CN116063572A - 一种同时表达bvdv e2蛋白和brsv f蛋白的融合蛋白及二联亚单位疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时表达BVDV E2蛋白和BRSV F蛋白的融合蛋白及二联亚单位疫苗,涉及兽用生物制品技术领域。本发明所述融合蛋白经酶切和体外重折叠,获得具有完整结构功能的牛病毒性腹泻、牛呼吸道合胞体病毒病二联亚单位疫苗,且牛病毒性腹泻病毒E2蛋白以二聚体形式,牛呼吸道合胞体病毒F蛋白以三聚体形式组成疫苗。本发明创新的实现了一次表达过程即可同时生产两种病毒的亚单位疫苗,且纯化填料和酶切用酶均可重复使用,纯化过程简单,生产成本低,抗原纯度高,不产生ADE效应,有效降低免疫副反应。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域,具体涉及一种同时表达BVDV E2蛋白和BRSVF蛋白的融合蛋白及二联亚单位疫苗。
背景技术
牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起牛的以粘膜发炎、糜烂、坏死和腹泻为特征的疾病。在自然条件下,本病可感染家养和野生的反刍兽,但主要侵害6~18月龄的幼牛,患牛表现为发病急,体温突然升高至40~42℃,食欲废绝,消化道粘膜损伤严重,最初常表现为水样腹泻,后期便中带血和粘膜,病牛的死亡率可高达90%。
BVDV基因组为单股正链RNA,全长约12.5Kb,仅含有一个能编码约4000个氨基酸多聚蛋白的ORF,多聚蛋白经翻译和加工后,可形成11种成熟的蛋白,其中C、Erns、E1、E2是病毒的结构蛋白。E2是BVDV的囊膜糖蛋白,免疫原性最强,能同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫,并产生中和抗体,因此是制备检测抗原和疫苗的首选基因。
牛呼吸道合胞体病(Bovine respiratory syncytial,BRS)是由牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)引起的一种急性、热性呼吸道传染病,主要症状为高热、咳嗽、流鼻涕和流涎等症状,是引起牛等反刍动物的呼吸道疾病的主要病原之一。该病呈世界性分布,对养牛业危害极大。据报道,15~18月龄牛发病率高达80~100%,一些牛场的病死率为5~20%,对养牛业造成了很大的经济损失。
BRSV是副黏病毒科、肺病毒亚科、肺病毒属的成员,为有囊膜病毒,其基因组是负链RNA,全长约15Kb,可转录出10条病毒RNA,其中9种为结构蛋白,包括G、F、SH、M、M2-1、M2-2、P、L和N;2种为非结构蛋白,包括NS1和NS2。G和F是BRSV两个主要的保护性抗原,也是BRSV宿主嗜性的主要决定因素。由于G蛋白高度变异、交叉保护性弱,而且G蛋白免疫后会引起抗体依赖的增强作用(Antibody dependent enhancement,ADE),致疾病加重,因此BRSVG蛋白不是亚单位疫苗的优选蛋白。F蛋白为N-糖基化的I型跨膜糖蛋白,通过剧烈的构象变化来介导病毒囊膜与宿主细胞的融合。在融合启动前,F蛋白采用融合前构象,这种构象是不稳定的,具有较低的能量屏障,在距离宿主很近的时候,融合肽插入宿主细胞膜中,F蛋白得以跨越病毒囊膜和宿主细胞膜。随后,F蛋白形成三聚体的发夹结构,将两层膜连接在一起,促进融合,融合后的构象非常稳定。融合前构象的F蛋白三聚体是“棒棒糖”形状的,融合后构象的F蛋白是“拐杖”形状的,两种构象在结构上有很大不同,有着不同的抗原表位。理想状态下,为了防止病毒的进入,需要以F蛋白融合前构象的抗原表位开发疫苗。由于融合后构象的稳定性,通过重组表达系统获得的完整F蛋白仅能够保持融合后的稳定构象。因此我们对F蛋白的基因编码序列进行一系列的基因突变,通过去除F蛋白C末端的跨膜区和胞内区,并在C端引入了三聚体结构稳定基序,将Furin蛋白酶位点和跨膜区替换为一段柔性“GSGSGR”序列,得以稳固其融合前构象。目前无特效的治疗方法,对症治疗和加强护理可以减轻症状,增强机体抵抗力,促使病牛康复。BVDV和BRSV商品化的疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗,但是这两种类型的疫苗都有缺点。BVDV弱毒疫苗可能会引起母牛流产,导致持续感染牛产生;灭活疫苗虽然安全性高,但其接种产生的抗体滴度水平低于弱毒疫苗。BRSV灭活疫苗还会引起ADE效应,从而增强病毒的感染性;弱毒疫苗在母源抗体存在时免疫效果欠佳,且不利于病毒净化。因此急需研制一种新型的疫苗,该疫苗的免疫原性强、不产生ADE效应、安全性好、成本低,且该疫苗能够同时预防上述两种疫病。