CN101955531B - 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的检测抗体和捕获抗体，这两种抗体分别由保藏号为CCTCC NO.C200851的杂交瘤细胞株G2C51A2分泌得到和由保藏号为CCTCC NO.C200850的杂交瘤细胞株V1C12A1分泌得到。上述抗体均能特异性结合PRRSV核衣壳蛋白，可用于制备PRRSV的试剂。本发明还提供了一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，该试剂盒包括检测抗体和捕获抗体，其特征在于所述的检测抗体由保藏号为CCTCC NO.C200851的杂交瘤细胞株G2C51A2分泌的抗体，所述的捕获抗体由保藏号为CCTCC NO.C200850的杂交瘤细胞株V1C12A1分泌得到。该试剂盒对PRRSV的美洲株和欧洲株都具有较高的准确度和灵敏度。

Description

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗体

技术领域

本发明涉及生化领域，具体涉及检测病毒的试剂。 

背景技术

猪繁殖与呼吸综合症(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是以母猪的繁殖障碍、仔猪及成猪的呼吸道症状为主要特征的一种病毒性传染病，其高死亡率在世界范围内给养猪业造成巨大的经济损失。自1987年在美国某个猪场发现PRRS以来，该病先后席卷整个北美、欧洲及亚洲。1990-1991年间该病在欧洲暴发流行，5000多个猪场发现本病，100多万头猪死亡。我国自1995年从加拿大引进种猪后，年底于华北地区爆发PRRS，1996-1998年更是出现“流产风暴”，发病母猪流产率达10-50％，母猪的死亡率高达10％。由于没有有效的防治手段，PRRS在我国愈演愈烈，并于2006年出现严重疫情，26省300多个县，379.8万头猪发病，死亡99.2万头，给养猪业带来沉重打击。PRRS爆发的原因在于其病毒复制过程存在变异，一般的疫苗难于预防，早发现，早隔离成为预防爆发流行的主要手段。 

经研究表明引起PRRS的病原体为猪繁殖于呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus，PRRSV)，属于尼多病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arteriviridae)动脉炎病毒属(Arterivirus)。PRRSV的基因组为不分节段的单股正链RNA，直径约40-80nm，大约为15kd，含9个开放读码框(ORFs)。病毒上的囊膜蛋白是病毒的结构和保护性抗原的组成部分，在致病和免疫过程中发挥着重要的作用。根据序列分析及血清学试验结果，将PRRSV分为两个亚型，即美洲型(代表株：VR-2332)和欧洲型(代表株：Lelystad Virus，LV)。PRRSV存在较大的基因变异，造成二者抗原性的差异也较大，因此两个亚型在血清学试验中很少有交叉反应。引起我国PRRS大规模暴发流行的主要是美洲型，流行病学调查发现我国亦存在欧洲型PRRSV。随着病毒基因组的变异，抗原决定簇的改变或转换，PRRSV的侵袭力和致病性可能还会不断增强，对养猪业将造成更大的威胁。 

对猪繁殖与呼吸综合症做出快速、准确诊断，及时有效掌握PRRSV的流行特点和监测其高致病毒株的出现，对流行趋势做出预测，尽早隔离并做出相应的防范，将能够最大限度地减低疾病所造成的危害。 

PRRS病毒的检测方法主要有病毒分离鉴定、免疫过氧化酶技术及RT-PCR检测等。病毒分离培养是最确切方法，但很多猪场不能开展，而且费时；RT-PCR检测技术含量及成本较高，同时易出现假阳性结果；抗体检测方法以美国IDEXX和法国LSI最为经典，由于目前各猪场均使用PRRS疫苗预防，上述两种方法都很难区分是疫苗免疫产生的抗体还是猪感染PRRSV 所产生，易出现假阳性；另外有些猪可能感染PRRS病毒但尚未产生抗体或曾感染过而现在血清转阴等，出现假阴性。 

