CN103224914A - 表达融合外源表位n蛋白的重组小反刍兽疫病毒的构建及应用 - Google Patents

表达融合外源表位n蛋白的重组小反刍兽疫病毒的构建及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫标记疫苗领域。具体地，本发明涉及表达融合外源表位N蛋白的重组小反刍兽疫病毒的构建及应用。

Description

表达融合外源表位N蛋白的重组小反刍兽疫病毒的构建及应用
技术领域
本发明涉及免疫标记疫苗领域。具体地，本发明涉及表达融合外源表位N蛋白的重组小反刍兽疫病毒的构建及应用。
背景技术
小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的急性、烈性传染病；临床以发热、口炎、腹泻和肺炎为特征。对山羊和绵羊等小反刍动物危害严重，给畜牧业造成重大经济损失[1]。PPR于2007年传入我国西部边境地区，导致局部疫情，对我国畜牧养殖业形成严重威胁。小反刍兽疫病毒基因组为不分节段的单股负链RNA，基因组长15948bp。从3’至5’依次分布着N、P、M、F、H、L基因，分别编码核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合基质蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大聚合蛋白(L)这六种结构蛋白，P基因还编码两种非结构蛋白C和V。N蛋白为小反刍兽疫病毒的核衣壳蛋白，是PPRV中含量最丰富和免疫原性最强的结构蛋白，在病毒的复制和转录中起主要的作用，其抗原性稳定，在病毒感染的动物血清中针对N蛋白的抗体占主导地位，主要用于检测诊断研究[2-4]，是引入外源表位用以构建标记疫苗的合适靶蛋白。
防治小反刍兽疫的主要措施就是进行疫苗免疫接种。常用的PPRV疫苗株Nigeria 75/1是在Vero细胞上多次传代致弱所获得，是一种安全经济的疫苗，但该疫苗的缺陷在于无法区分自然感染动物与免疫接种动物[5]。我国西部小反刍兽疫疫情的防控需要有效的血清学监控，因此标记疫苗的研制有其必要性和紧迫性。本研究室小反刍兽疫病毒反向遗传操作平台的建立为小反刍兽疫标记疫苗的构建提供全新的技术途径[6]，在此基础之上本研究于PPRV N蛋白羧基端分别引入HA、FLAG、5B19表位，利用反向遗传操作技术，分别成功拯救出表达融合外源表位N蛋白的重组病毒，并对重组病毒的生物学特性进行了研究。
发明内容
核衣壳蛋白(nucleocapsid，N)是小反刍兽疫病毒(peste des petitsruminants virus，PPRV)中含量最丰富和免疫原性最强的结构蛋白，是引入外源表位用以构建标记疫苗的合适靶蛋白。为构建小反刍兽疫标记疫苗，首先分别构建了在N蛋白羧基端引入外源表位(HA：YPYDVPDYA；FLAG：DYKDDDDK；小鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19：SPLLGCIGSTCAEDGN)的融合基因NHA、NFLAG、N5B19，并克隆至pCAGGS载体，以其替代PPRV反向遗传拯救系统中的表达天然PPRV N蛋白的辅助质粒后仍能够成功拯救出小反刍兽疫病毒，且拯救效率前后相差无几，表明融合外源表位后对N蛋白的功能影响不大。随后分别以NHA、NFLAG、N5B19基因替换PPRV感染性克隆中的N基因，体外救获表达融合外源表位N蛋白的重组病毒。蛋白印迹试验和间接免疫荧光试验表明分别融合外源表位的N蛋白获得了正确表达；体外生长动力学试验分析表明重组病毒的生长最高滴度虽比亲本毒低，但并不影响其今后作为标记疫苗的使用。小鼠免疫试验表明，本研究构建的三种标记疫苗rPPRV/GFP/NHA、rPPRV/GFP/NFLAG、rPPRV/GFP/N5B19都能够诱导特异性的针对外源表位的抗体，具有显著的标记作用，同时诱导的PPRV病毒中和抗体能够100％转阳。这些结果初步表明标记疫苗在山羊、绵羊等小反刍动物上使用的使用价值，不但能够提供区别自然感染和疫苗免疫感染的外源标记基因的抗体，还能够提供显著的PPRV病毒中和抗体以预防小反刍兽疫，是预防小反刍兽疫的新一代的标记弱毒疫苗。
更具体地，本发明提供以下各项：
1.一种重组小反刍兽疫病毒，在所述病毒的基因组中，在编码磷酸蛋白(P)和基质蛋白(M)的基因之间插入有编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因，其特征在于：在所述病毒的基因组中，在编码核蛋白(N)的基因的羧基端融合有编码外源表位的基因。