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种同时表达BVDV E2蛋白和BRSV F蛋白的融合蛋白及二联亚单位疫苗,将BVDV E2和BRSV F蛋白用TEV酶切基序连接起来,形成一个融合蛋白,利用一次生产过程,经酶切和体外重折叠,即可获得具有完整结构功能的牛病毒性腹泻、牛呼吸道合胞体病毒病亚单位疫苗。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种同时表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白和牛呼吸道合胞体病毒F蛋白的融合蛋白,所述融合蛋白的结构,自N端至C端,包括:信号肽、牛病毒性腹泻病毒E2蛋白、牛IgGFc、TEV酶切基序、牛呼吸道合胞体病毒F蛋白和Fibritin三聚化序列。
优选的,所述信号肽的来源包括小鼠IgG kappa链信号肽和/或家蚕免疫球蛋白信号肽;
所述Fc的来源包括牛IgGFc。
本发明还提供了一种利用CHO细胞表达的上述融合蛋白,所述融合蛋白自N端至C端的结构,依次包括:小鼠IgG kappa链信号肽、牛病毒性腹泻病毒E2蛋白、牛IgGFc、TEV酶切基序、牛呼吸道合胞体病毒F蛋白和Fibritin三聚化序列;
所述小鼠IgG kappa链信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述牛IgG Fc的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示,所述TEV酶切基序的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,所述牛呼吸道合胞体病毒F蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,所述Fibritin三聚化序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
优选的,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了一种利用昆虫细胞表达的上述融合蛋白,所述融合蛋白自N端至C端的结构,依次包括:家蚕免疫球蛋白信号肽、牛病毒性腹泻病毒E2蛋白、牛IgGFc、TEV酶切基序、牛呼吸道合胞体病毒F蛋白和Fibritin三聚化序列;
所述家蚕免疫球蛋白信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示,所述牛IgGFc的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示,所述TEV酶切基序的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示,所述牛呼吸道合胞体病毒F蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示,所述Fibritin三聚化序列的核苷酸序列如SEQID NO.14所示。
优选的,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
优选的,所述融合蛋白切除信号肽后分泌在培养上清中,切除信号肽后的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明提供了一种包含上述融合蛋白的重组载体。
本发明提供了一种表达上述融合蛋白的重组细胞系。
本发明还提供了上述融合蛋白、上述重组载体或上述重组细胞系在制备牛病毒性腹泻和牛呼吸道合胞体病毒病二联亚单位疫苗中的应用。
本发明还提供了一种牛病毒性腹泻和牛呼吸道合胞体病毒病二联亚单位疫苗,以上述重组细胞系表达的融合蛋白为抗原。
有益效果:本发明提供了一种同时表达BVDV E2蛋白和BRSV F蛋白的融合蛋白,在进行融合蛋白前对BRSV F蛋白进行改造,包括删除109位到136位的Furin蛋白酶位点和P27序列,改成一段柔性“GSGSGR”序列,同时为了增强单体的三聚化,去掉C端的526位到574位的跨膜区和胞内区,替换为一段Fibritin三聚化序列,既可以实现F蛋白的完整功能,又不会因Furin蛋白酶水解作用,使融合蛋白在分泌出胞前断裂。最后将BVDV E2和BRSV F蛋白用TEV酶切基序连接起来,形成一个融合蛋白,一次生产过程,经酶切,体外重折叠,获得具有完整结构功能的牛病毒性腹泻、牛呼吸道合胞体病毒病亚单位疫苗。
本发明所述融合蛋白中加入FC标签,促进牛病毒性腹泻病毒E2蛋白以二聚体形式表达,延长蛋白半衰期,促进抗原递呈,并且经一次表达后,可同时生产牛病毒性腹泻和牛呼吸道合胞体病毒病二联亚单位疫苗,最终牛病毒性腹泻病毒E2蛋白以二聚体形式,牛呼吸道合胞体病毒F蛋白以三聚体形式组成疫苗。可利用商品化ProteinA填料纯化融合蛋白,纯化过程简单,疫苗抗原纯度高,不产生ADE效应,有效降低免疫副反应。
