CN106755529A - 一种检测猪细菌性肠炎病原的多重pcr特异性引物及其应用 - Google Patents

一种检测猪细菌性肠炎病原的多重pcr特异性引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及动物医学的分子生物学和生产领域，具体涉及检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的多重PCR特异性引物，核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6所示，特异性、重复性好，灵敏度高。本发明还公开了以所述引物建立的检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的方法；能够快速区分大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的单独或混合感染导致的猪肠炎；能够快捷、有效地鉴别诊断，有利于制定针对性的防控措施，对临床生产猪细菌性肠炎的免疫防控，保障养猪生产平稳进行。

Description

一种检测猪细菌性肠炎病原的多重PCR特异性引物及其应用
技术领域
本发明涉及动物医学的分子生物学领域，具体涉及检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的多重PCR特异性引物及其应用。
背景技术
猪细菌性肠炎在临床生产中长期存在，并导致生长速度减慢和大量死亡。引起猪肠炎的病原主要为大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌，其中大肠杆菌导致仔猪黄白痢、断奶仔猪腹泻和肠道水肿等；沙门氏菌导致仔猪副伤寒和育肥猪拉稀等；产气荚膜梭菌导致仔猪红痢和肥猪阶段肠道胀气等。猪细菌性肠炎病程短，传播快，病情发展迅速，死亡率高。
猪大肠杆菌在猪群中引起很多疾病，包括新生仔猪腹泻、断奶仔猪腹泻和肠道黏膜下层水肿。由于发病率、死亡率和体重降低的增加，以及治疗、疫苗和饲料添加剂的成本增加，大肠杆菌引起的腹泻和水肿病造成了巨大的经济损失。
猪沙门氏菌多爆发于断奶的幼崽猪群，临床症状主要表现为小肠结肠炎、腹泻及脱水。本病常发生于感染了大剂量沙门氏菌，免疫抑制，且体质虚弱及卫生条件差的猪群。临床急性发病猪，其排菌可达每克粪便含106个猪霍乱沙门氏菌(Smith HW,JonesJET.1967.J Pathol 93:141-156.)或107个鼠伤寒沙门氏菌(Gutzmann F,Layton H,Simiins K,et al.1976.Am J Vet Res 37:649-655.)。
猪产气荚膜梭菌病在世界范围内流行，其病原梭菌是一类严格厌氧的革兰氏言行产芽胞杆菌，其中引起肠炎的主要为C型和A型产气荚膜梭菌。其中C型产气荚膜梭菌病例通常出现在仔猪出生以后3天，增殖快，世代间隔短，在数小时内，可以增殖到108-109个/g(Ohnuna Y,Kondo H,et al.1992.J Jpn Vet Diagn Invest 14:258-259)，感染仔猪迅速转变为虚脱，勉强运动，然后很快转并为濒死期，多数病例会在出生后12-36h死亡。A型产气荚膜收集是猪肠道内正常微生物区细的组成部分，一旦条件适宜就大量增殖，引起新生仔猪、偶尔也可以引起断奶仔猪的肠道疾病。
大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌这三种病原菌也是人畜共患的感染原，人群极易通过接触或食用带菌的食物而感染，尤其是对老人小孩人群，感染后会引发消化道炎症、出血性腹泻、败血症、伤寒等病症，伤害极大。
目前实验室对大肠杆菌和沙门氏菌进行有氧培养，对产气荚膜梭菌进行厌氧培养，并且分别进行三种病原菌的生化试验或者单病原PCR鉴定。培养过程耗时较长且目标盲目，尤其厌氧培养对硬件和操作熟练度要求高，而单病原PCR鉴定需要对三种病原分别进行检测耗时长试剂使用量大。
综上所述，现有技术还存在较大不足。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的多重PCR特异性引物及利用该引物建立的检测方法，特异性强和敏感性高，可满足临床上简便、快速、准确进行区分鉴定的要求，为临床生产对该病的免疫防控提供依据。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的多重PCR特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6所示。
进一步的，所述引物的模板基因为大肠杆菌uidA1和uidA2基因、沙门氏菌invA1和invA2基因、产气荚膜梭菌clo1和clo2基因。
一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的试剂盒，包含上述多重PCR特异性引物。
进一步的，所述试剂盒还包括：PCR预混液、无菌双蒸水；
所述PCR预混液包括：DNA聚合酶、pH8.3Buffer Tris-HCl、KCl、MgCl2、dNTPMixture。
进一步的，所述特异性引物在猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌检测中的应用。
一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的方法，包括：利用所述引物对待检样品进行PCR扩增；收集扩增产物进行电泳实验；判读电泳结果。
所述PCR反应体系包括：PCR预混液12.5μL、引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各1μL、引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4各0.5μL、引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6各1.5μL、无菌双蒸水6.5μL；
