CN101717446B

CN101717446B - 抗PRRSV-N-IgY抗体的制备及在检测PRRSV中的应用

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Publication number: CN101717446B
Application number: CN2009101538970A
Authority: CN
Inventors: 李肖梁; 方维焕; 万晓媛
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2009-11-17
Filing date: 2009-11-17
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2029-11-17
Also published as: CN101717446A

Abstract

本发明涉及病毒抗体研究，旨在提供一种抗PRRSV-N-IgY抗体的制备及在检测PRRSV中的应用。该抗体的制备包括：对PRRSV N蛋白基因序列PCR扩增N基因从而进行抗原制备、动物免疫、特异性卵黄免疫球蛋白的提取的步骤。本发明以重组PRRSV-N蛋白为抗原免疫蛋鸡获得了特异性的抗PRRSV-N-IgY抗体，制备的特异性抗PRRSV-N-IgY抗体可用于PRRSV间接免疫荧光(IFA)检测。与兔源、鼠源等动物的抗体相比，IgY具有物理性质稳定，具有不激活哺乳动物补体，不结合哺乳动物Fc受体或细菌，不与类风湿因子(RF)发生非特异反应等，可明显降低假阳性出现率等优点。

Description

抗PRRSV-N-IgY抗体的制备及在检测PRRSV中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(porcineproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)核衣壳蛋白(N)蛋白特异性卵黄免疫球蛋白(抗PRRSV-N-IgY抗体)的制备，及其在以间接免疫荧光检测(IFA)方法检测PRRSV中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine productive and respiratory syndrome，PRRS)主要病原猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(porcine productive and respiratory syndrome virus，PRRSV)于1987年首先发现于美国，在临床上主要表现流产、早产、死胎、木乃伊、仔猪成活率逐渐下降和育成猪呼吸道症状等。给养猪业带来了灾难性的经济损失。1991年Wensvoort等利用猪的肺泡巨噬细胞(PAM)首次分离出PRRS病原(Lelystad)，我国郭宝清等(1996)首次报道从流产胎儿中分离到PRRSV，从而证实猪繁殖与呼吸综合征在我国的存在。我国在1995年少数猪场暴发该病，数月之内迅速蔓延至全国，目前PRRS已成为我国规模化猪场引起母猪繁殖障碍和猪呼吸道疾病的主要疫病之一。根据抗原性差异将各地PRRSV分离株分为欧洲型(原型毒株为LV)和北美洲型(原型毒株为VR-2332)，这两种病毒有相似的生物学性质，但是又有着明显的血清学差异性。

PRRSV属于尼多病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，是单股正链有囊膜的RNA病毒，其病毒粒子共有7种结构蛋白，复制酶和聚合酶活性蛋白、核衣壳蛋白(N)、基质蛋白(M)、糖基化囊膜蛋白(GP5)和3个糖基化蛋白(GP2、GP3和GP4)。ORF1a和ORF1b位于基因组5′末端，占病毒基因组近3/4部分，编码具有复制酶和聚合酶活性的蛋，ORF2-5分别编码病毒的糖蛋白GP2-5，ORF6编码膜蛋白(M蛋白)，ORF7编码保守性的N蛋白。

ORF7通常由123(北美洲型)或者128(欧洲型)个氨基酸组成，是一种小的高度碱性的蛋白质，分子量约为14-15kDa。N蛋白是病毒粒子中含量最多的蛋白质，免疫原性极强，通常在感染PRRSV后，首先产生的是针对它的抗体，并且可持续半年以上。此外，在其N末端有很多碱性氨基酸，这可能有利于与病毒基因组RNA的结合。N蛋白大部分以二硫键连接的同型二聚体的形式存在，并聚合形成二十面体核心结构。N蛋白有5个抗原表位，其中4个线性表位1个构象性表位，在其C末端的11个氨基酸在构象表位的形成中起着关键作用。另外，虽然N蛋白保守性好，但这些表位都不能引起中和抗体的产生。可是此蛋白具有良好的诊断学意义，现已建立了以重组N蛋白为基础的ELISA诊断方法，特异性强，重复性好，成本低廉，应用前景十分广阔。另外，根据最新研究表明，N蛋白对于病毒粒子的致病性和与宿主细胞受体的结合也有关系。

鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)作用等同于哺乳动物的IgG，但与其他哺乳动物制备多克隆抗体相比，特异性IgY抗体制备有着经济、易操作、产量大等优点，目前纯化的IgY抗体已广泛在免疫沉淀反应、免疫电泳、ELISA、免疫电镜、免疫吸附和Western-blot等诊断检测技术和治疗上应用。本发明旨在建立抗PRRSV-N蛋白特异性IgY抗体的制备方法及基于抗PRRSV-N-IgY抗体检测PRRSV的间接免疫荧光检测(IFA)方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种抗PRRSV的N蛋白特异性卵黄免疫球蛋白(抗体)的制备方法，并进一步提供了基于抗PRRSV-N-IgY抗体的间接免疫荧光检测(IFA)方法。

为解决技术问题，本发明提供的解决技术方案为：

提供一种抗PRRSV-N-IgY抗体的制备方法，包括步骤：

(1)抗原制备

对PRRSVN蛋白基因序列PCR扩增N基因，并引入EcoR I/HindIII酶切位点，将扩增片段克隆至原核表达载体pET-30a(+)中，转化感受态E.coli BL21(DE3)pLysS菌株，挑取单菌落经PCR和测序鉴定；阳性克隆以1mmol·L^-1IPTG诱导4h，提取表达产物用SDS-PAGE检测；Ni-NTAAgarose亲和层析柱纯化表达重组蛋白，Western blot检测免疫原性和Bradford法测定蛋白浓度，纯化蛋白作为抗原备用；

(2)动物免疫

以含150μg重组蛋白·mL乳剂^-1的PRRSV-N重组蛋白与弗氏完全佐剂1∶1乳剂1mL对23周龄的海兰蛋鸡进行首免；分别间隔2周进行二免、三免，免疫原为N重组蛋白与弗氏不完全佐剂1∶1乳化后的乳化剂(含250μg重组蛋白·mL乳剂^-1)1mL；收集首免后第83～90天鸡蛋，4℃保存备用；

(3)特异性卵黄免疫球蛋白的提取

参照Akita EM所述方法进行卵黄抗体的粗提：将收集的鸡蛋以75％酒精消毒，破壳；以卵黄分离器收集卵黄，蒸馏水充分冲洗卵黄表面后在无菌滤纸上滚动，除去残留卵白蛋白，破卵黄膜，加卵黄液9倍体积pH5.2的蒸馏水稀释，充分搅匀后4℃静置6h以上，10000g，4℃离心25min，上清液备用；

以硫酸铵分级沉淀精提卵黄抗体：水稀释法粗提的上清液分别以w/v终浓度为50％、33.3％硫酸铵盐析，4℃静置过夜；10000g，4℃离心25min，弃上清，沉淀用少量0.01M、pH7.2的PBS缓冲液溶解，并经截留分子量100KD的超滤膜除盐浓缩。

本发明进一步提供了利用前述抗PRRSV-N-IgY抗体实施间接免疫荧光检测PRRSV的方法，包括：

以适合Marc-145细胞的完全培养液将收获的Marc-145细胞稀释至浓度为10⁵/mL接种96孔板，每孔50μL，置于5％CO₂培养箱中37℃培养24h；待细胞长成单层后，弃去培养液，以按培养液1/10体积接种PRRSV病毒液；PRRSV病毒液滴度为10^5.5-6.0TCID₅₀/mL，同时设不接毒的细胞孔作为空白对照；培养70h后，停止培养；弃去培养液，以0.02M、pH7.2磷酸缓冲液+0.05％Tween-20的PBST洗涤3次，每次3min，用4℃预冷甲醇固定细胞，每孔150μl，-20℃下放置30min；同上洗涤后；加入经含5％w/v的脱脂奶粉PBST