附图说明
图1为用IDXEE试剂盒测定免疫前后BVDV抗体效价;
图2为用BRSV的F蛋白包被ELISA板检测BRSV抗体效价。
具体实施方式
本发明提供了一种同时表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白和牛呼吸道合胞体病毒F蛋白的融合蛋白,所述融合蛋白的结构,自N端至C端,包括:信号肽、牛病毒性腹泻病毒E2蛋白、Fc、TEV酶切基序、牛呼吸道合胞体病毒F蛋白和Fibritin三聚化序列。
本发明所述信号肽的来源优选包括小鼠IgG kappa链信号肽和/或家蚕免疫球蛋白信号肽;所述Fc的来源优选包括牛IgG Fc。在本发明中,所述BRSV F蛋白在进行融合前,优选还包括改造,更优选包括删除109位到136位的Furin蛋白酶位点和P27序列,改成一段柔性“GSGSGR”序列,同时为了增强单体的三聚化,去掉C端的526位到574位的跨膜区和胞内区,替换为一段Fibritin三聚化序列,既可以实现F蛋白的完整功能,又不会因Furin蛋白酶水解作用,使融合蛋白在分泌出胞前断裂,降低蛋白折叠复杂程度,增加结构稳定性。
本发明所述融合蛋白利用不同的细胞系进行表达时,需要根据表达细胞的密码子偏好进行密码子优化,因此基于不同的细胞表达体系,虽然融合蛋白的结构相同,但是其核苷酸序列略有不同。
本发明还提供了一种利用CHO细胞表达的上述融合蛋白,所述融合蛋白自N端至C端的结构,依次包括:小鼠IgG kappa链信号肽、牛病毒性腹泻病毒E2蛋白、牛IgG Fc、TEV酶切基序、牛呼吸道合胞体病毒F蛋白和Fibritin三聚化序列;
所述小鼠IgG kappa链信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述牛IgGFc的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示,所述TEV酶切基序的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,所述牛呼吸道合胞体病毒F蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,所述Fibritin三聚化序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
本发明将利用CHO细胞表达的融合蛋白简称为CHO-E2-F序列,如在实施例中参考牛病毒性腹泻病毒3877株E2基因序列(MW013505)和牛呼吸道合胞体病毒ATCC51908株F基因序列(NC038272),经密码子优化,合成CHO-E2-F序列,但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明所述CHO-E2-F序列依次包括:小鼠IgG kappa链信号肽,大小为63个碱基,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;BVDV E2蛋白序列,大小为1017个碱基,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;牛IgGFC序列,大小为696个核苷酸,其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;TEV酶切基序,大小为21个碱基,其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;BRSV F蛋白序列,大小为1434个碱基,其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;Fibritin三聚化序列,大小为75个碱基,其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。本发明在合成所述合成CHO-E2-F序列后,优选还包括在所述CHO-E2-F序列的两端设置HindIII和EcoRI酶切位点,全长为3327个碱基,核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了一种利用昆虫细胞表达的上述融合蛋白,所述融合蛋白自N端至C端的结构,依次包括:家蚕免疫球蛋白信号肽、牛病毒性腹泻病毒E2蛋白、牛IgGFc、TEV酶切基序、牛呼吸道合胞体病毒F蛋白和Fibritin三聚化序列;
所述家蚕免疫球蛋白信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示,所述牛IgG Fc的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示,所述TEV酶切基序的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示,所述牛呼吸道合胞体病毒F蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示,所述Fibritin三聚化序列的核苷酸序列如SEQID NO.14所示。
