CN1955310B - 检测猪链球菌2型的核苷酸序列、检测试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组检测猪链球菌2型的核苷酸序列，如下：1)5’-GAA TCTGAG CTG CAA AAG TGT C-3’；2)5’-GGG CTA TTA AAG ATA CCG CTCAT-3’；3)5’-TCC TAA GTC TCG CAC CTC TTT TAT CTC-3’。本发明进一步提供了一种检测猪链球菌2型的试剂盒及检测方法，属于检验检疫领域。本发明的优点是：1)快速：将传统细菌分离方法的3～7天检测时间缩短为1.5个小时；2)灵敏：将猪链球菌2型培养物稀释到10^-5倍均检出为阳性，灵敏度可达10CFU；3)特异：对于猪链球菌以外的其它细菌的结果为阴性，未发现交叉反应；4)稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；5)安全：全封闭反应，无需PCR后处理，操作安全。

Description

检测猪链球菌2型的核苷酸序列、检测试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及检测猪链球菌2型的核苷酸序列、检测试剂盒和方法，尤指一种快速的荧光PCR检测方法及其试剂，适用于对猪链球菌病爆发疫情进行实时监控，可广泛用于动物产品的进出口及动物食品安全检测，属于检验检疫领域。

背景技术

猪链球菌为动物致病菌，可致猪脑膜炎，败血症，关节炎，心内膜炎，是小猪和架子猪的常见病。本病流行无明显季节性，但有夏、秋季多发，潮湿闷热的天气多发的特点。有时甚至可呈地方性爆发，发病率和死亡率都很高，给畜牧业和国际贸易造成严重的损失。根据荚膜抗原，猪链球菌可分为35个血清型，1/2，1，2，7，9和14是致动物疾病的主要血清型。其中猪链球菌2型是重要的人畜共患病病原，可引起人的脑膜炎，心内膜炎和败血症，特别常发于常与生猪或猪肉产品接触的从业人群，危害性较大。

传统的猪链球菌检测方法为细菌分离法，该方法至少需要3天的时间，耗时长，有必要开发一种快速检测方法。

目前常用的快速检测方法主要是分子生物学方法，包括核酸杂交、等电点电泳、寡核苷酸指纹图谱分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚合酶链式反应、单克隆抗体技术等。

核酸杂交、等电点电泳、寡核苷酸指纹图谱分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、单克隆抗体技术等检测方法适用于对细菌特性进行更加深入的研究，由于整个系统操作复杂、步骤繁多、成本高等原因，不适宜同时进行大批量样本的检测。

普通聚合酶链式反应的RT-PCR方法特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也可以直接检测灭活的核酸片段，样本来源广泛，适用性好，优于免疫学方法和细菌分离法。但是这种方法测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA或RNA的拷贝数。由于PCR的终产物的量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA或RNA的拷贝数，无法做到准确定量。

近年来涌现出的荧光定量PCR技术(也称TaqMan技术)以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析、病原体的定性和定量检测等方面得到广泛应用，并且已经成为了当前病毒核酸定量的主要方法，我们已经将其应用到了禽流感、新城疫病毒的检测领域，取得了很好的技术效果。

TaqMan技术的要点是在普通PCR原有一对特异性引物基础上增加特异性的荧光双标记探针。该探针结合部位位于引物结合区域的中间。探针的5’端和3’端分别标记不同的荧光素，如5’端标记的荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团(用R表示)，3’端标记的荧光素，在近距离内能吸收5’端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团(用Q表示)。当PCR反应在退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物的引导下，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探针结合部位时，此时的Taq酶发挥它的5’→3’外切核酸酶的功能，将探针切成单核苷酸，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再不为Q所吸收而被检测仪所接收。

PCR进行一个循环，合成了N条新链的同时，就水解了N条探针，亦释放了相应数量的荧光基团。仪器所接收到荧光信号的强度与PCR反应产物的量呈对应关系。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。如果以每一个PCR循环结束时所测得的荧光值为纵坐标，以PCR循环数为横坐标作图，即可得到一条连接每一个循环后荧光值的曲线-称为扩增曲线。当检测标本中含有所要检测病原体的核酸序列时，所得到的曲线呈“S”型；而当标本中不含病原体，则PCR过程不发生，探针不被水解，不产生荧光信号，其扩增曲线为一水平线。

PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长拐点处附近，称为阈值线(Threshold)；而扩增曲线与阈值线交叉点的循环数称为Ct值。样本中病原体的浓度越高，Ct值就越小。以此方法测定未知标本中的病原体核酸，不仅能快速定性，还因为荧光PCR本身先进的荧光信号检测系统和强大的信息处理能力，可以实现对病原体核酸的定量。

本发明首次将荧光PCR技术应用于猪链球菌检测领域，提供了针对猪链球菌的特异性引物序列、探针序列、试剂盒和检测方法。

技术内容

本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测猪链球菌2型的核苷酸序列，包括引物序列和探针序列。

本发明的另一个目的是提供一种快速、准确、使用方便的检测猪链球菌2型的试剂盒。

本发明的第三个目的是提供一种快速、准确、可定量检测猪链球菌2型的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明选择猪链球菌荚膜抗原基因2J(cps2J)作为靶区域，设计引物和探针。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。

一组检测猪链球菌的核苷酸序列，如下：

1)5’-GAA TCT GAG CTG CAA AAG TGT C-3’(SEQ ID NO：1)

2)5’-GGG CTA TTA AAG ATA CCG CTC AT-3’(SEQ ID NO：2)

3)5’-[FAM]TCC TAA GTC TCG CAC CTC TTT TAT CTC[TAMRA]-3’(SEQ IDNO：3)

其中序列1)和2)分别为正义引物和反义引物，序列3)为荧光探针，探针的5’端标记报告荧光基团FAM(6-羧基荧光素)，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。

我们采用TaqMan荧光PCR检测技术建立了猪链球菌2型检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg²⁺使用浓度的优化，引物探针浓度的优化，得到以下试剂盒。

一种检测猪链球菌2型的试剂盒，-20℃保存，由以下组分组成：

1)DNA提取试剂：购自INVITROGEN公司，货号10503-027，按5ml/管进行分装，6管/盒。

2)PCR反应液，见表1：

表1  PCR反应液组成

组分	终浓度
		10×PCR缓冲液	1×PCR缓冲液
25mM MgCl<sub>2</sub>	4.0mM
		2.0mM dNTP	0.2mM dNTP
引物1	0.3μmol/L
		引物2	0.3μmol/L
探针	0.1μmol/L

10×PCR缓冲液、25mM MgCl₂、2.0mM dNTP均购于Promega公司；引物和探针均委托上海闪晶分子生物技术有限公司合成，其中，引物1具有序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，引物2具有序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，探针具有序列表SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；其中10×PCR缓冲液的组成为：500mM KCl、100mMTris-HCl(pH9.0 25℃)、1.0％Triton X-100。

3)Taq DNA聚合酶5U/μL，购自Promega公司，货号M1661；

4)无DNA酶的灭菌纯化水，用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0M Ω.cm的水，贮于无菌瓶中。Millipore-Q纯化水15lbf/in²(1.034×10⁵Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。

5)阴性对照：1mL×1管；无菌摘取SPF猪实质脏器，用0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲盐水制成20％悬液。60℃作用1小时灭活。

6)阳性对照：1mL×1管；为含有猪链球菌2型荚膜多糖CPS2J基因(SEQ ID NO：4)的重组质粒，Ct值为22.0～28.0。

阳性对照的制备方法为：采用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物序列对2型猪链球菌进行PCR反应，回收PCR扩增产物(所有的2型猪链球菌均具备此保守序列)，获得高纯度的459 bp CPS2J基因，与PGEM-T easy载体(购自Promega公司)进行连接，转化JM109感受态细胞(购自Promega公司)，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒作为阳性对照，命名为PGEM-CPS2J。10倍连续梯度稀释裂解液，测定Ct值，Ct值为22.0～28.0均可作为阳性对照。

