CN102344913B - 表达狂犬病病毒g蛋白重组犬瘟热病毒cdv/r-20/8疫苗株的构建 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达狂犬病病毒糖蛋白(G蛋白)的重组犬瘟热病毒，更具体地，重组犬瘟热病毒是rCDV-RVG。本发明还公开了制备所述重组犬瘟热病毒疫苗的方法和该重组犬瘟热病毒在制备预防狂犬病和犬瘟热的二联疫苗中的应用。

Description

表达狂犬病病毒G蛋白重组犬瘟热病毒CDV/R-20/8疫苗株的构建

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种表达狂犬病病毒糖蛋白(G蛋白)的重组犬瘟热病毒疫苗，更具体地，重组犬瘟热病毒疫苗是rCDV-RVG。本发明还公开了制备所述重组犬瘟热病毒的方法和该重组犬瘟热病毒在制备预防狂犬病和犬瘟热的二联疫苗中的应用。

背景技术

犬瘟热(Canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的犬科(尤其是幼犬)、鼬科及部分浣熊动物的急性、高度接触性和致死性传染病，能引起大批犬、貂、狐等动物发病，甚至虎、豹、拼猴、大熊猫也能发生感染，病死率在不同宿主中表现不同^[1]，犬、貂、狐等动物的病死率30％～80％^[1]，雪貂的病死率可达100％^[2]，常给养犬业和皮毛经济动物养殖业带来惨重的经济损失。

CDV属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒属(Morbillivirus)，为负链单股不分节段的RNA病毒。CDV基因组全长15,690核苷酸，具有6个独立转录单元，分别为核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大聚合酶蛋白(L)。CDV与其它负链RNA病毒一样，其最小的感染单位是核蛋白复合体，无蛋白包裹的RNA并无感染性。CDV的基因组RNA与NP、P、L蛋白共同组成核蛋白复合体，启动RNA的首轮转录及病毒蛋白的翻译合成、产生感染性子代病毒。重组CDV作为活病毒疫苗载体具有极为突出的优点，犬瘟热弱毒疫苗长期以来一直用于犬及其他皮毛动物防疫，其安全有效性已被充分证明。

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)引起的一种重要的人兽共患传染病，主要通过被患病或带毒的动物咬伤而传染所致，其病死率几乎高达100％^[3]。RV的主要储存宿主为野生动物，犬在传播狂犬病中起重要作用，是人畜感染最主要的来源。全世界每年约有5.5万人死于该病。近年来，我国狂犬病死亡人数均超过2400人/年，且呈逐年上升的趋势，是甲、乙类传染病中死亡人数最高的传染病，具有重要的公共卫生学意义。当前我国狂犬病形势异常严峻，发病数居世界第2位，仅次于印度^[4]。近年来，随着中国家养宠物数量猛增，狂犬病正在重新成为严重危害我国公共卫生的重大疫病。因此，防治狂犬病的形势变得更加严峻。狂犬病的预防主要通过疫苗免疫的方式进行。狂犬病疫苗种类繁多，效果不一。科研工作者一直不间断地对狂犬病疫苗进行改进和创新，取得了丰硕的成果，但仍然存在很多不足。

1885年，法国科学家巴斯德首次用兔脑脊髓制备成狂犬病弱毒疫苗，应用于人体治疗并获得了成功。我国目前生产ERA株和Flury株活疫苗。狂犬病弱毒疫苗在体内的增殖过程与病原感染机体的过程相似，能诱导产生细胞免疫和体液免疫，且产生的免疫反应较强，持续时间较长，在我国狂犬病防制工作中曾起到一定的积极作用。但有的疫苗毒株本身对乳鼠致病，对怀孕动物、免疫机能不全的动物和幼小动物使用不安全，而且存在毒力回升、返祖的潜在危险。

鉴于弱毒活疫苗在使用过程中存在较大的安全隐患，WHO建议使用狂犬病灭活疫苗代替弱毒疫苗。主要有神经组织灭活苗、鸭胚疫苗和细胞培养苗等，由于神经组织疫苗注射量大，接种次数多，抗体产生慢、水平低，含有神经麻痹因子，易引发变态反应，而且疫苗中易残留有感染性的活病毒。鸭胚疫苗抗体效价低，而且需要进行病毒提纯，最终被市场淘汰。细胞苗生产工艺复杂，价格昂贵，同样限制了在生产实践中的广泛应用。

RV属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属(Lyssaviruses)，具有5个独立转录单元，分别为核蛋白(NP)、磷蛋白(NS)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和聚合酶蛋白(L)，狂犬病病毒糖蛋白(G蛋白)是诱导保护性中和抗体的主要免疫原。

发明内容

本发明选用我国生产实践中广泛应用、免疫效果良好的犬瘟热病毒CDV/R-20/8疫苗株，已经建立了相应的反向遗传操作平台。在此基础上，本研究构建了含有ERA株RV弱毒疫苗株的编码G蛋白的基因(G基因)的重组犬瘟热弱毒疫苗株基因组全长cDNA克隆pCI-CDV-RVG，采用反向遗传操作技术成功救获表达狂犬病病毒ERA疫苗株G蛋白基因的重组犬瘟热弱毒疫苗株rCDV-RVG，该重组病毒保持了亲本疫苗株的生长特性和低致病性及G蛋白的稳定表达。本研究为成功研制狂犬病犬瘟热二联活载体疫苗奠定了基础。

