を使用してCOVID-19ゲノム全体を再構築した。
最初に、19個全てのゲノム断片をオーバーラッピング反応において使用して、全長ゲノムを再構築した。簡潔に述べれば、30～40ngの各DNA断片（全ての部分の間のモル比は1:1）、10μlの5x反応緩衝液、1μlの10mM dNTP、0.5μlのQ5ポリメラーゼ、および50μlの最終体積までのH2Oを含む混合物を調製した。反応は以下の条件下で実行した：98℃で30秒、および72℃で16分30秒を10サイクル。
次に、2μlのオーバーラップ反応の生成物を、4μlの5x反応緩衝液、1μlの10mM dNTP、1μlの0.5μMの各隣接するプライマー、0.2μlのQ5ポリメラーゼ、および20μlの最終体積までのH2Oと混合し、PCRを以下のように実行した：反応を開始させるために98℃で30秒、続いて98℃で10秒間、60℃で45秒間、および72℃で16分30秒間を15サイクル、ならびに65℃で5分間の最終伸長。結果をチェックするために、5μlのPCR生成物を0.4％のアガロースゲル上で可視化した（図2B）。
（表４）
インビトロ転写
全長PCRから増幅されたDNA鋳型を、従来のフェノール/クロロホルム抽出、続いて3M酢酸ナトリウムの存在下でのエタノール沈殿を使用してRNA作業前に精製した。一部の改変と共に製造者の指示書にしたがってHiScribe T7 Transcription Kit（New England Biolabs）を使用してRNA転写物をインビトロで合成した。500ngのDNA鋳型および2.4μlの50mM GTP（capアナログ対GTP比は1:1）を加えることにより20μlの反応液を準備した。反応液を37℃で3時間インキュベートした。次にRNAを塩化リチウム沈殿法により沈殿し、精製し、70％のエタノールを用いて1回洗浄した。特異的な、
フォワードプライマー：
（小文字配列はT7プロモーターを表し；下線を引いた配列はN遺伝子ORFの上流の5’NTRを表す）および、
リバースプライマー：
を使用して、cDNAからのPCRによりN遺伝子DNA鋳型も調製した。
全長PCRから増幅されたDNA鋳型を、従来のフェノール/クロロホルム抽出、続いて3M酢酸ナトリウムの存在下でのエタノール沈殿を使用してRNA作業前に精製した。一部の改変と共に製造者の指示書にしたがってHiScribe T7 Transcription Kit（New England Biolabs）を使用してRNA転写物をインビトロで合成した。500ngのDNA鋳型および2.4μlの50mM GTP（capアナログ対GTP比は1:1）を加えることにより20μlの反応液を準備した。反応液を37℃で3時間インキュベートした。次にRNAを塩化リチウム沈殿法により沈殿し、精製し、70％のエタノールを用いて1回洗浄した。特異的な、
フォワードプライマー：
リバースプライマー：
RNAエレクトロポレーションによるVero E6細胞のトランスフェクション
Vero E6細胞をATTC（CRL-1586）から得て、10％のFBSを補充したDMEM高グルコース中で維持した。ウイルスRNAをトランスフェクトするために、10μgの精製された全長ゲノムRNA転写物を5ugのキャップ付加WA1-N mRNAと共に、製造者の指示書にしたがってMaxcyte ATX systemを使用してVero E6細胞中にエレクトロポレートした。簡潔に述べれば、3～4×106個のVero E6細胞をMaxcyteエレクトロポレーション緩衝液中で1回洗浄し、100μlの同じ緩衝液中に再懸濁した。細胞懸濁液を穏やかにRNA試料と混合し、RNA/細胞混合物をMaxcyte OC-100処理アセンブリーに移した。予めプログラムされたVero細胞エレクトロポレーションプロトコールを使用してエレクトロポレーションを行った。37C/5％CO2でのトランスフェクトされた細胞の30分の回復後に、細胞を温DMEM/10％ FBSに再懸濁し、様々な播種密度（総細胞の1/2、1/3、1/6）で、3つのT25フラスコの間で分配した。トランスフェクトされた細胞を37℃/5％CO2で6日間またはCPEが現れるまでインキュベートした。感染培地を2、4、および6日目に収集し、2日目および4日目に完全に培地交換した（DMEM/5％FBS）。生成されたウイルスは、トランスフェクション後の早くも2日目にプラークアッセイにより検出可能であり、ウイルス生成のピークは4～6日目であった。
Vero E6細胞をATTC（CRL-1586）から得て、10％のFBSを補充したDMEM高グルコース中で維持した。ウイルスRNAをトランスフェクトするために、10μgの精製された全長ゲノムRNA転写物を5ugのキャップ付加WA1-N mRNAと共に、製造者の指示書にしたがってMaxcyte ATX systemを使用してVero E6細胞中にエレクトロポレートした。簡潔に述べれば、3～4×106個のVero E6細胞をMaxcyteエレクトロポレーション緩衝液中で1回洗浄し、100μlの同じ緩衝液中に再懸濁した。細胞懸濁液を穏やかにRNA試料と混合し、RNA/細胞混合物をMaxcyte OC-100処理アセンブリーに移した。予めプログラムされたVero細胞エレクトロポレーションプロトコールを使用してエレクトロポレーションを行った。37C/5％CO2でのトランスフェクトされた細胞の30分の回復後に、細胞を温DMEM/10％ FBSに再懸濁し、様々な播種密度（総細胞の1/2、1/3、1/6）で、3つのT25フラスコの間で分配した。トランスフェクトされた細胞を37℃/5％CO2で6日間またはCPEが現れるまでインキュベートした。感染培地を2、4、および6日目に収集し、2日目および4日目に完全に培地交換した（DMEM/5％FBS）。生成されたウイルスは、トランスフェクション後の早くも2日目にプラークアッセイにより検出可能であり、ウイルス生成のピークは4～6日目であった。
ストックウイルスの継代およびVero E6細胞でのSARS-CoV-2のプラーク滴定
連続10倍希釈液をDMEM/2％FBS中で調製した。0.5mlの各希釈液を、12ウェルの、80％コンフルエントなVero E6細胞に加えた。37℃での1時間のインキュベーション後に、接種物を除去し、1x DMEM、0.3％のトラガカントゴム、2％のFBSおよび1xペニシリン/ストレプトマイシンを含有する2mlの半固体オーバーレイをウェル毎に加えた。37℃/5％CO2での3または4日のインキュベーション後に、オーバーレイを除去し、ウェルをPBSで穏やかにリンスし、続いて固定およびCrystal Violetでの染色を行った。
連続10倍希釈液をDMEM/2％FBS中で調製した。0.5mlの各希釈液を、12ウェルの、80％コンフルエントなVero E6細胞に加えた。37℃での1時間のインキュベーション後に、接種物を除去し、1x DMEM、0.3％のトラガカントゴム、2％のFBSおよび1xペニシリン/ストレプトマイシンを含有する2mlの半固体オーバーレイをウェル毎に加えた。37℃/5％CO2での3または4日のインキュベーション後に、オーバーレイを除去し、ウェルをPBSで穏やかにリンスし、続いて固定およびCrystal Violetでの染色を行った。
インビトロ転写から得られたRNAを使用して、wt WA1およびCDX-005をVero E6細胞にトランスフェクトし、Vero E6細胞で滴定された生ウイルスを回収した。3日間のインキュベーション後に、プラークアッセイを染色した。
多工程ウイルス増殖動態
5％のウシ胎仔血清（FBS）を含む1mlのDMEMを含有する12ウェルプレート中で3日間、コンフルエンシー近くに達するまでVero細胞（WHO 10-87）を生育した。感染前に、使用済みの細胞培養培地を、1％のFBSおよび30PFUの示されるウイルス（MOI 0.0001）を含有する0.5mlの新鮮なDMEMで置き換えた。33℃または37℃/5％ CO2での1時間のインキュベーション後に、接種物を廃棄し、細胞単層を1mlのダルベッコPBSで1回洗浄し、続いて1％のFBSを含有する1mlのDMEMを加えた。感染細胞を33℃または37℃で0、6、24、48、または72時間インキュベートした。示される時点において、細胞および上清を収集し（1ウェル/時点）、-80Cで1回凍結させ、解凍した。溶解液中の感染性ウイルス力価を37℃におけるVero E6でのプラークアッセイにより決定した。
5％のウシ胎仔血清（FBS）を含む1mlのDMEMを含有する12ウェルプレート中で3日間、コンフルエンシー近くに達するまでVero細胞（WHO 10-87）を生育した。感染前に、使用済みの細胞培養培地を、1％のFBSおよび30PFUの示されるウイルス（MOI 0.0001）を含有する0.5mlの新鮮なDMEMで置き換えた。33℃または37℃/5％ CO2での1時間のインキュベーション後に、接種物を廃棄し、細胞単層を1mlのダルベッコPBSで1回洗浄し、続いて1％のFBSを含有する1mlのDMEMを加えた。感染細胞を33℃または37℃で0、6、24、48、または72時間インキュベートした。示される時点において、細胞および上清を収集し（1ウェル/時点）、-80Cで1回凍結させ、解凍した。溶解液中の感染性ウイルス力価を37℃におけるVero E6でのプラークアッセイにより決定した。
結果
オーバーラッピングPCRにより生成された個々のゲノム断片1～19およびゲノムDNA全体の生成は良好に進行し、明確なバンドが0.4％のアガロースゲル上に見られた（図2A）。
オーバーラッピングPCRにより生成された個々のゲノム断片1～19およびゲノムDNA全体の生成は良好に進行し、明確なバンドが0.4％のアガロースゲル上に見られた（図2A）。
インビトロ転写により生成されたRNAを使用して、S-WWW（WT）およびS-WWDをVero E6細胞にトランスフェクトし、Vero E6細胞で滴定された生ウイルスを回収した。3日間のインキュベーション後に、プラークアッセイを染色したところ、部分的にスパイク脱最適化されたS-WWD候補中に観察される、より小さいプラーク（図3）および40％低減された最終力価が観察された。
実施例3
CDX-005プレマスターウイルスシード（プレMVS）を以下のように開発した：SARS-COV-2 BetaCoV/USA/WA1/2020（GenBank:MN985325.1）のRNAを、感染させ特徴付けられたVero E6細胞（ATCC CRL-1586 Lot＃70010177）から抽出し、商業的に入手可能な試薬およびキットを使用して、RT-PCRにより19個のオーバーラップするDNA断片に変換した。オーバーラッピングPCRを使用して、1つの脱最適化されたスパイク遺伝子カセットと共に191.8kbのwtゲノム断片にまとめ合わせた。特に、スパイクORFの1,272ヌクレオチドをゲノム位置24115～25387からヒトコドンペア脱最適化して、親WA1/2020ウイルスと比べて283のサイレント突然変異変化を結果として得た。結果として得られた全長cDNAをインビトロで転写して全長ウイルスRNAを調製した。ウイルス回収は、Stony Brook University（NY）の新たなBSL-3実験室において実行した。該実験室は2020年4月に初めて稼働され、本発明者らのプロジェクトは該実験室においてこれまで行われた唯一のプロジェクトであった。このウイルスRNAを次に、特徴付けられたVero E6細胞（Lot＃70010177）中にエレクトロポレートした。これによりCDX-005ウイルス（図3）を得、それをその後にVero E6細胞で追加の時間だけ継代して、継代数1、P1（Lot＃1-060820-9-1）を得た。P1材料を、以下に記載されるハムスター研究において使用した。
CDX-005プレマスターウイルスシード（プレMVS）を以下のように開発した：SARS-COV-2 BetaCoV/USA/WA1/2020（GenBank:MN985325.1）のRNAを、感染させ特徴付けられたVero E6細胞（ATCC CRL-1586 Lot＃70010177）から抽出し、商業的に入手可能な試薬およびキットを使用して、RT-PCRにより19個のオーバーラップするDNA断片に変換した。オーバーラッピングPCRを使用して、1つの脱最適化されたスパイク遺伝子カセットと共に191.8kbのwtゲノム断片にまとめ合わせた。特に、スパイクORFの1,272ヌクレオチドをゲノム位置24115～25387からヒトコドンペア脱最適化して、親WA1/2020ウイルスと比べて283のサイレント突然変異変化を結果として得た。結果として得られた全長cDNAをインビトロで転写して全長ウイルスRNAを調製した。ウイルス回収は、Stony Brook University（NY）の新たなBSL-3実験室において実行した。該実験室は2020年4月に初めて稼働され、本発明者らのプロジェクトは該実験室においてこれまで行われた唯一のプロジェクトであった。このウイルスRNAを次に、特徴付けられたVero E6細胞（Lot＃70010177）中にエレクトロポレートした。これによりCDX-005ウイルス（図3）を得、それをその後にVero E6細胞で追加の時間だけ継代して、継代数1、P1（Lot＃1-060820-9-1）を得た。P1材料を、以下に記載されるハムスター研究において使用した。
実施例4
GMP段階に入るために好適なシードウイルス（プレMVS）を製造するために、New Zealandをソースとする適格な2％のウシ胎仔血清（FBS）を補充した本発明者らの特徴付けられた10-87 WHO Vero細胞（Lot:563173-MCB1、COAおよび特徴付け試験）において、P1ロットをCodagenixにおいて継代した。結果として得られたウイルスを遠心分離により清澄化し、無菌濾過し、2mlのクライオバイアルに充填して、5×105 2.6×106 pfu/mlの力価を有するプレMVS（Lot＃1-061720-1）を得た。プレMVSは、BSL3下での無菌状態およびマイコプラズマ試験のためにBioReliance（Glasgow、UK）に送られる。さらには、1-061720-1を製造したVero培養物を完全な細胞傷害効果のためにさらに2日間生育し、次にバイアルに入れて、Charles River Laboratories（Malvern、PA、USA）においてサル、ヒト、ブタおよびウシウイルスを含む、包括的な、分子ベースの、外来性ウイルス試験を実行した（表5）。
