CN100447247C - 重组的感染性不分节段的负链rna病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了完全从cDNA克隆中产生感染性复制性不分节段的负链RNA病毒的方法。这一方法提供了通过重组DNA技术将突变引入该病毒基因组中的可能性。

Description

重组的感染性不分节段的负链RNA病毒
本发明涉及一种遗传工程得到的感染性复制性不分节段的负链RNA病毒突变体，和这种突变体的制备方法。
狂犬病病毒(RV)是棒状病毒科的不分节段的负链RNA病毒的一个实例。属于此科的其它病毒种为水泡性口炎病毒(VSV)，传染性造血器官坏死病毒(IHNV)，病毒性出血性败血病病毒(VHS，Egtved病毒)，牛暂时性发热病毒(BEFV)，和苦苣菜黄网病毒(SYNV)。
除棒状病毒科以外，属于副粘病毒(如sendai病毒(SV)，2型和3型副流感病毒(PIV)、新城疫病毒(NDV)、流行性腮腺炎病毒(MUV)、麻疹病毒(MEV)和犬热瘟病毒(CDV)和丝状病毒科的病毒，以及几种未归于某科的病毒(如Borna病病毒；BDV)均具有不分节段的负链RNA基因组。
各类的不分节段的负链RNA病毒中全基团结构是有可比的。特别是在副粘病毒和棒状病毒之间，在全基因结构上仅有很小的区别(Tordo等，Seminars in Virology 3：341-357，1992)。
RV可感染所有温血动物，在出现症状后这种感染最后几乎都导致死亡。犬狂犬病在世界上许多地方仍很重要：全世界每年发生的约75,000例人狂犬病例的大部分是由感染的狗引起的。在欧洲许多国家、和在美国加拿大，野生动物狂犬病的重要性日益增加。
在大部分物种中，狂犬病的临床特征相似，但在个体间存在很大的差异。在被狂犬病动物咬伤后，潜伏期一般为14-90天，但也可以相当长，有潜伏期超过一年的记录。该疾病的两个临床形式为狂暴性和早瘫性或麻痹性。在狂暴性形式中，动物变得不安、烦燥、富攻击性，并且通常是危险的，因为它失去了对人的一切恐惧，会咬任何引起其注意的东西。该动物经常不能吞咽，引起该病的症状“恐水症”。经常有过量的唾液、对光和声反应过度、及感觉过敏。随着脑炎的发展，瘫痪取代了狂暴，如从该病的早瘫性形式的全过程中所见，动物显示相同的临床特征。最后，常有抽搐发作、昏迷、和呼吸停止，临床症状开始后2-7天发生死亡。
当被狂犬病动物咬伤或偶发的抓伤，或当狂犬动物的带病毒唾液进入伤口时，狂犬病毒进入体内。在咬伤部位(肌肉)中病毒复制后，开始侵入外周神经末稍，及病毒基因组在轴突胞浆中向中枢神经系统运动。病毒进入脊髓再进入脑(特别是缘系统)与神经障碍的临床症状有关。一般，大约在中枢神经系统感染引起狂暴的同时，病毒颗粒从唾液腺中的粘液分泌细胞的顶端散发出来，以高浓度运送至唾液中。
在狂犬病的整个过程中，仅轻微地激起宿主炎症和特异的免疫应答；对此最合理的解释是因为此感染在肌肉中和在神经细中是非致细胞病变的，而且因为此感染大量集中在神经系统的免疫隐蔽区中。
像所有的棒状病毒那样，RV病毒由两个主要结构成分组成：核衣壳或核蛋白(RNP)核心和围绕RNP核心的双层膜形式的包膜。所有棒状病毒的感染性成分为RNP核心。此基因组RNA是反义的，因此不能作为信使，但要求其自身内源性RNA聚合酶转录mRNA。核衣壳(N)蛋白结合两种小蛋白(即RNA依赖性RNA聚合聚(L)和磷蛋白(P))包装此RNA基因组，形成RNP核心。膜部分含两种蛋白质：跨膜糖蛋白(G)和位于膜内侧的基质(M)蛋白。G蛋白在RV中负责细胞附着和膜融合，另外还是宿主免疫系统的主要靶点。
在转录过程中，此基因组指导一短的先导RNA和含5个单顺反子的、加帽的多聚腺苷化的mRNA的序列合成。在复制过程中，顺反子间的条件性转录终止和启动信号不被病毒聚合酶所识别。对于转录酶反应和复制酶反应，都要求与RNA基因组复合的N-蛋白以及L-蛋白和P-蛋白的存在。已测定了RV基因组上的基因顺序，其为如图1所示的3’-先导序列-N-P-M-G-L-5’。转录后，RV的每个mRNA立即被翻译。与复制过程中相继发生两个过程：先产生与基因组互补的衣壳化的完整的正链RNA，然后产生同样由N、L和P蛋白衣壳化的完整的负链RNA。最后，新组成的RNP核心在组装和芽殖过程中与M-蛋白及G-蛋白结合，导致装配好的感染性RV病毒颗粒的释放。
11.9Kb的基因组RVRNA含有5个开放阅读框架(ORF)，编码N、P、M、G和L蛋白，另外在G和L基因之间存在假基因区(ψ)(图1)。
对不分节段的负链RNA病毒的现代疫苗包含化学灭活病毒疫苗或含减毒的病毒株的改造的活病毒疫苗，其中减毒病毒株的致病性已经细胞培养中的多次传代而减低。化学灭活的狂犬病疫苗有，如：Rabivac，Behringwerke(人)，HDC，Rhone-Poulenc(人)，Bayovac-LT，Bayer(兽)，Madivac，Hoechst(兽)，Epivax-LT，Pitman-Moore，Rabisin，Phone-Merieux。对于RV，这种减毒病毒的实例有疫苗株SAD B19和ERA。灭活的疫苗一般仅诱导低水平的免疫，要求重复免疫接种。另外，经灭活处理后，诱导病原体的抗原决定簇的中和作用可能改变，从而减低的疫苗的保护能力。
一般优选减毒活病毒疫苗，因为它们激发常基于体液和细胞反应的免疫应答。但在细胞培养传代过程中，可能向病毒基因组中引入不可控制的突变，从而产生不同的毒力和免疫特性的病毒颗粒群。在细胞培养传代过程中过度减毒也是这些疫苗的一个问题。必须取得保证疫苗为无毒的和确保其仍有保护性之间的微妙平衡。另外，人们已知这种传统的减毒活病毒疫苗可能回复毒力，在接种动物中引起疾病暴发，并可能将病原体扩散到其它动物中。
另外，活病毒疫苗的一个问题是，抗原组分间的相互影响导致一种或多种组成成分的效力下降。
更进一步讲，对于现今施用的活的减毒RV疫苗或灭活的RV病毒，不可能确定某具体动物是RV类病毒携带者，还是已接种的动物。因此，能够区别用RV疫苗接种的动物和被该类病毒感染的动物是很重要的，以便采取适当的措施减小有毒的病毒的扩散。在某RV(糖)蛋白的编码基因中产生突变，能够引入例如血清学上可鉴别的标记，该蛋白一般在被感染宿主动物中引起抗体的产生。