PRRSV基因组ORFs7编码的核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein，NP)包含所有PRRSV毒株保守的共同抗原决定簇，又有具欧洲型和美洲型特异性的抗原决定簇。同时NP在病毒粒子中含量较高，约占病毒总蛋白的40％，具有极强的免疫原性。该蛋白是一种能够早期检测PRRSV感染的有效标志，及早确诊PRRSV感染，以便于快速采取有效的治疗和隔离措施，是防止PRRSV感染的扩散及降低死亡率的前提，也是减少经济损失的有效措施，而目前在国际上尚未有核衣壳蛋白抗原的检测方法。为此我们利用基因工程技术，表达该PRRSV核衣壳蛋白，并制备抗该蛋白的单克隆抗体，在此基础上构建双抗体夹心ELISA法检测PRRSV中的N蛋白，此抗原检测方法对于PRRS的早期诊断、预防PRRS的爆发流行、疫苗评测以及流行病学调查具有重要意义。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提高检测PRRS病毒的灵敏度和特异性。 

本发明解决上述问题的技术方案是： 

一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测抗体，该抗体由保藏号为CCTCC NO.C200851的杂交瘤细胞株G2C51A2分泌得到，记为单抗G2C51A2。 

一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的捕获抗体，该抗体由保藏号为CCTCC NO.C200850的杂交瘤细胞株V1C12A1分泌得到，记为单抗V1C12A1。 

本发明所述的单抗G2C51A2和单抗V1C12A1均能特异性结合PRRSV核衣壳蛋白，与临床PRRSV感染的猪血清及肺组织研磨液分离所获病毒培养上清反应均为阳性；而与其他常见猪感染性病毒培养上清的反应均为阴性，如伪狂犬病毒、猪圆环病毒等。 

所述单抗G2C51A2和单抗V1C12A1可分别由杂交瘤细胞株V1C12A1和G2C51A2分泌得到。杂交瘤细胞株V1C12A1和G2C51A2是分别用重组的PRRSV核衣壳蛋白免疫Balb/c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞和商品化的小鼠骨髓瘤细胞NS-1融合，最后用HAT培养基筛选得到，已于2008年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。 

所述单抗G2C51A2和单抗V1C12A1配对用于检测PRRSV，主要是结合双抗体夹心方法的检测，如双抗体夹心ELISA方法、胶体金免疫层析或免疫化学发光方法的检测，其中单抗V1C12A1作为捕获抗体，单抗G2C51A2单独或者结合各种能发出可检测信号的物质作为检测抗体。基于上述原理，本发明所述的单抗用于制备成可产业化的检测PRRSV的试剂盒，该试剂盒包括检测抗体和捕获抗体，其特征在于所述的检测抗体是保藏号为CCTCCNO.C200851的杂交瘤细胞株G2C51A2分泌的单抗G2C51A2，所述的捕获抗体是保藏号为 CCTCC NO.C200850的杂交瘤细胞株V1C12A1分泌的单抗V1C12A1。所述的试剂盒可以是双抗体夹心ELISA试剂盒、免疫化学放光试剂盒或胶体金快速免疫层析检测试纸等，例如：双抗体夹心ELISA试剂盒由以下试剂组成：包被单抗V1C12A1的微孔反应板、样品处理液、与标记物结合的单抗G2C51A2、阳性对照物、阴性对照物、浓缩洗液、显色液和终止液，其中所述的标记物是指能标记在抗体非活性部位且可定量分析的物质(如酶、生物素或发光物质等)；而相应的显色液则含有能与所述标记物反应并产生颜色变化的物质(例如酶的底物)。可以变换和选择相应标记物与显色液，如生物素亲和素系统，再如辣根过氧化物酶及其底物过氧化氢尿素和四甲基联苯胺(简称TMB)，也同样适用于本发明。所述的样品处理液、浓缩洗液和终止液均是双抗体夹心ELISA方法中的常用试剂，所述的阳性对照物是指PRRSV核衣壳蛋白，所述的阴性对照物是不含PRRSV核衣壳蛋白的空白对照物。 

本发明所说的检测PRRSV的试剂盒操作简单、快速，特异性高，与其它猪易感性病毒无交叉反应，既可用于猪只进出口检疫及猪场的检测监控，又可用PRRSV的诊断及流行病学调查。本发明试剂盒与现有检测PRRSV的技术相比有以下优点： 

