CN103160473B - 用于拯救麻疹病毒的组合物、试剂盒、用途及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于拯救麻疹病毒(measles virus)的组合物、试剂盒、用途及方法。本发明的用于拯救麻疹病毒的组合物包含：1)重组转录载体，其含有麻疹病毒全基因组cDNA，其中所述麻疹病毒全基因组的5’端和3’端分别包含具有自我剪切功能的核酶序列；2)第一重组表达载体，其含有麻疹病毒的核衣壳蛋白的编码基因；3)第二重组表达载体，其含有麻疹病毒的磷蛋白的编码基因；和4)第三重组表达载体，其含有麻疹病毒的RNA聚合酶的编码基因。本发明的组合物能够简单方便地拯救麻疹病毒，并且所拯救的麻疹病毒可用于制备麻疹疫苗，适于工业应用。

Description

用于拯救麻疹病毒的组合物、试剂盒、用途及方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体而言，本发明涉及一种用于拯救麻疹病毒的组合物、含该组合物的试剂盒、该组合物的用途及拯救麻疹病毒的方法。

背景技术

麻疹病毒(measles virus，MV)是副粘病毒科麻疹病毒属(morbillivirus)的成员，是一种含有未分段的线状单链RNA的有包膜病毒，其通过呼吸道飞沫小滴，或者接触感染。易感人群对麻疹的发病率几乎达到100％，因此麻疹病毒是在全世界范围内引起高度传染性疾病的病毒之一。

国内所用的麻疹疫苗株为沪191(S191)株(NCBI编号：EU435017.1)，该病毒株是在1960年从上海的1例2岁男麻疹患者的血液中分离得到的。沪191株生产的麻疹疫苗稳定性良好，其临床安全性和免疫原性均良好，有效性和安全性已经得到明确的肯定，是中国麻疹疫苗的主要生产株。麻疹病毒疫苗接种能激发持久的免疫应答，带来长期的保护作用，遗传性稳定同时无致病性的返祖现象。但最初制备麻疹疫苗的工艺复杂，需要在不同的细胞系中传代许多次才能得到减毒的毒株，费时费力。

RNA病毒反向遗传学的兴起促进了RNA病毒反向遗传系统的建立和发展，这使得能够利用负链RNA病毒的cDNA来进行病毒的拯救(Schell MJ，Mebatsion T，Conzelmann KK.Infectious rabie s virusfrom clone cDNA.EMBO J.1994，13：4195-4203)，从而利用拯救出的病毒研究病毒的分子特征、致病机理、病毒与宿主之间的相互作用，以及开展新型减毒活载体疫苗的研究，或者用来制备疫苗。利用如此拯救出的病毒进行疫苗制备将大大缩短制备时间，而且可为研究者提供一种输送治疗基因的载体，甚至研制出一种新型的致弱活病毒嵌合疫苗。鉴于负链RNA病毒载体的优点，以及其可以为进一步的研究如致病机理、减毒机理研究提供研究平台的前景。Inoue K等利用RNA病毒反向遗传系统成功拯救了狂犬病毒(Inoue K，Shoji Y，Kurane I，Iijima T，Sakai T，Morimoto K.An improved method for recovering rabiesvirus from cloned cDNA.J Virol Methods.2003，107(2)：229-36)，但其所使用的载体质粒为pcDNA3.1，其在拯救负链RNA病毒方面存在一些不足，并且该文献报道的拯救体系和方法较为复杂，拯救难度较大。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明基于广泛使用的麻疹病毒减毒疫苗株具有的无可比拟的优势，提供了一种用于拯救麻疹病毒的组合物，以及拯救麻疹病毒的方法。

具体而言，本发明提供了：

(1)一种用于拯救麻疹病毒(measles virus)的组合物，该组合物包含：

1)重组转录载体，其含有麻疹病毒全基因组cDNA，其中所述麻疹病毒全基因组的5’端和3’端分别包含具有自我剪切功能的核酶序列；

2)第一重组表达载体，其含有麻疹病毒的核衣壳蛋白的编码基因；

3)第二重组表达载体，其含有麻疹病毒的磷蛋白的编码基因；和

4)第三重组表达载体，其含有麻疹病毒的RNA聚合酶的编码基因。

(2)根据(1)所述的组合物，其中所述转录载体、所述第一重组表达载体、所述第二重组表达载体、所述第三重组表达载体的比例范围为：(3.5～4)∶(1～1.5)∶(0.1)∶(0.2～1)。

(3)根据(1)所述的组合物，其中所述5’端的具有自我剪切功能的核酶序列为锤头状核酶序列、并且/或者所述3’端的具有自我剪切功能的核酶序列为丁肝病毒核酶序列。

(4)根据(3)所述的组合物，其中所述重组转录载体具有如图1所示的pVAXm-mvfull质粒的物理图谱、所述第一重组表达载体具有如图2所示的pVAXm-N质粒的物理图谱、所述第二重组表达载体具有如图3所示的pVAXm-P质粒的物理图谱、并且/或者所述第三重组表达载体具有如图4所示的pVAXm-L质粒的物理图谱。