459 bp CPS2J片段基因序列如下：

1      GTTGAGTCCT TATACACCTG TTTAAAAGAG AATGATAGTG ATTTGTCGGG AGGGTTACTT

61     GCTACTTTTG ATGGAAATTA TCAAGAATCT GAGCTGCAAA AGTGTCAAAT TGATTTGGAA

121    GAGATAAAAG AGGTGCGAGA CTTAGGAAAT GAAAATTTTC CAAATCATTA TATGAGCGGT

181    ATCTTTAATA GCCCTTGTTG CAAACTTTAT AAGAATATAT ATATAAACAA AGGTTTTGAC

241    ACTGAACAGT GGTTAGGAGA GGACTTATTA TTTAATCTAA ATTATTTAAA GAATATAAAA

301    AAAGTCAGCT ATGTAAACAG AAATCTTTAT TTTGCTAGAA GAGGTATACA AAGTACTACA

361    AATACGTTTA AAAAAGATGT TTTTATTCAA TTAGAAAATT TAGAAGAAAA AACTTTTGAT

421    TTGTTTGTTA AAATATTTGG TGGACAATAT GAATTTTCT

对合成的引物和探针做HPLC分析，如得到单吸收峰图谱、而且用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间，即视为合格引物。从1∶100稀释的猪2型链球菌培养物中提取的DNA为模板进行扩增，结果显示对于猪链球菌2型检测方法，本发明提供的引物对与探针配合使用，扩增的Ct值相对较低，且升幅较高。

将筛选好的引物浓度从0.1μM至0.8μM以0.1μM为间距递增，探针浓度从0.025μM至0.2μM以0.025μM递增。对引物和探针不同浓度的配比进行了比较，从多次重复试验中发现：不同浓度的引物、探针对于该阳性模板，CT值基本稳定在20.0左右，但引物浓度为0.3μM，探针浓度为0.1μM时荧光增幅相对较高，所以选定引物浓度为0.3μM，探针浓度为0.1μM作为猪链球菌2型PCR检测方法的引物和探针浓度。

我们针对Roche Light Cycler荧光PCR检测仪，在92℃/3min的预变性之后，对该实验中对变性温度和时间、退火和延伸温度及时间进行了优化实验。扩增时，采用循环次数分别为40、45和50，比较扩增结果的Ct值，进而确定扩增的循环次数。最终确定采用耗时最短的方案为PCR反应参数：92℃/3min；92℃/5sec，60℃/30sec，45个循环，每个循环结束时收集荧光。

研究表明，Mg²⁺浓度对荧光PCR扩增结果的影响较大，故应用筛选好的引物探针，将Mg²⁺的浓度从1.5mM至6.0mM以0.5mM为间距递增，对不同Mg²⁺浓度条件下的扩增进行了比较，结果表明Mg²⁺浓度对荧光增量和检测的灵敏度相关，提高其使用浓度，可提高检测探针的荧光增量，但随着Mg²⁺浓度的提高，特别是超过5mM时，在检测某些样品时，可发现曲线上漂的现象。对于猪链球菌2型检测方法，优化后的Mg²⁺浓度为4.0mM。

我们选择Promega公司生产的Taq酶，一单位的定义：74℃作用30分钟，能将10nM的dNTPs掺入酸溶性物质中所需要的酶量。活性要求：具DNA聚合酶活性及5’→3’核酸外切酶活性，无3’→5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃1小时后仍保持50％活性。Taq酶用量(以单位U计)的优化实验模板采用2型链球菌培养物(1∶100稀释)提取DNA进行扩增。从多次重复试验结果中选定1.0U Taq酶作为使用的Taq酶量。

试剂盒的使用方法如下：

1)样品处理：对于生猪样品，咽喉拭子采样，采样时要将拭子深入喉头及上腭来回刮3次～5次，取咽喉分泌液。对于扁桃体、内脏或肌肉样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加5mL PBS混匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。对于血清或血浆，用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，须放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融(最多冻融3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。

2)DNA的提取：在样本处理区进行。

取n个1.5mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。

每管加入1.0mL裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各100μL，一份样本换用一个吸头；混匀器上震荡混匀5s。于4℃～25℃条件下，10 000r/min离心10min。

取相同数量的1.5mL灭菌Eppendorf管，加入500μL无水乙醇(-20℃预冷)，对每个管进行编号。吸取离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液要充分吸取，不要吸出底部沉淀，颠倒混匀。

于4℃～25℃条件下，5 000r/min离心5min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加入1.0mL 75％乙醇，颠倒洗涤。

于4℃～25℃条件下，5 000r/min离心10min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。

4 000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥5s～15s。不宜过于干燥，以免DNA不溶。

加入11μL无DNA酶的灭菌纯化水，轻轻混匀，溶解管壁上的DNA，2 000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的DNA须在2h内进行PCR扩增或放置于-70℃冰箱，将核酸转移至反应混合物配制区。

3)PCR扩增：扩增试剂准备与配制，在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出猪链球菌2型荧光PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2 000r/min离心5s。设所需PCR数为n，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和。每个测试反应体系需使用15μL PCR反应液及0.3μL Taq酶。计算各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。加样，在样本处理区进行。在各设定的PCR管中分别加入制备的DNA溶液10μL，使总体积达25μL。盖紧管盖后，500r/min离心30s。荧光PCR反应在检测区进行。将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。