1、用于进出口检疫及猪场的检测监控，与现有PRRSV检测技术相比，可利用本发明酶联免疫技术试剂盒，对进出口猪只进行检测严格控制PRRSV毒株的引入及输出，可以对猪的排泄物及血清样本初步筛查，可简易、快速、准确地检测出样本中PRRSV； 

2、用于猪场的检测监控，可利用本发明酶联免疫技术试剂盒，对可疑感染PRRSV的猪场大规模的初步筛查，可简易、快速、准确地检测出样本中PRRSV； 

3、与目前用于诊断PRRSV的早期诊断试剂盒相比，具有相似的灵敏度，但技术要求低，特异性好，与伪狂犬病毒、猪圆环病毒等无假阳性反应，成本低，适合各大猪场及兽医防疫站使用。 

附图说明

图1是本发明获得单抗V1C12A1和单抗G2C51A2所用的免疫源，诱导表达纯化获得重组PRRSV核衣壳蛋白的结果。其中条带M为低分子量Marker，条带1为经IPTG诱导后蛋白表达菌体，条带2为经Glutathione Sepharose 4B结合柱纯化的重组PRRSV核衣壳蛋白(箭头所示)。 

图2是本发明获得单抗V1C12A1和单抗G2C51A2所用的免疫源，诱导表达纯化获得重组PRRSV核衣壳蛋白免疫印迹鉴定结果。其中条带1为Anti-GST单抗，条带2为PRRSV减毒疫苗免疫小鼠血清，条带3为无关抗体。 

图3是本发明单抗V1C12A1和单抗G2C51A2对经Glutathione Sepharose 4B结合柱纯化的重组PRRSV核衣壳蛋白进行免疫印迹的结果，其结合条带的分子量为41kDa；其中条带1 是V1C12A1，条带2是单抗G2C51A2，条带5是单抗Anti-GST单抗，条带6是单抗Marker，条带3，4为无关单抗。 

图4是诱导表达纯化获得重组欧洲株PRRSV核衣壳蛋白的结果。其中条带M为低分子量Marker，条带1为经IPTG诱导后蛋白表达菌体，条带2为经Glutathione Sepharose 4B结合柱纯化的重组欧洲株PRRSV核衣壳蛋白(箭头所示)。 

图5是本发明获得单抗V1C12A1和单抗G2C51A2，与诱导表达纯化获得重组欧洲株PRRSV核衣壳蛋白免疫印迹鉴定结果。其中条带1为无关单抗，条带2和3分别为本发明获得单抗G2C51A2和单抗V1C12A1，条带4为PRRSV减毒疫苗免疫小鼠血清。 

图6是本发明检测PRRSV N蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒检测欧洲株及美洲株N蛋白的结果曲线图，其中 

表示美洲株N蛋白， 

表示欧洲株N蛋白， 

表示阴性对照。 

具体实施方式

例1本发明单克隆抗体的制备和鉴定 

1、单抗V1C12A1和单抗G2C51A2的制备 

1)猪繁殖与呼吸综合症病毒抗原制备： 

利用基因工程技术，设计美洲株PRRSV基因组ORFs7编码的核衣壳蛋白基因两端引物，上游引物5’-CGCGGATCCGTATGCCAAATAACAACGGCAAG-3’引入BamH I限制性内切酶位点，下游引物5’-CCGCTCGAG TTATCATGCTGAGGGTGATGCTGT-3’引入Xhol限制性内切酶位点，以PRRSV(ch-1a株，与美洲株同源性为93.5％)扩增所得细胞上清提取RNA为反转录模板，合成N蛋白基因CDNA，进而获得其dsDNA，构建进入PGEX-5X-3原核表达系统，1M IPTG，28℃诱导表达PRRSV核衣壳蛋白，并纯化获得该蛋白(图1所示)，同时以PRRSV减毒疫苗免疫小鼠血清及Anti-GST单抗、无关抗体鉴定所得重组蛋白后(图2所示)，并储存于-80℃备用。 