本发明的一个目的是提供一种表达编码狂犬病病毒糖蛋白即G蛋白的基因的重组犬瘟热病毒。优选G基因位于所述犬瘟热病毒的编码磷蛋白(P)的基因和编码基质蛋白(M)的基因之间。

在一个优选实施方案中，所述犬瘟热病毒是弱毒疫苗株，更优选用于表达编码所述G蛋白的基因的犬瘟热病毒是犬瘟热病毒CDV/R-20/8疫苗株，最优选所述重组犬瘟热病毒是rCDV-RVG。

在一个优选实施方案中，所述狂犬病病毒糖蛋白即G蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

在一个优选实施方案中，所述编码狂犬病病毒糖蛋白即G蛋白的基因的序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的另一个目的是提供根据本发明的重组犬瘟热病毒在制备预防狂犬病和犬瘟热的二联疫苗中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种生产本发明的重组犬瘟热病毒的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码狂犬病病毒糖蛋白即G蛋白的基因的所述犬瘟热病毒的基因组cDNA序列；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，所述辅助质粒能够表达所述犬瘟热病毒的核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、和/或大聚合酶蛋白(L)，优选三个辅助质粒，所述三个辅助质粒分别表达所述犬瘟热病毒的核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、和大聚合酶蛋白(L)；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述犬瘟热病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)从转染的宿主细胞的细胞悬液中拯救重组犬瘟热病毒。

在一个优选实施方案中，所述转录质粒是pCI-CDV-RVG。

在一个优选实施方案中，所述转录辅助质粒是质粒pCI-CDVN、pCI-CDVP和pCI-CDVL。

在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是BHK细胞或Vero细胞。

本发明的另一个目的是提供根据本发明的方法制备的重组犬瘟热病毒。

应当理解，上述实施方案中的技术特征可以任意组合，并且该组合对于本领域技术人员是显而易见的。

具体而言，重组犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景，本发明旨在探讨重组犬瘟热病毒作为防制狂犬病(Rabies)及犬瘟热重组二联活病毒载体疫苗的可行性。本研究以生产实践中广泛应用、免疫效果良好的犬瘟热弱毒疫苗株CDV/R-20/8为亲本株，采用反向遗传操作技术救获了表达狂犬病病毒(Rabies virus，RV)ERA疫苗株G蛋白的重组犬瘟热病毒rCDV-RVG，病毒一步生长试验显示，反向遗传救获的rCDV和rCDV-RVG的生长滴度在相近时间达到峰值，生长动力学曲线无明显差异；间接免疫荧光证实RVG蛋白在重组病毒rCDV-RVG感染的Vero细胞中获得高效表达。分别将重组病毒rCDV-RVG和野生型犬瘟热病毒疫苗株rCDV经肌肉注射途径免疫接种3月龄比格犬。中和试验结果显示，重组病毒rCDV-RVG和野生型犬瘟热病毒疫苗株rCDV均能在犬体内诱导的抗CDV中和抗体，且二者诱导中和抗体的能力无明显差别；同时，重组病毒rCDV-RVG在犬体内能诱导高水平的抗RV中和抗体。本研究为研制狂犬病-犬瘟热重组二联活载体疫苗奠定了基础。

附图说明

图1.犬瘟热弱毒疫苗株野生型及重组型基因组cDNA的构建(A.克隆于pCI上的CDV基因组cDNA克隆pCI-CDV；B.含有EGFP基因的重组CDV基因组cDNA克隆pCI-CDV-EGFP：其中“斜体大写字母序列”为Pme I酶切位点，基因转录信号终止(gene-end，GE)序列用“加下划线的小写字母”标识，“大写加粗的序列CTT”为基因间隔区核苷酸，基因转录信号起始(gene-start，GS)序列用“加下划线的大写字母”标识，“斜体粗体大写字母”序列为kozak序列，Mlu I酶切位点用“粗体小写字母”标识)；

图2.间接免疫荧光检测rCDV和rCDV-EGFP感染的Vero细胞(以1∶50倍稀释的鼠抗灭活犬瘟热弱毒疫苗株全病毒高免血清为一抗检测rCDV感染的Vero细胞(A)、rCDV-EGFP感染的Vero细胞(B)和未感染的Vero细胞(C))；

图3.rCDV和rCDV-EGFP在Vero细胞上的生长动力学曲线；

图4.GFP在重组病毒rCDV-EGFP感染的Vero细胞内的表达(将第1代(A)、第2代(B)、第3代(C)、第4代(D)和第5代(E)连续5代次重组病毒rCDV-EGFP按MOI为0.01接种于生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，5％CO₂、37℃培养3天(d)后，荧光显微镜(Leica DMIRES2)下观察结果)；

图5.转录质粒pCI-CDV的序列(从5′端到3′端)(1058-1115为HamRz序列；1116-16805为CDV基因组序列；16806-16893为HdvRz序列)；

