CN102353782A

CN102353782A - 抗人肾损伤分子1的体外诊断试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN102353782A
Application number: CN2011101783857A
Authority: CN
Inventors: 刘嵩凯; 赵勇; 陈成
Original assignee: SHANGHAI HUAGU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI HUAGU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2011-06-29
Publication date: 2012-02-15

Abstract

本发明提供了一种抗人肾损伤分子1（Kim-1）体外诊断试剂盒及其检测方法。该试剂盒主要包括：已包被单克隆第一抗体的96孔板；生物素标记的单克隆第二抗体；人肾损伤分子1的标准品；标记有辣根过氧化物酶的亲和素；底物；洗涤液；封闭液；终止液；该单克隆第一抗体，特异识别人肾损伤分子1的蛋白N端，其亲和力常数为5.3*10^-9；该生物素标记的单克隆第二抗体含有生物素标记，特异识别人肾损伤分子1的蛋白C端，其亲和力常数为1*10^-9。本发明提供的体外诊断试剂盒灵敏度高达10pg/ml.，检测范围可达10－12,000pg/ml，对Kim-1高度特异，准确性高，且稳定性好。采用该试剂盒进行体外诊断，简便快捷，无创伤，可以实现早期诊断及预后评估急性肾损伤（AKI）。

Description

抗人肾损伤分子1的体外诊断试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及医学和体外诊断技术，具体涉及抗人肾损伤分子1的体外诊断试剂盒及检测方法，属于免疫生物学领域。

背景技术

肾损伤分子1 （Kim-1 ）1998年由Joseph Bonventre教授实验室首先从缺血性肾损伤的大鼠中克隆，后由多家制药公司通过基因芯片的方法在药物诱导的大鼠急性肾损伤模型中得以验证。由于肾损伤分子1（Kim-1）也在Thl和Th2淋巴细胞表面有低表达，因而又被命名为T淋巴细胞免疫球蛋白粘蛋白分子1（TIM-1）和甲型肝炎病毒受体1（HAVCR-1）。RNA印迹杂交分析结果表明，肾伤分子1在胎肝、胎肾中不表达，在正常成人肝、肾、脾有微弱表达，而在缺血损伤后的肾组织中表达显著增强。免疫组织化学染色及RNA原位杂交均显示，肾损伤分子1（Kim-1） mRNA及蛋白分子表达于外髓部外层及皮质髓射线的近曲小管S3区再生上皮细胞中，亚细胞定位于基底膜细胞顶部。人肾损伤分子1（Kim-1）定位于染色体5q33.2区域，表达2种同源蛋白 Kim-1a和Kim-1b。Kim-1a和Kim-1b除胞内C端略微不同外，其它部分完全一致。肾损伤分子1a其C末端缺少酪氨酸激酶磷酸化区，主要在肝脏表达。肾损伤分子1b在350位含一个酪氨酸激酶磷酸化位点，主要在肾脏表达。

结构上，肾损伤分子（Kim-1）是I型膜性糖蛋白，分子量为104KD，分为胞外区，跨膜区和胞内区。其胞外部分由一个含6个胱氨酸的类免疫球蛋白结构域， 2个N糖基化位点和1个富含苏氨酸／丝氨酸和脯氨酸的结构域组成，具有典型的粘蛋白样O-糖基化蛋白特征。其胞内区很短，但至少含有1个酪氨酸磷酸化位点，可通过磷酸化酪氨酸残基进行信号转导。当发生肾损伤时，肾损伤分子l的细胞外域在金属基质蛋白酶的作用下可在跨膜区附近裂解为可溶性片段（90KD）释放人细胞外，并排人尿中，该片断的生理功能目前仍不清楚。

