CN103937836A - 水通道蛋白-4自身抗体的检测方法及融合表达病毒载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水通道蛋白-4自身抗体的检测方法及融合表达病毒载体和应用。所述病毒载体为pCDH-MCS-AQP4-EF1-copGFP，其核苷酸序列如序列表如SEQIDNO.2所示。本发明更进一步公开了融合表达病毒载体在制备用于提高视神经脊髓炎和多发性硬化的临床诊疗水平方面的应用。本发明采用灵敏度和特异性更高的荧光免疫细胞染色结合流式细胞检测技术，用于临床定性、定量检测AQP-4抗体，使检测结果更加稳定，且极大节约人力和时间成本。该项目的建立将极大提高视神经脊髓炎疾病谱和多发性硬化的诊疗水平，提高患者的劳动能力和生活质量，将产生很大的社会效益和经济效益。

Description

水通道蛋白-4自身抗体的检测方法及融合表达病毒载体和应用

技术领域

 本发明涉及一种流式细胞术检测水通道蛋白-4自身抗体的方法及其融合表达病毒载体。水通道蛋白（aquaporin, AQP）-4抗体阳性是视神经脊髓炎诊断的重要支持条件，抗体滴度与患者病情的严重程度、预后、复发具有相关性。本发明属于疾病分子鉴定和诊断领域，结合病毒载体构建，转染，荧光免疫染色及流式细胞分析技术，主要应用于NMO和MS的临床鉴别诊断，提高NMO和MS的诊断水平；能辅助作为用药疗效、病情监测、复发预测的指标；AQP-4检测平台的建立能为进一步研究AQP-4抗体的致病机制提供基础。

背景技术

多发性硬化（Multiple Sclerosis, MS）和视神经脊髓炎（neuromyelitis optica, NMO）是中枢神经系统最为常见的脱髓鞘疾病，已成为中青年非外伤致残首要疾病之一。两种疾病均常累及视神经和脊髓，因此临床上较难区分，尤其是发病早期。目前研究认为MS是由CD4辅助T细胞(包括Th1和Th17亚群)介导的自身免疫疾病，故治疗多以免疫调节为主，如β-干扰素等。而NMO以体液免疫为主，治疗多以免疫抑制为主。因此，早期鉴别诊断对指导两种疾病的治疗和评估预后非常重要。2004年Lennon等通过间接免疫荧光染色方法检测发现视神经脊髓炎病人血清中存在着一种特异性自身抗体NMO-IgG，它在视神经炎（Optic neuritis,ON)、长节段横贯性脊髓炎(Longitudinally extensive tranverse myelitis,LETM)患者血清中的阳性率也较高，2006年Wingerchuk DM修订了NMO诊断标准，将NMO-IgG抗体阳性做为诊断的重要支持条件，该诊断标准强调了水通道蛋白-4抗体在NMO诊断中的重要价值。在此基础上，Wingerchuk DM 又于2007年提出了视神经脊髓炎疾病谱，认为ON、LETM（包括伴有自身免疫病和/或有颅内病灶）为视神经脊髓炎的限定型，连同视神经脊髓型多发性硬化（OSMS）一同被归为NMO的疾病谱。后续研究还发现，AQP4抗体滴度与患者病情的严重程度、预后、复发具有相关性，临床上用免疫球蛋白和血浆置换治疗NMO疗效较好。NMO患者尸检的病理显示病灶中血管周围有大量的免疫球蛋白和补体沉积、星型胶质细胞破坏和再生，其分布与AQP-4表达的分布相一致。通过AQP-4抗体阳性血清与转染AQP-4cDNA的HEK293细胞孵育，并用抗人IgG示踪已结合的抗体，发现NMO中的AQP-4抗体为IgG1，而IgG1具有激活补体功能。进一步的体外实验证实AQP-4抗体与表达AQP-4分子的HEK细胞结合后能激活补体。2009年Bennett等研究发现，在已经诱导出EAE的大鼠鞘内注射人工合成的AQP-4抗体能够导致病灶内星型胶质细胞的死亡，与NMO病灶病理改变相似。这提示AQP4抗体可能不仅仅是NMO的标志物，有可能是致病性抗体。

目前国际上检测AQP-4抗体的技术主要有间接免疫荧光法(Indirect Immunofluorescence, IIF)、荧光免疫沉淀法(Fluoroimmunoprecipitation Assay, FIPA)、放射免疫沉淀法(Radioimmunoprecipitation Assay, RIPA)、荧光免疫细胞染色法(Cell-Based  Assay,CBA)（文献支持Clin Immunol. 2011 Mar;138(3):239-46, Neurology. 2012 Feb 28;78(9):665-71；）及酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)。其中以CBA和FIPA的敏感性和特异性最为理想。然而，CBA法平均检测周期超过两天，荧光效率不稳定，而且需要人为观察 ，费时费力，而且可能会增加检测中的人为误差；FIPA法涉及到同位素的应用，环境危害性大大增加。此外，针对AQP-4自身抗体的检测国内目前只少数研究者利用CBA和FIPA做了科研研究，尚未常规应用于临床，因此何种方法作为“金标准”被推荐应用于临床AQP-4抗体的检测尚待阐明。

