CN105906713B

CN105906713B - 一种猪elf4蛋白卵黄抗体的制备方法

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Publication number: CN105906713B
Application number: CN201610199701.1A
Authority: CN
Inventors: 唐青海; 阚云超; 姚伦广; 王瑾; 唐存多; 谷雅静; 李晓楠; 李羽; 焦铸锦; 李丹丹; 刘宗才
Original assignee: Nanyang Normal University
Current assignee: Hunan Perfect Animal Health Co ltd
Priority date: 2016-04-01
Filing date: 2016-04-01
Publication date: 2019-08-16
Anticipated expiration: 2036-04-01
Also published as: CN105906713A

Abstract

一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，首选扩增得到ELF4基因片段，与pET28a载体连接，获得重组表达菌株Rosetta(DE3)/pET28a‑pELF4；用诱导物IPTG诱导该重组表达菌株，获得融合蛋白；向纯化的融合蛋白中加入终浓度为0.05%的β‑丙内酯，将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG混合后，采用所得混合物对蛋鸡进行免疫，从蛋鸡所下鸡蛋中提取收集卵黄抗体，即制备出猪ELF4蛋白卵黄抗体。本发明方法相对简单，抗体产量大，制备成本低，所得到的种猪ELF4蛋白卵黄抗体效价高，适合工业化生产。

Description

一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗体，具体的说是一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法。

背景技术

ETS（E26 transformationspecific）家族分子是多细胞生物的一类转录因子，因最早在禽骨髓成红细胞增生症病毒 E26所表达的融合蛋白中发现的癌基因编码的蛋白而得名。该家族蛋白结构高度保守，其有一段85aa序列能够特异性地结合于DNA共有基序GGAA/T。ELF4（E74-like factor 4）是ETS家族的一员，早期被命名为骨髓elf-1（E74-likefactor 1）样因子（Myeloid elf-1-like factor，MEF），在上皮细胞中能够组成性的激活溶菌酶基因、上调人β防御素2基因的转录水平，而且被认为是X染色体上一个潜在的肿瘤抑制子。在基础水平，ELF4的转录受转录因子Sp1的调控，其反式激活功能部分被前髓细胞性白血病蛋白所调节。同时，受小泛素相关修饰蛋白（Small ubiquitin-related modifier，SUMO）的调控，人源ELF4的第657位赖氨酸被泛素化，导致ELF4对溶菌酶基因的转录反式激活能力被抑制。转录因子ELF4还参与细胞多种生理或病理过程，如肿瘤发生、DNA损伤反应和细胞周期调控。

目前，被克隆得到该基因序列的种属动物仅来源于人、小鼠和牛，猪源ELF4基因序列及其其编码蛋白的原核表达没有相关报道，目前亦无猪源ELF4蛋白抗体相关商品化产品，鉴于该蛋白在抗感染免疫方面的重要作用，本发明属于首次得到猪的ELF4基因序列，采用优化的免疫原制备方案，免疫蛋鸡制备相应的卵黄抗体，该抗体可以用于检测猪源ELF4蛋白，作为工具，开展猪ELF4深入的功能研究具有特异性强和敏感性高等特点。

发明内容

本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的方法。

一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、以猪肾细胞（PK15细胞系）为材料，提取总RNA为模板，采用RT-PCR法扩增得到猪ELF4（pELF4）基因片段，将扩增得到猪ELF4（pELF4）基因片段与pET28a载体连接并转化至Rosetta(DE3)感受态细胞，获得重组表达菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4，所述猪ELF4基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

步骤二、用诱导物IPTG诱导重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4表达目的蛋白，收集菌体，获得表达目的蛋白的重组表达菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4；

步骤三、从表达目的蛋白的重组表达菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4中分离纯化得到融合蛋白；所得融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

步骤四、向融合蛋白中加入终浓度为0.05%的β-丙内酯，先置于4℃下 24-48 h，再置于 37℃下2h，最后将融合蛋白中的外源污染微生物灭活，得到处理后的蛋白；

步骤五、将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合后，得到混合物A；采用所得混合物A对蛋鸡进行免疫，抽取第3次免疫后7天至30天的鸡蛋采用Westernblot方法检测ELF4特异性卵黄抗体效价，当抗体效价达到16000倍以上时，从鸡蛋中提取收集卵黄抗体，即制备出猪ELF4蛋白卵黄抗体。

步骤一中所述RT-PCR法扩增所用引物为：

引物名称	引物序列	酶切位点
			pELF4-S	ACT<u>GAATTC</u>ATGGCTATTACCCTGCAGCCCAGT	EcoRⅠ
pELF4-R	ACT<u>AAGCTT</u>TTATCATATGTCATGGGGCTCCATCTTAATG	HindⅢ