2.根据第1项所述的重组小反刍兽疫病毒，其中所述外源表位是HA。
3.根据第2项所述的重组小反刍兽疫病毒，其基因组的核酸序列如SEQ ID No.1的1116-17936位所示。
4.根据第1项所述的重组小反刍兽疫病毒，其中所述外源表位是FLAG。
5.根据第4项所述的重组小反刍兽疫病毒，其基因组的核酸序列如SEQ ID No.2的1116-17933位所示。
6.根据第1项所述的重组小反刍兽疫病毒，其中所述外源表位是5B19。
7.根据第6项所述的重组小反刍兽疫病毒，其基因组的核酸序列如SEQ ID No.3的1116-17957位所示。
8.根据第1-7项中任一项所述的重组小反刍兽疫病毒在制备标记的小反刍兽疫病毒疫苗中的用途。
9.利用根据第1-7项中任一项所述的重组小反刍兽疫病毒制备的标记的小反刍兽疫病毒疫苗。
10.根据第1-7项中任一项所述的重组小反刍兽疫病毒用作标记的小反刍兽疫病毒疫苗的用途。
附图说明
图1：融合外源表位的重组病毒的构建。图1A：将分别以引物pprv-N-F和pprv-NHA-R(或pprv-NFLAG-R或pprv-N5B19-R)、pprv-P-F和pprv-P-R扩增的PCR产物①(或③)和②克隆至质粒pCI-12II-N/P/M-GFP的XhoI位点；图中E表示外源表位HA、FLAG、5B19。图1B：用Rsr II酶切来自质粒pBlue-F/H/L的F-H-L片段，克隆至同样酶切的质粒pCI-12II-NHA/P/M-GFP(或pNg75/1-GFP/NFLAG或pNg75/1-GFP/N5B19)，图中E表示外源表位HA、FLAG、5B19。
图2：辅助质粒pCAGGS-NHA、pCAGGS-NFLAG、pCAGGS-N5B19对病毒拯救的影响。A、C、E：用辅助质粒pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-L拯救rPPRV/GFP病毒；B：用辅助质粒pCAGGS-NHA、pCAGGS-P、pCAGGS-L拯救rPPRV/GFP病毒(其对照组为图A)；D：用辅助质粒pCAGGS-NFLAG、pCAGGS-P、pCAGGS-L拯救rPPRV/GFP病毒(其对照组为图C)；F：用辅助质粒pCAGGS-N5B19、pCAGGS-P、pCAGGS-L拯救rPPRV/GFP病毒(其对照组为图E)。
图3：蛋白印迹检测外源表位在重组病毒感染vero细胞中的表达。I：免疫印迹检测感染rPPRV/GFP/NHA的细胞表达的HA表位；II：免疫印迹检测感染rPPRV/GFP/NFLAG的细胞表达的FLAG表位；III：免疫印迹检测感染rPPRV/GFP/N5B19的细胞表达的5B19表位；A：使用鼠抗HA单抗；C：使用鼠抗FLAG单抗；E：使用鼠抗5B19单抗；B、D、F：使用兔抗PPRV N多抗；1：标准蛋白分子量；2：阴性对照(mock)；3：rPPRV/GFP感染细胞；I-4：rPPRV/GFP/NHA感染的细胞；II-4：rPPRV/GFP/NFLAG感染的细胞；III-4：rPPRV/GFP/N5B19感染的细胞。
图4：间接免疫荧光检测重组病毒感染Vero细胞后外源表位的表达。
图5：rPPRV/GFP/NHA、rPPRV/GFP/NFLAG、rPPRV/GFP/N5B19和rPPRV/GFP病毒在Vero细胞上的生长曲线。
图6：小鼠免疫试验。Ctl-5B19、Ctl-HA、Ctl-FLAG分别表示以rPPRV/GFP免疫小鼠的血清分别检测5B19、HA、FLAG的抗体，作为各自外源表位的阴性对照；*、#、$表示P＜0.05。
具体实施方式
材料和方法
1.重组质粒、病毒、动物和细胞
表达GFP的重组PPRV感染性克隆质粒pN75/1-GFP，辅助质粒pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-L及pBlue-F/H/L、pCI-12II-N/P/M-GFP质粒由本实验室构建并保存[7](参见发明专利，专利号：201010559545.8)；表达GFP的重组小反刍兽疫病毒rPPRV/GFP由本实验室制备并保存[7](参见国家发明专利，专利号：201010559545.8)，rPPRV/GFP滴度在Vero细胞(ATCC No.CCL-81)上测定。BALB/C小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