所述引物的浓度均为10pmol；
所述PCR反应条件为：93～95℃预变性5min～10min；93～95℃变性30s，48～56℃退火30s，70～72℃延伸60s，30个循环；最后70～72℃终延伸7min～10min。
进一步的，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min；然后95℃30s，55℃30s，72℃60s，共进行30次循环；最后72℃延伸7min。
进一步的，所述PCR预混液包括：DNA聚合酶1.25U/25μL、pH8.3Buffer Tris-HCl20mM、KCl 100mM、MgCl23mM、dNTP Mixture各0.4mM。
进一步的，所述电泳检测为琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明有益效果：
本发明实施例的有益效果是：本发明根据大肠杆菌uidA基因、沙门氏菌invA基因和产气荚膜梭菌a毒素基因的分析并设计引物能扩增不同长度片段的这一特点，建立一种用多重PCR方法快速鉴别诊断引起猪肠炎性的大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌单独或者混合感染的方法，特异性强和敏感性高，可满足临床上简便、快速、准确进行区分鉴定的要求，为临床生产对该病的免疫防控提供依据。
附图说明
图1：样品检测电泳图，泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别为阴性对照、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌+沙门氏菌、产气荚膜梭菌+大肠杆菌、沙门氏菌+大肠杆菌、产气荚膜梭菌+大肠杆菌+大肠杆菌。
图2：猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌多重PCR扩增方法的特异性检验电泳图，泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别为阴性对照、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪巴氏杆菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌。
图3：猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌多重PCR扩增方法检测大肠杆菌敏感性检验电泳图，泳道1、2、3、4、5、6、7分别表示待检样品中大肠杆菌DNA含量为0、104CFU、105CFU、106CFU、107CFU、108CFU、109CFU。
图4：猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌多重PCR扩增方法检测沙门氏菌杆菌敏感性检验电泳图，泳道1、2、3、4、5、6、7分别表示待检样品中沙门氏菌DNA含量为0、104CFU、105CFU、106CFU、107CFU、108CFU、109CFU。
图5：猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌多重PCR扩增方法检测产气荚膜梭菌敏感性检验电泳图，泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别表示待检样品中产气荚膜梭菌DNA含量为0、103CFU、104CFU、105CFU、106CFU、107CFU、108CFU、109CFU。
图6：猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌多重PCR扩增方法检测模拟猪肠道感染的大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌敏感性检验电泳图，泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别表示待检样品中大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌样本DNA含量各为0、103CFU、104CFU、105CFU、106CFU、107CFU、108CFU、109CFU。
图7：猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌多重PCR扩增方法同时检测大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌敏感性检验电泳图，泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别表示待检样品中混合大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌样本DNA含量各为0、103CFU、104CFU、105CFU、106CFU、107CFU、108CFU、109CFU。
图8：猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌多重PCR扩增方法对产气荚膜梭菌临床分离株XY株、EP株、沙门氏菌临床分离株HS、猪霍乱沙门氏菌C500株和大肠杆菌临床分离株WH株、GL株等样品检测电泳图，泳道1、2、3、4、5、6、7分别表示待检样品分别为产气荚膜梭菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、大肠杆菌和阴性对照。
图9：猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌多重PCR扩增方法对20份临床采集的粪便样本等样品检测电泳图，泳道1～24分别表示待检样品中分别含有：1阴性对照、2～4产气荚膜梭菌、沙门氏菌和大肠杆菌阳性对照、5阴性、6产气荚膜梭菌、7阴性、8产气荚膜梭菌、9阴性、10大肠杆菌、11大肠杆菌、12阴性、13沙门氏菌、14阴性、15沙门氏菌、16阴性、17大肠杆菌、18阴性、19阴性、20大肠杆菌、21产气荚膜梭菌+大肠杆菌、22大肠杆菌、23阴性、24阴性。
