CN101586120B

CN101586120B - 狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统及LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体

Info

Publication number: CN101586120B
Application number: CN2009100889768A
Authority: CN
Inventors: 步志高; 陶丽红; 葛金英; 王喜军
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2009-07-15
Filing date: 2009-07-15
Publication date: 2011-06-15
Anticipated expiration: 2029-07-15
Also published as: CN101586120A

Abstract

本发明涉及狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株的反向遗传操作系统，其包括编码LEP全长基因组cDNA的重组载体，及其辅助质粒系统，其中所述辅助质粒系统分别编码LEP的核蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L。本发明还涉及由该反向遗传操作系统构建的LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体。更具体地，所述狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统是pCI-LEP及其辅助质粒系统pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L，所述LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体是pCI-LEP-EGFP。本发明还涉及由所述狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统及LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体二者拯救的重组病毒，以及它们的应用。

Description

狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统及LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统，其包括编码LEP全长基因组cDNA的重组载体，及其辅助质粒系统，其中所述辅助质粒系统分别编码LEP的核蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L。本发明还涉及由该反向遗传操作系统构建的LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体。更具体地，所述狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统是pCI-LEP及其辅助质粒系统pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L，所述LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体是pCI-LEP-EGFP。本发明还涉及由所述狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统及LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体二者分别拯救的重组病毒，以及它们的应用。

背景技术

狂犬病即疯狗症，又名恐水症，是由狂犬病病毒RV引起的、侵害中枢神经系统的急性病毒性人兽共患性传染病。几乎所有的温血动物都对狂犬病病毒易感。犬类动物在传播人狂犬病过程中起主要作用，是本病的主要宿主之一。此外，猫、浣熊、狐狸和蝙蝠等也会患病并传播病毒。狂犬病传播途径主要是通过动物咬伤后，唾液中的狂犬病病毒经破损皮肤侵入机体。此外，还可通过消化道、呼吸道以及动物密切接触等途径传播。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病，病死率可高达100％。据世界卫生组织报道，在世界范围内每年约有60,000余人死于狂犬病，引起严重的公共健康问题，主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家。中国也是受狂犬病危害最为严重的国家之一。

狂犬病病毒属于弹状病毒科、狂犬病毒属，为不分节段单股负链RNA病毒，其基因组长约12kb，共编码5个结构蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA聚合酶(L)。

狂犬病的预防主要通过疫苗免疫的方式进行。狂犬病疫苗种类繁多，效果不一。自从1940年，Koprowski等人从病死女孩脑内分离到狂犬病病毒Flury株，经1日龄雏鸡脑内、鸡胚卵黄囊传代后，再经鸡胚传代178代以上，无论神经内、外接种都对动物丧失致病力，但对于新生乳鼠和猴，在脑内接种时仍具有残留毒力^[1]。在鸡胚传代68代以前的称为“LEP”(鸡胚低代株)，高于136代的称为“HEP”(鸡胚高代株)。Flury-LEP株具有优良的免疫原性，被广泛用作人或动物的狂犬病灭活疫苗种毒株，还被包括中国在内的许多国家用作预防犬狂犬病的弱毒疫苗。科研工作者一直不间断地对狂犬病疫苗进行改进和创新，取得了丰硕的成果，但仍然存在很多不足。我国目前生产ERA株和Flury株活疫苗。狂犬病弱毒疫苗在体内的增殖过程与病原感染机体的过程相似，能诱导产生细胞免疫和体液免疫，且产生的免疫反应较强，持续时间较长，在我国狂犬病防制工作中曾起到一定的积极作用。但有的疫苗毒株本身对乳鼠致病，对怀孕动物、免疫机能不全的动物和幼小动物使用不安全，而且存在毒力回升、返祖的潜在危险。因此，存在获得更加安全的减毒活病毒疫苗株的需要。

反向遗传学(Reverse Genetics)是相对于经典遗传学而言的，经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律的(由表及里)，反向遗传学则是直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象(由里及表)，故与之相关的各种技术统称为反向遗传学技术。反向遗传学通过DNA重组等技术有目的地、精确定位地改造改造基因的精细结构以确定这些变化对表型、性状的直接影响。RNA病毒的反向遗传学技术是指由病毒的cDNA克隆获取RNA病毒的一项技术，该技术通过人为加入DNA基因片段，实现了在DNA水平上对RNA病毒基因组的人工操作。反向遗传系统可以对RNA病毒直接进行遗传操作，为RNA病毒的分子生物学研究提供了一种强大的工具。自20世纪70年代后期第一例RNA病毒感染性克隆构建成功以来，RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展，这在很大程度上归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立。

正链RNA病毒全长基因组RNA转染进入真核细胞，可以导致病毒蛋白表达和病毒复制。相比之下，负链RNA病毒基因组RNA的存在并无感染性。启动病毒的转录和复制，除病毒基因组外，同时需要病毒聚合酶复合体的共表达；此外，还要求病毒基因组与核衣壳蛋白结合形成复合体。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system，RGS)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒。

目前，反向遗传操作技术广泛用于研究病毒的生命周期，病毒装配，病毒蛋白在其致病性中的作用以及病毒蛋白与宿主细胞的相互关系，同时也为我们开发弱毒活疫苗和病毒载体开辟了新的捷径^[2]。目前，在国内外尚未有Flury-LEP株反向遗传操作系统的报道。

发明内容

本发明涉及狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统以及由该反向遗传操作系统构建的LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体。更具体地，所述狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统包括pCI-LEP及其辅助质粒系统，其中所述辅助质粒系统分别编码LEP的核蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L，并且优选地，所述LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体是pCI-LEP-EGFP，所述辅助质粒系统包括pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L。本发明还涉及由所述狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统及LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体二者分别拯救的重组病毒，以及它们的应用。在第一方面中，本发明通过将LEP全长基因组cDNA(SEQID NO：1)克隆至携带CMV启动子的质粒中，并且构建LEP的辅助质粒系统，从而构建了狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统，并在此基础上成功构建了表达绿色荧光蛋白重组病毒载体。所述LEP的辅助质粒系统包括pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L，其分别编码LEP的核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)。

具体而言，所述携带CMV启动子的质粒包括，但不限于，pCI和pCAGG等。利用携带CMV启动子的质粒的优点在于，携带CMV启动子的质粒利用细胞内的RNA聚合酶II进行转录，而无需传统的T7聚合酶系统，因此理论上可以在任何真核细胞系中拯救病毒。

在一个优选实施方案中，所述狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统是pCI-LEP及其辅助质粒系统，其中pCI-LEP通过将LEP全长基因组cDNA克隆至pCI质粒中而构建，并且所述辅助质粒系统是pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L。所述表达绿色荧光蛋白重组病毒载体是pCI-LEP-EGFP，其通过将编码绿色荧光蛋白EGFP的核苷酸克隆至上述pCI-LEP中而构建。

在第二方面中，利用本发明第一方面的狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统，从Flury-LEP疫苗株基因组cDNA克隆成功获得拯救病毒株rLEP，并且利用上述表达绿色荧光蛋白的LEP重组病毒载体和辅助质粒系统，成功拯救了表达外源绿色荧光蛋白EGFP的感染性重组病毒株rLEP-EGFP。

在第三方面中，本发明鉴定了拯救的Flury-LEP(rLEP)的生物学特性。本发明人检测了野生型LEP(wtLEP)和在第二方面中拯救的重组LEP(rLEP)在神经元细胞NA和非神经元细胞BHK-21上的生长动力学曲线，如图5所示，rLEP在两种细胞上的的生长性能与wtLEP没有显著差异，这表明从LEP基因组全长cDNA拯救的rLEP的生长特性与wtLEP是一致的。此外，本发明人还检测了wtLEP和rLEP的嗜神经指数，结果显示在表4中，wtLEP和rLEP的嗜神经指数均为0.8，没有差异。最后，本发明人还检测了wtLEP和rLEP对小鼠的致病性，测定了wtLEP和rLEP的LD₅₀，分别为8.8个FFU和2个FFU。结果表明，rLEP与wtLEP对小鼠的致病性没有显著差异。通过以上几项关于rLEP和wtLEP的生物学特性的测定，可见以LEP基因组全长cDNA克隆获救的rLEP与野生毒株wtLEP在生物学特性上并无显著差异。这表明，重组狂犬病病毒株rLEP具有作为预防狂犬病的活载体疫苗应用的潜力。因此，本发明第一方面构建的狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统和表达绿色荧光蛋白重组病毒载体可以作为在分子水平研究、构建和改造狂犬病病毒疫苗的有效平台。

在第四方面中，本发明提供第一方面所述的狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统和表达绿色荧光蛋白重组病毒载体的应用。利用本发明的反向遗传操作系统，可对Flury-LEP株基因组毒力相关位点进行定点突变修饰，获得更加安全的减毒活毒疫苗株，研究不同毒力毒株的分子致病机理。另外，表达EGFP的重组Flury-LEP的成功构建还表明所述狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统还是一个很好的表达外源蛋白的载体，既可在病毒基因组插入导致病毒减毒和增强免疫反应的外源基因，也可插入额外的G基因以增强免疫原性，或者是从基因组中删除某个完整的病毒基因，使病毒无法繁殖而失去毒力。因此，狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统还可以用于构建表达犬瘟热等其它重要病原保护性免疫原的重组病毒，研制出可同时预防狂犬病及犬瘟热等其它疫病的重组二联活载体疫苗。所述表达绿色荧光蛋白重组病毒载体也是构建表达其它外源蛋白的重组病毒载体的基础，由其拯救的表达EGFP的LEP重组病毒rLEP-EGFP可以用于直接观察病毒的增殖状态，分析LEP病毒的扩散和致病性，等等。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1显示狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株全长基因组cDNA的重组载体pCI-LEP的构建示意图；

图2显示从亚基因组cDNA片段构建rLEP-EGFP cDNA的策略。(a).通过PCR在LEP基因组4906位后定点突变，引入PmeI位点，(b).经PCR在EGFP基因5′端引入PmeI位点、GE、GS，在3′端引入PmeI位点，EGFP基因经PmeI位点插入pCI-LEP的G和L之间的基因间隔区；

图3是感染拯救病毒rLEP的NA细胞的间接免疫荧光照片。(a)感染拯救病毒rLEP的NA细胞的间接免疫荧光分析照片；(b)以阴性血清为一抗观察IFA结果；

图4显示rLEP-EGFP感染BHK-21细胞48小时后荧光显微镜观察显示出自发荧光。(a)rLEP-EGFP感染BHK-21细胞48小时后荧光显微镜观察的自发荧光，(b)空白BHK-21细胞荧光显微镜下观察结果；

图5显示野生型LEP(wtLEP)和拯救的rLEP病毒在NA细胞(a)和BHK-21细胞(b)上的生长动力学曲线；

图6显示质粒pCAGG(a)和pCI系列载体(b)的图谱。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

实施例1狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统及其表达绿色荧光蛋白的重组病毒载体的构建和生物学活性

1材料

1.1质粒、细胞株和病毒

质粒pCAGG、pCI-RBz购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，pBluescriptII SK(+)购自clonetech。BHK-21细胞(ATCC CCl-10)和293T细胞(CRL-11268)购自ATCC，培养基均为含10％胎牛血清的DMEM，小鼠脑神经瘤细胞NA细胞购自军事医学科学院军事兽医研究所，培养基为含10％胎牛血清的MEM，狂犬病病毒Flury-LEP购自中国兽医药品监察所，在BHK-21细胞上扩增，-70℃冻存备用。