反应参数设置：

--第一阶段，预变性92℃/3min；

--第二阶段，92℃/5s，60℃/30s，45个循环，荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。

4)结果的判定：结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无猪链球菌2型；阳性，Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪链球菌2型。

一种检测猪链球菌2型的方法，包括如下步骤：

1)提取样品DNA；

2)对提取的样品DNA进行PCR扩增：

引物序列为1)5’-GAA TCT GAG CTG CAA AAG TGT C-3’(SEQ ID NO：1)

          2)5’-GGG CTA TTA AAG ATA CCG CTC AT-3’(SEQ ID NO：2)

荧光探针为5’-[FAM]TCC TAA GTC TCG CAC CTC TTT TAT CTC[TAMRA]-3’；

扩增条件为92℃/3min；92℃/5sec，60℃/30sec，45个循环，每个循环结束时收集荧光。

3)测定PCR反应体系的荧光强度，判断样品中是否存在猪链球菌；阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无猪链球菌2型；阳性，Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪链球菌2型。

本发明的优点是：本发明选择猪链球菌荚膜抗原基因2J(cps2J)作为靶区域，设计引物和探针建立并优化了猪链球菌2型荧光PCR检测方法，取得了优异的技术效果：1)快速：该方法对PCR产物进行实时监控，PCR结束即可获得结果，将传统细菌分离方法的3～7天检测时间缩短为1.5个小时。

2)灵敏：由于采用了特异性的荧光探针和高灵敏度的荧光PCR仪，使该方法比传统的PCR方法灵敏度高100～1000倍；用所建立的方法对以10倍梯度稀释的4株猪链球菌2型培养物进行检测，结果4株猪链球菌2型培养物稀释到10^-5倍均检出为阳性，灵敏度可达10CFU。

3)特异：由于不仅采用了特异性的引物，而且采用了特异性的探针，使该方法的特异性高于传统PCR方法；建立的猪链球菌2型荧光PCR检测方法在检测所收集的猪链球菌和其它细菌的结果为阴性，未发现交叉反应；

4)稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；

5)安全：全封闭反应，无需PCR后处理，操作安全。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为猪链球菌2型检测方法的检测极限测定结果。

图2为猪链球菌2型检测方法对四株链球菌的检测结果。

图3为猪链球菌2型检测方法对其它细菌的检测结果。

图4为咽喉拭子用猪链球菌2型检测方法的检测结果。

图5为猪链球菌2型检测方法对猪扁桃体的检测结果。

具体实施方式

实施例1、试剂盒的配制和使用

1、试剂盒的配制组成，见表2。

表2  试剂盒配制组成

组成(48tests/盒)	数量
		DNA提取液	5.0mL×6管

组成(48tests/盒)	数量
		猪链球菌2型荧光PCR反应液	750μL×1管
Taq酶(5U/μL)	15μL×1管
		无DNA酶的灭菌纯化水	1mL×1管
阴性对照	1mL×1管
		阳性对照	1mL×1管

2、试剂盒的使用方法

1)DNA提取：

取n个1.5mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。

每管加入1.0mL裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各100μL，一份样本换用一个吸头；混匀器上震荡混匀5s。于4℃～25℃条件下，10 000r/min离心10min。

取相同数量的1.5mL灭菌Eppendorf管，加入500μL无水乙醇(-20℃预冷)，对每个管进行编号。吸取离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液要充分吸取，不要吸出底部沉淀，颠倒混匀。

于4℃～25℃条件下，5 000r/min离心5min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加入1.0mL 75％乙醇，颠倒洗涤。

于4℃～25℃条件下，5 000r/min离心10min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。

4 000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥5s～15s。不宜过于干燥，以免DNA不溶。

加入11μL无DNA酶的灭菌纯化水，轻轻混匀，溶解管壁上的DNA，2 000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的DNA须在2h内进行PCR扩增或放置于-70℃冰箱，将核酸转移至反应混合物配制区。

2)扩增试剂准备与配制

在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出猪链球菌2型荧光PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2 000r/min离心5s。设所需PCR数为n，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和。每个测试反应体系需使用15μL PCR反应液及0.3μLTaq酶。计算各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。加样，在样本处理区进行。在各设定的PCR管中分别加入制备的DNA溶液10μL，使总体积达25μL。盖紧管盖后，500r/min离心30s。荧光PCR反应在检测区进行。将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。