(5)根据(1)所述的组合物，所述麻疹病毒为中国麻疹疫苗株S191。

(6)一种试剂盒，该试剂盒包含根据(1)至(5)中任意一项所述的组合物。

(7)根据(1)至(5)中任意一项所述的组合物在拯救麻疹病毒中的用途。

(8)根据(1)至(5)中任意一项所述的组合物在制备麻疹疫苗中的用途。

(9)一种拯救麻疹病毒的方法，该方法包括：将根据(1)至(5)中任意一项所述的组合物共转染入宿主细胞中，从而进行麻疹病毒的拯救。

(10)根据(9)所述的方法，其中所述的宿主细胞为293T细胞。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1.本发明提供了一种用于拯救麻疹病毒的组合物，其能够简单方便地拯救麻疹病毒，并且所拯救的麻疹病毒可用于制备麻疹疫苗。

2.本发明提供的用于拯救麻疹病毒的组合物中还进一步优化了共转染转录载体和表达载体的比例，利用共转物以优化的比例接种Vero细胞后，可观察到细胞发生较为明显的CPE(细胞病变效应)融合病变，即病毒侵染Vero细胞后产生明显的细胞形态上的变化，并且以第一代拯救病毒为毒种感染Vero细胞后，间接免疫荧光检测结果显示Vero细胞中有部分细胞呈现阳性反应，可见绿色荧光，并且以第三代拯救病毒为毒种感染Vero细胞后，获得了同样的阳性结果，这证实所拯救的病毒获得了感染性，因此本发明获得了优异的病毒拯救效果。

3.本发明优选对pVAX1载体质粒进行构建，pVAX1的优点在于：本研究所用的转录载体和表达载体pVAX1是美国FDA认可的可应用于核酸疫苗的表达载体，其通过对pcDNA3.1载体的结构进行一系列的优化而获得，这些优化包括：1)去除了pcDNA3.1载体中对基因复制和对外源蛋白表达无关的序列，这样尽可能地降低了载体序列与人类基因的同源性，因此大大降低了与染色体整合的可能性；2)将pcDNA3.1载体上的氨苄抗性基因换成了卡那霉素抗性基因，这类抗生素不易引起人体过敏反应，更适宜各种哺乳动物细胞。此外，由于去除了pcDNA3.1上的一些结构序列，使得PVAX1载体比pcDNA3.1和其他载体更小、更利于转染入细胞。

4.本发明通过基因合成技术来实现对pVAX1载体质粒的突变改造，简化了拯救体系和流程，缩短了制备时间，适于研究、工业应用以及应急制备。

附图说明

图1为pVAXm-mvfull质粒的物理图谱；

图2为pVAXm-N质粒的物理图谱；

图3为pVAXm-P质粒的物理图谱；

图4为pVAXm-L质粒的物理图谱；

图5为示出在293T细胞、Vero细胞和BHK-21细胞中蛋白N(A)、P(B)、L(C)瞬时表达的结果图；

图6为示出利用本发明的一个实施例的共转染比例拯救获得的麻疹病毒感染细胞的免疫荧光结果图；

图7为示出采用本发明的组合物使麻疹病毒从cDNA获得感染性的过程的示意图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

副粘病毒科为一组不分节段的单负链RNA病毒，共分为两个亚科：副粘病毒亚科和肺病毒亚科。其中副粘病毒亚科由三个属组成：副粘病毒属、麻疹病毒属和腮腺炎病毒属。副粘病毒亚科的成员为球型有包膜病毒，基因组长约15.5kb，与同为RNA病毒的弹状病毒、丝状病毒一起构成单负链病毒家族(Mononegavirales)。副粘病毒均为单链RNA病毒，病毒得结构基因序列串联排列，各基因间均由基因间保守序列隔开，结构基因数目在不同病毒间有所差别，其中麻疹病毒为六个。基因组(-)RNA与病毒的结构蛋白(即核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)和RNA聚合酶蛋白(L))紧密结合，构成螺旋形核糖核蛋白(RNP)复合体。这种(-)RNP复合体即为病毒自然增殖过程中的复制和转录的模板。基因组3’端具有RNA聚合酶启动子，各结构基因间的非编码区具有停止信号(终止转录及腺苷酸化信号)及再启动信号，这样产生各结构基因的mRNA。在mRNA翻译并且翻译产物堆积到一定程度后，RNA聚合酶忽略基因间信号，从而复制出完整的RNP模板，造成通读(read-through)，从而产生全长的反基因组(+)RNP。通读的前提条件是新合成的N蛋白与新生的RNA链之间不断结合。(+)RNP反过来作为(-)RNP合成的模板。

