CN106801055A - 一种检测aqp‑4自身抗体的芯片、制备方法及其应用 - Google Patents

一种检测aqp‑4自身抗体的芯片、制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106801055A
CN106801055A CN201710051071.8A CN201710051071A CN106801055A CN 106801055 A CN106801055 A CN 106801055A CN 201710051071 A CN201710051071 A CN 201710051071A CN 106801055 A CN106801055 A CN 106801055A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aqp
detection
chip
hole
negative control
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710051071.8A
Other languages
English (en)
Inventor
徐辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201710051071.8A priority Critical patent/CN106801055A/zh
Publication of CN106801055A publication Critical patent/CN106801055A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种检测AQP‑4自身抗体的芯片、制备方法及其应用，属于生物医药与生物检测技术领域，通过成功分离稳定表达AQP‑4的原代星状胶质细胞，同时采用基因沉默的方法，创造性的设计RNAi序列采用RNA干扰方法进行AQP‑4基因沉默，降低蛋白表达，获得了稳定不表达AQP‑4的阴性对照细胞，进一步设计成可长期保存的芯片，从而高效、准确、低成本的检测AQP‑4自身抗体，可广泛适于临床检测和科学研究。

Description

一种检测AQP-4自身抗体的芯片、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药与生物检测技术领域，具体涉及一种检测AQP-4自身抗体的芯片、制备方法及其应用。
背景技术
AQP(aquaporins)家族是近几年来逐渐被发现并认识的一类与水通透有关的膜转运蛋白，广泛分布于机体多处涉及水分子快速跨膜转运的部位，在维持体内水、电解质运输平衡中发挥着重要作用。目前，在哺乳动物组织中已发现13种水通道蛋白(AQP0-AQP12)。其中，AQP-4主要分布于肺、脑、眼等组织内，是脑和眼内分布最多、最广泛的水通道蛋白之一，兼有水运输平衡及渗透压感受器的双重功能，在脑和视网膜内水、电解质运输平衡以及眼内压恒定的调节等方面发挥着重要作用。
多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)和视神经脊髓炎(neuromyelitis optica,NMO)是中枢神经系统最为常见的脱髓鞘疾病，视神经脊髓炎病人血清中存在着一种特异性自身抗体NMO-IgG，在NMO、MS、视神经炎(Optic neuritis，ON)、长节段横贯性脊髓炎(Longitudinally extensive tranverse myelitis，LETM)患者的血清中阳性率较高，NMO患者尸检的病理显示病灶中血管周围有大量的免疫球蛋白和补体沉积、星型胶质细胞破坏和再生，其分布与AQP-4表达的分布相一致，目前的诊断标准也将NMO-IgG抗体(即为AQP-4自身抗体)阳性做为诊断视神经脊髓炎和视神经脊髓炎谱系疾病的的重要标志物，且AQP-4自身抗体的检测对于视神经脊髓炎的诊断价值已经被大量临床和基础研究所证实。
