CN101661042A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心elisa试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心ELISA试剂盒，其中包括：包被PRRSV N蛋白单克隆抗体的酶标板、酶标记PRRSV N蛋白单克隆抗体、裂解液等。捕获抗体和检测抗体分别针对N蛋白不同的抗原决定簇。本发明为临床PRRSV抗原的快速检测提供了可靠的手段。运用本发明检测试剂盒可检测出血清中仅含有0.2 TCID₅₀的高致病性PRRSV JXwn06毒株(非高致病性的毒株也可以检出)。通过检测临床采集的80份血清样本，与RT－PCR结果相比，该方法的特异性为88％，敏感性为90％，两者的符合率为88.8％。本发明试剂盒便于操作、使用成本低、重复性好，适合广泛推广应用。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心ELISA试剂盒

技术领域

本发明涉及一种ELISA检测试剂盒，具体地说是一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)主要引起怀孕母猪流产、早产和死胎等繁殖障碍，仔猪和育肥猪出现呼吸道症状，是一种高度接触性传染病(Albina，1997；Christianson etal.，1992；Mengeling et al.，1998；Rossow，1998)。本病于1987年首次在美国爆发(Keffaber K K.，1989)，短短的十几年间，迅速遍及全球各个养猪业发达的国家和地区，给世界的养猪业带来了巨大的经济损失。我国于1996年首次报道有该病的发生，并且证明是美洲型PRRSV毒株感染所致(郭宝清，1996；杨汉春，1997)。

PRRSV属套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒成员(Cavanagh，1997；Snijder and Meulenberg，1998)，基因组为单股正链RNA，全长15kb，包括8个开放阅读框(ORF)，其中ORF1a和ORF1b位于基因组的5端，占据整个基因组的80％，编码RNA聚合酶和相关的蛋白酶，为非结构蛋白(NSP1，NSP2)。ORF2～4分别编码GP2、GP3、GP4三种糖基化蛋白，ORF5～7分别编码囊膜蛋白GP5、基质蛋白M和核衣壳蛋白N(Bautista et al.，1996；Lee andYoo，2006；Meng et al.，1994；Meulenberg et al.，1995a；Wu et al.，2005)，这些结构蛋白的功能逐渐得到阐明。其中PRRSV N蛋白大小约15kD，约占病毒蛋白总量的20％～40％，是病毒抗原性最强的蛋白(Loumba et al.，1996)，其诱导产生抗体的时间早，抗体持续的时间长(Denac et al.，1997)。N蛋白相对保守，是诊断PRRS的候选蛋白(Yang et al.，1999)。

猪繁殖与呼吸综合征是严重危害我国养猪业的主要疫病之一，2006年夏天出现的“高致病性蓝耳病”给我国养猪业造成了史无前例的巨大打击。此次发病和以往的经典毒株有很大的不同，不同日龄、不同品种的猪均可感染发病，而且发病率高、病死率高，造成了大批母猪、育肥猪死亡和淘汰，严重危害了我国养猪业的持续健康发展(杨汉春，2008)。另外，PRRSV感染可以造成猪群的免疫抑制，造成疫苗免疫效果下降，从而导致继发感染。应用各种免疫血清学技术对疫病做出准确、迅速的诊断是预防和控制该病的重要前提(严玉霖，2008)。

目前，国内外已建立了许多PRRSV相关的诊断技术，主要分为抗体检测和抗原检测两大类。抗体检测方法包括间接免疫荧光法、ELISA法、免疫过氧化物酶单层细胞试验、中和试验等。目前，临床使用最普遍的是IDEXX公司生产的间接ELISA试剂盒。该方法重复性和稳定性较好，操作简便，适合临床大批量样本的检测。但目前所有针对抗体的检测方法都无法区分免疫猪群和感染猪群，从而影响疫病的及时、有效防控。而抗原检测方法则结果较直接，能明确病毒感染。针对PRRSV抗原检测的方法主要有RT-PCR法、病毒分离、免疫组化等，各方法均存在一些不足之处。例如，病毒分离方法耗时、费力；免疫组化方法操作繁琐，影响因素较多，并且结果判断具有一定的主观性。RT-PCR方法对检测人员实验操作技能要求较严格，且成本较高。目前，国内申报的有关PRRSV抗原诊断方法的专利有3项，分别是农业部兽医诊断中心开发的PRRSV变异株RT-PCR检测试剂盒、华南农业大学建立的PRRSV变异株实时荧光鉴别及定量测定方法以及中国农业大学建立的利用多对引物和荧光显色剂进行PRRSV抗原检测的PCR方法。这3项技术专利均涉及分子生物学技术，检测结果的影响因素较多，更由于其成本因素，不利于基层的推广和使用。

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其操作简单，稳定性和重复性好，具有良好的可靠性。

本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心ELISA试剂盒，其包括：

(1)包被PRRSV N蛋白单克隆抗体(捕获抗体)的酶标板；

(2)酶标记PRRSV N蛋白单克隆抗体(检测抗体)；

(3)裂解液；

其中，包被在酶标板的PRRSV N蛋白单克隆抗体与酶标记PRRSV N蛋白单克隆抗体分别针对PRRSV N蛋白不同的抗原决定簇。

本发明以PRRSV BJ-4超离浓缩细胞毒作为抗原制备病毒N蛋白单克隆抗体，得到多个不同抗原决定簇的单克隆抗体，进一步筛选发现其中3株针对不同表位的杂交瘤细胞株上清效价较高，且其分泌获得的单克隆抗体的亲和力和特异性均显著高于其它株。