图6.转录质粒pCI-CDV-EGFP的序列(从5′端到3′端)(1058-1115为HamRz序列；1116-17579为CDV-EGFP基因组序列；4532-5251为EGFP基因序列；17580-17667为HdvRz序列)；

图7.辅助质粒pCI-CDV-N的序列(从5′端到3′端)(1075-2646为CDVN基因组序列)；

图8.辅助质粒pCI-CDV-P的序列(从5′端到3′端)(1086-2609为CDVP基因组序列)；

图9.辅助质粒pCI-CDV-L的序列(从5′端到3′端)(1075-7629为CDV L基因组序列)；

图10.表达RV G蛋白基因的重组犬瘟热病毒疫苗株基因组全长cDNA的构建(A.克隆于pCI上的CDV基因组全长cDNA克隆pCI-CDV；B.含有RVG基因(即RV的G基因)的重组CDV基因组cDNA克隆pCI-CDV-RVG：其中“斜体大写字母序列”为Pme I酶切位点，GE序列用“加下划线的小写字母”标识，“大写加粗的序列CTT”为基因间隔区核苷酸，GS序列用“加下划线的大写字母”标识，“斜体粗体大写字母”序列为kozak序列，Mlu I酶切位点用“粗体小写字母”标识)；

图11.间接免疫荧光检测重组犬瘟热病毒rCDV-RVG表达RV G蛋白(鼠抗灭活CDV全病毒高免血清为一抗，间接免疫荧光检测rCDV(A)和rCDV-RVG(B)分别感染的Vero细胞及未感染病毒的Vero细胞(C)；鼠抗灭活RV全病毒高免血清为一抗，间接免疫荧光检测rCDV(D)和rCDV-RVG(E)分别感染的Vero细胞及未感染病毒的Vero细胞(F)，Mock是未感染任何病毒的正常细胞对照)；

图12.rCDV和rCDV-RVG在Vero细胞上的生长动力学曲线；

图13.转录质粒pCI-CDV-RVG的序列(从5′端到3′端)，其中从5′端到3′端1058-1115位碱基为HamRz序列，1116-18437位碱基为CDV-RVG基因组序列，4535-6109位碱基为RV G蛋白基因序列，和18438-18525位碱基为HdvRz序列。

关于序列表的说明

SEQ ID No.1是狂犬病病毒糖蛋白即G蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID No.2是编码狂犬病病毒糖蛋白即G蛋白的基因(G基因)的序列。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1犬瘟热病毒反向遗传操作系统的构建

1材料与方法

1.1材料

犬瘟热弱毒疫苗CDV/R-20/8株购自解放军军事医学科学院军事兽医研究所；BHK-21细胞(乳仓鼠肾细胞ATCC No.CCL-10)和Vero细胞(非洲绿猴肾细胞，ATCCNo.CCL-81)，培养液均为含10％胎牛血清的DMEM；质粒pCI购自Promega，pBluescript购自Clontech；PrimeSTAR(R)HS DNA聚合酶，T4DNA连接酶及其它限制性内切酶均购自TaKaRa公司；RNA提取试剂Trizol、鼠源反转录酶(MLV)、胎牛血清以及磷酸钙转染试剂盒(Calcium phosphate Transfection Kit)购自Invitrogen；鼠抗犬瘟热病毒全病毒高免血清经由CDV CDV/R-20/8株Vero细胞培养裂解上清反复免疫BALB/c小鼠制备，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所人兽共患病研究室提供；红色荧光素(TRITC)标记的兔抗鼠二抗购自Sigma公司；荧光显微镜为Leica DM IRB，购自Leica公司。

1.2CDV基因组全长cDNA克隆及辅助质粒的构建

犬瘟热弱毒疫苗株病毒接种Vero细胞收获的病毒液按常规方法(Trizol法)提取病毒基因组RNA；整个基因组分为9个末端部分重叠的片段(F1～F9)进行RT-PCR扩增，在F1片段5’端通过PCR引入锤头状核酶结构(HamRz)，在F9片段3’端通过PCR引入丁肝病毒核酶结构(HdvRz)，同时在HamRz序列的上游和HdvRz序列的下游分别引入SpeI和NotI位点，cDNA片段克隆至pBluescript EcoRV位点并经序列测定确证与病毒基因组RNA序列完全一致；利用相邻近片段重叠部分的限制性酶切位点连接组装成完整的CDV基因组cDNA，并克隆在转录载体pCI中CMV-IE启动子的下游NheI和NotI位点之间，构成CDV基因组全长cDNA克隆pCI-CDV(质粒序列见附图5)。pCI-CDV中CMV-IE启动子和SV40晚期多腺苷酸化信号之间的DNA片段在宿主细胞RNA聚合酶II作用下得到转录，并且由于HamRz和HdvRz的自身催化功能，可以保证转录产物的3’末端和5’末端与克隆的CDV基因组cDNA片段精确一致。

按照上述方法，分别将CDV的NP、P和L基因的ORF cDNA，分别克隆在pCI质粒CMV-IE启动子的下游，分别构成表达CDV NP、P和L蛋白的辅助质粒pCI-CDVN、pCI-CDVP和pCI-CDVL(质粒序列分别见附图7-9)。