希望以可控制的方式向RV RNA基因组中引入突变，以便例如形成的突变体RV是减毒的，或含有编码外源蛋白如免疫标记蛋白或病原体抗原的异源核酸序列。为此目的，在DNA病毒和正链RNA病毒中已广泛使用了重组DNA技术。重组的DNA病毒实例有：Aujeszky病毒(PRV)；腺病毒；牛痘病毒。重组的正链RNA病毒的实例有：α-病毒(Sindbis V.，Semliki forest virus：H.V.Huang，C.M.Rice，C.Xiong，S.Schlesinger(1989)作为基因表达载体的RNA病毒。Virus Genes 3，85-91)，微小RNA病毒(脊髓灰质炎病毒、A型肝炎病毒、口蹄疫病毒：J.W.Almond和K.L.Burke(1990)，脊髓灰质炎病毒作为递呈外源抗原的载体，Semin.Virol.1，11-20)。RNA病毒基因组的定向遗传工程取决于产生能被特异RNA-依赖性RNA聚合酶接受作为模板的重组RNA的能力。用许多标准的DNA依赖性RNA聚合酶(如T7RNA聚合酶或细胞RNA聚合酶II)产生的转录本和模拟(mim-icking)病毒基因组为许多正链RNA病毒的聚合酶所识别。这使得可以从cDNA转录本中回收感染性病毒或复制子，应用重组DNA技术以位点特异性的方式对这些基因组进行操作。因为相应于正链RNA病毒的基因组的RNA可作为病毒聚合酶翻译的mR-NA，感染循环可以通过向细胞中引入基因组类似物而启动。而负链RNA病毒的聚合酶的模板绝不是RNP复合体。而且与正链RNA病毒不同，它们的基因组或反基因组RNA不能作为mRNA，因此人工RNA的复制和转录中涉及的所有病毒蛋白必须以反式形式提供。
最近Palese，P等(WO 91/03552)公开了一种具有分节段基因组的负链RNA病毒的基因组RNA类似物的适当包装系统，以提供适当的模板。来自流感病毒基因组节段的RNA转录本在体外用纯化蛋白包装，其可用于与辅助病毒一起转染细胞。但发现该途径对于RV这种共有不分节段的基因组的病毒是不成功的。缺少RNA基因组的主要部分含有病毒蛋白编码基因的VSV和RV的短模型(model)基因组可被质粒编码的蛋白所包装并表达(Pattnaik，A.K.等，Cell 69，1011-1020，1992；Conzelmann，K-K和M.schnell，J.Virology 68，713-719，1994)。此途径涉及任选含受体基因插入的基因组类似物，和来自转染质粒的特异病毒蛋白的共同表达，以产生缺损病毒颗粒。Ballart等描述了一种从克隆的cDNA得到感染性麻疹病毒的方法，该病毒也是一种不分节段的负链RNA病毒(The MEBO Journal，9：379-384(1990))。此作者作为发明人之一提交了一项关于此方法的欧洲专利申请。
但此论文和专利申请都已撤回，因为进一步研究表明所有推定的重组病毒根本不是重组子，而仅是原始所用疫苗株的后代病毒。
因此，应得出这样的结论，迄今为止为得到具有大的不分节段的基因组的感染性重组负链RNA病毒的努力(这需要整个基因组的操作)都失败了。
本发明提供一种遗传工程的感染性复制性不分节段的负链RNA病毒突变体，其可通过重组DNA技术得到，其在RV基因组的ORF，假基因区或非编码区含有插入和/或缺失。
更具体地讲，本发明提供副粘病毒和棒状病毒科的不分节段的负链RNA病毒。
如上所解释的那样，在不分节段的RNA病毒科之间基因组结构存在大的同源性。当在复制、组装、细胞附着或细胞融合过程中的被编码蛋白质的功能可此时，将称这些蛋白质为“类似物”。例如一个科中的两种蛋白质的功能可能在另一科中合并在一种蛋白质中。这例如为下面这种情况：副粘病毒的F和HN蛋白一起与棒状病毒的糖蛋白G具有相同的功能。在此情形下，该科的这两种蛋白质将被视为另一科中那一种蛋白质的类似物。
通过在相应的病毒ORF，假基因区或非编码区掺入适当的突变，可向RV基因组中引入一种或多种核酸残基的插入和缺失。此改变应理解为亲本RV的RV ORF或假基因中遗传信息的改变，从而得到本发明的插入或缺失RV突变体。
一突变体，其中一个或多个核苷酸被另外的核苷酸所代替，所谓的取代替换可认为是插入和缺失作用的结合。因此，这种突变也被认为包括在术语：缺失和(/或)插入中。
很明显，这里定义的任何突变包括改变适当的RV序列使形成的RV突变体仍有感染性和复制性，即突变的RV有感染敏感细胞的能力，其突变的RNA基因组有自发复制和转录的能力，即不需要RVN，P和L蛋白的共同表达。
不用说，本发明也包括能够仅感染一个循环，然后复制的突变RV(参见下文)。
不同RV株的基因组结构是相同的。已测定了疫苗株SAD B19和毒性株PV的核苷酸序列和推测的氨基酸序列(Conzelmann等，Virology 175，485-499，1990和Tordo等，Nucleic Acids Res.14，2671-2683，1986；Proc.Natl.Acad.Sci USA 83，3914-3918，1986；Virology 165，565-567，1988)。在Conzelmann等，1990(见上文)中，测得SAD B19株的病毒基因组含有11，928个核苷酸，推断的5个病毒蛋白N，P，M，G和L的氨基酸序列与致病的PV株的高度相似。文中已测定了RV中每个ORF、假基因区和基因间非编码区的位置：编码区RVN，P，M，G和L基因分别相当于位置：71-1423，1514-2407，2496-3104，3317-4891，5414-11797。假基区位于4961-5359的位置，而分隔五个顺反子的基因间区域，其旁侧为含转录启动和终止/多聚腺苷化信号的非编码序列，其位于1483-1484；2476-2480；3285-3289；5360-5383的位置。虽然这里用于引入突变的亲本RV株的ORF，假基因区或非编码区的编号和核苷酸序列不必与SAD B19或PV株的相同，但这些区域的上述特征明确定义了其在任何RV株的基因组中的定位。
一种从有毒的亲本RV株得到减毒的RV的方法是：向编码病毒蛋白的ORF中引入插入和/或缺失，例如使病毒蛋白对宿主细胞附着和膜融合的活性得以改变，如减低。已知改变RV的跨膜糖蛋白G的氨基酸序列对RV的致病性有明显影响。另外对于减毒来说，基质(M)蛋白中的变化也可影响G蛋白的构象，致使病毒减毒。因此，这里优选在编码G或M蛋白的ORF中含有缺失或插入的突变体RV。
本发明也包括仅能够感染一个循环，然后复制的感染性复制性狂犬病病毒突变体。其优点解释如下：
虽然一般说来已证明重组活疫苗是安全有效的，但存在该疫苗病毒扩散到更易感染此病毒的其它动物的危险。
因此，出于政治、道德和部分科学的原因，非常不愿允许在此领域中使用重组病毒。
特别是，管理当局对于遗传改造的疫苗病毒，特别是表达外源基因的活病毒的风险评价研究中，这些病毒扩散到环境中的可能性是一个非常重要的方面。
因此，认识到强烈期望有这样的狂犬病病毒疫苗，它显示出活病毒疫苗的所有优点，但其被限于接种动物而不会扩散。
通过例如编码M(基质)蛋白的M-基因突变可制得这种病毒。M-蛋白在病毒组装中起主要作用，另外它还影响糖蛋白G的掺入和构象。