在本发明实施例中，包被在酶标板的PRRSV N蛋白单克隆抗体与酶标记PRRSV N蛋白单克隆抗体分别为杂交瘤细胞株N35或N36分泌获得。优选地，所述包被在酶标板的PRRSV N蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株N36分泌获得，酶标记PRRSV N蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株N35分泌获得。

PRRSV病毒粒子外包裹着一层囊膜结构，而N蛋白是核衣壳蛋白，位于病毒粒子的中心区域。因此，血清样本中病毒粒子的裂解及导致的N蛋白的暴露程度直接关系着检测方法建立的成功与否。本发明中的裂解液的作用是破坏病毒粒子的囊膜结构，从而使N蛋白暴露出来。

本发明裂解液组成成分包括中性非离子型表面活性剂(例如NP-40、TritonX-100等)、Tris-base和中性盐(例如KCl、NaCl等)。其中，中性非离子型表面活性剂的主要作用是破坏病毒的囊膜，它的效果决定了N蛋白是否能够充分暴露。Tris-base的浓度也是影响裂解液效力的重要因素。在本发明中，优选裂解液含0.5～1％中性非离子表面活性剂、2.2～2.8M Tris-base、800mM中性盐，pH 7.0～7.5。更优选的裂解液配置为：1％Triton X-100、2.8MTris-base、800mM NaCl，pH7.5。

本发明所述酶标记PRRSV N蛋白单克隆抗体的标记酶可以是辣根过氧化物酶，具体标记方法包括如下步骤：取5mg的HRP溶于0.5mL三蒸水，室温搅拌2min，再加入新鲜配制的0.06mol/L NaIO₄ 0.5mL水溶液，混匀后置冰箱里避光搅拌30min，待溶液变为绿色时取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL，室温放置半小时，使氧化反应终止，再向液体中加入含有7.5mg的纯化抗体1mL，混匀后装入预先活化的透析袋中，以0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析过夜，使辣根过氧化物酶与抗体充分结合，取出透析袋中的液体，加入5mg/mL的硼氢化钠500μL，置冰箱中还原6-8小时，加入等体积的饱和硫酸铵，冰箱中放置过夜，3000rpm，离心10min，将所得的沉淀溶于少许0.01mol/L的PBS中，装入透析袋中以0.01mol/L的PBS透析过夜充分除去硫酸铵，透析24-36h，离心除去沉淀，即得纯化酶标记抗体。单克隆抗体可按照如下方法包被到酶标板：将3μg/mL的单克隆抗体按100μL/孔加入到酶标板中，4℃放置18-24h，用PBST洗涤后，用5％小牛血清封闭，150μL/孔，于4℃放置8h，再用PBST洗涤。

此外，本发明试剂盒还可进一步包括以下试剂中的一种或多种：洗涤液、二抗稀释液、底物显色液、终止液。

运用本发明检测试剂盒可检测出血清中仅含有0.2TCID₅₀的高致病性PRRSV JXwn06毒株。通过检测临床采集的80份血清样本，与RT-PCR结果相比，该方法的特异性为88％，敏感性为90％，两者的符合率为88.8％。本发明为临床PRRSV抗原的快速检测提供了可靠的手段。本发明试剂盒便于操作、使用成本低、重复性好，适合大规模推广应用。

附图说明

图1显示的是本发明ELISA方法建立的技术路线。

图2显示的是三株单克隆抗体与N蛋白反应性的Western blotting鉴定，M..蛋白marker，1.N35，2.N36，3.N51。

图3显示的是单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定(BJ-4)，A.N35；B.N36；C.N51；D.SP2/0细胞上清液。

图4显示的是单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定(HB-1/3.9)，E.N35；F.N36；G.N51；H.SP2/0细胞上清液。

图5显示的是单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定(JXwn06)，I.N35；J.N36；K.N751；L.SP2/0细胞上清液。

图6显示的是三株腹水纯化前后的SDS-PAGE，M.Marker；1.N35腹水；2.纯化后的N35 IgG；3.N36腹水；4.纯化后的N36 IgG；5.N51腹水；6.纯化后的N51 IgG。

图7RT-PCR方法确定血清样本中病毒的最低检出量，M.Marker；1.1∶2倍稀释；2.1∶4倍稀释；3.1∶8倍稀释；4.1∶16倍稀释；5.1∶32倍稀释；6.1∶64倍稀释；7.1∶128倍稀释；8.1∶256倍稀释；9.1∶512倍稀释；10.1∶1024倍稀释；11.1∶2048倍稀释。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1双抗夹心ELISA方法的建立

一、单克隆抗体的制备及初步筛选

实验方法

1单克隆抗体的制备

MARC-145细胞按常规方法培养细胞毒，待产生90％病变(CPE)后反复冻融3次，收集病毒液，冻融三次，12000rpm/min离心30min，弃沉淀留上清。经过超速离心，收获沉淀为粗提病毒，将沉淀用PBS溶解，用分光光度计测定病毒的蛋白含量，根据公式蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD_280nm-0.74×OD_260nm，计算超速离心的粗提病毒的蛋白浓度。用粗提病毒作为抗原免疫BALB/c小鼠。