反应参数设置：

--第一阶段，预变性92℃/3min；

--第二阶段，92℃/5s，60℃/30s，45个循环，荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。

3)结果判定

结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无猪链球菌2型；阳性，Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪链球菌2型。

实施例2、试剂盒的灵敏度试验

1、材料：

表3  方法研究过程中应用到的细菌菌株及来源

菌种	菌株	来源或提供单位
			猪链球菌2型猪链球菌2型猪链球菌2型D群猪链球菌	四川分离株1四川分离株22株，C<sub>55606</sub>和C<sub>55953</sub>兰氏D群，C<sub>55914</sub>	中国兽医药品监察所提供，分离于四川不同地区病死猪体内，用马丁肉汤复苏中国兽医药品监察所中国兽医药品监察所

2、方法

1)将4株加热灭活和非灭活的猪链球菌2型的马丁肉汤培养物作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10倍稀释，做猪链球菌2型荧光PCR。在测定检测极限的同时，比较加热灭活对荧光PCR检测方法的影响。

测定2株猪链球菌2型四川分离株的CFU/ml，即将每个稀释度未灭活的猪链球菌2型，取0.1ml接种用马丁肉汤，置于37℃孵化20-24小时观察，长菌、混浊的最高稀释度。检测结果与猪链球菌2型荧光PCR检测结果进行比较。

2)对模拟带菌组织样品的检测：

对4株加热灭活猪链球菌2型的马丁肉汤培养物作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10倍稀释于20％正常猪肝组织悬液中进行检测。

3、结果

1)见图1所示，将灭活或非灭活的猪链球菌2型的马丁肉汤培养物作10倍系列稀释，运用优化后的荧光PCR条件进行检测，试验结果显示4株灭活或非灭活猪链球菌2型型检测方法的检测极限可达10^-5，而本次试验用链球菌CFU的测定结果为10⁷/ml，表明荧光PCR方法的检测极限可达10～100CFU。结果也表明加热灭活不影响荧光PCR检测的灵敏度。

2)对模拟带菌组织样品的检测：2型检测方法为10^-4，初步认为可以满足临床样品检测对灵敏度的要求。

实施例3、试剂盒的特异性试验

1、材料

表4  方法研究过程中应用到的细菌菌株及来源

菌种	菌株	来源或提供单位
			猪链球菌2型猪链球菌2型猪链球菌2型D群猪链球菌肺炎链球菌多杀性巴氏杆菌大肠杆菌沙门氏菌空肠弯曲菌结肠弯曲菌	四川分离株1四川分离株22株，C<sub>55606</sub>和C<sub>55953</sub>兰氏D群，C<sub>55914</sub>ATCC496191株2株3株2株1株	中国兽医药品监察所提供，分离于四川不同地区病死猪体内，用马丁肉汤复苏中国兽医药品监察所中国兽医药品监察所中国药品生物制品检定所药物生物技术开发公司北京出入境检验检疫局动检实验室北京出入境检验检疫局动检实验室中国兽医药品监察所中国兽医药品监察所中国兽医药品监察所中国兽医药品监察所

2、方法

1)检测不同链球菌

用建立的荧光PCR检测方法对收集到的猪链球菌2型，D群猪链球菌和猪肺炎链球菌进行检测，以验证方法是否可检测其他的链球菌。

2)检测其他各种细菌

用建立的荧光PCR检测方法对收集到的多杀性巴氏杆菌，大肠杆菌，沙门氏菌，空肠弯曲菌，结肠弯曲菌进行检测，以验证方法的特异性。

3、结果

1)对其他链球菌的检测结果：如图2所示，猪链球菌2型检测试剂盒仅检出两株猪链球菌2型为阳性，其余链球菌检测为阴性。

2)用本发明试剂盒对收集到的多杀性巴氏杆菌，大肠杆菌，沙门氏菌，空肠弯曲菌，结肠弯曲菌进行检测，结果显示均为阴性，表明建立的方法特异性好。

实施例4、猪链球2型菌荧光PCR试剂盒的批间、批内可重复性试验

为对该试剂盒批间、批内重复性进行综合考核，我们选择三批合格试剂进行了批间、批内可重复性试验。

1、实验材料

试剂：猪链球菌2型荧光PCR检测试剂盒3批，批号：200508001、200508002、200508003

检测仪器：全自动荧光PCR检测仪ROCHE公司产品，型号，LightCyclerII。

检测样本：将经加热灭活的猪链球菌2型菌株C₅₅₆₀₆的马丁肉汤培养物作10^-1、10^-2、10^-3倍稀释后，连续三次分别用猪链球菌2型荧光PCR检测方法进行批间、批内重复性试验。