进一步研究表明，肾损伤分子1（Kim-1）在免疫应答，肾脏肿瘤发生和肾间质纤维化的病理方面都有重要作用。

由于肾损伤分子1（Kim-1）只在损伤的肾小管上皮细胞中表达，很多研究结果都认为其可以成为一个敏感的肾损伤标记物。在小鼠实验中结果发现，无论是缺血性肾损伤还是药物毒性肾损伤，尿中肾损伤分子l（Kim-1）的水平与肾损伤的严重程度高度相关。而当肾损伤程度减轻或经干预治疗后，尿中肾损伤分子l水平则会下降。与此同时，肾损伤分子1（Kim-1）还能对肾损伤的预后提供预测价值。Liangos等人在对201例住院患者的研究结果中发现，肾损伤分子l水平与患者预后的严重程度密切相关；在一项单中心的研究结果中，急性肾小管坏死患者尿中肾损伤分子l水平高于正常水平12倍。而在慢性肾损伤小鼠模型中，蛋白尿严重的小鼠其肾损伤分子l水平较高，提示发展至终末期肾病的风险增大。而目前尚缺乏有关蛋白尿与尿中肾损伤分子l水平相关性的大型队列研究。肾损伤分子1（Kim-1）还能对移植肾功能的预后进行评估。有研究结果发现，在近端肾小管上皮细胞中肾损伤分子l表达越多，其移植肾功能恢复越好；而对145例肾移植患者移植肾功能与尿中肾损伤分子l水平的随访研究结果中发现，肾损伤分子1（Kim-1）水平越高，其移植肾功能往往不佳甚至完全丧失功能。

综上所述，作为一个无创且敏感的肾损伤标记物，肾损伤分子1（Kim-1）不仅可用于急性和慢性肾损伤的早期诊断及治疗监测，还可用于药物研发过程中化合物肾脏毒性监测或临床用药的肾毒性监测。而最近Han等提出来将肾损伤分子1（Kim-1）联合其他肾损伤标记物(如中性粒细胞明胶酶脂质运载蛋白 NGAL、白细胞介素18、谷胱甘肽S-转移酶等分子)共同对肾损伤进行更为精确的预测。同时对其在肾小管上皮细胞修复过程中的作用研究，特别是通过抗体或者相关因子来改变肾损伤分子l的表达和释放过程也将为肾损伤的治疗策略提供药物靶点。

尽管多项研究表明肾损伤分子1（Kim-1）极有希望成为一项无创，早期诊断及预后评估急性肾损伤（AKI）的新型实验室指标，但由于其在正常人尿液中表达量极低 < 1ng/ml,一般的实验室和临床检测试剂很难满足该项检查的要求。

因此，肾损伤分子1（Kim-1）的检测要成为一项常规临床检查技术，迫切需要解决以下三个问题：1）开发特异性好，敏感性高，简便易行的临床检测技术，2）建立标准化检测试剂及检测流程以便各个研究和临床实验室之间进行交流 3）建立健康人尿液肾损伤分子1（Kim-1）正常值区间。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗人肾损伤分子1（Kim－1）的体外诊断试剂盒（酶联免疫法）及检测方法，采用该方法进行体外诊断，特异性好，敏感性高，简便易行，可以实现无创伤，早期诊断及预后评估急性肾损伤（AKI）的新型实验室指标。