1.3表达GFP的重组CDV基因组全长cDNA克隆的构建

在上述CDV基因组全长cDNA克隆pCI-CDV的基础上，通过PCR方法在cDNA3363-3388nt进行碱基定点突变，引入Pme I和Mlu I限制酶切位点(GTTTAAACTAACGCGT)，构成重组CDV基因组转录载体pCI-CDV-P/M；再以pIRES-EGFP(Cloneech)为模板，通过PCR在GFP的ORF 5’端引入Pme I限制酶识别序列和CDV自身聚合酶蛋白L识别的转录终止序列GE(ATTATAAAAAA)及转录起始序列GS(AGGACACAAGAGCCTAA)，PCR产物克隆至pBluescript EcoR V位点并经序列测定正确后，经限制酶Pme I消化插入pCI-CDV-P/M的Pme I位点，构成表达EGFP重组CDV基因组全长cDNA克隆pCI-CDV-EGFP(质粒序列见附图6)。

表1引物设计

1.4病毒的拯救及扩增

BHK-21细胞接种于35mm六孔板中，待生长至70％～80％单层时，采用CaPO₄转染试剂将转录质粒pCI-CDV(或pCI-CDV-EGFP)，以及辅助质粒pCI-CDVN、pCI-CDVP和pCI-CDVL分别以5μg、1μg、0.8μg和0.5μg的量共转染BHK细胞，5％CO₂、37℃培养，具体操作按试剂盒说明书进行^[3]。转染后8～12h，弃去转染混合物，用含10％DMSO的PBS液休克细胞2.5min，加入完全DMEM培养液，5％CO₂、37℃培养；4d后将细胞刮下来，将细胞悬液混匀，取300μL细胞悬液接种于生长过夜、密度约60％～70％的单层Vero细胞，感作1h后加入含5％胎牛血清的DMEM，5％CO₂、37℃培养4-6d，显微镜下观察细胞病变；待出现细胞病变时，收获细胞悬液，作为种毒保存于-70℃。救获具有感染性的野生型CDV疫苗株和表达EGFP的重组病毒分别命名为rCDV和rCDV-EGFP。

1.5间接免疫荧光检测救获的病毒

Vero细胞接种于24孔板中，待生长至70％～80％单层时，分别将rCDV和rCDV-EGFP种毒液按感染复数MOI为0.01感染Vero细胞；3天后，弃培养上清，PBS洗涤细胞2次，3％多聚甲醛室温固定30min。分别以1∶50倍稀释的鼠抗灭活CDV全病毒高免血清为一抗，作用30min。PBST洗涤后加入1∶64倍稀释红色荧光素(TRITC)标记的兔抗鼠二抗，作用30min，PBST洗涤后荧光显微镜(Leica DMIRES2)观察结果。

2结果

2.1CDV基因组全长cDNA克隆的构建

为了构建CDV基因组全长cDNA克隆，通过RT-PCR获得了覆盖整个基因组的9个cDNA克片段，并利用相邻近片段重叠部分的限制性酶切位点连接组装获得了15690nt的完整cDNA克隆，在全长cDNA片段5’端前缀HamRz，在全长cDNA片段3’端连有HdvRz，构建成表达野生型CDV cDNA克隆pCI-CDV(图1A)。

2.2表达EGFP的重组CDV基因组全长cDNA克隆的构建

在CDV基因组全长cDNA克隆的基础上，在cDNA 3363-3388nt进行碱基定点突变，引入Pme I和Mlu I限制酶切位点，在Pme I限制酶切位点插入5’端引入CDV L聚合酶特异的转录调控序列GE和GS的EGFP基因，构建成表达EGFP的重组CDVcDNA克隆pCI-CDV-EGFP(图1B)。

2.3从cDNA克隆救获感染性rCDV和重组病毒rCDV-EGFP

为了从克隆的cDNA中拯救感染性rCDV和rCDV-EGFP，以pCI-CDV(或pCI-CDV-GFP)及表达CDVNP、P和L蛋白的辅助质粒共转染BHK细胞。转染4天后，刮下细胞，并将细胞悬液混匀，后取300μL细胞悬液接种于Vero细胞，培养4-6天，显微镜下观察细胞病变；待出现细胞病变时，收获细胞悬液，分别作为救获病毒rCDV和rCDV-EGFP的F1代。按上述方法将救获病毒rCDV和rCDV-EGFP再传2代。进一步的RT-PCR及序列分析结果显示，F3代救获病毒基因组cDNA分别与用于转染的pCI-CDV和pCI-CDV-GFP序列一致，与预期相符。结果表明，通过反向遗传操作技术，利用CDV疫苗株基因组cDNA克隆成功救获具有感染性的野生型犬瘟热弱毒疫苗株rCDV和表达EGFP的重组犬瘟热弱毒疫苗株rCDV-EGFP。