GMP段階に入るために好適なシードウイルス（プレMVS）を製造するために、New Zealandをソースとする適格な2％のウシ胎仔血清（FBS）を補充した本発明者らの特徴付けられた10-87 WHO Vero細胞（Lot:563173-MCB1、COAおよび特徴付け試験）において、P1ロットをCodagenixにおいて継代した。結果として得られたウイルスを遠心分離により清澄化し、無菌濾過し、2mlのクライオバイアルに充填して、5×105 2.6×106 pfu/mlの力価を有するプレMVS（Lot＃1-061720-1）を得た。プレMVSは、BSL3下での無菌状態およびマイコプラズマ試験のためにBioReliance（Glasgow、UK）に送られる。さらには、1-061720-1を製造したVero培養物を完全な細胞傷害効果のためにさらに2日間生育し、次にバイアルに入れて、Charles River Laboratories（Malvern、PA、USA）においてサル、ヒト、ブタおよびウシウイルスを含む、包括的な、分子ベースの、外来性ウイルス試験を実行した（表5）。
（表５）CDX-005プレMVSのための外来性ウイルス試験パネル
マスターシードウイルス（MSV）をフェーズI試験材料として使用し、これはcGMP対応で製造される。CDX-005をVero（ATCC CCL-81）細胞株において製造し、適格な方法を使用して試験し、臨床試験用の製品をリリースする。CDX-005の製剤は、フェーズIII試験において鼻腔内用の生弱毒化インフルエンザワクチンのために現在用いられており、安定性および安全性を提供することが示されている。製造プロセスを下記に示す。
CDX-005の製造プロセス
実施例5A
COVID-19モデリングに関するWHO ad hoc Expert Working Groupは、アカゲザルおよびフェレットは両方とも、軽度から中等度のヒト疾患を再現するらしいと結論付けたが、より最近の研究（Chan、Sia）は、シリアンゴールデンハムスターは、この感染症の、より重篤な肺症状を再現するより有用なモデルであり得ることを示唆している。
COVID-19モデリングに関するWHO ad hoc Expert Working Groupは、アカゲザルおよびフェレットは両方とも、軽度から中等度のヒト疾患を再現するらしいと結論付けたが、より最近の研究（Chan、Sia）は、シリアンゴールデンハムスターは、この感染症の、より重篤な肺症状を再現するより有用なモデルであり得ることを示唆している。
CDX-005のインビボ特性を調べるために、本発明者らはシリアンゴールデンハムスターに転向した。これらのハムスターがヒトCOVID-19疾患の特徴を最良に再現することを、現行の動物モデルの最近の調査は示している。SARS-CoV-2はハムスター肺において効率的に複製して、鼻腔内感染後に重篤な病理学的損傷を引き起こす。ウイルス抗原は、SARS-CoV-2接種後2および5日目に鼻粘膜、気管支上皮、および肺コンソリデーションの区画に存在し、7日目にクリアランスされる。臨床徴候としては、ウイルスチャレンジの1週以内の呼吸促迫、体重喪失、肺/気道における組織病理学的変化、腸の関与、脾臓およびリンパ萎縮、ならびにサイトカイン活性化が挙げられる。感染したハムスターは、同じケージ中で飼育された他のハムスターに感染させることができ、中和抗体（Ab）がチャレンジ後14日目に検出される。
本発明者らは、BSL-3の下で、ハムスターモデルにおいて、WT BetaCoV/USA/WA1/2020と比較して、CDX-005 P1（Lot＃1-060820-9-1）の弱毒化を評価した。さらに、ワクチン接種後14日のWTでのチャレンジにより、ワクチン増強の存在/非存在を調べる。
36匹の5～8週齢雄ハムスターに、鼻腔内ドロッパーにより、0日目（12匹/群）に、5×104 PFU/mlもしくは5×103 PFU/mlの野生型WA1/2020 SARS-CoV-2、または5×104 PFU/mlのCDX-005の名目用量0.05mlを投与し、2、4、14、および16日間追跡した。エンドポイントは、1日2回の症状観察、毎日の体重、5日目まで1日2回、その後14日目まで毎日の体温を含む。ウイルス負荷を施した後2、4および6日目に鼻洗浄液、肺組織、脳および腎臓においてqPCRおよびTCID50により測定する。右肺、右腎臓および右脳半球を同じ時点に組織病理学的検査のために固定する。14日目に、CDX-005を投与された残存する3匹の動物に、5×104 PFU/mlの野生型WA1/2020でチャレンジし、鼻洗浄液、肺、脳、および腎臓のウイルス負荷を、16日目に同じ臓器の病理組織診断と共に測定する。
（表６）シリアンゴールドハムスターにおけるCDX-005の評価
この研究からの、接種後6日間の体重喪失を測定する初期データを図4に示す。CDX-005は、野生型と比較して、有意に弱毒化されているようである。5×104の名目用量のCDX-005を投与されたハムスターは、平均で4.1％の体重獲得を経験した一方、5×104および5×103の名目用量の野生型SARS-Cov-2を投与されたハムスターは、平均で-2.5％の体重喪失を経験した。この研究において送達された正確な用量を決定するための用量の逆滴定が進行中である。
近似的なハムスターの体重を0.1kgとすると、5×104のハムスターワクチン用量の、70kgのヒトに対する外挿は3.5×107の用量と同等となり、これは試験されるべき恐らく最大の臨床用量よりも高い。
さらに、ワクチン接種後14日のWTでのチャレンジにより、ワクチン増強の存在/非存在を調べる。
最後に、小さい試料サイズであることを本発明者らは理解しているが、BSL-3空間の不足と組み合わさったパンデミックの緊急的性質、および顕著な弱毒化についてのこの実証は、野生型SARS-CoV-2であっても多くの場合に無症候性感染症を有する健常な低リスクの成人におけるCDX-005の試験をサポートするはずである。
CDX-005の単回5.0×104 PFU用量は、用量の16日後の、野生型のチャレンジに対して保護的であった。この薬理学的な用量は、脳または腎臓への分布なし、および最小の組織病理学的所見を伴う肺への限定された分布を、結果としてもたらした。
COVID-19疾患は、肺、嗅覚および神経機能障害と関連付けられるため、ホモジナイズされた肺、嗅球および脳におけるウイルス負荷を測定した。qPCRにより測定された総ウイルスRNAは、CDX-005接種ハムスターにおいて、接種後（PI）2および4日目に肺、嗅球、および脳において、検出限界付近またはそれ未満であった。対照的に、ウイルスRNAは、wt WA1感染ハムスターにおいて、3つ全ての組織中に、両方の時点において検出された（図6a～c）。感染性ウイルスが存在するかどうかを試験するために、PI 2、4、および6日目に肺ホモジネートにおいてTCID50アッセイを行った（図6d）。4日目までに、感染性ウイルス負荷は、いずれかの用量のwt WA1感染動物と比べて、CDX-005を接種された動物の肺において10,000倍近く低かった（N＝3/群；P＜0.01、独立した試料に対する多元配置分散分析法（factorial ANOVA））（図6d）。このように、CDX-005は、wt WA1と比べてインビボで高度に弱毒化されている。
CDX-005の安全性を評価するために、ハムスターにおける体重の変化を、接種後9日間モニターした。CDX-005を接種されたハムスターは、この期間の間に体重獲得を経験した。一方、いずれかの用量のwt WA1を接種されたハムスターは、体重喪失を経験した（図7a）。PI 9日目になって初めて、wt WA1処置動物は開始時の体重に復帰している（図7a）。この変化は、CDX-005処置群とwt WA1処置群との間で有意に異なる（P＜0.001）ことを、混合モデルANOVAは示した。
肺、脳、および腎臓の組織学的検査も行った。ホルマリン固定されたパラフィン切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、光学顕微鏡評価を、盲検で、専門医認定獣医学的病理医により実行した（N＝3/群）。複数のパラメーターを0～5の病理評定スケールでスコア付けした。wt WA1またはCDX-005を投与されたハムスターの脳および腎臓切片において、変化は認められなかった。しかしながら、COVID-19を有するヒトの肺において見出される病的な細胞浸潤と合致して、肺胞および/または血管周囲または細気管支周囲の混合細胞浸潤物、内腔への好中球浸潤を伴う細気管支または気管支上皮の壊死、ならびに場合により細気管支または気管支上皮の過形成が付随する血管周囲の浮腫が、wt WA1に感染したハムスターにおいて見られた（図7b～c）。対照的に、CDX-005接種ハムスターにおいては、肺病理は、PI 6日目での最小の肺胞のものから軽度の血管周囲または細気管支周囲の混合細胞浸潤物に限定された（図7b～c）。
ワクチンとしてのCDX-005の有効性を評価するために、wt WA1に対してAbを誘導する能力を測定した。最初に、ELISAを行って、ナイーブ（モック）ハムスター、およびwt WA1またはCDX-005を接種されたハムスターからの血清中のSARS-CoV-2スパイクS1に対するIgG力価を決定した。wt WA1と同様に、CDX-005接種は、強い抗スパイクS1 Ab応答を誘導した（図8a）。次に、PI 16日目にプラーク低減中和力価（PRNT）により、接種されたハムスターの血清中のwt WA1ウイルスに対する中和Abの存在について試験した。最大1280倍の複数の血清希釈率から、50、80、および90パーセントの中和（プラーク形成の阻害）が算出された（図8a）。全てのCDX-005接種ハムスターは、wt WA1接種により誘導されるレベルに類似したレベルで、中和Ab力価を生成した（図8b）。
最後に、チャレンジ研究においてCDX-005の有効性を測定した。ハムスターの鼻腔内（IN）に、単回用量の5×104 PFUのCDX-005をワクチン接種し、次にPI 16日目に、INに5×104 PFUのwt WA1でチャレンジした。18日目（チャレンジ後2日目）に肺を採取し、ウイルス負荷をqRT-PCRにより測定した。チャレンジwt WA1ウイルスのウイルス負荷は、ワクチン非接種ハムスターと比較して、CDX-005ワクチン接種ハムスターの肺において、10,000倍より高く低減され、ワクチンの有効性を証明した（図8c）。SARS-CoV-2ウイルスが、チャレンジされたモック接種ハムスターの脳において検出された一方、CDX-005で保護された動物では検出されなかった（図8c）。嗅球中のレベルは2つの群において統計的に異ならなかった（図8c）。そのため、CDX-005は保護を付与し、チャレンジでのワクチン誘導性疾患増強の証拠はなかった。IgG Abレベルは、CDX-005接種ハムスターにおいて、チャレンジ後2日目に高いままであることも見出された（図8a）。
実施例5B
ハムスター研究
COVID-19モデリングに関するWHO ad hoc Expert Working Groupは、アカゲザルおよびフェレットは両方とも、軽度から中等度のヒト疾患を再現するらしいと結論付けたが、より最近の研究は、シリアンゴールデンハムスターが、この感染症の、より重篤な肺症状を再現するより有用なモデルであり得ることを示唆している。1～3。それゆえ、Codagenixは現在、BSL-3下でハムスターモデルにおいて、WA1と比較して、CDX-005 P1（Lot＃1-060820-9-1）の弱毒化を評価している。全ての動物研究は、IIT Research Institute IACUCで承認されたプロトコールにしたがって行った。
ハムスター研究
COVID-19モデリングに関するWHO ad hoc Expert Working Groupは、アカゲザルおよびフェレットは両方とも、軽度から中等度のヒト疾患を再現するらしいと結論付けたが、より最近の研究は、シリアンゴールデンハムスターが、この感染症の、より重篤な肺症状を再現するより有用なモデルであり得ることを示唆している。1～3。それゆえ、Codagenixは現在、BSL-3下でハムスターモデルにおいて、WA1と比較して、CDX-005 P1（Lot＃1-060820-9-1）の弱毒化を評価している。全ての動物研究は、IIT Research Institute IACUCで承認されたプロトコールにしたがって行った。
36匹の5～6週齢雄シリアンハムスター（Charles Rivers）を研究において利用した。チャレンジのために、ハムスターを、腹腔内注射を介してケタミン（100mg/kg）およびキシラジン（10mg/kg）で麻酔し、0日目（12匹/群）に鼻腔内に、5x104 PFU/mlもしくは5x103 PFU/mlのwt WA1 SARS-CoV-2、または5x104 PFU/mlのCDX-005の名目用量0.05mlを接種した。動物を1日2回観察し、体重を8日目まで毎日、その後16日目～18日目に毎日集めた。16日目に、3匹のCDX-005接種動物に、5x104 PFU/mlのwt WA1を用いて鼻腔内にチャレンジした。5x104 PFU/ml（N＝3）または5x103 PFU/ml（N＝3）のwt WA1を接種された6匹のナイーブハムスターを対照とした。これらの2つの群を、2つの接種用量でオーバーラップさせた力価として組み合わせた。
体重