经过超速离心的PRRSV BJ-4细胞毒作为免疫抗原免疫6周龄BALB/c小鼠(如表1)，共免疫5次，每次间隔2～3周，第一次免疫用超离病毒加等量弗氏完全佐剂，免疫剂量为100μg/只，免疫途径为颈背部多点皮下注射，以后用弗氏不完全佐剂，四免后12～15天，尾部小量采血，间接ELISA测定血清效价，若血清效价合格，融合前三天做加强免疫，用N蛋白腹腔注射，剂量为100μg/只。最后一次免疫后一周将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤融合，再经过2次亚克隆，筛选到能稳定分泌抗N蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过体外培养法，收集细胞培养上清，经离心后去除细胞碎片，上清液-20℃保存备用。参照Barton F等(1983)的方法制备单克隆抗体的腹水；挑选经产雌性或者个体大的雄性BALB/c小鼠，每只腹腔注射灭菌石蜡油0.5mL，分多点注射；10～14天后，将状态良好的杂交瘤细胞从细胞培养瓶内轻轻吹下，1000r/min离心10min，弃上清，用无菌PBS悬浮，计数备用；每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁵～1×10⁶个，注射后轻柔小鼠腹部，使细胞均匀分散于小鼠的腹腔中；7～10天后，可见小鼠腹部明显增大，采集腹水；将腹水3000r/min离心10min，收集上清，-20℃保存备用。

2单克隆抗体的鉴定

2.1单抗识别表位的初步分析

采用测相加指数法，N蛋白以3μg/mL浓度包被酶标板，洗涤后封闭，洗涤后分别加入饱和稀释度的单抗，37℃作用30min，洗涤后每孔分别两两组合加入另一株单抗，37℃作用30min，洗涤后加入工作浓度的HRP标记山羊抗小鼠二抗，37℃作用30min，洗涤后显色测定OD_450nm值。按如下公式计算两种单克隆抗体叠加后的AI值：

AI＝(A1.2-A1)/A2×100％(A1.2：表示2株单抗叠加后的OD值；A1：表示第1株单抗自身叠加的OD值；A2：表示第2株单抗自身叠加的OD值)。

当两两抗体叠加之后的AI值大于30％认为两株单抗识别不同位点。

2.2杂交瘤细胞上清及腹水中单克隆抗体效价的测定

杂交瘤细胞培养上清从1∶500开始作2倍比稀释，腹水从1∶5000开始作2倍比稀释，按间接ELISA方法测定其效价。

2.3免疫印迹(Western blotting)试验

SDS-PAGE PRRSV的N蛋白按照常规方法进行SDS-PAGE；

转印装置的准备  裁剪大小与凝胶面积一致的Whatman滤纸6张和PVDF膜一张(5cm×8.5cm)，滤纸于转印缓冲液中浸透，PVDF膜在使用之前需要浸泡在甲醇里面活化10分钟。在浸泡之前确定膜的正反面，光滑的一面为正面并在膜的右上角标记一个“正”字。转印电极装置从负极(黑色面)到正极依次放置海绵垫、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸和海绵垫，放置时用试管轻轻滚动排除所有气泡并且注意应使PVDF膜的光滑面贴近凝胶；

电转印  固定好转印电极后，将电极插入电转槽，注意正负极不要弄反，加满转印缓冲液，恒压65V转印3h或40V转印过夜；

蛋白质染色  转印结束后取出PVDF膜晾干后，浸入1×丽春红染色液对膜上的蛋白条带进行染色5～10min，取出立即放置蒸馏水中漂洗至条带清晰，检测转印效果，并剪下蛋白质marker，将带有目的条带的PVDF膜准备用于做免疫检测，切割蛋白条带，标记好每个条带的正反面，一般的做法是在条带的右上方剪一个小角；

封闭  将丽春红染色后的PVDF膜转移至封闭液5％脱脂奶中，室温摇床上作用2h或4℃过夜；

加一抗  将单抗腹水进行1∶100稀释，室温摇床上作用1h后，PBST洗膜5次，每次3min；

加二抗  将HRP-山羊抗小鼠IgG酶标二抗进行1∶10000稀释，室温摇床上作用0.5h后，PBST洗膜8次，每次3min；

显色  将PVDF膜取出，用吸水纸吸去多余PBST后，将PVDF膜浸入新鲜配置的DAB显色液中显色，待出现目的条带后，立即放入蒸馏水中漂洗以终止显色。

2.4单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定反应程序(同筛选建立的反应程序)

2.5单克隆抗体的亲和常数的测定

相对亲和力的测定参照徐志凯(1991)介绍的间接ELISA方法来进行。

将N蛋白取3个稀释度包被ELISA板，100μL/孔，4℃包被18～24小时；PBST洗涤4次，3min/次；用5％小牛血清封闭，4℃ 8小时，洗涤同上；加入系列稀释的已知浓度的纯化IgG，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤同上；加入1∶8000倍稀释的HRP标记山羊抗小鼠二抗，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤同上；加TMB底物溶液，100μL/孔，37℃孵育10min；每孔加入50μL 2mol/L H₂SO₄终止反应；自动酶联检测仪测定各孔OD_450nm值。

以已知浓度的纯化IgG的不同稀释度为横坐标，其相应的OD值为纵坐标，绘制出3条测定曲线，以各曲线上部趋于平坦段的OD值为100％，查出其OD值为50％时点的单克隆抗体的浓度[Ab]t，这样每份被检测样品针对N蛋白都可以得到[Ab]t、[Ab′]t、[Ab″]t三个值，然后按下列公式计算K值：

当包被抗原为1∶2时，K＝1/2[2(Ab′)t-(Ab)t]