目前，检测AQP-4自身抗体的主要技术有间接免疫荧光法(IndirectImmunofluorescence，IIF)、荧光免疫沉淀法(Fluoroimmunoprecipitation Assay，FIPA)、放射免疫沉淀法(Radioimmunoprecipitation Assay,RIPA)、荧光免疫细胞染色法(Cell-Based Assay，CBA)及酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)。其中以CBA和FIPA的敏感性和特异性最为理想，因此被广泛认可。然而，CBA法应用的质粒为EGFP标记的人AQP4cDNA质粒及对照EGFP cDNA质粒，应用聚乙烯亚胺(PEI)或脂质体方法进行瞬时转染，平均检测周期超过两天，耗时长，人力物力损耗大，荧光效率不稳定，人为观察也费时费力，而且过表达的AQP-4一方面空间构型不能保证与天然状态相同，另一方面表达水平不稳定，这两个因素容易造成假阳性检测结果；FIPA法涉及到同位素的应用，环境危害性大大增加。此外，针对AQP-4自身抗体的检测国内目前只少数研究者利用CBA和FIPA做了科研研究，尚未常规应用于临床。
综上可见，研究开发高效、敏感、准确的AQP-4自身抗体的检测方法及产品是科学研究及临床检测领域中亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测AQP-4自身抗体的芯片、制备方法及其应用，用以解决现有AQP-4自身抗体检测耗时耗力、成本高、检测结果不准确的问题。
为实现上述目的，首先，本发明提供一种用于AQP-4基因沉默的RNAi序列，所述RNAi序列包括如下序列中的至少一对：
stealth_121 GAGAGAACATCATGGTGGCTTTCAA
stealth_control_121 GAGACAATACTGTGGTTCGTGACAA
stealth_149 GGTCTGGACTCAAGCTTTCTGGAAA
stealth_control_149 GGTGGCACTAACGTTCTGTGTCAAA
stealth_595 GCTGTGATTCCAAACGGACTGATGT
stealth_control_595 GCTAGTTCCAACAGGCAGTATGTGT
stealth_710 CCGATCCTTTGGACCTGCAGTTATC
stealth_control_710 CCGTCCGTTCAGGTCGACTTATATC。
技术方案二，本发明还提供一种AQP-4基因沉默的星状胶质细胞，所述星状胶质细胞借助上述RNAi序列进行AQP-4基因沉默，AQP-4的蛋白敲除效率不低于65％。
技术方案三，本发明还提供一种检测AQP-4自身抗体的芯片，所述芯片上包括检测孔和阴性对照孔，所述检测孔由原代分离的正常星状胶质细胞依次经培养、4％多聚甲醛固定、洗涤、含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液浸没后并密封形成；所述阴性对照孔由原代分离的正常星状胶质细胞依次经培养、借助技术方案1所述RNAi序列进行AQP-4基因沉默、4％多聚甲醛固定、洗涤、含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液浸没后并密封形成。
优选的，所述阴性对照孔的细胞AQP-4蛋白敲除效率不低于65％。
优选的，所述检测孔和阴性对照孔为分别设置在聚碳酸酯板上、并借助联通沟形成联通结构的凹槽。
更优选的，所述凹槽直径为6mm，深度为0.5mm；联通沟的宽度为1mm，深度为0.5mm。
技术方案四，本发明还提供上述检测AQP-4自身抗体的芯片的制备方法，所述芯片上包括检测孔和阴性对照孔，所述方法包括以下步骤：
1)将原代分离的星状胶质细胞以1×105个/mL的浓度、0.1mL/孔的量分别接种至芯片的检测孔和阴性对照孔内，37℃、5％CO2条件下培养24-48h；
2)借助权利要求1所述的RNAi序列及RNA干扰试剂盒对阴性对照孔的细胞进行干扰处理48h；
3)对检测孔和经干扰处理的阴性对照孔内的细胞依次进行PBS磷酸盐缓冲液洗涤、4％多聚甲醛固定15-30min、PBS磷酸盐缓冲液浸泡15-40min，最后分别加入含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液并密封，避光4℃保存。
优选的，所述步骤1)培养时芯片置于装有蒸馏水的培养皿内，下部以载破片垫起。可以避免芯片干燥。
技术方案五，本发明还提供检测AQP-4自身抗体的芯片在制备检测AQP-4抗体的产品中的应用。