2)免疫小鼠 

取4-6周龄雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐剂与等体积PRRSV核衣壳蛋白抗原混匀乳化，皮下注射100μg/只小鼠，以后每10天以弗氏不完全佐剂与50μg抗原等体积乳化，腹腔和皮下多点注射，小鼠免疫4次后，于融合前3天静脉加强100μg/只抗原。 

3)免疫血清效价测定 

采用间接ELISA法测定免疫血清效价。配制10μg/ml PRRSV核衣壳蛋白抗原的50mMpH9.6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100μl/孔，4℃过夜。次日，含0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液300μl/孔4℃过夜，甩干包被板条，真空干燥12～24h，用铝膜袋真空包装4℃保存，用于鼠免疫血清效价测定。于第三次免疫后10天眼眶采血，鼠免疫血清用 含1％BSA 10mM PBS以10^-3～10^-6倍稀释，加入96孔板，100μl/孔37℃30min，10mM PBS含0.1％Tween-20洗涤液洗板四次后，加入1∶1000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma，INC)，100μl/孔37℃30min，同上洗板后，加入含有0.05％(W/V)TMB和0.06％(W/V)双氧pH5.0柠檬酸缓冲液，100μl/孔，室温避光10min，加100μl/孔1M H₂SO₂终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值得比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。 

4)杂交瘤制备 

选择血清抗体效价达1×10⁵的小鼠，于融合前3天尾静脉注射100μg PRRSV核衣壳蛋白抗原。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1按10∶1的比例混合，用45％聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma)作用下进行融合。按下述步骤将聚乙二醇溶液加入细胞。在37℃水浴中，在1-2min内缓慢加入1.0ml PEG，边加边轻轻摇匀，分别于1min、2min、3min、4min、5min内加1ml、2ml、3ml、4ml、5ml无血清RPMI-1640培养基终止融合，最后加入10ml含15％FBS的二合一培养基，室温1000rpm离心5min，弃上清，用36ml含15％胎牛血清的培养基轻轻悬起细胞。将此细胞悬液加入6块96孔培养板上，在二氧化碳培养箱中温度为37℃、5％CO2的培养箱中。一天以后，于每孔加入100μl含次黄嘌呤、氨基喋呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT，Sigma)筛选培养基。以后每3天用此筛选培养基给培养物换液一次，直到克隆细胞形成。 

5)筛选分泌抗PRRSV核衣壳蛋白抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞 

间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择强阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，得到2株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。 

小鼠体内接种阳性杂交瘤细胞，制备腹水，并采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水中的抗体。 

2、本发明单克隆抗体的特异性鉴定 

(1)实验材料：猪繁殖与呼吸综合症减毒疫苗(ch-1a株)(购自广州市动物防疫监督所) 

(2)抗原制备： 

利用基因工程技术，设计PRRSV核衣壳蛋白基因两端引物，合成NP蛋白基因，构建入PGEX-5X-3原核表达载体，1mM IPTG 37℃诱导4h，，并纯化获得PRRSV核衣壳蛋白，并储存于-80℃备用。 

(3)抗体亚类鉴定 

Ig亚类鉴定采用间接ELISA，包被PRRSV核衣壳蛋白抗原，封闭后与杂交瘤细胞培养 上清孵育，再分别与为1∶1000倍稀释HRP标记的兔抗小鼠不同亚类特异性免疫球蛋白，这些抗体包括兔抗小鼠IgG1(Sigma，Inc)，兔抗小鼠IgG2a(Sigma，Inc)，兔抗小鼠IgG2b(Sigma，Inc)，兔抗小鼠IgG3(Sigma，Inc)，兔抗小鼠IgM(Sigma，Inc)。检测结果两株杂交瘤细胞株均为IgG1阳性 