传统检测AQP-4的方法如间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法等敏感性和特异性均不高，放射免疫沉淀法涉及放射源污染问题。因此，我们应用稳定转染AQP-4的细胞系，采用灵敏度和特异性更高的荧光免疫细胞染色法（CBA）结合流式细胞检测技术，用于临床定性、定量检测AQP-4抗体。

传统CBA方法应用的质粒为EGFP标记的人AQP4 cDNA质粒及对照EGFP cDNA质粒，应用聚乙烯亚胺（PEI）或脂质体方法进行瞬时转染。耗时长，人力物力损耗大，且荧光效率不稳定。因此需要更为稳定的转染方法以获得更敏感稳定的结果。

发明内容

本发明通过提供一种流式细胞术检测水通道蛋白-4自身抗体的方法，及其融合表达病毒载体。采用灵敏度和特异性更高的荧光免疫细胞染色结合流式细胞检测技术，用于临床定性、定量检测AQP-4抗体，使检测结果更加稳定，且极大节约人力和时间成本。AQP4抗体检测技术的平台的建立，有利于提高视神经脊髓炎和多发性硬化的临床诊疗水平。应用于NMO和MS的临床鉴别诊断，提高NMO和MS的诊断水平；能辅助作为用药疗效、病情监测、复发预测的指标；AQP-4检测平台的建立能为进一步研究AQP-4抗体的致病机制提供基础。

因此，本发明的一个目的是一种水通道蛋白-4自身抗体融合表达病毒载体，其特征在于所述表达病毒载体为pCDH-MCS-AQP4-EF1-copGFP，具有SEQ ID NO.2所示序列。

构建好的病毒载体的完整序列：

acgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatactagtattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagattctagaATGAGTGACAGACCCACAGCAAGGCGGTGGGGTAAGTGTGGACCTTTGTGTACCAGAGAGAACATCATGGTGGCTTTCAAAGGGGTCTGGACTCAAGCTTTCTGGAAAGCAGTCACAGCGGAATTTCTGGCCATGCTTATTTTTGTTCTCCTCAGCCTGGGATCCACCATCAACTGGGGTGGAACAGAAAAGCCTTTACCGGTCGACATGGTTCTCATCTCCCTTTGCTTTGGACTCAGCATTGCAACCATGGTGCAGTGCTTTGGCCATATCAGCGGTGGCCACATCAACCCTGCAGTGACTGTGGCCATGGTGTGCACCAGGAAGATCAGCATCGCCAAGTCTGTCTTCTACATCGCAGCCCAGTGCCTGGGGGCCATCATTGGAGCAGGAATCCTCTATCTGGTCACACCTCCCAGTGTGGTGGGAGGCCTGGGAGTCACCATGGTTCATGGAAATCTTACCGCTGGTCATGGTCTCCTGGTTGAGTTGATAATCACATTTCAATTGGTGTTTACTATCTTTGCCAGCTGTGATTCCAAACGGACTGATGTCACTGGCTCAATAGCTTTAGCAATTGGATTTTCTGTTGCAATTGGACATTTATTTGCAATCAATTATACTGGTGCCAGCATGAATCCCGCCCGATCCTTTGGACCTGCAGTTATCATGGGAAATTGGGAAAACCATTGGATATATTGGGTTGGGCCCATCATAGGAGCTGTCCTCGCTGGTGGCCTTTATGAGTATGTCTTCTGTCCAGATGTTGAATTCAAACGTCGTTTTAAAGAAGCCTTCAGCAAAGCTGCCCAGCAAACAAAAGGAAGCTACATGGAGGTGGAGGACAACAGGAGTCAGGTAGAGACGGATGACCTGATTCTAAAACCTGGAGTGGTGCATGTGATTGACGTTGACCGGGGAGAGGAGAAGAAGGGGAAAGACCAATCTGGAGAGGTATTGTCTTCAGTAGGTGGAGGCGGTTCAagatccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaactgcagctcgaggcggccgcgaattcgtcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaaaataagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattg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本发明另一个目的是一种产生水通道蛋白-4自身抗体融合表达病毒载体的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行： 

1）载体构建：构建强组成型启动子CMV介导的融合表达人AQP-4基因及荧光标记基因EGFP的慢病毒载体；

无终止密码子的人AQP-4基因与EGFP基因用5个氨基酸组成的柔性序列（GGGGS）相连接，AQP-4-GGGGS-EGFP（如SEQ ID NO.1所示） ，EGFP在整个融合蛋白的N端，以保证AQP-4蛋白的天然状态的拓扑结构、亚细胞位置和两个蛋白相对独立的功能；

pEGFP-N1载体上扩增EGFP序列，所用引物如下：

EGFPF: 5’- CTA GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ 和EGFPR: 5’- CAG GTCGAC GAATTC GCGGCCGC CTCGAG CTGCAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’，

扩增片段切胶回收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用BamHI和SalI双酶切后与经同样酶双酶切后的pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP载体片段相连接，用EGFP置换掉原载体中的EF1-copGFP序列；