これらの36匹のハムスターおよび追加の58匹（半分は雌/半分は雄）の5～6週齢シリアンゴールデンハムスター（Charles Rivers）を使用して、体重喪失により評価される、ハムスターの健康状態に対するCDX-005およびwt WA1接種の効果を研究した。（これらの追加のハムスターは現在、CDX-005およびwt WA1が媒介する他の効果について評価されている。）全体で、40匹の、5×104 PFUのCDX-005、40匹の、5×104 PFUのwt WA1、および12匹の、5×103 PFUのwt WA1について、最大9日間、毎日計量した。PIの様々な日に他のエンドポイントのために動物を屠殺するにつれて、Nは各群について経時的に減少した。5×104 PFUのCDX-005および5×104 PFUのwt WA1について最小のNは10であり、5×103 PFUのwt WA1については3であった。
これらの36匹のハムスターおよび追加の58匹（半分は雌/半分は雄）の5～6週齢シリアンゴールデンハムスター（Charles Rivers）を使用して、体重喪失により評価される、ハムスターの健康状態に対するCDX-005およびwt WA1接種の効果を研究した。（これらの追加のハムスターは現在、CDX-005およびwt WA1が媒介する他の効果について評価されている。）全体で、40匹の、5×104 PFUのCDX-005、40匹の、5×104 PFUのwt WA1、および12匹の、5×103 PFUのwt WA1について、最大9日間、毎日計量した。PIの様々な日に他のエンドポイントのために動物を屠殺するにつれて、Nは各群について経時的に減少した。5×104 PFUのCDX-005および5×104 PFUのwt WA1について最小のNは10であり、5×103 PFUのwt WA1については3であった。
組織の採取
接種後2、4、6日目に各群からの3匹のハムスター、および16日目にチャレンジした動物からの18日目の3匹のハムスターを、150mg/kgのBeuthanasiaの静脈内注射により安楽死させた。左肺をウイルス負荷の決定のために収集した。ウイルス負荷を測定するために、16日目にチャレンジした動物において18日目に組織ホモジナイザー（Omni homogenizer）を使用して抗生物質を含むDMEM中10％ w/vで肺をホモジナイズした。鼻洗浄を行うことを試みたが、これらの小動物において再現性のある洗浄液を得ることに成功しなかった。
接種後2、4、6日目に各群からの3匹のハムスター、および16日目にチャレンジした動物からの18日目の3匹のハムスターを、150mg/kgのBeuthanasiaの静脈内注射により安楽死させた。左肺をウイルス負荷の決定のために収集した。ウイルス負荷を測定するために、16日目にチャレンジした動物において18日目に組織ホモジナイザー（Omni homogenizer）を使用して抗生物質を含むDMEM中10％ w/vで肺をホモジナイズした。鼻洗浄を行うことを試みたが、これらの小動物において再現性のある洗浄液を得ることに成功しなかった。
病理組織診断
病理組織診断を、盲検で、有資格の獣医学病理医により行った。肺、脳、および腎臓をホルマリン固定し、脱水し、パラフィン中に包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。光学顕微鏡評価を、盲検で、専門医認定の獣医学病理医により実行した。各組織を複数の病理学的パラメーターで等級付けし、切片を、0＝正常、1＝最小、2＝軽度、3＝中等度、4＝顕著、または5＝重篤としてスコア付けした。全ての組織の評価は細胞浸潤の評価を含んだ。少なくとも5つの切片を各臓器について調べ、スコアを平均化した。
病理組織診断を、盲検で、有資格の獣医学病理医により行った。肺、脳、および腎臓をホルマリン固定し、脱水し、パラフィン中に包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。光学顕微鏡評価を、盲検で、専門医認定の獣医学病理医により実行した。各組織を複数の病理学的パラメーターで等級付けし、切片を、0＝正常、1＝最小、2＝軽度、3＝中等度、4＝顕著、または5＝重篤としてスコア付けした。全ての組織の評価は細胞浸潤の評価を含んだ。少なくとも5つの切片を各臓器について調べ、スコアを平均化した。
ウイルス負荷
採取された組織においてqPCRおよびTCID50によりウイルス負荷を測定した。ウイルス負荷を測定するために、ビーズミルホモジナイザー（Omni）を使用して、抗生物質を含むDMEM中10％ w/vで組織をホモジナイズした。Vero E6細胞における肺ホモジネートの10倍段階希釈液を滴定する50％組織培養感染用量（TCID50）アッセイにより、感染性ウイルス力価を決定し、log10 TCID50単位/mlにおいて表す。製造者のプロトコールにしたがってQuick-RNA Viral Kit（Zymo Research）を使用して100μlの脳ホモジネートからRNAを抽出した。以下のPCRサイクリング条件：95℃で15s、60℃で15sおよび72℃で20sの40サイクルを使用して、iTaq 1-step universal probe kit（Bio-Rad）を使用してqRT-PCRを行った。
採取された組織においてqPCRおよびTCID50によりウイルス負荷を測定した。ウイルス負荷を測定するために、ビーズミルホモジナイザー（Omni）を使用して、抗生物質を含むDMEM中10％ w/vで組織をホモジナイズした。Vero E6細胞における肺ホモジネートの10倍段階希釈液を滴定する50％組織培養感染用量（TCID50）アッセイにより、感染性ウイルス力価を決定し、log10 TCID50単位/mlにおいて表す。製造者のプロトコールにしたがってQuick-RNA Viral Kit（Zymo Research）を使用して100μlの脳ホモジネートからRNAを抽出した。以下のPCRサイクリング条件：95℃で15s、60℃で15sおよび72℃で20sの40サイクルを使用して、iTaq 1-step universal probe kit（Bio-Rad）を使用してqRT-PCRを行った。
抗体-プラーク低減中和力価
PI 16日目に収集されたハムスター血清を、56Cで30’間、熱不活性化した。50ulの2倍段階希釈を、1:5の初期希釈で開始して96ウェルU底プレート中DMEM/1％ FBSで行った。50ulのDMEM/1％ FBS中の約30PFUのSARS-CoV-2 Washington/1/2020を、前記血清希釈液に加えて混合し、中和ウェル中の最終体積を100ulとし、トータル初期血清希釈を1:10とした。希釈プレートを37℃/5％ CO2で1時間インキュベートした。
PI 16日目に収集されたハムスター血清を、56Cで30’間、熱不活性化した。50ulの2倍段階希釈を、1:5の初期希釈で開始して96ウェルU底プレート中DMEM/1％ FBSで行った。50ulのDMEM/1％ FBS中の約30PFUのSARS-CoV-2 Washington/1/2020を、前記血清希釈液に加えて混合し、中和ウェル中の最終体積を100ulとし、トータル初期血清希釈を1:10とした。希釈プレートを37℃/5％ CO2で1時間インキュベートした。
Vero E6細胞（1日前にDMEM/5％FBS中に播種）のコンフルエントな単層を含有する24ウェルプレート上の細胞増殖培地を除去し、150ulの新鮮なDMEM/1％FBS、続いて100ulの各中和反応液を加えた。37℃/5％ CO2での1時間のウイルス吸着後に、0.75mlの半固体オーバーレイを24ウェルプレートに加え、最終濃度1X DMEM、1.75％のFBS、0.3％のトラガカントゴム、1x ペニシリン＋ストレプトマイシン、総体積1mlとした。24ウェルプレートを37℃で48時間インキュベートしてプラークを形成させた。50％のメタノール/4％のホルムアルデヒド中の1％のCrystal Violetを用いて細胞単層を固定および染色することにより、プラークを可視化した。非中和ウェル（ナイーブハムスター血清を含有する）中のプラーク数と比べて予め定義されたカットオフ値（50％、80％、90％）だけプラーク数を低減させた最終血清希釈率の逆数として、プラーク低減中和力価（PRNT）50、80、90を決定した。最も低い希釈（1:10）において中和しなかった血清に5の力価を割り当て、最も高い試験された血清希釈（1:1280）において中和した血清に≧1280の力価を割り当てた。
抗体-IgG ELISA
50ng/mlのBSA/0.05M炭酸/重炭酸緩衝液（pH9.6）中、30ng/ウェルのSARS-CoV-2（2019-nCoV）スパイクS1-His（Sino Biological）を用いて、96ウェルプレートを4℃で終夜被覆した。PBS中の10％のヤギ血清でプレートを37℃で2時間ブロッキングし、洗浄緩衝液（PBS中の0.1％のTween 20）で4回洗浄し、次にPBS中の10％のヤギ血清/0.05％のTween-20中の段階希釈された血清（1:10で希釈を開始し、その後2倍）とインキュベートし、37℃で1時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で4回洗浄し、次に1:10,000のホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）共役affinity pure goat anti-Syrian hamster IgG（H＆L）（Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.）と、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後に、プレートを洗浄緩衝液で4回洗浄し、Thermo Scientific OPD（o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド）を、比色反応のために加えた。暗所での25℃、10分のインキュベーション後に、50mlの2.5M硫酸溶液を加えることにより反応を停止させ、結果的な吸光度をマイクロプレートリーダー上490nmで読み取った。異なる群間の相対的なIgGレベルを報告し、OPD比色反応生成物の強度がバックグラウンド（血清なし）対照の強度の5倍より高くに達した希釈率のlogとして比較した。
50ng/mlのBSA/0.05M炭酸/重炭酸緩衝液（pH9.6）中、30ng/ウェルのSARS-CoV-2（2019-nCoV）スパイクS1-His（Sino Biological）を用いて、96ウェルプレートを4℃で終夜被覆した。PBS中の10％のヤギ血清でプレートを37℃で2時間ブロッキングし、洗浄緩衝液（PBS中の0.1％のTween 20）で4回洗浄し、次にPBS中の10％のヤギ血清/0.05％のTween-20中の段階希釈された血清（1:10で希釈を開始し、その後2倍）とインキュベートし、37℃で1時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で4回洗浄し、次に1:10,000のホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）共役affinity pure goat anti-Syrian hamster IgG（H＆L）（Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.）と、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後に、プレートを洗浄緩衝液で4回洗浄し、Thermo Scientific OPD（o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド）を、比色反応のために加えた。暗所での25℃、10分のインキュベーション後に、50mlの2.5M硫酸溶液を加えることにより反応を停止させ、結果的な吸光度をマイクロプレートリーダー上490nmで読み取った。異なる群間の相対的なIgGレベルを報告し、OPD比色反応生成物の強度がバックグラウンド（血清なし）対照の強度の5倍より高くに達した希釈率のlogとして比較した。
実施例6
CDX-005の特徴
wt WA1ウイルスと比べて、CDX-005は283個、CDX-007は149個の、スパイク遺伝子中のサイレント突然変異を含有する。結果として得られた全長wt WA1および脱最適化されたcDNAをインビトロで転写して全長ウイルスRNAを調製し、それをVero E6細胞にエレクトロポレートした。トランスフェクトされた細胞を6日間またはCPEが現れるまでインキュベートした。感染培地を2、4、および6日目に収集した。ウイルス力価をVero E6細胞においてプラークアッセイにより決定した。プラークはトランスフェクション後2日目もの早期に見られ、ウイルス生成のピークは4～6日目であった。CDX-005およびCDX-007により形成されたプラークはwtよりも小さいが、両方ともVero E6細胞中で堅牢に成長し、スケールアップ製造のためのそれらの好適性を示す。そのため、本発明者らの他のSAVEワクチンと同様に、異なる弱毒化の程度を有する複数のワクチン候補を迅速に生成することができた。
CDX-005の特徴
wt WA1ウイルスと比べて、CDX-005は283個、CDX-007は149個の、スパイク遺伝子中のサイレント突然変異を含有する。結果として得られた全長wt WA1および脱最適化されたcDNAをインビトロで転写して全長ウイルスRNAを調製し、それをVero E6細胞にエレクトロポレートした。トランスフェクトされた細胞を6日間またはCPEが現れるまでインキュベートした。感染培地を2、4、および6日目に収集した。ウイルス力価をVero E6細胞においてプラークアッセイにより決定した。プラークはトランスフェクション後2日目もの早期に見られ、ウイルス生成のピークは4～6日目であった。CDX-005およびCDX-007により形成されたプラークはwtよりも小さいが、両方ともVero E6細胞中で堅牢に成長し、スケールアップ製造のためのそれらの好適性を示す。そのため、本発明者らの他のSAVEワクチンと同様に、異なる弱毒化の程度を有する複数のワクチン候補を迅速に生成することができた。
