CN105968175A

CN105968175A - 一种重组小反刍兽疫病毒n蛋白及其表达方法和应用

Info

Publication number: CN105968175A
Application number: CN201610230766.8A
Authority: CN
Inventors: 步志高; 陈伟业; 刘文兴
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2016-04-14
Filing date: 2016-04-14
Publication date: 2016-09-28
Anticipated expiration: 2036-04-14
Also published as: CN105968175B

Abstract

本发明提供重组小反刍兽疫病毒N蛋白及其表达方法和应用。其中，所述重组小反刍兽疫病毒N蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。本发明还提供稳定表达所述重组小反刍兽疫病毒N蛋白的CHO‑PPRV‑N细胞系，其保藏编号为CGMCC No.12281。本发明还提供包含所述重组小反刍兽疫病毒N蛋白的检测小反刍兽疫的试剂盒。

Description

一种重组小反刍兽疫病毒N蛋白及其表达方法和应用

技术领域

本发明属于生物学领域。具体地，本发明涉及一种重组小反刍兽疫病毒N蛋白及其表达方法和应用。本发明还提供稳定表达所述重组小反刍兽疫病毒N蛋白的CHO-PPRV-N细胞系，其保藏编号为CGMCC No.12281。

背景技术

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(Pestedes petits ruminants virus，PPRV)引起的主要感染山羊和绵羊等小反刍兽的一种急性、高度接触性病毒性传染疾病，具有高发病率和死亡率，分别高达100％和90％(Abubakar，etal.，2008)。其也称为羊瘟疫，是非洲和亚洲等小反刍动物养殖量多的区域流行的一种重要动物疾病(Awa DN，et al.，2000；Roeder PL，et al.，1994；Shaila MS，et al.，1996)。由于PPR能够造成巨大的经济损失，世界动物卫生组织(Office of International DesEpizooties，OIE)很早就将其列为A类法定传染病之一(OIE Manual，2000)，并且PPR也是OIE要求必须通报的动物烈性传染病之一(Diallo A，2006)。目前，其严重影响着世界尤其是发展中国家畜牧业经济的发展，OIE和国际粮农组织(Food and AgricultureOrganisation，FAO)制订了到2030年彻底根除该疾病的目标。同时，我国也将其列为一类动物疫病，是《国家动物疫病中长期防治规划(2012-2020年)》明确规定重点防范的外来动物疫病之一。然而，目前还没有良好的诊断方法能够很好的区分该疾病的自然感染和免疫感染，进而影响了彻底根除净化PPR。

第二次世界大战期间，据报道PPR首次出现在西非的象牙海岸(Gargadennec L，etal.，1942)，此时其被称为假性牛瘟、口腔炎肺肠炎综合症等(Braide VB，1981)。随后，PPR在撒哈拉沙漠与赤道之间的许多非洲国家流行。1987年该疾病首次发生在亚洲的印度南部地区，并且在1993年至1995年期间，传入阿拉伯半岛、中东和南亚的部分国家地区，且在当地流行。1991年，印度旁遮普省根据临床症状和以前的尸体解剖结果(无实验室的确诊)(Amjad H，et al.，1996)报道了在山羊群体中发生的类似牛瘟的病例，同时，巴基斯坦也已公布了PPR疾病的发生(Athar M，et al，1995；Pervez K，et al.，1993)。最近几年，PPR已向非洲南部扩散，远到坦桑尼亚南部(2008)、刚果民主共和国和安哥拉(2012)(Banyard，etal.，2010；Libeau，et al.，2014)。北非也有该疾病的报道，包括突尼斯(2006)、摩洛哥(2008)、阿尔及利亚(2011)。除此之外，在2011-2012年期间，土耳其在欧洲的部分地区发生了12起PPR疫情(Libeau，et al.，2014)。2007年该疾病首次传入我国西藏阿里地区，并且近年来(2013年12月-2014年5月)在我国各地频繁爆发，至少有15个省区受其危害(Banyard，et al.，2014)(图1)，并且该疫情传播速度快、跨度大、风险高，给我国的畜牧业生产造成了巨大的经济损失，给该疫病的防控工作带来了严重的威胁。

绵羊和山羊是PPRV的自然宿主，山羊比绵羊易感，且不同品种的山羊易感性也具有差异；牛(Anderson and McKay，1994；Lembo，et al.，2013；Sen，et al.，2014)、水牛(Govindarajan，et al.，1997)和猪(Nawathe and Taylor，1979)被PPRV感染后出现亚临床症状，但是不能够排泄病毒。也有报道PPRV能感染主要在半散养条件下生活的野生动物(Parida S，et al.，2015)。该疾病在一年四季中都能发生，但在多冷季节和干燥寒冷的季节中多发。另外，在活小反刍动物贸易密集期间，PPRV更容易在活畜之间相互传播，以至于更易引发PPR疫情的爆发(于红等，2009)。

PPRV主要通过感染动物与易感动物的接触传播，被感染动物呼出的气体和临床排泄物(眼泪、鼻液、唾液、粪便等)都含有PPRV。该病毒是温度敏感性病毒，并且在干燥环境下能够快速灭活(Rossiter and Taylor，1994)。康复的感染动物可以获得长期的免疫保护。然而，在年幼的易感动物群体与那些已被感染的并且表现温和型疾病形式的动物混合期间，该病毒可以通过温和型疾病在动物之间传播，也容易导致PPR的爆发(Couacy-Hymann，et al.，2007；Banyard，et al.，2014)。

在PPRV主要感染的山羊和绵羊(Nanda，et al.，1996)，且临床症状较为典型。该疾病典型的潜伏期一般为4-6天。在该疾病的急性期，动物主要表现为持续3-5天的高热(高达41℃)，同时伴有精神萎靡、食欲不振和口鼻部干燥等；逐渐地，眼鼻排出大量分泌物，其由浆液样变为黏液性化脓性。口腔出现腐蚀性坏死性溃疡。在该疾病的后期，动物出现严重的带血样腹泻、咳嗽以及腹式呼吸，最终，动物呼吸困难、体重严重减轻，甚至发生死亡等，同时，未死亡康复的动物可以获得针对PPRV的终生的免疫保护(Balamurugan，et al.，2014)。该病在严重爆发时，发病率可以达到100％，并且具有较高的死亡率(Pope，et al.，2013)。另外，PPRV具有高噬淋巴细胞性，并且感染动物后经常导致严重的免疫抑制，这进而导致机体白细胞减少和抗体反应降低(Pope，et al.，2013；Rajak，et al.，2005)。病毒的强毒株可以导致显著的免疫抑制，然而疫苗接种只引起短暂的白细胞减少症，这对免疫应答没有显著的影响(Rajak，et al.，2005)。

PPR作为一种严重的跨国动物疫病，是阻碍全世界畜牧经济发展的重要因素，严重影响着扶贫工作、食品安全、人类健康以及社会经济发展等。对于目前全球PPR的爆发形式，OIE报道全世界约有70个国家感染和疑似感染PPR，其中，60％以上发生在非洲(包括北非)，其他发生在亚洲(东南亚、中国、南亚和中亚以及包含土耳其在内的西欧)和中东地区，另外50个国家处在PPR的威胁之中(OIE and FAO，2015)。据FAO评估，在2012-2017年期间，南亚区域合作联盟(South Asian Association For Regional Cooperation，SAARC)地区每年所有的PPR发病率、死亡率、生产损耗以及治疗费用可能导致约3亿美元的经济损失，其中，只在印度每年损失就达到约2.5亿美元(Felix，et al.，2013)。另外，在全球约18亿的小反刍动物中，约有62.5％受到PPR的威胁(Felix，et al.，2013)。根据广泛统计，肯尼亚有120万绵羊和山羊死于PPR，损失2360万美元，以及产奶量下降210万升(Jonathan Rushton，etal.，2015)。有关报道发现尼日尔中部的小反刍动物血清中有高阳性率PPR抗体，这表明了该疾病发生频繁(Stem，1993)，并且该国每5年爆发一次的PPR疫情，也主要限制了其小反刍动物产品的生产。随后，Martrenchar(1999)等人推断伴随着寄生虫感染的PPR和羊痘(Capripox，CP)的混合感染，也正影响着咯麦隆北部地区小反刍动物产品的生产。在我国近年来，特别是2013年-2014年期间，PPR对全国农业造成了严重的经济损失。因此，PPR不但限制着畜牧业生产特别是发展中国家小反刍动物养殖业的发展，而且同时也是各国间贸易出口的主要限制因素。