水通道蛋白AQP4基因序列构成：AQP-4-GGGGS-EGFP：

ATGAGTGACAGACCCACAGCAAGGCGGTGGGGTAAGTGTGGACCTTTGTGTACCAGAGAGAACATCATGGTGGCTTTCAAAGGGGTCTGGACTCAAGCTTTCTGGAAAGCAGTCACAGCGGAATTTCTGGCCATGCTTATTTTTGTTCTCCTCAGCCTGGGATCCACCATCAACTGGGGTGGAACAGAAAAGCCTTTACCGGTCGACATGGTTCTCATCTCCCTTTGCTTTGGACTCAGCATTGCAACCATGGTGCAGTGCTTTGGCCATATCAGCGGTGGCCACATCAACCCTGCAGTGACTGTGGCCATGGTGTGCACCAGGAAGATCAGCATCGCCAAGTCTGTCTTCTACATCGCAGCCCAGTGCCTGGGGGCCATCATTGGAGCAGGAATCCTCTATCTGGTCACACCTCCCAGTGTGGTGGGAGGCCTGGGAGTCACCATGGTTCATGGAAATCTTACCGCTGGTCATGGTCTCCTGGTTGAGTTGATAATCACATTTCAATTGGTGTTTACTATCTTTGCCAGCTGTGATTCCAAACGGACTGATGTCACTGGCTCAATAGCTTTAGCAATTGGATTTTCTGTTGCAATTGGACATTTATTTGCAATCAATTATACTGGTGCCAGCATGAATCCCGCCCGATCCTTTGGACCTGCAGTTATCATGGGAAATTGGGAAAACCATTGGATATATTGGGTTGGGCCCATCATAGGAGCTGTCCTCGCTGGTGGCCTTTATGAGTATGTCTTCTGTCCAGATGTTGAATTCAAACGTCGTTTTAAAGAAGCCTTCAGCAAAGCTGCCCAGCAAACAAAAGGAAGCTACATGGAGGTGGAGGACAACAGGAGTCAGGTAGAGACGGATGACCTGATTCTAAAACCTGGAGTGGTGCATGTGATTGACGTTGACCGGGGAGAGGAGAAGAAGGGGAAAGACCAATCTGGAGAGGTATTGTCTTCAGTAGGTGGAGGCGGTTCAagatccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa

以人视神经cDNA为模板，扩增AQP-4 （M1）序列，所用引物为：

AQP4F: 5’-ACTTCTAGAATGAGTGACAGACCCACAGCAAG-3’和

AQP4R: 5’-CCAAGATCTTGAACCGCCTCCACCTACTGAAGACAATACCTCTCCAGATTG-3’， 

扩增片段切胶回收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用XbaI和BglII双酶切后与经XbaI和BamHI双酶切后的步骤1获得质粒载体相连接，得到慢病毒质粒载体，其如SEQ ID NO.2所示。

本发明再一个目的是提供一种检测来自个体的生物样品中是否存在水通道蛋白-4自身抗体的方法，主要包括的步骤： 

1）载体构建：构建强组成型启动子CMV介导的融合表达人AQP-4基因及荧光标记基因EGFP的慢病毒载体。

无终止密码子的人AQP-4基因与EGFP基因用5个氨基酸组成的柔性序列（GGGGS）相连接，AQP-4-GGGGS-EGFP（序列1，如SEQ ID NO.1所示） ，EGFP在整个融合蛋白的N端，以保证AQP-4蛋白的天然状态的拓扑结构、亚细胞位置和两个蛋白相对独立的功能。

pEGFP-N1载体上扩增EGFP序列，所用引物如下：EGFPF: 5’- CTA GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ 和EGFPR: 5’- CAG GTCGAC GAATTC GCGGCCGC CTCGAG CTGCAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’，具体步骤如下：向PCR反应管中依次加入DNA模板 200ng，引物各2μl (终浓度为0.4μmol/L)，dNTP 2μl (终浓度为0.2μmol/L)，10×PCR缓冲液 5μl (终浓度为1×)，Taq DNA聚合酶 0.5μl (终浓度约5U/μl)，ddH2O补到终体积为50μl。 PCR的循环程序为：94℃变性30s， 60℃退火30s，72℃延伸2min)，循环35次。末次循环结束后，将反应管置于72℃温育5min，以确保充分延伸。扩增片段切胶回收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用BamHI和SalI双酶切后与经同样酶双酶切后的pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP载体片段相连接，用EGFP置换掉原载体中的EF1-copGFP序列；

以人视神经cDNA为模板，扩增AQP-4 （M1）序列，所用引物为：AQP4F: 5’-ACTTCTAGAATGAGTGACAGACCCACAGCAAG-3’和AQP4R: 5’-CCAAGATCTTGAACCGCCTCCACCTACTGAAGACAATACCTCTCCAGATTG-3’， 扩增片段切胶回收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用XbaI和BglII双酶切后与经XbaI和BamHI双酶切后的步骤1获得质粒载体相连接，得到本发明所用的慢病毒质粒载体（构建好的病毒载体的完整序列2，如SEQ ID NO.2所示）。

扩增方法如下：

    向PCR反应管中依次加入DNA模板 200ng，引物各2μl (终浓度为0.4μmol/L)，dNTP 2μl (终浓度为0.2μmol/L)，10×PCR缓冲液 5μl (终浓度为1×)，Taq DNA聚合酶 0.5μl (终浓度约5U/μl)，ddH2O补到终体积为50μl。 PCR的循环程序为：94℃变性30s， 60℃退火30s，72℃延伸2min)，循环35次。末次循环结束后，将反应管置于72℃温育5min，以确保充分延伸。