本发明方法具有如下优点：(1)本发明所提供的用于AQP-4基因沉默的RNAi序列可对AQP-4蛋白有效敲除，其设计科学合理，合成方法简单，成本低，应用时敲除效率高；(2)本发明所提供的AQP-4基因沉默的星状胶质细胞AQP-4蛋白敲除效率不低于65％，使得阴性对照组结果更准确可靠，大大避免了假阳性结果的出现；(3)本发明所提供的检测AQP-4自身抗体的芯片结构及制备方法简单，检测过程用时少，操作步骤简单，同步设置检测孔和阴性对照孔，保证了检测结果准确可靠，应用高效、方便、安全，且检测孔和阴性对照孔结构、大小设置科学合理，在检测时所需样本量少，也大大降低了检测成本；进一步优化的技术方案中，提供了星状胶质细胞的原代分离方法，能高效大量获得稳定表达纯天然构象AQP-4蛋白的细胞，同时获得不表达AQP-4的阴性对照细胞，与其他转染AQP-4的细胞相比，原代分离星状胶质细胞上的AQP-4蛋白形成的四聚体晶格结构对NMO-IgG的捕获最为接近患者体内发生的生物过程，结果更可靠准确；(4)本发明提供的RNAi、细胞、芯片等适合大规模生产，方便长期保存，其应用范围广阔，成本低，对临床检测和科学研究意义重大。
附图说明
图1为本发明中检测AQP-4自身抗体的芯片的结构示意图，其中，1代表联通沟；
图2为原代星状胶质细胞(空白对照组)和AQP-4基因沉默的星状胶质细胞(阴性对照组)的Western Blotting检测AQP-4蛋白表达结果图；
图3A、3B分别为原代星状胶质细胞(空白对照组)和敲除AQP-4蛋白的星状胶质细胞(阴性对照组)的荧光免疫染色镜检结果图；
图4A、4B分别为检测NMO患者的芯片检测孔和阴性对照孔的镜检结果图；
图5A、5B分别为检测RRMS患者的芯片检测孔和阴性对照孔的镜检结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围，以下实施例中所涉及的试剂，如无特殊说明，均可通过商业途径获得，所涉及的方法、操作步骤，如无特殊说明，均为常规操作。
本发明的主旨是分离能稳定表达纯天然构象AQP-4蛋白的原代星状胶质细胞，进一步设计特异性、敏感性、稳定性的用于敲除AQP-4蛋白的RNAi序列，采用基因沉默技术，获得不表达AQP-4的阴性对照细胞，进一步制成检测灵敏度高、结果准确可靠、且能稳定保存的检测AQP-4自身抗体的芯片，用于临床检测、非诊断性检测及科学研究，以下以各实验具体说明本发明。
实施例1 原代星状胶质细胞的分离及培养
1.1 实验用试剂的配制
(1)解剖缓冲液：
50毫升10X HBSS(W/O钙，镁，Gibco公司，货号14185-052)
5毫升青霉素/链霉素双抗溶液(GIBCO公司，货号15140-122)
5毫升丙酮酸钠(GIBCO公司，货号11360-070)
10ml HEPES(GIBCO公司，货号15630-080)
5ml(25mm)的葡萄糖(西格玛G-8769 2.5M 45％)
加入435ml ddH2O，并将以上各试剂混合成均匀溶液。
(2)神经胶质培养基组分如下：
430ml高糖DMEM培养基
50ml FBS
5ml Pen/链霉素
5ml丙酮酸钠(GIBCO公司，货号11360-070)
10ml Gluta-Max(Invitrogen 35050-061)。
(3)PBS磷酸盐缓冲液
采用pH为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液，采用常规方法配制或购买现有产品均可。
(4)培养瓶的预处理：
用1mg/ml的胶原溶液涂覆T75培养瓶表面并过夜，除去胶原溶液，用无菌ddH2O冲洗培养瓶，然后竖直放置于生物安全柜内2小时内并使其干燥，得预处理的培养瓶，备用。其中，所用胶原可以是琼脂糖、层粘连蛋白、或多聚赖氨酸，优选层粘连蛋白，以PBS磷酸盐缓冲液溶解制成1mg/ml的胶原溶液。
1.2 原代星形胶质细胞的分离和培养
(1)解剖P1-P3新生大鼠：选取2只出生后1-3天的SD大鼠，无菌条件下，在4℃下去除脑干，将小脑和间脑置于装有解剖缓冲液的10cm培养皿中，剥离脑膜，并将所得皮质组织转移到4℃预冷的50ml离心管中，加入20ml冷解剖缓冲液；
(2)小心地将皮质组织转移至装有解剖缓冲液的10cm培养皿中，用无菌剪刀或剃手术刀片轻轻地切碎皮质组织，再将切碎的皮质组织移回到50ml离心管中，加入5ml 1X胰蛋白酶(质量体积浓度为0.025％)和50uL DNAse，37℃孵育20-30min，期间每5min摇动离心管，得含胶质细胞的消化产物；
(3)以PBS磷酸盐缓冲液冲洗含胶质细胞的消化产物，并离心去上清，冲洗分离两次，得纯化的含胶质细胞的消化产物；
(4)用5ml或2ml移液管轻轻研磨纯化的含胶质细胞的消化产物，
然后用火抛光的巴斯德吸管充分研磨，并将分离的细胞悬浮液转移到新管中收集；
(5)将收集的细胞悬浮液加神经胶质培养基稀释至10ml，并用40μm过滤器过滤，1700rpm下离心5min；
(6)用10ml的神经胶质培养基重悬细胞，并计数，按照2×106个/瓶(2.0×106个/瓶＝1.33×105个/mL＝2.67×104个/cm2)、15ml神经胶质培养基的浓度接种于预处理的培养瓶中，以后每两天更换培养基一次，每次更换15ml新鲜胶质培养基。