1.2主要试剂和仪器

T4DNA连接酶，限制性内切酶Nhe I，Sph I，Mlu I，EcoR I，Kpn I等均购自大连TaKaRa公司。Phusion^TM超保真DNA聚合酶，限制性内切酶RsrII购自NEB公司。RNA提取试剂Trizol，SuperScript^TMIII反转录试剂盒，无血清培养基Opti-MEM，转染试剂Lipofectamine^TM 2000均购自Invitrogen公司。犊牛血清购自Gibco公司。LB培养基成分均购自OXOID公司。胶回收试剂盒(Gel Extraction Mini Kit)及质粒小量提取试剂盒(Plasmid Mini Kit)均购自OMEGA公司。质粒中量提取试剂盒QIAfilter Plasmid Midi Kit购自QIAGEN公司。鼠抗狂犬病病毒高免血清由本研究室按本领域常规方法制备。FITC标记的羊抗鼠荧光二抗购自Sigma公司。普通显微镜，购自OLYMPUS公司；荧光显微镜，购自ZEISS公司。PCR仪购自AppliedBiosystem公司。核酸测序采用BECKMAN CEQ 8000自动测序仪，所用试剂为BECKMAN公司产品。P2级生物安全柜购LABCONCO自公司。二氧化碳培养箱购自Thermo Electron公司。不同型号离心机均购自BECKMAN公司。-70℃超低温冰箱购自NBS公司。普通冰箱冰柜购自海尔公司。全自动净水机MILI-Q购自BIOCEL公司。各种规格细胞培养瓶及细胞培养板均购自CORNING公司。

1.3引物

参照Gene Bank中所提供的Flury-HEP株基因组序列(Gene Bank序列号AB085828)和Flury-LEP序列(Gene Bank序列号DQ099524)，将Flury-LEP全长基因组cDNA序列(SEQ ID NO：1)分为3段，即，F1，F2和F3，分别设计PCR引物。其中，片段F1为Flury-LEP全长基因组cDNA序列的1-4063核苷酸序列(SEQ ID NO：2)，片段F2为Flury-LEP全长基因组cDNA序列的4013-8254核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，片段F3为Flury-LEP全长基因组cDNA序列的8187-11925核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。构建上述全长基因组cDNA所用引物(表1)和构建辅助质粒所用引物(表2)均由上海英俊生物技术有限公司合成。

表1RT-PCR和全长基因组cDNA构建所用的引物

注：cDNA片断与图1相一致。下划线部分为病毒特异序列，黑体表示酶切位点，锤头状核酶(HamRz)和丁肝病毒核酶(HdvRz)用斜体表示。

表2辅助质粒构建所用的引物

注：下划线部分为病毒特异序列，黑体表示酶切位点，突变碱基用字符边框表示，Kozak序列用斜体表示。

1.4病毒基因组的提取、反转录和PCR

取Flury-LEP病毒液250μL，加入750μL Trizol，经常规方法提取基因组RNA。提取的RNA用SuperScript^TMIII反转录试剂盒进行反转录反应(反转录引物见表1)，按该试剂盒说明书方法进行，获得末端部分重叠的3个病毒cDNA片段F1、F2和F3片段。

1.5RT-PCR产物的克隆

以1.4中获得的末端部分重叠的3个病毒cDNA片段F1、F2和F3片段为模板，将整个基因组分为末端部分重叠的3个片断进行RT-PCR扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，以胶回收试剂盒(购自OMEGA公司)回收F1、F2和F3片段，分别克隆至pBluscript II KS(+/-)(Clontech)多克隆位点，转化感受态细胞DH5α，提取阳性质粒，测序确保克隆的基因组片段与病毒基因组RNA序列完全一致。

1.6Flury-LEP基因组全长cDNA克隆的构建

利用基因组cDNA片段F1、F2和F3相邻重叠部分存在的限制酶切位点进行连接组装(示意图见图1)。

具体地，参见图1，首先将F3段cDNA经Nhe I和Rsr II位点克隆进pCI-RBz(pCI质粒图谱见图6b)，所得质粒命名为pCI-F3，再将F1段经NheI和Mlu I插入到pCI-F3，所得质粒命名为pCI-F31，最后将F2段经Sph I和MluI克隆进pCI-F31，至此Flury-LEP全基因组cDNA组装完成，构建成的病毒基因组转录质粒命名为pCI-LEP。

该克隆在CMV启动子之下、两个核酶之间的全长cDNA可以在真核细胞RNA聚合酶的作用下得到转录，并且由于核酶的自身催化功能，可以保证转录产物的3′末端与病毒基因组精确一致。

1.7表达EGFP重组基因组全长cDNA克隆的构建

为了救获表达EGFP基因的重组LEP病毒，在病毒基因组转录质粒pCI-LEP的基础上，利用两对引物F2-PF和Pme I-PR，F2-PR和Pme I-PF，通过PCR方法在LEP cDNA第4906nt后引入Pme I限制性酶切位点(GTTTAAAC)。获得的两个PCR片段通过Pme I连接成一个完整的片段，并利用该片段两端的酶切位点(同F2段)替换pCI-LEP上的F2段，从而构建成重组基因组转录载体pCI-LEP-Pme I(见图2a)；再以pIRES-EGFP(Clonetech)为模板，以EGFP-PF和EGFP-PR为引物，通过PCR，在EGFP的ORF的5′端引入Pme I限制酶识别序列和LEP自身聚合酶L识别的转录终止序列GE(AGAAAAAAA)及转录起始序列GS(AACATCCCT)，在EGFP的ORF的3′端引入Pme I酶切位点识别序列；PCR产物经Pme I酶切插入pCI-LEP-Pme I，构建的表达EGFP重组基因组全长cDNA克隆命名为pCI-LEP-EGFP(见图2b)。

表3用于构建表达EGFP基因的重组LEP基因组全长cDNA的PCR引物

注：下划线部分为EGFP基因特异序列，黑体表示酶切位点，Kozak序列用斜体表示，基因起始信号和基因结束信号用字符边框表示。

1.8辅助质粒系统的构建

以已成功构建的pCI-LEP为模板，PCR扩增编码核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框架(ORF)cDNA(核苷酸序列分别为SEQ ID NOs：5-7，引物序列见表2)，分别克隆在pCAGG质粒的多克隆位点(MCS)(pCAGG质粒图谱见图6a)。在起始密码子前引入Kozak序列(GCCACC)，以增强蛋白表达^[3、4]；在原有终止密码子后增加一个终止密码子，以有效终止辅助质粒mRNA的转录。构建成的辅助质粒分别命名为pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L。

1.9病毒拯救：由LEP病毒基因组转录质粒pCI-LEP拯救LEP病毒

转染前一天，将293T细胞传到35mm 6孔板上，在10％DMEM培养基中37℃下培养，当细胞密度达到80％以上时即可进行转染。将上述已构建成功的pCI-LEP、pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L分别以4μg、2μg、1μg、1μg的量加入到250μl无血清培养基OPTI-MEM中，混匀；取15μlLipofectamine^TM 2000溶于250μl OPTI-MEM中，混匀后在室温静置5分钟；然后将Lipofectamine^TM 2000与转染质粒混合均匀，室温孵育30分钟。在此期间用OPTI-MEM洗涤293T细胞两次，然后每孔加入OPTI-MEM 1ml，最后将Lipofectamine^TM 2000-质粒混合液500μl加入细胞培养孔中，置于37℃CO₂培养箱中培养8小时后，吸弃转染液，加入10％DMEM继续培养。72小时后，仔细吹落培养板上的细胞，将培养液及细胞混合物全部接种BHK-21细胞。72小时后，在BHK-21细胞上用间接免疫荧光(IFA)检测病毒滴度，简言之，即以鼠抗狂犬病病毒高免血清为一抗，相同倍数稀释的小鼠阴性血清为对照，荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(Sigma)为二抗，最后用荧光显微镜观察结果。收获上清液，获救病毒株，获救的病毒株命名为rLEP株。

1.10重组病毒的拯救：由pCI-LEP-EGFP拯救rLEP-EGFP重组病毒

将pCI-LEP-EGFP与三个辅助质粒pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L按上述1.9的方法共转染293T细胞。72小时后，仔细吹落培养板上的细胞，将培养液及细胞混合物全部接种BHK-21细胞，48小时后用荧光显微镜观察EGFP在感染细胞的表达情况。阴性对照为荧光显微镜下直接观察空白BHK-21细胞。收获上清液，获救重组病毒株，获救的重组病毒株命名为rLEP-EGFP株。

1.11种毒的制备及滴定

将获救的病毒在BHK-21细胞上进行扩增，在5％DMEM培养基中，37℃培养72小时，收获上清，制备种毒，存于-70℃。在NA细胞或BHK-21细胞上培养48小时后，以IFA(步骤同1.9)确定病毒滴度。病毒滴度用病灶形成单位(focus forming unit)FFU表示。

1.12病毒生长动力学曲线的测定

为测定病毒生长动力学曲线，以M.O.I.为0.01分别感染单层NA细胞和BHK-21细胞。感作1小时后，用无菌PBS洗2次后，分别加含0.2％FBS的MEM 2ml和2％DMEM 2ml于37℃培养。分别于接种后24小时、72小时和120小时取细胞培养液上清，在NA细胞和BHK-21细胞上测定滴度，绘制病毒生长动力学曲线。

1.13小鼠半数致死量(LD₅₀)的测定

将rLEP和野生病毒wtLEP用灭菌PBS作10倍倍比稀释至10^-7，将10^-4～10^-7的各稀释度分别取30μl，分别脑内接种5只5～6周龄的Balb/c雌性小鼠。连续观察21天，记录每组小鼠的平均体重变化和死亡情况。利用Reed-Muench法计算小鼠半数致死量(LD₅₀)^[5]。

2.结果

2.1Flury-LEP株基因组全长cDNA的构建

为建立Flury-LEP株的反向遗传操作系统，必须首先构建相应基因组的全长cDNA克隆，作为基因组负链RNA转录模板，为此构建了覆盖整个基因组的三个cDNA克隆片段，利用各个片断间重叠部分的酶切位点，在转录载体质粒pCI上连接组装获得了11925nt的完整cDNA克隆，且cDNA片断两端加具有自我催化功能的锤头状核酶和丁肝核酶。构建完成的质粒命名为pCI-LEP。

2.2辅助质粒的构建

核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)组合形成的核糖核蛋白复合物(RNP)是启动病毒复制必不可少的。将N、P和L基因克隆于pCAGG的MCS，使之在真核启动子CMV的作用下转录mRNA，三种必需蛋白得到瞬时表达，从而启动病毒RNA的复制和转录。

2.3从全长cDNA克隆拯救病毒

将质粒pCI-LEP及表达RV N、P、L蛋白的辅助质粒共转染293T细胞。3天后收获细胞及上清，盲传一代后IFA检测是否成功拯救出病毒，结果以RV高免血清为一抗的细胞孔内观察到荧光信号(图3a)，以小鼠阴性血清为一抗的细胞孔内观察不到荧光信号(图3b)。结果表明，通过反向遗传技术，利用Flury-LEP疫苗株基因组cDNA克隆成功获得拯救病毒株rLEP。

2.4从全长cDNA克隆拯救重组病毒

为了评估Flury-LEP疫苗株作为载体表达外源基因的可行性，将pCI-LEP-EGFP与三个辅助质粒pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L共转染293T细胞。用拯救的重组病毒感染BHK-21，48小时后荧光显微镜下可观察到自发绿色荧光(图4)。结果表明，运用反向遗传操作技术成功地拯救了表达外源基因EGFP的感染性重组病毒株rLEP-EGFP。