当缺乏功能性M-蛋白的M(-)突变体在反式产生M-蛋白的遗传工程细胞中生长时，产生完整的病毒颗粒，关于其对于它们的天然宿主的感染性特征而言，它们的行为象野生型病毒。但一旦它们已感染了宿主细胞，它们不可能产生新的感染性病毒，因为它们缺乏合成M-蛋白的遗传信息。
所以它们保持留在宿主中。下面将讨论这种病毒的优点。
因此，本发明的一种优选实施方案涉及在编码基质蛋白M的开放阅读框架中的插入和/或缺失，以形成无功能的基质蛋白M，或甚至不存在基质蛋白M。具有无功能基质蛋白M或无基质蛋白M的M(-)突变病毒必须在提供反式补充的基质蛋白M的细胞中生长，以在表型上互补此病毒。
另外，可通过G一基因突变制得这种病毒。如前所述，G蛋白在感染早期，在细胞附着和膜融合过程中起主要作用。
通过插入和/或缺失(或甚至缺失整个G-基因)突变G-基因，可能致使G-突变病毒由于糖蛋白G严重损坏(甚至不存在)而不能再成功地感染其它细胞。这种突变体以下称为G-负(G--)突变体。
因此，这种G-基因突变比前述突变(仅导致毒力减弱)更严重：真正的G-突变体不具有感染性，因为其缺乏功能性糖蛋白G。
如果这种G-突变体在G蛋白互补的重组宿主细胞中生长，所释放的后代病毒的表型为G-正，但其基因型为G-负。
这些病毒与G-正病毒相比有重要的优点：一方面是它们有能力感染非互补宿主细胞，因为它们在膜中具有G-蛋白，在被感染细胞中，G-突变病毒象野生型病毒一样复制。这样的优点是包括克隆在重组病毒中的异源基因的整个病毒基因组增殖，象野生型病毒那样，编码基因组产物将被表达。
但另一方面，可在宿主中形成无感染性子代病毒，因为一般宿主细胞不合成G-蛋白，突变病毒本身为G-负基因型。
因此，被G-突变病毒感染的动物不会向环境中扩散感染性病毒。这使得G-突变体(以及以上讨论的M(-)突变体)作为疫苗的基础是非常安全的。
另外，本发明的G-突变体可用其它非狂犬病的已知起细胞附着作用的糖蛋白表型互补。
因为已知从病毒膜伸出进入环境的糖蛋白决定细胞特异性，所以通过选择适当的互补糖蛋白，可以将重组的感染性狂犬病病毒突变体定向于特异的细胞，而不是狂犬病的天然宿主细胞。
这些糖蛋白以下将称为“糖蛋白G类似物”，以表明它们象糖蛋白G一样参与细胞特异性附着。
应注意，在某些病毒中决定细胞特异性的“糖蛋白G类似物”不是糖蛋白，而是非糖基代的蛋白质。很清楚，这些蛋白质也在本发明的范围内。
因此，本发明的另一优选实施方案中，编码糖蛋白G的开放阅读框架中的插入和/或缺失造成无功能的糖蛋白G，或甚至不存在糖蛋白G。此具有无功能糖蛋白G或无糖蛋白G的G(-)突变病毒必须在能反式提供糖蛋白G类似物的细胞中生长，以表型互补此病毒。
在本发明的一种更优选的实施方案中，用于互补的糖蛋白类似物为狂犬病病毒糖蛋白G本身。
具有糖蛋白G的重组感染性狂犬病病毒具有几个重要的优点：
a)根据所选用的糖蛋白G类似物的靶点，可将它们特异性地定向于某些细胞、器官或宿主。
这意味着例如可以特异性地定向于呼吸道或消化道。因此例如可在预定位点得到粘膜反应。
另外，可定向于免疫系统的特异细胞。
b)如上所述，它们另外可作为编码非狂犬病病原体的表位的外源遗传信息的载体。
另外，它们可作为编码毒性物质的外源遗传信息的载体。
本发明的病毒的一个非常重要的应用是用既具有a)的糖蛋白G类似物，又有b)的外源遗传信息的病毒得到的。
根据本发明可以得到这样的重组的感染性狂犬病病毒，其定向于一般被非狂犬病病毒所侵袭的特异细胞型，同时带有非狂犬病病毒的免疫保护性决定簇。
这种病毒在宿主内诱导对非狂犬病病毒的免疫，而同时非常安全，因为它缺少糖蛋白G类似物的遗传信息。
本发明的另一个重要的实施方案是例如通过与HIV gp 120基因型互补定向于CD 4-细胞(代表HIV的靶细胞)的本发明的病毒，其中HIV gp 120可能编码一种细胞毒性蛋白质。
这种病毒将选择性地攻击CD4-细胞，一旦进入这些细胞中，将将其杀死。
另外，本发明的重组感染性狂犬病病毒可提供现在还没有安全活疫苗的有毒的致病病毒的非常安全的疫苗：通过以BRSV糖蛋白G类似物互补定向于如牛呼吸道合胞病毒(BRSV)的天然靶细胞，表达BRSV的免疫保护性表位的、重组感染性狂犬病病毒，成为对此疾病的非常安全的疫苗。
副流感病毒疫苗面临着与BRSV-疫苗相同的问题。因此，具有副流感糖蛋白G类似物，还有副流感病毒免疫原性表位的，重组感染性狂犬病病毒提供抗此疾病的良好的安全的疫苗。
基于重组感染性病毒的其它重要的兽用疫苗，可通过向重组狂犬病病毒中引入下列病毒的免疫原性决定簇而制得：
i)环曲病毒；马、牛和猪的环曲病毒，
ii)冠状病毒；牛、狗、猪和猫的冠状病毒，特别是其刺突蛋白。
因此，本发明的最优选的实施方案是：用糖蛋白G类似物互补的，带有编码病原病毒或微生物的表位或多肽的异源核酸序列的，重组感染性狂犬病病毒糖蛋白G(-)突变体。
另外，改变RV复制酶或转录酶的酶活性使其活性降低，从而产生对宿主动物感染性小的病毒颗粒，从而达到RV的减毒。因为RV聚合酶活性涉及N，P和L蛋白，本发明也包括在编码N，P或L蛋白的ORF中有插入或缺失的RV突变体。
为了区别(血清学上)施用了含有所述RV突变体的疫苗的宿主和被亲本RV感染的宿主，也用本发明的RV缺失和/或插入突变体接种宿主。在本发明的这一实施方案中，RV插入突变体中的插入可编码一种能够在接种宿主中激发非-RV免疫应答的异源表位，或者可编码一种有酶活性的蛋白质，如CAT或lac Z(Conzel-mann and Schnell，1994，参看上文)。掺入这种插入的优选区域是RV假基因区。如实施例中所讲明的，可在此区进行插入和缺失，而不会干扰RV的基本功能，如感染或复制所必需的那些功能。RV缺失突变体可缺少某RV蛋白的一表位，该表位一般在接种后将引起免疫反应，特别是在编码G蛋白的ORF中含缺失的RV突变体适用于此目的。在RV插入突变体中，插入包含编码血清学标记抗原或其表位的核酸序列。
在本发明的另一实施方案中，提供能够表达特定的病原体的一个或多个不同的异源表位或多肽的RV突变体。这种突变体可用于接种动物(家养或非家养动物)，以抵抗野生动物狂犬病和所述病原体。
用这种活载体疫苗接种后，首先在接种的宿主中复制RV突变体，在体内表达异源表位或多肽以及RV多肽。在接种宿主中所表达的多肽然后将激发抗RV和特定病原体两者的免疫应答。如果来自特定病原体的异源多肽能刺激保护性免疫应答，用本发明的RV突变体接种的动物将对随后此病原体的感染以及RV的感染免疫。因此，将异源校酸序列插入RV基因组的适当区域，可在体内连续表达，产生对此病原体的有效的、安全和持久的免疫。
具体讲，本发明提供包括编码特定病原体的表位或多肽的核酸序列的插入的RV载体，其中插入在假基因区。
如果需要，可从上述RV载体中缺失部分或全部假基因区。
希望将优选的编码犬微小病毒、犬冠状病毒和传统的猪热瘟病毒(CSFV)的表位或多肽的核酸序列掺入RV基因组的适当区域。