2.4间接免疫荧光检测救获的病毒

为了进一步鉴定上述救获的病毒，分别以rCDV和rCDV-EGFP感染Vero细胞，3天后再分别以1∶50倍稀释的鼠抗灭活CDV全病毒高免血清为一抗进行间接免疫荧光染色。结果以1∶50倍稀释鼠抗灭活CDV全病毒高免血清检测rCDV和rCDV-EGFP感染的Vero细胞均显示阳性荧光信号(图2A和2B)，而以1∶50倍稀释鼠抗灭活CDV全病毒高免血清检测未感染病毒的Vero细胞则显示的荧光信号为阴性(图2C)。结果表明，通过反向遗传操作技术，利用CDV疫苗株基因组cDNA克隆成功救获具有感染性的野生型犬瘟热弱毒疫苗株rCDV和表达EGFP的重组犬瘟热弱毒疫苗株rCDV-EGFP。

实施例2重组病毒与野生型病毒在Vero细胞上的生长动力学比较

将实施例1中制备的野生型病毒rCDV和重组病毒rCDV-EGFP分别按MOI为0.01接种于生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，37℃感作1h后，加入含5％胎牛血清的DMEM完全培养液，5％CO₂、37℃培养，于感染后12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h分别收获上述感染病毒的细胞；将上述不同时间段收获的重组病毒rCDV-EGFP和亲本株病毒液冻融1次后，做10倍连续稀释，分别取100μL各稀释度病毒液接种铺于96孔板、生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，37℃感作1h后，PBS洗2次，加入含5％胎牛血清的DMEM完全培养液，5％CO₂、37℃培养，每个稀释度做8个重复；感染后第5天显微镜下观察细胞病变，计算各时间段收获的重组病毒rCDV-EGFP和亲本株病毒液的病毒滴度(TCID₅₀)，以评价两种病毒在Vero细胞上的生长动力学特点。

结果显示，通过反向遗传技术救获的野生型病毒rCDV和重组病毒rCDV-EGFP生长滴度在相近时间达到峰值，生长动力学曲线无明显差异，见图3。

实施例3外源蛋白EGFP表达检测

为了评价重组病毒rCDV-EGFP在Vero细胞内表达GFP的稳定性，将F1～F5连续5代次重组病毒rCDV-EGFP按MOI为0.01接种于生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，37℃感作1h后，加入含5％胎牛血清的DMEM完全培养液，5％CO₂、37℃培养，3天后荧光显微镜(Leica DMIRES2)下观察结果。结果显示，各代次的重组病毒rCDV-EGFP在Vero细胞内均能高效地表达GFP，见图4。

实施例4表达编码狂犬病病毒糖蛋白(G蛋白)的基因的重组犬瘟热病毒疫苗的构建和生物学活性

1材料与方法

1.1材料

犬瘟热弱毒疫苗CDV/R-20/8株购自解放军军事医学科学院军事兽医研究所；狂犬病病毒(RV)ERA株(AV61)购于中国兽医药品监察所；BHK-21细胞(乳仓鼠肾细胞ATCC No.CCL-10)和Vero细胞(非洲绿猴肾细胞，ATCC No.CCL-81)，培养液均为含10％胎牛血清的DMEM；质粒pCI购自Promega，pBluescript购自Clontech；PrimeSTAR(R)HS DNA聚合酶，T4DNA连接酶及其它限制性内切酶均购自TaKaRa公司；RNA提取试剂Trizol、鼠源反转录酶(MLV)、胎牛血清以及磷酸钙转染试剂盒(Calcium phosphate Transfection Kit)购自Invitrogen；鼠抗犬瘟热病毒全病毒高免血清经由CDV CDV/R-20/8株Vero细胞培养裂解上清反复免疫BALB/c小鼠制备，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所人兽共患病研究室提供；红色荧光素(TRITC)标记的兔抗鼠二抗购自Sigma公司；荧光显微镜为Leica DM IRB，购自Leica公司。

1.2表达RV G基因的重组CDV基因组全长cDNA克隆的构建

在犬瘟热病毒CDV/R-20/8疫苗株基因组全长cDNA克隆质粒pCI-CDV(在犬瘟热病毒CDV/R-20/8疫苗株基因组cDNA的5’端和3’端分别引入锤头状核酶结构(HamRz)和丁肝病毒核酶结构(HdvRz)，并克隆在转录载体pCI中CMV-IE启动子和SV40晚期多腺苷酸化信号之间；pCI-CDV中CMV-IE启动子和SV40晚期多腺苷酸化信号之间的DNA片段在宿主细胞RNA聚合酶II作用下得到转录，并且由于HamRz和HdvRz的自身催化功能，可以保证转录产物的3’末端和5’末端与克隆的CDV基因组cDNA片段精确一致)的基础上，通过PCR方法在CDV cDNA3363-3388nt进行碱基定点突变，引入Pme I和Mlu I限制酶切位点(GTTTAAACTAACGCGT)，构成重组CDV基因组转录载体pCI-CDV-P/M；再以狂犬病病毒ERA疫苗株基因组为模板，通过RT-PCR在RV G基因的ORF 5’端引入Pme I限制酶识别序列和CDV自身聚合酶蛋白L识别的转录终止序列GE(ATTATAAAAAA)及转录起始序列GS(AGGACACAAGAGCCTAA)，PCR产物克隆至pBluescript EcoR V位点并经序列测定正确后，经限制酶Pme I消化插入pCI-CDV-P/M的Pme I位点，构成含有RV G蛋白基因的重组CDV基因组全长cDNA克隆pCI-CDV-RVG。