2.5拯救的Flury-LEP(rLEP)生物学特性的鉴定

2.5.1动力学曲线

野生型LEP(wtLEP)和拯救的LEP(rLEP)在神经元细胞NA和非神经元细胞BHK-21上的生长动力学曲线如图5所示，rLEP在两种细胞上的的生长性能与wtLEP没有显著差异，这表明从基因组全长cDNA拯救出来的rLEP的生长特性与wtLEP是一致的。

2.5.2嗜神经指数

狂犬病病毒的体外嗜神经指数是指病毒在NA细胞相对于BHK-21细胞上的感染性比例，嗜神经指数为1即表示病毒在神经表元细胞上感染的能力比在非神经细胞上的高10倍^[6]。表4可见wtLEP和rLEP的嗜神经指数均为0.8，没有差异。

表4wtLEP和rLEP的体外嗜神经性

a同一种毒在NA细胞和BHK-21细胞上的滴度

b体外嗜神经指数＝log(NA上的滴度)-log(BHK-21上的滴度)

2.5.3对小鼠的致病性

为了确定wtLEP和rLEP对小鼠的致病性，每只小鼠脑内接种病毒10⁵FFU/30μl。感染wtLEP和rLEP的小鼠表现出麻痹、兴奋、体重减轻等中枢神经系统疾病的临床症状，所有的老鼠在11天内全部死亡。此外，我们测定了wtLEP和rLEP的LD₅₀，分别为8.8个FFU和2个FFU。结果表明，rLEP与wtLEP对小鼠的致病性没有显著差异。

通过以上几项rLEP和wtLEP的生物学特性的测定，可见以基因组全长cDNA克隆获救的rLEP与野生毒株wtLEP在生物学特性上并无显著差异。

3.讨论

自1994年Conzelmann等^[7]第一次从基因组cDNA拯救了狂犬病病毒，至今已成功拯救出的狂犬病病毒株SAD B19、Flury-HEP^[8]、RC-HL^[9]、SHBRV-18^[10]、Nishigahaga^[11]、Ni-CE^[12]。本研究首次构建了弱毒疫苗株Flury-LEP的完整基因组cDNA克隆及其辅助质粒系统，并且成功拯救出子代病毒。该反向遗传系统利用胞内RNA聚合酶II，而无需传统的T7聚合酶系统，因此，理论上可以在任何真核细胞系中拯救出病毒。我们在BHK-21细胞、293T细胞上都成功拯救出病毒，但是拯救效率不一。因为在病毒拯救过程与质粒的转染效率、CMV启动子的活性、核酶的剪切活性、转录的速度和比例、病毒mRNA和基因组RNA的复制、病毒蛋白的翻译、组装和病毒粒子的出芽等都息息相关，与转染细胞的状态也有很大的关系。因此，要提高病毒的拯救效率还需要注意到更多的细节，如全长基因组cDNA质粒和辅助质粒的比例、转染细胞状态等。

研究通过反向遗传技术拯救的Flury-LEP弱毒疫苗株的生物学特性包括在神经细胞NA细胞和非神经细胞BHK-21细胞上的生长动力学曲线、嗜神经指数以及对小鼠的致病性与亲本株Flury-LEP十分相似。这表明，重组狂犬病病毒rLEP具有作为预防狂犬病的活载体疫苗应用的潜力。因此，本发明构建的狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统和表达绿色荧光蛋白重组病毒载体可以作为在分子水平研究、构建和改造狂犬病病毒疫苗的有效平台。

许多研究表明，狂犬病毒糖蛋白是主要的致病因子，第333位上的精氨酸(R)或赖氨酸(K)病毒的毒力有很大的决定作用^{[13、14、15]}。利用反向遗传技术或通过单抗筛选发现，将该位点精氨酸(R)或赖氨酸(K)替换为谷氨酰胺、丝氨酸或谷氨酸时病毒毒力显著下降。Takayama-Ito等将Flury-HEP的G蛋白第333位谷氨酰胺突变为精氨酸R后，小鼠脑内接种致死。Flury-LEP在传代过程中已高度致弱，但是G蛋白第333位仍为精氨酸(R)，且小鼠脑内接种能感染致死。将Flury-LEP的G333突变为其它氨基酸，其毒力是否会降低，能降低多少，抑或有其他相关致病位点这些问题都还尚未解答。

此外，狂犬病病毒还是一个很好的表达外源蛋白的载体^[16]，既可在病毒基因组插入导致病毒减毒和增强免疫反应的外源基因，也可插入额外的G基因以增强免疫原性，或者是从基因组中删除某个完整的病毒基因，使病毒无法繁殖而失去毒力。同时，本发明构建的狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统也为构建表达犬瘟热等其它重要病原保护性免疫原的重组病毒，研制出可同时预防狂犬病及犬瘟热等其它疫病的重组二联活载体疫苗奠定了基础。Flury-LEP弱毒疫苗株反向遗传系统的建立和表达EGFP的重组Flury-LEP的成功拯救为在分子水平研究狂犬病病毒的致病性提供了一个平台，同时也为开发高效、安全的狂犬疫苗提供了基础。另外，所述表达绿色荧光蛋白重组病毒载体也是构建表达其它外源蛋白的重组病毒载体的基础，由其拯救的表达EGFP的LEP重组病毒rLEP-EGFP可以用于直接观察病毒的增殖状态，分析LEP病毒的扩散和致病性，等等。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

参考文献

[1]Koprowski H，Black J，Nelsen DJ.Studies on chick-embryo-adapted-rabiesvirus.VI.Further changes in pathogenic properties following prolongedcultivation in the developing chick embryo.J Immunol，1954，72(1)：94-106.

[2]Neumann G，Whitt MA，Kawaoka YA decade after the generation of anegative-sense RNA virus from cloned cDNA-what have we learned？J GenVirol，2002，83(Pt 11)：2635-62.

[3]Kozak M.At least six nucleotides preceding the AUG initiator codonenhance translation in mammalian cells.J Mol Biol，1987，196(4)：947-50.

[4]Kretzschmar E，Buonocore L，Schnell MJ，et al.High-efficiencyincorporation of functional influenza virus glycoproteins into recombinantvesicular stomatitis viruses.J Virol，1997，71(8)：5982-9.

[5]Reed，LJ，Muench，H.A simple method of estimating fifty percent endpoints.Am.J.Hyg，1938，27：493-497.

[6]Morimoto K，Hooper DC，Carbaugh H，et al.Rabies virus quasispecies：implications for pathogenesis.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(6)：3152-6.

[7]Schnell MJ，Mebatsion T，Conzelmann KK.Infectious rabies viruses fromcloned cDNA.EMBO J，1994，13(18)：4195-203.

[8]Inoue K，Shoji Y，Kurane I，et al.An improved method for recoveringrabies virus from cloned cDNA.J Virol Methods，2003，107(2)：229-36.

[9]Ito N，Takayama M，Yamada K，et al.Rescue of rabies virus from clonedcDNA and identification of the pathogenicity-related gene：glycoprotein geneis associated with virulence for adult mice.J Virol，2001，75(19)：9121-8.

[10]Faber M，Pulmanausahakul R，Nagao K，et al.Identification of viralgenomic elements responsible for rabies virus neuroinvasiveness.Proc NatlAcad Sci USA.2004，101(46)：16328-32.

[11]Yamada K，Ito N，Takayama-Ito M，et al.Multigenic relation to theattenuation of rabies virus.Microbiol Immunol，2006，50(1)：25-32.

[12]Shimizu K，Ito N，Mita T，et al.Involvement of nucleoprotein，phosphoprotein，and matrix protein genes of rabies virus in virulence for adultmice.Virus Res，2007，123(2)：154-60.

[13]Dietzschold B，Wunner WH，Wiktor TJ，et al.Characterization of anantigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity ofrabies virus.Proc Natl Acad Sci USA，1983，80(1)：70-4.

[14]Tuffereau C，Leblois H，Bénéjean J，et al.Arginine or lysine in position333 of ERA and CVS glycoprotein is necessary for rabies virulence in adultmice.Virology.1989，172(1)：206-12.

[15]Takayama-Ito M，Inoue K，Shoji Y，et al.A highly attenuated rabies virusHEP-Flury strain reverts to virulent by single amino acid substitution toarginine at position 333 in glycoprotein.Virus Res，2006，119(2)：208-15.

[16]Mebatsion T，Schnell MJ，Cox JH，et al.Highly stable expression of aforeign gene from rabies virus vectors.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(14)：7310-4.

SEQUENCE LISTING

<110>哈尔滨兽医研究所

<120>狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统及LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体