为达到上述目的，本发明提供了一种抗人肾损伤分子1的体外诊断试剂盒，该试剂盒包含：

已包被单克隆第一抗体的96孔板；

生物素标记的单克隆第二抗体；

人肾损伤分子1的标准品；

标记有辣根过氧化物酶的亲和素；

底物；

洗涤液；

封闭液；

终止液；

所述的单克隆第一抗体，特异识别人肾损伤分子1的蛋白N端，其亲和力常数为5.3*10^-9；

所述的生物素标记的单克隆第二抗体含有生物素标记，特异识别人肾损伤分子1的蛋白C端，其亲和力常数为1*10^-9。

上述的抗人肾损伤分子1的体外诊断试剂盒，其中，所述的已包被单克隆第一抗体的96孔板是通过人肾损伤分子1的单克隆第一抗体包被96孔酶标板制成。

本发明还提供了一种采用所述的抗人肾损伤分子1的体外诊断试剂盒体外检测抗人肾损伤分子1的检测方法，该方法包含以下步骤：

步骤1，建立检测标准曲线：以人肾损伤分子1的标准品的浓度为纵坐标，光密度值为横坐标，在对数坐标纸上绘出标准曲线；

步骤2，向已包被单克隆第一抗体的96孔板中加入洗涤液洗涤，然后，加入封闭液室温孵育1小时；

步骤3，加入洗涤液洗涤，然后加入待测样品，室温孵育2小时；

步骤4，加入洗涤液洗涤，然后加入所述的生物素标记的单克隆第二抗体，室温孵育2小时；

步骤5，加入洗涤液洗涤，然后加入标记有辣根过氧化物酶的亲和素，室温避光孵育20分钟；

步骤6，加入洗涤液洗涤，然后加入底物溶液，室温避光孵育20分钟，显色；

步骤7，加入反应终止液；

步骤8，通过酶标仪读取光密度值，根据步骤1所绘的标准曲线算出人肾损伤分子1含量。

上述的诊断抗人肾损伤分子1的检测方法，其特征在于：步骤3所述的待测样品包含培养细胞上清、细胞和组织裂解液、人血清和人尿液。

本发明提供的抗人肾损伤分子1（Kim-1）的体外诊断试剂盒包含特异识别重组和天然人肾脏损伤分子1的一对高亲和力抗体，与目前市场上少数几个供研究使用的人肾脏损伤分子1（Kim-1）试剂盒相比，本发明试剂盒的检测灵敏度和检测范围大大增加。本发明提供的体外诊断试剂盒灵敏度高达10pg/ml.，检测范围可达10－12,000 pg/ml，对Kim-1高度特异，准确性高，且稳定性好：在室温可稳定存放一天，在4℃可稳定存放六个月；在 -20℃和-80℃可反复冻融3次；-20℃反复冻融后检测效果为81.6 %到 98.0 %。

采用本发明试剂盒检测20个健康志愿者尿液中的肾损伤分子1（Kim-1）含量为60－850 pg/ml，作为正常值可信区间。采用本发明提供的抗人肾损伤分子1（Kim-1）的体外诊断试剂盒进行体外诊断，特异性好，敏感性高，简便快捷，无创伤，可以实现早期诊断及预后评估急性肾损伤（AKI）。

附图说明

图1是应用本发明的抗人肾损伤分子1（Kim-1）的体外诊断试剂盒检测得到的20位健康志愿者尿液Kim-1含量示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施方式作进一步的说明。

本发明提供的一种抗人肾损伤分子1（Kim-1）的体外诊断试剂盒，该试剂盒包含：

已包被单克隆第一抗体的96孔板；

生物素标记的单克隆第二抗体；

人肾损伤分子1（Kim-1）的重组蛋白标准品；

标记有辣根过氧化物酶的亲和素；

底物；

洗涤液；

封闭液；及

终止液。

抗人肾损伤分子1（Kim-1）的体外诊断试剂盒的制备方法如下：

1.已包被单克隆第一抗体的96孔板的制备

1）高亲和力的抗人肾损伤分子1（Kim-1）单克隆抗体的筛选和纯化：Kim-1重组蛋白免疫BALB/c小鼠，挑选出对抗原反应最佳的小鼠进行小鼠脾细胞和Sp2/0的杂交瘤细胞融合，经ELISA（酶联免疫吸附反应法）和Western印记法（蛋白免疫印迹杂交法）双重筛选后获得单克隆抗体HG抗体#1(即第一抗体)，经Biacore（生物大分子相互作用仪）测定抗体亲和力，亲和力常数为：5.3*10^-9，为高亲和力抗体。

2）包被单克隆第一抗体的96孔板

将溶于磷酸缓冲液PBS的抗人肾损伤分子1（Kim-1）的鼠单克隆第一抗体100ml（400 ng /μl）加入到96孔酶标板中，4℃孵育过夜。

2.制备生物素标记抗体G#2（第二抗体）

采用与制备单克隆第一抗体相同的方法进行筛选和纯化，获得与第一抗体配对的HG抗体G#2（即第二抗体），经Biacore测定抗体亲和力，第二抗体的亲和力常数为 1*10^-9，为高亲和力抗体。