2.主要试剂
Primer Star HS DNA聚合酶购自TaKaRa公司；快速克隆试剂盒(ClonExpressTM one step Cloning Kit)购自南京诺唯赞(vazyme)生物技术有限公司；T4 DNA连接酶及其它限制性内切酶均购自NEB公司；抗HA taqMAb购自北京中杉金桥生物技术有限公司；抗FLAG taq MAb购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗PPRV N蛋白的高免血清由本实验室制备并保存(该高免血清由原核表达的PPRV N蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔所获得，具体参见文献[8])；鼠抗5B19的高免血清由本实验室制备并保存(在上海捷瑞生物工程有限公司合成偶联多肽5B19-KLH[完全商品化的]，该多肽多次免疫BALB/c小鼠获得抗5B19的高免血清)；TRITC标记山羊抗鼠IgG荧光抗体、TRITC标记山羊抗兔IgG荧光抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体购自Sigma公司；鼠源反转录酶(M-MLV)试剂盒以及磷酸钙转染试剂盒(Calcium phosphate Transfection Kit)均购自Invitrogen公司；小量病毒RNA抽提试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司。
3.引物
根据GenBank中PPRV Nigeria 75/1毒株的全长基因组(HQ197753.1)基因序列，结合外源表位特点，设计将融合外源表位的N基因克隆至感染性全长cDNA的引物以及RT-PCR鉴定引物。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。
表1引物设计
Figure BDA00003205209500051
注：限制性位点由下划线标注；外源表位由斜体标注；“粗体碱基”是为了满足“六碱基原则”而额外添加的。
实施例1、融合外源表位的重组病毒的构建
以质粒pCAGGS-N为模板，以Epitope-F和HA-R为引物进行PCR扩增，PCR产物经SacI和KpnI双酶切后克隆到pCAGGS的SacI和KpnI酶切位点之间，构建pCAGGS-NHA质粒并测序；以质粒pCAGGS-N为模板，以Epitope-F和FLAG-R为引物进行PCR扩增，PCR产物经SacI和KpnI双酶切后克隆到pCAGGS的SacI和KpnI酶切位点之间，构建pCAGGS-NFLAG质粒并测序；以pCAGGS-N为模板，以Epitope-F和5B19-R1为引物进行PCR扩增，PCR产物经SacI单酶切后克隆到pBlueScrip II KS(+)载体(购自stratagene公司)的SacI和EcoR V位点之间，构建pBlue-5B191质粒，然后以pBlue-5B191质粒为模板，以Epitope-F和5B19-R2为引物进行PCR扩增，PCR产物经SacI和KpnI双酶切后克隆到pCAGGS的SacI和KpnI酶切位点之间，构建pCAGGS-N5B19质粒并测序。然后分别以pCAGGS-NHA、pCAGGS-NFLAG、pCAGGS-N5B19为模板，并相应地分别利用三对引物pprv-N-F和pprv-NHA-R、pprv-N-F和pprv-NFLAG-R、pprv-N-F和pprv-N5B19-R为正反向引物进行PCR扩增，分别得到产物fNHA、fNFLAG、fN5B19(见图1，fNHA：①；fNFLAG/fN5B19：③)；以pCI-12II-N/P/M-GFP为模板，以pprv-P-F和pprv-P-R为引物进行PCR扩增所得产物fP(见图1，片段②)，将PCR产物fNHA、fNFLAG、fN5B19分别地和fP用快速克隆技术克隆到pCI-12II-N/P/M-GFP质粒的XhoI位点，测序验证后分别命名为pCI-12II-NHA/P/M-GFP、pCI-12II-NFLAG/P/M-GFP、pCI-12II-N5B19/P/M-GFP(图1A)。用Rsr II处理pBlue-F/H/L，将F/H/L片段分别克隆到pCI-12II-NHA/P/M-GFP、pCI-12II-NFLAG/P/M-GFP、pCI-12II-N5B19/P/M-GFP的Rsr II位点，构建得到感染性克隆质粒pNg75/1-GFP/NHA(其核酸序列如SEQ ID No.1所示，其中编码HA的序列为SEQ ID No.1中的2798-2824位)、pNg75/1-GFP/NFLAG(其核酸序列如SEQ ID No.2所示，其中编码FLAG的序列为SEQ ID No.2中的2798-2821位)、pNg75/1-GFP/N5B19(其核酸序列如SEQ ID No.3所示，其中编码5B19的序列为SEQ ID No.3中的2798-2845位)(图1B)。