对正链RNA病毒而言，无论是提供通过体外转录cDNA而获得的RNA，还是提供自身表达的来自DNA的RNA，其均可以自行产生感染性的后代，因为该病毒裸露的RNA本身即具有感染性。因此对正链RNA病毒而言，建立基于转录载体的反向遗传系统相对简单。而对负链RNA病毒而言，无论是基因组的负链(-)RNA，还是反基因组的正链(+)RNA，都不具有感染性。想要获得有功能的转录和复制的模板，(+)RNA还必须与三个或四个病毒蛋白结合，从而组成(+)RNP，其在相同的辅助蛋白的作用下复制成(-)RNP。(-)RNP一旦形成，其便可以作为病毒自然感染周期的起始模板，导致子代病毒产生。因此，拯救负链RNA病毒的关键是获得有功能的RNP。

在本文中，术语“拯救病毒”(或“病毒拯救”)是指，利用病毒的全长cDNA为模板，构建含有病毒全长cDNA的重组质粒，转染哺乳动物细胞，利用宿主的RNA聚合酶系统合成病毒RNA，并且使其具有感染性的过程。术语“感染性克隆”是指能够拯救病毒的遗传材料，一般为在体外转录载体中含有整个病毒基因组cDNA，或在辅助质粒的作用下，使该cDNA本身或者从该cDNA体外转录所得的RNA具有感染性。

本发明提供了一种用于拯救麻疹病毒的组合物，并在此基础上提供了一种拯救麻疹病毒的方法。本发明人对构建感染性克隆的载体质粒进行突变改造，使得麻疹病毒全基因组序列和/或结构蛋白N、P、L的编码序列能够被分别克隆入该改造好的载体质粒，并且获得进行病毒拯救的转录载体和表达载体。通过将上述转录载体和表达载体共转染入宿主细胞来拯救病毒(参见图7)。在共转染的过程中，本发明人经过大量的实验，优化了共转染转录载体和表达载体的比例，获得了优异的病毒拯救效果。

具体而言，本发明的一个方面提供了一种组合物，其至少包括一个含有麻疹病毒全基因组cDNA的转录载体和三种表达载体，所述三种表达载体分别为第一重组表达载体(含有麻疹病毒的核衣壳蛋白的编码基因)、第二重组表达载体(含有麻疹病毒的磷蛋白的编码基因)和第三重组表达载体(含有RNA聚合酶的编码基因)。

在本文中，术语“转录载体”是指，包含外源插入的核酸分子的载体，其仅能够使目的基因转录。术语“表达载体”是指，在转录载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，从而使目的基因能够表达的载体。术语“载体质粒”是指不包含外源插入的核酸分子的环状DNA分子。

优选地，转录载体、第一重组表达载体、第二重组表达载体、第三重组表达载体的比例范围为：(3.5～4)∶(1～1.5)∶(0.1)∶(0.2～1)。更优选地，转录载体、第一重组表达载体、第二重组表达载体、第三重组表达载体的比例为：4.0∶1.5∶0.1∶0.5。

优选地，需要将外源核酸分子插入载体质粒的多克隆位点，因此需要对所插入的核酸分子进行改造，包括在其5’端和3’端分别引入相应的酶切位点。

在本发明中，在转录载体和表达载体被转染入宿主细胞之后启动病毒的自我复制过程。优选地，本发明的麻疹病毒全基因组的5’端和3’端分别可包含具有自我剪切功能的核酶序列。这些核酶序列通过自我剪切而避免了在转录本两端具有多余的非病毒基因组序列，从而获得精确的麻疹病毒基因组转录本cDNA，进而利于病毒启动自我复制过程而并实现病毒拯救。

具有3’端自我剪切功能的核酶的例子包括发卡核酶、RNaseP、丁肝病毒核酶、锤头状核酶，其中优选为锤头状核酶。具有5’端自我剪切功能的核酶的例子包括发卡核酶、RNaseP、丁肝病毒核酶、锤头状核酶，其中优选为丁肝病毒核酶。

在本发明中，可以使用的转录载体的载体质粒的例子包括本领域中常用的载体质粒，例如pBluescript、pCI、pGEM、pUC119/118、pVAX1等)，其中优选为pVAX1。

在本发明中，可以使用的表达载体的载体质粒的例子包括本领域中常用的载体质粒，例如pCMV-script、pCI、pVAX 1、pcDNA3.1等，其中优选为pVAX1。pVAX1是美国FDA认可的可应用于核酸疫苗的表达载体，其通过对pcDNA3.1载体的结构进行一系列的优化而获得，这些优化包括：1)去除了pcDNA3.1载体中对基因复制和对外源蛋白表达无关的序列，这样尽可能地降低了载体序列与人类基因的同源性，因此大大降低了与染色体整合的可能性；2)将pcDNA3.1载体上的氨苄抗性基因换成了卡那霉素抗性基因，这类抗生素不易引起人体过敏反应，更适宜各种哺乳动物细胞。此外，由于去除了pcDNA3.1上的一些结构序列，使得PVAX1载体比pcDNA3.1和其他载体更小、更利于转染入细胞。