本发明对所述昆虫细胞的种类并没有特殊限定,实施例中以昆虫细胞SF9为例进行说明,但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。在本发明实施例中,参考牛病毒性腹泻病毒3877株E2基因序列(MW013505)和牛呼吸道合胞体病毒ATCC51908株F基因序列(NC038272),经密码子优化,合成所述融合蛋白,简称SF9-E2-F序列。本发明所述SF9-E2-F序列,优选依次包括:家蚕免疫球蛋白信号肽序列,大小为60个碱基,其核苷酸序列如SEQID NO.9所示;BVDV E2蛋白序列,大小为1017个碱基,其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示;牛IgGFC序列,大小为696个核苷酸,其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示;TEV酶切基序,大小为21个碱基,其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示;BRSV F蛋白序列,大小为1434个碱基,其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示;Fibritin三聚化序列,大小为75个碱基,其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示;合成后的SF9-E2-F序列的两端含有BamHI和HindIII酶切位点,全长为3324个碱基,核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示,编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明所述CHO-E2-F序列或SF9-E2-F序列经切除信号肽后分泌在培养上清中,切除信号肽后的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
YPDCKPEFSYAIARNEKIGPLGAEGLTTIWHEYSAKMRLKDTMVEVWCKDGQFMHLKKCAREARYLAVLHTRALPTSVVFKQLFSGQKSVGMVDMNDDFEFGLCPCDAKPVIRGKFNTTLLNGPAFQMVCPIGWTGTVSCALVNEDTLDTTTVHIYRRTRPFPHRQGCITHKLVGEDLYNCTLGGNWTCIPGERLTYKGGPIETCKWCGYNFKKDEGLPHYPIGKCKLKNETGYRLVDDTSCNRDGVAIVPTGTLKCKIGDTVIQVIAMDTNLGPMPCKPYEIIQSEGPVEKTACTFNYTKTLRNKYFEPRDRYFQQYMLKGEYQYWFDLDAVDHHKDYVDPRCKTTCDCCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLTISGTPEVTCVVVDVGHDDPEVKFSWFVDDVEVNTATTKPREEQFNSTYRVVSALRIQHQDWTGGKEFKCKVHNEGLPAPIVRTISRTKGPAREPQVYVLAPPQEELSKSTVSLTCMVTSFYPDYIAVEWQRNGQPESEDKYGTTPPQLDADGSYFLYSRLRVDRNSWQEGDTYTCVVMHEALHNHYTQKSTSKSAGKENLYFQGQNITEEFYQSTCSAVSRGYLSALRTGWYTSVVTIELSKIQKNVCNSTDSKVKLIKQELERYNNAVVELQSLMQNEPASFSRAKGSGSGRFLGFLLGIGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKELLPKVNNHDCRISKIETVIEFQQKNNRLLEIAREFSVNAGITTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSVVKEEVIAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTDNKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQTETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPTDVNLCNTDIFNTKYDCKIMTSKTDISSSVITSIGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKALYIKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASIAQVNAKINQSLAFIRRSDELLHSVDVGKSTTNVGYPEAPPRDGQAYVRKWWVLLSTFL。