<130>IB091967

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>11925

<212>DNA

<213>狂犬病病毒Flury-LEP

<400>1

acgcttaaca acaaaaccaa agaagaagca gacagcgtca gttgcaaagc aaaaatgtaa 60

cacccctaca atggatgccg acaagattgt gttcaaagtc aataatcagg tggtctcttt 120

gaagcccgag attatcgtgg atcaatatga gtacaagtac cctgctatca aagatttgaa 180

aaagccttgt ataaccctag ggaaagcccc cgatttaaac aaagcttaca aatcagtttt 240

atcaggcatg aatgccgcca aacttgatcc tgatgatgta tgctcctact tggcagcagc 300

aatgcagttc tttgagggga catgtccgga agactggacc agctatggaa tcctgattgc 360

acgaaaagga gacaagatca ccccagactc tctagtggag ataaagcgta ctgatgtaga 420

agggaattgg gctctgacag gaggcatgga actgacaagg gaccccactg tctccgaaca 480

tgcatcttta gtcggtcttc tcctgagtct gtacagattg agcaaaatat caggacaaaa 540

cactggtaac tataagacaa acattgcgga tagaatagag cagattttcg agacagcccc 600

ttttgttaag atcgtggaac accataccct gatgacaact cacaagatgt gtgctaattg 660

gagtactata ccgaacttca gatttttggc cggaacctac gacatgtttt tctcacggat 720

cgagcatctg tattcggcaa tcagagtggg cacagttgtc accgcttatg aagactgctc 780

aggactggta tcgtttacag ggttcataaa gcagatcaat ctcaccgcaa gagaagcaat 840

actatatttc ttccacaaga actttgaaga agagataagg agaatgtttg agccagggca 900

agagacagct gttcctcact cttatttcat tcacttccgt tcactaggct tgagtgggaa 960

gtctccttat tcatcaaatg ccgtcggtca tgtgttcaat ctcattcact ttgttggatg 1020

ctatatgggt caagtcagat ctctaaatgc aacggttatt gctgcatgtg cccctcatga 1080

gatgtctgtt ctagggggct atttgggaga ggagttcttc ggaaaaggga catttgaaag 1140

aaggttcttc agagacgaga aagaacttca agaatatgag gcggctgaac tgacaaagac 1200

cgacgtggca ctggcagatg acggaaccgt caactccgat gacgaggact acttctccgg 1260

tgaaaccaga agtccagaag ctgtctatac tcgaatcatg atgaatggag gtcgactgaa 1320

gagatcacat atacggagat atgtctcagt cagttccaat catcaagccc gtccaaactc 1380

attcgccgaa tttttaaaca aaacgtattc gagtgactca taaggagttg aatgacaggg 1440

tgccagaaat ccatagattg tgtatatcca tcatgaaaaa aactaacact cctcctttcg 1500

aaccatccca agtatgagca agatctttgt taatccgagt gcaatcagag ccggtctggc 1560

cgatcttgag atggccgaag agactgttga tctgatcaac agaaacatag aagacaatca 1620

ggctcatctc cagggagaac ccatagaagt ggacaatctc cctgaggaca tgaggcaatt 1680

tcacctgggc gatgaaaaat tgtccaacct tggtgagatg gttagggtgg gcgaaggcaa 1740

gtatcgagag gactttcaga tggatgaggg agaggacccc aacctcctgt tccaatcgta 1800

cctggacaat gttggagtcc aaatagtcag acaaatgagg tcaggagaga gattcctcaa 1860

gatatggtca cagaccgtag aggaaattat atcctatgtc acggtcaact ttcctaaccc 1920

tccaggaagg tcttcggagg ataaatcaac ccaaactact ggccgggagc tcaagaagga 1980

gacaacatcc actctttctc agagagaaag ccaaccttca aaagccggaa tggtggctca 2040

agttgcctct ggccctccat cccttgaatg gtctgccacc aatgaagagg atgatctatc 2100

agtagaggct gagatcgctc atcagattgc tgaaagcttt tccaagaagt acaagtttcc 2160

ctctcgatct tcaggaatat tcttgtataa ttttgagcaa ctggagatga accttgatga 2220

catagttaaa gaggcaaaaa atgtaccggg cgtgacccgt ctggcccatg atggatccaa 2280

aatcccccta agatgtgtac tgggatgggt cgctttggcc aactccaaga aattccaatt 2340

gatagtcgag gccgacaagc taagcaaaat catgcaagat gacttggatc gctacacatc 2400

atgctaaccg agtcttcgaa ttcattccct ctagataatg aaaactgaga tgtcatggag 2460

tcgacatgaa aaaaacaggc aacaccacta ataaaatgaa ctttctatgt aagatagtga 2520

aaaactgtag ggatgaggac acccaaaagc cctctcctgt gtcagcccct ccggatggcg 2580

atgacctgtg gcttccacct ccagaatatg tcccgctgaa agaactcaca agcaagaaga 2640

acatgaggaa cttttgtatc aacggggagg ttaaagtgtg tagcccgaac ggttactcat 2700

tcaggatcct gcggcatatt ctgagatcat tcgacgagat atactctggg aatcatagga 2760

tgattgggtt agtcaaagtt gttattggac tagctttatc aggagctcca gttcctgagg 2820

gcatgaactg ggtatacaaa ttgaggagaa cccttatttt ccagtgggct gattccaggg 2880

gccctcttga aggggaggag ttggaacact ctcaagagat cacttgggac gatgatactg 2940

aattcgtcgg attgcaaatg agagtgagcg caagacaatg tcatattcaa ggcaggatct 3000

ggtgtatcaa catgaactcg agggcatgtc aactatggtc tgacatgtct cttcagacac 3060

aaaggtctga agaggacaaa gactcttctc tgcttctaga ataatcagat tatatcccgc 3120

aagtttatca cttgtttacc tctggaggag agaacatacg ggcttaactc caatccttgg 3180

gagcaataga acaaaaaaac acgccatggt gccattaaac cgctgcattt tatcaaagtc 3240

aagttaatta cctttacatt ttgagcctct tggatgtgaa aaaaactatt aacatccctc 3300

aaaagactta aggaaagatg gttcctcagg ttcttttgtt tgtacccctc ctgggttttt 3360

cattgtgttt cgggaagttc cccatttaca cgataccaga caaacttggt ccctggagcc 3420

ctattgacat acaccatctc agctgtccaa ataacctggt tgtggaggac gaaggatgta 3480

ccaacctgtc cgagttctct tacatggaac ttaaagtggg atacatctca gccataaaag 3540

tgaacgggtt cacttgcaca ggtgttgtga cagaggcaga aacctacacc aactttgttg 3600

gttatgtcac aaccacattc aagagaaagc atttccgccc caccccagac gcatgtagag 3660

ccgcgtataa ctggaagatg gccggtgacc ccagatatga agagtctcta cacaatccgt 3720

accccgacta ccattggctt cgaactgtaa aaaccaccaa agagtctctc gttatcatat 3780

ccccaagtgt gacagatttg gacccatatg acaaatccct tcactcaagg gtcttccctg 3840

gcggaaattg ctcaggaata acggtgtcct cgacctactg ctcaactaat catgattaca 3900

ccatttggat gcctgagaat ctgagactag ggacatcttg tgacattttt accaatagca 3960

gagggaagag ggcatccaaa ggaggcaaga cttgcggctt tgtggatgaa agaggcctgt 4020

ataagtctct aaagggagca tgcaaactca agttatgtgg agttctcgga cttagactta 4080

tggatggaac atgggtcgcg atgcaaacat cagatgagac caaatggtgc cctccaggtc 4140

agttggtgaa tttgcacgac tttcgctcag acgagattga gcatctcgtt gtggaagagt 4200

tagtcaagaa aagagaggag tgtctggatg cactagagtc catcatgacc accaagtcag 4260

tgagtttcag acgtctcagt cacttgagaa aacttgtccc tgggtttgga aaagcatata 4320

ccatattcaa caaaaccttg atggaggctg atgctcacta caagtctgtc cggacctgga 4380

atgagatcat cccctcaaaa gggtgtttga gagttggggg gaggtgtcat ccccatgtga 4440

acggggtgtt tttcaatggt ataatattag ggtctgacgg ccatgttcta atcccagaga 4500

tgcagtcatc cctcctccag caacatatgg agttgttgga atcttcagtt atccccctga 4560

tgcacccctt ggcagaccct tctacagttt tcaaagacgg tgatgaggtt gaggattttg 4620

ttgaagttca cctccccgat gtgcatgaac aggtctcagg agttgaactg ggtctcccga 4680

actgggggaa gtatgtattg atgattgcag gggccttgat tgccctgatg ttgataattt 4740

tcctgatgac atgttgcaga agagtcaatc gaccagaatc tacgcaaagc agtcttggag 4800

agacagggag aaatgtgtca gtcacttccc aaagcggaaa agtcatatct tcatgggagt 4860

catataagag tggaggcgag accagactgt gaaggccggt catccttttg acacttcaag 4920

tcccgaggat aacctcctct cggggttggg gggaatcttg ggatccagta gtcctccttg 4980

aactccatcc aacagggtag atttaagagt catgagactt tcattaatca tctcagttga 5040

tcagacatgg tcgtgtagat tctcataaca cgggagatct tctagcagtt tcagtgacca 5100

acggtgcttt cattctccag gaactgatac caaaggttgt ggacaagcca aggggtgctt 5160

cggattactc tgtgcttggg cacagaaaga ggtcgtagtt tgccccttga tagcagattc 5220

aacatgaatt aactaagaaa ggcgatctgc ctcccatgaa ggacataagc aatagttcac 5280

aatcatcttg catctcagtg aagtgtacat aactataaag ggctgggtca tctaagcatt 5340

tcagtcgaga aaaaaactgt agaccaaaag aacaactaac aacacttctc atcccgagac 5400

ccatatcaag atgctggatc cgggagaggt ttatgatgac cctattgatc caattgagtc 5460

agaggctgaa cccagaggaa cccccactgt ccccaacatc ttgaggaact ctgactacaa 5520

tctcaactct cctttgatag aggactctgc caaactaatg ttagaatggt tgaaaacagg 5580

gaacagacct tatcggatga ctttgacaga caattgctcc aggtcttaca aagttttgaa 5640

agattatttc aagaaagtag atttgggttc tctcaaagtg ggaggaactg ctgcacaatc 5700

aatgatttct ctctggttgt atggagccca ctctgagtca aacaggagcc ggagatgtat 5760

aaccgacttg gcccatttct attccaagtc atcccccata gagaagctgt tgaattgtac 5820

gttaggaaac agaggcctga gaatcccacc agagggggtg ttaagttgcc ttgagagggt 5880

cgattatgat aaggcatttg ggaggtatct ggccaacacg tattcctctt atctgttttt 5940

ccatgtaatt accttataca tgaatgccct agactgggaa gaggaaaaaa ccatcctagc 6000

attatggaaa gatctaacct cagtggatac cgggaaggac ttggtcaaat tcaaagatca 6060

aatatgggga ctgctggttg tgacaaagga ctttgtttac tctcagagtt ctaactgtct 6120

ttttgacaga aactatacac tgatgctaaa ggatcttttc ttgtctcgat tcaactcctt 6180

gatgattttg ctttctcccc ctgagccccg atactcagat gacttaatat ctcagctgtg 6240

ccagctatac atcgctgggg atcaagtctt gtccttgtgt gggaactccg gctatgaagt 6300

catcaaaata ttggagccat atgtcgtgaa cagtttggtc cagagggcag agaagtttag 6360

gcctctcatc cactccttgg gagactttcc tatgtttata aaagacaagg tgaatcaact 6420

tgaagggact ttcggtccca gtgcaaaaag gttttttagg gttctagatc aattcgacaa 6480

catacatgat ctagtatttg tgtatggctg ttacagacat tgggggcacc cctatataga 6540

ttatcggaag ggtctgtcga aactatatga tcaagttcac attaagaaag taatagataa 6600