表2引物设计

1.3病毒的拯救及扩增

BHK-21细胞接种于35mm六孔板中，待生长至70％～80％单层时，采用CaPO₄转染试剂将转录质粒及辅助质粒pCI-CDV-RVG、pCI-CDVN、pCI-CDVP和pCI-CDVL分别以5μg、1μg、0.8μg和0.5μg的量共转染BHK-21细胞，5％CO₂、37℃培养，具体操作按试剂盒说明书进行^[5]。转染后8～12h，弃去转染混合物，用含10％DMSO的PBS液休克细胞2.5min，加入完全DMEM培养液，5％CO₂、37℃培养；4天后将细胞刮下来，将细胞悬液混匀，取300μL细胞悬液接种于生长过夜、密度约60％～70％的单层Vero细胞，感作1h后加入含5％胎牛血清的DMEM，5％CO₂、37℃培养4-6天，显微镜下观察细胞病变；待出现细胞病变时，收获细胞悬液，作为种毒保存于-70℃。救获具有感染性的表达狂犬病病毒ERA疫苗株G蛋白的重组犬瘟热病毒命名为rCDV-RVG。

1.4间接免疫荧光检测救获的病毒

Vero细胞接种于24孔板中，待生长至70％～80％单层时，分别10倍连续稀释rCDV和rCDV-RVG种毒液，按每孔100μL 10³倍稀释病毒液感染Vero细胞；3天后，弃培养上清，PBS洗涤细胞2次，3％多聚甲醛室温固定30min。分别以1∶50倍稀释的鼠抗灭活CDV全病毒高免血清和鼠抗灭活狂犬病病毒ERA疫苗株全病毒高免血清为一抗，作用30min。PBST洗涤后加入1∶64倍稀释荧光素(FITC)标记的兔抗鼠二抗，作用30min，PBST洗涤后荧光显微镜(Leica DMIRES2)观察结果。

1.5重组病毒与野生型病毒株在Vero细胞上的生长动力学比较

分别将重组病毒rCDV-RVG和野生型病毒rCDV按MOI为0.01接种于生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，37℃感作1h后，加入含5％胎牛血清的DMEM完全培养液，5％CO₂、37℃培养，于感染后24h、48h、72h、96h和120h分别收获上述感染病毒的细胞；将上述不同时间段收获的重组病毒rCDV-RVG和野生型病毒rCDV冻融1次后，做10倍连续稀释，分别取100μL各稀释度病毒液接种铺于24孔板、生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，37℃感作1h后，PBS洗2次，加入含5％胎牛血清的DMEM完全培养液，5％CO₂、37℃培养，每个稀释度做3个重复；感染后第5天显微镜下观察细胞病变，计算各时间段收获的重组病毒rCDV-RVG和野生型rCDV的病毒滴度(TCID₅₀)，以评价两种病毒在Vero细胞上的生长动力学特点。

2结果

2.1表达RV G基因的重组CDV基因组全长cDNA克隆的构建

为了构建表达RV G基因的重组CDV基因组全长cDNA克隆，在CDV基因组全长cDNA克隆pCI-CDV(图10A)的基础上，在cDNA 3363-3388nt进行碱基定点突变，引入Pme I和Mlu I限制酶切位点，在Pme I限制酶切位点插入5’端引入CDV L聚合酶识别的、特异的转录调控序列GE和GS的RV G基因，构建成表达RV G基因的重组CDV基因组全长cDNA克隆pCI-CDV-RVG(图10B)。pCI-CDV-RVG的序列如图13所示。

2.3从cDNA克隆救获感染性rCDV和重组病毒rCDV-RVG

为了从克隆的cDNA中拯救感染性rCDV-RVG，以pCI-CDV-RVG及表达CDVNP、P和L蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞。转染4天后，刮下细胞，后取300μL细胞悬液接种于Vero细胞，培养4-6天，显微镜下观察细胞病变；待出现细胞病变时，收获细胞悬液，作为救获病毒rCDV-RVG的F1代。按上述方法将救获病毒rCDV-RVG再传2代。进一步的RT-PCR及序列分析结果显示，F3代救获病毒rCDV-RVG基因组cDNA与用于转染的pCI-CDV-RVG序列一致(结果未显示)，与预期相符。结果表明，通过反向遗传操作技术，利用CDV疫苗株基因组cDNA克隆成功救获具有感染性的表达RV G蛋白基因的重组犬瘟热病毒rCDV-RVG。

2.4间接免疫荧光检测救获的病毒

为了进一步鉴定上述救获的病毒，分别以救获的野生型病毒rCDV疫苗株和重组病毒rCDV-RVG按M.O.I.为0.01感染生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，3天后再分别以1∶50倍稀释的鼠抗灭活CDV全病毒高免血清和鼠抗灭活RV全病毒高免血清为一抗进行间接免疫荧光染色。结果鼠抗灭活CDV全病毒高免血清检测rCDV和rCDV-RVG感染Vero细胞均显示阳性荧光信号(图11A和11B)，而未感染病毒的Vero细胞则显示阴性荧光信号(图11C)；鼠抗灭活RV全病毒高免血清检测rCDV-RVG感染Vero细胞显示阳性荧光信号(图11E)，而rCDV感染Vero细胞和未感染病毒的Vero细胞则显示阴性荧光信号(图11D和11F)。结果表明，通过反向遗传操作技术，利用表达RV G蛋白基因的犬瘟热弱毒疫苗株基因组cDNA克隆成功救获具有感染性、表达RV G基因的重组病毒rCDV-RVG。