步骤二中所述用诱导物IPTG诱导重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4表达目的蛋白的条件为：在37℃下，将重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4培养至OD₆₀₀值为1.6时，加入终浓度为1mmoL/L的IPTG诱导6-8h。

步骤四中所述将融合蛋白中的外源污染微生物灭活的方法为：向融合蛋白中加入终质量浓度为0.05%的β-丙内酯，先置于4℃下24 h，再置于37℃下2h。

步骤五中所述将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合的混合顺序为：将蛋白溶液缓慢加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为0.5mg/mL，同时以14000r/min的转速搅拌乳化1-2h。

步骤五中所述对蛋鸡进行免疫的方法为，进行注射免疫，剂量为0.5mL/只；依次于初次免疫后第21天和51天，进行第2次和第3次加强免疫，免疫剂量依次为0.5mL/只和1mL/只。

有益效果是：

1、本发明提取的包涵体重组蛋白ELF4具有良好的免疫原性和反应原性。

2、本发明所采用ISA71VG为佐剂的免疫原制备工艺能够很好的提示蛋白的免疫原性，是一种很好的用于家禽免疫接种过的免疫原配方，该抗原能在机体内缓释放，延长机体的免疫反应期，提高抗体产量。

3、本发明提取的抗猪ELF4蛋白卵黄抗体可较好地结合猪ELF4蛋白。

4、本发明提取方法相对简单，抗体产量大，制备成本低，所得到的抗体效价高，适合工业化生产。

附图说明

图1是猪ELF4基因（pELF4）的RT-PCR扩增电泳图；

图中标记是：M，Marker；1，PELF4；

图2是重组猪ELF4基因表达载体pET28a-ELF4的酶切鉴定电泳图；

图中标记是：M，Marker；1，PET28a-PELF4；

图3是原核表达重组猪ELF4蛋白的SDS-PAGE分析结果图；

图中标记是：M，Marker；1，PET28a-PELF4诱上清；2，PET28a-PELF4诱IB；3，PET28a-PELF4未诱上清；4，PET28a-PELF4未诱IB；5，PET28a-空载诱导上清；6，PET28a-空载诱导IB；

图4是表达重组猪ELF4蛋白的Western blot鉴定图；

图5是Western blot检测不同稀释倍数稀释的猪ELF4特异性卵黄抗体结果图。

图中标记是：M，Marker；1、抗体稀释2000倍，2、抗体稀释4000倍；3、抗体稀释8000倍。

具体实施方式

一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、猪转录调节因子ELF4基因的克隆与测序及其重组表达菌的构建：

（1）以猪肾细胞的总RNA为模板，合成第一链cDNA，利用primer prime5.0软件设计一对引物：pELF4-S：ACTGAATTCATGGCTATTACCCTGCAGCCCAGT（下划线序列为EcoRⅠ位点），pELF4-R：ACTAAGCTTTTATCATATGTCATGGGGCTCCATCTTAATG（下划线序列为HindⅢ位点），采用RT-PCR方法扩增得到猪ELF4基因片段。RNA进过随机引物反转录成cDNA后，进行PCR扩增。

（2）将PCR产物利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后与经过EcoRⅠ和HindⅢ双酶切的pET28a载体连接。连接产物转化至Rosetta(DE3)感受态细胞，挑取单个菌落克隆扩大培养提取质粒采用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，将双酶切鉴定阳性的质粒进行序列测定，酶切产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性质粒送至华大基因进行序列测定，阳性菌株命名为Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4。

（3）利用Lasergen7.1软件分析测定的猪ELF4基因，该基因开发阅读框长度为1989bp，编码662 aa，本发明所获得的猪ELF4基因具体核苷酸序列如SEQ No.1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ No.2所示。

步骤二、重组表达菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4诱导表达及蛋白的纯化：

（1）重组表达菌Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4，采用LB培养培养，在37℃，终浓度为1mM的IPTG诱导6-8h。

（2）8000 r/min，4℃离心10min，收集菌体；

（3）每1L菌液的菌体加入裂解液20mL，37℃，100 r/min，裂解1h。所述裂解液的配制方法为：50 mM Tris-HCl pH 7.5缓冲液中含有:1%（V/V） Terginol®type NP-40、0.5%（W/V）脱氧胆酸钠、150 mM氯化钠、1% SDS（W/V）、0.1 mM苯甲基磺酰氟W/V）。