本发明提供了一种包含上述融合蛋白的重组载体。
在本发明中,针对不同表达细胞,中间构建的重组载体也不相同,如融合蛋白为CHO-E2-F序列时,则优选使用HindIII和EcoRI酶切所述CHO-E2-F序列和pEE12.4载体,分别回收酶切片段后连接转化克隆,测序正确,构建得到CHO-E2-F-pEE12.4重组质粒。当所述融合蛋白为SF9-E2-F序列时,优选分别使用BamHI和HindIII酶切所述SF9-E2-F序列和pFastBac1载体序列,回收酶切片段后连接转化克隆,测序验证后,即构建得到SF9-E2-F-pFastBac1转移载体。
本发明提供了一种表达上述融合蛋白的重组细胞系。
本发明对所述重组细胞系的构建方法并没有特殊限定,利用本领域的常规构建方法即可,如在构建得到CHO-E2-F-pEE12.4重组质粒后,利用CHO-K1细胞转染及高表达细胞株筛选,从而筛选出稳转细胞株(高表达细胞株),并对高表达细胞株进行无血清悬浮驯化得所述重组细胞系。本发明优选对所述重组细胞系进行细胞摇瓶发酵,发酵结束后收获细胞上清液,并利用商品化proteinA填料纯化蛋白。本发明在得到所述纯化蛋白后,优选还包括根据每8μg蛋白的量加入1UTEV蛋白酶的比值进行酶切,将酶切蛋白装入透析袋中进行VLPs自组装,取出透析袋内液体,镍柱上样,去除含有His标签的TEV酶,流穿液即为含有BVDV E2蛋白二聚体和BRSV F蛋白三聚体的抗原液,可应用于制备BVDV和BRSV的二联亚单位疫苗。
本发明在得到所述SF9-E2-F-pFastBac1转移载体后,优选还包括将其转化感受态细胞DH10Bac,37℃培养后,使用蓝白斑筛选法进行筛选并进行PCR鉴定,获得SF9-E2-F-Bacmid重组杆粒;并将所述SF9-E2-F-Bacmid重组杆粒转染处于对数生长期的SF9细胞,培养后收获P1代的重组杆状病毒SF9-E2-F-rBV,并连续传代至P3代,将P3代病毒离心,上清为病毒液;用P3代毒感染HighFive细胞,培养后,收集上清,上清液中含有目的蛋白。本发明对所述目的蛋白的纯化、酶切和抗原液的制备方法均相同,在此不再赘述。
本发明还提供了上述融合蛋白、上述重组载体或上述重组细胞系在制备牛病毒性腹泻和牛呼吸道合胞体病毒病二联亚单位疫苗中的应用。
本发明所述应用优选与上述相同,在此不再赘述。
本发明还提供了一种牛病毒性腹泻和牛呼吸道合胞体病毒病二联亚单位疫苗,以上述重组细胞系表达的融合蛋白为抗原。
本发明在得到上述抗原液后,优选还包括将所述抗原液用PBS缓冲液稀释至终浓度60μg/mL,与ISA 201 VG佐剂按照46:54体积比混合乳化,即为所述二联亚单位疫苗。
下面结合实施例对本发明提供的一种同时表达BVDV E2蛋白和BRSV F蛋白的融合蛋白及二联亚单位疫苗进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中如非特殊说明,所用的试剂和材料均为本领域的常规市售产品,如BVDV病毒(W株)购自中国兽医药品监察所,BRSV购自美国ATCC,毒株为ATCC51908。
实施例1
序列合成
参考牛病毒性腹泻病毒3877株E2基因序列(MW013505)和牛呼吸道合胞体病毒ATCC51908株F基因序列(NC038272),经密码子优化,合成CHO-E2-F序列,合成后的CHO-E2-F序列的两端含有HindIII和EcoRI酶切位点,全长为3327个碱基,如SEQ ID NO.7所示。CHO-E2-F序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
实施例2
构建CHO-E2-F-pEE12.4重组质粒
使用HindIII和EcoRI酶切实施例1合成的CHO-E2-F序列和pEE12.4载体(购自吉满生物),回收酶切后的CHO-E2-F序列和pEE12.4序列片段,并进行连接转化克隆,测序验证无误后,即构建成功CHO-E2-F-pEE12.4重组质粒。
实施例3
CHO-K1细胞转染及高表达细胞株筛选
1、准备细胞:
取传代培养24小时内,汇合度在80%~90%的CHO-K1细胞一皿(10cm细胞培养皿),弃去培养基,加10mLPBS洗细胞一次,弃去PBS,加入15mL无血清无抗生素的DMEM/F12培养基,置于37℃5%CO2细胞培养箱中培养。
2、转染质粒