2、实验内容：每批试剂均对经加热灭活的猪链球菌2型菌株C₅₅₆₀₆的马丁肉汤培养物的3个稀释度进行3次荧光PCR检测，每次每一样本检测10份复管，然后根据以上数据计算试剂盒的批内、批间误差。

检测结果要求：同一样本的批内、批间CV值≤10％

3、实验结果

将猪链球菌2型菌株C₅₅₆₀₆的马丁肉汤培养物加热灭活，按10倍梯度稀释为7个浓度(分别标记为J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7，J0为未稀释的培养液)，每个浓度都用猪链球菌2型荧光PCR检测试剂盒进行复管检测，结果如下：

表5  猪链球菌2型菌株C₅₅₆₀₆的马丁肉汤培养物稀释结果

稀释梯度	J0	J1	J2	J3	J4	J5	J6	J7
									1	6.52	17.33	20.41	23.77	26.31	29.22	32.12	36.19
2	6.49	17.39	20.30	23.69	26.83	29.43	32.60	36.46

根据上述结果，选择J1、J2、J3三个浓度的马丁肉汤培养物作为检测样本。将J1、J2、J3三个浓度的马丁肉汤培养物按200ul/支分装150支，-80℃保存备用。

根据表6结果可见200508001、200508002、200508003三个批号的“猪链球菌2型荧光PCR检测试剂盒”对每一样本各10份复管的重复性检测，同一批号、同一次检测结果的CV值均小于10％，说明该试剂盒同批试剂同时检测具有很好的重复性。

表6  三批试剂盒批内、批间重复性试验数据

批号	次数	样本	每次检测结果(Ct值)										批内同次检测统计结果
																1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	均值	标准差	CV值
			200508001批试剂盒	1	J1	17.76	17.31	17.97	17.82	17.93	17.23	18.14	17.39	18.47	18.19														17.82	0.407	2.29％
J2	20.71	20.67														21.23	20.75	20.64	21.37	20.34	20.27	20.19	20.55	20.67	0.384	1.86％
					J3	23.57	24.10	23.88	24.09	23.70	23.49	23.92	23.36	23.72	23.83												23.77	0.246	1.03％
2	J1	17.28														17.76	18.18	17.77	17.50	17.81	17.37	18.20	17.27	17.49	17.66	0.340				1.93％
				J2	20.55	21.28	20.81	20.89	20.32	20.39	20.45	21.05	20.67	20.44	20.69												0.316	1.53％
	J3	24.30														24.08	23.54	24.00	23.67	23.49	23.73	24.38	23.90	23.77	23.89	0.303			1.27％
				3	J1	17.42	18.53	17.93	17.36	17.70	18.09	17.81	18.09	17.73	17.34												17.80	0.378		2.12％
J2	21.14	20.48														20.74	20.42	20.39	20.87	20.50	20.41	20.53	20.21	20.57	0.273	1.32％
					J3	23.79	23.36	23.27	23.95	24.14	23.88	24.10	23.87	23.44	23.42												23.72	0.321	1.35％
200508002批试剂盒	1	J1														17.48	17.74	17.58	17.43	17.99	17.25	17.57	17.71	17.43	17.35	17.55				0.216	1.23％
			J2	20.69	20.38	20.29	20.45	21.82	20.53	20.90	20.88	20.29	20.36	20.66	0.466												2.26％
		J3														23.29	23.55	23.77	23.25	23.63	23.59	23.88	23.43	23.79	23.42	23.56		0.214	0.91％
			2	J1	17.45	17.61	17.51	17.40	17.92	17.35	17.51	17.72	17.83	17.72	17.60												0.190			1.08％
	J2	20.34														20.66	20.05	20.78	20.43	20.59	20.38	20.70	21.13	20.33	20.54	0.300		1.46％
				J3	23.09	23.43	23.37	24.84	23.47	23.73	23.94	23.47	23.85	23.51	23.67												0.479		2.02％
	3	J1														17.38	17.37	17.69	17.86	17.59	17.50	17.65	17.48	17.43	17.55	17.55		0.153		0.87％