PPRV与牛瘟病毒(Rinderpest virus，RPV)、犬瘟热病毒(Canine distempervirus，CDV)、人类麻疹病毒(Human Measles virus，MV)、海豹瘟病毒(Phocine distempervirus，PDV)等病毒同属于副粘液病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)。结构上，PPRV粒子为有囊膜且多为圆形和椭圆形的多形性病毒粒子，大小为150nm-700nm(Bourdin P，et al.，1967)。其中，囊膜来自病毒感染的细胞膜，厚度约为8.5nm-14.5nm，囊膜上有纤突，长度为8nm-15nm，并且纤突上镶嵌有包括病毒融合蛋白(fusion，F)和血凝素糖蛋白(haemagglutinin，H)在内的糖蛋白膜粒(Parida S，et al.，2015)。虽然纤突上只含有血凝素而没有神经氨酸酶，但是其同时具有神经氨酸酶和血凝素活性。PPRV总长约1000nm的核衣壳呈螺旋对称，由核蛋白质(nucleoprotein，N)形成。核衣壳的直径约为18nm，螺距为5nm-6nm，且缠绕成团(井波等，2004)。其中，N蛋白与磷蛋白(phosphoprotein，P)和RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(Polymerase or large protein，L)三种蛋白质共同组成位于PPR病毒囊膜内的核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)复合物，(图2)(Parida S，etal.，2015)。另外，基质蛋白(matrix protein，M)位于病毒囊膜的内表面，是连接核糖核蛋白和膜蛋白的纽带(图2)。

PPRV全基因组含有15948个核苷酸(Bailey，et al.，2005)，与其他副粘病毒一样具有“六碱基规则”(rule of six)(Calain and Roux，1993)。最近也报道了六聚体核苷酸单病毒插入非编码区(Bao J，et al.，2014)。N蛋白完全壳体化的基因组可以有效的进行基因复制和病毒繁殖(Bailey，et al.，2007)。PPRV基因组为不分节段的单股负链RNA。该基因组包括六个转录单元(transcriptional units)，RNA链从3’到5’端依次有N-P-M-F-H-L 6个基因，分别编码6中结构蛋白N、P、M、F、H和L蛋白(Bailey，et al.，2007)以及两种非结构蛋白-C蛋白和V蛋白，其是由P基因开放阅读框分别通过替换起始密码子和RNA编辑来编码(图3)(Mahapatra，et a1.，2003)。PPRV基因组3’和5’端序列是互补和保守的，并且在病毒繁殖过程中的复制、转录以及RNA基因的包装中是重要的调控元件(Banyard，et al.，2005)。该病毒基因组的启动子(genome promoter，GP)由其前导区构成，其包含 N基因的3’端非翻译区(untranslated region，UTR)，相似的，具有短的拖尾序列的L基因5’端的UTR形成反基因组启动子(anti-genome promoter，AGP)。总体来说，在核苷酸和氨基酸序列水平上，该病毒基因组相对保守性的最大差异分别是12％和8％(Muniraju，et al.，2014)。

PPRV N基因是PPRV基因组的第一个基因，只包含一个开放阅读框(open readingframe，ORF)，长1575nt，开始于108nt AUC处，终止于1685nt AUU处，在有意义链中是AUG和UAA(Muthuehelvan，et al.，2006a；Bailey，et al.，2007；Mahapatr，et al.，2003；Muthuehelvan，et al.，2006b)，编码525个氨基酸残基。相关研究表明PPRV Nigeria/75/1株N基因全长1674nt，并且含有一个Poly(A)尾，在3’端含有前导序列，在ORF终止子下游1739nt-1744nt间有一个多聚U序列(U6GAAUCC)，该序列具有高度保守性，且是终止和多腺苷酸化的信号。在多聚U后紧跟一个保守的三聚体(GAA)，是基因间的一个区域，是激活病毒多聚酶的一个重要信号，不参与mRNA合成时的翻译。

PPRV N蛋白是由N基因编码的含量最丰富的主要结构蛋白(Diallo，et al.，1987)，分子量约为58KDa(Ismail，et al.，1995)，是形成PPRV的核糖核蛋白(RNP)复合物的主要蛋白，在病毒的复制和转录中起着重要作用。该N蛋白与其他麻疹病毒N蛋白序列的相似性在67％-74％之间(Barrett，et al.，2006)。PPRV N蛋白有4个主要区域，分别是高度保守区-氨基末端和蛋白中部的I区和III区，其保守性在75％-90％之间；123-144氨基酸处的易变区域-II区和C端的IV区，其同源性为17％-40％。Buckload等研究表明针对麻疹病毒属所有病毒的N蛋白的单克隆抗体(monoclone antibody，McAb)表位大多数在IV区，只有一个在二区，并且N蛋白的C端多数暴露在外面，可能与囊膜蛋白相连接。因此，有关通过N蛋白对PPR诊断的各种研究，一般都是利用了N蛋白的IV区基因或肽段。

有关研究已经证实麻疹病毒属的RPV、CDV以及MV等病毒的N蛋白具有核定位信号(Nuclear localization signal，NLS)和核输出信号(Nuclear export signal，NES)(Sato，et al.，2006)，现在对N蛋白NLS的研究正进一步向PPRV延伸。麻疹病毒属病毒N蛋白的NLS和NES在位置上具有保守性，一般分别位于70-77和4-11位氨基酸处，其中MV N蛋白的NLS 结构域不仅在70-77位氨基酸处，而且在其他区域也存在，NLS是富含有亮氨酸和异亮氨酸的结构域(Sato，et al.，2006)。PPRV N蛋白的NLS和NES与CDV非常相似，CDV和PPRV的NLS分别为TGILISIL和LLRSLTLF，NES分别为TGVLISML及LLKSLALF。研究表明麻疹病毒属病毒N蛋白在哺乳动物细胞中表达时，具有进入细胞核的固有的能力(Huber，et al.，1991；Shin，et al.，1997)，这可能与NLS和NES有关。另外，Shin等还报道了CDV N蛋白可以运输到细胞核中，然而，去掉氨基酸序列N端区域(1-80位氨基酸)后N蛋白只滞留在细胞质中(Yoshida，et al.，1999)。

另外，N蛋白还具有重要的免疫原性，虽然其不能够像H蛋白和F蛋白一样诱导机体产生中和抗体参与体液免疫和细胞免疫，进而不能诱导机体产生抗病毒的免疫保护作用(A.Diallo，unpublished data)(Sinnathamby，et al.，2001；Diallo，et al.，2007)，但是在感染动物血清中针对N蛋白的抗体占主导地位，因此，N蛋白对PPR诊断方法的研究具有重要意义，且在诊断方法的研究中也已经被广泛应用(Libeau，et al.，1994；Libeau，et al.，1995；Couacy-Hymann，et al.，2002)。

PPRV N蛋白在细菌、哺乳动物细胞和昆虫细胞中表达时，形成类核衣壳复合物(Mitra-Kaushik，et al.，2001)，可以在转染的真核细胞的细胞核和细胞质中检测到。目前，PPRV N蛋白已经在原核表达系统(Yadav V，et al.，2009)、真核表达系统-重组杆状病毒表达系统(Fuxiao Liu，et al.，2014)等系统成功表达。同时，在昆虫细胞中表达的外源蛋白-PPRV N蛋白可以进行适当的翻译前修饰，例如蛋白酶解加工(O’Reilly，et al.，1994)和二硫键的形成(Choi，et al.，2004；Kushima，et al.，2010)等，这些修饰可能与在哺乳动物细胞中表达的蛋白的修饰相一致。另外，相比较于原核表达系统，杆状病毒表达系统可以在一个感染的昆虫细胞中同时表达多个外源蛋白，并且该外源蛋白具有与它们的天然蛋白相似的功能(Liu，et al.，2013)。重组表达的PPRV N蛋白可以作为抗原用于PPR的诊断方法中，如酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。与弱毒PPRV作为ELISA的抗原相比较，重组PPRV N蛋白作为PPR的诊断抗原具有操作简单和避免了操作病毒带来的一系列危险，如避免PPRV弱毒的反强现象、避免抗原在批量生产中发生变异、避免了病毒在环境中的扩散等优点(Yadav V，et al.，2009)。因此，各表达系统表达的重组PPRV N蛋白作为诊断方法的抗原不但是PPR疾病控制与根除的较好选择，而且也在疾病根除后净化阶段中有着重要作用。目前已经在麻疹病毒属的数个病毒诊断中应用了重组抗原，例如RPV(Kamata，et al.，1993)、PPRV(Ismail，et al.，1995；Libeau，et al.，1995；Choi，et al.，2005；Dechamma，et al.，2006；Balamurugan，et al.，2006)、CDV(Latha，etal.，2007)和尼帕病毒(Nipah virus)(Yu，et al.，2006)等。然而，目前为止，还没有运用哺乳动物细胞系表达PPRV N蛋白，该方法表达的PPRV N蛋白除了具有上述优点外，其蛋白折叠和修饰更加全面，更接近于天然N蛋白结构，具有天然蛋白的活性，更适合作为ELISA等诊断方法的抗原。因此，迫切需要建立真核表达方法-构建细胞系，以便在哺乳动物细胞中真核表达PPRV N蛋白，更有效的应用在PPR诊断方法的研究中。