可以对载体质粒pVAX1的原有序列进行改造，将其第34位碱基T突变设计为G，第50位碱基A突变设计为T，从而消除MluI酶切位点和SpeI酶切位点，并且将其第725-730位碱基序列AGCTCG突变设计为ACGCGT，从而使该载体质粒的多克隆位点中具有Mlu I酶切位点。可以通过全基因合成来改造设计好的载体质粒序列，也可以通过本领域已知的其它常规方法(如设计引物以进行基因突变)来进行改造。

在本发明的一个实施方案中，重组转录载体具有如图1所示的pVAXm-mvfull质粒的物理图谱、第一重组表达载体具有如图2所示的pVAXm-N质粒的物理图谱、第二重组表达载体具有如图3所示的pVAXm-P质粒的物理图谱、并且/或者第三重组表达载体具有如图4所示的pVAXm-L质粒的物理图谱。

在一个优选实施方案中，所述重组转录载体包含转录框，其中包含的元件为：pUC复制起始子、CMV启动子、待转录基因序列和BGHpAz终止子。在另一个优选的具体实施方式中，该转录框在5′至3′方向上可操作地连接有：pUC复制起始子、CMV启动子、紧邻CMV启动子的锤头状核酶序列、麻疹病毒全基因组cDNA序列、丁型肝炎病毒核酶序列和BGHpAz终止子。

在一个优选实施方案中，第一重组表达载体包含表达框，其中包含的元件为：pUC复制起始子、CMV启动子、待表达基因序列和BGHpAz终止子。在另一个优选的具体实施方式中，该表达框在5′至3′方向上可操作地连接有：pUC复制起始子、CMV启动子、紧邻CMV启动子的核蛋白(N)DNA序列和BGHpAz终止子。

在一个优选实施方案中，第二重组表达载体包含表达框，其中包含的元件为：pUC复制起始子、CMV启动子、待表达基因序列和BGHpAz终止子。在另一个优选的具体实施方式中，该表达框在5′至3′方向上可操作地连接有：pUC复制起始子、CMV启动子、紧邻CMV启动子的磷蛋白(P)DNA序列和BGHpAz终止子。

在一个优选实施方案中，第三重组表达载体包含表达框，其中包含的元件为：pUC复制起始子、CMV启动子、待表达基因序列和BGHpAz终止子。在另一个优选的具体实施方式中，该表达框在5′至3′方向上可操作地连接有：pUC复制起始子、CMV启动子、紧邻CMV启动子的RNA聚合酶蛋白(L)DNA序列和BGHpAz终止子。

在本发明中，麻疹病毒可以为(例如)：中国麻疹疫苗株S191和中国麻疹疫苗株CC-47，其中优选为中国麻疹疫苗株S191。

本发明的另一个方面提供一种试剂盒，该试剂盒包含本发明的组合物。

在本发明的另一个方面中，本发明的组合物可以用于拯救麻疹病毒。更优选地，本发明的组合物可以用于制备麻疹疫苗。目前，我国还没有利用反向遗传技术来获得成功拯救的麻疹减毒病毒，进而利用其生产疫苗。本发明的组合物能够成功拯救麻疹病毒，并获得麻疹疫苗株(如S191)，进而填补国内在这方面的空白。

本发明的另一个方面提供了一种拯救麻疹病毒的方法，该方法包括：将本发明的组合物共转染入宿主细胞中，从而进行麻疹病毒的拯救。

为了实现本发明的目的，本发明人对载体质粒进行了突变改造，并构建了转录载体和三种表达载体(其中转录载体含有麻疹病毒全基因组cDNA，所述三种表达载体分别含有麻疹病毒的核衣壳蛋白的编码基因、磷蛋白的编码基因和RNA聚合酶的编码基因)。本发明人还筛选出了适合进行麻疹病毒拯救的宿主细胞，并将转录载体和表达载体共转染入筛选出的宿主细胞中，从而进行麻疹病毒的拯救，并检测了麻疹病毒的拯救。

优选地，这样进行宿主细胞的筛选：利用Western-Blot检测所述蛋白N、P和L在宿主细胞中的瞬时表达，如果能够成功表达N、P、L三种蛋白，则认为该宿主细胞适合进行麻疹病毒的拯救。

可以根据上述方法对本领域已知的细胞进行筛选，例如对293T细胞、Vero细胞和BHK-21细胞进行了筛选。本发明人发现，其中的293T细胞能够成功表达N、P两种蛋白。由于L蛋白的表达量小，因此利用目前的检测方法未能在上述三种细胞中检测到L蛋白的表达，但后续的对拯救麻疹病毒的检测实验证明293T细胞能够成功拯救该病毒，因此使用293T细胞作为宿主细胞。