50倍稀释的抗PRRSV-N-IgY抗体，每孔50μl，37℃作用1h；同上洗涤后，分别加入经含5％脱脂奶粉PBST 80倍稀释的FITC-羊抗鸡IgY抗体，每孔50μl，37℃作用1h；同上洗涤后，用含50％甘油的PBS封底，并置于荧光显微镜下观察结果。

目前，人们相继制备了针对PRRSV N蛋白的兔源、鼠源等的多克隆抗体或单克隆抗体，但未见特异性抗PRRSV-N-IgY抗体制备。本发明的有益效果在于，本发明以重组PRRSV-N蛋白为抗原免疫蛋鸡获得了特异性的抗PRRSV-N-IgY抗体，制备的特异性抗PRRSV-N-IgY抗体可用于PRRSV间接免疫荧光(IFA)检测。与兔源、鼠源等动物的抗体相比，IgY具有物理性质稳定，具有不激活哺乳动物补体，不结合哺乳动物Fc受体或细菌，不与类风湿因子(RF)发生非特异反应等，可明显降低假阳性出现率等优点。

附图说明

图1为N基因阳性克隆菌液PCR鉴定；图中M为DNA Marker；1为阳性克隆PCR鉴定；

图2为SDS-PAGE(A)和Western blot(B)分析原核表达重组蛋白6His-N；图中M1为非预染蛋白分子量Marker；1、5为空质粒诱导的表达产物(阴性对照)；2为重组蛋白6His-N；3、4为纯化后的N蛋白；M2为预染蛋白分子量Marker；

图3为IgY纯化后SDS-PAGE结果；图中M为非预染蛋白分子量marker；2为水稀释法提取的IgY；3为硫酸铵法提取的IgY；

图4为抗N蛋白IgY Western Blotting分析；图中M为蛋白分子量marker；1为PRRSV感染细胞裂解物；2为纯化后的重组蛋白6His-N；

图5为抗N蛋白IgY抗体的消长规律；图中“↓”为首免和再免时间

图6为抗PRRSV-N-IgY抗体检测PRRSV病毒感染的Marc-145细胞的间接免疫荧光结果；图中A为感染病毒的anti-PRRSVN IgY检测；B为感染病毒的阴性IgY检测；C为未感染病毒的anti-PRRSV N IgY检测。“→”表示核仁产生特异性的荧光。

具体实施方式

下面结合实施对本发明的抗体剂制备技术和应用作进一步描述。

1材料与方法

1.1抗原制备

参考《分子克隆实验指南》和GenBank上发表的PRRSV N蛋白基因序列(GenBank登录号：FJ175688)，PCR扩增N基因，并引入EcoR I/HindIII酶切位点，将扩增片段克隆至原核表达载体pET-30a(+)中，转化感受态E.coli BL21(DE3)pLysS菌株，挑取单菌落经PCR和测序鉴定；阳性克隆以1mmol·L^-1IPTG诱导4h，提取表达产物用SDS-PAGE检测；Ni-NTAAgarose亲和层析柱纯化表达重组蛋白，Western blot检测免疫原性和Bradford法测定蛋白浓度，纯化蛋白作为抗原备用。

1.2试验动物

试验鸡为23周龄的海兰蛋鸡。

1.3免疫方法

首免给予PRRSV-N重组蛋白与弗氏完全佐剂1∶1乳化后的乳化剂(含150μg重组蛋白·mL乳剂^-1)1mL；分别间隔2周进行二免、三免，免疫原为N重组蛋白与弗氏不完全佐剂1∶1乳化后的乳化剂(含250μg重组蛋白·mL乳剂^-1)1mL；收集首免后第83～90天鸡蛋，4℃保存备用；

