猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株RT-PCR试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术,尤其涉及动物疫病的预防控制。
背景技术
2006年6月份以来,我国多个省份的养猪场、户爆发猪“高热病”疫情,据不完全统计,在6~9月份,我国共有发病猪约200万头,死亡40余万头,给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。申请人研究发现,猪“高热病”疫情的原发病因是猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(Nsp21594~1680变异株),并分离鉴定了该病毒(分类命名:繁殖与呼吸综合征病毒;拉丁文学名:Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus,PRRSV;保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);保藏日期:2007年3月9日;保藏编号:CGMCC No.1964)。
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以母猪发热、流产,断奶前、后的仔猪死亡率升高,不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。1991年,荷兰学者Terpstra等人在感染猪体内分离到欧洲型PRRSV,命名为Lelystad病毒(Lv);同年,美国学者Benfield等人分离到美洲型PRRSV,命名为VR-2332。近年来,我国学者相继分离鉴定了美洲型PRRSV的CH-1a、S1、HB-1和HB-2等毒株。PRRSV为单股正链RNA病毒,包含8个开放阅读框(ORFs),其中ORF1编码有关RNA复制和转录的蛋白。NSP2属非结构蛋白,位于ORF1区,可能与PRRSV的嗜细胞性和嗜组织性有关。ORF5编码的糖蛋白GP5是主要的保护性抗原,可以诱导细胞凋亡和参与PRRSV粒子与受体的结合;PRRSV的变异分布于整个基因组,但以NSP2基因和ORF5基因变异最大。PRRSV美国分离株MN184和我国分离株HB-2,其NSP2均缺失数量不等的氨基酸;不同的PRRSV分离株,其GP5氨基酸序列存在数量不等的点突变。
2006年9月,申请人研究发现,全国各地发生的猪“高热病”的病原均为NSP2基因缺失第1441~1443位核苷酸和第1594~1680位核苷酸的美洲型PRRSV,该病毒的致病力超过已知的PRRSV强毒株。申请人针对该病毒建立了特异性RT-PCR检测方法,用于诊断和检测该病毒感染。
此前,我国尚无PRRSV超强变异株(NSP21594~1680变异株)的特异检测技术。常规RT-PCR技术不能区分PRRSV超强变异株(Nsp2 1594~1680变异株)和非变异毒株,因此不能特异地检测猪PRRSV超强变异株(Nsp2 1594~1680变异株);基因测序技术可以鉴定该病毒,但需要至少4天时间才能够鉴定出本病毒。
本发明针对PRRSV超强变异株的基因在Nsp21594~1680位核苷酸发生缺失的特征,根据缺失位点的上、下游的核苷酸序列,设计一系列PCR引物,采用RT-PCR方法扩增Nsp2基因,通过检测扩增片段的分子量大小,判断是否存在Nsp21594~1680位核苷酸发生缺失的超强变异病毒株,从而特异、敏感、省时、省力、低成本地检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594~1680变异株)。目前其他RT-PCR方法不能解决该问题;基因测序技术需要时间较长,且费时、费力、成本高。因此,该技术可对PRRSV超强变异株的诊断和监测起到重要作用。
发明内容
本申请涉及的猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(NSP2 1594~1680变异株),保藏信息如下:
分类命名:猪繁殖与呼吸综合征病毒
拉丁文学名:Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV
保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)
地址:北京市海淀区中关村北一条13号,中国科学院微生物研究所
保藏日期:2007年3月9日
保藏编号:CGMCC No.1964
理化特性该病毒直径40~80nm、为有囊膜的球形或椭圆形病毒粒子。不能凝集恒河猴、猪、犬、家兔、豚鼠、SD大鼠、Balb/c小鼠、鸡、人O型的红细胞。