按照2000说明书,分别用1.5mL无血清无抗生素的DMEM/F12培养基稀释24μg的CHO-E2-F-pEE12.4重组质粒和60μL的2000,混匀室温放置5分钟。将两管液体混合,室温放置20min。取准备好的CHO-K1细胞,逐滴加入前述混合试剂,然后放入37℃5%CO2细胞培养箱。培养4~6h后弃去培养基,加入10mL DMEM/F12培养基(10%血清,1%双抗(青霉素和链霉素,下同),不含谷氨酰胺),置于37℃5%CO2细胞培养箱中培养。
3、加压筛选
转染后24h,取转染后CHO-K1细胞和未转染的CHO-K1细胞(阴性对照)各一皿,弃去上清培养基,加入10mL DMEM/F12培养基(10%血清+25μM MSX,1%双抗,不含谷氨酰胺),加压筛选7d,中间观察细胞,死细胞多时,换液为相同培养基。
4、稳转细胞株筛选
25uM MSX加压筛选至阴性对照细胞基本死光时,约7d,开始细胞株筛选。取转染后CHO-K1细胞,弃掉培养基,PBS洗一次,加入500μL0.25%胰酶,室温2~5min,消化至细胞为单细胞,加入10mL DMEM/F12培养基(10%血清+25uM MSX,1%双抗,不含谷氨酰胺)终止消化反应,用移液器吹散细胞,细胞计数。用DMEM/F12培养基(10%血清+25μM MSX,1%双抗,不含谷氨酰胺)稀释细胞至104cells/mL,转移至96孔板,每孔200μL,放入37℃5%CO2细胞培养箱中培养。待96孔板长满时,取上清,ELISA检测,高表达的阳性细胞株继续扩大培养、冻存。
实施例4
高表达细胞株无血清悬浮驯化
在DMEM/F12培养基(10%血清,1%双抗,不含谷氨酰胺)中复苏高表达细胞株,并继续使用该培养基传代2到3次至细胞生长稳定,当细胞密度达到2×106cells/mL后进行传代,传代细胞密度控制在0.3~0.5×105cells/mL,培养基为10%血清的DMEM/F12培养基与基础培养基(购自健顺生物)以75:25的比例混合,将细胞置于37℃,5%CO2,转速为110rpm的恒温摇床中进行培养。当细胞密度3~4d后达到2×106cells/mL且细胞活率>90%,传代时10%血清的DMEM/F12培养基与基础培养基以50:50的比例混合,细胞密度控制在0.3~0.5×106cells/mL。如细胞生长慢,可离心上清,留20%原培养基,加入80%的10%血清的DMEM/F12培养基与基础培养基比例为75:25的混合培养基,继续培养;重复前述步骤,逐步增加基础培养基所占的比例直到100%的基础培养基。
实施例5
细胞摇瓶发酵
从恒温摇床中取出摇瓶细胞,稀释细胞至0.3~0.5×105cells/mL接种30mL基础培养基至一个125mL摇瓶中,置于37℃,5%CO2,转速为110rpm的恒温摇床中进行培养。每天检测葡萄糖浓度,当葡萄糖浓度小于4g/L时,添加葡萄糖溶液到培养液中葡萄糖浓度为4g/L。分别在第3天、第5天、第7天、第9天添加3%的补料培养基。第12天,收获细胞上清。
实施例6
昆虫细胞表达序列合成
参考牛病毒性腹泻病毒3877株E2基因序列(MW013505)和牛呼吸道合胞体病毒ATCC51908株F基因序列(NC038272),经密码子优化,合成SF9-E2-F序列,合成后的SF9-E2-F序列的两端含有BamHI和HindIII酶切位点,全长为3324个碱基,如SEQ ID NO.15所示,编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
实施例7
杆状病毒转移载体构建
使用BamHI和HindIII酶切实施例6合成的SF9-E2-F序列和pFastBac1载体序列,回收酶切后的SF9-E2-F和pFastBac1序列片段,并进行连接转化克隆,测序验证无误,构建得到SF9-E2-F-pFastBac1转移载体。
实施例8
杆粒制备
将实施例7制得的SF9-E2-F-pFastBac1转移载体转化感受态细胞DH10Bac,37℃培养后,使用蓝白斑筛选法进行筛选并进行PCR鉴定,获得SF9-E2-F-Bacmid重组杆粒。杆粒转化和筛选方法参考Invitrogen公司Bac-to-BacTM杆状病毒表达系统用户指南进行操作。
实施例9
重组杆状病毒收获
将实施例8获得的SF9-E2-F-Bacmid重组杆粒利用转染试剂转染处于对数生长期的SF9细胞,培养72h后,收获P1代的重组杆状病毒SF9-E2-F-rBV。将收获的P1代重组杆状病毒继续在SF9细胞上进行传代培养至P3代,将P3代病毒离心,上清为病毒液,通过噬斑法测定P3代病毒滴度。按照接种量为1个MOI,用P3代毒感染HighFive细胞,培养96h后,培养上清含有目的蛋白。
实施例10
蛋白纯化