(4)间接ELISA法进行单克隆抗体特异性分析： 

用PRRSV核衣壳蛋白抗原包被微孔板，按照常规的间接ELISA法进行检测。在包被的微孔板中加入本专利发明的杂交瘤细胞培养上清液，37℃再孵育1h，加入1∶1000稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma，Inc)，100μl/孔37℃ 30min，加TMB显色液室温避光10min，加1M H₂SO₂终止反应，测450nm吸收值(A₄₅₀)。表1结果显示本专利发明的单克隆抗体与PRRSV核衣壳蛋白抗原产生很强的特异性的免疫反应。 

表1：PRRSV核衣壳蛋白单克隆抗体与PRRSV核衣壳蛋白抗原反应间接ELISA结果 

(5)免疫印迹法分析本发明单抗的特异性 

重组纯化的PRRSV核衣壳蛋白经12.5％SDS-PAGE电泳分离的蛋白条带转印至硝酸纤维素膜上，10％脱脂奶粉封闭后，分别用本发明单抗V1C12A1和G2C51A2，及Anti-GST单抗，无关单抗结合纤维素膜于室温孵育1h，用含有0.5％(v/v)Tween-20的洗液清洗5次，再加入1∶1000HPR标记的羊抗鼠IgG(Sigma，Inc)，DAB(Amresco Inc，Solon，OH)显色，获得试验结果。本发明中的2种单克隆抗体结合重组蛋白分子量条带位于41kDa处(图3所示)，说明这2组单抗识别抗原为经Glutathione Sepharose 4B结合柱纯化的分子量为41kDa的重组蛋白。 

(6)间接免疫荧光法鉴定本发明单克隆抗体的特异性 

1)实验材料：猪繁殖与呼吸综合症病毒，MA-104细胞株。 

2)实验方法： 

以猪繁殖与呼吸综合症病毒感染MA-104细胞，37℃培养出现细胞病变，离心收集感染后细胞，用预冷的1×PBS收集、洗细胞二遍并调整浓度为1×10⁶个细胞/ml，然后将细胞滴于无菌干燥的玻片上，干燥后，制备成涂片，充分干燥，用预冷固定液(丙酮∶甲醇体积比为3∶7)固定20min，吹干，用同样的方法制备MA-104细胞涂片作为阴性对照。将上述两株单克隆抗体调整浓度为10μg/ml，加至两种荧光涂片孔中，同时设阴性和阳性对照血清，置37℃水浴60min后，取出将抗原片放于染色缸中用0.01mM pH7.2 PBS清洗3次，吹干，加入荧光标记羊抗小鼠IgG抗体，37℃水浴30min后，同上方法洗涤5次，吹干后，0.25％伊 文氏蓝对照染色，荧光显微镜下观察荧光图像，以荧光的强度和染色形态进行结果判定，检测抗体强度以(+～++++)计为阳性，抗体强度(±)和(-)计为阴性。 

3)实验结果： 

结果如表2所示，本发明单抗特异性结合PRRSV-MA104细胞涂片，且有很强的结合能力，而与无关单抗及阴性对照不结合。 

表2间接免疫荧光检测抗PRRSV核衣壳蛋白抗原的单克隆抗体的特异性 

(7)本发明单克隆抗体识别位点的分析 

1)抗原制备：利用基因工程技术，设计PRRSV核衣壳蛋白基因两端引物，合成NP蛋白基因，构建入PGEX-5X-3原核表达载体，1mM IPTG 37℃诱导4h，，并纯化获得PRRSV核衣壳蛋白，并储存于-80℃备用。 

2)方法和结果：用50mM pH9.6碳酸盐缓冲液稀释上述抗原至10μg/ml，包被聚苯乙烯微96孔板，100μl/孔，4℃过夜。次日，含0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液0.3ml/孔，4℃过夜后，先加单抗10μg/ml 50μl/孔及后加系列稀释Biotin(Sigma)标记单抗1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶200050μl/孔，26℃，孵育1h；PBST洗涤五次后加1∶1000的Avidin-HRP(Sigma)，26℃，孵育30min，PBST洗涤五次后加TMB(Amresco Inc)100μl/孔，10min后，1N硫酸终止反应，测定450nm吸收值。以单抗对同一Biotin标记的单抗抑制为100％，以已知无关单抗对标记单抗的抑制为阴性对照，计算各单抗间的抑制率。即抑制率为(1-测定值A450/阴性对照值A450)×100。抑制率＞75％为相关，＞50％为不完全相关，＜50％为不相关，＜25％为完全不相关。结果发现，两株单抗之间的抑制率均为0，说明2株单抗不存在相互间的空间位阻。 