目前，国际上针对PPRV可用的实验室诊断方法有很大发展，主要分为三类：一是检测病毒和病毒抗原的诊断方法，例如病毒分离、抗原捕获ELISA、横向流动装置(lateralflow devices)等方法；二是病毒核酸诊断技术，如逆转录-多聚酶链式反应(reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)、实时定量PCR(real-time，PCR)、环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)(OIE，2012)等；三是如病毒中和实验(virus neutralization test，VNT)、竞争ELISA、间接ELISA等的血清学诊断技术检测PPRV抗体(表1)。其中，尽管VNT具有耗时耗力且组织培养设备要求较高，以及操作要求严格等缺点，但是由于其灵敏度高、特异性强及对PPRV的诊断较为准确，一直是PPR诊断的“金标准”(Furley，et al.，1987)。基于H蛋白或N蛋白的竞争ELISA已经成为商业化产品用来检测PPRV抗体，同时，也经常应用包含实时定量RT-PCR在内的RT-PCR来检测PPRV核酸。另外，Bruning-Richardson等也成功研发了基于针对特异性PPRV H蛋白的单克隆抗体的免疫层析横向流装置诊断方法，该方法可以用于现场诊断(Bruning-Richardson，et al.，2011)。最近，已证实野外条件下，在感染后早期(第4天)出现严重临床症状之前，可以用该方法进行PPR诊断(Baron，et al.，2014)。

随着近年来PPR在我国许多地区发生和流行，加强了对PPR的防控及对其诊断方法的研究，建立了检测PPRV核酸的RT-PCR诊断方法，且在通过原核或杆状病毒等表达系统表达PPRV N和H蛋白的基础上研究各种诊断方法，尤其是ELISA诊断方法(李刚等，2007)。

随着分子生物学和免疫学的发展，已经研究出多种检测PPR的诊断方法，如多种酶联免疫吸附试验以及分子生物学检测方法，然而其中c-ELISA诊断方法已成为OIE规定的检测PPR的标准方法(印春生，支海兵，2007)之一，可以作为VNT的替代诊断方法。基于PPRV特异性单克隆抗体的ELISA具有快速、特异性高及灵敏性强等特点，已在大规模检测PPRV相应的抗体和抗原中广泛应用。

Saliki和Anderson and Mckay基于中和PPRV H蛋白的单克隆抗体(monoclonalantibody，MAbs)建立了特异性检测PPRV抗体的竞争ELISA(c-ELISA)和阻断ELISA(blocking ELISA，B-ELISA)(Saliki，et al.，1994；Anderson and Mckay，1994；Libeau，etal.，1995；Singh，et al.，2004a；Singh，et al.，2004b)。其与VNT相比，其有较高的特异性和敏感性。根据Anderson and Mckay研究，非洲国家主要用基于MAbs的c-ELISA检测绵羊、山羊和牛血清中的PPRV抗体。另外，已经研发出基于PPRV多种不同MAbs的竞争ELISA诊断方法并在PPRV及抗体的检测中应用。如，可以有效检测出PPRV抗体的用PPRV N蛋白的MAbs建立的竞争ELISA，以及利用抗PPRV H蛋白上一个表位的特异性MAbs(4B11)和细胞传代疫苗株为抗原建立的c-ELISA，这两种c-ELISA诊断方法分别在检测PPRV抗体和感染动物恢复期血清时，都有较高的特异性和敏感性(Libeau，et al.，1995；Singh，et al.，2004a；Sreenivasa，et al.，2000)。目前，印度各地区广泛应用该诊断方法监测PPR疫情。而且，还研发了一种基于多克隆抗体(polyclonal antibody)的间接ELISA(i-ELISA)诊断方法，该方法是将Vero细胞传代培养的PPRV进行纯化作为抗原，检测绵羊和山羊血清中的PPRV抗体。与c-ELISA和VNT相比，该诊断方法有高特异性和敏感性，分别是95.09％和90.81％，100％和80％(Singh，et al.，2004b)。该c-ELISA可以作为进行血清学流行病调查时的一种侯选诊断工具(Balamurugan，et al.，2007)。

另外，相继研发的基于MAbs的免疫捕获ELISA和夹心ELISA(s-ELISA)也广泛应用在临床样品PPRV抗原的检测(Libeau，et al.，1994；Singh，et al.，2004c)。其中，法国OIE参考实验室(CIRAD-EMVT， France)研发免疫捕获ELISA诊断方法是目前国际上广泛接受的PPRV抗原检测方法(Libeau，et al.，1994)，但是其具有较高的应用成本。类似的，印度有关部门研发的基于抗PPRV N蛋白一个抗原表为MAbs(4G6)的s-ELISA诊断试剂盒通常应用于印度PPR临床样品PPRV抗原的检测或临床流行病学调查(Singh，et al.，2004c)。该方法与免疫捕获ELISA相比也是有效的。因此，急需研发一种应用成本低、且高特异性和敏感性的ELISA诊断试剂盒。

发明内容

本发明涉及一种重组小反刍兽疫病毒N蛋白及其表达方法和应用。所述重组小反刍兽疫病毒N蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。本发明还提供稳定表达所述重组小反刍兽疫病毒N蛋白的CHO-PPRV-N细胞系，其保藏编号为CGMCC No.12281。

本发明首次运用哺乳动物细胞真核表达方法来表达PPRV N蛋白。本发明通过将去除NLS(核定位信号)的PPRV N基因成功改造后，克隆至真核表达载体pCAG-neo中，建立能够在细胞培养上清中稳定表达PPRV N蛋白的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)系，并对该重组N蛋白表达量进行优化。经过筛选后，获得稳定表达所述重组小反刍兽疫病毒N蛋白的CHO-PPRV-N细胞系，其保藏编号为CGMCC No.12281。

本发明构建的重组小反刍兽疫病毒N蛋白(SEQ ID NO：1)是缺失核定位信号(NLS)的蛋白，其可在本发明筛选得到的CHO-PPRV-N细胞中稳定地分泌表达。

本发明还构建了编码所述重组小反刍兽疫病毒N蛋白的核苷酸序列，其中，经过密码子优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

同时，在绵羊体内制备了PPRV高免血清，并对其进行纯化与标记，制备HRP/生物素标记的绵羊抗PPRV多克隆抗体。之后，运用该多克隆抗体研究该重组PPRV N蛋白的免疫原性。该CHO细胞系表达的重组PPRV N蛋白可以作为诊断抗原，其与该酶标PPRV多克隆抗体共同为建立PPRV N蛋白的ELISA诊断方法鉴定了基础。

由此，在一个优选的实施方案中，本发明提供用于检测小反刍兽疫的试剂盒，所述试剂盒包含本发明所述的重组小反刍兽疫病毒N蛋白。进一步地，所述试剂盒还可以包含酶标记的PPRV多克隆抗体。所述试剂盒用于检测小反刍兽中的小反刍兽疫，例如，所述小反刍兽包括，但不限于，山羊、绵羊、鹿等。

因此，本发明提供下述技术方案：

1.一种重组小反刍兽疫病毒N蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码第1项所述的重组小反刍兽疫病毒N蛋白的核苷酸序列。

3.根据第2项所述的核苷酸序列，其如SEQ ID NO：2所示。

4.包含第1或2项所述的核苷酸序列的重组载体。

5.稳定表达第1项所述的重组小反刍兽疫病毒N蛋白的CHO-PPRV-N细胞系细胞，其保藏编号为CGMCC No.12281。

6.一种制备第1项所述的重组小反刍兽疫病毒N蛋白的方法，所述方法包括：培养第5项所述的CHO-PPRV-N细胞系细胞，获得由所述细胞表达的重组小反刍兽疫病毒N蛋白。