    应用胶回收试剂盒对扩增片段切胶回收（Axygen公司）后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用XbaI和BglII双酶切。具体步骤如下：将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号，用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶（XbaI和BglII）2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl酶液。混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。反应完成后制备琼脂糖凝胶，取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳，紫外成像系统观察并测定DNA酶切片段大小。鉴定正确后将获得质粒载体相连接，得到本发明所用的慢病毒质粒载体。

2）病毒包装及HEK293稳定转染细胞系的获得

 细胞系及其培养：人胚肾HEK293细胞系（为市售产品）由本室常规培养。细胞置于含有10%灭活胎牛血清（市售）的DMEM培养基中，放入37℃，5% CO₂孵箱，按常规方法培养，取处于对数生长期的细胞用于实验。

细胞的复苏和传代：预先向50ml 离心管中加入20mL DMEM培养基，从液氮罐取出冻存的细胞迅速投入37oC 水浴中并不断摇动使其在最短时间内解冻，用70%酒精消毒冻存管外表后，将细胞存储液转移至上述离心管中，1000rmp离心10分钟。弃上清，重悬细胞置于含10% 胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO₂、饱和湿度下培养。

待HEK293细胞长至70%密度时，撤掉旧的培养基，用PBS清洗细胞，利用CaCl₂法包装表达AQP-4-EGFP（pCDH-MCS-AQP4-EF1-copGFP）融合蛋白的慢病毒，收集病毒悬液在6 μg/ml Polybrene存在的情况下感染HEK293细胞，1周后，分选阳性稳定转染细胞。继续传代培养后进行二次筛选，获得100%转染过的稳定表达融合蛋白的HEK293细胞系。

所述的传代培养指的是细胞生长至对数生长期，用胰酶消化贴壁细胞2-5分钟，后传代至培养皿继续培养；

3）细胞免疫荧光染色法结合流式细胞术测定血清AQP-4抗体：

获得待检血清后，用含1%BSA（Sigma）DMEM-Hepes洗液稀释待测血清，收集转染及未转染的HEK293细胞，按1：1的比例混合，总数为5×10⁵，用流式staining缓冲液（1×PBS含3%的马血清及0.02%的叠氮钠NaN₃) 清洗1次，离心后弃去上清，用100μl稀释过的血清或人Ig对照重悬细胞，4度孵育30min，然后加入流式staining缓冲液清洗1次，离心收集细胞后加入100ul稀释后的Fast blue标记的山羊抗人IgG，4度避光孵育30 min，流式staining缓冲液清洗1次，然后用300ul流式staining缓冲液重悬细胞，流式细胞仪双通道检测荧光信号，以未转染细胞亚群及人Ig染色组为对照，判断AQP-4抗体阳性样本，依据EGFP阳性细胞类群中的Fast blue信号强弱用来标示抗体浓度的相对量。

4）统计分析：使用GraphPad Prism 4软件对数据进行绘图及统计分析得出结果。

本发明还一个目的是公开了水通道蛋白-4自身抗体融合表达病毒载体在制备用于提高视神经脊髓炎和多发性硬化临床诊疗方面的应用。

本发明提供的流式细胞术检测水通道蛋白-4自身抗体的方法，采用灵敏度和特异性更高的荧光免疫细胞染色结合流式细胞检测技术，用于临床定性、定量检测AQP-4抗体，使检测结果更加稳定，且极大节约人力和时间成本。AQP-4抗体检测技术的平台的建立，有利于提高视神经脊髓炎和多发性硬化的临床诊疗水平。抗体检测是自身免疫性疾病重要诊断指标，该项目的建立将极大提高视神经脊髓炎疾病谱和多发性硬化的诊疗水平，提高患者的劳动能力和生活质量，将产生很大的社会效益和经济效益。

 

附图说明  

图1  AQP4载体构建示意图；

图2  AQP4病毒质粒图谱；

图3  HEK293细胞感染AQP-4病毒表达载体后AQP-4基因表达水平示意图；

图4  HEK293细胞感染AQP-4病毒表达载体后AQP-4蛋白表达水平示意图；

图5  流式细胞术检测待检血清：灰色阴影表示AQP-4(-)血清标本，灰色实线表示AQP-4(+)血清标本，黑色实线表示AQP-4强阳性血清标本；

图6  流式细胞术检测待检血清，阴性、阳性及强阳性AQP4表达定量分析；

图7  流式结合细胞免疫荧光法检测视神经脊髓炎、多发性硬化及健康对照组血       清AQP4；

图8  传统细胞免疫荧光法检测视神经脊髓炎、多发性硬化及健康对照组血清       AQP4抗体表达水平。

具体实施方式

  为了对发明做进一步说明，下面结合具体实施例加以阐述。本行业的技术人员应该了解，下面的实施例和说明书中的描述的只是说明本发明的原理，而不是对本发明进行限制。

实施例1

一种水通道蛋白-4自身抗体融合表达病毒载体，所述表达病毒载体为pCDH-MCS-AQP4-EF1-copGFP具有SEQ ID NO.2所示序列，构建的方法： 

1）载体构建：构建强组成型启动子CMV介导的融合表达人AQP-4基因及荧光标记基因EGFP的慢病毒载体；

无终止密码子的人AQP-4基因与EGFP基因用5个氨基酸组成的柔性序列（GGGGS）相连接，AQP-4-GGGGS-EGFP（如SEQ ID NO.1所示） ，EGFP在整个融合蛋白的N端，以保证AQP-4蛋白的天然状态的拓扑结构、亚细胞位置和两个蛋白相对独立的功能；

pEGFP-N1载体上扩增EGFP序列，所用引物如下：

EGFPF: 5’- CTA GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ 和EGFPR: 5’- CAG GTCGAC GAATTC GCGGCCGC CTCGAG CTGCAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’，