CDX-005はCDX-007よりも脱最適化および弱毒化されているが、大規模に製造するために十分に堅牢に増殖するので、インビボ安全性を最大化するために、これをさらなる研究のために選択した。CDX-005において、スパイクORFの1,272ヌクレオチドをヒト細胞のためにコドンペア脱最適化して、283のサイレント突然変異を得た。弱毒化および安全性の追加のためにスパイクタンパク質から、多塩基のフューリン切断部位を除去した。
2020年の第四四半期までに大スケールでワクチン製造を開始できるように、本発明者らのGMP対応の動物由来物のない（AOF）Vero（WHO-10-87）細胞におけるCDX-005の増殖最適化研究を行った。33℃での増殖は、37℃における増殖よりも、CDX-005およびwt WA1の両方について、より高い力価を結果としてもたらす。細胞傷害性効果（CPE）が観察される前にウイルスはピークとなり、ウイルスの80～90％は、ピーク時に細胞内（cell associated）である。動態は異なるが、類似したウイルス力価がMOI 0.01およびMOI 0.0001において達成され得る。
ウイルス採取のための最適な条件も調べた。Vero WHO 10-87細胞を、5％のウシ胎仔血清（FBS）を含むDMEM中、37℃/5％ CO2で生育した。33℃での培養におけるCDX-005の感染後48hにおいて、図11に記載されるスキームを使用して細胞および上清を採取した。
33℃でのMOI 0.01での感染後48時間において、ほとんどのCDX-005は細胞内であるが（約80～90％）、Vero細胞からのウイルス回収が容易であることを、データは実証する。低張溶解はCDX-005を採取するための有効な手段であり、この方法が、ある程度の融通性が有益であり得る規模が変更されたバッチにおいて実行可能であることを、広い溶解ウィンドウは示唆する。
凍結/解凍溶解もまた有効であり、FBSは必要でも有益でもない。これが望ましいのは、感染の間のFBSがVero細胞の異常増殖に繋がってウイルス収率を低減させ得ること、およびFDAが無血清製造を好むこと、の両方が理由である。またこれも留意されることとして、FBSは、少なくとも2回の凍結/解凍サイクル後に、ほとんどまたは全く安定化を提供しなかったので、CDX-005は単純なDMEM中で凍結された場合でも安定なようである。そのため、採取の最適なタイミングと一致して、33℃または37℃のいずれでの増殖であっても、2～3×107 PFU/mlのCDX-005の粗バルク力価、または約106 PFU/cm2の増殖表面積が日常的に観察される。
これらの研究に基づいて、本発明者らは現在、33℃でMOI 0.01でVero（WHO-10-87）細胞に接種することにより、CDX-005を増殖させている。本発明者らは、英国での本発明者らのファースト・イン・ヒューマン研究のために、5％のスクロースおよび5％のグリシンを含むDMEMのワクチン製剤を選択し試験した。この製剤において、CDX-005は、-80℃で少なくとも3回の凍結解凍サイクル、および1か月（これまでに試験された最も長い貯蔵期間）にわたり安定である。
最後に、CDX-005のゲノム安定性の評価における最初のステップとして、Vero（WHO 10-87）細胞でのウイルスの繁殖後に、ウイルス継代1～6をシークエンシングした。ウイルスは極めて安定であることをデータは示す。継代6のシークエンシングは亜集団がないことを明らかにした。本発明者らは、9つの継代を増殖および採取して、現在継代9をシークエンシングしている。本明細書に記載される研究の開始までに継代10の採取およびシークエンシングを本発明者らは完了しているであろう。
実施例7
血清IgG抗体ELISAおよびPRNTアッセイによる、SARS-CoV-2（wt WA1）およびCDX-005の免疫原性の評価
Th1/Th2:SARS-CoV-2特異的T細胞は、感染した個体において相対的に早期に存在し、経時的に増加する。最も強いT細胞応答は、スパイク（S）表面糖タンパク質に向けられているようであり、Th2およびTh17サイトカインが検出されるが、SARS-CoV-2特異的T細胞は、主にエフェクターおよびTh1サイトカインを産生する。Th1およびT細胞傷害性リンパ球は、SARS-CoV-2により最も影響される免疫細胞であること、ならびにT細胞応答およびTh1/Th2の均衡は、COVID-19の重症度を部分的に定め得ることが示唆されている。減弱されたTh1応答を一般的に有する高齢個体において、免疫系は、ウイルス負荷に対抗するためにTh2応答に強いられて、Th2応答による全ての負の影響を生じ、臨床像を深刻に悪化させ得る。興味深いことに、SARS-CoV-2に対するT細胞応答はまた、成人および小児において異なる。小児においてはそうでないが、COVID-19を発症した成人は、D関連抗原（DR）を発現する活性化CD4およびCD8細胞の数、ならびに血漿IL-12、IL-1β、およびCXCL9レベルの増加を示す。これらは、小児と比較して、感染した成人におけるSARS-CoV-2に対する免疫応答の顕著なTh1極性化を示唆する。CDX-005は生ウイルスであり、他のワクチンクラスとは異なり、T細胞応答を誘導することにより免疫応答をブーストできるので、FDAにより指示されるようなTh1/Th2の均衡の研究は特に妥当である。
血清IgG抗体ELISAおよびPRNTアッセイによる、SARS-CoV-2（wt WA1）およびCDX-005の免疫原性の評価
Th1/Th2:SARS-CoV-2特異的T細胞は、感染した個体において相対的に早期に存在し、経時的に増加する。最も強いT細胞応答は、スパイク（S）表面糖タンパク質に向けられているようであり、Th2およびTh17サイトカインが検出されるが、SARS-CoV-2特異的T細胞は、主にエフェクターおよびTh1サイトカインを産生する。Th1およびT細胞傷害性リンパ球は、SARS-CoV-2により最も影響される免疫細胞であること、ならびにT細胞応答およびTh1/Th2の均衡は、COVID-19の重症度を部分的に定め得ることが示唆されている。減弱されたTh1応答を一般的に有する高齢個体において、免疫系は、ウイルス負荷に対抗するためにTh2応答に強いられて、Th2応答による全ての負の影響を生じ、臨床像を深刻に悪化させ得る。興味深いことに、SARS-CoV-2に対するT細胞応答はまた、成人および小児において異なる。小児においてはそうでないが、COVID-19を発症した成人は、D関連抗原（DR）を発現する活性化CD4およびCD8細胞の数、ならびに血漿IL-12、IL-1β、およびCXCL9レベルの増加を示す。これらは、小児と比較して、感染した成人におけるSARS-CoV-2に対する免疫応答の顕著なTh1極性化を示唆する。CDX-005は生ウイルスであり、他のワクチンクラスとは異なり、T細胞応答を誘導することにより免疫応答をブーストできるので、FDAにより指示されるようなTh1/Th2の均衡の研究は特に妥当である。
FDAにより指定されるように、本発明者らは、Th1/Th2因子インターフェロンガンマ（IFNγ）、インターロイキン12（IL-12）、腫瘍壊死因子アルファ（TNFβ）、IL4、IL10、およびトランスフォーミング増殖因子ベータ（TGFβ）の、肺組織中でのmRNAレベルを測定する。公開されたハムスター特異的プライマーおよび条件を使用して、qPCRにより組織ホモジネートを分析する。標準的な自社手順を使用して、Bioqualにおいてアッセイを行う。
これらは若い（但し若年動物ではない）ため、wt WA1およびCDX-005接種は両方とも、主にTh1応答を誘導すると本発明者らは予想する。チャレンジと比較して、初期接種に対して異なる応答があること、およびそれらの差異は、SARS-CoV-2により生じる免疫応答の性質への洞察を提供し得ると本発明者らは予想している。
実施例8
Th1/Th2の均衡に対するSARS-CoV-2（wt WA1）およびCDX-005の効果のqPCRによる評価
有効性： 本発明者らは、後期継代CDX-005ワクチンの有効性を評価するために、標準的なチャレンジ研究を行う。5×104 PFUのCDX-005またはビヒクルのいずれかを接種されたハムスターに、約1.0×105 TCID50のwt WA1で27日目にチャレンジする。27日目は、他のハムスター研究および本発明者ら自身のデータに基づいて選択した。3匹のモックチャレンジされた動物を、チャレンジされた動物を屠殺する3つの時点の各々について1匹、同期間の陰性対照として含める。ここでもチャレンジ後2および4日目における屠殺の選択は、公開されたデータおよび本発明者ら自身のデータに基づく。SARS-CoV-2誘導性免疫応答をより良好に理解するためにFDAの示唆でより後の時点を含めた。ハムスター血清および組織の分析は、接種物のみを与えられるハムスターについてのものと同じプロトコールを使用する同じ分析を含む。
Th1/Th2の均衡に対するSARS-CoV-2（wt WA1）およびCDX-005の効果のqPCRによる評価
有効性： 本発明者らは、後期継代CDX-005ワクチンの有効性を評価するために、標準的なチャレンジ研究を行う。5×104 PFUのCDX-005またはビヒクルのいずれかを接種されたハムスターに、約1.0×105 TCID50のwt WA1で27日目にチャレンジする。27日目は、他のハムスター研究および本発明者ら自身のデータに基づいて選択した。3匹のモックチャレンジされた動物を、チャレンジされた動物を屠殺する3つの時点の各々について1匹、同期間の陰性対照として含める。ここでもチャレンジ後2および4日目における屠殺の選択は、公開されたデータおよび本発明者ら自身のデータに基づく。SARS-CoV-2誘導性免疫応答をより良好に理解するためにFDAの示唆でより後の時点を含めた。ハムスター血清および組織の分析は、接種物のみを与えられるハムスターについてのものと同じプロトコールを使用する同じ分析を含む。
後期継代CDX-005の接種は、早期継代ウイルスのものと類似したチャレンジからの保護を提供すると本発明者らは予想している。CDX-005ワクチンの接種は高度に有効であり、2日目のqPCR肺力価を少なくとも5,000倍低減させることをデータは示唆する。早期継代CDX-005と比べた後期継代物の100倍より大きい有効性の喪失または安全性の指標（すなわち、体内分布、病理組織診断、または弱毒化）における有意差は、さらなる試験を正当化するであろう。本発明者らはFDAに報告し、彼らと共に研究して次のステップを決定することになる。
実施例9
CDX-005をファースト・イン・ヒューマン臨床試験に進めるための準備として、ワクチンに対する非ヒト霊長動物の応答を調べた。15頭のアフリカミドリザルの、6頭に106 PFUのwt WA1、6頭に106 PFUのCDX-005、および3頭にダルベッコPBSを、鼻腔内に接種した。wt WA1およびCDX-005接種動物の洗浄液中のウイルス力価はPI 4日目においては類似していたが、ウイルス力価はwt WA1接種サルにおいて高いままであったがCDX-005接種サルにおいて検出不可能まで急落したことを本発明者らの発見は示す。これらのデータは、SARS-CoV-2ワクチンとしてのCDX-005の潜在能力をさらに実証する。
CDX-005をファースト・イン・ヒューマン臨床試験に進めるための準備として、ワクチンに対する非ヒト霊長動物の応答を調べた。15頭のアフリカミドリザルの、6頭に106 PFUのwt WA1、6頭に106 PFUのCDX-005、および3頭にダルベッコPBSを、鼻腔内に接種した。wt WA1およびCDX-005接種動物の洗浄液中のウイルス力価はPI 4日目においては類似していたが、ウイルス力価はwt WA1接種サルにおいて高いままであったがCDX-005接種サルにおいて検出不可能まで急落したことを本発明者らの発見は示す。これらのデータは、SARS-CoV-2ワクチンとしてのCDX-005の潜在能力をさらに実証する。
実施例10
COVI-VACの安全性および免疫原性を評価する、健常若年成人におけるファースト・イン・ヒューマン、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、用量漸増研究
COVI-VACは、COVID-19の予防のためにCDX-005を有する生弱毒化ワクチンである。弱毒化ウイルスは、ウイルススパイクタンパク質をコードする遺伝子中のヒトコドンペア脱最適化核酸配列を用いた283個の設計されたサイレント突然変異とスパイク遺伝子中のフューリン切断部位の欠失とを有する。追加的に、それは、Vero細胞中でのウイルス回収プロセスの間に選択された2つのサイレントおよび5つの非サイレント突然変異を有する。
COVI-VACの安全性および免疫原性を評価する、健常若年成人におけるファースト・イン・ヒューマン、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、用量漸増研究
COVI-VACは、COVID-19の予防のためにCDX-005を有する生弱毒化ワクチンである。弱毒化ウイルスは、ウイルススパイクタンパク質をコードする遺伝子中のヒトコドンペア脱最適化核酸配列を用いた283個の設計されたサイレント突然変異とスパイク遺伝子中のフューリン切断部位の欠失とを有する。追加的に、それは、Vero細胞中でのウイルス回収プロセスの間に選択された2つのサイレントおよび5つの非サイレント突然変異を有する。
一次的な研究目的は、点鼻で投与される1または2用量の約5×104、5×105、および5×106のプラーク形成単位（PFU）でのCOVI-VACの安全性および忍容性を評価することである。エンドポイントは、各用量後14日間の反応原性事象；1日目から57日目までの有害事象（AE）；1日目から400日目までの診療を要したAE（MAAE）、新規発症慢性病（NCI）、重篤なAE（SAE）である。
二次的な研究目的は、点鼻で投与されるCOVI-VACの液性免疫原性を評価することである。エンドポイントは、1、15、29、43、57、120、210、および400日目に収集された血清における、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により測定される免疫グロブリンG（IgG）力価；1、15、29、43、57、120、210、および400日目に収集された血清における、マイクロ中和試験アッセイにより測定される中和抗体レベルである。