培养特性病毒可在Marc-145细胞中培养增殖,并产生CPE(细胞聚集、隆起、细胞轮廓模糊、变圆、皱缩、核固缩,呈灶状脱落),在PK-15、ST、BHK21、VERO、MDCK等其他5种细胞上均不产生CPE。
分离鉴定:
该病毒分离自江西省病死猪脑组织。将病死猪脑组织样品接种在PK-15细胞单层上,37℃温箱静置培养、观察7天,待出现细胞病变时收获培养物,-70℃保存。
负染电镜观察可见直径约50nm、具有囊膜的球形病毒粒子;超薄切片电镜观察结果可见细胞浆内聚集有大量典型的球形、椭圆星病毒粒子,直径40~80nm不等。
经RT-PCR鉴定和单克隆抗体中和试验,鉴定为美洲型PRRSV。全基因测序结果表明,除去Poly A尾,病毒全基因长度为15320bp,与美洲型PRRSV HB-1(sh)毒株的同源性最高,为96.5%。该病毒毒株与美洲型PRRSV标准株(VR-2332株)比较,其NSP2基因缺失第1441~1443位核苷酸和第1594-1680位核苷酸。
致病性病毒接种5头21日龄仔猪,10天内5头全部发病死亡,其临床症状和大体剖检变化与临床发病猪基本相似,用RT-PCR和病毒分离试验可以检测和回收到病毒。接种2月龄猪29头,发病率100%,病死率57%。因此,该病毒与此前常见的PRRSV强毒相比,致病力显著提高,可称为PRRSV超强变异株。
本申请涉及针对PRRSV超强变异株的NSP2基因的第1594~1680位核苷酸缺失片断设计的引物对,用于检测猪“高热病”病原PRRSV超强变异株(NSP21594~1680变异株)。
该引物对是含有下列核苷酸序列(或其反义互补序列)中任意截取的、长度在5-60个核苷的寡核苷酸,或其衍生物。
包括上游引物SEQ ID NO:1和下游引物SEQ ID NO:2,见图1和图2。
优选的,上游引物:
SEQ ID NO:3:5′-AAGCCTGTCCCYGCYCCGCGCA-3′
SEQ ID NO:4:5′-GGTTCGGAAGAAACTGTCGGTGGT-3′
SEQ ID NO:5:5′-TAACGGTTCGGAAGAAACTGTC-3′
SEQ ID NO:6:5′-GTCCTAACGGTTCGGAAGAAAC-3′
SEQ ID NO:7:5′-GTCCTAACGGTTCGGAAGAAACT-3′
优选的,下游引物:
SEQ ID NO:8:5′-GAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT-3′
SEQ ID NO:9:5′-CARGGAGCTGCTTGATGACAC-3′
SEQ ID NO:10:5′-CTGCGAYGGTGCTAGGGGGAAAG-3′
SEQ ID NO:11:5′-GAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT-3′
SEQ ID NO:12:5′-GAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT-3′
本申请还提供一种能够特异、敏感、省时、省力、低成本地检测出PRRSV超强变异株(Nsp21594~1680变异株)的RT-PCR试剂盒以及一种检测PRRSV超强变异株(Nsp21594~1680变异株)的方法。
一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株的试剂盒,包括如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对。
进一步的,一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株的试剂盒,包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8;SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12所示的引物对。
具体的,该试剂盒包括:
1.RNA提取试剂:由醋酸钠溶液350μl,酚/氯仿/异戊醇混合液3.5ml,异丙醇3.5ml,75%乙醇12ml,无菌DEPC水450μl,RNA酶抑制剂24μl组成。
2.RT-PCR反应试剂:由RT反应液200μl(含反转录引物序列:RT引物5’-TCgCCCTAAT-3’)、RNA酶抑制剂24μl、AMV反转录酶12μl、PCR反应液200μl、0.5U/μL Taq DNA聚合酶25μl、矿物油300μl组成。
3.电泳检测试剂:包括50×TAE电泳缓冲液20ml、溴化乙锭溶液100μl、上样缓冲液50μl。
4.阴性对照350μl、阳性对照350μl、变性液7ml。
以上试剂的基本制备方法为:
1)RNA酶抑制剂购自Promega公司,250μL/管,50U/μL。
2)AMV反转录酶购自Promega公司,1000μL/管,10U/μL。