收集实施例5或9中的细胞上清,4℃,8000g离心30min,取上清,过0.8μm滤膜。5~10倍柱体积PBS平衡Protein A柱料,处理好的细胞上清重复上柱3次,10倍PBST冲洗柱料,2倍PBS冲洗柱料,2倍柱料体积的0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱蛋白,收集洗脱液,加入1MTris(pH9.0)中和到pH7.5,即为纯化蛋白。
实施例11
蛋白的酶切和重折叠
依据BCA蛋白质定量检测试剂盒(购自上海生工)说明,测定纯化蛋白浓度,计算蛋白总质量,按照每8μg酶切蛋白加入1UTEV蛋白酶(His-tag,购自碧云天生物),按体积加入10×酶切缓冲液(500mMNaH2PO4,150mM NaCl,10mMEDTA,10mMDTT,1%Tween-20,pH8.0),4℃酶切12~16h。酶切完成后,将酶切蛋白装入透析袋(3500D),透析液为50mMNaH2PO4,500mMNaCl,pH8.0,透析12~16h,期间换液2~3次。第一次透析完成后,4℃静置8~12h,完成蛋白重折叠。更换透析液为PBS缓冲液,透析12~16h,期间换液2~3次。第二次透析完成后,取出透析袋内液体,镍柱上样,去除含有His标签的TEV酶,流穿液即为含有BVDV E2蛋白二聚体和BRSV F蛋白三聚体的抗原液。用含200mM咪唑的PBS缓冲液洗脱镍柱,收集洗脱液,即为回收的TEV蛋白酶,经酶活测定,可直接用于下次生产的酶切过程。
实施例12
疫苗制备
将实施例11的抗原液用PBS缓冲液稀释至终浓度60μg/mL,与ISA 201 VG佐剂按照46:54体积比混合乳化,即为牛病毒性腹泻、牛呼吸道合胞体病毒病二联亚单位疫苗。
实施例13
F蛋白包被ELISA板检测BRSV抗体
PBS缓冲液平衡Protein A柱,将实施例11所述含有BVDV E2蛋白二聚体和BRSV F蛋白三聚体的抗原液,重复上样3次,流穿液即为只含有BRSV F蛋白的抗原液。经BCA法定量浓度,用PBS缓冲液稀释至0.2μg/mL包被酶联反应板,100μL/孔,4℃包被16h。包被结束后,弃去孔中液体,每孔加入PBST洗液300μL,漂洗1次。每孔加入新鲜配制的封闭液(5%脱脂乳,PBS)200μL,37℃封闭2h。封闭结束后,弃去孔中液体,每孔加入PBST洗液300μL,漂洗1次,于吸水滤纸上拍干。将待测BRSV血清用PBS缓冲液稀释100倍,加入抗原包被板,37℃孵育1h。弃去孔中液体,每孔加入洗液300μL,漂洗3次。用含5%脱脂乳的PBS将HRP标记兔抗牛IgGFab二抗稀释10000倍,每孔加入100μl,37℃孵育1h。弃去孔中液体,每孔加入PBST洗液300μL,漂洗3次。每孔加入100μLTMB显色液,室温避光显色10min。每孔加入50μL终止液,酶标仪上读取450nm吸光值。判断抗体阳性标准:P/N≥2.1,OD450≥0.4。
实施例14
免疫实验
筛选4-5月龄小牛7头(BVDV和BRSV抗体阴性),随机分成2组,疫苗免疫组5头,空白对照组2头,疫苗免疫组免疫牛病毒性腹泻、牛呼吸道合胞体病毒病二联亚单位疫苗,空白对照组免疫PBS。每次肌肉注射1ml,初免三周后加强免疫一次,免疫前、一免后21天和二免后21天采集血清。用IDEXXBVDV总抗体检测试剂盒(货号99-44000)测定免疫前后BVDV抗体效价。结果如图1,编号1至5为疫苗免疫组,编号6和7为空白组。结果显示免疫前和空白组BVDV抗体S/P值均小于0.5,均为阴性,疫苗免疫组一免21天后BVDV抗体S/P均大于0.5,二免21天后BVDV抗体S/P值在1.5上下。用实施例16的间接ELISA方法检测BRSV抗体效价,结果如图2,编号1至5为疫苗免疫组,编号6和7为空白组。结果显示免疫前和空白组BRSV抗体P/N值均在1左右,小于2.1,均为阴性,疫苗免疫组一免21天后BVDV抗体P/N值达到4以上,二免21天后BVDV抗体P/N值最高可到11。BVDV和BRSV抗体检测结果说明牛病毒性腹泻、牛呼吸道合胞体病毒二联亚单位疫苗具有很好的免疫原性。
实施例15
中和抗体实验
试验前一日,用胰酶将MDBK细胞消化后,使用含10%FBS的DMEM重悬细胞,铺入96孔细胞培养板,细胞接种密度为2×105cells/mL,每孔接种0.1mL,置于37℃,5%CO2条件下培养。用含2%FBS的DMEM细胞培养液稀释二免后21天血清样品,稀释度为21,22,23,24,25,26,27,28混合均匀。将BVDV病毒液按照测定的病毒毒价,用含2%FBS的DMEM细胞培养液稀释到200个TCID50/0.1ml。取100μL血清稀释液,与等体积的BVDV病毒(200TCID50)混合均匀,最终毒量为100TCID50/0.1ml,置于37℃,5%CO2的培养箱中培养90min;取培养24h的96孔培养板MDBK细胞,弃去生长液,将中和90min的病毒与血清的混合物转移至96孔细胞培养板相应孔内,0.1mL/孔,不同稀释度的血清/病毒混合液被移到细胞板时要及时更换移液器枪头,每个稀释度做4个重复,同时设置不加中和病毒的正常阴性对照细胞;置于37℃,5%CO2的条件下培养。不同稀释度的血清-BVDV病毒混合液接种与MDBK细胞于细胞培养箱中培养72h,观察细胞病变。若细胞发生病变,说明BVDV没有被血清中产生的中和抗体中和;如果细胞生长状态良好,与对照组结果一样,说明BVDV被血清中产生的中和抗体所中和,细胞不会出现病变情况。MDBK细胞中未出现CPE的最大稀释度为此血清样品的中和抗体滴度。BRSV中和抗体实验操作同上。BVDV和BRSV中和抗体实验结果见表1,BVDV中和抗体效价不低于1:128,BRSV中和抗体效价不低于1:64,二免后21天血清均产生中和抗体,说明牛病毒性腹泻、牛呼吸道合胞体病毒二联亚单位疫苗可以给免疫牛提供保护。