1.3 传代和冻存：
当分离的原代星形胶质胶质细胞达到90％汇合时，约6-7天内，可进行传代时，可参照常规传代方法进行传代，优选的，消化细胞后重悬，以3×105个/瓶重新接种于新的75cm2预处理的培养瓶内。
实施例2 阴性对照细胞的制备(AQP-4基因沉默的原代星形胶质细胞)
平行设置空白对照组和阴性对照组，空白对照组为正常培养的原代星状胶质细胞，阴性对照组为要进行AQP-4基因沉默的原代星形胶质细胞，对阴性对照组的处理方法如下：将分离的原代星状胶质细胞培养24h后，加入用于AQP-4基因沉默的RNAi序列进行基因干扰，干扰方法是采用Life公司的RNAIMAX试剂盒并按照其说明书进行。
上述RNAi序列包括如下序列：
stealth_121 GAGAGAACATCATGGTGGCTTTCAA
stealth_control_121 GAGACAATACTGTGGTTCGTGACAA
stealth_149 GGTCTGGACTCAAGCTTTCTGGAAA
stealth_control_149 GGTGGCACTAACGTTCTGTGTCAAA
stealth_595 GCTGTGATTCCAAACGGACTGATGT
stealth_control_595 GCTAGTTCCAACAGGCAGTATGTGT
stealth_710 CCGATCCTTTGGACCTGCAGTTATC
stealth_control_710 CCGTCCGTTCAGGTCGACTTATATC。
上述RNAi设计科学，分子大小及G/C比例合理，能高效的实现AQP-4基因沉默。
干扰48h后，按照常规方法分别收集细胞进行Western Blotting检测AQP-4蛋白表达量，同时结合荧光免疫染色镜检方法双重验证检查干扰效率，其中细胞核以DAPI染料按照常规实验方法进行染色，AQP-4蛋白借助市售的AQP-4抗体及荧光抗体进行常规的荧光染色以供镜检。
结果参见图2、图3A和图3B。图2中下部的条带为管家基因蛋白Actin的表达量，上部条带为AQP-4蛋白表达量，由图2可见，阴性对照组的AQP-4蛋白表达量相对于空白对照组大大降低，表明上述RNAi序列对AQP-4蛋白的基因沉默效率高，进一步的将图像结果分析发现，上述RNAi序列对AQP-4蛋白的基因沉默效率高达80％，这保证了检测中结果的准确可靠，避免了假阳性结果。且上述RNAi序列合成方便，成本低，基因沉默效率高。
图3A和图3B分别为空白对照组和AQP-4基因沉默的阴性对照组的荧光免疫结果图，图中，胞浆部分显示了AQP-4的表达量，统计结果表明阴性对照组的AQP-4蛋白表达量相对于空白对照组大大降低，上述RNAi序列对AQP-4的基因沉默效率高。
可见本发明中提供了一种高效实现AQP-4基因沉默的RNAi序列，同时获得了能作为阴性对照的AQP-4基因沉默的星状胶质细胞，能稳定的不表达AQP-4，其AQP-4蛋白的敲除效率不低于65％，优选敲除80％。
实施例3
本实施例提供一种检测AQP-4自身抗体的芯片，其结构示意图参见图1，所述芯片上包括检测孔和阴性对照孔，所述检测孔和阴性对照孔为分别设置在聚碳酸酯板上、并借助联通沟1形成联通结构的凹槽，联通沟1的设置可使加入测试样本，如血清，或其它试剂时从中央的联通沟1缓缓滴入，保证血清从联通沟1扩散向两侧，避免加入力度过大造成贴壁的原代星状胶质细胞发生漂移、卷起等，造成镜检时视野破坏，结果不准确。其中，检测孔和阴性对照孔的位置不具有特定性，为便于统一描述，本实施例中拟定左侧为检测孔，右侧为阴性对照孔。
考虑原代细胞用量、检测所用细胞密度、检测样本量等，优选所述凹槽，及检测孔和阴性对照孔的大小统一设置为直径6mm、深度0.5mm，中央的联通沟1宽度为1mm、深度为0.5mm。
芯片上所述检测孔由原代分离的正常星状胶质细胞依次经培养、4％多聚甲醛固定、洗涤、含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液浸没后并密封形成；所述阴性对照孔由原代分离的正常星状胶质细胞依次经培养、借助实施例2中的RNAi序列基因敲除AQP-4、4％多聚甲醛固定、洗涤、含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液浸没后并密封形成。
具体的，制作该芯片时，将原代分离的星状胶质细胞以1×105个/mL的浓度、0.1mL/孔的量分别接种至芯片的检测孔和阴性对照孔内，37℃、5％CO2条件下培养24-48h；为避免芯片变干，优化的培养方法是，将芯片置于10cm培养皿内，芯片下方以玻璃载破片垫起，并在培养皿底部加灭菌过的双蒸水，以免芯片变干，放置于细胞培养箱中，37℃、5％CO2培养24小时。