3、双抗体夹心ELISA法单克隆抗体最佳配对的筛选和ELISA参数的优化 

将腹水纯化的2株单克隆抗体用于进行一组矩阵格式实验以选出最适合于建立夹心ELISA法中用作捕获和标记的单克隆抗体对。简单地说，用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化的2株杂交瘤细胞(编号为V1C12A1，G2C51A2)衍生而来的腹水包被96孔板，以前述制备的PRRSV核衣壳重组蛋白抗原、PRRSV疫苗(ch-1a株)、及扩增培养的PRRSV上清，作为抗原筛选抗体对。Biotin标记2株单克隆抗体，采用矩阵格式，也就是上述2株单克隆抗体将每株进行包被作为捕获或混合包被作为捕获，分别与每一株Biotin标记单克隆抗体进行配对，以快 速筛选夹心ELISA中捕获和标记的单克隆抗体对。初步实验显示单克隆抗体V1C12A1作为捕获抗体，与Biotin标记G2C51A2单克隆抗体配对时，可产生较强的信号。而在此基础上，分别组合上述2株单克隆抗体进行捕获的抗体和标记的抗体的配对，以信号强度和特异性而言，用V1C12A1作为捕获的单克隆抗体，用G2C51A2抗体作为标记的单克隆抗体，产生最强的信号。 

例2本发明检测PRRSV的双抗体夹心ELISA试剂盒 

1、检测PRRSV的双抗体夹心ELISA试剂盒由以下试剂组成： 

包被单抗V1C12A1的微孔反应板 

样品处理液：4％乙二胺四乙酸(PH 7.0)，即称取乙二胺四乙酸40g，溶于1L蒸馏水中，NaOH调PH值至7.0，保存于4℃； 

生物素结合物：Biotin标记的单抗G2C51A2； 

酶标亲和素：Avidin-HRP 

浓缩洗液：含有2％Tween-20的20×PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH2PO4，58.02gNa2HPO4.12H2O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌后，加入20ml Tween-20搅匀，使用时20倍稀释； 

阳性对照：PRRSV重组核衣壳蛋白 

阴性对照：含0.1％Tween-20的10mM PH7.4PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH₂PO₄，58.02g Na₂HPO₄.12H₂O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌，20倍稀释后加入0.1％Tween-20； 

显色液：由显色液A和B组成，使用时取二者等量混匀使用。其中显色液A、B的组成成分如下： 

显色液A： 

将0.89g柠檬酸和0.16g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃ 30min后，降至90℃后加TMB 0.25g，摇匀于4℃闭光保存； 

显色液B： 

将9.33g柠檬酸和14.6g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃ 30min后，降至90℃后加0.75％过氧化氢尿素12.8ml，摇匀于4℃闭光保存； 

终止液：1M H₂SO₄； 

其中， 

包被单抗V1C12A1的微孔反应板的制备方法是：将本发明单抗V1C12A1用50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释至10μg/ml，用0.1ml/孔包被聚苯乙烯96微孔板，于4℃过夜。拍干后，每孔加入0.3ml的0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液，于4℃过夜以封闭非特异性结合位 点。甩干板条，真空干燥12～24h，用铝膜袋真空包装4℃保存备用； 

生物素结合物的制备方法是：将2.2mg生物素溶解于500μl蒸馏水中，混匀；取2mg抗体以1×PBS稀释至1ml混合30μl溶解的生物素，混匀后冰浴4℃冰箱作用3h，并于1×PBS 4℃透析过夜，换液三次。收集结合物加入50％甘油保护剂，最后用磷酸盐缓冲液稀释1000倍，即可。 