在本文中，293T细胞是指人胚肾传代细胞；Vero细胞是指非洲绿猴肾传代细胞；BHK21细胞是指幼仓鼠肾传代细胞。

如上文所述，在拯救诸如麻疹病毒这样的单负链RNA病毒时，需要将包含麻疹病毒全基因组cDNA的转录载体和三种分别包含结构蛋白N、P和L的表达载体共转染入宿主细胞，这样病毒才能够在宿主细胞中完成复制和转录，进而产生感染性病毒颗粒，从而实现病毒的拯救。然而，在共转染过程中，通常需要摸索进行共转染的载体的比例，如果比例不合适，则不能够成功拯救病毒。如本领域的技术人员所公知的，摸索四种载体的合适的共转染比例是困难的，并且需要进行大量的试验。

可以采用常规的方法由拯救的麻疹病毒制备麻疹疫苗。例如用拯救的麻疹病毒与单细胞悬液混合的接种模式接种，病毒液的量与细胞悬液的量的比通常为1∶100～1∶200，选择无污染、形态正常的单层细胞，开启工作种子，以无菌方式取定量病毒液，加至配制完毕的细胞维持液中摇匀，以无菌方式开启细胞培养瓶，换以新鲜的含适量病毒的细胞维持液，加塞后置33℃继续培养至CPE达到“++”(用+表示细胞病变的程度，“+”表示轻度病变，“++”表示中度病变，“+++”表示重度病变)，弃旧维持液，洗涤细胞面，更换疫苗液，待CPE达到“+++”时，于2～8℃释放病毒，进而收获病毒。然后，可以将收获的麻疹病毒与可任选的可药用载体(如麻疹疫苗中常用的佐剂等)混合，制备成疫苗。

本发明所构建的组合物还可以应用于病毒载体的开发。已知，副粘病毒基因组能够容纳一定长度的外源基因，将外源基因插入病毒基因组中，并且使其具有能被病毒RNA聚合酶识别的起始和终止信号，这样便能够表达该基因。因此，在本发明的转录载体的麻疹病毒全基因组中插入目的病毒基因，例如表达目的病毒的表面抗原的基因，利用本发明的组合物在宿主细胞中进行病毒的拯救，由此便可以表达该病毒的表面抗原。该表面抗原在动物体内可诱导相应的体液免疫反应，由此，麻疹病毒载体有望用于重组疫苗的构建。

以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些实施例不应被理解为对本发明的保护范围的限制。

实施例

材料和方法：

除非另有说明，细胞培养采用生物学领域中的常规方法，所用细胞培养基为添加了10％胎牛血清(购自Sigma公司)的DMEM highglucose(购自Hyclone公司)培养基，使用前添加青霉素-链霉素双抗(其中青霉素的含量为10kU/ml，链霉素的含量为10mg/ml，在细胞培养液中推荐的青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml。)(购自Amresco公司)。细胞传代所用胰蛋白酶可购自GIBCO公司。在细胞培养箱(购自Thermo公司)中培养细胞(37℃，5％CO₂)。

实施例1：转录载体和表达载体的构建

1.核酸序列的突变改造

对载体质粒pVAX1(购自Invitrogen公司，具有CMV启动子)的原有序列进行改造，将其第34位碱基T突变设计为G，第50位碱基A突变设计为T，从而消除MluI酶切位点和SpeI酶切位点，并且将其第725-730位碱基序列AGCTCG突变设计为ACGCGT，从而使该载体质粒的多克隆位点中具有Mlu I酶切位点。合成改造设计好的载体质粒序列(由上海捷瑞生物工程有限公司进行)，将其命名为pVAXm。对该载体质粒序列进行测序鉴定(由Takara公司进行)，所得序列如序列表中的SEQ ID No.：1所示。

在麻疹病毒S191株的全基因组序列(NCBI编号：EU435017.1)的5’端和3’端分别设计引入锤头状核酶序列和丁肝病毒核酶序列，并且在锤头状核酶序列和丁肝病毒核酶序列的上游分别设计引入Mlu I酶切位点和Not I酶切位点，使麻疹病毒全基因组序列的5’端紧贴于载体的CMV启动子下游。将所述麻疹病毒全基因组序列第2101位碱基C突变设计为A，用作与母本病毒区别鉴定的遗传标签。合成设计改造好的麻疹病毒全基因组cDNA序列(由上海捷瑞生物工程有限公司进行)，对该序列进行测序鉴定(由Takara公司进行)，所得序列如序列表中的SEQ ID No.：2所示。

在麻疹病毒复制结构蛋白核衣壳蛋白N(175-1752)、磷蛋白P(1874-3397)和RNA聚合酶L(9301-15852)的核酸序列的5’端和3’端分别设计引入Mlu I酶切位点和Not I酶切位点。合成设计改造好的三种结构蛋白的核酸序列(由上海捷瑞生物工程有限公司进行)，对这些序列进行测序鉴定(由Takara公司进行)，所得序列如序列表中的SEQ ID No.：3、4、5所示。

测序结果显示，对上述核酸序列的突变改造成功。

2.转录载体和表达载体的构建

1)转录载体pVAXm-mvfull的构建

将1μl Mlu I(购自Takara公司)、1μl Not I(购自Takara公司)、1μl 10×H缓冲液(购自Takara公司)、2μl基因组cDNA和4.5μl去离子水加入Eppendorf管，在37℃水浴中酶切2小时。