探査的な目的およびエンドポイントは以下を含む：
・COVI-VACが点鼻で投与された後のワクチンウイルスのシェディングの規模および持続期間を測定すること：鼻咽頭スワブ試料における定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）アッセイにより評価されるコピー数/mL；4/5および14/15日目に収集された糞便試料からの培養結果；
・点鼻で投与されたCOVI-VACの細胞性免疫原性を評価すること；点鼻で投与されたCOVI-VACの粘膜免疫原性を評価すること：1、8、29、および36日目に収集された全殺傷ウイルス刺激性末梢血単核細胞（PBMC）における、インターフェロン-ガンマ（IFN-γ）酵素連結免疫吸着スポットアッセイ（ELISpot）により測定されるスポット形成単位（SFU）/106細胞；
・点鼻で投与されたCOVI-VACの粘膜免疫原性を評価すること：1、15、29、43、および57日目に収集された鼻ガーゼ試料における、ELISAにより測定された免疫グロブリンA（IgA）力価；
・COVI-VACが点鼻で投与された後の、SARS-CoV-2感染症に起因するものを含む、呼吸器病の発生率を測定すること：マルチプレックスPCR呼吸器パネル（SARS-CoV-2を含む）の結果；呼吸器MAAEを有する対象における、マルチプレックスPCR呼吸器パネル（SARS-CoV-2を含む）の結果；ならびに
・ワクチンウイルスの遺伝子安定性を評価すること：鼻咽頭スワブ試料からのワクチンウイルスの配列解析。
・COVI-VACが点鼻で投与された後のワクチンウイルスのシェディングの規模および持続期間を測定すること：鼻咽頭スワブ試料における定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）アッセイにより評価されるコピー数/mL；4/5および14/15日目に収集された糞便試料からの培養結果；
・点鼻で投与されたCOVI-VACの細胞性免疫原性を評価すること；点鼻で投与されたCOVI-VACの粘膜免疫原性を評価すること：1、8、29、および36日目に収集された全殺傷ウイルス刺激性末梢血単核細胞（PBMC）における、インターフェロン-ガンマ（IFN-γ）酵素連結免疫吸着スポットアッセイ（ELISpot）により測定されるスポット形成単位（SFU）/106細胞；
・点鼻で投与されたCOVI-VACの粘膜免疫原性を評価すること：1、15、29、43、および57日目に収集された鼻ガーゼ試料における、ELISAにより測定された免疫グロブリンA（IgA）力価；
・COVI-VACが点鼻で投与された後の、SARS-CoV-2感染症に起因するものを含む、呼吸器病の発生率を測定すること：マルチプレックスPCR呼吸器パネル（SARS-CoV-2を含む）の結果；呼吸器MAAEを有する対象における、マルチプレックスPCR呼吸器パネル（SARS-CoV-2を含む）の結果；ならびに
・ワクチンウイルスの遺伝子安定性を評価すること：鼻咽頭スワブ試料からのワクチンウイルスの配列解析。
この研究は、18～30歳の健常な成人においてCOVI-VACの安全性および免疫原性を評価するためのフェーズ1、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、用量漸増、臨床試験である。潜在的な対象は、施設の一般的なスクリーニング方法を使用してスクリーニングされ、このスクリーンを通過した個体は、投薬の1～2日前（-2/-1日目）に検疫ユニットに入れられ、インフォームドコンセントを提供する。彼らは次に、1日目に無作為化の前にこの研究に対する適格性についてスクリーニングされる。全ての研究包含基準を満たし、除外基準を満たさない約48名の対象が3つの漸増用量コホートに登録され、3:3:2の比で、各コホート内で無作為化されて、下記の表に示されるように2用量のCOVI-VAC/プラセボ（生理食塩水）を与えられる。
コホート1は、3名の対象（2名は活性物質、1名はプラセボ）のセンチネル群を含む。安全性審議委員会（Safety Review Committee（SRC））は、コホート1の残りの対象への投薬の前に、8日目を通じてこれらの3名の対象の盲検安全性データを審議する。
対象は、用量1（および入院の状況で投与される場合は用量2）の14日後まで検疫ユニットに留まり、対象が臨床的に重大な症状または進行中のウイルス感染症の証拠を経験しておらず、あるいは、対象が、（14/42日目の鼻咽頭スワブ試料に基づいて）リスク管理プランに文書化されているような低い伝染リスクよりも高いレベルでワクチンウイルスをシェディングしていると、検疫ユニットが実験室ユニットから報告されていなければ、15日目（および適用可能な場合は43日目）に退院する。qPCRアッセイの結果が、低い伝染リスクと合致するまで、これらの対象は検疫ユニットに限局され続ける（試料は1日2回収集される）。
SRCはまた、15日目を通じた盲検安全性データおよび少なくとも8日目を通じた盲検鼻咽頭スワブシェディングデータを審議して、対象のコホートが用量2の後に14日間検疫ユニットに限局されるのか、それとも29日目に退院させてその後は外来患者とするのかを決定する。対象が外来患者とされる場合、SRCはまた、これらのデータを使用して、用量2の後の最初の週のいずれの2日に、対象が来診のためにユニットに戻ってくるのかを決定する。対象が入院患者とされる場合、SRCはまた、鼻咽頭スワブ試料収集の頻度を決定する（1日2回以下の頻度）。
各対象は、COVI-VAC/プラセボ用量の後に、14日間、毎日、日誌に反応原性（局所事象、全身事象、および体温）を記録する。
インフォームドコンセントフォーム（ICF）の署名から57日目まで、全てのAEおよび随伴的な医薬品が記録される。その後に研究の終了（400日目）まで、MAAE、NCI、SAE、免疫抑制用医薬品、血液製造物、およびワクチンのみが記録される。安全性実験室試験（血液学、生化学、凝固、尿検査）用の試料を、用量1の前ならびに8、36、および57日目に収集する。完全な身体検査を2/1日目に行い、標的化された症状主導性の身体検査を、1日目および29日目の用量前；各用量の2時間後；検疫ユニットにいる間の2/30、4/32、8/36、および15/43日目、ならびに投薬期間中の各来診時に行う。ピーク呼気流量（PEF）およびバイタルサイン（酸素飽和度を含む）を、1日目および29日目の用量前；各用量の2時間後；検疫ユニットにいる間の2/30、4/32、8/36、および15/43日目、ならびに投薬期間中の各来診時に測定する。心電図（ECG）を用量1の前ならびに2、8および57日目に取る。胸部X線を用量1の14～22日後（15日目～22日目）を取る。
1および29日目の用量前ならびに15、43、57、120、210、および400日目に、ELISAにより測定されるIgG力価およびマイクロ中和試験により測定される中和抗体レベルの評価のために、血清試料を各対象から収集する。1および29日目の用量前ならびに8および36日目に、全血試料を各対象から収集し、それを処理して、IFN-γ ELISpotによるT細胞応答の評価のためにPBMCを単離する。
鼻咽頭スワブ試料を、各対象から1日2回（頻度は用量2の後に低減されてもよい）検疫ユニットにいる間（例外として、1日目には用量後のみ、対象が用量2のために外来を基準にされる場合は29日目には用量前のみ、および15/43日目には1つの試料のみ）ならびに用量2の後に決定されるような来診時に収集して、qPCRアッセイによるシェディングの評価のためにワクチンウイルスの濃度を測定する。個々の対象について陰性の結果が得られたら、その対象のために後の試料は試験されなくてもよい。ワクチンウイルスシェディングの証拠を有する試料は、潜在的なウイルスシークエンシングのために保持される。糞便からのスワブ試料を4または5および14または15日目に収集して、力価についてワクチンウイルスを測定する。
鼻ガーゼ試料を、各対象から1および29日目の用量前ならびに15、43、および57日目に粘膜免疫応答の評価のためのELISAによるIgAの測定のために収集する。
対象がウイルス呼吸器感染症と適合性の急性症状を経験した場合、鼻咽頭スワブ試料を、マルチプレックスPCR呼吸器パネル（SARS-CoV-2を含む）のために収集する。
SARS-CoV-2について陽性の任意の試料を分析のために保持して、それが野生型SARS-CoV-2であるのか、それともワクチンウイルスであるのかを決定する。
各対象は、スクリーニング期間を含めて、研究に約13か月間参加する。研究の終了は、研究に参加している最後の対象の最後の来診の日として定義される。研究の予想される持続期間は、対象を登録するための4か月を仮定して、約17か月である。
COVI-VACは、点鼻で最大2用量を28日の間隔で投与される。SARS-CoV-2の最小感染用量は不明であるが、動物モデルは104～106 PFUの用量において再現性のある感染症を結果としてもたらす。シリアンハムスターモデルにおいて忍容性良好なCOVI-VAC用量の体重ベースの外挿は、70kgのヒトにおいて約3.5×107 PFUの用量を結果としてもたらす。この研究のために選択される用量レベルは、忍容性良好かつCOVI-VACの活性の評価のために十分であると思われる。
分析
安全性：1日目から57日目までの、AE（MAAE、NCI、およびSAEを含む）を伴う対象の数（パーセンテージ）を、各々のMedical Dictionary for Regulatory Activities（MedDRA）の器官別大分類および好ましい用語について、および群により、要約する。1日目から400日目までの、MAAE、NCI、およびSAEを伴う対象の数（パーセンテージ）を、類似した様式で要約する。重症度による、および治験薬（IMP）との関係性による、AEを伴う対象の数（パーセンテージ）もまた要約する。AE、MAAE、NCI、およびSAEのリストを提供する。各用量後に局所および反応原性全身事象を伴う対象の数（パーセンテージ）を、群により要約する。反応原性事象もまた、重症度により要約する。
安全性：1日目から57日目までの、AE（MAAE、NCI、およびSAEを含む）を伴う対象の数（パーセンテージ）を、各々のMedical Dictionary for Regulatory Activities（MedDRA）の器官別大分類および好ましい用語について、および群により、要約する。1日目から400日目までの、MAAE、NCI、およびSAEを伴う対象の数（パーセンテージ）を、類似した様式で要約する。重症度による、および治験薬（IMP）との関係性による、AEを伴う対象の数（パーセンテージ）もまた要約する。AE、MAAE、NCI、およびSAEのリストを提供する。各用量後に局所および反応原性全身事象を伴う対象の数（パーセンテージ）を、群により要約する。反応原性事象もまた、重症度により要約する。
連続的なパラメーター（安全性実験室試験、PEF、およびバイタルサイン）のための要約統計量を以下のように、群により提示する：用量前、用量後、および用量前から用量後への変化の評価。研究ワクチン接種後に新たに異常（すなわち、ベースライン値と比べた毒性等級における増加および中等度またはより高い重症度等級を有する事象）として記録された、ワクチン接種後の安全性実験室値またはバイタルサイン値を伴う対象の数およびパーセンテージを集計する。重症度等級による各対象の用量前および用量後の安全性実験室値をクロス集計したシフト表も作成する。
身体検査、ECG、および胸部X線について、正常な、異常な臨床的に有意でない、および異常な臨床的に有意な解釈を伴う対象の数およびパーセンテージの要約を提示する。
免疫原性：COVI-VACに対する液性免疫応答の評価のための関心対象となる一時的な変量は、IgG力価および中和抗体レベルである。以下の指標およびそれらの95％ CIを、群により要約する：
・ベースラインならびに15、29、43、57、120、210、および400日目における、幾何平均
・15、29、43、57、120、210、および400日目における、レスポンダー率。
・ベースラインならびに15、29、43、57、120、210、および400日目における、幾何平均
・15、29、43、57、120、210、および400日目における、レスポンダー率。
関連する試料収集時点における細胞および粘膜免疫応答データを、同じ様式で要約する。
シェディング：鼻咽頭および糞便スワブ試料からのワクチンウイルスシェディングデータを、メジアン値と共に、時点による陽性の数およびパーセントにより要約する。ワクチンウイルスシェディングのメジアン、四分位範囲、最小、および最大持続期間を、鼻咽頭スワブの結果について、群により提示する。
呼吸器ウイルス発生率：症候性対象からのマルチプレックスPCR呼吸器パネル（SARS-CoV-2を含む）の結果および関連付けられる症状を列記する。
評価
安全性
安全性の評価は、この研究のための一時的な目的である。安全性評価は、早期フェーズ臨床試験のための標準であり、予防ワクチン臨床試験に関するFDAのガイダンス［FDA 2007］にしたがって為される。追加的に、野生型感染症において見られる炎症性後遺症および凝固性亢進のため、安全性実験室研究はまた、C反応性タンパク質、IL-6およびTNF、d-ダイマーならびに高感受性トロポニン-Tを含む。
安全性
安全性の評価は、この研究のための一時的な目的である。安全性評価は、早期フェーズ臨床試験のための標準であり、予防ワクチン臨床試験に関するFDAのガイダンス［FDA 2007］にしたがって為される。追加的に、野生型感染症において見られる炎症性後遺症および凝固性亢進のため、安全性実験室研究はまた、C反応性タンパク質、IL-6およびTNF、d-ダイマーならびに高感受性トロポニン-Tを含む。
バイタルサイン評価にはパルスオキシメトリーが含まれ、無症候性呼吸器障害を評価するためにピークフローもまた記録される。