3)Taq DNA聚合酶购自Promega公司Taq DNA聚合酶,100U/管,5U/μL。将Taq DNA聚合酶与无菌DEPC水以1∶9体积比混合,混匀。
4)RT反应液按下列配方配制:
A)无菌DEPC水8μL
B)2.5mmol/L dNTP2μL(购自Promega公司,dATP、dCTP、dGTP、dTTP(统称为dNTP)浓度均为100mmol/L。将dATP、dCTP、dGTP、dTTP等体积混匀后,再用DEPC水稀释10倍,即为制备的2.5mmol/L dNTP)
C)16pmol/μL RT引物液2μL,RT引物用700μL/OD无菌DEPC水溶解,即为16pmol/μL RT引物溶液。
引物序列:RT引物5’-TCgCCCTAAT-3’
D)5倍RT缓冲液4μL(购买Promega公司的AMV反转录酶时,附带的产品,2mL/管)。
5)PCR反应液按下列配方配制:
A)无菌DEPC水8μL
B)2.5mmol/L dNTP2μL
C)8pmol/μL PCR引物混合液2μL。上游引物用256μL/OD无菌DEPC水溶解,下游引物用294μL/OD灭菌DEPC水溶解。等体积混合上游引物和下游引物溶液,即为每条引物浓度为8pmol/μL PCR引物溶液。
D)15mmol/L MgCl22μL,购买Promega公司的Taq DNA聚合酶时,附带的产品,规格为750μL/管,取750μL MgCl2溶液加入500μL灭菌DEPC水即为15mmol/L MgCl2溶液。
E)10倍PCR缓冲液2μL,购买Promega公司的Taq DNA聚合酶时,附带的产品,50μL/管。
6)电泳上样缓冲液:溴酚蓝0.2g,加双蒸水10mL过夜溶解。50g蔗糖加入50mL水溶解后,移入已溶解的溴酚蓝溶液中,摇匀用双蒸馏水定容至100mL。
本申请还提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株的方法,包括:
1.样品处理:
组织样品处理:称取待检组织0.5g置研磨器中剪碎并研磨,加入1.5mL PBS(pH7.2)继续研磨。取已研磨好的待检组织液,置1.5mL灭菌离心管中,8000g离心5min,取上清100μL,再加入300μL变性液,混匀。
血清样品处理:取血清100μL,置1.5mL灭菌离心管中,加入300μL变性液,混匀。
阳性对照样品处理:取阳性对照样品100μL,置1.5mL灭菌离心管中,加入300μL变性液,混匀。
阴性对照样品处理:取阴性对照100μL,置1.5mL灭菌离心管中,加入300μL变性液,混匀。
2.病毒提取RNA:取已处理的待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品,每管依次加入醋酸钠溶液30μL、酚/氯仿/异戊醇混合液300uL,颠倒10次,混匀冰浴15min,4℃13000g离心15min。取300μL上清置于新的经无菌DEPC水处理过的1.5mL灭菌离心管中,加入300μL异丙醇,混匀,置液氮3min或-70℃冰箱中30min。室温融化,4℃20000g离心20min。弃上清,沿离心管开口方向管壁缓缓滴入-20℃预冷的75%乙醇溶液1mL,轻轻旋转一周后倒掉,将离心管倒扣于吸水纸上1min,真空抽干15min(以无乙醇味为准)。用9μL无菌DEPC水和1μL RNA酶抑制剂沿离心管开口相反方向溶解沉淀,备用。
3.RT操作:RT反应液体系配制,N个检测样品反应体系配制为:取16×(N+3)μl RT反应液(用前融化,混匀)、(N+3)μl RNA酶抑制剂、(N+3)μl反转录酶,混匀。取N+2个0.2ml薄壁PCR管作好标记,将配制的混合液以每管18μl分配至薄壁PCR管中。根据标记分别加入2μl提取的样品RNA(一份样品换用一个吸头),其中2管分别加入2μl阳性对照和阴性对照样品RNA,混匀。将0.2ml薄壁PCR管放置在PCR扩增仪上进行以下温度控制程序:42℃60min,98℃5min。
4.PCR操作:PCR反应液体系配制,N个检测样品反应体系配制为:取16×(N+3)μl PCR反应液(用前融化,混匀)、2(N+3)μl 0.5U/μl Taq DNA聚合酶,混匀。取N+2个0.2ml薄壁PCR管作好标记,将配制的混合液以每管18μl分配至薄壁PCR管中。根据标记分别加入2μl cDNA模板(一份样品换用一个吸头),混匀。加入矿物油一滴(约15μl)覆盖。将0.2mL薄壁PCR管放置在PCR扩增仪上进行以下温度控制程序:94℃30s、55℃30s、72℃30s循环,35个循环后,72℃延伸10min。