迄今为止还不可能在DNA水平上用重组DNA技术操作RV的不分节段的负链RNA基因组，因为不能产生感染性复制性病毒。但现提供一种方法，它允许在DNA水平用重组DNA技术在病毒基因组的编码区或非编码区产生突变，然后产生在其基因组中带有突变的感染性可复制RV。
本发明的这种方法包括以下步骤：
a)向表达RNA聚合酶的细胞中引入：
1)一种或多种编码RVN，P和L蛋白的DNA分子，及
2)含RV cDNA基因组的DNA分子和
b)从细胞中分离所产生的病毒。
一般，通过在基因组中引入突变来改造狂犬病病毒基因组的cDNA。
但此方法还用于如纯化污染的RV库。这种情况下，将使用原始的未突变的cDNA。
由于含异源插入的标准的RV微小基因组使用编码蛋白的质粒的拯救效率极低，并且与插入长度相关(Conzelmann和Schnell，1994，参见上文)，不能期望通过与编码RVN，P和L蛋白的质粒共转染可以从转染的全长基因组RNA开始有效感染。因为预期与同时被表达的负链基因组RNA转录体杂交从编码转染蛋白的质粒产生了大量正义的N，P和L特异RNA，所以以上情况更可能发生。但这种能与大半基因组进行的可能的杂交，干扰关键的包装步骤。另外还可能影响N，P和LmRNA的翻译。实际上，发现用标准转染实验得不到感染性病毒。但如实施例中所述，使用别的转染实验，结合使用产生正链反基因组RNA转录体的RV cDNA基因组，可产生可复制的遗传工程RV。
上述方法使得可以在体外用重组DNA技术在亲本RV基因组中引入突变，然后产生带有所述突变的感染性复制性RV突变体。该突变包括但不限于：在亲本RV基因组的编码RV蛋白的ORF、非编码区如假基因区、或转录信号序列中插入、缺失或取代核酸残基。
在非编码的基因间区中的突变操作可影响特异病毒基因的转录，使mRNA的转录和随后蛋白质的翻译减低。(其中蛋白质可为包膜蛋白如M和G蛋白，或涉及聚合酶活性的蛋白如N，P或L蛋白)使生成的突变体具有减毒的特征，因为此突变体产生感染性子代病毒的能力减低了。特别是，在基因间区和/或转录信号序列中取代一个或多个核酸残基可影响转录的效率。
另外，应用此处所描述的方法，在毒性RV的基因组中涉及毒力的区域(如编码G蛋白的ORF)中，取代一个或多个核酸残基也是本发明的一部分。
这种突变可引起RV毒株的G蛋白中单个氨基酸的置换，导致(部分)丧失致病性，例如Arg(333)用Ile，Glu或Gln代替，或Leu(132)由Phe或Trp代替。
在本发明的方法中，含有RV遗传信息的DNA分子优选包含提供适当的转录启动子和终止子序列的质粒，所述序列可被转染宿主细胞共同表达的聚合酶所识别。
本发明的一个优选方法包括使用RV DNA转染的宿主细胞，所述细胞能够表达噬菌体T7DNA依赖性RNA聚合物，例如从牛痘病毒重组子胞浆中表达。在此例中，含RV DNA的质粒含有T7启动子和终止子序列(Conzelmann和schnell，1994，参见上文)。
为了制备活疫苗，本发明的重组RV突变体可在来自例如BHK或人二倍体细胞的细胞培养物上生长。通过收集组织细胞培养液和/或细胞，可收获这样生长后的病毒。可将活疫苗制备成悬液形式，或冷冻干燥。
除致免疫有效量的重组RV外，疫苗可含有药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明中有用的药学上可接受的载体或稀释剂的实例包括稳定剂如SPGA，碳水化合物(如，山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，葡萄糖，葡聚糖)，蛋白质如牛血清或脱脂奶和缓冲液(如磷酸缓冲液)。
任选地，可向疫苗中加入一种或多种具有佐剂活性的化合物。适宜的佐剂的实例有氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝，油乳液(如
Figure C9510895500191
Figure C9510895500192
或
Figure C9510895500193
的乳液)，皂素或维生素E溶解液。
有用的给药剂量将根据接种的脯乳动物类型、年龄、体重和给药方式而变化。剂量可在广泛的范围内变化：如102-107pfu/个动物可能是适宜剂量。具体剂量例如为约106pfu/个动物。
本发明的RV突变体还可用于制备灭活疫苗。
至于动物的给药，可能过特别是口服、鼻内、真皮内、皮下或肌内途径给以本发明的RV突变体。
本发明的RV疫苗可施用于狗，但还可施用于主要媒介动物，即浣熊、臭鼬和狐狸。另外，还希望用能够表达猪病原体如传统猪热瘟病毒的异源基因的活RV载体来接种野猪。
实施例1
感染性复制性RV病毒颗粒的制备
全长RV cDNA的构建(图2)
狂犬病毒SAD B 19株全基因组cDNA的克隆以前已描述过(Conzelmann等，1990，上述；GenBank登记号M31046)。这里所用的狂犬病毒核苷酸和氨基酸编号与Conzelmann等，1990(上述)的相对应。使用含有狂犬病毒微小基因组的转录质粒pSDI-1(Conzelmann和Schmell，1994，上述)作为SAD B19全长DNA克隆构建的基础(图2)。pSDI-1含有SDA B19的3’和5’末端(分别为SAD B 19核苷酸1～68和11760-11928)，它们插入到T7RNA聚合酶启动子和丁型肝炎病毒反基因组核酶序列之间。为了构建可产生正链的SDI-1转录本的质粒(PSDI-1+)，利用一11个碱基的引物(5’-ACGCTTAACAA-3’)通过PCR技术扩增pSDI-1中的狂犬病毒序列，由于狂犬病毒基因组末端的互补性，所用该引物与正义和反义病毒RNA的5’末端都对应。将合成的带有后跟3个G残基(划线)的T7启动子序列的EcoRI/平端衔接子(T7/3)(5’-AATTCC TGCAGTAA TACGACT CAC-TATAGGG-3’)部分连接到扩增的狂犬病毒序列后，连接产物被克隆到pX8dT的EcoRI/Smal位点上。质粒pX8dT是从pBluescipt II(Stratagene)缺失含有原T7启动子的多克隆位点的BSSH II/laI片段衍生而来的。该质粒在SmaI位点上含有84碱基的HDV反基因组核酶序列，紧随其后在BamHI位点上克隆了T7转录终止子序列。含有正义狂犬病毒序列上游的T7启动子的结构通过限制内切酶分析和测序进行了鉴定。然后pSDI-1的MunI/BglII片段(SADB19核苷酸40-48)被来自不同的SAD B19cD-NA克隆的三个片段(MunI-SphI(SAD B19核苷酸40～482，来自pZAD1-9)；SphI-AatII(4041～4273来自PSDAD 13)，和AatII-BglII(11472-11759来自pSAD85))组装在pBluescript II所形成的1kb MunI/BglII cDNA所替换产生pSDI-1170。SphI片段是由克隆pSAD 25和pSAD13经NcoI位点组装而成(SAD B19核苷酸482-4041)，AatII片段是由克隆pSAD 49和pSAD 85经XhoI位点组装而成(SAD B19核苷酸4273～11472)，将这两个片段插入到pSDI-1170的SphI和AatII特异酶切位点上，从而最终构建了基本的全长克隆pSAD L16。利用环状质粒进行体外转录并用变性琼脂糖凝胶对产物进行分析。RNA转录本与12kb狂犬病毒基因组RNA的共迁移说明了T7聚合酶转录了全长反基因组RNA。