当包被抗原为1∶4时，K＝3/2[2(Ab″)t-(Ab)t]

这样每株单克隆抗体每次都可以得到3个K值，取平均值即为其亲和常数。

2.6单克隆抗体的类型鉴定

按照mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents(Sigma-Aldrich，INC.，Saint Louis，USA)试剂盒说明书进行MAbs亚类鉴定，具体操作如下：

包被  将PRRSV N蛋白3μg/mL包被ELISA板，100μL/孔，4℃包被过夜。甩干包被液，PBST洗涤3次，3min/次，轻轻拍干；

封闭  加入含有10％FBS的PBST封闭液，150μL/孔，4℃过夜，甩干；

一抗  加入杂交瘤细胞的上清，100μL/孔，室温孵育1h，甩干，洗涤同上，轻轻拍干；

分型抗体  用封闭液稀释分型抗体(Sigma-Aldrich，INC.，Saint Louis，USA)(1∶1000)，碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA，100μL/孔，室温孵育30min，甩干，PBST洗涤液3次，3min/次，轻轻拍干；

酶标抗体  加入1∶10000稀释的HR标记的兔抗山羊IgG(H+L)，100μL/孔，室温孵育30min，甩干，洗涤同上，轻轻拍干；

显色  每孔加入新配制的底物溶液，100μL/孔，37℃避光显色10min；

终止  每孔加入50μL 2mol/L H₂SO₄终止反应；

读值  自动酶联检测仪测定各孔OD_450nm值。

2.7杂交瘤细胞系分泌单抗的稳定性检测

在杂交瘤细胞冻存后，分别在3个月和8个月后，从液氮中取出冻存的杂交瘤细胞株复苏，然后进行间接ELISA，检测杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体的情况。

结果

1.杂交瘤细胞株的建立

将脾细胞和骨髓瘤细胞按照5∶1的比例融合，融合后铺于6块96孔细胞培养板。融合后第10天用间接ELISA筛选，隔2天重复检测一次，筛选出抗体分泌阳性的孔，再用间接免疫荧光检测。6块板中所有检测强阳性孔的融合细胞转到48孔板，进行扩大培养，同时选择5个ELISA值高并且荧光亮度强的孔(记为D10、G5、F7、G3、F3)进行第一次亚克隆。同样的方法又进行两次亚克隆，最终获得了12株能稳定分泌单克隆抗体的细胞株，分别命名为N11、N21、N25、N32、N34、N35、N36、N41、N43、N51、N53、N59。

2.单克隆抗体的鉴定及初步分析

2.1单克隆抗体抗原识别位点分析

采用测相加指数法测定单克隆抗体的抗原识别表位，按如下公式计算两种单克隆抗体叠加后的AI值：AI＝(A1.2-A1)/A2×100％(A1.2：表示2株单抗叠加后的OD值；A1：表示第1株单抗自身叠加的OD值；A2：表示第2株单抗自身叠加的OD值)。当两两抗体叠加之后的AI值大于30％认为两株单抗识别不同位点。经过计算在12株单克隆抗体能识别N蛋白的3个不同表位，N11、N21、N25、N32和N36识别同一表位；N34和N35识别同一表位；N41、N43、N51、N53和N59识别同一表位。其中N35、N36以及N51显著优于其他株，根据单抗上清效价测定结果，结合间接免疫荧光结果，确定识别3个不同表位的单抗代表株分别为N35、N36和N51。

2.2杂交瘤细胞上清及腹水中单克隆抗体效价的测定

杂交瘤细胞培养上清从1∶500开始作2倍比稀释，单克隆抗体腹水从1∶5000开始作2倍比稀释，按间接ELISA测定其效价，单克隆抗体上清和腹水的效价测定结果分别见表1、表2。

表1三株单克隆杂交瘤细胞培养上清ELISA效价

表2腹水效价测定

间接ELISA的阴阳性临界值OD_450nm值大于0.1即为阳性，依据表5、表6的结果：N35、N36和N51上清的效价分别达到1∶6.4×10⁴、1∶6.4×10⁴和1∶3.2×10⁴，腹水效价分别皆达到1∶4.096×10⁷。

2.3免疫印迹(Western blotting)试验

以N35、N36、N51的腹为一抗，HRP-羊抗鼠IgG为二抗进行Westernblotting鉴定，结果(图2)显示，3株单克隆抗体均能特异性的识别PRRSV N蛋白(在35kDa处出现特异性的目的条带)。重组蛋白是在经过变性的条带，所以三株单克隆抗体均识别的表位是B细胞线性表位。

2.4单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定

N35、N36、N51分别用PRRSV BJ-4、HB-1/3.9、JXwn06感染MARC-145细胞进行间接免疫荧光检测，同时设SP2/0细胞上清液对照(如图3、4、5)。结果显示获得的三株单克隆抗体对PRRSV的三个毒株感染的细胞都具有较强的特异性荧光，呈现典型的细胞胞浆的荧光着染；SP2/0细胞上清液对照为阴性。

2.5单克隆抗体的亲和常数的测定

经间接ELISA得到N35、N36、N51三株单克隆抗体与不同浓度N蛋白的反应曲线，以曲线平坦段的OD值计算为100％，得到OD值为50％时所对应点的McAb浓度[Ab]t，再根据亲和常数计算公式就可以得到N35、N36、N51的亲和常数分别为7.8×10⁷、1×10⁸、7.45×10⁷。