24h后，对阴性对照孔的细胞进行RNA干扰，干扰方法是实施例2部分提供的RNAi序列配合Life公司的RNAIMAX试剂盒并按照其说明书进行，干扰48h，此时，阴性对照组的AQP-4蛋白表达水平可达到下降65％以上，一般为下降80％。为避免进行RNA干扰时对检测孔内的细胞产生影响，芯片上配套设有与联通沟1宽度、深度相当的挡板，挡板上设有凸起，可用手提起从而从联通沟1内取出，挡板可将检测孔和阴性对照看相对分隔，实现单独操作，互不影响。
干扰成功的芯片立即对检测孔和经干扰处理的阴性对照孔内的细胞依次进行PBS磷酸盐缓冲液洗涤、4％多聚甲醛固定15-30min、PBS磷酸盐缓冲液浸泡15-40min，最后分别加入含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液并用封板膜密封，避光4℃冰箱内保存，可保存6个月以上。
实施例4
本发明还提供检测AQP-4自身抗体的芯片在制备检测AQP-4自身抗体的产品中的应用。
具体的，应用时包括以下步骤：
1)将样本血清以PBS磷酸盐缓冲液稀释5-20倍，得待检样本；
2)打开芯片，以PBS磷酸盐缓冲液洗涤、浸泡10-30min并移除，分别向检测孔和阴性对照孔加入10％驴血清，37℃封闭15-40min后移除；
3)分别向检测孔和阴性对照孔加入待检样本至覆盖孔底，室温-37℃孵育3-15h；
4)PBS磷酸盐缓冲液洗涤2-4次，分别加入驴抗人荧光抗体并按其配套的使用方法避光孵育，最后避光冲洗2-5次，以荧光显微镜观察，比较检测孔和阴性对照孔的荧光强度
按照上述方法以12块芯片，分别测试随机选择的6例NMO患者和6例RRMS(复发缓解型多发性硬化)患者，首先，分别将患者血清以PBS磷酸盐缓冲液稀释10倍，将芯片撕去封板膜后，以PBS磷酸盐缓冲液浸泡30min，移除PBS磷酸盐缓冲液并稍微晾干1-3min；
以分别向芯片的检测孔和阴性对照孔加入10％驴血清，37℃封闭30min，然后分别从每块芯片中央的联通沟1处滴入患者血清，使保证血清从联通沟1扩散向两侧的检测孔和阴性对照孔，待患者血清充满两侧的检测孔和阴性对照孔后，置于湿盒内或细胞培养箱内孵育，孵育条件可为37℃孵育4小时或者4℃孵育12小时。上述10％驴血清为以PBS磷酸盐缓冲液稀释的驴血清。
孵育完成后，PBS磷酸盐缓冲液轻轻漂洗3次，每次5min；与加血清同样的方法加入荧光抗体(Abcam，ab102407，1：50)，避光室温孵育2小时后，避光冲洗3次，镜检。
检测NMO患者的芯片检测孔和阴性对照孔的镜检结果图分别见图4A和4B，检测RRMS患者患者的芯片检测孔和阴性对照孔的镜检结果图分别见图5A和5B。图中结果可见，阴性对照孔几乎无荧光，而检测孔荧光突出明显，可确认说明对患者检出的可靠性。
实施例5
本实施例随机选取50例NMO患者和10例正常人，并分别用RSR检测试剂盒、euroimmune CBA检测、euroimmune组织芯片法和本发明提供的芯片进行血清AQP-4自身抗体检测并进行统计，统计结果如下表1。
表1 AQP-4自身抗体检测统计结果
由表1数据可见，本方法误诊率为0，与CBA法相当，高于ELISA法；对于NMO患者，阳性检出率高达96％，与CBA法相当或说略高，高于ELISA法和组织芯片法。检测的敏感度和准确度更是高于采用动物组织芯片的检测技术。作为本发明提供的芯片及方法的突出优势是，在一天时间内，通过较少的操作步骤即可高效、准确检测AQP-4自身抗体，节省了大量的人力、物力，同时检测成本低，适于大范围使用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种用于AQP-4基因沉默的RNAi序列，其特征在于，所述RNAi序列包括如下序列中的至少一对：
stealth_121 GAGAGAACATCATGGTGGCTTTCAA
stealth_control_121 GAGACAATACTGTGGTTCGTGACAA
stealth_149 GGTCTGGACTCAAGCTTTCTGGAAA
stealth_control_149 GGTGGCACTAACGTTCTGTGTCAAA
stealth_595 GCTGTGATTCCAAACGGACTGATGT
stealth_control_595 GCTAGTTCCAACAGGCAGTATGTGT
stealth_710 CCGATCCTTTGGACCTGCAGTTATC
stealth_control_710 CCGTCCGTTCAGGTCGACTTATATC。