2.5重组病毒与亲本病毒株在Vero细胞上的生长特性比较

为了比较两种病毒在Vero细胞上的生长动力学特点，将rCDV和rCDV-RVG分别按M.O.I.为0.01接种于生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，于感染后24h、48h、72h、96h和120h分别收获病毒液；将上述不同时间段收获的病毒rCDV和rCDV-RVG冻融一次后，分别做10倍连续稀释，接种铺于24孔板、生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，感染后第5天显微镜下观察细胞病变，计算其病毒滴度(TCID₅₀)。结果显示，通过反向遗传技术救获的野生型病毒rCDV和重组病毒rCDV-RVG生长滴度在相近时间达到峰值，生长动力学曲线无明显差异，见图12。

实施例5重组病毒的免疫试验和中和试验

1.材料与方法

1.1材料

同以上实施例4。

1.2方法

免疫试验

分别用10⁶TCID₅₀的重组病毒rCDV-RVG和野生型病毒rCDV经肌肉注射途径免疫接种5条3月龄的比格犬(购自广州医药工业研究院)；首免三周后，分别用相同剂量和相同接种途径加强免疫。分别于免疫前及首免后第7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天和56天前肢静脉采血，分离血清-70℃保存。

中和试验

用于中和试验的表达绿色荧光蛋白的重组犬瘟热病毒rCDV-EGFP的构建参见上文实施例，重组狂犬病病毒rRV-EGFP的制备参照文献^[7]进行：将EGFP基因插到狂犬病毒ERA弱毒疫苗株基因组中编码磷蛋白(P)的基因和编码基质蛋白(M)的基因之间，后采用反向遗传技术救获，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所人兽共患病研究室构建、滴定和保存。rCDV-EGFP血清中和试验步骤如下：在96孔板上进行，首先将血清样品置于56℃水浴30min进行灭活，再将血清样品分别以不完全DMEM连续倍比稀释，每稀释度体积为50μL，与50μL约含200TCID₅₀的rCDV-EGFP病毒液混合，37℃感作1h后，每孔加入约10⁵Vero细胞，5％CO₂环境，37℃培养24h后置于荧光显微镜(Leica DMIRES2)下观察GFP表达阳性细胞情况。血清每稀释度设4个平行孔。

rRV-EGFP血清中和试验基本参照文献进行^[5]。在96孔板上进行，首先将血清样品置于56℃水浴30min进行灭活，再将血清样品分别以不完全DMEM 9倍稀释，后连续3倍稀释，每稀释度体积为50μL，与50μL约含100TCID₅₀的rRV-EGFP病毒液混合，37℃感作1h后，每孔加入约10⁵Vero细胞，5％CO₂环境，37℃培养24h后置于荧光显微镜(Leica DMIRES2)下观察GFP表达阳性细胞情况。血清每稀释度设4个平行孔。

2.结果

中和试验

将表达绿色荧光蛋白的重组犬瘟热病毒rCDV-EGFP和重组狂犬病病毒rRV-EGFP代替野生型CDV和RV应用于中和试验，荧光显微镜下观察，通过96孔板中每孔有无表达绿色荧光蛋白的细胞来计算中和抗体滴度，使中和试验变得更为直观、简便和安全。中和试验结果显示：应用表达RV G蛋白的重组犬瘟热病毒rCDV-RVG和亲本株病毒rCDV分别免疫犬，首免后第21天能检测到抗CDV中和抗体，加强免疫后抗CDV中和抗体滴度迅速升高，且在加强免疫后第二周中和抗体滴度达到峰值；同时，重组犬瘟热病毒rCDV-RVG和亲本株病毒rCDV在犬体内诱导中和抗体的水平及消长规律无明显差异，见表4。另外，重组犬瘟热病毒rCDV-RVG在犬体内可诱导高水平的抗RV中和抗体，见表3。重组犬瘟热病毒rCDV-RVG的上述免疫活性证明G蛋白在重组犬瘟热病毒免疫的犬体内获得高效表达，从而能够引起针对G蛋白的免疫反应。

表3中和试验检测重组病毒rCDV-RVG免疫犬诱导的抗RV中和抗体滴度

表4中和试验检测rCDV和rCDV-RVG分别免疫犬诱导的抗CDV中和抗体滴度

现在我国使用的兽用狂犬病疫苗主要有弱毒疫苗和灭活疫苗。狂犬病弱毒疫苗生产成本低，免疫期较长，但存在一个安全问题——毒力返强；而狂犬病灭活疫苗较为安全，但其生产成本高，免疫剂量大，免疫期短，经常需要多次免疫接种，给免疫接种的实际操作带来诸多不便。因而，研制更为经济、安全和有效的狂犬病疫苗尤为重要。