5.电泳:称4g琼脂糖置500mL锥形瓶中,加入1倍TAE电泳缓冲液200mL(取4mL 50×TAE电泳缓冲液,用双蒸水稀释至200mL),于微波炉中或电热器上熔解,再加入20μL溴化乙锭溶液混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物15μL混合3μL上样缓冲液,加样于琼脂糖凝胶孔中,以5V/cm电压电30min,紫外灯下观察结果,照相。
6.判定变异株的方法
被检样品出现一条与阳性对照病毒(PRRSVNSP21594~1680变异株)大小相同的扩增片段,判定为PRRSV超强变异株阳性。
被检样品出现与阳性对照病毒(PRRSVNSP21594~1680变异株)大小不同的扩增片段,或不出现扩增片段,判定为PRRSV超强变异株阴性。
附图说明
图1:SEQ ID NO:1
图2:SEQ ID NO:2
图3:RT-PCR检测部分省(市)PRRSV超强变异株(NSP21594~1680变异株)的电泳结果。
具体实施方式
实施例1
一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒,按下表组装:
表1试剂盒组成
成分(10份/盒) |
含量 |
阴性对照 |
350μl×1管 |
阳性对照 |
350μl×1管 |
变性液 |
7ml×1瓶 |
醋酸钠溶液 |
350μl×1管 |
酚/氯仿/异戊醇混合液 |
3.5ml×1瓶 |
异丙醇 |
3.5ml×1瓶 |
75%乙醇 |
12ml×1瓶 |
无菌DEPC水 |
450μl×1管 |
RNA酶抑制剂 |
24μl×1管 |
RT反应液 |
200μl×1管 |
PCR反应液 |
200μl×1管 |
AMV反转录酶 |
12μl×1管 |
0.5U/μLTaqDNA聚合酶 |
25μl×1管 |
矿物油 |
300μl×1管 |
50×TAE电泳缓冲液 |
20ml×1瓶 |
溴化乙锭溶液 |
100μl×1管 |
上样缓冲液 |
50μl×1管 |
使用说明书 |
一份 |
1病毒株:
病毒株背景:制造本品使用PRRSV超强变异株(NSP21594~1680变异株)--NVDC-JXA1分离株作为阳性对照。
保存:在本试验室PRRSV超强变异株NVDC-JXA1分离株已用Marc-145细胞传代3次;-70℃以下,保存期为24个月。
1.1阴性对照样品的制备
取灭菌的DEPC水,置-20℃冰箱保存。
1.2阳性对照样品的制备
将Marc-145细胞培养的PRRSV超强变异株NVDC-JXA1分离株,60℃灭活30min,用合格的本试剂盒检测,出现特异的扩增带,为阳性。其余的培养毒放于-70℃保存备用。
2试剂盒中其他成分的制造
2.1变性液的制备
购自Promega公司Reagent Total RNA Isolation Kit中的组份,120mL/瓶。
2.2醋酸钠溶液的制备
购自Promega公司Reagent Total RNA Isolation Kit中的组份,10mL/瓶。
2.3酚/氯仿/异戊醇混合液的制备
购自Promega公司Reagent Total RNA Isolation Kit中的组份,100mL/瓶。
2.4异丙醇的制备
购自Promega公司Reagent Total RNA Isolation Kit中的组份,100mL/瓶。
2.5无菌DEPC水的制备
纯化水的制备
用双蒸馏水,经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化,要求纯化水的电阻率≥18.2MΩ.cm,贮于无菌瓶中。
无菌DEPC水的制备:
Millipore-Q纯化水加入DEPC至终浓度为0.1%,37℃搅拌处理12h,
151bf/in2(1.034×105Pa)高压蒸汽灭菌15min。
2.675%乙醇的制备
取无水乙醇750mL,加入DEPC水250mL,混匀。
2.7RNA酶抑制剂的制备
购自Promega公司,250μL/管,50U/μL。
2.8AMV反转录酶的制备
购自Promega公司,1000μL/管,10U/μL。
2.9RT反应液的制备和检验
按下列配方配制RT反应液
无菌DEPC水 8μL
2.5mmol/L dNTP 2μL
16pmol/μL RT引物液 2μL
5倍RT缓冲液 4μL
混匀后,用0.22μm滤膜过滤。-20℃保存,检验合格后分装,用于成品试剂盒。
2.10PCR反应液制备:
按下列配方配制PCR反应液
无菌DEPC水 8μL
2.5mmol/L dNTP 2μL
8pmol/μL PCR引物混合液 2μL
15mmol/L MgCl2 2μL
10倍PCR缓冲液 2μL
混匀后,用0.22μm滤膜过滤。-20℃保存,检验合格后分装,用于成品试剂盒。
2.11 0.5U/μL Taq DNA聚合酶的制备
购自Promega公司Taq DNA聚合酶,100U/管,5U/μL。将Taq DNA聚合酶与无菌DEPC水以1∶9体积比混合,混匀。
2.12 50×TAE电泳缓冲液的制备
