BRPI0312173B1 - Vetor e processo para a preparação de partículas infecciosas de vírus do sarampo - Google Patents
Vetor e processo para a preparação de partículas infecciosas de vírus do sarampo Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0312173B1 BRPI0312173B1 BRPI0312173-9A BR0312173A BRPI0312173B1 BR PI0312173 B1 BRPI0312173 B1 BR PI0312173B1 BR 0312173 A BR0312173 A BR 0312173A BR PI0312173 B1 BRPI0312173 B1 BR PI0312173B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- virus
- cells
- vector
- schwarz
- cdna
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 48
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 41
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 89
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 25
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 claims abstract description 138
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 94
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 96
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 77
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 38
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 31
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 18
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 18
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 16
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 16
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 11
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 claims description 10
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 9
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 7
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 4
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 claims description 4
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 claims description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 claims description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 3
- 238000000682 scanning probe acoustic microscopy Methods 0.000 claims description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 3
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 68
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 68
- 241000711513 Mononegavirales Species 0.000 abstract description 3
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 32
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 26
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 23
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 20
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 18
- 101000961414 Homo sapiens Membrane cofactor protein Proteins 0.000 description 17
- 102100039373 Membrane cofactor protein Human genes 0.000 description 15
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 14
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 12
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 12
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 9
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 9
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 8
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 8
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 5
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 5
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 101710160621 Fusion glycoprotein F0 Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 229940041323 measles vaccine Drugs 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 3
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 3
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 3
- 108091080980 Hepatitis delta virus ribozyme Proteins 0.000 description 3
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 3
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001102 Hammerhead ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 2
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000011053 TCID50 method Methods 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- -1 DNA Chemical class 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 238000011771 FVB mouse Methods 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000007438 Interferon alpha-beta Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010086140 Interferon alpha-beta Receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000274177 Juniperus sabina Species 0.000 description 1
- 101150062031 L gene Proteins 0.000 description 1
- 229940124862 Measles virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102000050019 Membrane Cofactor Human genes 0.000 description 1
- 101710146216 Membrane cofactor protein Proteins 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102100036546 Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2 Human genes 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 101900186544 Sendai virus C' protein Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529934 Simian T-lymphotropic virus 3 Species 0.000 description 1
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000039634 Untranslated RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004417 Untranslated RNA Proteins 0.000 description 1
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical class O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108010059722 Viral Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000009215 host defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 102000044446 human CD46 Human genes 0.000 description 1
- 229940040731 human interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000011809 primate model Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical class CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000022846 transcriptional attenuation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
- A61K39/165—Mumps or measles virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
- C07K14/12—Mumps virus; Measles virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
- C12N2760/18421—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
- C12N2760/18422—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
- C12N2760/18434—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
- C12N2760/18441—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/18443—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10211—Podoviridae
- C12N2795/10241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2795/10243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
"molécula de cdna, molécula e seqüência de cdna recombinante, vetor, processo de preparação de partículas de vírus do sarampo infeccioso, composição imunogênica, composição de vacina e vírus mononegaviral recombinante". a presente invenção refere-se a uma molécula de cdna que codifica a seqüência de nucleotídeos da fita de (+) rna antigenômica de comprimento total de um vírus do sarampo (mv) que se origina de uma linhagem de vacina aprovada. ela também se refere à preparação de composições imunogênicas utilizando o mencionado cdna.
Description
“VETOR E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PARTÍCULAS INFECCIOSAS DE VÍRUS DO SARAMPO”
Antecedentes da Invenção [001] O vírus do sarampo é um membro da ordem Mononegavirales, ou seja, vírus com genoma de RNA de fita negativa não segmentado. O genoma não segmentado do vírus do sarampo (“measles virus” - MV) possui polaridade antimensagens que resulta em RNA genômico que não é traduzido, seja in vivo ou in vitro, nem infeccioso quando purificado.