2.一种AQP-4基因沉默的星状胶质细胞，其特征在于，所述星状胶质细胞借助权利要求1所述RNAi序列进行AQP-4基因沉默，AQP-4的蛋白敲除效率不低于65％。
3.一种检测AQP-4自身抗体的芯片，其特征在于，所述芯片上包括检测孔和阴性对照孔，所述检测孔由原代分离的正常星状胶质细胞依次经培养、4％多聚甲醛固定、洗涤、含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液浸没后并密封形成；所述阴性对照孔由原代分离的正常星状胶质细胞依次经培养、借助权利要求1所述RNAi序列进行AQP-4基因沉默、4％多聚甲醛固定、洗涤、含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液浸没后并密封形成。
4.根据权利要求3所述的检测AQP-4自身抗体的芯片，其特征在于，所述阴性对照孔的细胞AQP-4蛋白敲除效率不低于65％。
5.根据权利要求3所述的检测AQP-4自身抗体的芯片，其特征在于，所述检测孔和阴性对照孔为分别设置在聚碳酸酯板上、并借助联通沟形成联通结构的凹槽。
6.根据权利要求5所述的检测AQP-4自身抗体的芯片，其特征在于，所述凹槽直径为6mm，深度为0.5mm；联通沟(1)的宽度为1mm，深度为0.5mm。
7.检测AQP-4自身抗体的芯片的制备方法，其特征在于，所述芯片上包括检测孔和阴性对照孔，所述方法包括以下步骤：
1)将原代分离的星状胶质细胞以1×105个/mL的浓度、0.1mL/孔的量分别接种至芯片的检测孔和阴性对照孔内，37℃、5％CO2条件下培养24-48h；
2)借助权利要求1所述的RNAi序列及RNA干扰试剂盒对阴性对照孔的细胞进行干扰处理48h；
3)对检测孔和经干扰处理的阴性对照孔内的细胞依次进行PBS磷酸盐缓冲液洗涤、4％多聚甲醛固定15-30min、PBS磷酸盐缓冲液浸泡15-40min，最后分别加入含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液并密封，避光4℃保存。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)培养时芯片置于装有蒸馏水的培养皿内，下部以载破片垫起。
9.检测AQP-4自身抗体的芯片在制备检测AQP-4自身抗体的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用时包括以下步骤：
1)将样本血清以PBS磷酸盐缓冲液稀释5-20倍，得待检样本；
2)打开芯片，以PBS磷酸盐缓冲液洗涤、浸泡10-30min并移除，分别向检测孔和阴性对照孔加入10％驴血清，37℃封闭15-40min后移除；
3)分别向检测孔和阴性对照孔加入待检样本至覆盖孔底，孵育3-15h；
4)PBS磷酸盐缓冲液洗涤2-4次，分别加入驴抗人荧光抗体并按其配套的使用方法避光孵育，最后避光冲洗2-5次，以荧光显微镜观察，比较检测孔和阴性对照孔的荧光强度。
CN201710051071.8A 2017-01-23 2017-01-23 一种检测aqp‑4自身抗体的芯片、制备方法及其应用 Pending CN106801055A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710051071.8A CN106801055A (zh) 2017-01-23 2017-01-23 一种检测aqp‑4自身抗体的芯片、制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710051071.8A CN106801055A (zh) 2017-01-23 2017-01-23 一种检测aqp‑4自身抗体的芯片、制备方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106801055A true CN106801055A (zh) 2017-06-06

Family

ID=58988106

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710051071.8A Pending CN106801055A (zh) 2017-01-23 2017-01-23 一种检测aqp‑4自身抗体的芯片、制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106801055A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008067382A2 (en) * 2006-11-28 2008-06-05 Alcon Research, Ltd. Rnai-mediated inhibition of aquaporin 4 for treatment of iop-related conditions
