CN110108889A - 一种用于诊断IgA肾病的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于诊断IgA肾病的试剂盒，该试剂盒包括能够捕捉离体样品中的IgA1的试剂，该试剂为TINAGL1蛋白、能够稳定表达TINAGL1蛋白的质粒或将所述能够稳定表达TINAGL1蛋白的质粒转染得到的能够表达TINAGL1蛋白的细胞，可以利用免疫荧光方法，通过IgA1‑TINAGL1免疫复合物的形成检测离体样品中的IgA1，来诊断IgAN的发生，实现了对IgA肾病的无创检测。同时，本发明提供了能够与IgAN患者血液等循环组织中的IgA1形成复合物的、可用于诊断IgAN的新的生物标志物TINAGL1，为IgAN的治疗和研究提供了新的方向，具有广泛应用价值。

Description

一种用于诊断IgA肾病的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种免疫组合物及其在制备IgA肾病诊断试剂盒中的用途。

背景技术

IgA肾病(IgA nephrophy，IgAN)是最常见的原发性肾小球疾病，我国是IgA肾病高发国家。80％的IgA肾病患者为青壮年，绝大多数患者病情呈慢性进行性发展，其中大约1/3的患者在发病10～20年后进展到终末期肾衰竭-尿毒症，IgAN是我国终末期肾衰竭的主要病因之一。IgAN是在肾小球系膜区出现IgA或IgA免疫复合物沉积而命名的疾病。目前诊断该病的金标准为肾活检，即通过检测其肾小球系膜区是否有IgA沉积为诊断标准，但肾活检属于有创检查，对患者的损伤较大。此外，目前临床上多通过检测24h尿蛋白定量血肌酐，尿微量白蛋白以及肾小球滤过率来评价病情及预后，然而这些检测指标影响因素较多，灵敏度和特异性较差。所以目前主要研究热点旨在寻找一种标记物，能通过无创检测血/尿及相关基因明确诊断该疾病，减少或避免有创检查带来的痛苦和伤害，是目前肾脏病研究的重点和难点，更是临床的迫切需求。

目前，IgA肾病发病机制尚未明确阐明，且缺乏针对性的有效治疗方案，多种因素在发病的不同环节起作用。其中，致病性IgA1分子的形成可能是IgAN发病的使动环节，而且可能是有别于其他肾小球疾病发病机制的关键环节。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明目的在于提供能够无创的、高特异性和灵敏度地诊断IgA肾病的生物标志物。本发明发现相对于健康人患有IgA肾病患的IgA1更容易与TINAGL1形成免疫复合物，可通过检测该免疫复合物，实现对IgA肾病的无创检测，能够准确诊断IgA肾病的发生。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种用于诊断IgA肾病的试剂盒，该试剂盒包括能够捕捉离体样品中的IgA1的试剂，该试剂为TINAGL1蛋白、能够稳定表达TINAGL1蛋白的质粒或将所述能够稳定表达TINAGL1蛋白的质粒转染得到的能够表达TINAGL1蛋白的细胞。

本发明中，所述离体样品中的IgA1可以理解为IgA1单体本身，或含有IgA1的复合物，如TINAGL1-IgA1免疫复合物。

进一步地，在上述技术方案中，所述试剂包被于固体载体。所述试剂，即TINAGL1蛋白可以包被于固体载体，如聚苯乙烯。能够稳定表达TINAGL1蛋白的质粒，可转染于细胞，获得能够稳定表达TINAGL1蛋白的细胞，作为宿主细胞，将该宿主细胞固定于固体载体上，所表达的TINAGL1蛋白可作为抗原，用于捕捉离体样品中的IgA1。所述固体载体可以为能够适用于免疫荧光检测体系的24孔板、96孔板、玻璃片等。

进一步地，在上述技术方案中，所述的试剂盒还包括标记物标记的抗IgA1特异性抗体。所述标记物可以为本领域常规的能够用于免疫荧光检测的标记物，可以为酶、辅基、荧光物质，生物发光物质等。通过上述标记物，能够定性或定量地测定与TINAGL1形成复合物的离体样品中的IgA1。所述标记物优选，可采用生物素、辣根过氧化物、荧光素等。

进一步地，在上述技术方案中，所述的试剂盒还包括抗TINAGL1特异性抗体。所述抗TINAGL1特异性抗体可固定于固体载体中，可作为捕捉离体样品中的IgA1的试剂，即能够捕捉离体样品中含有IgA1的复合物，如TINAGL1-IgA1免疫复合物，进而用于诊断IgA肾病。