应用公认的生物素酰基化反应法标记第二抗体：将生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯和纯化的第二抗体按摩尔比4：1混合，室温孵育4小时；最后，透析出去未结合生物素。

采用网格法通过在96孔板中添加不同浓度的第一抗体、第二抗体来确定最佳浓度比例及用量。

3.人肾损伤分子1（Kim-1）的重组蛋白标准品

购自北京义翘神州生物技术有限公司，为哺乳动物细胞表达产品。

4.标记有辣根过氧化物酶的亲和素

购自 Sigma 公司。

5.配置底物溶液

H₂O₂ 和四甲基联苯胺（TMB）体积比为1：1的混合物。TMB在过氧化物酶的催化下可转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Kim-1的含量呈正相关。

6.配置洗涤液

洗涤液为Tris (三羟甲基胺基甲烷)缓冲盐（PH8.0）+0.05%（重量百分比）吐温（Tween），用以洗涤酶联反应孔。

7.配置封闭液

封闭液为Tris缓冲盐_牛血白蛋白+2%（重量百分比）牛血白蛋白。

8.配置终止液

配置2N H₂SO₄作为终止液，用以终止颜色反应。

本发明提供的检测人肾损伤分子1（Kim-1）的体外诊断试剂盒体外诊断抗人肾损伤分子1的检测方法包括：

步骤1，建立检测标准曲线：以人肾损伤分子1的标准品的浓度为纵坐标（对数坐标），光密度值为横坐标（对数坐标），在对数坐标纸上，使用专业制作曲线软件绘出标准曲线。可优先选择使用curve expert 1.3或 SoftMax Pro制作曲线；

步骤2，向已包被单克隆第一抗体的96孔板中加入洗涤液洗涤3次，然后，加入封闭液室温孵育1小时；

步骤3，加入待测样品：洗涤液洗涤3次，加入100μl待检样品，室温孵育2小时；所述的待测样品包含培养细胞上清、细胞和组织裂解液、人血清和人尿液；

步骤4，加入生物素标记的单克隆第二抗体：洗涤液洗涤3次，加入100μl 生物素标记的单克隆第二抗体（400 ng /μl），室温孵育2小时；

步骤5，加入标记有辣根过氧化物酶的亲和素：洗涤液洗涤3次，加入100μl亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温避光孵育20分钟；

步骤6，加入底物溶液，显色：洗涤液洗涤3次，加入100μl底物溶液，室温避光孵育20分钟；

步骤7，加入反应终止液：加入50μl终止液；

步骤8，在酶标仪上读取光密度（450nm），根据样品的OD光密度值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与光密度值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

检测人肾损伤分子1（Kim-1）的体外诊断试剂盒的质量检测

验证通过标准：

1) 批内和批间准确性指标：试验结果显示，所有检测样品的平均准确度位于75-125%区间

2) 批内和批间精密度指标：试验结果显示，所有检测样品的变异系数￡25%

3) 特异性：待检样品中加入Tim-4蛋白后进行检测，所有检测样品的平均准确度位于75-125%区间，所有检测样品的变异系数￡25%

4) 稳定性：将待检样品放置于不同温度下不同时间后，所有检测样品的平均准确度位于75-125%区间，所有检测样品的变异系数￡25%

5) 检测范围：该方法的最低检测值和最高检测值，且满足检测样品的平均准确度位于75-125%区间，所有检测样品的变异系数￡25%

6) 灵敏度：满足上述要求的最低检测值

根据预先设定好的验证标准验证试剂盒的灵敏度，准确性，精密度，特异性，检测范围和稳定性，所得结果为：

1) 灵敏度为10pg/ml；

2) 批内准确性为101.7 %到107.6 %，批内精确度为1.9 %到4.8 %，批间准确性为103.8%，批间精密度为3.5 %；

3) 检测范围为10–12,000 pg/ml （最低检出限和最高检出限之间的范围）；

4) 特异性：在待检样品中加入结构类似的人Tim-4蛋白，检测发现试剂盒对Kim-1高度特异，和Tim-4没有交叉反应；

5) 稳定性：在室温可稳定存放一天，在4℃可稳定存放半个月；在 -20℃可稳定存放6个月，在 -20℃和-80℃可反复冻融3次；-20℃反复冻融后检测效果为81.6 %到 98.0 %。