1.4卵黄抗体的制备

参照Akita EM所述方法进行卵黄抗体的粗提，将收集的鸡蛋以75％酒精消毒，破壳；以卵黄分离器收集卵黄，蒸馏水充分冲洗卵黄表面后在无菌滤纸上滚动，除去残留卵白蛋白，破卵黄膜，加卵黄液9倍体积的蒸馏水(pH5.2)稀释，充分搅匀后4℃静置6h以上，10000g，4℃离心25min，上清液备用。

以硫酸铵分级沉淀精提卵黄抗体。方法简述如下：水稀释法粗提的上清液分别以终浓度为50％、33.3％(w/v)硫酸铵盐析，4℃静置过夜；10000g，4℃离心25min，弃上清，沉淀用少量PBS缓冲液(0.01M，pH7.2)溶解，并经截留分子量100KD的超滤膜除盐浓缩。在Mini-PROTEAN II Cell(Bio-Rad Laboratorie)上进行SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度。

1.5免疫印迹(West-Blot)分析卵黄抗体的反应性

将SDS-PAGE电泳凝胶分离的蛋白转移至NC膜，用含5％脱脂奶粉的TBST(Tris缓冲液、0.05％吐温20)封闭，以提纯的卵黄抗体为一抗，HRP标记的兔抗鸡IgY为二抗(Promega公司)，4-氯-1-萘酚(4-CN)显色并拍照。

1.6ELISA检测

用PRRSV感染Marc-145细胞，48h内出现细胞病变且细胞尚未脱落时，刮下单层细胞，悬浮于pH7.2的PBS缓冲液中，反复冻融3次，1000g离心10min去细胞碎片，保留上清液，-80℃保存备用。

利用ELISA测定PRRS抗体进行IgY抗体变化规律检测。简述如下：将收获保存的病毒上清液用0.4％甲醛灭活并用碳酸盐缓冲液(CBS，pH9.6)稀释后包被96孔酶标板(Corning，美国)，37℃温育2h后4℃过夜，PBST洗涤三次，含5％脱脂奶粉的PBST(0.02mol·L^-1磷酸缓冲盐溶液、0.05％吐温20)200μL封闭2h后，PBST洗涤三次，加入1∶100稀释的水稀释法提取的IgY(以免疫前鸡蛋为阴性对照)100μL，37℃孵育1h，PBST洗涤三次，加入1∶8000的HRP标记兔抗鸡IgY 100μL 37℃温育1h，PBST洗涤三次，3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)显色100μL，2M H₂SO₄终止后，立即用酶标仪((美国，Bio-Tek，Elx800)测定吸光值(OD₄₅₀nm)。以免疫鸡IgY OD₄₅₀nm值(P)与阴性IgY OD₄₅₀nm值(＜0.20)(N)之比大于2.1作为抗体阳性的判定阈值。

1.7间接免疫荧光(IFA)

以含4％新生牛血清的DMEM细胞培养液将Marc-145细胞稀释至浓度为10⁵/mL接种96孔板，每孔50μL。置于5％CO₂培养箱中37℃培养24h；待细胞长成单层后，弃去培养液，以按培养液1/10体积接种病毒(病毒液滴度为10^5.5-6.0TCID₅₀/mL)，设不接毒的细胞孔作为空白对照；培养70h后，停止培养；弃去培养液，PBST洗涤3次，每次3min，用4℃预冷甲醇固定细胞，每孔150μL，-20℃下放置30min；洗涤同上，抗PRRSV全病毒和抗N蛋白IgY抗体的纯化产物分别加入以含5％脱脂奶粉PBST按1∶50稀释，阴性IgY抗体作为阴性对照，每孔50μL，37℃作用1h；洗涤同上，分别加入含5％脱脂奶粉PBST按1∶80稀释的FITC-羊抗鸡IgG抗体，每孔50μL，37℃作用1h；洗涤同上，用含50％甘油的PBS封底，并置于荧光显微镜下观察结果。