2、使用方法： 

组织标本需经样品处理液研磨处理而分泌物及血清标本直接用于检测，加100μl于V1C12A1包被的聚苯乙烯96孔微量测试板中，每份样品设复孔，同时设阴对照和阳性对照，37℃温育1h，浓缩洗涤液20倍稀释后洗涤板条，洗板四次后，加入生物素结合物，100μl/孔，26℃温育30min，洗板四次后，加入酶结合物，100μl/孔，37℃30min，同上洗板八次后，加显色液(显色液A和B等量混合，现用现配)，100μl/孔，室温避光10min后，加入终止液，100μl/孔，终止反应。 

3、结果判定： 

以空白孔调零，于450nm波长测定A值。 

CUT OFF值＝0.15+阴性对照平均值 

如待测标本A450值≥CUT OFF值，则判为阳性，反之，如待测标本A450值＜CUT OFF值，则判为阴性。 

当阳性对照A450值低于1.0或阴性对照A450值高于0.3，检测结果无效。 

4、检测PRRSV的双抗体夹心ELISA试剂盒对各标本病毒分离上清及其他常见猪易感病毒的特异性 

将疑感染PRRSV的猪肺组织以标本处理液研磨取上清，抑或取血清标本500μl于1mlMEM培养基中，混匀后用0.22μm滤器过滤后加入含有50-60％MA-104细胞的培养瓶中，置于37℃、5％CO2的培养箱中。每隔20min摇晃一次，1h后加入1.5ml含10％FBS的MEN培养基，37℃、5％CO2的培养箱中至细胞出现病变，获取培养上清。按照本实施，例2的方法检测上述各种培养液上清。结果如表3所示，本发明试剂盒对5份猪肺组织研磨液及4份血清标本，病毒分离培养后都有特异性反应，而与常见的其他猪易感病毒，如伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)无交叉反应。 

表3本发明试剂盒对各培养上清的特异性 

注：L1-L5：感染PRRSV猪肺组织进行研磨后病毒分离上清；S1-S4：PRRSV猪感染血清；PRV：伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)培养上清；FMDV：口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus，FMDV)培养上清；MA-104：罗猴肾细胞系MA-104培养上清。 

5、本发明检测PRRSV的双抗体夹心ELISA试剂盒与IDEXX抗体检测试剂盒及RT-PCR方法对各血清标本检测比较 

对三种PRRSV核衣壳蛋白相关检测方法做比较，以本发明的PRRSV核衣壳蛋白抗原检测试剂盒，购买美国IDEXX猪繁殖与呼吸综合症病毒核衣壳蛋白抗体检测试剂盒，同时设计检测PRRSV核衣壳蛋白基因的引物，上游引物(nt 15036-15056)；5’-GGGGAATGGCCAGYCAGTCAA-3’和下游引物(nt 15148-15170)；5’-GCCAGRGGAAAATGKGGCTTCTC-3’，共135bp。利用三种方法同时对466份猪血清样本做检测，结果(详见表4)显示三种检测方法均阳性47份，均阴性88份；仅IDEXX Ab Test阳性的291份；仅NP-Ag阳性3份；仅NP-RTPCR阳性2份；NP-Ag及IDEXX Ab Test阳性而NP-RTPCR阴性14份，NP-RTPCR及NP-Ag阳性而IDEXX Ab Test阴性4份，NP-RTPCR及IDEXX Ab Test阳性而NP-Ag阴性17份。从以上结果表明，血清样本中出现抗原抗体共存的状态，另外IDEXX Ab Text检测NP抗体阳性率(79.18％，369/466)明显高于前面两种抗原检测方法，很难去分清是疫苗免疫产生的抗体抑或是感染病毒所至，另外循环抗体的产生及消失都有一定的时间限制，故此方法很难用于早期诊断及后期的监控。而对照RT-PCR检测结果本发明的PRRSV核衣壳蛋白抗原检测试剂盒，符合率为72.9％(51/70)亦具有较高的符合率。 

表4IDEXX Ab Test VS NP-Ag VS RT-PCR 

注：NP-Ag是指用本发明试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合症病毒核衣壳蛋白抗原，NP-RTPCR为用RT-PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合症核衣壳蛋白基因。 