表1 BVDV和BRSV中和抗体实验结果表
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种同时表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白和牛呼吸道合胞体病毒F蛋白的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白的结构,自N端至C端,包括:信号肽、牛病毒性腹泻病毒E2蛋白、Fc、TEV酶切基序、牛呼吸道合胞体病毒F蛋白和Fibritin三聚化序列。
2.根据权利要求1所述融合蛋白,其特征在于,所述信号肽的来源包括小鼠IgG kappa链信号肽和/或家蚕免疫球蛋白信号肽;
所述Fc的来源包括牛IgG Fc。
3.一种利用CHO细胞表达的权利要求1或2所述融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白自N端至C端的结构,依次包括:小鼠IgG kappa链信号肽、牛病毒性腹泻病毒E2蛋白、牛IgGFc、TEV酶切基序、牛呼吸道合胞体病毒F蛋白和Fibritin三聚化序列;
所述小鼠IgG kappa链信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述牛IgG Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,所述TEV酶切基序的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,所述牛呼吸道合胞体病毒F蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,所述Fibritin三聚化序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.一种利用昆虫细胞表达的权利要求1或2所述融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白自N端至C端的结构,依次包括:家蚕免疫球蛋白信号肽、牛病毒性腹泻病毒E2蛋白、牛IgGFc、TEV酶切基序、牛呼吸道合胞体病毒F蛋白和Fibritin三聚化序列;
所述家蚕免疫球蛋白信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示,所述牛IgG Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示,所述TEV酶切基序的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示,所述牛呼吸道合胞体病毒F蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示,所述Fibritin三聚化序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示。
5.根据权利要求3或4所述融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白切除信号肽后分泌在培养上清中,切除信号肽后的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
6.一种包含权利要求1或2所述融合蛋白、权利要求3或4所述融合蛋白或权利要求5所述融合蛋白的重组载体。
7.一种表达权利要求1或2所述融合蛋白、权利要求3或4所述融合蛋白或权利要求5所述融合蛋白的重组细胞系。
8.权利要求1或2所述融合蛋白、权利要求3或4所述融合蛋白、权利要求5所述融合蛋白、权利要求6所述重组载体或权利要求7所述重组细胞系在制备牛病毒性腹泻和牛呼吸道合胞体病毒病二联亚单位疫苗中的应用。
9.一种牛病毒性腹泻和牛呼吸道合胞体病毒病二联亚单位疫苗,其特征在于,以权利要求7所述重组细胞系表达的融合蛋白为抗原。
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