gtcctaccag gagtgtttag caagtgactt ggctagaagg atcctcagat ggggatttga 6660

caagtactcc aagtggtatc tagattcgag attccttgcc ctagaccacc ccttggctcc 6720

ttatatcaag acccaaacat ggccacccaa acatatagta gacttggtgg gggacacatg 6780

gcacaagctc ccgatcacgc agatctttga gattcctgaa tcaatggacc cgtcagagat 6840

actggatgat aaatcacatt ctttcaccag aacaagacta gcttcttggc tgtccgagaa 6900

ccgagggggg cctgttccta gcgagaaggt cattatcacg gccctgtcta agccacctgt 6960

caatccccga gagtttttga aatctatcga cctcggagga ttgccagatg atgacttgat 7020

aattggcctc agaccaaagg aacgggagtt gaagattgag ggccgattct tcgctctaat 7080

gtcatggaat ctaagattat attttgtcat caccgagaag ctcttggcca actacatttt 7140

gccacttttt gacgcactga ctatgacaga caacctgaac aaggtattta aaaagttgat 7200

cgacagggtc accgggcaag ggcttttgga ctattcgagg gtcacatacg catttcacct 7260

ggactatgag aaatggaaca atcatcaaag attggagtca acggaggatg tattttctgt 7320

cctagatcag gtgtttggat tgaagagggt gttttctaga acacacgagt tttttcagaa 7380

gtcctggatc tattattcag acagatcaga cctcattggg ttacgggagg atcagatata 7440

ttgcttggat atgtccaatg gtccaacctg ctggaatggc caagacggcg ggctagaggg 7500

cttacggcag aagggctgga gtctagtcag cttattgatg atagatagag aatctcaaac 7560

caggaacaca agaaccaaga tactagctca aggagacaac caggttctgt gtccgacata 7620

catgttgtca ccgggattgt ctcaagaggg gcttctctat gagttagaga gcatatcgag 7680

gaatgcactc tcaatatacc gagctatcga ggaaggagca tctaaactgg ggctgatcat 7740

caagaaagaa gagaccatgt gtagttatga ctttctcata tatgggaaga cccccttatt 7800

tcgaggcaac atattagtac ctgaatccaa aagatgggcc cgagtctctt gcatctctaa 7860

cgaccaaata gtcaacctcg ccaatataat gtctacagta tccaccaatg cgctgacagt 7920

ggcacaacac tctcaatctc tgatcaaacc tatgagggat tttctgctca tgtcagtaca 7980

ggcagttttc cactacctgc tgtttagccc aatcttaaaa ggcagggttt ataagattct 8040

gagtgctgaa ggggagagct ttctcctagc catgtcgcgg ataatctacc tagatccttc 8100

tttgggaggg gtgtctggaa tgtctctcgg gaggttccat atacgtcagt tctcagaccc 8160

tgtctctgaa gggttgtcat tctggagaga gatctggtta agctcccatg aatcctggat 8220

tcacgcgttg tgtcaagagg ccgggaaccc cgatcttgga gagagaacac tagagagctt 8280

cactcgcctt ttagaagatc ctactacctt aaatatcaaa ggaggggcca gtcctaccat 8340

tctactcaag gatgctatca gaaaggctct gtacgacgag gtggacaagg tggaaaattc 8400

agagtttcga gaggcaatcc tgttgtccaa gacccataga gataacttta tactcttttt 8460

aaaatctgtt gagcctctgt tccctcgatt tctcagtgaa ctcttcagtt cgtccttctt 8520

gggaatacca gagtcaatta ttggactgat acaaaactcc aggacaataa gaaggcagtt 8580

tagaaagagt ctctcaagaa ctttagaaga gtccttctac aactcagaga tccacgggat 8640

taatcggatg acccagacac ctcaaagggt cgggagagtg tggccttgct cttcagagag 8700

ggcagatcta cttagggaga tctcttgggg aaggaaagtg gtaggcacga cagttcctca 8760

cccttccgag atgttggggc tgcttccaaa atcctctatt tcctgcactt gtggagcaac 8820

agggggaggc aatcctagag tttctgtatc agtactcccg tccttcgatc agtcattttt 8880

ttcacgaggt cccctaaagg gatacttggg ctcgtccacc tccatgtcaa cccagctatt 8940

ccatgcatgg gaaaaagtca ctaatgttca tgtggtgaaa agggctatat cgttaaaaga 9000

atctataaac tggttcatca atagaaattc caatttggct caaactctaa ttagaaacat 9060

catgtctctg acaggccctg atttccctct agaagaggct cctgttttca aacggacagg 9120

gtcagccttg cataggttca agtctgccag atacagcgaa ggagggtatt cttctgtttg 9180

tcctaacctt ctctctcata tctctgtcag tacagacact atgtctgatt tgacccaaga 9240

cgggaagaac tatgatttca tgtttcagcc attgatgctt tatgcgcaaa catggacatc 9300

agagctggta cagagagaca caagactgag agactccacg tttcactggc accttcgatg 9360

caacagatgt gtaaggccca ttgaggatat aacactggaa acttctcaga tcttcgagtt 9420

cccggatgtg tcaaaaagga tatccaggat ggtttctgga gccgtccctc actttcagaa 9480

gcttcctgat atccgtctaa gaccaggtga ttttgaatct ctaagtggta gagaaaagtc 9540

tcgccacata gggtcagctc aggggctctt atactcaatc ttagtagcaa ttcacgattc 9600

aggatacaat gatgggacca tcttccctgt caacatatac ggcaaagttt cccctagaga 9660

ctatttgaga gggctcgcaa gagggatctt gataggatcc tcgatttgct tcttgacacg 9720

aatgacaaat attaatatta aaagacctct tgaattgatc tcaggggtaa tttcctatat 9780

tctcctgagg ctggataatc atccctctct gtatataatg cttagagaac cgtctcttag 9840

aggagagata ttctctatcc ctcagaaaat ccccgccgct tacccaacca ctatgaaaga 9900

aggcaacaga tcgatcttgt gttacctcca acacgtgcta cgctatgagc gagaagtaat 9960

cacggcgtcc ccggagaatg actggctgtg gatcttctca gacttcagaa gtgcgaaaat 10020

gacgtacttg accctcatta cctaccagtc tcacctccta ctccagaggg ttgagcgaaa 10080

cttgtctaag agtatgagag ctactctgcg acaaatgggt tccttaatga ggcaagtgct 10140

gggtgggcac ggagaagaca ccttggagtc agacgacgac attcaacgat tactaaaaga 10200

ctctttgcga aggacaaggt gggtagatca agaggtgcgc catgcagcta gaaccatgag 10260

tggagattac agccccaaca agagagtatc ccgcaaggca ggatgttcag aatgggtctg 10320

ctctgctcaa caggttgccg tctccacctc agccaacccg gcccctgtct cagagcttga 10380

cattagggcc ctatctaaga ggtttcaaaa ccccttgatc tcgggcctaa gagtggttca 10440

gtgggcaacc ggcgcccatt ataagcttaa gcctattcta gatgatctaa atgttttccc 10500

atctctctgt cttgttgttg gagacgggtc agggggaata tcaagggcag ttctcaacat 10560

gtttccagat tctaagcttg tgttcaacag cctattggag gtgaatgatc tgatggcttc 10620

cggaacacat ccactgcctc cttcagcaat catgagtgga ggagatgata tcatctccag 10680

agtgatagac tttgactcaa tctgggaaaa accatccgac ctgaggaact tggccacctg 10740

gagatacttc cagtcagttc aaaagcaggt caacatgtcg tatgacctca ttgtttgtga 10800

tgcagaagtt actgatattg catctatcaa ccggataact ctgttgatgt ctgatttcgc 10860

attgtctata gatggaccac tttatctggt cttcaaaact tacgggacta tgctagtgaa 10920

cccagactat aaagctatcc aacatctgtc aagagcgttc ccttcggtca cagggtttat 10980

aacccaagta acttcgtcct tttcttctga gctatacctc cggttctcca aacgagggaa 11040

gttttttagg gatgctgagt acttgacctc ttccaccctt cgggagatga gccttgtgtt 11100

attcaattgt agcagcccca aaagtgagat gcagagagct cgttccttaa actatcaaga 11160

tcttgtaagg ggatttcctg aagagatcat atcaaatcct tacaatgaaa tgatcataac 11220

tctgattgac agtgatgtag agtccttcct ggtccacaag atggtggatg atcttgagtt 11280

acagagggga actctgtcta aagtggctat cattatatcc atcatgattg ttttttccaa 11340

tagagtcttc aacatttcca aacctttgac tgaccccttg ttctatcccc catctgatcc 11400

taaaatcctg aggcacttca acatatgttg cagtactatg atgtatctat ctaccgcttt 11460

aggcgacgtc cctagcttcg caagacttca tgacctatat aatagaccta taacttatta 11520

cttcagaaag caagttattc gagggaatat ttatctatct tggagctggt ccgatgacac 11580

cccagtgttc aagagggtag cctgtaattc tagcttgagt ctgtcatctc actggatcag 11640

gttgatttac aagatagtga agactaccag actcgttggc agcatagaag atctatcagg 11700

agaggtagaa cgacacctgc atgggtacaa cagatggatc accctcgagg atatccgatc 11760

tagatcatcc ctactagact acagttgttt gtaagccgga cattaatgaa agcctgtaca 11820

tgctaaaatt cttgtatgat gcatcttgaa aaaaacaaga tcttgaatcc gaacctctgg 11880

ttgtttgatt gtttttttta tctttattgt ttatttgtta agcgt 11925

<210>2

<211>4063

<212>DNA

<213>人工的

<400>2

acgcttaaca acaaaaccaa agaagaagca gacagcgtca gttgcaaagc aaaaatgtaa 60

cacccctaca atggatgccg acaagattgt gttcaaagtc aataatcagg tggtctcttt 120

gaagcccgag attatcgtgg atcaatatga gtacaagtac cctgctatca aagatttgaa 180

aaagccttgt ataaccctag ggaaagcccc cgatttaaac aaagcttaca aatcagtttt 240

atcaggcatg aatgccgcca aacttgatcc tgatgatgta tgctcctact tggcagcagc 300

aatgcagttc tttgagggga catgtccgga agactggacc agctatggaa tcctgattgc 360

acgaaaagga gacaagatca ccccagactc tctagtggag ataaagcgta ctgatgtaga 420

agggaattgg gctctgacag gaggcatgga actgacaagg gaccccactg tctccgaaca 480

tgcatcttta gtcggtcttc tcctgagtct gtacagattg agcaaaatat caggacaaaa 540

cactggtaac tataagacaa acattgcgga tagaatagag cagattttcg agacagcccc 600

ttttgttaag atcgtggaac accataccct gatgacaact cacaagatgt gtgctaattg 660

gagtactata ccgaacttca gatttttggc cggaacctac gacatgtttt tctcacggat 720

cgagcatctg tattcggcaa tcagagtggg cacagttgtc accgcttatg aagactgctc 780

aggactggta tcgtttacag ggttcataaa gcagatcaat ctcaccgcaa gagaagcaat 840

actatatttc ttccacaaga actttgaaga agagataagg agaatgtttg agccagggca 900

agagacagct gttcctcact cttatttcat tcacttccgt tcactaggct tgagtgggaa 960

gtctccttat tcatcaaatg ccgtcggtca tgtgttcaat ctcattcact ttgttggatg 1020

ctatatgggt caagtcagat ctctaaatgc aacggttatt gctgcatgtg cccctcatga 1080

gatgtctgtt ctagggggct atttgggaga ggagttcttc ggaaaaggga catttgaaag 1140

aaggttcttc agagacgaga aagaacttca agaatatgag gcggctgaac tgacaaagac 1200

cgacgtggca ctggcagatg acggaaccgt caactccgat gacgaggact acttctccgg 1260

tgaaaccaga agtccagaag ctgtctatac tcgaatcatg atgaatggag gtcgactgaa 1320