US20100092478A1 (en) * 2008-10-10 2010-04-15 Lennon Vanda A Materials and methods for evaluating and treating neuromyelitis optica (nmo)
CN103937836A (zh) * 2014-04-04 2014-07-23 天津医科大学总医院 水通道蛋白-4自身抗体的检测方法及融合表达病毒载体和应用
WO2014130777A1 (en) * 2013-02-21 2014-08-28 University Of Rochester Methods for evaluating brain-wide paravascular pathway for waste clearance function and methods for treating neurodegenerative disorders based thereon

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008067382A2 (en) * 2006-11-28 2008-06-05 Alcon Research, Ltd. Rnai-mediated inhibition of aquaporin 4 for treatment of iop-related conditions
TW200922625A (en) * 2006-11-28 2009-06-01 Alcon Res Ltd RNAi-mediated inhibition of aquaporin 4 for treatment of IOP-related conditions
US20100092478A1 (en) * 2008-10-10 2010-04-15 Lennon Vanda A Materials and methods for evaluating and treating neuromyelitis optica (nmo)
WO2014130777A1 (en) * 2013-02-21 2014-08-28 University Of Rochester Methods for evaluating brain-wide paravascular pathway for waste clearance function and methods for treating neurodegenerative disorders based thereon
CN103937836A (zh) * 2014-04-04 2014-07-23 天津医科大学总医院 水通道蛋白-4自身抗体的检测方法及融合表达病毒载体和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRAZIA PAOLA NICCHIA等: ""Inhibition of aquaporin-4 expression in astrocytes by RNAi determines alteration in cell morphology,growth, and water transport and induces changes in ischemia-related genes"", 《FASEB》 *
GRAZIA PAOLA NICCHIA等: "Inhibition of aquaporin-4 expression in astrocytes by RNAi determines alteration in cell morphology,growth, and water transport and induces changes in ischemia-related genes", 《FASEB》 *
刘林林等: "《恶性肿瘤生物治疗学》", 30 November 2013, 北京：人民军医出版社 *
孙巧松等: ""中国人视神经脊髓炎疾病谱NMO-IgG/anti-AQP4抗体检测方法学的比较"", 《中山大学学报》 *