扩增片段切胶回收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用BamHI和SalI双酶切后与经同样酶双酶切后的pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP载体片段相连接，用EGFP置换掉原载体中的EF1-copGFP序列；

以人视神经cDNA为模板，扩增AQP-4 （M1）序列，所用引物为：

AQP4F: 5’-ACTTCTAGAATGAGTGACAGACCCACAGCAAG-3’和

AQP4R: 5’-CCAAGATCTTGAACCGCCTCCACCTACTGAAGACAATACCTCTCCAGATTG-3’， 扩增片段切胶回收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用XbaI和BglII双酶切后与经XbaI和BamHI双酶切后的步骤1获得质粒载体相连接，得到慢病毒质粒载体，如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

一种检测来自个体的生物样品中是否存在水通道蛋白-4自身抗体的方法： 

1）载体构建：构建强组成型启动子CMV介导的融合表达人AQP-4基因及荧光标记基因EGFP的慢病毒载体；

无终止密码子的人AQP-4基因与EGFP基因用5个氨基酸组成的柔性序列（GGGGS）相连接，AQP-4-GGGGS-EGFP（如SEQ ID NO.1所示） ，EGFP在整个融合蛋白的N端，以保证AQP-4蛋白的天然状态的拓扑结构、亚细胞位置和两个蛋白相对独立的功能；

pEGFP-N1载体上扩增EGFP序列，所用引物如下：

EGFPF: 5’- CTA GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ 和EGFPR: 5’- CAG GTCGAC GAATTC GCGGCCGC CTCGAG CTGCAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’，扩增片段切胶回收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用BamHI和SalI双酶切后与经同样酶双酶切后的pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP载体片段相连接，用EGFP置换掉原载体中的EF1-copGFP序列；

以人视神经cDNA为模板，扩增AQP-4 （M1）序列，所用引物为：AQP4F: 5’-ACTTCTAGAATGAGTGACAGACCCACAGCAAG-3’和AQP4R: 5’-CCAAGATCTTGAACCGCCTCCACCTACTGAAGACAATACCTCTCCAGATTG-3’， 扩增片段切胶回收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用XbaI和BglII双酶切后与经XbaI和BamHI双酶切后的步骤1获得质粒载体相连接，得到慢病毒质粒载体（如SEQ ID NO.2所示）；

2）病毒包装及HEK293稳定转染细胞系的获得：

     细胞系及其培养：人胚肾HEK293细胞系由本室常规培养，细胞置于含有10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中，放入37℃，5% CO₂孵箱，按常规方法培养，取处于对数生长期的细胞用于实验；

细胞的复苏和传代：预先向50ml 离心管中加入20mL DMEM培养基，从液氮罐取出冻存的细胞迅速投入37℃水浴中并不断摇动使其在最短时间内解冻，用70%酒精消毒冻存管外表后，将细胞存储液转移至上述离心管中，1000rmp离心10分钟，弃上清，重悬细胞置于含10% 胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO₂、饱和湿度下培养；

待HEK293细胞长至70%密度时，撤掉旧的培养基，用PBS清洗细胞，利用CaCl₂法包装表达AQP-4-EGFP（pCDH-MCS-AQP4-EF1-copGFP）融合蛋白的慢病毒，收集病毒悬液在6 μg/ml Polybrene存在的情况下感染HEK293细胞，1周后，分选阳性稳定转染细胞；继续传代培养后进行二次筛选，获得100%转染过的稳定表达融合蛋白的HEK293细胞系；所述的传代培养指的是细胞生长至对数生长期，用胰酶消化贴壁细胞2-5分钟，后传代至培养皿继续培养；

3）细胞免疫荧光染色法结合流式细胞术测定血清AQP-4抗体：

获得待检血清后，用含1%BSA（Sigma）DMEM-Hepes洗液稀释待测血清，收集转染及未转染的HEK293细胞，按1：1的比例混合，总数为5×10⁵，用流式staining缓冲液（1×PBS含3%的马血清及0.02%的叠氮钠NaN₃) 清洗1次，离心后弃去上清，用100μl稀释过的血清或人Ig对照重悬细胞，4度孵育30min，然后加入流式staining缓冲液清洗1次，离心收集细胞后加入100ul稀释后的Fast blue标记的山羊抗人IgG，4度避光孵育30 min，流式staining缓冲液清洗1次，然后用300ul流式staining缓冲液重悬细胞，流式细胞仪双通道检测荧光信号，以未转染细胞亚群及人Ig染色组为对照，判断AQP-4抗体阳性样本，依据EGFP阳性细胞类群中的Fast blue信号强弱用来标示抗体浓度的相对量；