将1μl Mlu I(购自Takara公司)、1μl Not I(购自Takara公司)、1μl 10×H缓冲液(购自Takara公司)、0.5μl载体质粒pVAXm和4.5μl去离子水加入Eppendorf管，在37℃水浴中酶切2小时。

将1μl酶切后的基因组cDNA和5μl载体质粒pVAXm，以及0.4μlT4连接酶(购自Takara公司)和1μl 10×缓冲液(购自Takara公司)加入Eppendorf管，在16℃下进行连接反应过夜。用PCR产物回收试剂盒(购自QIAGEN)回收连接产物，方法按照试剂盒提供的说明书进行。从而获得转录载体pVAXm-mvfull。对序列进行测序鉴定(由Takara公司进行)，所得序列如序列表中的SEQ ID No.：6所示。

2)表达载体pVAXm-N的构建

按照pVAXm-mvfull的构建方法进行表达载体pVAXm-N的构建，不同之处在于：Mlu I的量为0.5μl，Not I的量为0.5μl，所加入的DNA为2μl衣壳蛋白(N)的编码基因。连接反应时的载体质粒pVAXm的量为3μl，T4连接酶的量为0.3μl。对所得pVAXm-N的序列测序鉴定(由Takara公司进行)，所得序列如序列表中的SEQ ID No.：7所示。

(3)表达载体pVAXm-P的构建

按照pVAXm-mvfull的构建方法进行表达载体pVAXm-P的构建，不同之处在于：Mlu I的量为0.5μl，Not I的量为0.5μl，所加入的DNA为2μl磷蛋白(P)的编码基因。连接反应时，载体质粒pVAXm的量为3μl，T4连接酶的量为0.3μl。对所得pVAXm-P的序列测序鉴定(由Takara公司进行)，所得序列如序列表中的SEQ ID No.：8所示。

(4)表达载体pVAXm-L的构建

按照pVAXm-mvfull的构建方法进行表达载体pVAXm-L的构建，不同之处在于：Mlu I的量为0.5μl，Not I的量为0.5μl，所加入的DNA为4μl RNA聚合酶(L)的编码基因，去离子水的量为2.5μl。连接反应时，载体质粒pVAXm的量为3μl，T4连接酶的量为0.3μl。对所得pVAXm-L的序列测序鉴定(由Takara公司进行)，所得序列如序列表中的SEQ ID No.：9所示。

实施例2：筛选合适的宿主细胞

1.细胞转染

分别将Vero细胞(购自上海细胞资源中心)和293T细胞(购自上海细胞资源中心)进行1∶1传代培养，以5×10⁵个/孔的量将细胞铺于6孔板的孔中；将BHK-21细胞(购自上海细胞资源中心)进行1∶2传代培养，以5×10⁵个/孔的量将细胞铺于6孔板中。待六孔板中的细胞融合至密度为80-90％时，用三种表达载体pVAXm-N、pVAXm-P和pVAXm-L分别转染三种细胞系，方法如下：

溶液1：用240μl/孔无血清培养基稀释10μl/孔转染剂(lipofectamine 2000，可购自Invitrogen公司)，在室温下轻柔混匀5分钟；溶液2：用10μl/孔无血清培养基稀释4μg/孔表达载体；将溶液1与溶液2混合，在室温下置20分钟。与此同时，用无血清培养基冲洗6孔板中的细胞两次，之后加入2ml无血清培养基。将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入细胞培养孔中，轻轻混匀。在37℃、5％CO₂中培养5-6小时。6小时之后，将培养基更换为含有10％胎牛血清(购自Sigma公司)的DMEM完全培养基，在37℃、5％CO₂中培养48-72小时。

2.检测蛋白N、P和L的瞬时表达

利用Western-Blot检测蛋白的瞬时表达，方法与生物学领域中常规的Western-Blot方法相同。其中，运用Bio-rad半干电转系统，将蛋自质从SDS-PAGE胶中转到硝酸纤维素膜上，所用第一抗体为用封闭液(3％(w/v)的脱脂奶粉)稀释200倍的麻疹病毒免疫兔血清(稀释前为1mg/ml)，在室温下轻柔摇荡孵育1小时；第二抗体为用封闭液(3％(w/v)的脱脂奶粉)稀释10000倍的抗兔抗体(稀释前为100μg/ml，辣根过氧化物酶标记)，在室温下轻柔摇荡孵育1小时。用5ml与第二抗体作用的显色液TMB(购自sigma公司)处理之后，观察分析所显示的蛋白条带，结果如图5所显示。

由图5可知，蛋白N、P在293T细胞中成功表达，其中磷蛋白P(54KD)的泳动速度慢于核衣壳蛋白N(58KD)的泳动速度，这可能由磷酸化修饰或者糖基化修饰所导致。在Vero细胞和BHK21细胞中未见核衣壳蛋白N和磷蛋白P蛋白的表达。而在三种细胞中都未观察到蛋白L的表达，这可能由其表达量极低而检测方法无法检测，最终共转染体系的成功也间接证实了蛋白L的表达导致。