彭双清等: "《药物安全性评价关键技术》", 30 September 2013, 北京：军事医学科学出版社 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Madara et al. A simple approach to measurement of electrical parameters of cultured epithelial monolayers: use in assessing neutrophil-epithelial interactions
CN107022548B (zh) 一种人体抗aqp4自身抗体检测材料及其制备方法
Turpin et al. Human Afflictions and Chromosomal Aberrations: International Series of Monographs in Pure and Applied Biology: Modern Trends in Physiological Sciences
CN108441464B (zh) 一种胰岛β细胞体外制备方法
Vaughan et al. Studies of proliferative capabilities in isolated epidermal basal and differentiated cells
Todd et al. Towards neuronal organoids: a method for long-term culturing of high-density hippocampal neurons
Hamill et al. Type XVII collagen regulates lamellipod stability, cell motility, and signaling to Rac1 by targeting bullous pemphigoid antigen 1e to α6β4 integrin
CN109708935A (zh) 一种高分辨外周血染色体g带的制作方法
CN103396995B (zh) 一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法
CN108203732A (zh) Trim24在胶质瘤诊断中的应用
CN110108889A (zh) 一种用于诊断IgA肾病的试剂盒及其应用
CN109706181A (zh) 一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法、永生化猪肝星状细胞系和应用
Rajeshwari et al. Acid-fastness of Histoplasma in surgical pathology practice
CN108486039A (zh) 小分子诱导人脂肪干细胞分化为睾丸间质细胞的方法
CN106801055A (zh) 一种检测aqp‑4自身抗体的芯片、制备方法及其应用
Yang et al. An improved method for the isolation and culture of rat epidermal stem cells
Capsoni et al. A new simplified single-filter assay for ‘in vitro’evaluation of chemotaxis of 51Cr-labeled polymorphonuclear leukocytes
Domire et al. Markers for neuronal cilia
CN108410803B (zh) 一种诱导脂肪干细胞成软骨分化的培养方法和培养液
Haykin et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients
CN105988010A (zh) 磷酸化hoxa10作为子宫内膜容受性检测的方法
CN107779503A (zh) 阿尔茨海默相关的差异表达基因及其应用
CN107236709A (zh) 来源于肺转移灶的高转移人卵巢癌细胞系及其建立和应用
CN112813021A (zh) 评估药物心血管安全性的细胞模型及方法
Partiot et al. Trans-synaptic dwelling of SARS-CoV-2 particles perturbs neural synapse organization and function

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170606