4）统计分析：使用GraphPad Prism 4软件对数据进行绘图及统计分析得出结果。

实施例3  

实际应用情况:

研究对象： 所选NMO患者58例、MS患者54例，其他神经科疾病（OND）组22例，来源于2010年01月至2012年12月天津医科大学总医院神经内科就诊患者。

实验材料来源：实验材料和测试设备除特别标明之外，其它均为市售产品，并参照相关使用说明书操作。AQP-4基因序列可从美国ncbi网站查询获得。

人胚肾HEK293细胞（为市售产品）由本实验室保存，细胞培养基及血清购自美国GIBICO公司，转染试剂购自Invitrogen公司。

1）载体构建：构建强组成性（型）启动子CMV介导的融合表达人AQP-4基因及荧光标记基因EGFP的慢病毒载体，无终止密码子的人AQP-4基因与EGFP基因用5个氨基酸组成的柔性序列（GGGGS）相连接，AQP-4-GGGGS-EGFP，其中，EGFP在整个融合蛋白的N端，以保证AQP-4蛋白的天然状态的拓扑结构、亚细胞位置和两个蛋白相对独立的功能。

2）pEGFP-N1载体上扩增EGFP序列，所用引物如下：EGFPF: 5’- CTA GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ 和EGFPR: 5’- CAG GTCGAC GAATTC GCGGCCGC CTCGAG CTGCAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’，扩增片段切胶回收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用BamHI和SalI双酶切后与经同样酶双酶切后的pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP载体片段相连接，用EGFP置换掉原载体中的EF1-copGFP序列；

3）以人视神经组织cDNA为模板，扩增AQP-4 （M1）序列，所用引物为：AQP4F: 5’-ACTTCTAGAATGAGTGACAGACCCACAGCAAG-3’和AQP4R: 5’-CCAAGATCTTGAACCGCCTCCACCTACTGAAGACAATACCTCTCCAGATTG-3’，向PCR反应管中依次加入DNA模板 200ng，引物各2μl (终浓度为0.4μmol/L)，dNTP 2μl (终浓度为0.2μmol/L)，10×PCR缓冲液 5μl (终浓度为1×)，Taq DNA聚合酶 0.5μl (终浓度约5U/μl)，ddH2O补到终体积为50μl。 PCR的循环程序为：94℃变性30s， 60℃退火30s，72℃延伸2min)，循环35次。末次循环结束后，将反应管置于72℃温育5min，以确保充分延伸。

    应用胶回收试剂盒对扩增片段切胶回收（Axygen公司）后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用XbaI和BglII双酶切。具体步骤如下：将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号，用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶（XbaI和BglII）2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl酶液。混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。反应完成后制备琼脂糖凝胶，取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳，紫外成像系统观察并测定DNA酶切片段大小。鉴定正确后将获得质粒载体相连接，得到本发明所用的慢病毒质粒载体。

4）病毒包装及HEK293稳定转染细胞系的获得

利用CaCl₂法包装表达AQP-4-EGFP融合蛋白的慢病毒，收集病毒悬液在6 μg/ml Polybrene存在的情况下感染HEK293细胞，1周后，分选阳性稳定转染细胞。继续传代培养后进行二次筛选，获得100%转染过的稳定表达融合蛋白的HEK293细胞系。

5）荧光免疫细胞染色法结合流式细胞术测定血清AQP-4抗体：

获得待检血清后，用含1%BSA（Sigma）DMEM-Hepes洗液稀释待测血清，收集转染及未转染的HEK293细胞，按1：1的比例混合，总数为5×10⁵，用流式staining缓冲液（1×PBS含3%的马血清及0.02%的叠氮钠（NaN_3））清洗1次，离心后弃去上清，用100μl稀释过的血清或人Ig对照重悬细胞，4度孵育30min，然后加入流式staining缓冲液清洗1次，离心收集细胞后加入100ul稀释后的Fast blue标记的山羊抗人IgG，4度避光孵育30 min，流式staining缓冲液清洗1次，然后用300ul流式staining缓冲液重悬细胞，流式细胞仪双通道检测荧光信号，以未转染细胞亚群及人Ig染色组为对照，判断AQP-4抗体阳性样本。此外，EGFP阳性细胞类群中的Fast blue信号强弱可用来标示抗体浓度的相对量。

6）统计分析：使用GraphPad Prism 4对数据进行绘图及统计分析与结果： 

细胞免疫荧光结合流式细胞术测定血清AQP-4抗体：NMO组AQP-4抗体阳性率为89.6%(52/58)；MS组、OND组和健康对照组均为阴性；

细胞免疫荧光（CBA）测定血清AQP4抗体：NMO组AQP4抗体阳性率为86.2% (50/58)；MS组、OND组和健康对照组均为阴性。

细胞免疫荧光结合流式细胞术与传统CBA方法对比：对于AQP-4抗体，CBA结合流式法灵敏度为89.6%，CBA法灵敏度为86.2%； 两种方法检测AQP-4抗体特异性均为100%，表1。

     表1 流式结合细胞免疫荧光法与传统细胞免疫荧光方法阳性率比较

。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  天津医科大学总医院

 