追加的に、無症候性肺炎について対象をモニターするために、胸部X線が、CodaVax-COVID/プラセボの第1の用量の2～3週後に行われる。COVID-19の早期検出における胸部イメージングの有用性の証拠が現れつつある。イタリアにおける厳格な地方検疫の直後の、COVID-19の低い臨床的疑いを伴う無症候性個体および症候性個体の胸部X線スクリーニングは、異常な所見の高い率を示した。SARS-COV-2を有する無症候性個体における陽性胸部イメージング所見の割合を評価する臨床研究の最近のメタ解析において、無症候性症例は陽性胸部イメージングを有し得ること、および放射線写真所見を伴う無症候性個体の緊密な臨床的モニタリングは、著しいパーセンテージが症状を発症するので必要であることを著者らは結論付けた。
免疫原性
結合性および中和血清抗体は最も頻繁に評価されるワクチンバイオマーカーであるが、細胞および粘膜免疫は、感染および疾患の予防ならびに進行中の伝染のリスクの低減において、同等またはよりいっそう重要な役割を果たし得る。この研究において、血清の結合性および中和抗体を二次的なエンドポイントとして測定し、IFN-γ ELISpotにより測定される粘膜IgAおよびT細胞応答を、探査的なエンドポイントとして測定する。
結合性および中和血清抗体は最も頻繁に評価されるワクチンバイオマーカーであるが、細胞および粘膜免疫は、感染および疾患の予防ならびに進行中の伝染のリスクの低減において、同等またはよりいっそう重要な役割を果たし得る。この研究において、血清の結合性および中和抗体を二次的なエンドポイントとして測定し、IFN-γ ELISpotにより測定される粘膜IgAおよびT細胞応答を、探査的なエンドポイントとして測定する。
シェディング
ワクチンウイルスの保有が一過性であることを、ハムスター研究からの結果は示している。鼻咽頭スワブ試料をqPCRのために得て、ベクターがどれほど長く投与の部位に持続するのかを決定する。意義は明確でないが、胃腸シェディングは気道シェディングよりも後に始まり、より長く持続することが、現在までに公開されたデータは示している。直腸スワブ試料をこの研究においてプラークアッセイのために収集して、感染性ウイルスの胃腸シェディングを評価する。
ワクチンウイルスの保有が一過性であることを、ハムスター研究からの結果は示している。鼻咽頭スワブ試料をqPCRのために得て、ベクターがどれほど長く投与の部位に持続するのかを決定する。意義は明確でないが、胃腸シェディングは気道シェディングよりも後に始まり、より長く持続することが、現在までに公開されたデータは示している。直腸スワブ試料をこの研究においてプラークアッセイのために収集して、感染性ウイルスの胃腸シェディングを評価する。
対象集団
この研究の目的のために、包含基準および除外基準を以下のように設定する。集団全般への投与のための実際の基準は異なり得る。これらの包含および除外基準は、請求項中に特に提供されなければ、請求項に対する限定として解釈されるべきではない。
この研究の目的のために、包含基準および除外基準を以下のように設定する。集団全般への投与のための実際の基準は異なり得る。これらの包含および除外基準は、請求項中に特に提供されなければ、請求項に対する限定として解釈されるべきではない。
包含基準
以下の基準の全てを満たす対象は研究に含められ得る：
1. ICFへの署名の日に、両端を含めて18～30歳の、男性および女性。
2. 以下に制限されないが、特に、高血圧、糖尿病、血栓塞栓障害、冠動脈心疾患、慢性閉塞性肺疾患に関して、臨床的に重大な医学的状態の経歴もその現行の証拠もなく、かつ研究者により決定されるような病歴、身体検査、バイタルサイン（酸素飽和度を含む）、ECG、肺活量測定、および安全性実験室試験により定義されるような、対象の安全性に干渉する臨床的に重大な検査異常もない、良好な健康状態。
3. 全体重≧50kgおよび体型指数（BMI）≧18.0kg/m2かつ≦28.0kg/m2（BMIの上限は、BMIが上方にバイアスされ得る筋肉質の健常対象の場合において、研究者の自由裁量で≦30kg/m2まで増加されてもよい）。
4. 薬物乱用、コチニン、およびアルコールスクリーニングで陰性（処方された医薬品により説明される場合を除く）。
5. 外科的に不妊化されていない女性について妊娠検査で陰性。
6. COVID Clear検査で陰性。
7. ワクチンウイルス伝染のリスクを軽減するための条件に従う意思がある（以下の条件は最小標準であるが、公共の健康に関する当局がSARS-CoV-2伝染の軽減のためにより高い標準を推奨する場合には増加され得る）：
・研究薬物の対ヒト伝染を予防するために意図される衛生手段；これには、各IMP用量後少なくとも14日間の石鹸または手消毒剤での頻繁な手洗い、呼吸衛生、および咳エチケットが含まれるがこれらに限定されない
・各IMP用量後少なくとも14日間の公共の場所または他人との接触時の手術用マスクの着用
・各IMP用量後少なくとも14日間、呼吸分泌物を一次容器に収集するために使用された全ての組織および材料を密封し、小児または動物にアクセス可能でない二次容器内に入れること
・各IMP用量後少なくとも14日間、脆弱な個体と緊密に接触しないこと。脆弱な個体としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
〇 65歳以上の人
〇 1歳以下の小児
〇 養護施設の住人および労働者
〇 以下のものなどの重大な慢性の医学的状態を有する任意の年齢の人：
- 慢性肺疾患（例えば、重篤な喘息、慢性閉塞性肺疾患）
- 慢性心臓血管疾患（例えば、心筋症、鬱血性心不全、心臓手術、虚血性心臓疾患、既知の解剖学的欠陥）
- 病的な肥満症
- インスリン依存性または2型糖尿病
- 慢性代謝性疾患（例えば、腎臓機能障害、異常ヘモグロビン症）による過去5年の間の医学的フォローアップまたは入院
- 免疫抑制
- がん
- 神経学的および神経発達的状態（例えば、脳性麻痺、癲癇、卒中、発作）
〇 妊娠しているか、または妊娠しようとしている女性
〇 COVID-19パンデミックの間に脆弱であるとして定義される任意の他の人。
8. 妊娠可能な女性対象は1つの形態の高度に有効な避妊法を使用しなければならない。避妊法の使用は、最後のIMP用量後少なくとも90日間続けなければならない。高度に有効な避妊法は下記に記載される通りである：
・以下に記載されるホルモン避妊法の確立された使用（1日目の前に≧14日間）。ホルモン避妊法が使用される場合、男性パートナーは、殺精子剤を含むコンドームを使用しなければならない：
〇 排卵の阻害と関連付けられる併用（エストロゲンおよびプロゲストゲン含有）ホルモン避妊法：
- 経口
- 腟内
- 経皮
〇 排卵の阻害と関連付けられるプロゲストゲン単独ホルモン避妊法：
- 経口
- 注射可能
- 移植可能
・子宮内デバイス
・子宮内ホルモン放出システム
・両側卵管結紮術
・男性の不妊手術（射精液中の精子の非存在について適切な精管切除術後の文書を伴う）；その場合、精管切除された男性がその女性にとっての唯一のパートナーである
・真の禁欲-性的禁欲は、研究処置と関連付けられるリスクの期間全体の間の異性との性交を避けることとして定義される場合にのみ高度に有効な方法であると考えられる。性的禁欲の信頼性は、臨床試験の持続期間および対象の好ましい通常の生活様式に関して評価される必要がある。
9. 男性対象は、最後のIMP用量後少なくとも90日間継続する使用と共に下記の避妊要件に同意しなければならない：
・女性パートナーにおいて妊娠を予防するためまたはIMPへの任意のパートナー（男性および女性）の曝露を予防するための殺精子剤を含むコンドームの使用
・射精液中の精子の非存在について適切な精管切除術後の文書を伴う男性の不妊手術（殺精子剤を含むコンドームの使用は、パートナーの曝露を予防するために依然として要求されることを留意されたい）。これは、研究に参加する男性にのみ適用される。
・追加的に、妊娠可能な女性パートナーのために、そのパートナーは、別の形態の避妊法、例えば女性対象について上記される高度に有効な方法のうちの1つを使用しなければならない。
・真の禁欲-性的禁欲は、研究処置と関連付けられるリスクの期間全体の間の異性との性交を避けることとして定義される場合にのみ高度に有効な方法であると考えられる。性的禁欲の信頼性は、臨床試験の持続期間および対象の好ましい通常の生活様式に関して評価される必要がある。
10. 上記の避妊要件に加えて、男性対象は、最後のIMP用量後少なくとも90日間精子を提供しないことに同意しなければならない。
11. 研究ユニットへの全ての来診を含めて、研究期間の全体を通じて研究の全ての局面への参加およびその遵守の意思があること。
12. 書面によるインフォームドコンセントの提出。
以下の基準の全てを満たす対象は研究に含められ得る：
1. ICFへの署名の日に、両端を含めて18～30歳の、男性および女性。
2. 以下に制限されないが、特に、高血圧、糖尿病、血栓塞栓障害、冠動脈心疾患、慢性閉塞性肺疾患に関して、臨床的に重大な医学的状態の経歴もその現行の証拠もなく、かつ研究者により決定されるような病歴、身体検査、バイタルサイン（酸素飽和度を含む）、ECG、肺活量測定、および安全性実験室試験により定義されるような、対象の安全性に干渉する臨床的に重大な検査異常もない、良好な健康状態。
3. 全体重≧50kgおよび体型指数（BMI）≧18.0kg/m2かつ≦28.0kg/m2（BMIの上限は、BMIが上方にバイアスされ得る筋肉質の健常対象の場合において、研究者の自由裁量で≦30kg/m2まで増加されてもよい）。
4. 薬物乱用、コチニン、およびアルコールスクリーニングで陰性（処方された医薬品により説明される場合を除く）。
5. 外科的に不妊化されていない女性について妊娠検査で陰性。
6. COVID Clear検査で陰性。
7. ワクチンウイルス伝染のリスクを軽減するための条件に従う意思がある（以下の条件は最小標準であるが、公共の健康に関する当局がSARS-CoV-2伝染の軽減のためにより高い標準を推奨する場合には増加され得る）：
・研究薬物の対ヒト伝染を予防するために意図される衛生手段；これには、各IMP用量後少なくとも14日間の石鹸または手消毒剤での頻繁な手洗い、呼吸衛生、および咳エチケットが含まれるがこれらに限定されない
・各IMP用量後少なくとも14日間の公共の場所または他人との接触時の手術用マスクの着用
・各IMP用量後少なくとも14日間、呼吸分泌物を一次容器に収集するために使用された全ての組織および材料を密封し、小児または動物にアクセス可能でない二次容器内に入れること
・各IMP用量後少なくとも14日間、脆弱な個体と緊密に接触しないこと。脆弱な個体としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
〇 65歳以上の人
〇 1歳以下の小児
〇 養護施設の住人および労働者
〇 以下のものなどの重大な慢性の医学的状態を有する任意の年齢の人：
- 慢性肺疾患（例えば、重篤な喘息、慢性閉塞性肺疾患）
- 慢性心臓血管疾患（例えば、心筋症、鬱血性心不全、心臓手術、虚血性心臓疾患、既知の解剖学的欠陥）
- 病的な肥満症
- インスリン依存性または2型糖尿病
- 慢性代謝性疾患（例えば、腎臓機能障害、異常ヘモグロビン症）による過去5年の間の医学的フォローアップまたは入院
- 免疫抑制
- がん
- 神経学的および神経発達的状態（例えば、脳性麻痺、癲癇、卒中、発作）
〇 妊娠しているか、または妊娠しようとしている女性
〇 COVID-19パンデミックの間に脆弱であるとして定義される任意の他の人。
8. 妊娠可能な女性対象は1つの形態の高度に有効な避妊法を使用しなければならない。避妊法の使用は、最後のIMP用量後少なくとも90日間続けなければならない。高度に有効な避妊法は下記に記載される通りである：
・以下に記載されるホルモン避妊法の確立された使用（1日目の前に≧14日間）。ホルモン避妊法が使用される場合、男性パートナーは、殺精子剤を含むコンドームを使用しなければならない：
〇 排卵の阻害と関連付けられる併用（エストロゲンおよびプロゲストゲン含有）ホルモン避妊法：
- 経口
- 腟内
- 経皮
〇 排卵の阻害と関連付けられるプロゲストゲン単独ホルモン避妊法：
- 経口
- 注射可能
- 移植可能
・子宮内デバイス
・子宮内ホルモン放出システム
・両側卵管結紮術
・男性の不妊手術（射精液中の精子の非存在について適切な精管切除術後の文書を伴う）；その場合、精管切除された男性がその女性にとっての唯一のパートナーである
・真の禁欲-性的禁欲は、研究処置と関連付けられるリスクの期間全体の間の異性との性交を避けることとして定義される場合にのみ高度に有効な方法であると考えられる。性的禁欲の信頼性は、臨床試験の持続期間および対象の好ましい通常の生活様式に関して評価される必要がある。
9. 男性対象は、最後のIMP用量後少なくとも90日間継続する使用と共に下記の避妊要件に同意しなければならない：
・女性パートナーにおいて妊娠を予防するためまたはIMPへの任意のパートナー（男性および女性）の曝露を予防するための殺精子剤を含むコンドームの使用
・射精液中の精子の非存在について適切な精管切除術後の文書を伴う男性の不妊手術（殺精子剤を含むコンドームの使用は、パートナーの曝露を予防するために依然として要求されることを留意されたい）。これは、研究に参加する男性にのみ適用される。
・追加的に、妊娠可能な女性パートナーのために、そのパートナーは、別の形態の避妊法、例えば女性対象について上記される高度に有効な方法のうちの1つを使用しなければならない。
・真の禁欲-性的禁欲は、研究処置と関連付けられるリスクの期間全体の間の異性との性交を避けることとして定義される場合にのみ高度に有効な方法であると考えられる。性的禁欲の信頼性は、臨床試験の持続期間および対象の好ましい通常の生活様式に関して評価される必要がある。
10. 上記の避妊要件に加えて、男性対象は、最後のIMP用量後少なくとも90日間精子を提供しないことに同意しなければならない。