感染性重组狂犬病毒的回收
如Conzelmann和Schnell，1994(上述)所述进行质粒pSADL16和编码狂犬病毒N、P和L蛋白的质粒的共转染。
转染实验的进行如先前所述。克隆的BSR，细胞BHK-21在直径3.2cm的培养皿中以添加10％小牛血清的Eagle’s培养基过夜培养，直到80％细胞交会，用重组牛痘病毒v TF7-3以m.o.i5来感染(Fours等，Proc.Natl.Acad.Sci USA83，8122-8126，1986)。处理一小时后，用不含小牛血清的培养基洗涤细胞两次，应用哺乳动物细胞转染试剂盒(stratagene；CaPO4法)，按照产品指导，用含5μg pT7T-N，5μg pT7T-P和25μg
Figure C9510895500221
T7T-L的混合物，及用2μgpSAD-L16质粒转染细胞。转染4小时后移去沉淀并洗涤细胞并培养在含10％小牛血清的Eagle’s培养基中。来自T7RNA聚合酶转录本的pSAD-L16可能的衣壳化和来自核衣壳的狂犬病毒蛋白的表达结果可通过间接荧光法检测。运用抗只能由重组狂犬病基因组表达的狂犬病毒G蛋白的单壳降抗体来筛选培养物。转染一天后对细胞染色，证实来自狂犬病毒基因组的基团的表达。但在一系列20个转染实验中只发现一个阳性细胞。无荧光的细胞病灶表明这些实验中能得到感染性病毒。而且两天后从用转染细胞的完全上清液培养的细胞培养物中均不能回收到感染性病毒。因此，为了分离由转染细胞产生的假定为小量的感染性病毒，修正的实验方法。为了分离病毒转染子，细胞和上清液在转染两天后收集。细胞用橡胶淀帚刮起并悬浮在上清中。悬液经三次冻融(-70℃/37℃，每次5分钟)。细胞碎片和这一条件下过剩的牛痘病毒形成的聚合体可通过10,000g离心10分钟沉淀下来。全部上清用于培养一培养四中汇合单层细胞。培养两小时后，用2ml新鲜培养基代替上清液。感染一两天后，可以观察到由牛痘病毒引起的细胞病变作用(cpe)。10,000g离心后，平均只能观察到十个空斑。没有产生可检测的细胞病变作用的细胞RV病毒感染可在感染一两天后，用抗N偶联物(centocore)对整个单层细胞进行直接免疫荧光染色加以证实。在20个实验中的两个发现有荧光病灶，并且每个上清液中都含有感染性狂犬病毒(SAD L16)，假定这些病毒是由cDNA转录本产生的转染子病毒。
将有病灶的培养物一半上清10000g离心后用于第二次传代，根据狂犬病毒感染的程度，在以后的传代中(每两天一次)，减少使用上清的量。为了完全除去牛痘病毒，全部细胞都感染的培养物上清液(第三次传代)14,000g 10分钟离心两次。接着将最终的上清液用灭菌的MI LLEX-VV 0.1μm的过滤单位(Millipore Pro-ducs，Bedford，MA01730)过滤后，用以产生高滴度的重组狂犬病毒。
后面的转染和分离方法用于下面的实施例中。
实施例2
在RV假基因区插入寡核苷酸
的操作在含有pSAD L16的2.8kb xhoI-ScaI片段即SADB19核苷酸3823至6668的亚克隆pPSiX8上进行。改造过的pPsix8质粒的StuI片段被分离后用于替换全长克隆pSAD L16(图1)中的相应片段(SAD B19)位置4014到6364)。用Hind III降解pPdix8，用Klenow酶补平突出端并重连以实现在
Figure C9510895500232
内插入4个核苷酸，并产生一个新的NheI位点。通过重复核苷酸5338到5341，使最终的全长克隆pSAD U2与SAD L16相区别。
将转感细胞连同上清液的抽提物转入到新鲜细胞后，可证明有感染性病毒产生。在一个实验中可以观察到病灶的形成。通过转移上清液到新鲜细胞中两次，将转染子病毒(克隆SAD U2-13和SAD U2-32)转代，几乎100％细胞感染。为了证实在SAD U2病毒基因组中的插入，从SAD U2-13感染的细胞中提取分离总RNA并进行
Figure C9510895500233
的逆转录酶-PCR(RT-PCR)实验。应用引物G3P和L4M(图1)，它们分别对G和L基因特异，可以从转染了病毒SAD U2和SAD L16及标准狂犬病毒SAD B19的基因组中得到约730bp的DNA片段。但接着发现只有从SAD B19和SADLl 6得到的PCR DNA可以用Hind III酶解，而从SADU2来的PCR DNA则不行。相反，只有从SAD U2来的DNA可以用NheI酶切，产生两个分别约为530和200bp的片段(图3)。对转染子病毒SAD U2的基因组RNA直接RT测序进一步证实了在预定的位点上存在预期的4个残基的插入，同是测定的序列的其余部分与原SAD B19基因组相对应。因此，显而易见SAD U2病毒为基因组来自于改造过的cDNA的转染子病毒。
靠近狂犬病毒
Figure C9510895500241
区未端引入4个额外的核苷酸既不影响转染子病毒SAD U2的活力，又不干扰正常的G mRNA转录终止。
实施例3
通过G和L编码区之间的插入和缺失改变狂犬病毒的转录
用Sty1和Hind III双酶切，Klenow补平并重新连接，缺失396个碱基(SAD B19核苷酸4942到5337)，最终的结构为pSADW9。为了构建pSAD V*，从pSAD 13(Conzelmamm等，1990，上述)中分离到包括SAD B19N/P顺反子边界区的一个180bpBglII-AsuII片段。该片段包括N编码区的97个核苷酸，全部的3’端非编码区和由N转录终止/多聚腺苷化信号、基因间区及包括转录起始信号的P顺反子的前16个核苷酸组成的N/P顺反子边界区。该片段用Klenow酶(pNigP-180)补平3’端退缩性末端后亚克隆到pBluescript的EcoRI位点上。用HindIII/XbaI从pNigP上酶切并制成平端，得到一含有狂犬病毒插入，旁侧分别带有载体序列的16和34bp，将该片段克隆到pPsiX8补平的Sty1位点上。与pSAD L16相比，最终的全长结构(pSAD V*)带有一234bp的插入。