RV编码5种结构蛋白，其中囊膜糖蛋白(G蛋白)为主要保护性抗原，能诱导特异地中和抗体反应和细胞免疫反应。本研究选用的RV G蛋白基因的供体病毒为RVERA疫苗株，该株病毒为Vero细胞适应株，背景清楚，且免疫后对RV的致死性攻击具有良好的保护作用。

外源基因在基因组内的插入可对重组CDV的复制、生长能力产生显著影响。外源基因的插入位置还可能对其表达水平产生显著影响，一般认为，外源基因插入位置越接近基因组3’末端，其表达水平越高，但对有些外源免疫原蛋白，特别是一些病毒囊膜糖蛋白，表达后可装配于病毒粒子的表面，过高的表达有可能影响到重组病毒在体内的感染、复制、甚至遗传稳定性^[6]。综合考虑诸方面因素，本研究选择在P-M之间插入RV G蛋白基因，构建了含有RV G蛋白基因的重组犬瘟热病毒基因组全长cDNA克隆pCI-CDV-RVG，并采用反向遗传操作技术成功救获表达RV G蛋白的重组犬瘟热病毒rCDV-RVG。病毒一步生长试验结果显示，重组犬瘟热病毒rCDV-RVG和亲本株rCDV均具有良好的Vero细胞生长适应性，二者生长滴度在相近时间达到峰值，生长动力学曲线无明显差异；间接免疫荧光结果显示，RV G蛋白在rCDV-RVG感染的Vero细胞中能获得高效的表达。中和试验结果显示，表达RV G蛋白的重组犬瘟热病毒rCDV-RVG和亲本株病毒rCDV在犬体内均能诱导抗CDV中和抗体，且诱导中和抗体的水平及消长规律无明显差别。同时，重组犬瘟热病毒rCDV-RVG在犬体内可诱导高水平的抗RV中和抗体，具有作为预防犬瘟热和狂犬病的重组二联活病毒载体疫苗潜力和良好的应用前景，并将会产生巨大的经济和社会效益。

参考文献

1.何洪彬，夏咸柱.犬瘟热的诊断及其预防免疫的研究进展.动物医学进展.2001，22(1)：12-15.

2.Loffer S，Lottspeich F，et al.CDV transmembrane protein renders cells susceptible tocanine distemper virus.J.Virol.，1997，17(1)：422491.

3.罗明，张茂林，涂长春.我国狂犬病流行状况分析及防治对策[J].中国人兽共患病杂志，2005，111(2)：188-190.

4.唐靑，李浩.中国狂犬病流行近况及相关因素分析.中华流行病学杂志.2005，26(3)，223-224.

5.Parks CL，Lerch RA，Walpita P，et al.Enhanced measles virus cDNA rescue and geneexpression after heat shock.J.Virol.，1999，73(5)：3560-6.

6.葛金英，温志远，王永等.表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建微生物学报，2006，46(4)：547-551.

7.Faber M，Li J，Kean RB，et al.Effective preexposure and postexposure prophylaxis ofrabies with a highly attenuated recombinant rabies virus.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(27)：11300-5.

Claims (10)

1.一种表达编码狂犬病病毒糖蛋白即G蛋白的基因(G基因)的重组犬瘟热病毒，其基因组序列如SEQ ID No.3所示。 

2.根据权利要求1的重组犬瘟热病毒，其中G基因位于所述犬瘟热病毒的编码磷蛋白(P)的基因和编码基质蛋白(M)的基因之间。 

3.根据权利要求1的重组犬瘟热病毒，其中所述犬瘟热病毒是弱毒疫苗株。 

4.根据权利要求1的重组犬瘟热病毒，其中所述犬瘟热病毒是犬瘟热病毒CDV/R-20/8疫苗株。 

5.根据权利要求1或2的重组犬瘟热病毒，其中所述狂犬病病毒糖蛋白即G蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。 

6.根据权利要求1或2的重组犬瘟热病毒，其中所述编码狂犬病病毒糖蛋白即G蛋白的基因的序列如SEQ ID No.2所示。 

7.根据权利要求1-6中任何一项的重组犬瘟热病毒在制备预防狂犬病和犬瘟热的二联疫苗中的应用。 

8.一种生产权利要求1-7中任何一项的重组犬瘟热病毒的方法，该方法包括： 

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码狂犬病病毒糖蛋白即G蛋白的基因(G基因)的所述犬瘟热病毒的基因组cDNA序列，所述转录质粒是序列如SEQID No.4所示的pCI-CDV-RVG； 

(2)构建三个辅助质粒，所述三个辅助质粒分别表达所述犬瘟热病毒的核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、和大聚合酶蛋白(L)，所述转录辅助质粒分别是质粒pCI-CDVN、pCI-CDVP和pCI-CDVL，其中pCI-CDVN的序列如SEQ ID No.5所示，pCI-CDVP的序列如SEQ ID No.6所示，并且pCI-CDVL的序列如SEQ ID No.7所示； 

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述犬瘟热病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞； 

(4)从转染的宿主细胞的细胞悬液中拯救重组犬瘟热病毒。 

9.根据权利要求8的方法，其中所述宿主细胞是BHK细胞或Vero细胞。 

10.通过根据权利要求8-9中任何一项的方法制备的重组犬瘟热病毒。 

Images