7.第1项所述的重组小反刍兽疫病毒N蛋白在制备用于检测小反刍兽疫的试剂盒中的应用。

8.第7项所述的应用，其中所述试剂盒还包含酶标记的PPRV多克隆抗体。

9.第8项所述的应用，其中所述试剂盒用于小反刍兽。

10.第9项所述的应用，其中所述小反刍兽选自山羊、绵羊、鹿。

11.一种用于检测小反刍兽疫的试剂盒，其中所述试剂盒包含第1项所述的重组小反刍兽疫病毒N蛋白。

12.第11项所述的检测小反刍兽疫的试剂盒，其中所述试剂盒还包含酶标记的PPRV多克隆抗体。

13.第11项所述的检测小反刍兽疫的试剂盒，其中所述试剂盒用于小反刍兽。

14.第13项所述的检测小反刍兽疫的试剂盒，其中所述小反刍兽选自山羊、绵羊、鹿。

本发明的目的和意义：

如背景技术部分所述，近几年来尤其是2013年以来，PPR在我国甚至全球爆发频繁，并且造成了巨大的经济损失，严重影响着发展中国家的经济发展，并且随着2015年我国农业部印发的《全国小反刍兽疫消灭计划(2016-2020年)》，全面启动全国小反刍兽疫消灭行动，力争到2020年全国消灭小反刍兽疫。建立高效的PPR诊断方法对我国甚至全球小反刍兽疫的消灭和净化具有重要意义。

PPRV N蛋白是PPRV中含量最高、免疫原性最强的主要结构蛋白，并且在感染动物血清中含有高滴度的针对N蛋白的抗体，因此，PPRV N蛋白在PPR的诊断研究中具有重要意义。近年来，主要通过原核表达系统和杆状病毒表达系统表达PPRV N蛋白，甚至是化学合成方法合成N蛋白。然而，这些方法都有一定的缺点，如原核表达方法表达的N蛋白不能够进行相关的修饰，杆状病毒表达系统虽然能够进行一定的蛋白修饰，但是与PPRV在哺乳动物细胞中复制表达的PPRV N蛋白的加工修饰仍然不同，并且需要操作病毒，存在一定的生物安全威胁性。为了克服以上缺点，获得更接近其天然构象的PPRV N蛋白，本发明首次运用哺乳动物细胞真核表达方法来表达PPRV N蛋白。本发明通过将去除NLS的PPRV N基因成功改造后，克隆至真核表达载体pCAG-neo中，建立能够在细胞培养上清中稳定表达PPRV N蛋白的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)系，并对该重组N蛋白表达量进行优化。同时，在绵羊体内制备了PPRV高免血清，并对其进行纯化与标记，制备HRP/生物素标记的绵羊抗PPRV多克隆抗体。之后，运用该多克隆抗体研究该重组PPRV N蛋白的免疫原性。该CHO细胞系表达的重组PPRV N蛋白可以作为诊断抗原，其与该酶标PPRV多克隆抗体共同为建立PPRV N蛋白的高特异性、高灵敏性的ELISA诊断方法鉴定了基础。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1显示2013年12月-2014年5月，PPR在我国的爆发情况(ProMedMail，2014)。

图2显示PPR病毒粒子结构(Banyard et al.，2010)。

图3显示PPRV基因组结构(Parida S，et al.，2015)。

图4显示重组质粒pCAG-PPRV-Nhis的示意图。

图5显示PPRV N基因的改造的示意图。Kozark序列：GCCGCCACC；SP基因序列：ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGGCCCGC；histag：CCACCACCACCACCACCA。

图6显示重组pCAG-PPRV-N_ΔNLS/his质粒的示意图。

图7显示PPRV-N_flag在细胞核中的表达。图7A是阳性单克隆细胞系，图7B是阴性对照。

图8显示PPRV N基因改造鉴定的琼脂糖凝胶电泳照片。M：DNA2000标记；泳道1：SP-PPRV-N_ΔNLS/hisPCR产物。

图9显示重组质粒pCAG-PPRV-N_ΔNLS/his的酶切鉴定图谱。M：DNA 5000标记；泳道1：用SacI和XhoI消化的空质粒pCAG-neo；泳道2：用SacI和XhoI消化的PPRV-N_ΔNLS/his片段；泳道3：用SacI和XhoI消化的重组质粒pCAG-PPRV-N_ΔNLS/his。

图10显示稳定表达PPRV N蛋白细胞系的筛选。图10A：初始筛选的单克隆细胞系的间接免疫荧光测定(IFA)：照片1：阳性对照(在CHO中瞬时转染质粒pCAG-PPRV-N_ΔNLS/his)，照片2：阳性单克隆细胞系，照片3：阴性对照；图10B：进一步筛选的单克隆细胞系的Western-Blot，泳道1：阳性对照(在CHO中瞬时转染质粒pCAG-PPRV-N_ΔNLS/his)，泳道2：筛选的阳性单克隆细胞系，泳道3：阴性对照。

图11显示细胞系CHO-PPRV-N的传代稳定性检测。A：间接免疫荧光测定(IFA)：在CHO-PPRV-N细胞系第1代、第8代、第15代、第22代中的PPRV-N表达；B：Western-Blot，M：预染色的蛋白梯度，泳道1th.8th.15th.22th：在CHO-PPRV-N细胞系第1代、第8代、第15代、第22代中的PPRV-N表达，N：阴性对照。

图12显示PPRV多克隆抗体的亲和纯化检测。M：预染色的蛋白梯度，泳道1：通过蛋白质G亲和纯化的PPRV多克隆抗体。

图13显示Western-Blot检测细胞系表达的PPRV N蛋白的抗原性。M：预染色的蛋白梯度，泳道1：CHO-PPRV-N细胞系表达的PPRV N蛋白，泳道2：阴性对照。

图14显示间接ELISA检测该重组蛋白的抗原性。

序列说明：

SEQ ID NO：1 重组小反刍兽疫病毒N蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO：2 编码重组小反刍兽疫病毒N蛋白的核苷酸序列

SEQ ID NOs：3-12 引物序列

生物材料保藏说明：

本发明构建并筛选得到了稳定表达缺失核定位信号的可分泌表达的小反刍兽疫N蛋白的CHO细胞系(CHO-PPRV-N)，其于2016年4月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，电话：(010)64807355，传真：(010)64807288，E-mail：cgmcc@im.ac.cn，网址：www.cgmcc.net)，保藏编号为CGMCC No.12281；其生长条件为：含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃，5％CO₂。

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

1.实验

1.1 材料

1.1.1 病毒株和细胞

小反刍兽疫病毒弱毒疫苗株(PPRV，Nigeria/75/1)最初由世界动物卫生组织提供，目前由本实验室保存(参见《陆生动物诊断试验和疫苗手册》，世界动物卫生组织，2004年，第5版)；非洲绿猴肾细胞(African green monkey kidney cell，Vero)(ATCC：CCL-81)用含有10％胎牛血清的DMEM培养液中培养传代；中国仓鼠卵巢细胞(Chinese HamsterOvary，CHO，购自ATCC，ATCC Number：CCL-61)用含有10％的胎牛血清的DF-12培养液(DMEM∶HAM’S/F-12为1∶1)中培养传代。

1.1.2 质粒

含有PPRV N基因的重组质粒pCA-N(Hu Qian-qian，et al.，2012)和pCAG-neo真核表达载体(来自去掉GFP和IRES基因序列的真核表达载体p4(Wen Zhi-yuan，et al.，2015))由本实验室按照分子生物学技术构建并保存。

1.1.3 试验动物

健康的小尾寒羊购自当地地区，并按照用于实验的动物的管理方法进行相应的护理。

1.1.4 主要试剂和仪器

T4DNA连接酶购自Thermo公司；Phanta^TM Super-Fidelity DNA Polymerase购自南京诺唯赞生物科技(Vazyme)有限公司；各种核酸限制性内切酶和DL5000DNA marker均购自TaKaRa公司；质粒小量和中量提取试剂盒以及核酸凝胶回收试剂盒均购自Qiagen公司；鼠源抗His-Tag的单克隆抗体(His-tag MAb)购自北京中杉金桥生物技术有限公司：辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG单克隆抗体、FITC标记山羊抗鼠IgG单克隆抗体、HRP标记的小鼠抗山羊IgG单克隆抗体、弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete Adjuvant，FIA)以及TMB显色液都购自Sigma公司；Lipofectamine 3000转染试剂购自invitrogen公司；蛋白预染marker和G418购自amresco公司。蛋白上样缓冲液购自索莱宝公司；胎牛血清(Fetalbovine serum，FBS)购自Excell公司，DMEM细胞培养基购自gibco公司，Opti-MEM细胞培养液购自Invitrogen公司，SFM4CHO无血清细胞培养液和HAM’S/F-12细胞培养液均购自Hyclone公司，CHO悬浮饲料反应器细胞培养液补料(CHO Feed Bioreactor Supplement)购自sigma公司；倒置荧光显微镜购自zeiss公司，普通倒置显微镜购自Olympus公司，半湿转转膜仪购自BioRad公司，乳化器由本发明所研制；细胞工厂购自鼎昊源(DHS)公司。