11. 研究ユニットへの全ての来診を含めて、研究期間の全体を通じて研究の全ての局面への参加およびその遵守の意思があること。
12. 書面によるインフォームドコンセントの提出。
除外基準
以下の基準のいずれかを満たす対象は研究から除外される：
1. ヘモグロビンA1c≧6.0％または42mmol/mol。
2. 1秒間の強制呼気量（FEV1）が予測値の＜80％。
3. 1日目の28日以内の、上または下気道感染症を示唆する徴候または症状（発熱または持続性の咳を含む）。
4. 妊娠、妊娠の可能性、または授乳している女性。
5. 妊娠中の第3期であるか、または過去6か月以内に出産した女性。
6. 最後のIMP用量後90日以内に妊娠を計画している（対象またはパートナー）。
7. 繰返しの静脈切開術のために不十分な静脈アクセス。
8. 確認されたか、または疑われたSARS-CoV-2感染の経歴。
9. 接触後14日以内にSARS-CoV-2を有することがその後に確認された任意の個体との接触。
10. 吸入器を用いて処置された喘鳴の経歴。
11. これまでに入院を結果としてもたらした、喘鳴を含む呼吸器症状。
12. ウイルスに対する既知の気管支過敏症。
13. 研究の目的、および特に鼻評価またはウイルスチャレンジに干渉し得る実質的な仕方での鼻または鼻咽頭の解剖学的形態を変更する任意の重大な異常（鼻ポリープの経歴は包含され得るが、現行の重大な症状を引き起こすおよび/または前月の定期的な処置を要した大きな鼻ポリープは除外される）。
14. 1日目の前の3か月以内の鼻出血（多量の鼻血）の任意の臨床的に重大な経歴または任意の以前の機会における鼻出血に起因する入院の経歴。
15. 1日目の前の3か月以内の任意の鼻または洞の手術。
16. 鼻手術または鼻焼灼術の経歴。
17. 自己免疫または脱髄性の病歴。
18. ベル麻痺の経歴。
19. 過去10年以内の精神病、精神医学的病気のための入院、臨床的に関連するうつ病、または自殺企図の経歴。
20. 発作（小児期熱性発作以外）、認知症、または進行性の神経学的疾患の経歴。
21. ギラン-バレー症候群を含む、感染後またはワクチン接種後の神経学的続発症の経歴。
22. 免疫化に対する重篤な反応の経歴。
23. アナフィラキシーの経歴、または研究者による評価で任意の食品もしくは薬物に対する重篤なアレルギー性反応もしくは重大な不耐性の経歴。
24. 再発の可能性は極めて低いと研究者が考える非黒色腫皮膚がんおよび他の早期ステージの外科的に切除される悪性腫瘍を除く、既知のまたは疑われる悪性腫瘍。
25. 1日目の前の90日以内のコルチコステロイド（鼻腔内ステロイドを含む）、アルキル化薬物、代謝拮抗物質、放射線、免疫調節生物製剤、もしくは他の免疫調節療法の使用を含む、免疫不全、または研究の間のこれらのいずれかの使用の計画（皮膚に使用される軽度～中等度の効力の外用ステロイドクリームは許容される）。
26. 1日目の前の30日以内の安定でないか、または医薬品の変更を要求する任意の他の慢性の医学的状態。
27. 任意の認可済みもしくは研究用コロナウイルスワクチンを受けたことまたはSARS-CoV-2の接種。
28. 1日目の前の12か月以内に3回以上IMPを受けたこと。
29. 1日目の前の90日または5半減期（いずれかより長い方）以内の呼吸器ウイルスを用いるウイルスチャレンジ研究への参加。
30. 1日目の前の90日または5半減期（いずれかより長い方）以内にIMPを受けたこと。
31. 1日目の前の90日以内に輸血もしくは血液製造物を受けたことまたは研究の間の使用の計画。
32. 1日目の前の90日以内に鼻腔内ワクチンを受けたこと。
33. 1日目の前の30日以内に任意のワクチン、結核皮膚試験、もしくはアレルギー抗原接種を受けたことまたは57日目を通じて受けようと計画していること。
34. 1日目の前の30日以内に鼻腔内ステロイドを受けたことまたは1日目の前の7日以内に任意の他の鼻腔内医薬品（店頭医薬品を含むが、食塩水は除く）を受けたこと。
35. COVID-19の予防または処置のための任意の医薬品の現行の使用。
36. 57日目を通じて入院または外科的処置を計画している。
37. 鼻腔内非合法薬物の定期的なまたは現行の使用。
38. アルコール嗜癖、またはアルコールの過度の使用（週当たりで＞28単位のアルコールの摂取；1単位はビールグラス半量、小さいワイングラス、またはスピリッツの尺度）の経歴または存在。
39. キサンチン含有物質の過度の消費（例えば、1日当たりで＞5カップのカフェイン入り飲料、例えば、コーヒー、茶、コーラの摂取）。
40. 任意の種類の現行の喫煙者（例えば、シガレット、電子シガレット、マリファナ）。
41. ≧5パック-イヤーの喫煙歴または1日目の前の30日以内の任意の喫煙。
42. -2日目または-1日目の入院前の48時間の激しい運動。
43. 1日目の前の90日以内の≧470mLの血液供与。
44. 研究者により決定される臨床的に重大なECG異常。
45. HIV、B型肝炎ウイルス、またはC型肝炎ウイルスまたは活動性A型肝炎ウイルス感染の陽性の結果。
46. 研究者の判断で、プロトコールの遵守、安全性（反応原性を含む）の評価、またはインフォームドコンセントを行う対象の能力に干渉するか、またはその禁忌となる、任意の医学的、精神医学的、もしくは社会的条件または職業上もしくは他の責任。
47. 研究者の意見で、対象が検疫要件に対処できないようにする懸念を生じさせる任意の理由。
48. Codagenix、ベンダー、または研究と関連付けられる研究施設の従業員または従業員の近親者。
以下の基準のいずれかを満たす対象は研究から除外される：
1. ヘモグロビンA1c≧6.0％または42mmol/mol。
2. 1秒間の強制呼気量（FEV1）が予測値の＜80％。
3. 1日目の28日以内の、上または下気道感染症を示唆する徴候または症状（発熱または持続性の咳を含む）。
4. 妊娠、妊娠の可能性、または授乳している女性。
5. 妊娠中の第3期であるか、または過去6か月以内に出産した女性。
6. 最後のIMP用量後90日以内に妊娠を計画している（対象またはパートナー）。
7. 繰返しの静脈切開術のために不十分な静脈アクセス。
8. 確認されたか、または疑われたSARS-CoV-2感染の経歴。
9. 接触後14日以内にSARS-CoV-2を有することがその後に確認された任意の個体との接触。
10. 吸入器を用いて処置された喘鳴の経歴。
11. これまでに入院を結果としてもたらした、喘鳴を含む呼吸器症状。
12. ウイルスに対する既知の気管支過敏症。
13. 研究の目的、および特に鼻評価またはウイルスチャレンジに干渉し得る実質的な仕方での鼻または鼻咽頭の解剖学的形態を変更する任意の重大な異常（鼻ポリープの経歴は包含され得るが、現行の重大な症状を引き起こすおよび/または前月の定期的な処置を要した大きな鼻ポリープは除外される）。
14. 1日目の前の3か月以内の鼻出血（多量の鼻血）の任意の臨床的に重大な経歴または任意の以前の機会における鼻出血に起因する入院の経歴。
15. 1日目の前の3か月以内の任意の鼻または洞の手術。
16. 鼻手術または鼻焼灼術の経歴。
17. 自己免疫または脱髄性の病歴。
18. ベル麻痺の経歴。
19. 過去10年以内の精神病、精神医学的病気のための入院、臨床的に関連するうつ病、または自殺企図の経歴。
20. 発作（小児期熱性発作以外）、認知症、または進行性の神経学的疾患の経歴。
21. ギラン-バレー症候群を含む、感染後またはワクチン接種後の神経学的続発症の経歴。
22. 免疫化に対する重篤な反応の経歴。
23. アナフィラキシーの経歴、または研究者による評価で任意の食品もしくは薬物に対する重篤なアレルギー性反応もしくは重大な不耐性の経歴。
24. 再発の可能性は極めて低いと研究者が考える非黒色腫皮膚がんおよび他の早期ステージの外科的に切除される悪性腫瘍を除く、既知のまたは疑われる悪性腫瘍。
25. 1日目の前の90日以内のコルチコステロイド（鼻腔内ステロイドを含む）、アルキル化薬物、代謝拮抗物質、放射線、免疫調節生物製剤、もしくは他の免疫調節療法の使用を含む、免疫不全、または研究の間のこれらのいずれかの使用の計画（皮膚に使用される軽度～中等度の効力の外用ステロイドクリームは許容される）。
26. 1日目の前の30日以内の安定でないか、または医薬品の変更を要求する任意の他の慢性の医学的状態。
27. 任意の認可済みもしくは研究用コロナウイルスワクチンを受けたことまたはSARS-CoV-2の接種。
28. 1日目の前の12か月以内に3回以上IMPを受けたこと。
29. 1日目の前の90日または5半減期（いずれかより長い方）以内の呼吸器ウイルスを用いるウイルスチャレンジ研究への参加。
30. 1日目の前の90日または5半減期（いずれかより長い方）以内にIMPを受けたこと。
31. 1日目の前の90日以内に輸血もしくは血液製造物を受けたことまたは研究の間の使用の計画。
32. 1日目の前の90日以内に鼻腔内ワクチンを受けたこと。
33. 1日目の前の30日以内に任意のワクチン、結核皮膚試験、もしくはアレルギー抗原接種を受けたことまたは57日目を通じて受けようと計画していること。
34. 1日目の前の30日以内に鼻腔内ステロイドを受けたことまたは1日目の前の7日以内に任意の他の鼻腔内医薬品（店頭医薬品を含むが、食塩水は除く）を受けたこと。
35. COVID-19の予防または処置のための任意の医薬品の現行の使用。
36. 57日目を通じて入院または外科的処置を計画している。
37. 鼻腔内非合法薬物の定期的なまたは現行の使用。
38. アルコール嗜癖、またはアルコールの過度の使用（週当たりで＞28単位のアルコールの摂取；1単位はビールグラス半量、小さいワイングラス、またはスピリッツの尺度）の経歴または存在。
39. キサンチン含有物質の過度の消費（例えば、1日当たりで＞5カップのカフェイン入り飲料、例えば、コーヒー、茶、コーラの摂取）。
40. 任意の種類の現行の喫煙者（例えば、シガレット、電子シガレット、マリファナ）。
41. ≧5パック-イヤーの喫煙歴または1日目の前の30日以内の任意の喫煙。
42. -2日目または-1日目の入院前の48時間の激しい運動。
43. 1日目の前の90日以内の≧470mLの血液供与。
44. 研究者により決定される臨床的に重大なECG異常。
45. HIV、B型肝炎ウイルス、またはC型肝炎ウイルスまたは活動性A型肝炎ウイルス感染の陽性の結果。
46. 研究者の判断で、プロトコールの遵守、安全性（反応原性を含む）の評価、またはインフォームドコンセントを行う対象の能力に干渉するか、またはその禁忌となる、任意の医学的、精神医学的、もしくは社会的条件または職業上もしくは他の責任。
47. 研究者の意見で、対象が検疫要件に対処できないようにする懸念を生じさせる任意の理由。
48. Codagenix、ベンダー、または研究と関連付けられる研究施設の従業員または従業員の近親者。
包含および除外基準を満たさない対象は、研究者の自由裁量において、スポンサーとの相談で再スクリーニングすることができ、後日に包含および除外基準を満たした場合に研究に参加することができる。
一時的遅延基準
COVI-VAC/プラセボの投与は、以下の基準のいずれかを満たした任意の対象について遅延される：
1. 過去3日以内の鼻出血（鼻血）。
2. 過去3日内の上呼吸器感染症もしくは発熱の症状（主観的もしくは客観的）または倦怠感。
COVI-VAC/プラセボの投与は、以下の基準のいずれかを満たした任意の対象について遅延される：
1. 過去3日以内の鼻出血（鼻血）。
2. 過去3日内の上呼吸器感染症もしくは発熱の症状（主観的もしくは客観的）または倦怠感。
IMPの適切な投与または日誌データの解釈を阻害し得る症状の任意の徴候（例えば、体温≧38℃、鼻詰まり、鼻漏）。
本発明の様々な態様が詳細な説明において上記される。これらの説明は上記の態様を直接的に記載するが、当業者は本明細書に示され、記載される特有の態様に対する改変および/またはバリエーションを想像し得ることが理解される。本明細書の範囲内に入る任意のそのような改変またはバリエーションもまた本明細書に含まれることが意図される。特に記載されなければ、明細書および請求項における単語および語句は、応用可能な技術分野の当業者にとって通常および慣例の意味を与えられることが本発明者らの意図である。
本出願の出願時に出願人が知る本発明の様々な態様の以上の記載が提示され、例証および説明の目的のために意図される。本明細書は網羅的であることも、本発明を開示される正確な形態に限定することも意図せず、上記の教示に照らして多くの改変およびバリエーションが可能である。記載される態様は、本発明の原理およびその実際の応用を説明するためならびに当業者が本発明を様々な態様においておよび想定される特定の用途に適するような様々な改変と共に利用することを可能にするために役立つ。したがって、本発明は、本発明を実行するために開示された特定の態様に限定されないことが意図される。
本発明の特定の態様を示し、記載してきたが、本明細書における教示に基づいて、本発明およびそのより広い局面から離れることなく変更および改変が為され得ること、ならびにしたがって、添付の請求項は、本発明の真の精神および範囲内にあるような全てのそのような変更および改変をそれらの範囲内に包含することは当業者に明らかであろう。一般に、本明細書において使用される用語は、「オープン」な用語として一般に意図されることが当業者により理解されるであろう（例えば、「含む」（including）という用語は、「含むがそれに限定されない」として解釈されるべきであり、「有する」という用語は、「少なくとも～を有する」として解釈されるべきであり、「含む」（includes）という用語は、「含むがそれに限定されない」として解釈されるべきである、など）。