gagatcacat atacggagat atgtctcagt cagttccaat catcaagccc gtccaaactc 1380

attcgccgaa tttttaaaca aaacgtattc gagtgactca taaggagttg aatgacaggg 1440

tgccagaaat ccatagattg tgtatatcca tcatgaaaaa aactaacact cctcctttcg 1500

aaccatccca agtatgagca agatctttgt taatccgagt gcaatcagag ccggtctggc 1560

cgatcttgag atggccgaag agactgttga tctgatcaac agaaacatag aagacaatca 1620

ggctcatctc cagggagaac ccatagaagt ggacaatctc cctgaggaca tgaggcaatt 1680

tcacctgggc gatgaaaaat tgtccaacct tggtgagatg gttagggtgg gcgaaggcaa 1740

gtatcgagag gactttcaga tggatgaggg agaggacccc aacctcctgt tccaatcgta 1800

cctggacaat gttggagtcc aaatagtcag acaaatgagg tcaggagaga gattcctcaa 1860

gatatggtca cagaccgtag aggaaattat atcctatgtc acggtcaact ttcctaaccc 1920

tccaggaagg tcttcggagg ataaatcaac ccaaactact ggccgggagc tcaagaagga 1980

gacaacatcc actctttctc agagagaaag ccaaccttca aaagccggaa tggtggctca 2040

agttgcctct ggccctccat cccttgaatg gtctgccacc aatgaagagg atgatctatc 2100

agtagaggct gagatcgctc atcagattgc tgaaagcttt tccaagaagt acaagtttcc 2160

ctctcgatct tcaggaatat tcttgtataa ttttgagcaa ctggagatga accttgatga 2220

catagttaaa gaggcaaaaa atgtaccggg cgtgacccgt ctggcccatg atggatccaa 2280

aatcccccta agatgtgtac tgggatgggt cgctttggcc aactccaaga aattccaatt 2340

gatagtcgag gccgacaagc taagcaaaat catgcaagat gacttggatc gctacacatc 2400

atgctaaccg agtcttcgaa ttcattccct ctagataatg aaaactgaga tgtcatggag 2460

tcgacatgaa aaaaacaggc aacaccacta ataaaatgaa ctttctatgt aagatagtga 2520

aaaactgtag ggatgaggac acccaaaagc cctctcctgt gtcagcccct ccggatggcg 2580

atgacctgtg gcttccacct ccagaatatg tcccgctgaa agaactcaca agcaagaaga 2640

acatgaggaa cttttgtatc aacggggagg ttaaagtgtg tagcccgaac ggttactcat 2700

tcaggatcct gcggcatatt ctgagatcat tcgacgagat atactctggg aatcatagga 2760

tgattgggtt agtcaaagtt gttattggac tagctttatc aggagctcca gttcctgagg 2820

gcatgaactg ggtatacaaa ttgaggagaa cccttatttt ccagtgggct gattccaggg 2880

gccctcttga aggggaggag ttggaacact ctcaagagat cacttgggac gatgatactg 2940

aattcgtcgg attgcaaatg agagtgagcg caagacaatg tcatattcaa ggcaggatct 3000

ggtgtatcaa catgaactcg agggcatgtc aactatggtc tgacatgtct cttcagacac 3060

aaaggtctga agaggacaaa gactcttctc tgcttctaga ataatcagat tatatcccgc 3120

aagtttatca cttgtttacc tctggaggag agaacatacg ggcttaactc caatccttgg 3180

gagcaataga acaaaaaaac acgccatggt gccattaaac cgctgcattt tatcaaagtc 3240

aagttaatta cctttacatt ttgagcctct tggatgtgaa aaaaactatt aacatccctc 3300

aaaagactta aggaaagatg gttcctcagg ttcttttgtt tgtacccctc ctgggttttt 3360

cattgtgttt cgggaagttc cccatttaca cgataccaga caaacttggt ccctggagcc 3420

ctattgacat acaccatctc agctgtccaa ataacctggt tgtggaggac gaaggatgta 3480

ccaacctgtc cgagttctct tacatggaac ttaaagtggg atacatctca gccataaaag 3540

tgaacgggtt cacttgcaca ggtgttgtga cagaggcaga aacctacacc aactttgttg 3600

gttatgtcac aaccacattc aagagaaagc atttccgccc caccccagac gcatgtagag 3660

ccgcgtataa ctggaagatg gccggtgacc ccagatatga agagtctcta cacaatccgt 3720

accccgacta ccattggctt cgaactgtaa aaaccaccaa agagtctctc gttatcatat 3780

ccccaagtgt gacagatttg gacccatatg acaaatccct tcactcaagg gtcttccctg 3840

gcggaaattg ctcaggaata acggtgtcct cgacctactg ctcaactaat catgattaca 3900

ccatttggat gcctgagaat ctgagactag ggacatcttg tgacattttt accaatagca 3960

gagggaagag ggcatccaaa ggaggcaaga cttgcggctt tgtggatgaa agaggcctgt 4020

ataagtctct aaagggagca tgcaaactca agttatgtgg agt 4063

<210>3

<211>4242

<212>DNA

<213>人工的

<400>3

aggcctgtat aagtctctaa agggagcatg caaactcaag ttatgtggag ttctcggact 60

tagacttatg gatggaacat gggtcgcgat gcaaacatca gatgagacca aatggtgccc 120

tccaggtcag ttggtgaatt tgcacgactt tcgctcagac gagattgagc atctcgttgt 180

ggaagagtta gtcaagaaaa gagaggagtg tctggatgca ctagagtcca tcatgaccac 240

caagtcagtg agtttcagac gtctcagtca cttgagaaaa cttgtccctg ggtttggaaa 300

agcatatacc atattcaaca aaaccttgat ggaggctgat gctcactaca agtctgtccg 360

gacctggaat gagatcatcc cctcaaaagg gtgtttgaga gttgggggga ggtgtcatcc 420

ccatgtgaac ggggtgtttt tcaatggtat aatattaggg tctgacggcc atgttctaat 480

cccagagatg cagtcatccc tcctccagca acatatggag ttgttggaat cttcagttat 540

ccccctgatg caccccttgg cagacccttc tacagttttc aaagacggtg atgaggttga 600

ggattttgtt gaagttcacc tccccgatgt gcatgaacag gtctcaggag ttgaactggg 660

tctcccgaac tgggggaagt atgtattgat gattgcaggg gccttgattg ccctgatgtt 720

gataattttc ctgatgacat gttgcagaag agtcaatcga ccagaatcta cgcaaagcag 780

tcttggagag acagggagaa atgtgtcagt cacttcccaa agcggaaaag tcatatcttc 840

atgggagtca tataagagtg gaggcgagac cagactgtga aggccggtca tccttttgac 900

acttcaagtc ccgaggataa cctcctctcg gggttggggg gaatcttggg atccagtagt 960

cctccttgaa ctccatccaa cagggtagat ttaagagtca tgagactttc attaatcatc 1020

tcagttgatc agacatggtc gtgtagattc tcataacacg ggagatcttc tagcagtttc 1080

agtgaccaac ggtgctttca ttctccagga actgatacca aaggttgtgg acaagccaag 1140

gggtgcttcg gattactctg tgcttgggca cagaaagagg tcgtagtttg ccccttgata 1200

gcagattcaa catgaattaa ctaagaaagg cgatctgcct cccatgaagg acataagcaa 1260

tagttcacaa tcatcttgca tctcagtgaa gtgtacataa ctataaaggg ctgggtcatc 1320

taagcatttc agtcgagaaa aaaactgtag accaaaagaa caactaacaa cacttctcat 1380

cccgagaccc atatcaagat gctggatccg ggagaggttt atgatgaccc tattgatcca 1440

attgagtcag aggctgaacc cagaggaacc cccactgtcc ccaacatctt gaggaactct 1500

gactacaatc tcaactctcc tttgatagag gactctgcca aactaatgtt agaatggttg 1560

aaaacaggga acagacctta tcggatgact ttgacagaca attgctccag gtcttacaaa 1620

gttttgaaag attatttcaa gaaagtagat ttgggttctc tcaaagtggg aggaactgct 1680

gcacaatcaa tgatttctct ctggttgtat ggagcccact ctgagtcaaa caggagccgg 1740

agatgtataa ccgacttggc ccatttctat tccaagtcat cccccataga gaagctgttg 1800

aattgtacgt taggaaacag aggcctgaga atcccaccag agggggtgtt aagttgcctt 1860

gagagggtcg attatgataa ggcatttggg aggtatctgg ccaacacgta ttcctcttat 1920

ctgtttttcc atgtaattac cttatacatg aatgccctag actgggaaga ggaaaaaacc 1980

atcctagcat tatggaaaga tctaacctca gtggataccg ggaaggactt ggtcaaattc 2040

aaagatcaaa tatggggact gctggttgtg acaaaggact ttgtttactc tcagagttct 2100

aactgtcttt ttgacagaaa ctatacactg atgctaaagg atcttttctt gtctcgattc 2160

aactccttga tgattttgct ttctccccct gagccccgat actcagatga cttaatatct 2220

cagctgtgcc agctatacat cgctggggat caagtcttgt ccttgtgtgg gaactccggc 2280

tatgaagtca tcaaaatatt ggagccatat gtcgtgaaca gtttggtcca gagggcagag 2340

aagtttaggc ctctcatcca ctccttggga gactttccta tgtttataaa agacaaggtg 2400

aatcaacttg aagggacttt cggtcccagt gcaaaaaggt tttttagggt tctagatcaa 2460

ttcgacaaca tacatgatct agtatttgtg tatggctgtt acagacattg ggggcacccc 2520

tatatagatt atcggaaggg tctgtcgaaa ctatatgatc aagttcacat taagaaagta 2580

atagataagt cctaccagga gtgtttagca agtgacttgg ctagaaggat cctcagatgg 2640

ggatttgaca agtactccaa gtggtatcta gattcgagat tccttgccct agaccacccc 2700

ttggctcctt atatcaagac ccaaacatgg ccacccaaac atatagtaga cttggtgggg 2760

gacacatggc acaagctccc gatcacgcag atctttgaga ttcctgaatc aatggacccg 2820

tcagagatac tggatgataa atcacattct ttcaccagaa caagactagc ttcttggctg 2880

tccgagaacc gaggggggcc tgttcctagc gagaaggtca ttatcacggc cctgtctaag 2940

ccacctgtca atccccgaga gtttttgaaa tctatcgacc tcggaggatt gccagatgat 3000

gacttgataa ttggcctcag accaaaggaa cgggagttga agattgaggg ccgattcttc 3060

gctctaatgt catggaatct aagattatat tttgtcatca ccgagaagct cttggccaac 3120

tacattttgc cactttttga cgcactgact atgacagaca acctgaacaa ggtatttaaa 3180

aagttgatcg acagggtcac cgggcaaggg cttttggact attcgagggt cacatacgca 3240

tttcacctgg actatgagaa atggaacaat catcaaagat tggagtcaac ggaggatgta 3300

ttttctgtcc tagatcaggt gtttggattg aagagggtgt tttctagaac acacgagttt 3360

tttcagaagt cctggatcta ttattcagac agatcagacc tcattgggtt acgggaggat 3420

cagatatatt gcttggatat gtccaatggt ccaacctgct ggaatggcca agacggcggg 3480

ctagagggct tacggcagaa gggctggagt ctagtcagct tattgatgat agatagagaa 3540

tctcaaacca ggaacacaag aaccaagata ctagctcaag gagacaacca ggttctgtgt 3600

ccgacataca tgttgtcacc gggattgtct caagaggggc ttctctatga gttagagagc 3660

atatcgagga atgcactctc aatataccga gctatcgagg aaggagcatc taaactgggg 3720

ctgatcatca agaaagaaga gaccatgtgt agttatgact ttctcatata tgggaagacc 3780

cccttatttc gaggcaacat attagtacct gaatccaaaa gatgggcccg agtctcttgc 3840

atctctaacg accaaatagt caacctcgcc aatataatgt ctacagtatc caccaatgcg 3900