2.6单克隆抗体的类型鉴定

按照mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents(Sigma-Aldrich，INC.，Saint Louis，USA)试剂盒说明书进行MAbs亚类鉴定，鉴定结果是N35为IgG2b亚类、N36和N51为IgG1亚类。

2.7杂交瘤细胞系分泌单抗的稳定性检测

分别在3个月和8个月后，从液氮中取出冻存的杂交瘤细胞株复苏，然后进行间接ELISA检测。结果表明三株单克隆抗体的上清效价都达到了1∶6400，上清的效价没有降低；对三株单克隆抗体上清进行与PRRSV的反应性鉴定，结果被病毒感染的细胞都出现了特异性的荧光；间接ELISA和间接免疫荧光的结果表明单克隆细胞株分泌抗体的活性没有降低。

二、夹心ELISA方法的建立

1材料

1.1PRRSV N蛋白单克隆抗体

PRRSV BJ-4株N蛋白单克隆抗体N35、N36、N51。

其中，N35、N36已于2009年9月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为可分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号分别为CGMCC No.3238和CGMCC No.3239。

1.2耗材

酶标板，购自美国costar公司；底物A、B液，购自北京望尔生物技术有限公司；辛酸，北京金龙化学试剂有限公司；饱和硫酸铵、乙二醇、硼氢化钠，北京化学试剂有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)，购自美国Cayman公司；高碘酸钠NaIO₄，购自汕头市西陇化工厂有限公司。

2.具体构建过程

2.1单克隆抗体腹水的制备与纯化

常规方法制备N35、N36、N51的腹水。利用辛酸-饱和硫酸铵法(陈月莲，2007)进行IgG纯化。收集后利用SDS-PAGE鉴定纯化效果，于-20℃保存备用。

2.2酶标单克隆抗体的制备及鉴定(殷震，刘景华，1997)

取5mg的HRP溶于0.5mL三蒸水，室温搅拌2min，再加入新鲜配制的0.06mol/LNaIO₄ 0.5mL水溶液，混匀后置冰箱里避光搅拌30min。待溶液变为绿色时取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL，室温放置半小时，使氧化反应终止。再向液体中加入含有7.5mg的纯化抗体1mL(PBS稀释)，混匀后装入预先活化的透析袋中，以0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析过夜，使辣根过氧化物酶与抗体充分结合。取出透析袋中的液体，加入5mg/mL的硼氢化钠500μL，置冰箱中还原6-8小时，将辣根过氧化物酶还原为稳定地结合物。然后将上述混合物，加入等体积的饱和硫酸铵，冰箱中放置过夜，3000rpm，离心10min，将所得的沉淀溶于少许0.01mol/L的PBS中，装入透析袋中以0.01mol/L的PBS透析过夜充分除去硫酸铵，透析24-36h。离心除去沉淀，加少许PBS，计算出总体积，记录，加50％甘油混匀，置-20℃保存。

N35、N36和N51三株单克隆抗体经过酶标记后，记为N35^E、N36^E和N51^E，利用间接ELISA方法进行活性的鉴定。

2.3夹心配对抗体的选择

先将提纯的单抗IgG以5μg/mL包被酶标板，100μL/孔，4℃放置18-24h；取出后用PBST洗涤4次，每次3min；用5％小牛血清封闭，150μL/孔，于4℃放置8-12h；封闭后洗涤同上；然后以BJ-4细胞毒作为抗原，原液加入，100μL/孔，37℃反应60min；反应完毕后洗涤同上；将N35^E、N36^E和N51^E用稀释液进行1∶3000稀释，100μL/孔，37℃反应30min；反应完毕后洗涤同上；加入新鲜配制的TMB底物，100μL/孔，37℃反应15min；底物反应完后，加入终止液，每孔加入50μL 2mol/mL的硫酸终止；终止后于酶标仪上读数，双波测定各孔(OD_450nm-OD_630nm)，并记录结果。

2.4单抗包被浓度及阴阳性对照稀释度的确定

采取方阵滴定法来测定：将N36株单克隆抗体IgG用包被液进行梯度稀释，分四个浓度3μg/mL、1.5μg/mL、0.75μg/mL、0.375μg/mL，100μL/孔，4℃放置18-24h；取出后用PBST洗涤4次，每次3min；用5％小牛血清封闭，150μL/孔，于4℃放置8h；封闭后洗涤同上；阴阳性对照(BJ-4细胞毒和猪PCR阴性血清)分六个稀释度1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160，自上而下分别加入以上的反应孔中，100μL/孔，于37℃ 1h；取出后洗涤同上；接着加入N35^E(1∶3000)，于37℃作用30min；取出后洗涤同上；加入新鲜配置底物(TMB)100μL/孔，于37℃作用10min；最后每孔加入50μL 2mol/mL的硫酸终止，于酶标仪上读数，双波测定各孔(OD_450nm-OD_630nm)。

2.5封闭液的选择

将N36株单克隆抗体IgG以确定的最佳反应条件包被ELISA板，100μL/孔，4℃放置18-24h；取出后洗涤4次，每次3min；分别用1％BSA、5％脱脂奶、5％小牛血清、10％小牛血清、5％马血清、10％马血清作为封闭液，于4℃放置8h；每个封闭液做4个孔，两个阳性对照，两个阴性对照，在其它条件及操作方法相同的情况下对已知的阴阳性对照进行检测，在酶标仪上读数，双波测定各孔(OD_450nm-OD_630nm)；比较各组阴阳性对照的P/N，以确定合适的封闭液。