（4）将上述裂解液超声波破碎，条件为：能量值60%，每间隔5s超声5s，总时长为1h。

（5）8000 r/min，4℃，离心15min，收集沉淀蛋白；

（6）往沉淀蛋白中加入PBS缓冲液20mL；

（7）超声裂解：能量值60%，每间隔5s超声5s，总时长为1h。

（8）8000 r/min，4℃，离心15min，收集沉淀蛋白；

（9）往沉淀蛋白中加入PBS缓冲液5mL，漩涡振荡制备得到纯化的猪ELF4重组蛋白悬液。

步骤三、获得了一种用于家禽的免疫原的制备与免疫程序和接种方式：

（1）免疫原的灭活处理：向纯化的蛋白中加入终浓度为0.05%的β-丙内酯，于4℃，作用24 h，37℃，作用2h，将蛋白中的外源污染微生物灭活。

（2）免疫原的乳化制备：将蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以3:7的体积比例混合，混合顺序为：将蛋白溶液缓慢加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为0.5mg/mL，同时以14000r/min的转速搅拌乳化2h。

（3）蛋鸡的免疫：对来航鸡蛋鸡进行胸部肌肉注射，剂量为0.5mL/只。依次于初次免疫后第21天和51天，进行第2次和第3次加强免疫，免疫剂量依次为0.5mL/只和1mL/只。抽取第3次免疫后7天至30天的鸡蛋采用western blot方法检测ELF4特异性卵黄抗体效价，当抗体效价达到16000倍以上时，从鸡蛋中提取收集卵黄抗体。

步骤四、本发明获得了一种ELF4卵黄抗体提取工艺：

（1）在无菌的条件下，用蛋黄分离器分离卵黄与卵白。

（2）向100mL卵黄中加入400mL pH为7.9的Tris-NaCl，1.2%（W/V）的泊洛沙姆溶液(1:4)；500r/min，搅拌5min。

（3）室温静置1 h；

（4）弃沉淀，收集上清；

（5）12000r/min，4℃离心15min；

（7）收集上清用0.45μm滤膜过滤；

（8）滤过液采用超滤膜在6000r/min，4℃离心15min，离心超滤。

（9）用含有体积分数为30%的甘油PBS缓冲液洗脱IgY抗体；

（10）采用紫外分光光度计测定浓度，并用SDS-PAGE方法鉴定分离的抗体纯度。利用western blot分析抗体效价。

实施例1

本实施例拟对猪ELF4蛋白基因进行克隆，构建原核表达载体pET28a-pELF4，表达和纯化重组猪ELF4蛋白，并将其作为免疫原，免疫产蛋鸡，生产抗猪ELF4重组蛋白特异性IgY抗体。

1、引物设计与合成

根据人源的ELF4基因序列，使用软件Primer Prime5.0软件设计一对引物，用于扩增猪ELF4基因DNA序列。pELF4-S：5’-ACTGAATTCATGGCTATTACCCTGCAGCCCAGT-3’（下划线序列为EcoRⅠ位点），pELF4-R：5’-ACTAAGCTTTTATCATATGTCATGGGGCTCCATCTTAATG-3’（下划线序列为HindⅢ位点），引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

2.猪ELF4基因的PCR扩增，采用RT-PCR方法扩增得到猪ELF4基因片段。

PCR反应体系如下：

试剂体积

5XPrime STAR GXL Buffer 10μL

dNTP Mix 4μL

上下游引物P,R 1μL

Prime STAR GXL DNA Polymerase 1μL

模板cDNA 2μL

ddH₂O 31μL

总体系 50μL

反应参数：95℃预变性4min，98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸2min，35个循环，68℃延伸7min，4℃保存。

3、PCR产物纯化，测浓度，酶切

PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V,50min。凝胶成像系统进行观察，拍照。使用Axygen公司PCR产物纯化试剂盒进行DNA的纯化，测定DNA浓度。

4、纯化产物与pET28a载体连接与转化

连接体系如下：

pET28a（经EcoRⅠ和HindⅢ酶切） 1μL

纯化的ELF4（经EcoRⅠ和HindⅢ酶切） 4μL

Ligation Mix 5μL

混合后16℃连接过夜。

连接产物转化Rosetta（DE3）感受态细胞，步骤如下：

（1)从-80℃冰箱中取Rosetta感受态细胞悬液，手握住迅速解冻，至管中还有小部分呈冰晶状态时，立即置冰上。

（2)超净台中，向感受态细胞中加入过夜的质粒DNA 5μL，用灭菌枪头将其轻轻轻混匀，冰上放置30 min。

（3)42℃水浴中热击90秒，后迅速置于冰上冷却5 min。

（4)向管中加入800 μL无抗生素的LB液体培养基，37℃，220rpm振荡培养50min。

（5)将上述菌液12000 rpm离心1min，超净台中，弃掉上清600 μL，剩余的300μL将管底菌体吹均匀，分成两份分别涂布于含Amp的筛选平板上（其中一块板加50μL，另外一块加250μL）正面向上放置1h，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16h小时。