如前述，pSAD W9和pSAD V*每一个去转染二十个培养平皿，随后从三个SAD V*转染的培养物和一个SAD W9转染的培养物中分离到活病毒，表明病毒存活。连续五次传代后，从感染的细胞和上清液中分离到RNA，使用与前述实验中相同的引物通过RT-PCR进行分析。与标准的SAD B19病毒相比，用SAD V*所感染细胞的RNA产生的0.9kb的增大的DNA片段，因此表明这一转染子病毒的
Figure C9510895500251
区存在插入序列(图4)。相反，从SAD W9感染的细胞的RNA，只能得到0.3kb的DNA片段；这一大小与在cDNA基因组拷贝中造成缺失是一致的。PCR产物的测序进一步证实了起初改造的cDNA序列已被拯救到SAD V*和SAD W9转染子病毒的基因组中。因此，在G开放读码框架和
Figure C9510895500252
区间存在包括50个载体序列核苷酸的插入序列和整个区的缺失对转染子狂犬病毒的感染能力和繁殖都没有影响。以某种方式设计了SAD V*和SADW9基因组中的遗传改造，造成在转录行为中的表型改变，研究这是否影响每个转染卫病毒的生长特征。但是感染性SAD V*和SADW9在细胞培养物中的繁殖以及最终滴度都与标准的SAD B19RV的相似。用0.01的m.o.i感染3天后，上清液中SAD B19、SAD V*和SAD W9的滴度都达到108病灶形成单位(ffu)，这说明狂犬病毒
Figure C9510895500254
区对细胞培养中的繁殖是不重要的。
使用
Figure C9510895500255
区特异性探针，没有检测到与来自
Figure C9510895500256
-缺失的SAD W9病毒感染的细胞的RNA发生杂交。但其它病毒的基因组RNA及SAD B19和SAD L16的GmRNA都能通过这一探针找到，而SADV*GmRNA无反应。相反，一个弱的RNA带表明与新的额外的
Figure C9510895500261
-mRNA大小相一致，这被在SAD V*
Figure C9510895500262
序列的前面一额外的P基因转录起始信号的存在所预测。与天然存在的狂犬病毒相反，转染子病毒SAD V*是一基因组含有六个功能性顺反子的狂犬病毒。
实施例4
重组狂犬病毒中外源蛋白编码基因的表达
用Klenow酶产生平端后，将实施例3所述的含有N/P顺反子交界区、旁侧带有多限制性酶切位点的230bp cDNA片段引入到全长cDNA pSAD L16的假基因区的Bst XI位点上(SAD B19位置4995)。形成的cDNA pSAD V作为引入细菌氯霉素-2酰转移酶(CAT)基因的基础。为了得到pSAD X CAT，将pCM7(Pharma-cia)带有完整的CAT编码区的0.8kb DNA片段克隆到在N/P顺反子交界区假基因序列上游含有的pSAD V的AsuII位点上。为了构建pSAD VCAT，将AsuII位点和靠近假基因序列末端的HindIII位点(SAD B19位置5337)间的cDNA的缺失，并经过Klenow酶产生平末端后用pCMT的编码CAT的Hidn III DNA取代。因此，重组体RV SAD XCAT的转录本应该产生带有假基因序列作为非翻译的3’区的CAT mRNA，而SAD VCAT应该转录成一没有假基因序列的CAT mRNA。
分别如实施例1所述，转染编码RV N，P和L蛋白的质粒和pSAD-XCAT，及pSAD-VCAT，以拯救重组狂犬病毒。除去牛痘病毒后，通过Northern杂交分析重组体RV的转录方式。两种病毒都转录了预期大小和组成的CAT mRNA(图5)。通过标准的CAT分析(Conze-1mann和Schnell，1994，上述)，在两种病毒感染的细胞中，分别测定了CAT酶活性的表达。发现两个都有效地表达了CAT酶活的表达。发现两个都有效地表达了CAT。细胞培养连续转代中，细胞表现出导入的外源序列是遗传稳定的。既使经过40次转代，两种病毒都有效地表达CAT(图6)。为了检测在感染的动物中重组子病毒的表达和行为，又进行了另外的实验。六周成年小鼠(每组五只)分别脑内注射104ffu的SAD VCAT，SADXCAT和标准序列RV SAD L16。注射后七天，所有动物都表现出典型的狂犬病症状，在下一周内死于狂犬病。分别用SAD VCAT和SAD XCAT感染的小鼠脑部都证实有CAT活性。从小鼠脑部和表达CAT的细胞培养中这两种病毒都可以被再分离到。因此，外源基因可以导入到感染性RV的基因组中并被稳定表达，还可用作区分重组子病毒的标记。
实施例5
异种病毒的抗原在重组RV中的表达及诱导对RV和异种病毒的免疫应答
典型的猪热瘟病毒(CSFV)基因组编码三个结构糖蛋白(E0，E1和E2)。CSFV感染的动物，其中和抗体是针对E2的，而E0诱导细胞免疫应答，如实施例4所述，分别用CSFV Alfort株的包含E2和E0蛋白编码区的cDNA替换位于pSADV的AsuII位点和Hind III位点间的假基因区。重组病毒(分别为SAD-VE0和SAD-VE2)如实施例1所述从转染实验中回收。在感染细胞中，病毒分别表达CSFV E0蛋白和CSFV E2蛋白(图7)。
通过口服，用重组病毒SAD VE0和SAD VE2免疫猪。标准的狐饵常用于加入减毒的RV SAD B19株口服免疫狐锂，将狐饵分别加入107pfu的SAD-VE0、SAD-VE2和SAD B19。每种制备物分两份饵喂给每组的两头猪(猪#1和#2：SAD VE0，#3和#4，SAD B19，#5和#6，SAD VE2)。免疫四周后，分析抗RV和CS-FV的中和抗体。除了#5外，所有猪都有RV中和抗体(滴度＞250)，证明摄入了疫苗饵。因此不再考查猪5。猪#6产生滴度＞16的CSFV中和抗体。如同所料，猪#1到4没有产生CSFV中和抗体。免疫后第五周用107pfu的CSFV Alfort株鼻内攻击。攻击后，监测猪的白细胞数和体温，分别示于图8和9中。所有的猪开始发热，但猪#1，和#2还有#6很快恢复。对照动物#4有典型的CSFV症状，死于攻击后的第十五天，对照#3在21天时死亡。喂以SAD VE2的猪产生CSFV中和抗体，及接受SADVE0或SADVE2的猪的部分保护，都证实了通过口服应用，可由重组RV活疫苗诱导对两异种病毒产生体液和细胞免疫应答。
实施例6
通过在G基因序列中引入突变产生减毒RV
为了产生一比标准病毒SAD B19繁殖能力低的病毒构建了具有突变的G蛋白的重组体。