实施例2、表达融合外源表位N蛋白的重组病毒的拯救
将感染性克隆质粒pNg75/1-GFP/NHA与辅助质粒pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-L共转染Vero细胞进行病毒的拯救，具体试验方法参照文献[6]，将救获的病毒命名为rPPRV/GFP/NHA(其编码核酸序列如SEQ ID No.1中的1116-17936位所示)。同样方法救获重组病毒rPPRV/GFP/NFLAG(其编码核酸序列如SEQ ID No.2中的1116-17933位所示)和rPPRV/GFP/N5B19(其编码核酸序列如SEQ ID No.3中的1116-17957位所示)。为了鉴定三种外源表位对N蛋白功能的影响，通过病毒拯救效率来验证N蛋白的功能是否受到影响。病毒拯救后4～6天观察GFP的表达情况，结果(图2)表明：其一，采用辅助质粒pCAGGS-N、pCAGGS-NHA、pCAGGS-NFLAG、pCAGGS-N5B19都能够顺利拯救出表达GFP的重组病毒rPPRV/GFP，在荧光倒置显微镜下可观察到绿色荧光阳性信号，说明融合所述三种外源表位后，N蛋白的功能并没有丧失；其二，从荧光细胞的数量上看，两者无显著差异，表明融合所述三种外源表位对N蛋白功能应该影响不大。
实施例3、重组病毒的RT-PCR鉴定
将感染性克隆质粒pNg75/1-GFP/NHA与辅助质粒pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-L共转染Vero细胞进行病毒的拯救，具体试验方法参照文献[6]，救获融合HA表位的重组病毒rPPRV/GFP/NHA。为确定HA表位是否成功引入N基因的羧基端，对收获的rPPRV/GFP/NHA病毒液和rPPRV/GFP病毒液提取RNA，以NP-rtpcr-F和NP-rtpcr-R为引物进行RT-PCR。扩增出来的片段与对照rPPRV/GFP经相同引物RT-PCR扩增出来的片段大小一致，进一步测序分析表明HA表位已经成功的N蛋白的羧基端。同样方法检测到FLAG和5B19表位成功的引入N蛋白的羧基端。
实施例4、蛋白印迹检测
为了鉴定融合外源表位的N蛋白在重组病毒感染细胞中的表达情况，按MOI为0.1将rPPRV/GFP/NHA、rPPRV/GFP/NFLAG、rPPRV/GFP/N5B19病毒分别接种到Vero单层细胞上，当CPE达到80％左右，刮下细胞并离心，细胞沉淀用细胞裂解液(RIPA裂解液，购自碧云天生物科技有限公司)裂解，细胞裂解物经SDS-PAGE电泳分离后，半干转移法转至硝酸纤维素膜上；5％脱脂乳4℃封闭过夜。分别以鼠抗HA taq MAb和兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗，以HRP标记的兔抗小鼠IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗对rPPRV/GFP/NHA处理后样品进行蛋白印迹(western blotting)分析；分别以鼠抗FLAG taq MAb和兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗，以HRP标记的兔抗小鼠IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗对rPPRV/GFP/NFLAG处理后样品进行蛋白印迹分析；分别以鼠抗5B19的高免血清和兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗，以HRP标记的兔抗小鼠IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗对rPPRV/GFP/N5B19处理后样品进行蛋白印迹分析。同时设立未感染的细胞对照(Mock)和rPPRV/GFP感染的细胞对照。