例3本发明检测PRRSV N蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒对欧洲株PRRSV N蛋白的分析 

1、欧洲株猪繁殖与呼吸综合症病毒核衣壳蛋白的制备： 

查找Gene Bank利用基因合成技术，完成欧洲株PRRSV N蛋白基因序列(与ch-1a同源性为63％)的合成(M96262，Lelystad virus)，同时构建进入PGEX-5X-3原核表达系统，1MIPTG，28℃诱导表达其核衣壳蛋白，并纯化获得该蛋白(图4所示)，于-80℃储存备用。 

2、本发明所涉及的两株单抗对欧洲株PRRSV N蛋白的检测 

以纯化获得的欧洲株PRRSV N蛋白进行SDS-PAGE电泳，并转印PVDF膜，10％脱脂奶4℃放置过夜，分别以无关单抗，本发明的两株单抗V1C12A1和G2C51A2，及抗PRRSV多抗血清，与PVDF膜上的N蛋白结合，室温摇晃1h，PBST洗涤5次，3min/次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，以1∶1000稀释，室温摇晃30min，再以PBST洗涤5次，3min/次，加入ECL试剂，X-ray曝光显像(图5所示). 

此外，我们以纯化的欧洲株PRRSV N蛋白包被微孔反应板，具体制备方法是：将制备的欧洲株PRRSV N蛋白用50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释至1μg/ml，用0.1ml/孔包被聚苯乙烯96微孔板，于4℃过夜。拍干后，每孔加入0.3ml的0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液，于4℃过夜以封闭非特异性结合位点。甩干板条，真空干燥12～24h，用铝膜袋真空包装4℃保存备用。 

同时稀释本发明两株单抗V1C12A1和G2C51A2至10μg/ml，加100μl于上述包被的聚苯乙烯96孔微量测试板中，每份样品设复孔，同时设阴对照和阳性对照，37℃温育1h，浓缩洗涤液20倍稀释后洗涤板条，洗板四次后，加入生物素结合物，100μl/孔，26℃温育30min，洗板四次后，加入酶结合物，100μl/孔，37℃30min，同上洗板八次后，加显色液(显色液A和B等量混合，现用现配)，100μl/孔，室温避光10min后，加入终止液，100μl/ 孔，终止反应。 

表5：PRRSV核衣壳蛋白单克隆抗体与欧洲株PRRSV核衣壳蛋白抗原反应间接ELISA结果 

3、本发明检测PRRSV N蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒检测欧洲株以美洲株PRRSV N蛋白的灵敏度分析 

梯度稀释欧洲株及美洲株PRRSV N蛋白，从0.1ng-1000ng，以同样梯度稀释的BSA作为对照，加100μl于V1C12A1包被的聚苯乙烯96孔微量测试板中，每份样品设复孔，同时设阴对照和阳性对照，37℃温育1h，浓缩洗涤液20倍稀释后洗涤板条，洗板四次后，加入生物素结合物，100μl/孔，26℃温育30min，洗板四次后，加入酶结合物，100μl/孔，37℃ 30min，同上洗板八次后，加显色液(显色液A和B等量混合，现用现配)，100μl/孔，室温避光10min后，加入终止液，100μl/孔，终止反应。结果显示，本发明检测PRRSV N蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒能够检测到欧洲株及美洲株PRRSV N蛋白的最低浓度分别为20ng/ml和5ng/ml，结果见图6所示。 

Claims (6)

1.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测抗体，该抗体由保藏号为CCTCCNO.C200851的杂交瘤细胞株G2C51A2分泌得到。

2.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的捕获抗体，该抗体由保藏号为CCTCCNO.C200850的杂交瘤细胞株V1C12A1分泌得到。

3.一种产生权利要求1所述抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号是CCTCC NO.C200851。

4.一种产生权利要求2所述抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号是CCTCC NO.C200850。

5.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，该试剂盒包括检测抗体和捕获抗体，其特征在于所述的检测抗体是权利要求1所述的单克隆抗体，所述的捕获抗体是权利要求2所述的单克隆抗体。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒是双抗体夹心ELISA试剂盒。

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