0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)配制
EDTA 18.61g
灭菌双蒸水 80mL
氢氧化钠 调pH至8.0
灭菌双蒸水 加至100mL
50×T AE电泳缓冲液配制
三羟甲基氨基甲烷(Tris) 242g
冰乙酸 57.1mL
0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0) 100mL
灭菌双蒸水 加至1000mL
使用时灭菌双蒸水稀释50倍。
2.13溴化乙锭溶液制备
溴化乙锭 0.2g
灭菌双蒸水 加至20mL
2.14上样缓冲液的制备
溴酚蓝0.2g,加双蒸水10mL过夜溶解。50g蔗糖加入50mL水溶解后,移入已溶解的溴酚蓝溶液中,摇匀用双蒸馏水定容至100mL。
2.15矿物油的制备
购自Sigma公司,500mL/瓶。
实施例2
一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp21594~1680变异株)的方法,包括:
1.样品处理:
组织样品处理:采集19个省(市)154头疑似“高热病”发病猪的肺、扁桃体、脑等脏器组织或血清样品,称取待检组织0.5g置研磨器中剪碎并研磨,加入1.5mL PBS(pH 7.2)继续研磨。取已研磨好的待检组织液,置1.5mL灭菌离心管中,8000g离心5min,取上清100μL,再加入300μL变性液,混匀。
血清样品处理:取血清100μL,置1.5mL灭菌离心管中,加入300μL变性液,混匀。
阳性对照样品处理:取阳性对照样品100μL,置1.5mL灭菌离心管中,加入300μL变性液,混匀。
阴性对照样品处理:取阴性对照100μL,置1.5mL灭菌离心管中,加入300μL变性液,混匀。
2.病毒提取RNA:取已处理的待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品,每管依次加入醋酸钠溶液30μL、酚/氯仿/异戊醇混合液300μL,颠倒10次,混匀冰浴15min,4℃13000g离心15min。取300μL上清置于新的经无菌DEPC水处理过的1.5mL灭菌离心管中,加入300μL异丙醇,混匀,置液氮3min或-70℃冰箱中30min。室温融化,4℃20000g离心20min。弃上清,沿离心管开口方向管壁缓缓滴入-20℃预冷的75%乙醇溶液1mL,轻轻旋转一周后倒掉,将离心管倒扣于吸水纸上1min,真空抽干15min(以无乙醇味为准)。用9μL无菌DEPC水和1μL RNA酶抑制剂沿离心管开口相反方向溶解沉淀,备用。
3.RT操作:RT反应液体系配制,N个检测样品反应体系配制为:取16×(N+3)μl RT反应液(用前融化,混匀)、(N+3)μl RNA酶抑制剂、(N+3)μl反转录酶,混匀。取N+2个0.2ml薄壁PCR管作好标记,将配制的混合液以每管18μl分配至薄壁PCR管中。根据标记分别加入2μl提取的样品RNA(一份样品换用一个吸头),其中2管分别加入2μl阳性对照和阴性对照样品RNA,混匀。将0.2ml薄壁PCR管放置在PCR扩增仪上进行以下温度控制程序:42℃60min,98℃5min。
4.PCR操作:PCR反应液体系配制,N个检测样品反应体系配制为:取16×(N+3)μl PCR反应液(用前融化,混匀)、2(N+3)μl0.5U/μl Taq DNA聚合酶,混匀。取N+2个0.2ml薄壁PCR管作好标记,将配制的混合液以每管18μl分配至薄壁PCR管中。根据标记分别加入2μl cDNA模板(一份样品换用一个吸头),混匀。加入矿物油一滴(约15μl)覆盖。将0.2mL薄壁PCR管放置在PCR扩增仪上进行以下温度控制程序:94℃30s、55℃30s、72℃30s循环,35个循环后,72℃延伸10min。
5.电泳:称3g琼脂糖置500mL锥形瓶中,加入1倍TAE电泳缓冲液200mL(取4mL 50×TAE电泳缓冲液,用双蒸水稀释至200mL),于微波炉中或电热器上熔解,再加入20μL溴化乙锭溶液混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物15μL混合3μL上样缓冲液,加样于琼脂糖凝胶孔中,以5V/cm电压电30min,紫外灯下观察结果,照相。
6.判定变异株的方法
被检样品出现一条与阳性对照病毒(PRRSVNSP21594~1680变异株)大小相同的扩增片段,判定为PRRSV超强变异株阳性。
被检样品出现与阳性对照病毒(PRRSV NSP21594~1680变异株)大小不同的扩增片段,或不出现扩增片段,判定为PRRSV超强变异株阴性。
结果
19省(市)的154头猪“高热病”发病猪的样品均为PRRSV(NSP21594~1680变异株)阳性,其RT-PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳可见特异性扩增片段的条带,大小约400bp,与阳性对照的扩增片段大小一致。