[002] A transcrição e a replicação de RNA viral de fita negativa não-segmentada e seu agrupamento como partículas virais foram estudadas e relatadas, especialmente em Fields Virology (terceira edição, vol. 1, 1996, Lippincott - Raven Publishers - Fields BN et al.). A transcrição e a replicação de vírus do sarampo não envolvem o núcleo das células infectadas, mas ocorrem no citoplasma de ditas células infectadas. O genoma do vírus do sarampo compreende genes que codificam 6 proteínas estruturais principais dos 6 genes (denominados N, P, M, F, H e L) e 2 proteínas não-estruturais adicionais do gene P. A ordem do gene é a seguinte: 3', N, P (incluindo C e V), M, F, H e L grande proteína polimerase na extremidade 5'. O genoma compreende, adicionalmente, regiões não-codificantes na região intergênica M/F; esta região não-codificante contém cerca de 1.000 nucleotídeos de RNA não-traduzido. Os ditos genes codificam, respectivamente, o peptídeo líder (gene I), as proteínas do nucleocapsídeo do vírus, ou seja, a nucleoproteína (N), a fosfoproteína (P) e a proteína grande (L) que são agrupadas em torno do RNA genômico para fornecer o nucleocapsídeo. Os demais genes codificam as proteínas de envelope viral, que incluem as proteínas hemaglutinina (H), de fusão (F) e de matriz (M).
[003] O vírus do sarampo foi isolado e vacinas vivas atenuadas foram derivadas do MV Edmonston isolado em 1954 (Enders, J. F. e T. C.
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 16/86
2/44
Peebles, 1954, “Propagation in Tissue Cultures of Cytopathogenic Agents from Patients with Measles”, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 277-286), por meio de passagens em série realizadas em células primárias humanas de âmnio ou rim. As linhagens utilizadas foram adaptadas em seguida para fibroblastos de embriões de galinhas (FEG) para produzir sementes Edmonston A e B (Griffin, D. e W. Bellini, 1996, Measles Virus, págs. 1267-1312, em B. Fields, D. Knipe et al. (ed.), Virology, vol. 2, Lippincott - Raven Publishers, Filadélfia, Estados Unidos). Edmonston B foi licenciada em 1963 como a primeira vacina MV. Passagens adicionais de Edmonston A e B sobre FEG produziram vírus Schwarz e Moraten mais atenuados (Griffin, D. e W. Bellini, 1996, Measles Virus, págs. 1267-1312, em B. Fields, D. Knipe et al. (ed.), Virology, vol. 2, Lippincott - Raven Publishers, Filadélfia, Estados Unidos), cujas seqüências se mostraram, recentemente, idênticas (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu e S. A. Udem. 2001. “Analysis of the Noncoding Regions of Measles Virus Strains in the Edmonston Vaccine Lineage”, J. Virol. 75: 921933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu e S. A. Udem. 2001. “Comparison of Predicted Amino Acid Sequences of Measles Virus Strains in the Edmonston Vaccine Lineage”, J. Virol. 75: 910-920). Como a vacina Edmonston B era reatogênica, ela foi abandonada em 1975 e substituída pela vacina Schwarz/Moraten que é, atualmente, a vacina contra sarampo mais amplamente utilizada no mundo (Hilleman, M., 2002, “Current Overview of the Pathogenesis and Prophylaxis of Measles with Focus on Practical Implications”, Vaccine, 20: 651-665). Também foram utilizadas diversas outras linhagens de vacinas: AIK-C, Schwarz F88, CAM70, TD97 no Japão, Leningrad-16 na Rússia e Edmonston Zagreb. As linhagens chinesas CAM70 e TD97 não foram derivadas de Edmonston. As vacinas Schwarz/Moraten e AIK-C são produzidas sobre FEG. A vacina de Zagreg é produzida em células humanas diploides (WI-38).
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 17/86
3/44 [004] A vacina viva atenuada derivada da linhagem Schwarz é comercializada pela Aventis Pasteur (Lyon, França) com a marca comercial Rouvax®.
[005] Em um trabalho notável e pioneiro, Martin Billeter e seus colaboradores clonaram um cDNA infeccioso correspondente ao antigenoma de MV de Edmonston e estabeleceram um procedimento genético reverso original e eficiente para resgatar o vírus correspondente (Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Dotsch, G. Christiansen e M. Billeter., 1995, “Rescue of Measles Viruses from Cloned DNA”, EMBO Journal, 14: 5773-5784 e WO 97/06270, incorporados ao presente como referência).