本明細書において使用される場合、「含む」（comprising）または「含む」（comprises）という用語は、態様にとって有用な、組成物、方法、およびその各々の構成要素に関して使用されるが、有用なものまたは有用でないもののいずれであれ、不特定の構成要素の包含に対してオープンである。一般に、本明細書において使用される用語は、「オープン」な用語として一般に意図されることが当業者により理解されるであろう（例えば、「含む」（including）という用語は、「含むがそれに限定されない」として解釈されるべきであり、「有する」という用語は、「少なくとも～を有する」として解釈されるべきであり、「含む」（includes）という用語は、「含むがそれに限定されない」として解釈されるべきである、など）。含む（including）、含有する、または有するなどの用語の同義語としての「含む」（comprising）というオープンエンドの用語が、本発明を記載およびクレームするために本明細書において使用されるが、本発明、またはその態様は、「からなる」または「から本質的になる」などの代替的な用語を使用して代替的に記載され得る。
Claims (48)
- 親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片をコードするポリヌクレオチドであって、
前記ポリヌクレオチドが、その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、再コードされており、かつ
前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記親SARS-CoV-2コロナウイルスの前記1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列が同じままであるか、あるいは
前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記親SARS-CoV-2コロナウイルスの前記1つもしくは複数のウイルスタンパク質または1つもしくは複数のその断片のアミノ酸配列が、最大20アミノ酸の置換、付加、または欠失を含む、
ポリヌクレオチド。 - 前記親SARS-CoV-2コロナウイルスが、野生型SARS-CoV-2である、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 前記親SARS-CoV-2コロナウイルスが、天然分離株SARS-CoV-2である、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 前記親SARS-CoV-2コロナウイルスが、GenBankアクセッション番号MN985325.1の核酸配列を有するSARS-CoV-2コロナウイルスのワシントン分離株である、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 前記親SARS-CoV-2コロナウイルスが、SARS-CoV-2コロナウイルスのBetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019分離株（SEQ ID NO:1）である、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 前記親SARS-CoV-2コロナウイルスが、SARS-CoV-2バリアントである、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 前記親SARS-CoV-2コロナウイルスが、英国バリアント、南アフリカバリアント、およびブラジルバリアントからなる群より選択されるSARS-CoV-2バリアントである、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、コドンペアバイアス（CPB）を低減させることまたはコドン使用頻度バイアスを低減させることにより再コードされている、請求項1～7のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、CpGまたはUpAジヌクレオチドの数を増加させることにより再コードされている、請求項1～7のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- 前記再コードされた1つもしくは複数のウイルスタンパク質の各々、または前記再コードされた1つもしくは複数のその断片の各々が、-0.05より低い、-0.1より低い、-0.2より低い、-0.3より低い、または-0.4より低いコドンペアバイアスを有する、前記請求項のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、CPB脱最適化されている、前記請求項のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- その親SARS-CoV-2コロナウイルスポリヌクレオチドと比較して、コドン脱最適化されている、前記請求項のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- 前記コドン脱最適化またはCPB脱最適化が、ヒトにおいて頻繁に使用されるコドンまたはCPBに基づく、請求項11～12のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- 前記コドン脱最適化またはCPB脱最適化が、コロナウイルスにおいて頻繁に使用されるコドンまたはCPBに基づく、請求項11～12のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- 前記コドン脱最適化またはCPB脱最適化が、SARS-CoV-2コロナウイルスにおいて頻繁に使用されるコドンまたはCPBに基づく、請求項11～12のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- 前記コドン脱最適化またはCPB脱最適化が、野生型SARS-CoV-2コロナウイルスにおいて頻繁に使用されるコドンまたはCPBに基づく、請求項11～12のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- RNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRP）、RdRPの断片、スパイクタンパク質、スパイクタンパク質の断片、およびこれらの組合せから選択される、再コードされたヌクレオチド配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のbp 11294～12709、bp 14641～15903、bp 21656～22306、bp 22505～23905、およびbp 24110～25381から選択される少なくとも1つのCPB脱最適化された領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- 再コードされたスパイクタンパク質またはスパイクタンパク質の断片を含み、フューリン切断部位が排除されている、前記請求項のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834、SEQ ID NO:7、またはSEQ ID NO:7のヌクレオチド1～29,834を有する、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 3’末端における1つまたは複数の連続するアデニンをさらに含む、請求項20記載のポリヌクレオチド。
- SEQ ID NO:3を有する、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1～22のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む、細菌人工染色体（BAC）。
- 請求項1～22のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項1～22のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、請求項23記載のBAC、または24記載のベクターを含む、細胞。
- Vero細胞またはベビーハムスター腎臓（BHK）細胞である、請求項25記載の細胞。
- 請求項1～22のいずれか一項記載のポリヌクレオチドによりコードされる、ポリペプチド。
- 請求項1～22のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む、改変型SARS-CoV-2コロナウイルス。
- 請求項1～22のいずれか一項記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
を含む、改変型SARS-CoV-2コロナウイルス。 - そのウイルスタンパク質のうちの1つまたは複数の発現が、その親SARS-CoV-2コロナウイルスと比較して、低減されている、請求項28または請求項29記載の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス。
- そのウイルスタンパク質のうちの1つまたは複数の発現における低減が、RdRP、スパイクタンパク質およびこれらの組合せから選択される領域を再コードすることの結果として、低減されている、請求項28～30のいずれか一項記載の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス。
- SEQ ID NO:4、またはSEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834、またはSEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834および3’末端における1つもしくは複数の連続するアデニン
を有するポリヌクレオチド
を含む、改変型SARS-CoV-2コロナウイルス。 - SEQ ID NO:4、またはSEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834、またはSEQ ID NO:4のヌクレオチド1～29,834および3’末端における1つもしくは複数の連続するアデニンを有するポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチドを含む、改変型SARS-CoV-2コロナウイルス。 - 請求項28～33のいずれか一項記載の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス
を含む、対象において保護免疫応答を誘導するためのワクチン組成物。 - 薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項34記載のワクチン組成物。
- 請求項28～33のいずれか一項記載の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス
を含む、対象において免疫応答を誘発するための免疫組成物。 - 薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項36記載の免疫組成物。
- 対象において免疫応答を誘発する方法であって、以下：
請求項28～33のいずれか一項記載の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、または
請求項34もしくは請求項35記載のワクチン組成物、または
請求項36もしくは請求項37記載の免疫組成物
のある用量を、前記対象に投与する工程
を含む、方法。 - 対象において免疫応答を誘発する方法であって、以下：
請求項28～33のいずれか一項記載の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、または請求項34もしくは請求項35記載のワクチン組成物、または請求項36もしくは請求項37記載の免疫組成物の、プライム用量を、前記対象に投与する工程；および
請求項28～33のいずれか一項記載の改変型SARS-CoV-2コロナウイルス、または請求項34もしくは請求項35記載のワクチン組成物、または請求項36もしくは請求項37記載の免疫組成物の、1つまたは複数のブースト用量を、前記対象に投与する工程
を含む、方法。 - 前記免疫応答が、保護免疫応答である、請求項38～39のいずれか一項記載の方法。
- 前記用量が、予防有効用量または治療有効用量である、請求項38～40のいずれか一項記載の方法。
- 投与する工程が、経鼻経路を介する、請求項38～41のいずれか一項記載の方法。
- 投与する工程が、点鼻を介する、請求項38～41のいずれか一項記載の方法。
- 投与する工程が、経鼻スプレーを介する、請求項38～41のいずれか一項記載の方法。
- 前記用量が約104～106 PFUである、または、
前記プライム用量が約104～106 PFUであり、かつ前記1つもしくは複数のブースト用量が約104～106 PFUである、
請求項38～45のいずれか一項記載の方法。 - 改変型SARS-CoV-2コロナウイルスを製造する方法であって、以下：
親SARS-CoV-2コロナウイルスの1つもしくは複数のタンパク質または1つもしくは複数のその断片をコードするヌクレオチド配列を得る工程；
前記1つもしくは複数のタンパク質または1つもしくは複数のその断片のタンパク質発現を低減させるために、前記ヌクレオチド配列を再コードする工程；および
前記改変型SARS-CoV-2コロナウイルスゲノムを製造するために、前記再コードされたヌクレオチド配列を有する核酸で前記親SARS-CoV-2コロナウイルスゲノムを置換する工程
を含み、
前記再コードされたヌクレオチド配列の発現が、前記親ウイルスと比較して、低減されている、方法。 - 前記親SARS-CoV-2コロナウイルス配列が、野生型（wt）ウイルス核酸である、請求項46記載の方法。
- 前記改変型SARS-CoV-2コロナウイルスが、請求項28～33のいずれか一項記載のものである、請求項46記載の方法。
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