本发明所述的抗体，如标记或未标记的IgA1特异性抗体，以及TINAGL1特异性抗体均可通过商业途径获得，还可以通过常规抗体制备方法来完成，如重组方法制备的抗体、噬菌体展示抗体等。本发明所述的TINAGL1蛋白以及能够稳定表达TINAGL1蛋白的质粒，也可通过商业途径获得，还可以通过常规蛋白制备方法或质粒构建方法来分别获得，这里不再赘述。

进一步地，在上述技术方案中，所述的试剂盒还包括健康人离体样品和患有IgA肾病的人离体样品。健康人离体样品和患有IgA肾病的人离体样品可以作为标准品在实际检测中作为对比，以辅助基于试剂盒的判断结果。所述的离体样品为人血清、人血浆、从所述离体样品中分离得到的IgA1中的一种。

进一步地，在上述技术方案中，所述的试剂盒还包括检测所需的稀释试剂，缓冲试剂、洗涤试剂、显示试剂以及反应终止试剂等，所述各种试剂可采用本领域常规的用于抗原抗体免疫荧光检测的试剂，这里不再赘述。

本发明的另一方面还提供上述的用于诊断IgA肾病的试剂盒的使用方法，该使用方法包括如下步骤：

(1)将TINAGL1蛋白或将所述能够稳定表达TINAGL1蛋白的质粒转染得到的能够表达TINAGL1蛋白的细胞固定于固体载体；

(2)步骤(1)得到的固体载体与离体样品相接触；

(3)加入标记物标记的抗人IgA1特异性抗体；

(4)对于标记物进行检测。

在上述步骤(2)中，经过步骤(1)处理得到的固体载体和离体样品相接触，获得TINAGL1蛋白与离体样品中的IgA1相结合而成的TINAGL1-IgA1复合物。

上述步骤(4)中，进一步地，根据检测结果，对标记物进行定量，获得TINAGL1-IgA1复合物的含量。根据TINAGL1-IgA1复合物的含量判断离体样品是否来自IgA肾病患者。所述检测，可以使用荧光显微镜观测荧光标记信号的位置和分布，并进行定量分析，获得TINAGL1-IgA1复合物的含量。也可以酶标仪进行检测，根据吸光度，进一步定量，获得TINAGL1-IgA1复合物的含量。

本发明通过研究发现IgA肾病病人血中纯化出的IgA1或血浆、血清中的IgA1可以和纯化的肾小球蛋白中的TINAGL1结合形成复合物，而健康人的血中纯化出的IgA1不与或很少量地与TINAGL1结合形成复合物。可证明TINAGL1可能与IgA肾病患者血中IgA1存在相互作用。TINAGL1与IgA1的结合可作为IgA肾病重要诊断依据。基于该研究结果，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒能够检测和定量离体样品中的IgA1与TINAGL1形成的复合物，实现无创检测和诊断IgA肾病。IgA肾病患者血液中的IgA1在体外与TINAGL1结合而形成免疫复合物，同时研究证明，相对于健康人在IgA肾病患者血液中存在更多含量的TINAGL1-IgA1免疫复合物，基于该结果，可采用TINAGL1特异性抗体来检测和定量离体样品如血浆中的TINAGL1-IgA1免疫复合物，进而用于诊断IgA肾病。

本发明的有益效果：

1)本发明提供的试剂盒能够检测离体样品如人血浆中的IgA1与TINAGL1形成复合物，实现对IgA1肾病的无创检测，能够准确诊断IgA肾病的发生。由于基于离体样品的无创检测，避免了患者的由于肾活检所带来的痛苦和伤害。

2)本发明提供能够与IgAN患者血液等循环组织中的IgA1形成复合物的、可用于诊断IgAN的新的生物标志物TINAGL1，为IgA肾病的治疗和研究提供了新的方向，具有广泛应用价值。

附图说明

图1为对于健康人和IgA肾病病人血浆中纯化的IgA1与肾小球蛋白作用后形成的免疫复合物的质谱分析结果获得的火山图；

图2为表示转入和未转入TINAGL1基因的HEK293细胞中TINAGL1基因和蛋白表达情况的电泳图；

图3为表示健康对照组和IgA肾病组血浆与TINAGL1相互作用的免疫荧光实验结果；

图4为表示健康对照组和IgA肾病组血浆中纯化的IgA1与TINAGL1相互作用的免疫荧光实验结果；

图5为利用间接ELISA方法检测健康对照组和IgA肾病组循环中IgA1与与TINAGL1相互作用的结果。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下面实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照本领域常规条件或按照产品说明书上所提供的条件或方法来进行。下面是实例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例使用的试剂盒以及试剂：