实施例3
灵敏度和敏感度试验
1.材料
猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株的分离毒株共5株:PRRSV/HEB1/2006、PRRSV/JXB2/2006、PRRSV/HBB1/2006、PRRSV/NM1/2006和PRRSV/HNXTA3/2006。作为猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp21594~1680变异株)RT-PCR检测试剂盒的敏感性质控样品。
2方法
2.1灵敏度试验
取PRRSV分离株PRRSV/JXB2/2006,稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594~1680变异株)RT-PCR检测试剂盒检测每个稀释度样品。
2.2敏感性试验
用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594~1680变异株)RT-PCR检测试剂盒检测5株临床上分离鉴定过的猪繁殖与呼吸综合征病毒,重复检测3次。考查试剂盒检测不同来源猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594~1680变异株)的敏感性。
3结果
3.1灵敏度试验结果
RT-PCR对不同浓度的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594-1680变异株)的检测结果见表2。RT-PCR检测试剂盒可以检出10-3稀释的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594-1680变异株)细胞培养毒。
表2灵敏度试验结果
3.2敏感性试验结果
用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594~1680变异株)RT-PCR检测试剂盒检测5株临床上分离鉴定过的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594~1680变异株),结果全部为阳性(见表3)。
表3敏感性试验结果
试验批次 |
PRRSV/HEB1/2006 |
PRRSV/JXB2/2006 |
PRRSV/HBB1/2006 |
PRRSV/NM1/2006 |
PRRSV/HNXTA3/2006 |
1 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
2 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
3 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
实施例4
特异性试验
1材料
1.1样品
1.1.1其它猪易感病毒毒株:日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),由本单位保存。
1.1.22份SPF猪肺和血清。
1.1.3PRRSV标准株(VR2332毒株)和PRRSV标准株(LV毒株)。
2方法
2.1特异性试验方法
用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp21594~1680变异株)RT-PCR检测试剂盒检测6株其它猪易感病毒毒株,2份SPF猪肺和血清,2份PRRSV标准株VR2332毒株和LV毒株。考查试剂盒检测不同样品的特异性。
3结果
3.1检测其它猪易感病毒毒株、SPF猪样品和其它猪繁殖与呼吸综合征病毒结果
用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp21594~1680变异株)RT-PCR检测试剂盒其它猪易感病毒毒株、SPF猪样品和其它猪繁殖与呼吸综合征病毒,结果均为阴性,结果见表4。
表4特异性试验检测结果
被检样品 |
RT-PCR检测结果 |
日本乙型脑炎病毒 |
- |
猪瘟病毒 |
- |
猪细小病毒 |
- |
猪伪狂犬病毒 |
- |
猪圆环病毒 |
- |
猪传染性胃肠炎病毒 |
- |
SPF猪肺 |
- |
SPF猪血清 |
- |
PRRSV标准株VR2332毒株 |
- |
PRRSV标准株LV毒株 |
- |
实施例5
猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(Nsp21594~1680变异株)RT-PCR检测试剂盒与细胞分离培养试验比较