为这一目的，编码G蛋白的最后46个氨基酸的序列被缺失。首先编码G蛋白的质粒pT7T-G(Conzelmann和Schnell，1994，上述)用Afl III(SAD B19序列的位置4752)和EcoRV(后一个位点位于质粒多克隆位点)消化，用Klonow酶产生平端。连接得到的Afl III和EcoEV末端在前Afl III序列处形成一个翻译终止密码子。用带有修饰区的0.3kb DNA PuMI-SmaI片段替代pSAD16真正的PpuMI-BstXI片段4469-4995。这一操作使得编码G蛋白胞质区尾部的羧基端46个氨基酸的SAD B19核苷酸4753～4995和一部分假基因序列缺失。另一结果是将18个来自载体的核苷酸引入到新的G翻译终止子的紧下游。
如实验例1所述，回收重组RV(SAD DCD)。如同所料，用SAD DCD感染的细胞表达了一截短的G蛋白(图10)。与标准序列病毒SAD L16相比，m.o.i为1的SAD DCD病毒感染的细胞所得病毒滴度要低100倍，而且观察到其在细胞培养物中传播速度下降(图11)，表明G蛋白的截短降低了病毒颗粒的装配或细胞感染能力。为了分析SAD DCD在被感染动物中的行为，对5只小鼠脑内注射105ffu的SAD DCD，以同样剂量的SAD L16注射给5只小鼠。
实施例7
通过反式互补产生狂犬病病毒G--突变体
为了使整个G蛋白编码区从RV基因组中缺失，应用了全长克隆pSAD UE(实施例2)。这一克隆因在G基因3’端非翻译区存在一NheI特异酶切位点(SAD B19位置5339)而与pSAD L16相区别。用PflMI对pSAD U2进行部分酶切(SAD位置3176)，用NheI作完全酶切，接着用Klenow酶补齐后再连接，从而除去一包括SAD B193177～5339核苷酸的cDNA片段。形成的克隆pSAD dG用于转染实验以拯救重组病毒。但险了编码N、P和L蛋白的质粒外，编码G蛋白的质粒也与pSAD dG共转染，以互补病毒基因组G缺失。
通过Northern印迹实验分析SAD dG的RNA转录本。用N特异性探针杂交后，发现SAD dG基因组比狂犬病毒wt基因组相当小，表明了2.1kb的cDNA缺失。但包括全部G编码区的探针不能与SAD dG RNA杂交，证明其缺少G编码序列(图12)。通过RT-PCR和测序进一步对缺失进行鉴定。
表型互补的SAD dG能感染非互补的BSR细胞，并复制其基因组，表达基因组编码的基因。但它不能产生感染性病毒颗粒，因此，感染不能传播到其它细胞，或通过培养物上清液的传代传递给其它细胞。
实施例8
异种糖蛋白对G突变体的互补：将病毒定向于特异细胞
为了证明异种表面蛋白可有效地掺入到重组病毒的包膜中，如实施例7中对于狂犬病病毒G所述方法，G-突变SAD dG通过重组病毒糖蛋白互补，产生了含有来自Mokola病毒(狂犬病毒属的另一成员)、棒状病毒料水泡性口炎病毒(VSV；New Jersey血清型，水泡病毒属)及人免疫缺陷逆转录病毒(HIV-I，NL-43株)的刺突蛋白的感染性假病毒颗粒。
Mokla和VSV-G蛋白转染质粒的表达和用SAD dG感染细胞将形成感染性假型病毒。但与狂犬病毒G和密切相关的Mokola病毒G相比，发现VSV-G的滴度下降(104/ml对106/ml)。用狂犬病毒G蛋白的相应区取代VSV-G的胞质区和跨膜区序列后，产生106感染性颗粒，说明RVG的胞质区引导蛋白进入病毒包膜。
没有发现含有HIV gp120(gp120/40)刺突的假型颗粒的产生。相反，通过表达由HIV gp的外膜和跨膜区融合到RV G的胞质区而组成的嵌合蛋白的表达，从而产生RV(HIV)假型。这证实了G蛋白的胞质区与刺突蛋白有效地掺入到棒状病毒的包膜相关。RV(HIV)假型颗粒成功地感染表达人CD4表面蛋白(T4+细胞)的Vero细胞，而不感染表达CD8的对照细胞(T8+细胞)(细胞来自AIDS Research and Reference Reagant Programme)。该假型病毒拥有HIV的宿主范围和细胞特异性。
附图说明：
图1：
狂犬病毒假基因区(
Figure C9510895500311
)的组成及重组的狂犬病毒基因组的构建(按比例绘制)。数字表示SAD B19反基因组序列中核苷酸的位置。上方所示为具有五个开放阅框架的狂犬病毒的全基因组。在含有部分基因组(3823-6668)的pSsiX8中进行突变，并通过StuI片段(4014-6364)的交换重新引入到pSAD L16全序列克隆上。在详图中，灰框表示编码区，黑线表示非编码区。实心竖条(终止和多聚腺苷化)和箭头(mRAN转录起始)表示功能性转录信号序列。代表
Figure C9510895500312
区起始的非功能性信号类似序列用空心竖条表示。箭号表示用来做区RT-PCR分析的寡聚核苷酸引物G3P系L4M的位置。在SAD U2，补平Hind II I的突出端导致了四个核苷酸的插入，从而产生一个独特的NheI位点。在SAD V*中，含有狂犬病毒N/P顺反子边缘(SAD B19核苷酸1323-1502)的cDNA片段被插入到Sty1位点；SAD W9中StyI/Hind III片段缺失。
图2：
含有全长狂犬病毒cDNA的转录质粒构建的简单示意。数字表示SAD B19狂犬病毒反基因组序列的核苷酸的位置(Conzel-mann et al，1990)。质粒pSDI-1+是pSDI-1(Conzelmann和Schnell，1994)的复本，作为重建全长狂犬病毒基因组DNA的基础。pSDI-1中含有SDI-1狂犬病毒微小基因组，后者包括分别与T7RNA聚合酶启动子(T7)和丁型肝炎病毒反基因组核酶序列(HDV)有关的末端核苷酸1-68和相反方向的11760-11928。pSDI-1+的MunI-BglII片段用由所示的三个SAD B19cDNA克隆装配成的1kb cDNA片段代替。从两个cDNA克隆组装成3.6kbSphI和7.2kb AatII片段的插入可产生含全长SAD B19cDNA的最终的质粒pSAD L16。用T7RNA聚合酶转录这个质粒，可得到正链(反基因组的)RNA，其中5’端有三个额外的非病毒G残基，核酶自溶后有一精确的3’末端。T7表示T7启动子；T7T表示T7转录终止子；HDV表示HDV反基因组核酶序列。
图3：转染子病毒SAD U2基因组中遗传标记的显示。用标准的RV SAD B19(B19)和转染子病毒SAD L16(L16)和SAD U2(U2)感染细胞两天后，分离全RNA，用来作RT-PCR以扩增
Figure C9510895500321
区，引物为G3P和L4M。扩增的DNA直接用1％琼脂糖凝胶分离，然后分别用Hind III和NheI酶切。NheI限制性酶切位点只存在于由SAD U2而得到的DNA中。M表示DNA大小标识。图4：SAD B19(B19)，SAD V*(V*)和SAD W9(W9)基因组的PCR分析。RT-PCR在如图3中所描述用G3P和L4M作引物来进行。扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中分离。