2结果

2.1N重组蛋白表达和纯化

图1显示pET30a-N阳性克隆PCR结果，并对其测序鉴定分析后，全长387bp的N基因与载体上的His标签融合，且阅读框正确。含重组质粒pET30a-N的E.coli BL21(DE3)诱导表达的SDS-PAGE结果(图2，A)，融合蛋白6His-N相对分子量约为20.6kDa，与理论推测结果一致，表达产物经Ni-NTA Agarose亲和层析后纯度较高。经Bradford法测定浓度，推算出每升重组菌可纯化得到目的蛋白60.2mg.。Western blot分析显示，在转印膜目的蛋白处出现特异性反应条带，表明融合表达产物对猪PRRSV阳性血清具有良好的免疫反应性(图2，B)。

2.2抗N蛋白特异性卵黄抗体提取和纯化

经15％SDS-PAGE电泳显示(图3)，硫酸铵分级沉淀提取的IgY抗体纯度较高，几乎不含杂蛋白，可见Mr为67KDa重链和27KDa轻链。

2.3Western Blotting检测

图4显示抗N蛋白IgY Western blotting分析结果，融合表达产物与制备的卵黄抗体具有良好的免疫反应性，且以PRRSV感染Marc-145后的细胞裂解物对照，在14kDa左右出现特异性的N蛋白条带。

2.4抗N蛋白IgY抗体效价及其消长规律

抗N蛋白IgY抗体消长规律ELISA检测结果见图5。三次免疫后，抗N蛋白IgY抗体的P/N值呈明显的增长趋势；首免后6周可检测到抗体(P/N＝2.44)，83d时达到最高(P/N＝5.63)，此时滴度达到1∶640(表1)，至120d试验结束时，P/N值仍达3.57。为此收集免疫后83-90d鸡蛋提取纯化特异性抗体后用于IFA检测的研究。

表1第83天免疫鸡卵黄中特异性IgY抗体滴度

2.5特异性抗PRRSV-N-IgY抗体IFA检测PRRSV

图6为抗PRRSV-N-IgY抗体检测PRRSV病毒感染的Marc-145细胞的间接免疫荧光结果。以5％脱脂奶粉作抗体稀释液和封闭液时效果较好，显著降低了反应背景，抗PRRSV-N-IgY能够对PRRSV感染的细胞产生特异性的核仁染色，阴性IgY抗体对照及空细胞对照均未出现特异性荧光。

Claims

1.一种抗PRRSV-N-IgY抗体的制备方法，包括步骤：

(1)抗原制备

对PRRSVN蛋白基因序列PCR扩增N基因，并引入EcoR I/HindIII酶切位点，将扩增片段克隆至原核表达载体pET-30a(+)中，转化感受态E.coli BL21(DE3)pLysS菌株，挑取单菌落经PCR和测序鉴定；阳性克隆以1mmo1·L^-1IPTG诱导4h，提取表达产物用SDS-PAGE检测；Ni-NTAAgarose亲和层析柱纯化表达重组蛋白，Western blot检测免疫原性和Bradford法测定蛋白浓度，纯化蛋白作为抗原备用；

(2)动物免疫

以含150μg重组蛋白·mL乳剂^-1的PRRSV-N重组蛋白与弗氏完全佐剂1∶1乳剂1mL对23周龄的海兰蛋鸡进行首免；分别间隔2周进行二免、三免，免疫原为N重组蛋白与弗氏不完全佐剂1∶1乳化后的乳化剂1mL，含250μg重组蛋白·mL乳剂^-1；收集首免后第83～90天鸡蛋，4℃保存备用；

(3)特异性卵黄免疫球蛋白的提取

以硫酸铵分级沉淀精提卵黄抗体：水稀释法粗提的上清液分别以w/v终浓度为50％、33.3％硫酸铵盐析，4℃静置过夜；10000g，4℃离心25min，弃上清，沉淀用少量0.01M、pH7.2的PBS缓冲液溶解，并经截留分子量100KDa的超滤膜除盐浓缩。