具体实施方式
为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。
实施例一
1、引物的设计
ASIMK.BEJ等人研究结果显示编码葡萄糖苷酶uidA基因仅能在大肠杆菌中检测到而不能在其他肠道肠杆菌检测到。Rahn等发现沙门氏菌invA基因广泛分布于沙门氏菌多种血清类型中，这个基因能够编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白，该蛋白与沙门氏菌的致病性有关,几乎分布于所有己知的沙门氏菌中，而在非沙门氏菌中没有发现。产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)分泌的外毒素是其致病因子，根据产生外毒素的种类不同，可分为A、B、C、D和E5个血清型，其中α毒素(C.perfringens alpha toxin，CPA)是各型产气荚膜梭菌产生的共同毒力因子，其能破坏细胞膜的完整性，导致细胞裂解，从而具有细胞毒性、溶血性、致死性和皮肤坏死性等特性。
本发明根据NCBI登陆的猪大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌基因组序列，登录号：猪丹毒弱毒疫苗G4T10毒株(KF150604)和猪丹毒流行株Fujisawa(AP012027)、ATCC19414(AB259654)、GD01(KF177344)提供的信息，根据对大肠杆菌uidA基因、沙门氏菌invA基因和产气荚膜梭菌(clo)a毒素基因的比对分析，设计了如下所述PCR的引物：
使用如上表所述引物进行PCR扩增，可以通过电泳鉴别猪大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌感染，省去培养鉴定的步骤，节省了时间和成本。
2、检测方法
(1)待检样品DNA提取：1mL大肠杆菌培养液、1mL沙门氏菌培养液、1mL产气荚膜梭菌CVCC12-57株培养液按照TIANGEN细菌基因组DNA提取操作步骤进行，提取的DNA放于-20℃保存。
(2)将上述(1)中提取的DNA1μL大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌DNA模板单独、两两混合、三种混合；然后分别加入到装有PCR预混液的PCR管中，均配制成25μL反应体系，并混合均匀。
PCR预混液：Premix Taq(包含DNA聚合酶1.25U/25μL；BufferTris-HCl,pH8.320mM，KCl 100mM，MgCl23mM；dNTP混合物各0.4mM)12.5μL，均购自大连TaKaRa公司；F1和R1(均为10pmol)各1μL、F2和R2(均为10pmol)各0.5μL、F3和R3(均为10pmol)各1.5μL，无菌双蒸水6.5μL。
(3)将步骤(2)的PCR管置于PCR仪上进行循环扩增反应。扩增条件为：95℃预变性10min；然后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，进行30个循环；最后72℃延伸7min。各取5μLPCR反应产物在1％(质量比)的琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。
(4)结果判定：如果PCR产物仅有一条166bp的条带，则表明待检样品为大肠杆菌；如果PCR产物仅有一条449bp的条带，则表明待检样品为沙门氏菌，如果PCR产物仅有一条579bp的条带，则表明待检样品为产气荚膜梭菌，如果PCR产物长度为166bp和449bp，则表明待检样品为大肠杆菌和沙门氏菌；如果PCR产物长度为166bp和579bp，则表明待检样品为大肠杆菌和产气荚膜梭菌；如果PCR产物长度为449bp和579bp，则表明待检样品为沙门氏菌和产气荚膜梭菌；如果PCR产物长度为166bp、449bp和579bp，则表明待检样品为大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌。检测结果见图1和表1。
表1待检样品检测结果
实施例2特异性检验
以存在大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌CVCC12-57株培养液作为阳性对照，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌，和猪巴氏杆菌的培养液进行特异性检测，使用实施例1的方法与引物，结果除阳性对照外均未能扩出任何条带，阳性病料经过PCR分别扩出166bp条带、449bp条带和579bp，见图2，说明本发明引物和检测方法可以验证和鉴别样品中是否含有大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌。
实施例3灵敏度检验
将实施例1中提取得到的大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌CVCC12-57株DNA分别用灭菌双蒸水做10倍的梯度稀释，即109CFU、108CFU、107CFU、106CFU、105CFU、104CFU含量的大肠杆菌、沙门氏菌和109CFU、108CFU、107CFU、106CFU、105CFU、104CFU、103CFU含量的产气荚膜梭菌DNA作为模板，每个稀释度各取1μL作为模板，按实施例1方法对各个病原进行单个病原和三种病原同时存在的情况进行检测，并设阴性对照，观察阳性条带结果，以出现阳性预期条带所用模板量的最高稀释度计算其敏感性，结果表明单个病原大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌最小检出浓度分别为105CFU、105CFU和104CFU，分别见图3、4、5；