2.6抗原作用时间的确定

用封闭液作为稀释液稀释阴阳性对照，按确定的最佳条件进行ELISA检测，抗原在37℃分别反应30min、45min、60min、90min、120min，在其它条件和反应程序相同的情况下进行ELISA检测，双波测定各孔(OD_450nm-OD_630nm)，通过比较P/N值来确定抗原的作用时间。

2.7酶标单克隆抗体(N35E)工作浓度和作用时间的确定

按已确定好的条件反应，用已知的阴阳性对照进行ELISA检测，N35^E的稀释度分别为1∶1000、1∶1500、1∶2000、1∶2500、1∶3000、1∶3500；双波测定各孔(OD_450nm-OD_630nm)，比较各孔的P/N。

按已确定好的反应条件反应，用已知的阴阳性对照进行ELISA检测，酶标单抗的反应时间分别为30min、45min、60min，双波测定各孔(OD_450nm-OD_630nm)，比较各孔的P/N。

2.8底物作用时间的确定

将阴阳性对照按照已确定好的条件反应，底物的反应时间分别为5min、10min、15min、20min，双波测定各孔(OD_450nm-OD_630nm)，通过比较P/N值来确定底物作用时间。

2.9阴阳性临界值的确定

选择27份猪PRRSV抗原阴性的血清，按照已确定的最佳的反应条件进行ELISA检测，双波测定各孔(OD_450nm-OD_630nm)，根据公式：阴阳性临界值＝阴性样本(OD_450nm-OD_630nm)平均值+3×标准差(SD)。

2.10裂解液成分的确定

裂解液的成分为NP-40/TritonX-100、Tris-base、NaCl；

用3份PRRSV JXwn06株阳性血清样本和一份阴性血清来摸索中性非离子型表面活性剂为NP-40还是TritonX-100，配方是NP-40/Triton X-100为1％，Tris-base浓度为1.5M、NaCl为800mM，水做溶剂并且用盐酸将pH值调到7.5左右；用已经建立好的ELISA方法检测。

NP-40为1％，Tris-base浓度为0.1M、0.3M、0.6M、0.9M、1.2M、1.5M、2M、2.8M，NaCl为800mM，用水做溶剂并用盐酸将pH值调到7.5左右；用已经建立好的ELISA方法检测。

2.11裂解液与血清比例的确定

为了确定裂解液与PRRSV JXwn06株阳性血清样本的最佳比例，将裂解液与血清按5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的比例裂解，按已经建立方法的最佳反应条件反应。

2.12交叉反应试验

在相同条件下，用圆环病毒、伪狂犬病毒、细小病毒、流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、PRRSV JXwn06株阳性血清、PRRSV抗原阴性血清进行ELISA试验，确定该方法的交叉反应性。

2.13双抗体夹心ELISA法检测血清中病毒最低含量的确定

将PRRSV JXwn06株抗原阳性的血清(毒价为1000TCID₅₀/mL)进行2倍稀释，加入等量的裂解液，分为两份，一份按建立好的方法进行ELISA检测，另一份用RT-PCR方法检测，确定两个方法对血清病毒的最低检出量。

2.14双抗体夹心ELISA法的特异性与敏感性确定

利用建立的双抗体夹心方法与RT-PCR方法同时检测80份临床样本，确定该方法的特异性及敏感性。

3结果

3.1单克隆抗体的纯化

N35、N36和N51单克隆抗体腹水用辛酸-饱和硫酸铵法纯化后，用SDS-PAGE鉴定，达到了比较好的效果，结果如图6所示。

3.2酶标单克隆抗体的制备及鉴定

利用直接ELISA方法对N35^E、N36^E和N51^E的活性进行鉴定，它们的效价分别可达到1∶1.6×10⁶、1∶8×10⁵、1∶1.6×10⁶。

3.3夹心配对抗体的选择

将N35、N36、N51提纯的IgG作为捕获抗体，N35^E、N36^E、N51^E做为检测抗体，进行夹心配对试实验，以(OD_450nm-OD_630nm)值最高的配对为最佳的抗体组合，比较结果(如表3)，确定N36作为捕获抗体，N35^E作为检测抗体。

表3三株单抗的夹心配对试验结果

3.4单克隆抗体包被浓度和阴阳性对照稀释度的确定

将N36株单抗IgG用包被液梯度稀释为3μg/mL、1.5μg/mL、0.75μg/mL、0.375μg/mL；阴阳性对照(BJ-4细胞毒和猪阴性血清)分六个稀释度1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160。选定P/N最大且阳性(OD_450nm-OD_630nm)值1.0左右的孔，其所对应的捕获抗体包被浓度和阴阳性对照的稀释度为最佳条件，最终确定单抗包被浓度为3μg/mL，阴阳性对照稀释度为1∶40(如表4)。

表4单抗包被浓度和阴阳性对照稀释度的确定

3.5封闭液的选择

以最适抗原浓度和最佳阴阳性对照稀释度，选定6种封闭液进行ELISA检测，双波测定各孔(OD_450nm-OD_630nm)；以P/N值最大的一组为最佳封闭液，确定5％小牛血清为最佳封闭液(如表5)。