实施例3：麻疹病毒的拯救

1.共转染

将经过消毒的盖玻片放入六孔培养板的孔中，之后加入2mloptimem(可购自GIBCO公司)培养基，并且以8×10⁵个/孔的量将293T细胞铺于6孔板的孔中，在37℃、5体积％CO₂中培养过夜。之后，用上述构建好的转录载体和三种表达载体共转染细胞，方法如下：

将转染剂(lipofectamine 2000，可购自Invitrogen公司)混匀后，吸取10μl/孔，用100μl optimem(GIBCO)培养基稀释，室温静置5分钟。之后，用100μl optimem(GIBCO)培养基稀释四种载体，四种载体的比例见表1(组1-11)，将其与上述稀释好的转染剂混匀之后于室温静置20分钟。将500μl/孔的上述混合物逐滴加入细胞培养孔中，混匀。在37℃、5体积％CO₂中培养8小时。将培养基更换为DMEM完全培养基，继续培养36小时。在本实施例中设置未转染转录载体和表达载体的阴性对照(对照组)。

由于对细胞进行共转染是以脂质体的方式进行的，因此不同分子量的质粒进入细胞的量和速度差异较大，相对分子量越小越容易转染入细胞。pVAXm-mvfull的分子量最大，因此共转染的量应最大以增加进入细胞的机会。pVAXm-L的分子量次之，其它两种质粒的分子量更次之。在整个拯救体系中，病毒转录过程中所需要的RNA聚合酶的量极少，因此pVAXm-L的量应为最小，但因其表达量极少，共转染时需适当提高其转染用量。共转染后，根据细胞的CPE融合病变的程度和免疫荧光实验的荧光强度可以确定能够成功拯救病毒的四种质粒的比例。

2.检测麻疹病毒的拯救

分别对对照组和下表1中的各组进行免疫荧光检测。当293T细胞在盖片上生长融合至密度为95-100％时，将其从培养箱中取出。用预温的1×PBS(8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L)洗细胞3次，每次5分钟。用丙酮低温固定20-30分钟，之后按相同的方法进行清洗。用0.5体积％的Triton X-100的PBS溶液透化2-5分钟，之后按相同的方法进行清洗。加入5％(w/v)BSA的PBS溶液，室温封闭30分钟，之后加入用1％(w/v)BSA的PBS溶液稀释1000倍的作为第一抗体的麻疹病毒免疫兔血清(稀释前1mg/ml)，置于湿盒中孵育过夜。按相同的方法进行清洗，每次10分钟。加入用1％(w/v)BSA的PBS溶液稀释1500倍的作为第二抗体的抗兔抗体(FITC标记)(稀释前100ug/ml)，在37℃下避光孵育30分钟。按相同的方法进行清洗，每次10分钟。之后用95体积％的甘油封片。

免疫荧光结果显示，在对照组细胞中未见绿色荧光，而与对照组相比，在以组5、组7和组8的比例共转染的293T细胞中可见绿色荧光，这表明本发明成功拯救出了麻疹病毒，并且能够成功拯救麻疹病毒的四种质粒的比例范围为(3.5～4)∶(1～1.5)∶(0.1)∶(0.2～1)。最佳的共转染比例是4.0∶1.5∶0.1∶0.5。将各个共转染比例和拯救结果总结在下表1中。

表1：转录载体pVAXm-mvfull及表达载体pVAXm-N、pVAXm-P和pVAXm-L的共转染比例

实施例4：所拯救的麻疹病毒的感染性检测

1.免疫荧光检测

为了检测拯救出的麻疹病毒是否具有感染性，即能否在宿主细胞中传代，收集共转染后出现典型CPE融合病变效应的293T细胞，将其直接接种于Vero细胞中，共培养4天，待细胞出现典型的CPE融合病变后，用胰酶(购自GIBICO公司)消化细胞并收集，反复冻融，在4℃、12000rpm下离心10分钟，收集上清，其中所含的病毒为拯救的第1代病毒。将100ul上述上清接种于培养的Vero细胞中，培养4天，按照相同的方法收集上清，其中的病毒为拯救的第2代病毒，如此反复传10代。当接种第10代拯救病毒的Vero细胞在盖片上生长融合至密度为80-90％时，按照上述免疫荧光检测方法检测麻疹病毒的感染性。结果如图6所显示。

结果显示Vero细胞中有部分细胞呈现阳性反应，可见绿色荧光，这表明存在麻疹病毒的蛋白抗原成分。以第三代拯救病毒为毒种感染Vero细胞获得同样的阳性结果，这说明成功获得了感染性病毒。