<120>  水通道蛋白-4自身抗体的检测方法及融合表达病毒载体和应用

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1710

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

atgagtgaca gacccacagc aaggcggtgg ggtaagtgtg gacctttgtg taccagagag       60

 

aacatcatgg tggctttcaa aggggtctgg actcaagctt tctggaaagc agtcacagcg      120

 

gaatttctgg ccatgcttat ttttgttctc ctcagcctgg gatccaccat caactggggt      180

 

ggaacagaaa agcctttacc ggtcgacatg gttctcatct ccctttgctt tggactcagc      240

 

attgcaacca tggtgcagtg ctttggccat atcagcggtg gccacatcaa ccctgcagtg      300

 

actgtggcca tggtgtgcac caggaagatc agcatcgcca agtctgtctt ctacatcgca      360

 

gcccagtgcc tgggggccat cattggagca ggaatcctct atctggtcac acctcccagt      420

 

gtggtgggag gcctgggagt caccatggtt catggaaatc ttaccgctgg tcatggtctc      480

 

ctggttgagt tgataatcac atttcaattg gtgtttacta tctttgccag ctgtgattcc      540

 

aaacggactg atgtcactgg ctcaatagct ttagcaattg gattttctgt tgcaattgga      600

 

catttatttg caatcaatta tactggtgcc agcatgaatc ccgcccgatc ctttggacct      660

 

gcagttatca tgggaaattg ggaaaaccat tggatatatt gggttgggcc catcatagga      720

 

gctgtcctcg ctggtggcct ttatgagtat gtcttctgtc cagatgttga attcaaacgt      780

 

cgttttaaag aagccttcag caaagctgcc cagcaaacaa aaggaagcta catggaggtg      840

 

gaggacaaca ggagtcaggt agagacggat gacctgattc taaaacctgg agtggtgcat      900

 

gtgattgacg ttgaccgggg agaggagaag aaggggaaag accaatctgg agaggtattg      960

 

tcttcagtag gtggaggcgg ttcaagatcc atggtgagca agggcgagga gctgttcacc     1020

 

ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg     1080

 

tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc     1140

 

accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag     1200

 

tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc     1260

 

gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc     1320

 

gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac     1380

 

ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac     1440

 

gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac     1500

 

aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc     1560

 

gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa     1620

 

gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc     1680

 

actctcggca tggacgagct gtacaagtaa                                 1710

 

 

<210>  2

<211>  7926

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca       60

 

acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta    120

 

cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga   180

 

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ttcagtaggt ggaggcggtt caagatccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg     3300

 

ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc     3360

 

cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac     3420

 

cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg     3480

 

cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga     3540

 

aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc     3600

 

cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt     3660

 

caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt     3720

 

ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa      3780

 

catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga     3840

 

cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga     3900

 

ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac     3960

 

tctcggcatg gacgagctgt acaagtaact gcagctcgag gcggccgcga attcgtcgac     4020

 

aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct        4080

 

ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt         4140

 

atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg          4200

 

tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact     4260

 

ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct       4320

 

attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg     4380

 

ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc     4440

 

gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc     4500

 

aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt     4560

 

cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tggtaccttt     4620

 

aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg     4680

 

actggaaggg ctaattcact cccaacgaaa ataagatctg ctttttgctt gtactgggtc     4740

 

tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct     4800

 

taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga     4860

 

ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag     4920

 

tagttcatgt catcttatta ttcagtattt ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag       4980

 

tgagaggaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa     5040

 

tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa       5100

 

tgtatcttat catgtctggc tctagctatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat     5160

 

tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc     5220

 

tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctagactt ttgcagagac     5280

 

ggcccaaatt cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca        5340

 

attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg     5400

 

agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg       5460

 

tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc     5520

 

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta       5580

 

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag     5640

 

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg     5700

 

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg       5760

 

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg     5820

 

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga        5880

 

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc        5940

 

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt     6000

 

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact     6060

 

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg     6120

 

cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt       6180

 

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt     6240

 

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct       6300

 

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg       6360

 

gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt        6420

 

aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt       6480

 

gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc       6540

 

gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg     6600

 

cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc     6660

 

gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg        6720

 

gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca       6780

 

ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga       6840

 

tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct     6900

 

ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg     6960

 

cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca        7020

 

accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata     7080

 

cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct     7140

 

tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact     7200

 

cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa         7260

 

acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc     7320

 

atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga          7380

 

tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga        7440

 

aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg        7500

 

cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac       7560

 

atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc     7620

 

cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca     7680

 

gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg     7740

 

agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga     7800

 

tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga     7860

 

ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgcc     7920

 

aagctg                                                    7926。

 

Claims (4)

1.一种水通道蛋白-4自身抗体融合表达病毒载体，其特征在于所述表达病毒载体为pCDH-MCS-AQP4-EF1-copGFP具有SEQ ID NO.2所示序列。

2.一种产生水通道蛋白-4自身抗体融合表达病毒载体的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：

 1）载体构建：构建强组成型启动子CMV介导的融合表达人AQP-4基因及荧光标记基因EGFP的慢病毒载体；

无终止密码子的人AQP-4基因与EGFP基因用5个氨基酸组成的柔性序列（GGGGS）相连接，AQP-4-GGGGS-EGFP（如SEQ ID NO.1所示） ，EGFP在整个融合蛋白的N端，以保证AQP-4蛋白的天然状态的拓扑结构、亚细胞位置和两个蛋白相对独立的功能；

pEGFP-N1载体上扩增EGFP序列，所用引物如下：

EGFPF: 5’- CTA GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ 和EGFPR: 5’- CAG GTCGAC GAATTC GCGGCCGC CTCGAG CTGCAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’，