1.1.5 引物设计合成

根据GenBank中PPRV Nigeria75/1基因序列(HQ197753)，优化N基因序列的密码子以适合在哺乳动物细胞内表达，并在上海捷瑞生物公司合成，根据优化合成的序列，运用Oligo7引物设计软件设计引物PPRV-N-his-f/r，同时根据组织纤维蛋白溶酶原抗原信号肽(Signal peptide of the tissue plasminogen antigen，tPA SP)(Ling，Ye et al.，2003)基因序列(U63828.1)设计SP-N-f/r 3对引物，用于构建pCAG-PPRV-N_ΔNLS/his重组质粒。引物序列由吉林省库美科技有限公司合成(表2)。

1.2 方法

1.2.1 pCAG-PPRV-N_his重组质粒的构建

运用N-his2引物(表2)，采用PCR方法扩增出PPRV-N_his基因片段，并在其两端分别引入SacI和XhoI两个限制性核酸内切酶。用SacI和XhoI双酶切pCAG-neo真核表达载体以及PPRV-N_his基因片段，并用T4DNA连接酶16℃过夜连接，将该基因序列克隆至pCAG-neo载体，构建重组质粒pCAG-PPRV-N_his(图4)。并用SacI和XhoI两种限制性核酸内切酶酶切鉴定。

1.2.2 表达完整PPRV N蛋白CHO细胞系的构建及筛选

CHO细胞接种于六孔细胞培养板中，待细胞密度达到80％左右单层时，参照Lipofectamine 3000转染试剂说明书，将重组质粒pCAG-PPRV-Nhis转染至该细胞中。根据相关文献(Chen Wei-ye，et al.，2011)筛选表达PPRV N蛋白的CHO细胞系。对其进行间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay，IFA)(鼠源抗his标签单克隆抗体和FITC标记的山羊抗鼠IgG单克隆抗体分别作为一抗和二抗)，观察结果。同时，设未转染的亲本CHO细胞作为阴性对照。

1.2.3 PPRV N基因的改造

根据已经发表的麻疹病毒属有关病毒N蛋白NLS的文献(Sato，et al.，2006)，PPRVN基因的NLS位于N蛋白氨基酸序列的70-77位，剔除编码该NLS的基因序列及其上游的序列，并且在N基因的3’端引入哺乳动物偏嗜的his标签序列(CACCACCACCACCACCAC)作为N蛋白的的鉴定标签，以pCAG-N质粒为模板，以N-his-f/r引物(表2)为引物，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增出PPRV-N_ΔNLS/his基因片段；再以SP-N1-f/r引物(表2)作为PCR扩增引物，先以PPRV-N_ΔNLS/his片段为模板，扩增出含有SP基因序列3’端的30bp的 PPRV-N_ΔNLS/his序列，接着以SP-N2-f/r引物(表2)为引物，以第二次扩增出的PCR片段为模板，进行下一轮的PCR扩增，最后以SP-N3-f/r引物(表2)作为引物，以第三次扩增出的PCR片段为模板，进行PCR反应，最终扩增出5’端引入tPA SP基因序列的PPRV-N_ΔNLS/his基因序列(图5)，命名为SP-PPRV-N_ΔNLS/his(SEQ ID NO：2)。以上每次PCR扩增出的片段都通过1％琼脂糖核酸凝胶电泳分离PCR基因片段，之后运用胶回收试剂盒回收。并将最终扩增出的SP-PPRV-N_ΔNLS/his PCR基因序列测序鉴定正确性。1.2.4pCAG-PPRV-N_ΔNLS/his重组质粒的构建

前面章节扩增出SP-PPRV-N_ΔNLS/his的片段，基因片段上游和下游分别引入SacI和XhoI限制性核酸酶切位点。用SacI和XhoI限制性核酸内切酶双酶切回收的PCR产物，同时用这两种限制性核酸内切酶酶切pCAG-neo真核表达载体，之后分别进行胶回收，回收酶切产物。用T4DNA连接酶16℃过夜连接，将SP-PPRV-N_ΔNLS/his片段克隆至pCAG-neo真核表达载体上，以构建重组质粒并命名为pCAG-PPRV-N_ΔNLS/his(图6)，无菌转化至DH5α感受态后，涂至氨苄抗性的LB琼脂板上，37℃恒温细菌培养箱培养16h，无菌挑取单克隆菌落于灭菌LB液体培养液中，37℃摇床扩大培养16h，最终根据小提质粒试剂盒说明书提取细菌质粒。之后运用SacI和XhoI两种限制性核酸内切酶双酶切提取的质粒，以鉴定陔重组质粒的正确性，并且同时进行测序鉴定。

1.2.5 稳定表达PPRV N蛋白细胞系的构建及筛选

CHO细胞接种于六孔细胞培养板中，待细胞密度达到80％左右单层时，参照Lipofectamine 3000转染试剂说明书，将重组质粒pCAG-PPRV-N _ΔNLS/his转染至该CHO细胞中。转染后，细胞在5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养。之后，根据相关文献(Chen Wei-ye，etal.，2011)中的方法进行G418加压筛选、培养。

转染后的CHO细胞在G418压力下培养至细胞培养皿中出现单细胞克隆群，接着挑取生长状态良好的单细胞克隆分别传代至96孔、24孔、6 孔细胞培养板中扩大培养，同时采用IFA对N蛋白表达进行初步筛选，采用Western-Blot试验对表达量高的克隆株进行进一步筛选。

待96孔细胞培养板中的细胞克隆密度达到80％以上时，进行IFA试验初步筛选表达PPRV N蛋白的细胞克隆株，方法如下：

(1)固定：用3％的多聚甲醛室温固定细胞30min，弃掉液体，用1xPBS洗3遍，5min/遍；

(2)透膜：用0.5％Triton X-100室温透膜30min，弃掉液体，用1xPBS洗3遍；

(3)孵育一抗：以1∶200倍稀释鼠源抗his标签单克隆抗体为一抗，室温孵育1h，之后弃掉液体，用1xPBST洗3遍，5min/遍；

(4)孵育二抗：以1∶200倍稀释的FITC标记的山羊抗鼠IgG单克隆抗体作为二抗，室温避光孵育1h；

(5)荧光显微镜观察：用1xPBST洗3遍，5min/遍，荧光显微镜下观察结果并分析。

初步筛选出绿色荧光较强的阳性单细胞克隆株。同时以CHO亲本细胞作为阴性对照。

将IFA试验初步筛选出的阳性单细胞克隆株的细胞培养5天后，收获上清，加入蛋白上样缓冲液，煮沸10min后，进行SDS-PAGE电泳分离，经半干转移法转移至硝酸纤维素膜上；用5％脱脂乳4℃封闭过夜。封闭后，用1xPBST洗膜3遍，5min/遍；以1∶200倍稀释的鼠源抗his标签单克隆抗体为一抗(2.5％脱脂乳稀释)，室温孵育膜1h；1x PBST洗膜3遍，5min/遍后，以1∶1000倍稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG单克隆抗体为二抗，室温孵育膜1h；1xPBST洗膜3遍，5min/遍，用DAB显色试剂盒显色；观察结果并分析。同时设CHO亲本细胞培养上清作为阴性对照，设瞬时转染pCAG-PPRV-N_ΔNLS/his后72h的CHO细胞培养上清作为阳性对照。最终筛选出生长状态较好、PPRV N蛋白表达量较高的单细胞克隆株，并进行扩增与保存于液氮。将最终获得的表达PPRV N蛋白的细胞克隆株命名为CHO-PPRV-N。该细胞株于2016年4月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，电话： (010)64807355，传真：(010)64807288，E-mail：cgmcc@im.ac.cn，网址：www.cgmcc.net)，保藏编号为CGMCC No.12281；其分类命名为“稳定表达缺失核定位信号的可分泌表达的小反刍兽疫N蛋白细胞系”，生长条件为：含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃，5％CO₂。

1.2.6 CHO-PPRV-N细胞系传代稳定性检测

将CHO-PPRV-N细胞在G418压力下常规传代，在传代至第1代、第8代、第15代、第22代时分别在96孔板中进行IFA试验，根据前面的方法，以1∶200倍稀释鼠源抗his标签单克隆抗体为一抗，以1∶200倍稀释的FITC标记的山羊抗鼠IgG单克隆抗体作为二抗，在荧光显微镜下观察结果并分析。同时，收获各代次培养5d的细胞上清，根据前面的方法，进行Western-Blot试验，分别1∶200倍稀释的鼠源抗his标签单克隆抗体为一抗，以1∶1000倍稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG单克隆抗体为二抗，最后以DAB显色试剂盒进行显色，观察结果并分析。