其中测定方法为：

批间精密度： 3个已知浓度的样品随机抽取40盒不同批次试剂盒进行检测，应用测定结果的均值和标准差计算出不同批次之间的变异系数CV即为批间精密度。

批内精密度： 3个已知浓度的样品用同一批试剂盒检测20次，应用测定结果的均值和方差计算出不同检测之间的变异系数CV即为批内精密度。

批间准确性：3个已知浓度的样品随机抽取40盒不同批次试剂盒进行检测，测定结果的均值和真实结果之间的比值乘以100%即为批间准确性。

批内准确性： 3个已知浓度的样品用同一批试剂盒检测20次测定，结果的均值和真实结果之间的比值乘以100%即为批内准确性。

从健康人尿液中检测人肾损伤分子1（Kim-1）建立人肾损伤分子1的正常值区间

1. 样品准备：收集20位健康志愿者（10位男性，10位女性）清晨第一次尿液（中段尿）或24小时尿液，2000 x g离心15分钟后收集上清，并将标本保存于-20℃。

2. 酶联免疫检测：

1) 加样：在已包被单克隆第一抗体的96孔板上，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，加样尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板（即，已包被单克隆第一抗体的96孔板）加上盖或覆膜，室温反应120分钟，以促进抗原和单克隆第一抗体结合。

2) 弃去液体，洗涤液洗涤三次。每孔加第二抗体100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,室温反应60分钟，以促进抗原和第二抗体结合。

3) 温育60分钟后，弃孔内液体，甩干并洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，以去除未结合的第二抗体。

4) 每孔加标记有辣根过氧化物酶的亲和素100μl，酶标板加上覆膜室温反应60分钟，以促进抗体与过氧化物酶的结合。

5) 温育60分钟后，弃去孔内液体并洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，以去除未结合的辣根过氧化物酶。

6) 依序每孔加底物溶液100μl，酶标板加上覆膜室温避光显色，20分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色（辣根过氧化物酶催化TMD底物变成蓝色），后3-4孔梯度不明显，即可终止。

7) 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8) 在加终止液后立即用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。

3.根据标准曲线计算出这20位健康志愿者的尿液Kim-1含量，建立健康人尿液肾损伤分子1的正常值区间：如图1所示，是应用本发明的体外诊断试剂盒检测得到的20位健康志愿者尿液Kim-1含量示意图，由图可知，最低为60 pg/ml, 最高为850 pg/ml，该范围作为健康人肾损伤分子1的正常值区间。依该健康人尿液肾损伤分子1的正常值区间可对本发明的体外检测试剂盒检测出的待测样品进行判断。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims

1.一种抗人肾损伤分子1的体外诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：

已包被单克隆第一抗体的96孔板；

生物素标记的单克隆第二抗体；

人肾损伤分子1的标准品；

标记有辣根过氧化物酶的亲和素；

底物；

洗涤液；

封闭液；

终止液；

2.如权利要求1所述的抗人肾损伤分子1的体外诊断试剂盒，其特征在于，所述的已包被单克隆第一抗体的96孔板是通过人肾损伤分子1的单克隆第一抗体包被96孔酶标板制成。

3.一种采用权利要求1所述的试剂盒体外检测抗人肾损伤分子1的检测方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：

步骤7，加入反应终止液；

4.如权利要求3所述的诊断抗人肾损伤分子1的检测方法，其特征在于，步骤3所述的待测样品包含培养细胞上清、细胞和组织裂解液、人血清和人尿液。