[006] Entretanto, a comparação de sequências (vide abaixo) revelou que o genoma clonado neste vetor divergiu da sequência de Edmonston
B. Dito genoma estava mais próximo de Edmonston-wt, uma passagem anterior nas células Vero (células de rim de macaco verde africano) de Edmonston isolado (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu e S. A. Udem. 2001. “Analysis of the Noncoding Regions of Measles Virus Strains in the Edmonston Vaccine Lineage”, J. Virol. 75: 921-933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu e S. A. Udem. 2001. “Comparison of Predicted Amino Acid Sequences of Measles Virus Strains in the Edmonston Vaccine Lineage”, J. Virol. 75: 910-920) e continha 10 substituições de aminoácidos não relacionadas aos subgrupos de Edmonston. Além disso, apesar do fato deste vetor ser imunogênico em camundongos que expressam CD46 e não conter o receptor de IFN do tipo I (19), os inventores demonstram na presente invenção que dito vetor não é imunogênico em primatas não-humanos quando inoculado em dose padrão de TCID50 a 104. Portanto, este vetor desenvolveu-se a partir de uma linhagem de vacinas abandonada há 25 anos e cuja sequência divergiu muito, não sendo aparentemente apropriada como vetor de vacinação,
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 18/86
4/44 especialmente em humanos, embora certamente ajude a compreender alguns aspectos da replicação do MV.
[007] Por estas razões, os inventores decidiram que um vetor de sarampo destinado às crianças deve ser desenvolvido a partir de uma linhagem de vacina aprovada e, consequentemente, clonaram um cDNA infeccioso a partir de partículas virais da linhagem Schwarz/Moraten de vírus do sarampo amplamente utilizada. Este cDNA pode permitir a produção de estoques de vacina Schwarz/Moraten sem depender da disponibilidade de estoques de sementes. Dito cDNA pode também ser utilizado como vetor de vacinação recombinante baseado em uma linhagem de vacinas eficiente e aprovada, cultivada em FEG por razões de segurança, e utilizada em todo o mundo. O dito vetor pode também ser de interesse para populações adultas em determinadas circunstâncias onde exista necessidade.
Descrição da Invenção [008] A presente invenção refere-se a uma molécula de cDNA que codifica a sequência de nucleotídeos do RNA de fita positiva antigênica de comprimento total do vírus do sarampo (MV) originada de uma linhagem de vacina aprovada.
[009] A expressão “codifica” na definição acima engloba a capacidade do cDNA de permitir a transcrição do RNA de fita positiva antigênica de comprimento total, em que o dito cDNA serve, especialmente, de modelo para transcrição. Conseqüentemente, quando o cDNA for uma molécula de fita dupla, uma das fitas contém a mesma sequência de nucleotídeos do RNA de fita positiva antigênica do vírus do sarampo, exceto pelo fato dos nucleotídeos uracilas (“U”) serem substituídos por timinas (“T”) no cDNA.
[010] A Figura 5 ilustra a sequência de uma molécula de DNA de acordo com a presente invenção que compreende uma sequência de cDNA
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 19/86
5/44 conforme definido acima, especificando-se que a fita do cDNA representado é idêntica à fita de RNA positiva antigênica de uma linhagem do MV, exceto pela substituição de “U” por “T”.
[011] A molécula de cDNA de acordo com a definição acima permite a produção, quando colocada em condições apropriadas, de um RNA infeccioso de fita positiva antigênica capaz de produzir partículas infecciosas do vírus do sarampo.
[012] O cDNA obtido contém especialmente as extremidades 5' e 3' originais da fita positiva antigênica nativa do RNA viral. Além disso, o cDNA obtido está de acordo com a regra de 6 que é necessária para expressar partículas virais infecciosas.
[013] A “regra de 6” é expressa pelo fato da quantidade total de nucleotídeos presentes no cDNA representar um múltiplo de 6, dita regra permite replicação suficiente de RNA do genoma do vírus do sarampo. A dita regra foi descrita na referência citada acima, Fields Virology, na pág. 1197.
[014] A molécula de cDNA de acordo com a presente invenção, que é derivada de uma linhagem de vacina aprovada de MV, pode ser obtida a partir da linhagem Schwarz ou Moraten.
[015] Ditas linhagens foram descritas em várias publicações e utilizadas na preparação das vacinas utilizadas atualmente. Os inventores propõem especialmente o uso da linhagem Schwarz, disponível pela Aventis Pasteur (França).
[016] De acordo com outra realização particular da presente invenção, a molécula de cDNA é colocada sob controle de uma sequência de controle de expressão heteróloga.
[017] A inserção desse controle para a expressão do cDNA é favorável quando a expressão deste cDNA é procurada em tipos celulares que
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 20/86
6/44 não permitem a transcrição completa do cDNA com as suas sequências de controle nativas.
[018] De acordo com uma realização particular da presente invenção, a sequência de controle de expressão heteróloga compreende a sequência promotora T7 e a sequência terminal T7. Estas sequências estão localizadas, respectivamente, em 5' e 3' da sequência codificadora da fita de RNA positiva antigênica do MV e das sequências adjacentes em torno da dita sequência codificadora.