表5封闭液选择

3.6抗原作用时间的确定

用封闭液作为抗原稀释液稀释阴阳性对照，按已经确定的程序反应，抗原在37℃分别反应30min、45min、60min、90min、120min，在其它条件和反应程序相同的情况下，进行ELISA检测，取P/N最大的一组阳性值在1.0左右的作用时间确定为最佳反应时间。综合考虑，确定抗原最佳作用时间为37℃ 60min(如表6)。

表6抗原作用时间的确定

3.7酶标记单克隆抗体工作浓度和作用时间的确定

按已确定条件进行ELISA，酶标单抗的稀释度分别为1∶1000、1∶1500、1∶2000、1∶2500、1∶3000、1∶3500。确定P/N最大时为酶标抗体最佳稀释度(如表7)，确定酶标单抗的最佳工作稀释度为1∶2000。

表7酶标单抗工作浓度的确定

按已确定条件进行ELISA，酶标单抗的反应时间分别为30min、45min、60min。以P/N最大为最佳的酶标单抗的反应时间，最终确定酶标单抗反应时间为45min(如表8)。

表8酶标记单克隆抗体作用时间的确定

3.8底物作用时间的确定

按已优化的反应程序进行ELISA反应，底物的显色时间分别为5min、10min、15min、20min，以P/N值最大组的反应时间确定为底物最佳反应时间，依据表9的结果，确定最佳显色时间为37℃反应15min。

表9底物作用时间的确定

3.9阴阳性临界值的确定

选取经RT-PCR确定为阴性的27份PRRSV阴性血清样本，测定其OD值(OD_450nm-OD_630nm)。经计算阴阳性临界值为0.083。为便于判断，并尽量避免实验假阴性的出现，将临界值定为0.12。表10为27份阴性血清样本的夹心ELISA检测结果。

表10阴阳性临界值的确定

3.10裂解液成分的确定

通过系列试验，确定TritonX-100可作为裂解液的成分；Tris-base的工作浓度为2.8M(见表11、表12)，用盐酸将pH值调到7.5左右。

表11中性非离子型表面活性剂的确定

表12裂解液中Tris-base浓度的确定

3.11裂解液与血清样本比例的确定

将裂解液与PRRSV阳性的血清样本按5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的比例混合作用，确定裂解液与血清按1∶1配比，效果最佳(表13)。

表13裂解液与血清比例的确定

3.12双抗体夹心ELISA方法的交叉反应试验

分别用圆环病毒、伪狂犬病毒、细小病毒、乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、PRRSV JXwn06抗原阳性血清样本、PRRSV抗原阴性血清样本进行交叉反应试验。结果表明，该方法具有较好的特异性，与其它引起繁殖障碍疾病的病毒间不存在交叉反应(见表14)。

表14双抗体夹心ELISA的交叉反应试验

3.13双抗体夹心ELISA和RT-PCR方法确定血清样本中病毒最低检出量

将PRRSV JXwn06株抗原阳性血清样本(1000TCID₅₀/mL)进行2倍比稀释，加等量裂解液，分别用ELISA和RT-PCR法进行检测。确定夹心ELISA方法对血清样本的病毒最低检出量为0.2TCID₅₀(如表15)，用RT-PCR法检测的病毒最低检出量为0.1TCID₅₀(如图7)。

表15双抗体夹心方法对血清最低检出量的确定

3.14双抗体夹心ELISA法检测PRRSV抗原反应程序

包被：将单克隆抗体N36株IgG用包被液稀释为3μg/mL，100μL/孔，4℃放置18-24h；

封闭：取出包被板用PBST洗涤4次，3min/次；用5％小牛血清封闭，150μL/孔，4℃放置8-12h，封闭后洗涤同上；

加样：阴阳性对照按1∶40稀释，待检血清样本与裂解液等体积混合，100μL/孔，37℃

反应60min，洗涤同上；

加酶标单抗：将N35^E进行1∶2000稀释，100μL/孔，37℃反应45min，洗涤同上；

显色：加入新鲜配制的TMB底物，100μL/孔，37℃反应15min；

终止：显色后，每孔加入50μL 2mol/mL H₂SO₄终止；

读板：酶标仪上双波测定各孔(OD_450nm-OD_630nm)，进行结果判定。

3.15双抗体夹心ELISA法特异性及敏感性试验

利用建立的双抗体夹心方法与RT-PCR方法同时检测80份临床血清样本。该方法的特异性为88％(44/50)，敏感性为90％(27/30)，两者的符合率为88.8％(71/80)。结果见表16。

表16双抗体夹心ELISA法与RT-PCR法临床样本检测结果比较

4讨论

本发明运用杂交瘤细胞技术制备了多株针对PRRSV N蛋白的单克隆抗体，筛选出其中可分别识别N蛋白上3个不同线性表位的3株单克隆抗体(即N35、N36、N51)进行了相应的特性鉴定。经间接免疫荧光法鉴定，3株单抗与PRRSV分离株BJ-4、HB-1和JXwn06均具有良好的反应性。其腹水效价均可达1∶2.048×10⁷或以上，且分泌抗体的杂交瘤细胞株活性较稳定。

亲和常数表示了抗体与抗原结合的紧密程度。高亲和力的抗体对于定量检测及导向诊治是非常有用的(万文徽，1993)。单克隆抗体亲和力越高，以其为基础建立的夹心ELISA方法的敏感性越好。本研究用到的N35株、N36株、N51株单抗的亲和常数均较高，分别为7.8×10⁷，1×10⁸和7.45×10⁷。