结果显示，以鼠抗HA taq MAb为一抗进行western blotting检测，在rPPRV/GFP/NHA感染的细胞中可检测到正确大小的条带，约为59.0ku(图3 I-A-4)，而在未感染的细胞以及rPPRV/GFP感染的细胞中均未检测到条带(图3 I-A-2和I-A-3)；以兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗进行western blotting检测，在rPPRV/GFP感染的细胞和rPPRV/GFP/NHA感染的细胞中同时检测到大小约为59.0ku的条带(图3 I-B-3和I-B-4)，而在未感染的细胞中未检测到条带(图3 I-B-2)。上述结果表明，rPPRV/GFP/NHA能够正确表达融合HA表位的N蛋白。以鼠抗FLAG taq MAb为一抗进行western blotting检测，在rPPRV/GFP/NFLAG感染的细胞中可检测到正确大小的条带，约为59.0ku(图3 II-C-4)，而在未感染的细胞以及rPPRV/GFP感染的细胞中均未检测到条带(图3 II-C-2和II-C-3)；以兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗进行western blotting检测，在rPPRV/GFP感染的细胞和rPPRV/GFP/NFLAG感染的细胞中同时检测到大小约为59.0ku的条带(图3II-D-3和II-D-4)，而在未感染的细胞中未检测到条带(图3 II-D-2)。上述结果表明，rPPRV/GFP/NFLAG能够正确表达融合FLAG表位的N蛋白。以鼠抗5B19的高免血清为一抗进行western blotting检测，在rPPRV/GFP/N5B19感染的细胞中可检测到正确大小的条带，约为59.5ku(图3 III-E-4)，而在未感染的细胞以及rPPRV/GFP感染的细胞中均未检测到条带(图3 III-E-2和III-E-3)；以兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗进行western blotting检测，在rPPRV/GFP感染的细胞和rPPRV/GFP/N5B19感染的细胞中同时检测到大小约为59.5ku的条带(图3 III-F-3和III-F-4)，而在未感染的细胞中未检测到条带(图3 III-F-2)。上述结果表明，rPPRV/GFP/N5B19能够正确表达融合5B19表位的N蛋白。综上结果可得重组病毒能够正确表达融合外源表位的N蛋白。
实施例5、间接免疫荧光试验
为检测重组病毒在Vero细胞中的复制及融合外源表位N蛋白的表达情况，将rPPRV/GFP/NHA、rPPRV/GFP/NFLAG、rPPRV/GFP/N5B19病毒按MOI为0.1分别接种于Vero单层细胞，待CPE约70％～80％时，依次以3％的多聚甲醛室温固定细胞30min，0.5％Triton X-100透膜30min。分别以鼠抗HA taq MAb和兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗，TRITC标记山羊抗鼠IgG荧光抗体和TRITC标记山羊抗兔IgG荧光抗体为二抗对rPPRV/GFP/NHA处理后样品进行间接免疫荧光(IFA)检测；分别以鼠抗FLAG taq MAb和兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗，TRITC标记山羊抗鼠IgG荧光抗体和TRITC标记山羊抗兔IgG荧光抗体为二抗对rPPRV/GFP/NFLAG处理后样品进行IFA(间接免疫荧光)检测；分别以鼠抗5B19的高免血清和兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗，TRITC标记山羊抗鼠IgG荧光抗体和TRITC标记山羊抗兔IgG荧光抗体为二抗对rPPRV/GFP/N5B19处理后样品进行IFA检测。同时设立未感染的细胞对照(Mock)和rPPRV/GFP感染的细胞对照。