[019] Em uma realização específica da presente invenção, a molécula de cDNA definida acima é modificada, ou seja, compreende sequências de nucleotídeos adicionais ou unidades, ou compreende deleções ou substituições no dito cDNA.
[020] Em uma realização preferida, a molécula de cDNA de acordo com a presente invenção compreende adicionalmente, na sua extremidade 5', adjacente ao primeiro nucleotídeo da sequência de nucleotídeos codificadora da fita de RNA positiva antigênica de comprimento total da linhagem de vacina MV aprovada, uma unidade GGG seguida por uma sequência de ribozima com estrutura do tipo cabeça de martelo e que compreende, na sua extremidade 3', adjacente ao último nucleotídeo da dita sequência de nucleotídeos codificadora da fita de RNA positiva antigênica de comprimento total, a sequência de uma ribozima. A ribozima de vírus da hepatite delta (δ) é apropriada para a realização da presente invenção.
[021] A unidade GGG colocada na extremidade 5', adjacente ao primeiro nucleotídeo da sequência codificadora acima, aumenta a eficiência da transcrição da dita sequência codificadora de cDNA. Como exigência para o agrupamento apropriado de partículas de vírus do sarampo, encontra-se o fato de que o cDNA que codifica o RNA positivo antigênico cumpra com a regra de 6, quando a unidade GGG for adicionada, uma ribozima também é
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 21/86
7/44 adicionada na extremidade 5' da sequência codificadora do cDNA, 3' da unidade GGG, a fim de permitir a clivagem do transcrito no primeiro nucleotídeo codificador da fita de RNA positiva antigênica de comprimento total de MV.
[022] Desta forma, no caso da unidade GGG ser adicionada para aumentar a eficiência da transcrição, 2 ribozimas são adicionadas a fim de garantir a clivagem da sequência codificadora da fita de RNA positiva antigênica de comprimento total de MV.
[023] De acordo com a presente invenção, a expressão “cDNA” engloba uma molécula de DNA obtida por meio de transcrição reversa de uma molécula de RNA, incluindo mas sem limitar-se a uma molécula de mRNA.
[024] Pode ser utilizada qualquer outra técnica de preparação de DNA, a partir do material descrito na presente invenção ou utilizando as características descritas relacionadas ao cDNA de acordo com a presente invenção, incluindo técnicas que envolvam síntese ou PCR.
[025] Portanto, a expressão “cDNA” utilizada para a descrição da sequência de nucleotídeos da molécula de acordo com a presente invenção meramente refere-se ao fato de que originalmente a dita molécula é obtida por meio da transcrição reversa da fita de RNA negativa genômica de comprimento total do genoma de partículas virais do vírus do sarampo. Isso não deverá ser observado como limitação para os métodos utilizados para a sua preparação. Ácidos nucléicos purificados, incluindo DNA, são englobados, portanto, no significado de cDNA de acordo com a presente invenção, desde que o dito ácido nucléico, especialmente DNA, satisfaça as definições fornecidas acima.
[026] A presente invenção refere-se ainda a uma molécula de cDNA, de acordo com uma das definições acima, compreendida em um plasmídeo capaz de replicação.
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 22/86
8/44 [027] Muitos plasmídeos podem ser preparados a fim de satisfazer as necessidades da presente invenção e a presente invenção referese especialmente ao plasmídeo pTM-MVSchw representado na Figura 2.
[028] O plasmídeo pTM-MVSchw foi depositado na CNCM (Paris, França) em 12 de junho de 2002 com o número I-2889. Este plasmídeo é descrito nos exemplos e figuras a seguir. O plasmídeo pTM-MVSchw é um vetor derivado do Bluescript, que compreende a sequência de comprimento total que codifica o vírus do sarampo, linhagem Schwarz, colocado sob o controle do promotor da T7 RNA polimerase; o seu tamanho é de 18.967 nucleotídeos.
[029] A presente invenção também se refere, especialmente, a uma molécula de cDNA que é capaz de produzir partículas virais infecciosas da linhagem de vacina aprovada de MV, utilizando-se, preferencialmente, o sistema de recuperação relatado anteriormente que envolve células auxiliares 293-3-46 (Radecke et al e WO 97/06270), células auxiliares 293-3-46 que expressam proteínas necessárias para a transcrição e replicação da sequência genômica de RNA do MV do dito cDNA e em condições que permitam o agrupamento das partículas virais.
[030] As células 293-3-46 são citadas como exemplo para a preparação das partículas virais. Elas podem, entretanto, ser substituídas por qualquer outra linhagem celular apropriada para compor células auxiliares.