批号	次数	样本	每次检测结果(Ct值)										批内同次检测统计结果
																J2	20.71	20.27	21.75	20.39	20.49	20.27	20.46	20.65	20.46	20.54	20.60	0.429	2.08％
			J3	23.88	23.69	23.82	23.95	23.16	23.60	23.52	23.35	23.59	23.81	23.64	0.247															1.05％
200508003批试剂盒	1	J1														17.75	17.68	17.35	17.76	17.35	17.80	17.98	18.18	17.25	17.39	17.65	0.306	1.73％
			J2	20.68	20.69	20.59	20.64	20.43	21.42	20.71	20.40	20.49	20.69	20.67	0.286														1.38％
		J3														23.70	23.96	23.68	23.26	23.55	24.44	23.50	24.25	23.69	23.39	23.74	0.373	1.57％
			2	J1	17.23	17.59	17.64	17.96	17.46	17.52	18.10	17.45	18.07	17.81	17.68														0.291	1.65％
	J2	20.61														20.25	20.73	20.46	20.78	20.57	20.65	20.74	20.87	20.29	20.60	0.206	1.00％
				J3	23.57	23.76	23.55	23.74	23.38	23.42	23.61	23.60	23.87	23.76	23.63													0.157	0.66％
	3	J1														17.88	17.39	17.27	17.85	17.33	17.59	17.55	17.57	17.69	17.46	7.56	0.206			1.17％
			J2	20.78	20.44	20.55	20.65	20.35	20.51	20.38	20.52	20.50	20.73	20.54	0.142													0.69％
		J3														23.40	23.51	23.26	24.55	24.86	24.94	23.38	23.56	23.69	23.37	23.85	0.660		2.77％

根据表7结果可见200508001、200508002、200508003三个批号的“猪链球菌2型荧光PCR检测试剂盒”对三份样本的重复性检测，同一批号、各自三次检测结果之间的CV值均小于10％，说明该试剂盒同批试剂、不同时间的检测结果也具有很好的重复性。

表7  三批试剂盒各自批内重复性试验数据

试剂批号	检测样本	检测样本数	批内重复性统计结果
						均值Ct值	标准差	CV值
			200508001	J1	30				17.63	0.384	1.86％
J2	30	20.52				0.206	1.17％
				J3	30			23.72	0.206	1.00％
200508002	J1	30				17.74	0.321				1.35％
			J2	30	20.66			0.142	0.69％
	J3	30				23.63	0.246			1.03％
			200508003	J1	30			17.49	0.273		1.32％
J2	30	20.41				0.190	1.08％
				J3	30			23.37	0.479	2.02％

根据表8结果可见200508001、200508002、200508003三个批号的“猪链球菌2型荧光PCR检测试剂盒”对三份样本的重复性检测，三批号试剂、各自三次检测结果之间的CV值均小于10％，说明该试剂盒不同批次试剂、不同时间的检测结果也具有很好的重复性。

表8  三批试剂盒批间重复性试验数据

试剂批号	检测样本	检测样本数	批间重复性统计结果
						均值Ct值	标准差	CV值
			200508001200508002200508003	J1	90				17.23	0.303	1.27％
J2	90	20.32				0.479	2.02％
				J3	90			23.25	0.286	1.38％

根据以上试验数据及统计分析，该试剂盒批内、批间重复性结果的CV值均小于10％，说明具有很好的批内、批间重复性。

实施例5、与其他诊断方法的比较(细菌分离技术)实验报告

1、材料

方法研究过程中应用到的细菌菌株及来源见表4。

2、方法

1)对临床样品-猪咽喉拭子的检测：

随机采集某猪场的猪咽喉拭子50份，置于1.0ml 0.01M pH7.2 PBS盐水中，4℃过夜浸泡后，挤压后取上清分成2份，其中一份用猪链球菌2型检测方法进行检测，一份样品采用血琼脂平板对采取的拭子进行细菌分离鉴定。

2)对临床样品--猪扁桃体的检测

随机采集某屠宰场的猪扁桃体108份，称取lg用0.01M pH7.2 PBS盐水研磨成20％悬液，将悬液分成2份，其中一份用2型检测方法进行检测，一份用血琼脂平板对扁桃体组织悬液进行细菌分离鉴定。