取等量实施例1中提取得到的大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌CVCC12-57株DNA混合，然后10倍7个梯度稀释，即为109CFU、108CFU、107CFU、106CFU、105CFU、104CFU、103CFU，三种菌的DNA浓度在同一梯度稀释液中相同，即每种菌在每个梯度混合液中同时达到浓度109CFU、108CFU、107CFU、106CFU、105CFU、104CFU、103CFU。每个稀释度各取1μL作为模板，按实施例1方法进行检测，观察阳性条带，以出现阳性预期条带所用模板量的最高稀释度计算其敏感性，结果表明三种病原同时存在大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌最小检出浓度分别为105CFU、105CFU和104CFU，与单个病原检测时相同，说明本发明引物在有多种病原DNA存在时互相不被干扰，灵敏度依然很高，如图7。
实施例4模拟猪肠道感染灵敏度检验
将大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌混合物各自终浓度均为108CFU的粪便样本做10倍的梯度稀释，即粪便样本中大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌混合物稀释后各自终浓度分别为109CFU、108CFU、107CFU、106CFU、105CFU、104CFU、103CFU，设阴性对照三种菌各自浓度为0。
并利用天根粪便基因组DNA提取试剂盒提取DNA，每个稀释度各取1μL作为模板，按实施例1方法对三种病原同时存在的情况进行检测，观察阳性条带，以出现阳性预期条带所用模板量的最高稀释度计算其敏感性，结果表明能从粪便样本中直接检测到大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌最小检浓度为105CFU、105CFU和104CFU，见图6。
实施例5临床分离株和临床采集的粪便样本的检验
对大肠杆菌临床分离株WH株、GL株，沙门氏菌临床分离株HS、猪霍乱沙门氏菌C500株，产气荚膜梭菌临床分离株XY株、EP株按照实例1中提取DNA进行PCR检测，结果表明该方法可以检测和区分猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌，见图8。
对20份临床采集的粪便样本按照实例4中提取DNA进行检测并同时进行传统的分离培养，结果表明该方法可以检测到猪肠道中感染的大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌，见图9。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
<110> 广东温氏食品集团股份有限公司
<120> 一种检测猪细菌性肠炎病原的多重PCR特异性引物及其应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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Claims (9)

1.一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的多重PCR特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于，所述引物的模板基因为大肠杆菌uidA1和uidA2基因、沙门氏菌invA1和invA2基因、产气荚膜梭菌clo1和clo2基因。
3.一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的特异性引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：PCR预混液、无菌双蒸水；
所述PCR预混液包括：DNA聚合酶、pH8.3Buffer Tris-HCl、KCl、MgCl2、dNTP Mixture。
5.权利要求1或2所述特异性引物在猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌检测中的应用。
6.一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的方法，包括：利用所述引物对待检样品进行PCR扩增；收集扩增产物进行电泳实验；判读电泳结果；
所述PCR反应体系包括：PCR预混液12.5μL、引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各1μL、引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4各0.5μL、引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6各1.5μL、无菌双蒸水6.5μL；
所述引物的浓度均为10pmol；
所述PCR反应条件为：93～95℃预变性5min～10min；93～95℃变性30s，48～56℃退火30s，70～72℃延伸60s，30个循环；最后70～72℃终延伸7min～10min。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：：95℃预变性10min；然后95℃30s，55℃30s，72℃60s，共进行30次循环；最后72℃延伸7min。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述PCR预混液包括：DNA聚合酶1.25U/25μL、pH8.3Buffer Tris-HCl 20mM、KCl 100mM、MgCl2 3mM、dNTP Mixture各0.4mM。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述电泳检测为琼脂糖凝胶电泳检测。
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