ctgacagtgg cacaacactc tcaatctctg atcaaaccta tgagggattt tctgctcatg 3960

tcagtacagg cagttttcca ctacctgctg tttagcccaa tcttaaaagg cagggtttat 4020

aagattctga gtgctgaagg ggagagcttt ctcctagcca tgtcgcggat aatctaccta 4080

gatccttctt tgggaggggt gtctggaatg tctctcggga ggttccatat acgtcagttc 4140

tcagaccctg tctctgaagg gttgtcattc tggagagaga tctggttaag ctcccatgaa 4200

tcctggattc acgcgttgtg tcaagaggcc gggaaccccg at 4242

<210>4

<211>3739

<212>DNA

<213>人工的

<400>4

gagagatctg gttaagctcc catgaatcct ggattcacgc gttgtgtcaa gaggccggga 60

accccgatct tggagagaga acactagaga gcttcactcg ccttttagaa gatcctacta 120

ccttaaatat caaaggaggg gccagtccta ccattctact caaggatgct atcagaaagg 180

ctctgtacga cgaggtggac aaggtggaaa attcagagtt tcgagaggca atcctgttgt 240

ccaagaccca tagagataac tttatactct ttttaaaatc tgttgagcct ctgttccctc 300

gatttctcag tgaactcttc agttcgtcct tcttgggaat accagagtca attattggac 360

tgatacaaaa ctccaggaca ataagaaggc agtttagaaa gagtctctca agaactttag 420

aagagtcctt ctacaactca gagatccacg ggattaatcg gatgacccag acacctcaaa 480

gggtcgggag agtgtggcct tgctcttcag agagggcaga tctacttagg gagatctctt 540

ggggaaggaa agtggtaggc acgacagttc ctcacccttc cgagatgttg gggctgcttc 600

caaaatcctc tatttcctgc acttgtggag caacaggggg aggcaatcct agagtttctg 660

tatcagtact cccgtccttc gatcagtcat ttttttcacg aggtccccta aagggatact 720

tgggctcgtc cacctccatg tcaacccagc tattccatgc atgggaaaaa gtcactaatg 780

ttcatgtggt gaaaagggct atatcgttaa aagaatctat aaactggttc atcaatagaa 840

attccaattt ggctcaaact ctaattagaa acatcatgtc tctgacaggc cctgatttcc 900

ctctagaaga ggctcctgtt ttcaaacgga cagggtcagc cttgcatagg ttcaagtctg 960

ccagatacag cgaaggaggg tattcttctg tttgtcctaa ccttctctct catatctctg 1020

tcagtacaga cactatgtct gatttgaccc aagacgggaa gaactatgat ttcatgtttc 1080

agccattgat gctttatgcg caaacatgga catcagagct ggtacagaga gacacaagac 1140

tgagagactc cacgtttcac tggcaccttc gatgcaacag atgtgtaagg cccattgagg 1200

atataacact ggaaacttct cagatcttcg agttcccgga tgtgtcaaaa aggatatcca 1260

ggatggtttc tggagccgtc cctcactttc agaagcttcc tgatatccgt ctaagaccag 1320

gtgattttga atctctaagt ggtagagaaa agtctcgcca catagggtca gctcaggggc 1380

tcttatactc aatcttagta gcaattcacg attcaggata caatgatggg accatcttcc 1440

ctgtcaacat atacggcaaa gtttccccta gagactattt gagagggctc gcaagaggga 1500

tcttgatagg atcctcgatt tgcttcttga cacgaatgac aaatattaat attaaaagac 1560

ctcttgaatt gatctcaggg gtaatttcct atattctcct gaggctggat aatcatccct 1620

ctctgtatat aatgcttaga gaaccgtctc ttagaggaga gatattctct atccctcaga 1680

aaatccccgc cgcttaccca accactatga aagaaggcaa cagatcgatc ttgtgttacc 1740

tccaacacgt gctacgctat gagcgagaag taatcacggc gtccccggag aatgactggc 1800

tgtggatctt ctcagacttc agaagtgcga aaatgacgta cttgaccctc attacctacc 1860

agtctcacct cctactccag agggttgagc gaaacttgtc taagagtatg agagctactc 1920

tgcgacaaat gggttcctta atgaggcaag tgctgggtgg gcacggagaa gacaccttgg 1980

agtcagacga cgacattcaa cgattactaa aagactcttt gcgaaggaca aggtgggtag 2040

atcaagaggt gcgccatgca gctagaacca tgagtggaga ttacagcccc aacaagagag 2100

tatcccgcaa ggcaggatgt tcagaatggg tctgctctgc tcaacaggtt gccgtctcca 2160

cctcagccaa cccggcccct gtctcagagc ttgacattag ggccctatct aagaggtttc 2220

aaaacccctt gatctcgggc ctaagagtgg ttcagtgggc aaccggcgcc cattataagc 2280

ttaagcctat tctagatgat ctaaatgttt tcccatctct ctgtcttgtt gttggagacg 2340

ggtcaggggg aatatcaagg gcagttctca acatgtttcc agattctaag cttgtgttca 2400

acagcctatt ggaggtgaat gatctgatgg cttccggaac acatccactg cctccttcag 2460

caatcatgag tggaggagat gatatcatct ccagagtgat agactttgac tcaatctggg 2520

aaaaaccatc cgacctgagg aacttggcca cctggagata cttccagtca gttcaaaagc 2580

aggtcaacat gtcgtatgac ctcattgttt gtgatgcaga agttactgat attgcatcta 2640

tcaaccggat aactctgttg atgtctgatt tcgcattgtc tatagatgga ccactttatc 2700

tggtcttcaa aacttacggg actatgctag tgaacccaga ctataaagct atccaacatc 2760

tgtcaagagc gttcccttcg gtcacagggt ttataaccca agtaacttcg tccttttctt 2820

ctgagctata cctccggttc tccaaacgag ggaagttttt tagggatgct gagtacttga 2880

cctcttccac ccttcgggag atgagccttg tgttattcaa ttgtagcagc cccaaaagtg 2940

agatgcagag agctcgttcc ttaaactatc aagatcttgt aaggggattt cctgaagaga 3000

tcatatcaaa tccttacaat gaaatgatca taactctgat tgacagtgat gtagagtcct 3060

tcctggtcca caagatggtg gatgatcttg agttacagag gggaactctg tctaaagtgg 3120

ctatcattat atccatcatg attgtttttt ccaatagagt cttcaacatt tccaaacctt 3180

tgactgaccc cttgttctat cccccatctg atcctaaaat cctgaggcac ttcaacatat 3240

gttgcagtac tatgatgtat ctatctaccg ctttaggcga cgtccctagc ttcgcaagac 3300

ttcatgacct atataataga cctataactt attacttcag aaagcaagtt attcgaggga 3360

atatttatct atcttggagc tggtccgatg acaccccagt gttcaagagg gtagcctgta 3420

attctagctt gagtctgtca tctcactgga tcaggttgat ttacaagata gtgaagacta 3480

ccagactcgt tggcagcata gaagatctat caggagaggt agaacgacac ctgcatgggt 3540

acaacagatg gatcaccctc gaggatatcc gatctagatc atccctacta gactacagtt 3600

gtttgtaagc cggacattaa tgaaagcctg tacatgctaa aattcttgta tgatgcatct 3660

tgaaaaaaac aagatcttga atccgaacct ctggttgttt gattgttttt tttatcttta 3720

ttgtttattt gttaagcgt 3739

<210>5

<211>1353

<212>DNA

<213>人工的

<400>5

atggatgccg acaagattgt gttcaaagtc aataatcagg tggtctcttt gaagcccgag 60

attatcgtgg atcaatatga gtacaagtac cctgctatca aagatttgaa aaagccttgt 120

ataaccctag ggaaagcccc cgatttaaac aaagcttaca aatcagtttt atcaggcatg 180

aatgccgcca aacttgatcc tgatgatgta tgctcctact tggcagcagc aatgcagttc 240

tttgagggga catgtccgga agactggacc agctatggaa tcctgattgc acgaaaagga 300

gacaagatca ccccagactc tctagtggag ataaagcgta ctgatgtaga agggaattgg 360

gctctgacag gaggcatgga actgacaagg gaccccactg tctccgaaca tgcatcttta 420

gtcggtcttc tcctgagtct gtacagattg agcaaaatat caggacaaaa cactggtaac 480

tataagacaa acattgcgga tagaatagag cagattttcg agacagcccc ttttgttaag 540

atcgtggaac accataccct gatgacaact cacaagatgt gtgctaattg gagtactata 600

ccgaacttca gatttttggc cggaacctac gacatgtttt tctcacggat cgagcatctg 660

tattcggcaa tcagagtggg cacagttgtc accgcttatg aagactgctc aggactggta 720

tcgtttacag ggttcataaa gcagatcaat ctcaccgcaa gagaagcaat actatatttc 780

ttccacaaga actttgaaga agagataagg agaatgtttg agccagggca agagacagct 840

gttcctcact cttatttcat tcacttccgt tcactaggct tgagtgggaa gtctccttat 900

tcatcaaatg ccgtcggtca tgtgttcaat ctcattcact ttgttggatg ctatatgggt 960

caagtcagat ctctaaatgc aacggttatt gctgcatgtg cccctcatga gatgtctgtt 1020

ctagggggct atttgggaga ggagttcttc ggaaaaggga catttgaaag aaggttcttc 1080

agagacgaga aagaacttca agaatatgag gcggctgaac tgacaaagac cgacgtggca 1140

ctggcagatg acggaaccgt caactccgat gacgaggact acttctccgg tgaaaccaga 1200

agtccagaag ctgtctatac tcgaatcatg atgaatggag gtcgactgaa gagatcacat 1260

atacggagat atgtctcagt cagttccaat catcaagccc gtccaaactc attcgccgaa 1320

tttttaaaca aaacgtattc gagtgactca taa 1353

<210>6

<211>894

<212>DNA

<213>人工的

<400>6

atgagcaaga tctttgttaa tccgagtgca atcagagccg gtctggccga tcttgagatg 60

gccgaagaga ctgttgatct gatcaacaga aacatagaag acaatcaggc tcatctccag 120

ggagaaccca tagaagtgga caatctccct gaggacatga ggcaatttca cctgggcgat 180

gaaaaattgt ccaaccttgg tgagatggtt agggtgggcg aaggcaagta tcgagaggac 240

tttcagatgg atgagggaga ggaccccaac ctcctgttcc aatcgtacct ggacaatgtt 300

ggagtccaaa tagtcagaca aatgaggtca ggagagagat tcctcaagat atggtcacag 360

accgtagagg aaattatatc ctatgtcacg gtcaactttc ctaaccctcc aggaaggtct 420

tcggaggata aatcaaccca aactactggc cgggagctca agaaggagac aacatccact 480

ctttctcaga gagaaagcca accttcaaaa gccggaatgg tggctcaagt tgcctctggc 540

cctccatccc ttgaatggtc tgccaccaat gaagaggatg atctatcagt agaggctgag 600

atcgctcatc agattgctga aagcttttcc aagaagtaca agtttccctc tcgatcttca 660

ggaatattct tgtataattt tgagcaactg gagatgaacc ttgatgacat agttaaagag 720

gcaaaaaatg taccgggcgt gacccgtctg gcccatgatg gatccaaaat ccccctaaga 780

tgtgtactgg gatgggtcgc tttggccaac tccaagaaat tccaattgat agtcgaggcc 840

gacaagctaa gcaaaatcat gcaagatgac ttggatcgct acacatcatg ctaa 894

<210>7

<211>6384

<212>DNA

<213>人工的

<400>7

atgctggatc cgggagaggt ttatgatgac cctattgatc caattgagtc agaggctgaa 60

cccagaggaa cccccactgt ccccaacatc ttgaggaact ctgactacaa tctcaactct 120

cctttgatag aggactctgc caaactaatg ttagaatggt tgaaaacagg gaacagacct 180

tatcggatga ctttgacaga caattgctcc aggtcttaca aagttttgaa agattatttc 240