结果显示，以鼠抗HA taq MAb为一抗进行IFA检测，在rPPRV/GFP/NHA感染的细胞中可检测到HA表位的表达(图4A)，而在rPPRV/GFP感染的细胞和未感染的细胞中未检测到HA表位的表达(图4B和C)。以兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗进行IFA检测，在rPPRV/GFP/NHA感染的细胞和rPPRV/GFP感染的细胞中均检测到N蛋白的表达(图4D和E)，而在未感染的细胞中未检测到N蛋白的表达(图4F)。综上所述，rPPRV/GFP/NHA能够正确表达融合HA表位的N蛋白。以鼠抗FLAG taq MAb为一抗进行IFA检测，在rPPRV/GFP/NFLAG感染的细胞中可检测到FLAG表位的表达(图4G)，而在rPPRV/GFP感染的细胞和未感染的细胞中未检测到FLAG表位的表达(图4H和I)。以兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗进行IFA检测，在rPPRV/GFP/NFLAG感染的细胞和rPPRV/GFP感染的细胞中均检测到N蛋白的表达(图4J和K)，而在未感染的细胞中未检测到N蛋白的表达(图4L)。综上所述，rPPRV/GFP/NFLAG能够正确表达融合FLAG表位的N蛋白。以鼠抗5B19的高免血清为一抗进行IFA检测，在rPPRV/GFP/N5B19感染的细胞中可检测到5B19表位的表达(图4M)，而在rPPRV/GFP感染的细胞和未感染的细胞中未检测到5B19表位的表达(图4N和O)。以兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗进行IFA检测，在rPPRV/GFP/N5B19感染的细胞和rPPRV/GFP感染的细胞中均检测到N蛋白的表达(图4P和Q)，而在未感染的细胞中未检测到N蛋白的表达(图4R)。综上所述，rPPRV/GFP/N5B19能够正确表达融合5B19表位的N蛋白。综上结果可得重组病毒能够正确表达融合外源表位的N蛋白。
实施例6、重组病毒的生长动力学分析
将rPPRV/GFP/NHA、rPPRV/GFP/NFLAG、rPPRV/GFP/N5B19和rPPRV/GFP病毒按MOI为0.01分别接种于Vero单层细胞上。分别在第3、4、5、6、7和8天收获细胞，并冻融两次，随后在96孔细胞板进行病毒滴度的滴定，绘制重组病毒在Vero细胞上的生长动力学曲线。
生长动力学曲线显示，rPPRV/GFP/NHA、rPPRV/GFP/NFLAG、rPPRV/GFP/N5B19三种重组病毒与rPPRV/GFP的病毒滴度均在第五天达到峰值，但三种重组病毒的最高滴度(rPPRV/GFP/NHA：106.2TCID50/mL；rPPRV/GFP/NFLAG：105.4TCID50/mL；rPPRV/GFP/N5B19：106.9TCID50/mL)低于亲本毒rPPRV/GFP，rPPRV/GFP/NHA与rPPRV/GFP、rPPRV/GFP/NFLAG与rPPRV/GFP、rPPRV/GFP/N5B19与rPPRV/GFP两两配对样本T检验结果(P＜0.05)表明rPPRV/GFP/NHA、rPPRV/GFP/NFLAG、rPPRV/GFP/N5B19生长复制能力受到一定程度的影响。
实施例7、小鼠免疫试验
本实验室已证实rPPRV/GFP重组毒与疫苗株Nigeria75/1的感染与生长复制能力相近[6]。为确定重组病毒rPPRV/GFP/NHA、rPPRV/GFP/NFLAG、rPPRV/GFP/N5B19在Vero细胞上的生长复制能力，将rPPRV/GFP/NHA、rPPRV/GFP/NFLAG、rPPRV/GFP/N5B19和rPPRV/GFP稀释成1.5×106TCID50/ml，经腹腔(200ul)和两后腿肌肉(每条腿各50ul)共注射4.5×105TCID50剂量各免疫5只BALB/C小鼠(其中rPPRV/GFP免疫组为4只)，免疫后3周按相同剂量和免疫途径进行加强免疫，分别于免疫前、2次免疫后2周采血分离血清，采用ELISA方法检测Ha、flag和5B19的抗体，同时检测PPRV病毒中和抗体。ELISA方法：将HA、Flag、5B19三种多肽进行人工合成(中科亚光生物科技有限公司)。将合成的多肽以0.5μg/孔的包被96孔酶标板，4℃过夜，PBST(0.05％Tween20)洗涤4遍，3％的鱼皮胶溶液37℃封闭2h，PBST洗涤4遍，待检血清用3％的脱脂乳溶液以1∶50进行稀释，每孔加入100μl，37℃反应1h，PBST洗涤4次，每次5min。加入1∶5000稀释后的HRP-兔抗鼠IgG(Sigma)100μl，37℃反应1h，PBST洗涤3次。以TMB作为底物，50μl/孔，37℃作用10min。加入50μl/孔的0.5M H2SO4终止反应，在酶标仪上测定OD450nm值。根据P/N值确定阴性、阳性血清的判定标准。小反刍兽疫病毒中和抗体检测方法参见之前报道的文献[6，9，10]。病毒中和抗体滴度≥10判定为阳性。