（6)次日观察菌落、挑取单菌落进行鉴定。

5、重组质粒的提取

含有重组质粒的Rosetta菌在含有卡那霉素的 LB液体培养基培养后，提质粒酶切鉴定：参照Axygegen质粒提取试剂盒，操作如下：

（1) 取4 mL在LB培养基中培养过夜的菌液，12000g离心1min，弃尽上清。

（2）加250μL BufferS1，悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀。

（3）加250μL BufferS2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步不宜超过5min。

（4）加350μL BufferS3，温和并充分的上下翻转混合6-8次，12000g离心10min。

（5）吸取步骤（4）中的离心上清并转移到制备管（置于2ml离心管），12000g离心1min，弃滤液，

（6）将制备管置回离心管，加500μL BufferW1,12000g离心1min，弃滤液。

（7）将制备管置回离心管，加700μL BufferW2，12000g离心1min，弃滤液，以同样的方法再用700μL BufferW2洗涤一次。弃滤液。

（8）将制备管置回2ml离心管中，12000g离心1min。

（9）将制备管移回新的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加60-80μL Eluent或去离子水，室温静置1min。12000g离心1min。

6、重组质粒的酶切鉴定

重组质粒使用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定，酶切体系如下。酶切体系如下：

质粒 5μL

EcoRⅠ 0.4μL

HindⅢ 0.4μL

10XBuffer（Q.Cut） 2μL

ddH2O 12.2μL

37℃酶切反应15min，酶切产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，酶切产产物有2条带，一条为5.7kb的空载体带，一条为1989bp的目的基因条带，阳性质粒测序鉴定开放阅读框准确。

7、ELF4基因的诱导温度的确定

（1）将双酶切和测序结果正确的阳性菌株5μL接种于含卡那霉素的5mL新鲜LB培养基中，37℃，220r/min培养过夜。

（2）把培养过夜的菌液，按1：10分加到4mL含卡那霉素的LB液体培养基中（例如4mL的LB中加40μL菌液），37℃，220rpm,2h。

(3)当菌液OD600nm=1.6～1.8时，每管加入终浓度为1mmoL/L IPTG。

（4）分别置于25 ℃、28 ℃ 、37 ℃，200 r/min诱导6-8 h。

（5）4℃，8000rpm离心，15min，弃上清，收集沉淀。

（6）向沉淀中加入适量菌体裂解液，悬浮。

（7）超声裂解1h。

（8）4℃，8000g离心15min，收集上清和包涵体。

（9）SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，具体步骤如下：

①制胶：洗净玻璃板，固定在制胶器上，按分离胶配方，依次加入各试剂，最后加入过硫酸铵，上下颠倒混匀后，快速注入两玻璃板之间，胶上覆盖一层异丙醇，静置30min。倾去上层异丙醇，吸水纸吸干残留的双蒸水，加入配置好的5% 浓缩胶，水平插入梳子，静置2h垂直移去梳子，去掉制胶器，移入电泳槽，在内、外槽加入电泳缓冲液，电泳液没过胶孔。

②上样:样品按照1:1 比例加入电泳上样缓冲液，涡旋混匀，沸水浴10min ，8000rpm离心1min，取上清。使用移液枪上样，10μL/ 孔。电泳，浓缩胶电压为80V ，当溴酚蓝进入分离胶时，提高电压至120V，溴酚蓝至胶底部1cm，停止电泳。

③染色: 放于加有考马斯亮蓝染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约3小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染脱色:染色结束后，取凝胶置于脱色液中，摇床上进行脱色，直至北景变淡。

④脱色：取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。

8、ELF4基因最佳诱导剂浓度的确定

当菌液OD600nm=1.6～1.8时，选择最佳诱导温度，不同IPTG浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmoL/L），220 r/min诱导6-8 h，方法同上进行SDS-PAGE电泳。

9、ELF4最佳诱导时间的确定

当菌液OD600nm=1.6～1.8时，选择最佳诱导温度和最佳诱导剂浓度，分别诱导不同时间（1 h、2 h、4 h、6h和8 h），方法同上进行SDS-PAGE电泳。

10、重组蛋白可溶性分析

在 IPTG 最佳诱导浓度和诱导时间的条件下,诱导培养含有Rosetta（DE3）/pET28a-ELF4菌，4℃,8000rpm ，15min。菌体在冰浴中超声破碎(间隔 5s ，60min) ，4℃,8000 rpm ，15min ，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE 分析。分别取pET28a空载体诱导前、后上清和不溶部分，各取 1ml 作为对照。