Trizol试剂盒：美国Invitrogen公司；

逆转录试剂盒：中国北京公司；

脂质体lipo3000：美国Invitrogen公司。

实施例1

利用质谱分析方法检测健康人和IgA肾病病人血浆中纯化的IgA1与健康人肾小球蛋白是否存在相互作用。图1为表示对于健康人和IgA肾病病人血浆中纯化的IgA1与肾小球蛋白作用后形成的免疫复合物的质谱分析结果获得的火山图(Volcano Plot)，即表示差异表达蛋白统计分析结果。图1中，横坐标表示差异倍数(FC)的变化，即log2转换的差异倍数，当log2FC>1时，表示蛋白表达差异上调两倍以上，当log2FC<-1时，表示蛋白表达差异下调两倍以上，纵坐标表示-log转换过的假设检验得到的显著性p值，即虚线上方表示p<0.05的蛋白，虚线下方的代表p>0.05的蛋白。

对于图1中区域1～6的含义说明为如下：

区域1：p<0.05且FC<1/2，表示具有显著差异的蛋白且表达差异下调两倍以上；区域2：p<0.05且1/2<FC<2，表示相对于log2F＝0时，位于左侧的区域的蛋白表达差异下调两倍以下，位于右侧的区域的蛋白表达差异上调两倍以下，且具有显著性差异；区域3：p<0.05且FC>2，表示在IgA肾病组中表达上调大于2倍的蛋白，且具有显著性差异；区域4：p>0.05且FC<1/2，表示在IgA肾病组中表达下调大于2倍的蛋白，但没有显著性差异；区域5：p>0.05且1/2<FC<2，表示相对于log2F＝0时，位于左侧的区域的蛋白表达差异下调两倍以下，位于右侧的区域的蛋白表达差异上调两倍以下，但不具有显著性差异；区域6：p>0.05且FC>2，表示在IgA肾病组中表达上调大于2倍的蛋白，但不具有显著性差异。以上分析可见，TINAGL1只在IgA肾病患者组中表达，但在健康对照组中没有表达，说明TINAGL1可能在IgA肾病患者中与IgA1存在相互作用。

实施例2

人TINAGL1质粒(货号CH806021(NM022164，1404bp)，购自山东维真生物有限公司)。

将4μg人TINAGL1质粒以及4μg空载体pTENT，采用脂质体lipo3000试剂盒以及说明书所述的转染方法将其转入到293T细胞中，37℃、5％CO₂的培养箱中培养48h后，换用含有5μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养基进行培养，筛选出稳定高表达TINAGL1基因的293T细胞株及pTENT对照细胞株。

高表达TINAGL1基因的293T细胞及pTENT对照细胞，分别用Trizol试剂提取其总RNA，经逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA，以其为模板，进行PCR反应，扩增TINAGL1基因。其中，TINAGL1的上游引物序列为5’-ACGACTGTGCCCTGCCCTAC-3’，下游引物序列为5’-GCCCTGGTTGATGGCTTTG-3’；GAPDH的上游引物序列为5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’，下游引物序列为5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。图2A为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果，可见与空白组(Ctrl，未转染239T细胞)和对照组(Mock，pTENT转染细胞)相比，转染TINAGL1组的TINAGL1mRNA水平表达明显升高，且p<0.01，具有统计学意义。

高表达TINAGL1基因的293T细胞及pTENT对照细胞，分别用蛋白裂解液RIPA(碧云天)裂解，提取总蛋白，然后进行免疫印迹实验(WB)，检测蛋白表达水平，图2B为SDS-PAGE电泳结果，与空白组和对照组相比，转染TINAGL1组的TINAGL1蛋白水平表达明显升高，且p<0.01，具有统计学意义。

通过PCR和WB技术检测其基因和蛋白水平的过表达效果。如图2所示，与空白组(Ctrl)和转入空载(PTENT)对照组相比，过表达TINAGL1组基因和蛋白水平明显升高，说明稳定高表达TINAGL1基因的细胞株构建成功。