结果如图6所示，2次免疫后2周的外源表位特异性抗体比免疫前有大幅度的提高，t检验表明免疫前后的外源表位抗体差异显著(图6，*、#、$P＜0.05)。同时，PPRV病毒中和抗体转阳率在2次免疫后2周后都100％转阳。表明本研究构建的标记疫苗具有良好的应用价值。
讨论：
由于Nigeria75/1疫苗株免疫效力确实，持续期长，而且经过数十年的使用，非常安全可靠，因此是构建标记疫苗的极其合适的毒株。为此我们采用本研究室新建立的采用PPR弱毒疫苗株Nigeria75/1的反向遗传操作系统[6]，通过融合外源表位(HA、FLAG、5B19)至N蛋白羧基端来构建标记疫苗。
本研究标记疫苗的构建重在探索，在重组病毒rPPRV/GFP的基础上构建表达融合外源表位(HA、FLAG、5B19)N蛋白的重组病毒rPPRV/GFP/NHA、rPPRV/GFP/NFLAG、rPPRV/GFP/N5B19，其GFP的表达方便进行后续试验的观察和研究。标记疫苗所采用的外源表位为8～16个氨基酸的短肽，对外源靶蛋白的空间结构影响小并且具有良好的免疫原性[11]，适合引入PPRV N蛋白羧基端以构建标记疫苗。RT-PCR、蛋白印迹和IFA结果表明，在救获的重组病毒中，外源表位成功引入N蛋白的羧基端，融合的外源表位随着N蛋白获得表达而获得表达。虽然生长动力学试验结果显示重组病毒在细胞上的复制能力受到一定的影响，但其最高病毒滴度可达到Nigeria75/1弱毒疫苗株在免疫时的使用滴度103TCID50，因此rPPRV/GFP/NHA能够符合将来作为标记疫苗的使用要求。
最后，小鼠免疫试验表明，本研究构建的标记疫苗rPPRV/GFP/NHA、rPPRV/GFP/NFLAG、rPPRV/GFP/N5B19都能够诱导特异性的针对外源表位的抗体，具有显著的标记作用，同时诱导的PPRV病毒中和抗体能够100％转阳。这些结果初步表明其在山羊、绵羊等小反刍动物上的使用价值，不但能够提供区服自然感染和疫苗免疫感染的外源标记基因的抗体，还能够提供显著的PPRV病毒中和抗体以预防小反刍兽疫，是预防小反刍兽疫的新一代的标记弱毒疫苗。
本文构建的将标记基因融合至N蛋白的重组小反刍兽疫病毒，为全球首创。理论上标记基因插入可能会影响N蛋白的功能，可能会对重组疫苗生长有影响，试验也表明融合的表位也确实轻微影响了病毒的复制能力，但动物实验表明，本研究构建的重组标记疫苗能够成功诱导特异的标记表位抗体和较高的小反刍兽疫中和抗体，标记基因的插入对于这些重组标记疫苗的将来使用没有影响。此外，构建的重组疫苗克服了亲本疫苗株和其它传统PPR疫苗株不能区分自然感染和疫苗免疫感染的缺陷，这些都表明本研究具有一定的新颖性和创新性。
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Claims (10)

1.一种重组小反刍兽疫病毒，在所述病毒的基因组中，在编码磷酸蛋白(P)和基质蛋白(M)的基因之间插入有编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因，其特征在于：在所述病毒的基因组中，在编码核蛋白(N)的基因的羧基端融合有编码外源表位的基因。
2.根据权利要求1所述的重组小反刍兽疫病毒，其中所述外源表位是HA。
3.根据权利要求2所述的重组小反刍兽疫病毒，其基因组的核酸序列如SEQ ID No.1的1116-17936位所示。
4.根据权利要求1所述的重组小反刍兽疫病毒，其中所述外源表位是FLAG。
5.根据权利要求4所述的重组小反刍兽疫病毒，其基因组的核酸序列如SEQ ID No.2的1116-17933位所示。
6.根据权利要求1所述的重组小反刍兽疫病毒，其中所述外源表位是5B19。
7.根据权利要求6所述的重组小反刍兽疫病毒，其基因组的核酸序列如SEQ ID No.3的1116-17957位所示。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的重组小反刍兽疫病毒在制备标记的小反刍兽疫病毒疫苗中的用途。
9.利用根据权利要求1-7中任一项所述的重组小反刍兽疫病毒制备的标记的小反刍兽疫病毒疫苗。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的重组小反刍兽疫病毒用作标记的小反刍兽疫病毒疫苗的用途。
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