11、重组蛋白ELF4的Western blot分析

SDS-PAGE电泳分离目的蛋白，操作如上，电泳后，进行Western blot鉴定，操作如下：

（1）转膜前准备：剪与胶相应大小的PVDF膜（Millipore公司），用100%甲醇处理15S，用MilliQ H₂O处理2min，用转印缓冲液处理5min。

（2）转膜：按照自下而上依次放置1张厚滤纸、PVDF膜、凝胶、1张厚滤纸的顺序，将其叠放于电转移仪器上进行转移，转移参数：10V，25min。

（3）封闭：2%脱脂奶粉-PBS，覆盖整张膜为宜，37℃，57r/min，1h。

（4）洗膜：摇床45-57r/min，PBST洗涤5min。

（5）一抗反应：Anti-his mAb多克隆抗体，用2%脱脂奶粉-PBS 1:2000稀释，总体积以覆盖整张膜为宜，摇床45r/min，37℃，1h。

（6）洗膜：PBST洗涤3次，摇床45r/min，5min/次。

（7）二抗反应：用2%脱脂奶粉-PBS, 按照1:4000稀释HRP-SPA。总体积覆盖整张膜为宜，摇床45r/min，37℃，1h；

（8）洗膜：摇床45r/min，PBST洗涤3次，5min/次；最后一次不用立即倒掉PBST溶液。先配好显色液。

（9）显色：（1）配制显色液1mL：具体根据说明书进行；（2）显色：倒掉PBST溶液，用枪吸显色液往膜上轻轻吹，反复操作，直到目的条带显色，用自来水冲洗终止反应。

（10）拍照记录结果。

12、表达蛋白的纯化

在最佳IPTG诱导浓度和诱导时间下，诱导培养含有ELF4的菌（100mL），8000r/min离心15min，收集菌体沉淀。纯化步骤如下：

（1）洗涤菌体：每管分别加入15 mL的PBS，漩涡振荡1min，悬起菌体，8000r/min离心15 min，去掉上清。

（2）超声裂解：往离心管中分别加入15mL的PBS，将菌体漩涡振荡1min，悬起，分别进行超声，每次超5s，间隔5s，每管合计1 h。

（3）离心洗涤：将超声裂解产物4℃，8000r/min离心15min，弃掉上清。

（4）二次超声：将第一次超声后的沉淀，用20mL包涵体洗涤液将沉淀悬起，漩涡振荡1min，进行超声，每次超5s，间隔5s，合计1 h。

（5）离心洗涤：将超声裂解产物4℃，8000r/min离心15min，弃掉上清。沉淀即为包涵体蛋白。用包涵体溶解液将包涵体溶解，UV法测定重组蛋白含量，4℃保存。

13、免疫原制备及免疫

14、IgY抗体提取与鉴定

（1）在无菌的条件下，用蛋黄分离器分离卵黄与卵白。

（3）室温静置1 h；

（4）弃沉淀，收集上清；

（5）12000r/min，4℃离心15min；

（7）收集上清用0.45μm滤膜过滤；

（8）滤过液采用超滤膜6000r/min，4℃离心15min，离心超滤。

（9）用含有体积分数为30%的甘油PBS缓冲液洗脱IgY抗体；

（10）采用紫外分光光度计测定浓度，并用SDS-PAGE方法鉴定分离的抗体纯度。

15、IgY抗体效价的测定

Western blot法测定抗pELF4抗体效价，操作步骤如下：

SDS-PAGE电泳分离ELF4重组蛋白，转膜后进行Western blot鉴定，方法如上述Western blot步骤。一抗为本试验所制备Anti-pELF4 IgY抗体，抗体分别作1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000稀释，每个稀释度的一抗对应一条转印膜，每条膜加入的二抗为HRP-兔抗鸡IgY二抗稀释度为 1:4000。

16、结果

（1）经PCR扩增得到猪ELF4基因片段大小为1989bp（图1），重组载体pET28a-pELF4经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定可见2条特异性条带，一条为空载体（分子量大小约为5.7kb），一条为1989bp的目的基因条带（图2）。经序列测定，猪ELF4开放阅读全长为1989bp，编码662氨基酸，其详细序列见SEQ No.1。

（2）诱导表达的重组猪ELF4蛋白分子量大小约为95kDa，蛋白的表达形式为可溶性（上清）和包涵体（IB）两种（图3）。

（3）提纯IgY 的免疫活性检测：将所提取的IgY抗体以不同的稀释倍数（1:2000、1:8000、1:8000）与表达的pELF4蛋白进行Western blot检测，如图4所示，低稀释倍数的条带很浓，抗体稀释到8000倍时，与抗原结合出现明显条带，说明所制备的抗体能够用检测猪源ELF4蛋白。

（4）Western blot鉴定与效价测定

重组蛋白经 SDS-PAGE 电泳后，进行转膜，使用抗ELF4-IgY 抗体作为一抗，检测抗体特异性。提取的抗ELF4-IgY 抗体可较好地结合ELF4蛋白(75kD)，经稀释测定猪ELF4特异性IgY抗体滴度为64000倍。