[031] Métodos para a produção dessas partículas infecciosas são fornecidos nos exemplos da presente invenção.
[032] As moléculas de cDNA particularmente preferidas de acordo com a presente invenção são as moléculas que possuem uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências:
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 23/86
9/44
- molécula de cDNA que compreende a sequência de nucleotídeos que se estende do nucleotídeo 83 ao nucleotídeo 15.977 da sequência representada na figura 5;
- molécula de cDNA que compreende a sequência de nucleotídeos que se estende do nucleotídeo 29 ao nucleotídeo 16.202 da sequência representada na figura 5;
- molécula de cDNA que compreende a sequência de nucleotídeos que se estende do nucleotídeo 26 até o nucleotídeo 16.202 da sequência representada na figura 5;
- molécula de cDNA que compreende a sequência de nucleotídeos que se estende do nucleotídeo 9 ao nucleotídeo 16.202 da sequência representada na figura 5;
- molécula de cDNA que compreende a sequência de nucleotídeos que se estende do nucleotídeo 29 ao nucleotídeo 15.977 da sequência representada na figura 5;
- molécula de cDNA que compreende a sequência de nucleotídeos que se estende do nucleotídeo 26 ao nucleotídeo 15.977 da sequência representada na figura 5; e
- molécula de cDNA que compreende a sequência de nucleotídeos que se estende do nucleotídeo 9 ao nucleotídeo 15.977 da sequência representada na figura 5.
[033] A presente invenção naturalmente se refere a cada uma das sequências específicas descritas acima.
[034] Uma molécula de cDNA específica preferida para a realização da presente invenção é a molécula que compreende o inserto contido no plasmídeo pTM-MVSchw depositado na CNCM com número I-2889, em que o dito inserto codifica a sequência de nucleotídeos da fita de RNA positiva antigênica de comprimento total do vírus do sarampo. Um inserto
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 24/86
10/44 específico é aquele compreendido na sequência definida pelos seguintes sítios de restrição: NotI (localizado na posição 1 na figura 5) e NotI (localizado na posição 16.203 na figura 5).
[035] Em uma realização particular da presente invenção, a molécula de cDNA é o produto da transcrição reversa do RNA viral purificado a partir de partículas virais do vírus do sarampo.
[036] A preparação do cDNA a partir de RNA viral purificado limita, vantajosamente, a presença de componentes celulares e especialmente RNA ou DNA celular que poderão estar presentes em células utilizadas para o cultivo do vírus. Dita preparação limita especialmente a presença de RNA genômico viral que seria incompleto ou mutado e que está presente em células e limita a presença de mRNA viral presente em grandes quantidades nas células.
[037] A presente invenção refere-se ainda a uma molécula de cDNA que possui as características definidas acima, capaz de induzir uma resposta imunológica contra pelo menos um antígeno de um vírus do sarampo, quando administrada in vivo.
[038] A presente invenção também se refere a um vírus Mononegavirales recombinante que compreende a molécula de cDNA de um vírus do sarampo de acordo com uma das definições acima e uma sequência de DNA de um vírus de RNA, em que o vírus recombinante é capaz de desencadear, in vivo, uma resposta humoral e/ou celular contra o vírus do sarampo ou contra o dito vírus de RNA, ou contra o vírus do sarampo e o vírus de RNA.
[039] A presente invenção trata ainda de uma molécula de cDNA recombinante conforme definida acima, que compreende adicionalmente uma sequência de DNA heteróloga nela clonada em condições que permitam sua expressão como uma sequência de aminoácidos heteróloga, em que a dita
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 25/86
11/44 clonagem é realizada de tal forma que o cDNA recombinante obtido satisfaça a regra de 6.
[040] Sequências codificadoras heterólogas, especialmente sequências de DNA, são vantajosamente selecionadas dentre sequências capazes de expressar antígenos ou epítopos de antígenos, que possuem propriedades imunogênicas e especialmente que possuem a capacidade de permitir ou favorecer uma resposta imunogênica em hospedeiro no qual foram administradas. As ditas sequências de DNA heterólogas podem ser derivadas, por exemplo, a partir de antígenos de patógenos.
[041] A presente invenção vantajosamente permite a inserção dessas sequências heterólogas de DNA em uma sequência denominada Unidade de Transcrição Adicional (ATU), especialmente uma ATU conforme descrita por Billeter et al. no documento WO 97/06270.
[042] Dita ATU encontra-se especialmente representada na Figura 4.