2.RT-PCR鉴定

用1ml注射用水溶解市售冻干麻疹疫苗(购自北京天坛生物股份有限公司)，取50ul接种长满T25细胞培养瓶的Vero细胞，此为阳性对照组。

(1)总RNA的提取

将长满T25细胞培养瓶的广泛病变染毒(拯救的第1代病毒)Vero细胞(实验组)和上述阳性对照Vero细胞(对照组)分别收集于Eppendorf管中，各加入1ml Trizol Reagent(购自Invitrogen公司)，反复摇匀，直至细胞碎块完全裂解。必要时，可加入少许Trizol。将上述Eppendorf管分别置于0℃30-60分钟，之后向其中各加入0.2ml氯仿，反复振荡摇匀，室温静置10分钟。在4℃，12000rpm的转速下离心10分钟。小心吸取上层水相，分别置于另一新的无菌Eppendorf管中，各加入0.7倍体积的异丙醇，4℃放置30分钟。之后，在4℃，12000rpm的转速下离心10分钟。弃去上清，分别用溶于无RNA酶的去离子水的75％乙醇清洗，以15000rpm离心5分钟，重复此步操作1次。弃去上清，在室温下自然干燥8-10分钟。分别用50μl无RNA酶的纯水重悬，保存于-70℃。

(2)逆转录合成cDNA

使用SUPERSCRIPT II 1ST STRAND第1链cDNA合成试剂盒(购自Invitrogen公司)对所提取的实验组RNA和对照组RNA分别进行逆转录。取5μl所提取的总RNA，加入上游和下游随机引物各1μl(100pM，上海捷瑞生物工程有限公司合成)，加入5μl DEPC水，使总体积达到12μl。将该体系置于95℃下，持续10分钟，之后置于冰浴中，持续至少1分钟。之后加入以下物质，这些物质均为上述试剂盒提供：2μl 10×PCR缓冲液、2μl 25mM MgCl₂、1μl 10mM dNTPmix和2μl 0.1M DTT。将Eppendorf管置于42℃下5分钟，加入1μlSuperScript II RT，轻柔混匀，在42℃下放置50分钟，之后在70℃下放置15分钟，加入1μl RNaseH，轻柔混匀，在37℃下放置20分钟。将产物保存于-20℃。

(3)聚合酶链式反应(以下简称PCR)扩增

分别向实验组和对照组的Eppendorf管中加入32μl高压去离子水、5μl 10×PCR缓冲液(购自Takara公司)、4μl 25mM MgCl₂(购自Takara公司)、6μl 10mM dNTP(购自Takara公司)、上游和下游引物(100pM，上海捷瑞生物工程有限公司合成)各1μl和1μl cDNA模板。其中上游引物序列为：CATCCACTCCCACGATTG(1840-1858)(SEQ ID No.：10)，下游引物序列为：CCCTCGGTATCAGGTTCG(2332-2350)(SEQ ID No.：11)。对拯救获得的麻疹病毒和阳性对照麻疹病毒分别进行PCR反应。对扩增产物进行测序(Takara公司)。

测序结果显示，在拯救获得的麻疹病毒中，第2101位碱基C突变成为A。这进一步证明了拯救获得的麻疹病毒具有感染性。

Claims (8)

1.一种用于拯救麻疹病毒（measles virus）的组合物，该组合物由以下物质组成：

1）重组转录载体，其含有麻疹病毒全基因组cDNA，其中所述麻疹病毒全基因组的5’端和3’端分别包含具有自我剪切功能的核酶序列；

2）第一重组表达载体，其含有麻疹病毒的核衣壳蛋白的编码基因；

3）第二重组表达载体，其含有麻疹病毒的磷蛋白的编码基因；和

4）第三重组表达载体，其含有麻疹病毒的RNA聚合酶的编码基因，

其中所述重组转录载体具有如图1所示的pVAXm-mvfull质粒的物理图谱、所述第一重组表达载体具有如图2所示的pVAXm-N质粒的物理图谱、所述第二重组表达载体具有如图3所示的pVAXm-P质粒的物理图谱、并且所述第三重组表达载体具有如图4所示的pVAXm-L质粒的物理图谱；并且

所述转录载体、所述第一重组表达载体、所述第二重组表达载体、所述第三重组表达载体的比例范围为：(3.5～4):(1～1.5):(0.1):(0.2～1)。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述5’端的具有自我剪切功能的核酶序列为锤头状核酶序列，并且所述3’端的具有自我剪切功能的核酶序列为丁肝病毒核酶序列。

3.根据权利要求1所述的组合物，所述麻疹病毒为中国麻疹疫苗株S191。

4.一种试剂盒，该试剂盒包含根据权利要求1至3中任意一项所述的组合物。

5.根据权利要求1至3中任意一项所述的组合物在拯救麻疹病毒中的用途。

6.根据权利要求1至3中任意一项所述的组合物在制备麻疹疫苗中的用途。

7.一种拯救麻疹病毒的方法，该方法包括：将根据权利要求1至3中任意一项所述的组合物共转染入宿主细胞中，从而进行麻疹病毒的拯救。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的宿主细胞为293T细胞。