实施例2

一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤四、向纯化的融合蛋白中加入终浓度为0.05%的β-丙内酯，先置于4℃下 24h，再置于 37℃下2h，最后将融合蛋白中的外源污染微生物灭活，得到处理后的蛋白；

步骤五、将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合后，采用所得混合物对蛋鸡进行免疫，抽取第3次免疫后7天至30天的鸡蛋采用Western blot方法检测ELF4特异性卵黄抗体效价，检测抗体效价达到60000倍，从鸡蛋中提取收集卵黄抗体，即制备出猪ELF4蛋白卵黄抗体。

步骤二中所述用诱导物IPTG诱导重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4表达目的蛋白的条件为：在37℃下，将重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4培养至OD₆₀₀值为1.6时，加入终浓度为1mmoL/L的IPTG诱导6h。

步骤五中所述将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合的混合顺序为：将蛋白溶液缓慢加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为0.5mg/mL，同时以14000r/min的转速搅拌乳化1h。

实施例3

一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤四、向纯化的融合蛋白中加入终浓度为0.05%的β-丙内酯，先置于4℃下48 h，再置于 37℃下2h，最后将融合蛋白中的外源污染微生物灭活，得到处理后的蛋白；

步骤五、将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合后，采用所得混合物对蛋鸡进行免疫，抽取第3次免疫后7天至30天的鸡蛋采用Western blot方法检测ELF4特异性卵黄抗体效价，抗体效价达到40000倍，从鸡蛋中提取收集卵黄抗体，即制备出猪ELF4蛋白卵黄抗体。

步骤二中所述用诱导物IPTG诱导重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4表达目的蛋白的条件为：在37℃下，将重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4培养至OD₆₀₀值为1.6时，加入终浓度为1mmoL/L的IPTG诱导8h。

步骤五中所述将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合的混合顺序为：将蛋白溶液缓慢加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为0.5mg/mL，同时以14000r/min的转速搅拌乳化2h。

实施例4

一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤四、向纯化的融合蛋白中加入终浓度为0.05%的β-丙内酯，先置于4℃下40 h，再置于 37℃下2h，最后将融合蛋白中的外源污染微生物灭活，得到处理后的蛋白；

步骤五、将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合后，采用所得混合物对蛋鸡进行免疫，抽取第3次免疫后7天至30天的鸡蛋采用Western blot方法检测ELF4特异性卵黄抗体效价，抗体效价达到80000倍，从鸡蛋中提取收集卵黄抗体，即制备出猪ELF4蛋白卵黄抗体。

步骤二中所述用诱导物IPTG诱导重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4表达目的蛋白的条件为：在37℃下，将重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4培养至OD₆₀₀值为1.6时，加入终浓度为1mmoL/L的IPTG诱导7h。

步骤五中所述将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合的混合顺序为：将蛋白溶液缓慢加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为0.5mg/mL，同时以14000r/min的转速搅拌乳化1.5h。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