[043] Quando utilizada para a realização da presente invenção, a ATU encontra-se vantajosamente localizada na sequência N-terminal da molécula de cDNA que codifica a fita de RNA positiva antigênica de comprimento total de MV e encontra-se, particularmente, localizada entre os genes P e M deste vírus ou entre os genes H e L. Observou-se que a transcrição do RNA viral de MV segue um gradiente que vai da extremidade 5' à extremidade 3'. Isso explica que, quando inserida na extremidade 5' da sequência codificadora do cDNA, a ATU permitirá uma expressão mais eficiente da sequência de DNA heteróloga que a contém.
[044] A presente invenção refere-se também a um vetor que compreende uma molécula de cDNA conforme definido acima, que inclui um cDNA recombinante. Um vetor específico é o vetor para clonagem e/ou expressão desse cDNA.
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 26/86
12/44 [045] De acordo com uma realização preferida da presente invenção, o vetor é um plasmídeo, particularmente, pTM-MVSchw depositado na CNCM em 12 de junho de 2002 com número I-2889.
[046] Outros vetores, denominado pTM-MVSchw2-gfp depositado na CNCM com número I-2890 em 12 de junho de 2002, ou denominado pTM-MVSchw2-GFPbis depositado na CNCM com número I-3034 em 26 de maio de 2003, são englobados pela presente invenção.
[047] Ditos vetores são derivados de pTM-MVSchw e são conseqüentemente plasmídeos vetores derivados de Bluescript, que compreendem a sequência de comprimento total codificadora para o vírus do sarampo, linhagem Schwarz, colocada sob o controle do promotor da T7 RNA polimerase, e que contêm adicionalmente o gene gfp que codifica a proteína GFP, o dito gene sendo inserido em uma ATU na posição 2 (ou seja, entre os genes N e P do MV).
[048] O tamanho de pTM-MvSchw é de 18.967 nucleotídeos. O tamanho de pTM-MVSchw2-gfp é de 19.800 nucleotídeos.
[049] A diferença entre pTM-MVSchw2-gfp e pTM-MVSchw2GFPbis corresponde a uma mutação na sequência ATU em que um nucleotídeo C é substituído conforme ilustrado na Figura 4B no final da ATU, para fornecer pTM-MVSchw2-GFPbis.
[050] A presente invenção refere-se também a um processo para a preparação de partículas infecciosas de vírus do sarampo que compreende:
1) expressão do cDNA da presente invenção de acordo com uma das definições acima ou o vetor que contém tal cDNA em uma linhagem de células auxiliares que também expressa proteínas necessárias para a transcrição, replicação e encapsulação da sequência de RNA positiva antigênica do MV do dito cDNA e em condições que permitam o agrupamento de partículas virais; e
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 27/86
13/44
2) recuperação das partículas virais expressas.
[051] De acordo com uma realização particular, dito processo compreende:
1) transfecção de células auxiliares com um cDNA tal como definido acima com um vetor acima definido, em que as ditas células auxiliares são capazes de expressar funções auxiliares para expressar uma RNA polimerase e proteínas N, P e L do MV;
2) co-cultivo das ditas células auxiliares transfectadas da etapa 1) com células passadas apropriadas para a passagem da linhagem de vacina do MV da qual origina-se o cDNA; e
3) recuperação das partículas virais infecciosas de MV produzidas.
[052] De acordo com uma realização preferida, as células auxiliares são derivadas da linhagem 293 de células de rim embrionário humano, em que a linhagem celular 293 possui depósito ATCC n° CRL-1573.
[053] De acordo com outro aspecto deste processo, as células apropriadas para passagem são células FEG.
[054] As células FEG podem ser preparadas a partir de ovos de galinha fertilizados conforme obtido por EARL Morizeau, 8 rue Moulin, 28190 Dangers, França, ou de qualquer outro produtor de ovos de galinha fertilizados.
[055] O processo descrito de acordo com a presente invenção é vantajosamente utilizado para a produção de vírus infeccioso de sarampo apropriado para uso como composições de vacina.
[056] A presente invenção refere-se, portanto, a uma composição imunogênica cujo princípio ativo compreende partículas virais infecciosas de sarampo obtidas por meio do processo descrito acima.
[057] A presente invenção também se refere a uma composição de vacina. Dita composição de vacina contém vantajosamente um princípio
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 28/86
14/44 ativo que compreende partículas de vírus de sarampo recuperadas do cDNA do vetor que foi definido acima, expresso em um sistema de recuperação com base em células auxiliares.