aagaaagtag atttgggttc tctcaaagtg ggaggaactg ctgcacaatc aatgatttct 300

ctctggttgt atggagccca ctctgagtca aacaggagcc ggagatgtat aaccgacttg 360

gcccatttct attccaagtc atcccccata gagaagctgt tgaattgtac gttaggaaac 420

agaggcctga gaatcccacc agagggggtg ttaagttgcc ttgagagggt cgattatgat 480

aaggcatttg ggaggtatct ggccaacacg tattcctctt atctgttttt ccatgtaatt 540

accttataca tgaatgccct agactgggaa gaggaaaaaa ccatcctagc attatggaaa 600

gatctaacct cagtggatac cgggaaggac ttggtcaaat tcaaagatca aatatgggga 660

ctgctggttg tgacaaagga ctttgtttac tctcagagtt ctaactgtct ttttgacaga 720

aactatacac tgatgctaaa ggatcttttc ttgtctcgat tcaactcctt gatgattttg 780

ctttctcccc ctgagccccg atactcagat gacttaatat ctcagctgtg ccagctatac 840

atcgctgggg atcaagtctt gtccttgtgt gggaactccg gctatgaagt catcaaaata 900

ttggagccat atgtcgtgaa cagtttggtc cagagggcag agaagtttag gcctctcatc 960

cactccttgg gagactttcc tatgtttata aaagacaagg tgaatcaact tgaagggact 1020

ttcggtccca gtgcaaaaag gttttttagg gttctagatc aattcgacaa catacatgat 1080

ctagtatttg tgtatggctg ttacagacat tgggggcacc cctatataga ttatcggaag 1140

ggtctgtcga aactatatga tcaagttcac attaagaaag taatagataa gtcctaccag 1200

gagtgtttag caagtgactt ggctagaagg atcctcagat ggggatttga caagtactcc 1260

aagtggtatc tagattcgag attccttgcc ctagaccacc ccttggctcc ttatatcaag 1320

acccaaacat ggccacccaa acatatagta gacttggtgg gggacacatg gcacaagctc 1380

ccgatcacgc agatctttga gattcctgaa tcaatggacc cgtcagagat actggatgat 1440

aaatcacatt ctttcaccag aacaagacta gcttcttggc tgtccgagaa ccgagggggg 1500

cctgttccta gcgagaaggt cattatcacg gccctgtcta agccacctgt caatccccga 1560

gagtttttga aatctatcga cctcggagga ttgccagatg atgacttgat aattggcctc 1620

agaccaaagg aacgggagtt gaagattgag ggccgattct tcgctctaat gtcatggaat 1680

ctaagattat attttgtcat caccgagaag ctcttggcca actacatttt gccacttttt 1740

gacgcactga ctatgacaga caacctgaac aaggtattta aaaagttgat cgacagggtc 1800

accgggcaag ggcttttgga ctattcgagg gtcacatacg catttcacct ggactatgag 1860

aaatggaaca atcatcaaag attggagtca acggaggatg tattttctgt cctagatcag 1920

gtgtttggat tgaagagggt gttttctaga acacacgagt tttttcagaa gtcctggatc 1980

tattattcag acagatcaga cctcattggg ttacgggagg atcagatata ttgcttggat 2040

atgtccaatg gtccaacctg ctggaatggc caagacggcg ggctagaggg cttacggcag 2100

aagggctgga gtctagtcag cttattgatg atagatagag aatctcaaac caggaacaca 2160

agaaccaaga tactagctca aggagacaac caggttctgt gtccgacata catgttgtca 2220

ccgggattgt ctcaagaggg gcttctctat gagttagaga gcatatcgag gaatgcactc 2280

tcaatatacc gagctatcga ggaaggagca tctaaactgg ggctgatcat caagaaagaa 2340

gagaccatgt gtagttatga ctttctcata tatgggaaga cccccttatt tcgaggcaac 2400

atattagtac ctgaatccaa aagatgggcc cgagtctctt gcatctctaa cgaccaaata 2460

gtcaacctcg ccaatataat gtctacagta tccaccaatg cgctgacagt ggcacaacac 2520

tctcaatctc tgatcaaacc tatgagggat tttctgctca tgtcagtaca ggcagttttc 2580

cactacctgc tgtttagccc aatcttaaaa ggcagggttt ataagattct gagtgctgaa 2640

ggggagagct ttctcctagc catgtcgcgg ataatctacc tagatccttc tttgggaggg 2700

gtgtctggaa tgtctctcgg gaggttccat atacgtcagt tctcagaccc tgtctctgaa 2760

gggttgtcat tctggagaga gatctggtta agctcccatg aatcctggat tcacgcgttg 2820

tgtcaagagg ccgggaaccc cgatcttgga gagagaacac tagagagctt cactcgcctt 2880

ttagaagatc ctactacctt aaatatcaaa ggaggggcca gtcctaccat tctactcaag 2940

gatgctatca gaaaggctct gtacgacgag gtggacaagg tggaaaattc agagtttcga 3000

gaggcaatcc tgttgtccaa gacccataga gataacttta tactcttttt aaaatctgtt 3060

gagcctctgt tccctcgatt tctcagtgaa ctcttcagtt cgtccttctt gggaatacca 3120

gagtcaatta ttggactgat acaaaactcc aggacaataa gaaggcagtt tagaaagagt 3180

ctctcaagaa ctttagaaga gtccttctac aactcagaga tccacgggat taatcggatg 3240

acccagacac ctcaaagggt cgggagagtg tggccttgct cttcagagag ggcagatcta 3300

cttagggaga tctcttgggg aaggaaagtg gtaggcacga cagttcctca cccttccgag 3360

atgttggggc tgcttccaaa atcctctatt tcctgcactt gtggagcaac agggggaggc 3420

aatcctagag tttctgtatc agtactcccg tccttcgatc agtcattttt ttcacgaggt 3480

cccctaaagg gatacttggg ctcgtccacc tccatgtcaa cccagctatt ccatgcatgg 3540

gaaaaagtca ctaatgttca tgtggtgaaa agggctatat cgttaaaaga atctataaac 3600

tggttcatca atagaaattc caatttggct caaactctaa ttagaaacat catgtctctg 3660

acaggccctg atttccctct agaagaggct cctgttttca aacggacagg gtcagccttg 3720

cataggttca agtctgccag atacagcgaa ggagggtatt cttctgtttg tcctaacctt 3780

ctctctcata tctctgtcag tacagacact atgtctgatt tgacccaaga cgggaagaac 3840

tatgatttca tgtttcagcc attgatgctt tatgcgcaaa catggacatc agagctggta 3900

cagagagaca caagactgag agactccacg tttcactggc accttcgatg caacagatgt 3960

gtaaggccca ttgaggatat aacactggaa acttctcaga tcttcgagtt cccggatgtg 4020

tcaaaaagga tatccaggat ggtttctgga gccgtccctc actttcagaa gcttcctgat 4080

atccgtctaa gaccaggtga ttttgaatct ctaagtggta gagaaaagtc tcgccacata 4140

gggtcagctc aggggctctt atactcaatc ttagtagcaa ttcacgattc aggatacaat 4200

gatgggacca tcttccctgt caacatatac ggcaaagttt cccctagaga ctatttgaga 4260

gggctcgcaa gagggatctt gataggatcc tcgatttgct tcttgacacg aatgacaaat 4320

attaatatta aaagacctct tgaattgatc tcaggggtaa tttcctatat tctcctgagg 4380

ctggataatc atccctctct gtatataatg cttagagaac cgtctcttag aggagagata 4440

ttctctatcc ctcagaaaat ccccgccgct tacccaacca ctatgaaaga aggcaacaga 4500

tcgatcttgt gttacctcca acacgtgcta cgctatgagc gagaagtaat cacggcgtcc 4560

ccggagaatg actggctgtg gatcttctca gacttcagaa gtgcgaaaat gacgtacttg 4620

accctcatta cctaccagtc tcacctccta ctccagaggg ttgagcgaaa cttgtctaag 4680

agtatgagag ctactctgcg acaaatgggt tccttaatga ggcaagtgct gggtgggcac 4740

ggagaagaca ccttggagtc agacgacgac attcaacgat tactaaaaga ctctttgcga 4800

aggacaaggt gggtagatca agaggtgcgc catgcagcta gaaccatgag tggagattac 4860

agccccaaca agagagtatc ccgcaaggca ggatgttcag aatgggtctg ctctgctcaa 4920

caggttgccg tctccacctc agccaacccg gcccctgtct cagagcttga cattagggcc 4980

ctatctaaga ggtttcaaaa ccccttgatc tcgggcctaa gagtggttca gtgggcaacc 5040

ggcgcccatt ataagcttaa gcctattcta gatgatctaa atgttttccc atctctctgt 5100

cttgttgttg gagacgggtc agggggaata tcaagggcag ttctcaacat gtttccagat 5160

tctaagcttg tgttcaacag cctattggag gtgaatgatc tgatggcttc cggaacacat 5220

ccactgcctc cttcagcaat catgagtgga ggagatgata tcatctccag agtgatagac 5280

tttgactcaa tctgggaaaa accatccgac ctgaggaact tggccacctg gagatacttc 5340

cagtcagttc aaaagcaggt caacatgtcg tatgacctca ttgtttgtga tgcagaagtt 5400

actgatattg catctatcaa ccggataact ctgttgatgt ctgatttcgc attgtctata 5460

gatggaccac tttatctggt cttcaaaact tacgggacta tgctagtgaa cccagactat 5520

aaagctatcc aacatctgtc aagagcgttc ccttcggtca cagggtttat aacccaagta 5580

acttcgtcct tttcttctga gctatacctc cggttctcca aacgagggaa gttttttagg 5640

gatgctgagt acttgacctc ttccaccctt cgggagatga gccttgtgtt attcaattgt 5700

agcagcccca aaagtgagat gcagagagct cgttccttaa actatcaaga tcttgtaagg 5760

ggatttcctg aagagatcat atcaaatcct tacaatgaaa tgatcataac tctgattgac 5820

agtgatgtag agtccttcct ggtccacaag atggtggatg atcttgagtt acagagggga 5880

actctgtcta aagtggctat cattatatcc atcatgattg ttttttccaa tagagtcttc 5940

aacatttcca aacctttgac tgaccccttg ttctatcccc catctgatcc taaaatcctg 6000

aggcacttca acatatgttg cagtactatg atgtatctat ctaccgcttt aggcgacgtc 6060

cctagcttcg caagacttca tgacctatat aatagaccta taacttatta cttcagaaag 6120

caagttattc gagggaatat ttatctatct tggagctggt ccgatgacac cccagtgttc 6180

aagagggtag cctgtaattc tagcttgagt ctgtcatctc actggatcag gttgatttac 6240

aagatagtga agactaccag actcgttggc agcatagaag atctatcagg agaggtagaa 6300

cgacacctgc atgggtacaa cagatggatc accctcgagg atatccgatc tagatcatcc 6360

ctactagact acagttgttt gtaa 6384

Claims

1.狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株的反向遗传操作系统，其包括编码LEP全长基因组cDNA的重组载体pCI-LEP，及其辅助质粒系统pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L，其中所述LEP全长基因组cDNA的序列为SEQ ID NO：1，所述辅助质粒系统分别编码LEP的核蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L。

2.权利要求1的狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株的反向遗传操作系统，其中所述载体为携带CMV启动子的质粒。

3.表达绿色荧光蛋白的LEP重组病毒载体，其为pCI-LEP-EGFP。

4.由权利要求1的狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株的反向遗传操作系统拯救的病毒株，其为rLEP。

5.由权利要求3的表达绿色荧光蛋白的LEP重组病毒载体拯救的表达绿色荧光蛋白的LEP重组病毒株，其为rLEP-EGFP。

6.权利要求5的表达绿色荧光蛋白的LEP重组病毒株rLEP-EGFP的应用，其用于直接观察病毒的增殖状态，分析LEP病毒的扩散和致病性。