3、结果

1)对临床样品咽喉拭子的检测结果：

如图4所示，对50份猪咽喉拭子用建立的2型检测方法进行检测时，结果全部为阴性，血琼脂分离试验的结果全部为阴性。

2)对临床样品-猪扁桃体悬液的检测结果：

如图5所示，对随机采集的108份猪扁桃体悬液，用建立的2型检测方法进行检测，结果全部为阴性。血琼脂分离试验的结果也全部为阴性。

在本研究中，我们将建立的方法初步用于临床样品的检测，样品均从某健康猪场随机采集，2型检测方法在对咽喉拭子和猪扁桃体样品的检测中与细菌分离试验的结果完全一致。

                               序列表

<110>中华人民共和国北京出入境检验检疫局

     中国兽医药品监察所

<120>检测猪链球菌2型的核苷酸序列、检测试剂盒和方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

gaatctgagc tgcaaaagtg tc    22

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

gggctattaa agataccgct cat   23

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

tcctaagtct cgcacctctt ttatctc    27

<210>4

<211>459

<212>DNA

<213>猪链球菌2型

<400>4

gttgagtcct tatacacctg tttaaaagag aatgatagtg atttgtcggg agggttactt     60

gctacttttg atggaaatta tcaagaatct gagctgcaaa agtgtcaaat tgatttggaa    120

gagataaaag aggtgcgaga cttaggaaat gaaaattttc caaatcatta tatgagcggt    180

atctttaata gcccttgttg caaactttat aagaatatat atataaacaa aggttttgac    240

actgaacagt ggttaggaga ggacttatta tttaatctaa attatttaaa gaatataaaa    300

aaagtcagct atgtaaacag aaatctttat tttgctagaa gaggtataca aagtactaca    360

aatacgttta aaaaagatgt ttttattcaa ttagaaaatt tagaagaaaa aacttttgat    420

ttgtttgtta aaatatttgg tggacaatat gaattttct                           459

Claims (6)

1.一组检测猪链球菌2型的核苷酸，其序列如下：

1)5’-GAA TCT GAG CTG CAAAAG TGT C-3’

2)5’-GGG CTA TTA AAG ATA CCG CTC AT-3’

3)5’-TCC TAA GTC TCG CAC CTC TTT TAT CTC-3’。

2.根据权利要求1所述的检测猪链球菌2型的核苷酸，其特征在于：序列3)的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。

3.一种检测猪链球菌2型的试剂盒，48tests/盒，由以下组分组成：

1)DNA提取试剂：5ml/管×6管；

2)PCR反应液，750μL×1管，包括：1×PCR缓冲液、4.0mM MgCl₂、0.2mMdNTP、0.3μmol/L引物1、0.3μmol/L引物2和0.1μmol/L探针；其中，引物1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，引物2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；

3)Taq DNA聚合酶5U/μL，15μL×1管；

4)无DNA酶的灭菌纯化水，1mL×1管；

5)阴性对照：1mL×1管：无菌摘取SPF猪实质脏器，用0.01mol/L pH7.2PBS缓冲盐水制成20％悬液，60℃作用1小时灭活；

6)阳性对照：1mL×1管；为含有猪链球菌2型荚膜多糖CPS2J基因的重组质粒，Ct值为22.0～28.0。

4.根据权利要求3所述的一种检测猪链球菌2型的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照的制备方法为：采用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物序列对2型猪链球菌进行PCR反应，回收PCR扩增产物，获得高纯度的459bp CPS2J基因，与PGEM-T easy载体进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，10倍连续稀释裂解液，测定Ct值为22.0～28.0即可作为阳性对照。

5.根据权利要求3所述的一种检测猪链球菌2型的试剂盒，其特征在于：所述2型荚膜多糖CPS2J基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。

6.一种检测猪链球菌2型的方法，包括如下步骤：

1)提取样品DNA；

2)对提取的样品DNA进行PCR扩增：

引物序列为1)5’-GAA TCT GAG CTG CAAAAG TGT C-3’

          2)5’-GGG CTA TTAAAG ATA CCG CTC AT-3’

荧光探针为5’-[FAM]TCC TAA GTC TCG CAC CTC TTT TAT CTC[TAMRA]-3’；

扩增条件为92℃/3min；92℃/5sec，60℃/30sec，45个循环，每个循环结束时收集荧光；

3)测定PCR反应体系的荧光强度，判断样品中是否存在猪链球菌；阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无猪链球菌2型；阳性，Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪链球菌2型。

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