1材料
1.1毒株20株PRRSV超强变异株国内分离株和6株其它猪易感毒株均由中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室保存。
1.2SPF猪肺、血清由中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室保存。
2方法
2.1检测方法
2.1.1RT-PCR检测按试剂盒检测方法进行。
2.1.2病毒分离鉴定参考GB/T 18090-2000《猪繁殖与呼吸综合征诊断方法》中细胞分离培养方法进行。
2.2符合率试验
2.2.1用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp21594~1680变异株)RT-PCR检测试剂盒与细胞分离培养方法检测20株PRRSV分离株。
2.2.2用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp21594~1680变异株)RT-PCR检测试剂盒与细胞分离培养方法检测6株其它猪易感病毒和2份SPF猪样品。
3结果
3.1猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp21594~1680变异株)RT-PCR检测试剂盒与细胞分离培养方法检测20株分离的PRRSV。符合率为95%。
表5PRRSV分离株检测结果
|
测结果 |
法结果 |
PRRSV/JXA1/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/JXB1/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/JXC1/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/JXD1/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/JXD2/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/HBA1/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/HBA2/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/HBB1/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/HBB2/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/HBC1/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/HNYYA1/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/HNYYA2/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/HNYYA11/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/HNYYB1/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/HNXTA1/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/HNXTA3/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/HNXTA5/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/HNXTB1/2006 |
+ |
+ |
PRRSV/NM1/2006 |
+ |
+ |
3.2检测其它猪易感病毒毒株及SPF猪样品与细胞分离培养方法结果
用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp21594~1680变异株)RT-PCR检测试剂盒与细胞分离培养方法分别检测其它猪易感病毒毒株及SPF猪样品,结果所有被检的样品均为阴性,符合率为100%。结果见表5。
表6其它猪易感病毒毒株及SPF猪样品检测结果
被检样品 |
RT-PCR检测结果 |
细胞分离培养方法结果 |
日本乙型脑炎病毒 |
- |
- |
猪瘟病毒 |
- |
- |
猪细小病毒 |
- |
- |
猪伪狂犬病毒 |
- |
- |
猪圆环病毒 |
- |
- |
猪传染性胃肠炎病毒 |
- |
- |
SPF猪肺 |
- |
- |
SPF猪血清 |
- |
- |