[058] Vantajosamente, tal composição de vacina é apropriada para a proteção contra vírus do sarampo. De acordo com a realização em que o cDNA é recombinado com uma sequência de DNA heteróloga que codifica uma sequência de aminoácido imunogênica, a composição de vacina pode ser adicionalmente apropriada para proteção contra o patógeno do qual se deriva a sequência de DNA imunogênica.
[059] A presente invenção também se refere a uma célula que é recombinada com uma molécula de cDNA de acordo com a presente invenção ou com um vetor tal como definido acima. Uma célula preferida é uma célula procariótica tal como E. coli ou Salmonella.
[060] Outra célula preferida é uma célula eucariótica, especialmente uma célula selecionada entre as leveduras, tais como Saccharomyces cerevisiae.
[061] Uma célula de acordo com a presente invenção pode ser caracterizada de acordo com uma realização particular pelo fato de compreender sequências de nucleotídeos que expressem funções auxiliares necessárias para expressar uma RNA polimerase e proteínas N, P e L do MV. Dita célula pode ser utilizada, portanto, para a recuperação das partículas virais.
[062] Os exemplos e figuras apresentados a seguir fornecem características adicionais para a caracterização da presente invenção.
Breve Descrição das Figuras [063] Figura 1. Comparação de genomas de MV. (A) Substituições de nucleotídeos para cada região codificante (letras maiúsculas em caixas) e em regiões não-codificantes (letras minúsculas) são exibidas na
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 29/86
15/44 parte inferior. As substituições de aminoácidos são exibidas na parte superior (símbolo de aminoácido de uma letra). A cor amarela na grade indica as substituições wt. A cor azul indica as substituições correspondentes ao tipo de vacina Rubeovax/Schwarz/Moraten. A cor vermelha indica substituições de nucleotídeos e aminoácidos que estão presentes somente na seqüência EdBtag. As substituições de nucleotídeos nas posições 1.805 e 1.806 de EdB-tag correspondem à tag introduzida. (B) Árvore filogenética que exibe o EdB-tag entre o grupo Edmonston e 2 wt isolados (Takeda, M., A. Kato, F. Kobune, H. Sakata, Y. Li, T. Shioda, Y. Sakai, M. Asakawa e Y. Nagai, 1998, “Measles Virus Attenuation Associated with Transcriptional Impediment and a Few Amino Acid Changes in the Polymerase and Accessory Proteins”, J. Virol. 72: 86908696; Takeuchi, K., N. Miyajima, F. Kobune e M. Tashiro, 2000, “Comparative Nucleotide Sequence Analyses of the Entire Genomes of B95a Cell-Isolated and Vero Cell-Isolated Measles Viruses from the Same Patient”, Virus Genes. 20: 253-257). As sequências foram alinhadas utilizando-se Clustal W (Thompson, J. D., D. G. Higgins e T. J. Gibson. 1994. “CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice”, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680). As distâncias das seqüências de nucleotídeos foram determinadas com Dnadist do pacote Phylip, versão 3.5, Felsenstein, J., 1989, Cladistics 5: 164-166. A árvore foi derivada por meio da análise de agrupamento (método “neighbor-joining”) aplicada a distâncias de seqüências em pares calculadas através do uso de diversos métodos, incluindo o método “Kimura 2-parameter” para gerar árvores sem raízes. O resultado final foi gerado pelo Treeview (Page, R. D., 1996, “TreeView: An Application to Display Phylogenetic Trees on Personal Computers”, Comput. Appl. Biosci. 12: 357358).
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 30/86
16/44 [064] Figura 2. Mapa esquemático do plasmídeo pTM-MVSchw. Para a construção da sequência completa, os 6 fragmentos representados na parte superior foram gerados e recombinados passo a passo através do uso dos sítios de restrição específicos indicados. T7 = promotor T7; hh = ribozima do tipo cabeça de martelo; hôv = ribozima da hepatite delta; T7t = terminador da T7 RNA Polimerase. Os oligonucleotídeos indicados a seguir foram utilizados para o seqüenciamento do cDNA de MV Schwarz e do MV Schwarz recuperado do cDNA.