1.2.7 酶标绵羊抗PPRV多克隆抗体的制备

为了检测CHO-PPRV-N细胞系表达的重组N蛋白的抗原性，制备酶标绵羊抗PPRV多克隆抗体，同时也可用于今后的竞争ELISA诊断方法。

1.2.7.1 免疫抗原的制备

用细胞工厂大量扩增Vero细胞，待其长到80％-90％左右时，接种PPRV，待细胞病变(CPE)达到80％左右时，反复冻融3次。收获细胞和上清培养液，离心(3000g，20min)后，弃沉淀，病毒上清液离心(27000g，2h)后弃上清，留沉淀；病毒沉淀用适量的灭菌PBS重悬，用20％和60％的蔗糖进行蔗糖密度梯度离心(30000g，2.5h)；用带长针头的注射器吸出20％和60％两个蔗糖密度梯度间的病毒沉淀，加入适量的灭菌PBS混匀，离心(30000g，2.5h)进行脱糖处理，弃去上清，将沉淀溶解在适量的灭菌PBS中。待病毒沉淀完全溶解后混匀，测病毒的蛋白含量，根据bradford试剂盒(BIO-RAD)说明书，运用酶标仪(BIO-RAD)测得BSA标准液和待测病毒蛋白的吸光光度值(OD_595nm)，绘制BSA标准曲线。之后将待测蛋白的OD_595nm值代入标准曲线中，计算出PPRV的浓度为1.46ug/ul，分装，于-80℃保存备用。

1.2.7.2 绵羊抗PPRV高免血清的制备

选取两只健康状况良好的绵羊，编号分别为13号和16号，免疫前颈静脉采血并分离血清。首先将PPRV Nigeria/75/1疫苗按照10^3.5TCID₅₀的剂量通过皮下注射免疫绵羊。免疫后4周进行第二次加强免疫，免疫抗原是与水性佐剂按照一定比例混匀的蔗糖垫超离纯化的PPRV病毒粒子，剂量为200ug/只。第二次免疫后第四周颈静脉采血，并进行第三次加强免疫，免疫抗原是蔗糖垫超离纯化的、经FIA乳化的PPRV病毒粒子，免疫剂量为1.3mg蛋白/只绵羊，免疫途径为10个点皮下注射，每个点注射200ul。第三次免疫后第三周颈静脉采血，并进行第四次加强免疫，免疫抗原、剂量和途径同第三次免疫。该免疫后第10天，颈静脉采血，并使用本实验室构建的PPRV的IPMA诊断方法(张家林，2015)检测以上血清的抗体效价，方法如下：首先用封闭液封闭已经制备好的IPMA 96孔反应板，4℃，过夜封闭；样品稀释液稀释待测血清至适当的稀释倍数；弃掉反应板中的封闭液，用1xPBST洗3遍，5min/遍后，将从1000倍开始倍比稀释好的绵羊血清加入IPMA反应板中，37℃反应1.5h；孵育二抗：弃掉反应板中的液体，1xPBST洗3遍，5min/遍后，加入HRP标记的小鼠抗山羊IgG单克隆抗体(1∶5000倍稀释)，100ul/孔，37℃，反应1h；显色：弃掉反应板中的液体，1xPBST洗3遍，5min/遍后，TMB 50ul/孔显色；光学显微镜下观察结果，记录血清抗体效价。如果抗体效价仍然比上一次免疫更高，则重复第四次免疫，直至抗体效价不再提高。

最后一次免疫后第14天根据动物福利要求将羊处死并采血。将采集的血液在37℃温箱中放置1h，之后4℃过夜，将析出的血清离心(5000g，5min)，弃去血细胞，即为绵羊抗PPRV高免血清。分装后，-20℃保存备用。

1.2.7.3 绵羊抗PPRV多克隆抗体的纯化及检测

利用亲和层析(Protein G)的方法纯化绵羊抗PPRV抗血清中的抗体，以制备PPRV多克隆抗体。具体纯化方法如下：

(1)血清预处理：为了避免血清中蛋白质聚集将血清放入冰水或4℃冰箱中缓慢解冻，之后用0.22um孔径的滤器过滤血清以出去血清中多余的脂类等杂质，再与等体积的PBS混匀，调至PH 7.8。

(2)平衡亲和柱-ProteinG琼脂糖凝胶预装柱(武汉福因德科技有限公司)：用10倍体积的PBS清洗柱子，同时将柱子下端与核酸蛋白检测仪(上海沪西分析仪器厂)进液口连接在一起，并固定。

(3)上样：在PBS平衡柱子时，调节核酸蛋白检测仪，使其数值稳定在0左右，接着将样品加入上样柱床，核酸蛋白检测仪上的数值慢慢升高，同时收集液体(流穿液，以备再次过柱纯化)，当核酸蛋白检测仪的数值下降到平衡数值，不再下降时，停止收集流穿液，循环上样。

(4)抗体洗脱：当核酸蛋白检测仪的数值保持较低并且稳定时，同时，待柱床液面快流干时，轻轻将洗脱液(PH 7.2 0.1M的Gly-HCl)加入柱床上。之后当核酸蛋白检测仪的数值迅速升高时，迅速多管顺次接取洗脱的液体，记录好接取的液体顺序，并迅速用中和液(PH 8.0 0.5M Tris-Cl)中和，以维持抗体的生物活性，从而避免抗体失活。

(5)洗脱完毕后，当数值变低并不在变动时，用至少5倍体积的PBS，2-4ml/min流速清洗平衡柱子。

(6)用保存液(20％乙醇)封闭柱子上下两端，4℃保存。

(7)将洗脱后的抗体放入处理好的透析袋中，4℃TBS(50mM Tris，150mM NaCl以及0.05％叠氮化钠溶于1L蒸馏水中，并用HCl调节PH 8.0)，透析，2h换一次TBS，换5次左右，用PEG2000浓缩至所需体积，收集抗体，以备下一步进行对应的标记。

取适量纯化后的多克隆抗体，加入蛋白上样缓冲液，煮沸10min，之后进行SDS-PAGE电泳分离。分离结束后，采用考马斯亮蓝R250进行染色，室温摇床轻摇2h，之后运用脱色液进行脱色，分析结果。

根据bradford试剂盒(BIO-RAD)说明书，测纯化后的抗体的浓度并将浓度调至2mg/ml。

1.2.7.4 绵羊抗PPRV多克隆抗体的标记

HRP标记：用双蒸水稀释辣根过氧化物酶(HRP)至10mg/ml(溶液为棕黄色)，取10ml HRP加入到10ml 0.06mol/L NaIO4溶液中(溶液变为灰绿色)，4℃，静置30min，氧化HRP；在上述溶液中加入10ml 0.16mol/L的乙二醇(溶液又变回棕黄色)，室温静置30min，终止氧化反应；加入50mg等体积纯化的待标记的PPRV多克隆抗体，混匀，在碳酸盐缓冲液中4℃透析过夜；之后取出透析袋中的液体，加入10ml 5mg/ml NaBH4，混匀，室温静置2h，将HRP与抗体的结合物还原成稳定的结合物；再用10ml 50％饱和硫酸铵(NH4)₂SO₄溶液盐析一次，4℃离心(12000rpm，30min)，收取沉淀，用5ml 0.01mol/L的PBS重悬，装入透析袋；溶液在PH7.40.01mol/L的PBS中透析过夜；取出透析袋中的液体，加入等体积60％甘油，测定工作效价后，小量分装，-20℃保存备用。

生物素标记：首先取10mg待标记的纯化的PPRV多克隆抗体于超滤管中，并加入相应体积的标记缓冲液(PH 7.4 PBS)，使抗体的终浓度为2mg/ml，离心(12000g，10min)；之后加入生物素溶液和适量标记缓冲液(PH 7.4PBS)至上述超滤管中，使终体积为0.5ml(超滤管的最大体积)，并轻轻吹打混匀，放入37℃恒温箱中避光孵育30min，同上离心；加入适量标记缓冲液，至上述超滤管中使终体积为0.5ml，并轻轻吹打混匀，同上离心；重复该步骤一次；再加入2ml标记物保存液至超滤管(0.01M Tris-Cl)中，轻轻吹打，将滤芯倒转放置于另一个离心管中，离心(6000g，10min)；最后收集离心管中的溶液，即为生物素标记的抗体。

根据测得的纯化后的多克隆抗体的浓度，将酶标后的抗体浓度调至1mg/ml。

1.2.5.5 HRP和生物素标记PPRV多克隆抗体结果检测

通过ELISA方法检测PPRV多克隆抗体的标记情况，同时设PPRV未包被孔作为对照。

HRP标记的PPRV多克隆抗体：

(1)包被：用PH 9.6 50mM的碳酸盐缓冲液(CBS)作为包被液，稀释PPRV使其终浓度为1ug/ml，100ul/孔包被96孔酶标板，4℃过夜。

(2)封闭：弃掉酶标板中的包被液，用1xPBST洗涤3次，每次3min，用1xPBST配置的5％脱脂乳作为封闭液，150ul/孔，37℃封闭1h。

(3)孵育抗体：弃掉封闭液，用1xPBST洗板3次，5min/次，将酶标板拍干，加入HRP标记的PPRV多克隆抗体(从1∶500倍开始稀释，1∶2连续梯度倍比稀释)100ul/孔，37℃孵育1h。