本发明用分别针对N蛋白不同线性表位的2株单抗对抗原进行捕获和检测，相对于仅用一株单抗建立的抗体夹心ELISA方法来说，敏感性大大提高，更适用于临床血清样本中少量抗原的检测。

本发明还有一个重要的环节就是需要高纯度的酶标记抗体，优秀的酶标记的抗体既需要保留抗体的免疫学活性，又需要保留酶的活性。抗体的标记率越高，则方法的敏感性越高，所以这就需要摸索出比较成熟的HRP标记抗体的方法；本发明利用病毒学上的高碘酸钠法进行标记，并进行了一些细节上的改进。标记后用ELISA鉴定，效价都达到了40万以上，这有效地保证了本方法的高敏感性。

PRRSV病毒粒子外包裹着一层囊膜结构，而N蛋白是核衣壳蛋白，位于病毒粒子的中心区域。因此，血清样本中病毒粒子的裂解及导致的N蛋白的暴露程度直接关系着检测方法建立的成功与否。本发明经反复摸索确定：裂解液组成成分为NP-40/TritonX-100、Tris-base和NaCl。其中，中性非离子型表面活性剂的主要作用是破坏病毒的囊膜，它的效果决定了N蛋白是否能够充分暴露。Tris-base的浓度也是影响裂解液效力的重要因素。通过多次尝试，本发明最终确定的裂解液配方为TritonX-100、Tris-base 2.8M、NaCI 600mM，并且用盐酸将裂解液的pH值调整到7.5左右。裂解液组分及其浓度的准确确定对于双抗体夹心ELISA方法敏感性的提高至关重要，是本方法建立的核心步骤。

与目前常用于抗原检测的RT-PCR方法相比，本发明建立的双抗体夹心ELISA法成本低、操作简便、重复性好，适用于基层临床推广应用，具有巨大的经济效益和广阔的应用前景。本方法的建立为PRRSV流行病学研究及疫病防控、净化提供了实用、快速、有效的检测手段，也为PRRSV抗原检测试剂盒的进一步研制奠定了扎实的基础。

实施例2试剂盒的构成

本例中的试剂盒的组成如下：

酶标板：包被N36株分泌产生的单克隆抗体

酶标抗体：辣根过氧化物酶标记N35分泌产生的单克隆抗体

裂解液：1％Triton X-100、2.8M Tris-base、800mM NaCl，pH7.5。

底物液：100mmol/L的柠檬酸溶液(21g柠檬酸C₆H₆O₇·H₂O溶于去离子水，定容至1L)24.3mL，200mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O(71.6gNa₂HPO₄.12H₂O溶于去离子水，定容至1L)25.7mL混匀，加入50mg的四甲基联苯胺(TMB)，临用前加入50μL的30％H₂O₂；

终止液：(2mol/L H₂SO₄)分别取蒸馏水177.8mL和浓硫酸22.2mL混和即可。

洗涤液  1000mL 10mmol/L pH 7.4的PBS中加入0.5mL Tween-20；

阴性对照  未接毒MARC-145培养液；

阳性对照  利用MARC-145培养的BJ-4细胞毒。

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Claims (8)

1、猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心ELISA试剂盒，其包括：

(1)包被PRRSV N蛋白单克隆抗体的酶标板；

(2)酶标记PRRSV N蛋白单克隆抗体；

(3)裂解液；

其中，包被在酶标板的PRRSV N蛋白单克隆抗体与酶标记PRRSV N蛋白单克隆抗体分别针对PRRSV N蛋白不同的抗原决定簇。

2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包被在酶标板的PRRSV N蛋白单克隆抗体与酶标记PRRSV N蛋白单克隆抗体分别为杂交瘤细胞株N35或N36分泌获得。

3、如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述包被在酶标板的PRRSVN蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株N36分泌获得，酶标记PRRSV N蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株N35分泌获得。

4、如权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液的配置为：0.5～1％中性非离子表面活性剂、2.2～2.8M Tris-base、800mM中性盐，pH 7.0～7.5。

5、如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液的配置为：1％Triton X-100、2.8M Tris-base、800mM NaCl，pH7.5。

6、如权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其还包括以下试剂中的一种或多种：洗涤液、二抗稀释液、底物显色液、终止液。

7、如权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记PRRSVN蛋白单克隆抗体的标记酶为辣根过氧化物酶，具体标记方法包括如下步骤：取5mg的HRP溶于0.5mL三蒸水，室温搅拌2min，再加入新鲜配制的0.06mol/L NaIO₄0.5mL水溶液，混匀后置冰箱里避光搅拌30min，待溶液变为绿色时取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL，室温放置半小时，使氧化反应终止，再向液体中加入含有7.5mg的纯化抗体1mL，混匀后装入预先活化的透析袋中，以0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析过夜，使辣根过氧化物酶与抗体充分结合，取出透析袋中的液体，加入5mg/mL的硼氢化钠500μL，置冰箱中还原6-8小时，加入等体积的饱和硫酸铵，冰箱中放置过夜，3000rpm，离心10min，将所得的沉淀溶于少许0.01mol/L的PBS中，装入透析袋中以0.01mol/L的PBS透析过夜充分除去硫酸铵，透析24-36h，离心除去沉淀，即得纯化酶标记抗体。

8、如权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述PRRSV N蛋白单克隆抗体的包被方法是：将3μg/mL的单克隆抗体按100μL/孔加入到酶标板中，4℃放置18-24h，用PBST洗涤后，用5％小牛血清封闭，150μL/孔，于4℃放置8h，再用PBST洗涤。

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