扩增片段切胶回收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用BamHI和SalI双酶切后与经同样酶双酶切后的pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP载体片段相连接，用EGFP置换掉原载体中的EF1-copGFP序列；

以人视神经cDNA为模板，扩增AQP-4 （M1）序列，所用引物为：

AQP4F: 5’-ACTTCTAGAATGAGTGACAGACCCACAGCAAG-3’和

AQP4R: 5’-CCAAGATCTTGAACCGCCTCCACCTACTGAAGACAATACCTCTCCAGATTG-3’， 扩增片段切胶回收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用XbaI和BglII双酶切后与经XbaI和BamHI双酶切后的步骤1获得质粒载体相连接，得到慢病毒质粒载体，如SEQ ID NO.2所示。

3.一种检测来自个体的生物样品中是否存在水通道蛋白-4自身抗体的方法，其特征在于按如下的步骤进行： 

1）载体构建：构建强组成型启动子CMV介导的融合表达人AQP-4基因及荧光标记基因EGFP的慢病毒载体；

无终止密码子的人AQP-4基因与EGFP基因用5个氨基酸组成的柔性序列（GGGGS）相连接，AQP-4-GGGGS-EGFP（如SEQ ID NO.1所示） ，EGFP在整个融合蛋白的N端，以保证AQP-4蛋白的天然状态的拓扑结构、亚细胞位置和两个蛋白相对独立的功能；

pEGFP-N1载体上扩增EGFP序列，所用引物如下：

EGFPF: 5’- CTA GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ 和EGFPR: 5’- CAG GTCGAC GAATTC GCGGCCGC CTCGAG CTGCAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’，扩增片段切胶回收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用BamHI和SalI双酶切后与经同样酶双酶切后的pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP载体片段相连接，用EGFP置换掉原载体中的EF1-copGFP序列；

以人视神经cDNA为模板，扩增AQP-4 （M1）序列，所用引物为：AQP4F: 5’-ACTTCTAGAATGAGTGACAGACCCACAGCAAG-3’和AQP4R: 5’-CCAAGATCTTGAACCGCCTCCACCTACTGAAGACAATACCTCTCCAGATTG-3’， 扩增片段切胶回收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用XbaI和BglII双酶切后与经XbaI和BamHI双酶切后的步骤1获得质粒载体相连接，得到慢病毒质粒载体（如SEQ ID NO.2所示）；

2）病毒包装及HEK293稳定转染细胞系的获得：

     细胞系及其培养：人胚肾HEK293细胞系由本室常规培养，细胞置于含有10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中，放入37℃，5% CO₂孵箱，按常规方法培养，取处于对数生长期的细胞用于实验；

细胞的复苏和传代：预先向50ml 离心管中加入20mL DMEM培养基，从液氮罐取出冻存的细胞迅速投入37℃水浴中并不断摇动使其在最短时间内解冻，用70%酒精消毒冻存管外表后，将细胞存储液转移至上述离心管中，1000rmp离心10分钟，弃上清，重悬细胞置于含10% 胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO₂、饱和湿度下培养；

待HEK293细胞长至70%密度时，撤掉旧的培养基，用PBS清洗细胞，利用CaCl₂法包装表达AQP-4-EGFP（pCDH-MCS-AQP4-EF1-copGFP）融合蛋白的慢病毒，收集病毒悬液在6 μg/ml Polybrene存在的情况下感染HEK293细胞，1周后，分选阳性稳定转染细胞；继续传代培养后进行二次筛选，获得100%转染过的稳定表达融合蛋白的HEK293细胞系；所述的传代培养指的是细胞生长至对数生长期，用胰酶消化贴壁细胞2-5分钟，后传代至培养皿继续培养；

3）细胞免疫荧光染色法结合流式细胞术测定血清AQP-4抗体：

获得待检血清后，用含1%BSA（Sigma）DMEM-Hepes洗液稀释待测血清，收集转染及未转染的HEK293细胞，按1：1的比例混合，总数为5×10⁵，用流式staining缓冲液（1×PBS含3%的马血清及0.02%的叠氮钠NaN₃) 清洗1次，离心后弃去上清，用100μl稀释过的血清或人Ig对照重悬细胞，4度孵育30min，然后加入流式staining缓冲液清洗1次，离心收集细胞后加入100ul稀释后的Fast blue标记的山羊抗人IgG，4度避光孵育30 min，流式staining缓冲液清洗1次，然后用300ul流式staining缓冲液重悬细胞，流式细胞仪双通道检测荧光信号，以未转染细胞亚群及人Ig染色组为对照，判断AQP-4抗体阳性样本，依据EGFP阳性细胞类群中的Fast blue信号强弱用来标示抗体浓度的相对量；

4）统计分析：使用GraphPad Prism 4软件对数据进行绘图及统计分析得出结果。

4.权利要求1所述水通道蛋白-4自身抗体融合表达病毒载体在制备用于提高视神经脊髓炎和多发性硬化临床诊疗方面的应用。