(4)加入HRP：弃掉封闭液，用1xPBST洗板3次，5min/次，将酶标板拍干，加入羊抗鼠HRP(1∶3000倍稀释)100ul/孔，37℃孵育1h。

(5)显色：弃掉封闭液，用1xPBST洗板3次，5min/次，将酶标板拍干，加入TMB显色液100ul/孔。室温显色10min。

(6)终止：加入终止液50ul/孔。

(7)读数：用酶标仪测定450nm波长处的吸光光度值(OD_450nm)。生物素标记的PPRV多克隆抗体：

(1)包被：用PH 9.6 50mM的碳酸盐缓冲液作为包被液，稀释PPRV使其终浓度为1ug/ml，100ul/孔包被96孔酶标板，4℃过夜。

(2)封闭：弃掉酶标板中的包被液，用1xPBST洗涤3次，每次3min。用1xPBST配置的5％脱脂乳作为封闭液，150ul/孔，37℃封闭1h

(3)孵育抗体：弃掉封闭液，用1xPBST洗板3次，5min/次，将酶标板拍干。加入生物素标记的PPRV多克隆抗体(从1∶1000倍开始稀释，1∶2连续梯度倍比稀释)100ul/孔，37℃孵育1h。

(4)加入链霉素亲和素HRP：弃掉封闭液，用1xPBST洗板3次，5min/次，将酶标板拍干。加入链霉素亲和素HRP(1∶3000倍稀释)100ul/孔，37℃孵育1h。

(5)显色和终止：弃掉液体，用1xPBST洗板3次，5min/次，将酶标板拍干。加入TMB显色液100ul/孔。室温显色10min；加入终止液50ul/孔。

(6)读数：用酶标仪测定450nm波长处的吸光光度值(OD_450nm)。

1.2.8 细胞系CHO-PPRV-N表达的N蛋白的抗原性检测

将该细胞系CHO-PPRV-N在传代过程中制备的SDS-PAGE蛋白电泳样品，进行Western-Blot，分析其表达的N蛋白的抗原性。根据前面的方法，以1xPBST 1∶200倍稀释的HRP标记的绵羊抗PPRV多克隆抗体作为抗体，最后以DAB显色试剂盒进行显色，观察结果并分析。同时设有未转染质粒的正常CHO细胞培养至第5天的细胞培养上清作为阴性对照。

间接ELISA试验检测该重组蛋白，具体试验步骤如下：

(1)包被：用该细胞系表达的重组PPRV N蛋白原液包被96孔酶标板，175ul/孔；同时，设有亲本CHO细胞培养上清包被96孔酶标板(175ul/孔)作为阴性对照，未包被孔(只用等量的碳酸钠/碳酸氢钠包被液包被)作为空白对照。各为3个重复。37℃，2h。

(2)封闭：弃掉包被液，1xPBST洗3遍，5min/遍，加入200ul/孔5％脱脂乳(1xPBS配置)，37℃，2h。

(3)孵育抗体：弃掉封闭液，1xPBST洗4遍，5min/遍，加入1xPBST 1∶1000倍稀释的生物素标记的绵羊抗PPRV多克隆抗体，100ul/孔，37℃，1h。

(4)加入HRP-链霉素亲和素(武汉福因德科技有限公司)：弃掉抗体，1xPBST洗4遍，5min/遍，加入1xPBST 1∶3000倍稀释的HRP-链霉素亲和素，100ul/孔，37℃，1h。

(5)显色：弃掉液体，1xPBST洗4遍，5min/遍，加入TMB显色液，50ul/孔，室温显色，20min。

(6)终止：加入终止液，50ul/孔，终止显色。

(7)读数：用酶标仪在450nm波长下读数OD值，分析结果。

1.3 结果

1.3.1 pCAG-PPRV-N_his重组质粒的酶切鉴定

为了鉴定重组质粒pCAG-PPRV-N_his的正确性，将该重组质粒与空载体pCAG-neo分别用SacI和XhoI两种限制性核酸内切酶进行双酶切。酶切后核酸琼脂糖凝胶电泳结果显示PPRV-N_his基因片段大小与理论值相符合，约1620bp(结果未显示)。

1.3.2 表达完整PPRV N蛋白CHO细胞系的构建及筛选

重组质粒pCAG-PPRV-N_his鉴定正确后，转染后筛选细胞系。IFA试验结果表明该细胞系表达了PPRV N蛋白，但其定位在细胞核中；同时，阴性对照细胞未表达该N蛋白(图7)。因此，对N基因进行改造，以使重组N蛋白在细胞上清中表达。

1.3.3 PPRV N基因的改造及鉴定

采用PCR扩增出的SP-PPRV-N_ΔNLS/his基因片段，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果表明SP-PPRV-N_ΔNLS/his基因大小与理论值相符，约1500bp(图8)。测序结果电表明改造后的PPRVN基因序列是正确的(结果未显示)，即在5’端成功引入了tPA SP基因序列和Kozark序列，3’端成功引入了his标签序列。

1.3.4 pCAG-PPRV-N_ΔNLS/his重组质粒的构建及鉴定

将通过PCR方法扩增出的目的片段SP-PPRV-N_ΔNLS/his克隆至真核表达载体pCAG-neo上，构建了重组质粒pCAG-PPRV-N_ΔNLS/his。为了鉴定重组质粒pCAG-PPRV-N_ΔNLS/his的正确性，将陔重组质粒与空载体pCAG-neo分别用SacI和XhoI两种限制性核酸内切酶进行双酶切。酶切后核酸琼脂糖凝胶电泳结果显示SP-PPRV-N_ΔNLS/his基因片段大小与理论值相符合，约1500bp(图9，泳道3)；同时，也与PCR扩出的SP-PPRV-N_ΔNLS/his片段相符(图9，泳道2)。DNA测序结果进一步表明插入的基因片段序列正确(数据未显示)，大小为1458bp，并且在其3’端插入了his标签序列。这表明重组质粒pCAG-PPRV-N_ΔNLS/his构建成功。

1.3.5 稳定表达PPRV N蛋白细胞系的筛选

为了筛选出能够稳定表达PPRV N蛋白且表达量相对较高的细胞系，对挑选的约200个单细胞克隆株进行了IFA试验和Western-Blot试验。IFA试验结果初步表明了阳性单细胞克隆(图10A-2)与瞬时转染重组质粒pCAG-PPRV-N_ΔNLS/his的CHO 48h后的阳性对照(图10A-1)相符，都呈现绿色荧光阳性，而阴性单细胞克隆(图10A-3)呈现绿色荧光阴性；Western-Blot试验结果表明阳性单克隆细胞株泳道(图10B-2)处出现大小约55KDa的条带，与瞬时转染重组质粒的CHO阳性对照(图10B-1)相符，而亲本细胞(图10B-3)未出现目的条带。综上，IFA试验和Western-Blot试验都表明了重组PPRV N蛋白在CHO-PPRV-N细胞系中得到表达。且成功筛选出了表达该重组蛋白的单细胞克隆。

1.3.6 细胞系CHO-PPRV-N传代稳定性检测

为了检测构建的细胞系CHO-PPRV-N的传代稳定性，该细胞在G418压力常规培养下进行了连续22代次的传代，传代至第1代、第8代、第15代、第22代时分别接种于96孔细胞培养板和24孔细胞培养板中，各自都进行了IFA试验和Western-Blot试验检测重组N蛋白的表达。同时，观察细胞系各代次的细胞生长状态。结果表明该细胞在传代期间细胞形态和生长速度保持良好，维持了良好的生长状态。IFA试验结果表明，所有代次呈现的绿色荧光强度基本上没有变化，同时，几乎所有细胞呈现绿色荧光(图11A)。为了再进一步确定其表达量的稳定性，进行了Western-Blot试验，结果同样表明所有代次的泳道都出现了55KDa左右的条带，且条带的粗细基本一致(图11B)，表明表达量也是基本一致。综上，CHO-PPRV-N细胞系具有良好的传代稳定性。

1.3.7 绵羊抗PPRV高免血清抗体效价的检测

为了确定各免疫阶段绵羊血清中PPRV的抗体效价，进而评估PPRV高免血清的抗体效价情况，以便确定其是否达到所需要求，采用IPMA试验方法检测各免疫阶段采取的血清中PPRV抗体效价，结果表明PPRV抗体效价在第四次免疫后第10天达到了25万以上(表3)，符合高免血清抗体效价要求。