SEQUENCE LISTING

<110> 南阳师范学院

<120> 一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1989

<212> DNA

<213> 猪

<400> 1

atggctatta ccctgcagcc cagtgacctg atctttgagt ttgcaagcaa cggaatggat 60

gacatccacc agttggaaga cccctcagtg ttcccagctg tgattgtgga gcaggtcccc 120

tacccggaat tgctgcatct gtactcaggc ctggagctgg acgatgttca caatggcatc 180

ataacggatg ggaccttgtg catgacacag gatcagatcc tggagggcag ttttttgctg 240

acagatgaca atgaagcaac ctcacaaacc atgtcaacca ctgaagtctt gctcaacgtc 300

gagtcaccca gcgacatcct ggatgagaag cagatcttca gcacctccga aatgcttcca 360

gacccagagc ccgctccagc cgtcacgctg cccaactacc tgtttcctgt ctctgagccc 420

gacgccctga acagggctgg tgacactggt gaccaggagg agcactgtct gaaggagaag 480

gtccccagag aagacagtgc caagaagact ggaaaatcga agaagaggat ccggaagacc 540

aagggcaacc gcagtacctc acccgtcacc gaccccagca tccccatacg gaagaagtcc 600

aaggacggca aaggcagcac catctaccta tgggagttcc tcctcgccct tctgcaagat 660

aggaacacct gccccaagta catcaagtgg acccagagag agaaaggcat cttcaagcta 720

gtggattcca aagccgtgtc caagctgtgg gggaagcaga agaacaagcc tgacatgaac 780

tacgagacaa tggggcgggc gctaagatat tactaccaaa gaggcatcct tgccaaagtg 840

gaaggtcaga ggctggtgta ccagtttaag gagatgccca aggacctggt ggtgattgaa 900

gacgaggacg agagaagcga agttacagcc gcctcccctc aggcctccac cccctccacg 960

tcctctgctg gcagcacccg gagagccagc gccagggtct cctcccgggc tgccccgccg 1020

ggtaagggcg gcacctcgtg ggaaaagcca aaggtgcagc agcacgtcgg cctgcagcca 1080

tccgccagcc tggaatcggg accgtcccca gacgaggaga tgcccactac ctctaccgtg 1140

cttgtctctc cgccagagag ccaggccaag ctcaccaaag ctgtgagcac ttcggtgccc 1200

agcaacatcc acctgggagt ggcccctgtc gggtcgggct cggccttgac cctgcagaca 1260

atcccgctga ccacagtgct gaccaacggg cctcccgcca gtactactgc ttccacccag 1320

ctcgttctcc agagcgttcc acccgcttcg accttcaagg acaccttcac tttgcaggcc 1380

tccttccccc tgaataccag cttccaagag aaccaagtgg cagcgccagg ggcaccgctg 1440

atcctcagcg gcctccccca acttctggct gggaccaacc gtccgaacaa cccagcacca 1500

ccgtcggtca caggggctgg cccagcgggg cccagctctc agccccccgg gactgtcatt 1560

gcagccttca tcaggacttc cggtgccaca gccgcccctg gggtcaagga agggccgctg 1620

aggccctcct cgtatgtgca gggcgtgatg actggggccc ccatggaggg gctgctggtt 1680

cctgaagaga ccctgaggga gctcctgagg gatcaggctc accttcagcc acttccaacc 1740

caggtagttt ccaggggttc ccacaatccg agccttctgg gaaaccagac tctctctcct 1800

cccagccgcc ccactgttgg gctgaccccg gtggctgaac ttgagctctc ctcaggctca 1860

gggtccctgt ttatggctga gcctagtgtg gccacatctg ggagcctgct gaccagatcc 1920

ccaaccccag cccccttctc tccgttcaac cctacttccc tcattaagat ggagccccat 1980

gacatatga 1989

<210> 2

<211> 662

<212> PRT

<213> 猪

<400> 2

Met Ala Ile Thr Leu Gln Pro Ser Asp Leu Ile Phe Glu Phe Ala Ser

1 5 10 15

Asn Gly Met Asp Asp Ile His Gln Leu Glu Asp Pro Ser Val Phe Pro

20 25 30

Ala Val Ile Val Glu Gln Val Pro Tyr Pro Glu Leu Leu His Leu Tyr

35 40 45

Ser Gly Leu Glu Leu Asp Asp Val His Asn Gly Ile Ile Thr Asp Gly

50 55 60

Thr Leu Cys Met Thr Gln Asp Gln Ile Leu Glu Gly Ser Phe Leu Leu

65 70 75 80

Thr Asp Asp Asn Glu Ala Thr Ser Gln Thr Met Ser Thr Thr Glu Val

85 90 95

Leu Leu Asn Val Glu Ser Pro Ser Asp Ile Leu Asp Glu Lys Gln Ile

100 105 110

Phe Ser Thr Ser Glu Met Leu Pro Asp Pro Glu Pro Ala Pro Ala Val

115 120 125

Thr Leu Pro Asn Tyr Leu Phe Pro Val Ser Glu Pro Asp Ala Leu Asn

130 135 140

Arg Ala Gly Asp Thr Gly Asp Gln Glu Glu His Cys Leu Lys Glu Lys

145 150 155 160

Val Pro Arg Glu Asp Ser Ala Lys Lys Thr Gly Lys Ser Lys Lys Arg

165 170 175

Ile Arg Lys Thr Lys Gly Asn Arg Ser Thr Ser Pro Val Thr Asp Pro

180 185 190

Ser Ile Pro Ile Arg Lys Lys Ser Lys Asp Gly Lys Gly Ser Thr Ile

195 200 205

Tyr Leu Trp Glu Phe Leu Leu Ala Leu Leu Gln Asp Arg Asn Thr Cys

210 215 220

Pro Lys Tyr Ile Lys Trp Thr Gln Arg Glu Lys Gly Ile Phe Lys Leu

225 230 235 240