图5：重组的RV转录的CAT mRNA的图示
用SAD L16(L16)，SAD XCAT(X6)和SAD VCAT(VC18)感染的细胞中提取的全RNA的Northern印迹，分别用对G基因(G)，假基因(Y)和CAT基因特异的探针杂交。左侧所示为病毒基因组(V)和特定的mRNA。SAD XCAT转录的mRNA中含有CAT和假基因序列(“CAYT”)，而SAD VCAT缺少假基因序列，转录的mRNA(“CAT”)中只含有CAT序列。RNA大小标识单位为kb。
图6：细胞培养多次传代后，SAD XCAT和SAD CVAT的CAT活性。细胞用经过特定传代的病毒感染(传代数如所示)，感染后两天，用等量的细胞抽提物来分析CAT活性。在电泳槽“-”中分析SAD L16感染的细胞抽提物。
图7：重组的RV中E0和E2蛋白的表达
细胞分别用SAD VE0(分离物1，2，3)和SAD VE2(分离物a，b，c)感染。两天后，细胞抽提物在还原条件下用PAA胶分离，然后转到硝酸纤维素膜上。分别和抗CSFV E0和E2蛋白的单克隆抗体一起孵育后，接着再与偶联有碱性磷酸酯酶的第二抗体孵育，加入底物，X射线胶片曝光后，蛋白显现。杆状病毒表达和纯化的E0和E2蛋白用作对照。此外，用CSFV(V)感染的细胞抽提物作为比较。
图8：用SAD VE0(#1和2)，SAD VE2(#6)和标准狂犬病毒SAD B19(#3和#4)免疫并用CSVF攻击后的猪的白细胞，所给出的白细胞的量是攻击前(0天)绝对数字的百分比。*C#1，攻击后10天：没做，估计值。
图9：
CSFV攻击后猪的体温(0天)
a.以SAD VE0免疫的动物(#1和#2)到第11天轻度发热(#1)或无发热(#2)。以SAD B19(#3和#4)免疫的两组照组动物表现长期的高热。#4在攻击后第15天由于症状严重死于典型的猪瘟，#3在攻击后21天死亡。
b.以SAD E2免疫的动物在第6至8天轻度发热。对照同a。
图10
感染SAD DCD的细胞中截短的G蛋白的表达。用SAD DCD或SAD L16以m.o.i.为1感染BSR细胞，并在感染后16小时以50μci的[35S]甲硫氨酸标记3小时。细胞提取物同抗狂犬病毒G单克隆抗体培育，免疫沉淀样品或以PNGaseF(+PF)消化以阐明蛋白骨架；或模拟处理(-)以证明糖基化蛋白。+TM：感染细胞在标记前和标记的三小时间在2μg/ml衣霉素存在下分别温育90分钟。用10％SDS-PAGE分离蛋白质，放射自显影观察。细胞提取物分析同上。L16：SAD L16病毒；ΔCD：SAD DCD突变病毒。M：蛋白大小标识。
图11
SAD L16和SAD DCD在细胞培养中的扩散。分别用SAD L16(L16)和SAD DCD(DCD)以0.05m.o.i感染培养细胞，在感染后指定的时间以抗狂犬病毒N蛋白的偶联物(
Figure C9510895500351
)通过直接免疫荧光进行分析。可以观察到感染SAD DCD的细胞对邻近细胞发生较慢的感染扩散。
图12：
SAD dG(实施例7)和SAD dCD(实施例6)专一性RNA的分析。以1个m.o.i用SAD L16(例1)，SAD dCD(ΔCD)和表型互补的SAD dG病毒(ΔG)感染BSR细胞，两天后分离总RNA并以Northern杂交分析。正如以上N基因特异性探针(A)杂交所显示的，SAD dG的基因组明显小于标准的狂犬病毒基因组(V)，反映出G基因2.1kb的缺
Figure C9510895500352
，包括整个G蛋白编码序列的探针不能和SAD dG RNA杂交。比标准狂犬病毒GmRNA短的GmRNA(G)的生成说明了SAD dCD基因组胞质区编码区小的缺失，V：基因组RNA；N，G：单顺反子mRNA；N+P，M+G，G+L：双顺反mRNA。
图13
G-突变SAD dG的不扩散性
用表型互补的SAD dG感染BSR细胞，感染36小时后用免疫荧光镜检分析。在(A)中，用抗N蛋白FI TC偶联抗体(Cento-core)与细胞孵育后显示N蛋白的表达。只有单个细胞被感染，没发现病毒传播到附近的细胞。(B)：以G特异性抗体作对照。
图14
用以产生RV(HIV)假型病毒颗粒的功能性HIV/RV嵌合糖蛋白的组成。除了紧接跨膜区下游的三个氨基酸外，整个HIV-NL43gp160胞质区被完整的RV-G胞质区所取代。“p”代表脯氨酸残基，它不存在于亲本蛋白质中。胞质区和跨膜区序列用斜线(/)分开。

Claims (13)

1.一种遗传工程产生的感染性复制性不分节段狂犬病毒突变体，其包括在病毒基因组的开放阅读框架、假基因区或非编码区中的插入和/或缺失。
2.根据权利要求1的病毒突变体，其特征为该突变体在假基因区含有插入和/或缺失。
3.根据权利要求1的病毒突变体，其特征为该病毒突变体在开放阅读框架中含有插入和/或缺失。
4.根据权利要求3的病毒突变体，其特征为该病毒突变体在编码基质蛋白的开放阅读框架中含有插入和/或缺失，导致功能性基质蛋白的缺失，所述的突变体与基质蛋白表型互补。
5.根据权利要求3的病毒突变体，其特征为该病毒突变体在编码糖蛋白G的开放阅读框架中含有插入和/或缺失。
6.根据权利要求5的病毒突变体，其特征为插入和/或缺失导致缺少功能性糖蛋白G，所述突变体与糖蛋白G表型互补。
7.根据权利要求1-6之一的病毒突变体，其特征为其携带有编码特定病原体的表位或多肽的异源核酸序列。
8.根据权利要求3的病毒突变体，其特征为该病毒突变体在编码N、P或L蛋白的ORF中含有插入和/或缺失。
9.一种用以预防哺乳动物由不分节段狂犬病毒引起的感染的疫苗，其特征为该疫苗包括权利要求1-8之一的病毒突变体和药学上可接受的载体或稀释剂。
10.感染性复制性不分节段的狂犬病毒的制备方法，其包括以下步骤：
a)向一表达RNA聚合酶的宿主细胞中导入：
1)编码狂犬病毒N，P和L蛋白的DNA分子；及
2)含有不分节段的狂犬病毒基因组的cDNA的DNA分子，其特征为不分节段的狂犬病毒基因组的cDNA包括在开放阅读框架、假基因区或非编码区中的插入和/或缺失，及
b)分离由细胞产生的病毒。
11.根据权利要求10的方法，其特征为不分节段的狂犬病毒cDNA基因组的转录本为正链反基因组RNA。
12.根据权利要求10的方法，其特征为RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。
13.根据权利要求12的方法，其特征为RNA聚合酶是从重组牛痘病毒表达的T7 RNA聚合酶。
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