表3 各免疫阶段绵羊血清PPRV抗体效价

1.3.8 绵羊抗PPRV多克隆抗体的纯化

为了检测PPRV多克隆抗体的纯化结果，进行了SDS-PAGE分析。结果显示(图12)，亲和纯化的抗体出现了两条清楚的条带，分别在50KDa处和25KDa处，其分别对应为IgG重链分子和IgG轻链分子，两条链的分子大小都与预期相符。

1.3.9 PPRV多克隆抗体的HRP和生物素标记

为了检测PPRV多克隆抗体的标记情况，进行了ELISA试验。试验结果显示HRP标记的PPRV多克隆抗体在1∶500倍、1∶1000倍等倍数稀释时，其OD_450nm分别为2.718、1.428等；生物素标记的PPRV多克隆抗体在1∶1000倍、1∶2000倍等倍数稀释时，其OD_450nm分别为3.371、1.857等(表4)；且都明显高于其相应的阴性对照孔的OD_450nm。因此，ELISA试验表明该PPRV多克隆抗体成功标记上了HRP和生物素，且在相应的抗体稀释倍数内，HRP标记的PPRV多克隆抗体在1∶500倍稀释时OD_450nm值最大(2.718)，而生物素标记的PPRV多克隆抗体在1∶1000倍稀释时OD_450nm值最大(3.371)(表4)。

表4 HRP和生物素标记PPRV多克隆抗体检测结果

1.3.10 细胞系CHO-PPRV-N表达的N蛋白的抗原性检测

为了研究CHO-PPRV-N表达的重组PPRV N蛋白的抗原性，采用纯化、标记的绵羊抗PPRV多克隆抗体进行检测。首先，采用HRP标记的绵羊抗PPRV多克隆体进行Western-Blot分析，结果显示在CHO-PPRV-N细胞的泳道中出现了55KDa左右的条带(图13)，与用鼠源抗his标签单克隆抗体检测显示的条带大小相符，表明该重组PPRV N蛋白能够与天然PPRV多克隆抗体反应。同时，采用生物素标记的绵羊抗PPRV多克隆抗体进行的间接ELISA试验表明(图14)，该重组N蛋白的OD₄₅₀值为2.669，阴性对照的OD₄₅₀值为0.652，P/N值为4.094，显示了重组N蛋白与PPRV多克隆抗体具有良好的反应性。综上，该重组PPRV N蛋白具有天然PPRVN蛋白抗原性。

2.讨论

在PPRV所有蛋白中N蛋白含量最丰富，且在其感染动物的血清具有较高的抗体滴度，因此，N蛋白在PPR诊断方法的研究中具有重要意义。目前，PPRV N蛋白已经在原核表达系统(Yadav V，et al.，2009)以及重组杆状病毒表达系统(Fuxiao Liu，et al.，2014)等系统中成功表达，且已经应用其建立了各种相关的PPR诊断方法，然而，这些表达系统表达的N蛋白在转录和翻译时都不能够进行完整的蛋白修饰，不能够形成天然的空间结构，进而不能够保留其最大的天然抗原性。另外，病毒的蛋白都是在哺乳动物细胞辅助下进行表达和修饰的。与其相比，哺乳动物表达系统通过哺乳动物细胞自身具备的蛋白折叠和翻译后修饰等功能来克服以上缺点。因此，本发明首次成功利用哺乳动物表达系统体外大量制备了重组PPRV N蛋白，由于其在细胞内进行了有效的折叠和修饰，与病毒在哺乳动物细胞体内N蛋白的加工修饰基本一样，更接近于天然抗原性，有利于提高基于PPRV N蛋白的ELISA诊断方法的敏感性和特异性。

N蛋白是形成PPRV核糖核蛋白(RNP)复合物的主要结构蛋白，并且根据有关文献报道在第70-77位氨基酸处具有一个NLS，导致N蛋白表达后转移至细胞核(Sato，et al.，2006)，导致了N蛋白表达量非常低。这与本发明开始采用含有NLS的完整N蛋白进行表达而导致表达较低的结论相符，并且表达的N蛋白定位在细胞核中，进而改变了技术策略来改造N蛋白以有利于表达。本发明将PPRV N基因中的NLS基因及其上游基因删除。为了使得该重组蛋白能够在上清中表达并易于检测，并在N基因的5’端引入tPA信号肽基因序列，在3’端引入his标签基因序列。根据之前我们的发明(殷倩倩等，2013)，该外源标签的引入对N蛋白的结构和功能影响较小，因而几乎不会影响重组蛋白的抗原性。

另外，我们用CHO细胞作为表达细胞，因为CHO细胞表达体系与其他真核细胞相比，不但具有准确的转录后修饰功能，使表达的重组蛋白在生物学等功能方面最接近天然蛋白分子(Conradt H S.et al.，1989)，以及高效扩增、表达重组基因和外源蛋白整合稳定的能力，而且很少分泌自身的内源蛋白，以及能以悬浮培养的方式或在无血清培养基中达到高密度培养，便于大规模生产等优点(申烨华等，2000)。

在重组细胞系的筛选试验以及传代稳定性检测试验中，IFA和Western-Blot双重验证结果都表明了该细胞系能够稳定表达重组PPRV N蛋白至少22代，这方便了今后PPRV N蛋白的产业化。在重组蛋白的抗原性检测试验中，该重组蛋白能够与绵羊抗PPRV多克隆抗体反应，这进一步表明了该重组蛋白具有天然的抗原性。法国OIE参考实验室(CIRAD-EMVT，France)研发的PPR免疫捕获ELISA诊断方法采用重组杆状病毒载体表达的PPRV N蛋白作为抗原，并且该试剂盒应用成本较高，与其相比，本实验室采用哺乳动物细胞表达的重组PPRVN蛋白的翻译后的加工修饰更接近于天然蛋白，因此可能具有更好的天然抗原性，有利于提高诊断方法的敏感性和特异性，同时，本实验正应用该重组蛋白研发拥有自主知识产权的、价格便宜的诊断试剂盒。

由于该重组PPRV N蛋白在CHO细胞中表达时，进行了糖基化和其它蛋白的进一步修饰，所以Western-Blot中显示的其实际分子量大小比EditSeq软件预测的理论值要偏大。同时，由于FBS血清中含有大量的的BSA(68KDa)，其与重组PPRV N蛋白分子量相近，其占位挤压效应，使得Western-Blot试验中重组蛋白条带分子量相对偏小，具体分子量大小需要纯化的重组蛋白进行确定。

推测PPRV N重组蛋白在细胞中表达时可能因为部分修饰缺失，或者是部分重组蛋白发生了降解，使得在Westem-Blot试验结果其显示出两条条带，但是具体原因不明。

在制备绵羊抗PPRV高免血清时，为了获得天然结构N蛋白的抗体，首次免疫采用PPRV弱毒免疫。第二次免疫采用水性佐剂进一步增加天然结构N蛋白的抗体滴度，但是为了提高最终抗体滴度，采用FIA乳化蔗糖垫纯化的PPRV。因此，这三种方法结合免疫使得天然结构N蛋白抗体含量尽可能提高，而且获得高效价的N蛋白总抗体。纯化后绵羊抗PPRV多克隆抗体成功标记上HRP/生物素，这使在检测实验中不需要加入二抗，节约了检测时间。

综上，本发明首次成功构建了稳定表达重组PPRV N蛋白的CHO-PPRV-N细胞系，其表达的重组N蛋白能够与PPRV多克隆抗体反应，具有天然的抗原性。该重组蛋白与本发明制备的酶标绵羊抗PPRV多克隆抗体，为建立基于N蛋白的PPRV诊断方法奠定了基础。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

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Claims

2.编码权利要求1所述的重组小反刍兽疫病毒N蛋白的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其如SEQ ID NO：2所示。

4.包含权利要求1或2所述的核苷酸序列的重组载体。

5.稳定表达权利要求1所述的重组小反刍兽疫病毒N蛋白的CHO-PPRV-N细胞系细胞，其保藏编号为CGMCC No.12281。

6.一种制备权利要求1所述的重组小反刍兽疫病毒N蛋白的方法，所述方法包括：培养权利要求5所述的CHO-PPRV-N细胞系细胞，获得由所述细胞表达的重组小反刍兽疫病毒N蛋白。

7.一种用于检测小反刍兽疫的试剂盒，其中所述试剂盒包含权利要求1所述的重组小反刍兽疫病毒N蛋白。

8.权利要求7所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含酶标记的PPRV多克隆抗体。

9.权利要求7所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于小反刍兽。

10.权利要求1所述的重组小反刍兽疫病毒N蛋白在制备用于检测小反刍兽疫的试剂盒中的应用。