实施例3

通过免疫荧光技术检测健康人和IgAN患者血浆中IgA1是否能够与高表达TINAGL1的稳定转染细胞株相互作用。将TINAGL1高表达的293T细胞铺于24孔板大小的细胞爬片上，待细胞长约60-70％时收集细胞爬片，冷PBS清洗两遍，4％多聚甲醛室温固定30分钟，弃掉固定液，PBS洗3次，5分钟每次，向爬片内加入1％Triton-X100，室温孵育10分钟，PBS洗3次，5分钟每次，用5％BSA(PBS配制)室温孵育1h进行封闭处理，每张爬片滴加70μL健康人及IgAN患者的血浆，阴性对照组用等体积的PBS代替，然后将爬片小心放入湿盒内，于37℃孵箱内孵育1h，PBS洗3次，5分钟每次，将FITC-羊抗人IgA1(BA1112，博士德生物)荧光二抗(1：100PBS稀释)滴于细胞爬片上，放入湿盒中，37℃孵箱内避光孵育1h，PBS洗3次，5分钟每次，加入含DAPI的荧光淬灭剂(Abcam)溶液，进行封片，激光共聚焦显微镜进行观察并拍照。如图3所示，与阴性对照组(NC)和健康对照组(HC1，HC2)相比，IgAN患者组(IgAN1，IgAN2，IgAN3)血浆中IgA1的表达显著升高，说明IgAN患者组血浆中IgA1与TINAGL1存在明显的相互作用。其中NC组为只加二抗，不加血浆的阴性对照组；HC代表健康人对照组；IgAN代表IgAN患者组。

实施例4

通过免疫荧光技术检测健康人和IgAN患者血浆中纯化的IgA1是否能够与高表达TINAGL1的稳定转染细胞株相互作用。将TINAGL1高表达的293T细胞铺于24孔板大小的细胞爬片上，待细胞长约60-70％时收集细胞爬片，冷PBS轻洗两遍，4％多聚甲醛室温固定30分钟，弃掉固定液，PBS洗3次，5分钟每次，向爬片内加入1％Triton-X100，室温孵育10分钟，PBS洗3次，5分钟每次，用5％BSA(PBS配制)室温孵育1h进行封闭处理，每张爬片滴加20μL(IgA浓度为：0.9μg/μL)健康人及IgAN患者的血浆中纯化的IgA1，阴性对照组用等体积的PBS代替，然后将爬片小心放入湿盒内，于37℃孵箱内孵育1h，PBS洗3次，5分钟每次，将FITC-羊抗人IgA1(BA1112，博士德生物)荧光二抗(1：100PBS稀释)滴于细胞爬片上，放入湿盒中，37℃孵箱内避光孵育1h，PBS洗3次，5分钟每次，加入含DAPI的荧光淬灭剂(Abcam)溶液，进行封片，激光共聚焦显微镜进行观察并拍照。如图4所示，与阴性对照组(NC)和健康对照组(HC1，HC2)相比，IgAN患者组(IgAN1，IgAN2，IgAN3)血浆中纯化的IgA1的表达显著升高，说明IgAN患者组血浆中纯化的IgA1与TINAGL1存在明显的相互作用。其中NC组为只加二抗，不加纯化的IgA1的阴性对照组；HC代表健康人对照组；IgAN代表IgAN患者组。

实施例5

利用间接ELISA方法，检测TINAGL1与循环中IgA1形成的免疫复合物。具体方法如下：将10μg/mL的TINAGL1蛋白(PRO-1675，ProSpec)稀释于包被液(Na₂CO₃ 0.8g，NaHCO₃1.46g，500mL H₂O(pH9.6)定容)中作为抗原，以100μL/孔抗原包被于96孔包被板中，4℃过夜包被；倒空液体并拍干，加300μL洗涤液(0.05％Tween-20PBS配制)洗两次，300μL封闭液(3％BSA溶于包被液)每孔，37℃孵育1h；倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次，加入健康人(来自体检中心10例)和IgAN患者(来自医院肾内科15例)的血浆样本100μL每孔，37℃孵育1h；倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次；每个孔中加100μL小鼠抗人IgA1-BIOT(B3506B4，SouthernBiotech)，室温孵育1h；倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次；每孔加100μLstrevidens室温孵育1h；倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液浸泡5分钟，倒空液体并拍干残留液体，重复3次；每个孔中加100μL底物，显色30min并立即在405-410nm读数。如图5所示，与健康对照组相比，IgAN组循环中IgA1与TINAGL1存在明显的相互作用，能够形成IgA1-TINAGL1蛋白复合物，p<0.01，具有统计学意义。

Claims (7)

1.一种用于诊断IgA肾病的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括能够捕捉离体样品中的IgA1的试剂，该试剂为TINAGL1蛋白、能够稳定表达TINAGL1蛋白的质粒或将所述能够稳定表达TINAGL1蛋白的质粒转染得到的能够表达TINAGL1蛋白的细胞。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括标记物标记的抗IgA1特异性抗体。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括抗TINAGL1特异性抗体。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括健康人离体样品和患有IgA肾病的人的离体样品。

5.根据权利要求1～4的任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的离体样品为人血清、人血浆、从所述离体样品中分离得到的IgA1中的一种。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的细胞为HEK293细胞。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物为生物素、辣根过氧化物、荧光素中的一种。