Val Asp Ser Lys Ala Val Ser Lys Leu Trp Gly Lys Gln Lys Asn Lys

245 250 255

Pro Asp Met Asn Tyr Glu Thr Met Gly Arg Ala Leu Arg Tyr Tyr Tyr

260 265 270

Gln Arg Gly Ile Leu Ala Lys Val Glu Gly Gln Arg Leu Val Tyr Gln

275 280 285

Phe Lys Glu Met Pro Lys Asp Leu Val Val Ile Glu Asp Glu Asp Glu

290 295 300

Arg Ser Glu Val Thr Ala Ala Ser Pro Gln Ala Ser Thr Pro Ser Thr

305 310 315 320

Ser Ser Ala Gly Ser Thr Arg Arg Ala Ser Ala Arg Val Ser Ser Arg

325 330 335

Ala Ala Pro Pro Gly Lys Gly Gly Thr Ser Trp Glu Lys Pro Lys Val

340 345 350

Gln Gln His Val Gly Leu Gln Pro Ser Ala Ser Leu Glu Ser Gly Pro

355 360 365

Ser Pro Asp Glu Glu Met Pro Thr Thr Ser Thr Val Leu Val Ser Pro

370 375 380

Pro Glu Ser Gln Ala Lys Leu Thr Lys Ala Val Ser Thr Ser Val Pro

385 390 395 400

Ser Asn Ile His Leu Gly Val Ala Pro Val Gly Ser Gly Ser Ala Leu

405 410 415

Thr Leu Gln Thr Ile Pro Leu Thr Thr Val Leu Thr Asn Gly Pro Pro

420 425 430

Ala Ser Thr Thr Ala Ser Thr Gln Leu Val Leu Gln Ser Val Pro Pro

435 440 445

Ala Ser Thr Phe Lys Asp Thr Phe Thr Leu Gln Ala Ser Phe Pro Leu

450 455 460

Asn Thr Ser Phe Gln Glu Asn Gln Val Ala Ala Pro Gly Ala Pro Leu

465 470 475 480

Ile Leu Ser Gly Leu Pro Gln Leu Leu Ala Gly Thr Asn Arg Pro Asn

485 490 495

Asn Pro Ala Pro Pro Ser Val Thr Gly Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ser

500 505 510

Ser Gln Pro Pro Gly Thr Val Ile Ala Ala Phe Ile Arg Thr Ser Gly

515 520 525

Ala Thr Ala Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Pro Leu Arg Pro Ser Ser

530 535 540

Tyr Val Gln Gly Val Met Thr Gly Ala Pro Met Glu Gly Leu Leu Val

545 550 555 560

Pro Glu Glu Thr Leu Arg Glu Leu Leu Arg Asp Gln Ala His Leu Gln

565 570 575

Pro Leu Pro Thr Gln Val Val Ser Arg Gly Ser His Asn Pro Ser Leu

580 585 590

Leu Gly Asn Gln Thr Leu Ser Pro Pro Ser Arg Pro Thr Val Gly Leu

595 600 605

Thr Pro Val Ala Glu Leu Glu Leu Ser Ser Gly Ser Gly Ser Leu Phe

610 615 620

Met Ala Glu Pro Ser Val Ala Thr Ser Gly Ser Leu Leu Thr Arg Ser

625 630 635 640

Pro Thr Pro Ala Pro Phe Ser Pro Phe Asn Pro Thr Ser Leu Ile Lys

645 650 655

Met Glu Pro His Asp Ile

660

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actgaattca tggctattac cctgcagccc agt 33

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actaagcttt tatcatatgt catggggctc catcttaatg 40

Claims

1.一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、以猪肾PK15细胞系细胞为材料，提取总RNA为模板，采用RT-PCR法扩增得到猪ELF4基因片段，将扩增得到猪ELF4基因片段与pET28a载体连接并转化至Rosetta(DE3)感受态细胞，获得重组表达菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4；所述猪ELF4基因核苷酸序列列如SEQ ID No.1所示；

步骤三、从表达目的蛋白的重组表达菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4中分离纯化得到目的蛋白；所得目的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

步骤四、向目的蛋白中加入终浓度为0.05%的β-丙内酯，先置于4℃下 24-48 h，再置于37℃下2h，将目的蛋白中的外源污染微生物灭活，得到处理后的蛋白；

2.如权利要求1所述猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤一中所述RT-PCR法扩增所用引物为：

pELF4-S：ACTGAATTCATGGCTATTACCCTGCAGCCCAGT；

pELF4-R：ACTAAGCTTTTATCATATGTCATGGGGCTCCATCTTAATG。

3.如权利要求1所述猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤二中所述用诱导物IPTG诱导重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4表达目的蛋白的条件为：在37℃下，将重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4培养至OD₆₀₀值为1.6时，加入终浓度为1mmoL/L的IPTG诱导6-8h。

4.如权利要求1所述猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤四中所述将目的蛋白中的外源污染微生物灭活的方法为：向目的蛋白中加入终质量浓度为0.05%的β-丙内酯，先置于4℃下24 h，再置于37℃下2h。

5.如权利要求1所述猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤五中所述将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合的混合顺序为：将蛋白溶液缓慢加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为0.5mg/mL，同时以14000r/min的转速搅拌乳化1-2h。

6.如权利要求1所述猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤五中所述对蛋鸡进行免疫的方法为，注射免疫，剂量为0.5mL/只；依次于初次免疫后第21天和51天，进行第2次和第3次加强免疫，免疫剂量依次为0.5mL/只和1mL/只。