N° de sequências positivas
ATCCGAGATGGCCACACTTT
TGATTCTGGGTACCATCCTA
TATGCCATGGGAGTAGGAGT
TGGCAGGAATCTCGGAAGAA
GCATCAAGCACTGGGTTACA
TACAGGAGTGGACACCCGAA
AGGACAGCTGCTGAAGGAAT
TTGTTGAGGACAGCGATTCC
AGAGTGAAGTCTACTCTGCC
TGACACAAGGCCACCACCAG
AGCTCCCAGACTCGGCCATC
CCAGCCATCAATCATTAGTC
AGTTTACGGGACCCCATATC
GGAACCTAATAGCCAATTGT
CTCTTCGTCATCAAGCAACC
TCACTTGGTGTATCAACCCG
AACTGTATGGTGGCTTTGGG
TGTGTATTGGCTGACTATCC
ATCAGGCATACCCACTAGTG
GCACAGCTCCCAGTGGTTTG
TCATGAGTTAACTGAAGCTC
GTCACGGAGGCTTGTAGATG
GTACTGCCTTAATTGGAGAT
TGATGGGCTACTTGTGTCCC
ACCCTTACTCAGCAAATCTT
TCTATGCGAGGCCACCTTAT
TTGTCCGAGTGGCGAGGTAT
CAATTGGGCATTTGATGTAC
GAGGCTATGTTATCTCCAGC
AGTTGGCCTTGTCGAACACA
CTGGACTTATAGGTCACATC
GGTTTGAAACGTGAGTGGGT
Posição
101
601 1110 1609 2110 2651 3096 3610 4120 4608 5169 5603
6115 6608 7151 7677 8126 8620 9162 9701 10214 10715 11231 11747 12223 12726 13144 13712 14172 14723 15190 15693
N° de sequências negativas
1a AAAGTGTGGCCATCTCGGAT 2a TAGGATGGTACCCAGAATCA 3a ACTCCTACTCCCATGGCATA 4a TTCTTCCGAGATTCCTGCCA 5a TGTAACCCAGTGCTTGATGC 6a TTCGGGTGTCCACTCCTGTA 7a ATTCCTTCAGCAGCTGTCCT 8a GGAATCGCTGTCCTCAACAA 9a GGCAGAGTAGACTTCACTCT
10a CTGGTGGTGGCCTTGTGTCA 11 a GATGGCCGAGTCTGGGAGCT 12a GACTAATGATTGATGGCTGG
13a GATATGGGGTCCCGTAAACT 14a ACAATTGGCTATTAGGTTCC 15a GGTTGCTTGATGACGAAGAG 16a CGGGTTGATACACCAAGTGA 17a CCCAAAGCCACCATACAGTT 18a GGATAGTCAGCCAATACACA 19a CACTAGTGGGTATGCCTGAT 20a CAAACCACTGGGAGCTGTGC 21a GAGCTTCAGTTAACTCATGA 22a CATCTACAAGCCTCCGTGAC 23a ATCTCCAATTAAGGCAGTAC 24a GGGACACAAGTAGCCCATCA 25a AAGATTTGCTGAGTAAGGGT 26a ATAAGGTGGCCTCGCATAGA 27a ATACCTCGCCACTCGGACAA 28a GTACATGAAATGCCCAATTG 29a GCTGGAGATAACATAGCCTC 30a TGTGTTCGACAAGGCCAACT 31a GATGTGACCTATAAGTCCAG 32a ACCCACTCACGTTTCAAACC
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 31/86
17/44 [065] Figura 3. Cinética de crescimento dos vírus Schwarz e EdB-tag recuperados em células Vero e FEG. Células em placas de 35 mm foram infectadas com MV Schwarz recuperado do plasmídeo pTM-MVSchw (-), MV EdB-tag (-o-) e vírus Schwarz industrial (-Δ-) em diferentes multiplicidades de infecção (MOI) (conforme indicado). Em cada momento, células foram coletadas e quantidades de vírus associados a células foram determinadas através do uso do método TCID50 em células Vero. (A) Células Vero incubadas a 37°C; (B) FEG incubado a 37°C; (C) FEG incubado a 32°C.
[066] Figura 4. A: Representação esquemática da unidade de transcrição adicional (ATU) e plasmídeo vetor de MV Schwarz. (AA) Elementos atuantes cis da ATU inserida na posição 2 entre as estruturas de leitura aberta da fosfoproteína (P) e da matriz (M) de MV. (AB). Representação das 3 posições da inserção de ATU no plasmídeo vetor de MV Schwarz.
[067] B: Sequência de ATU: as letras minúsculas representam sequências adicionais (cópia da região intergênica N-P do vírus do sarampo) mais sítios de clonagem. As letras maiúsculas correspondem à sequência GFP melhorada inserida. Dita sequência é inserida no sítio Spel (posição 3.373) da sequência de cDNA da linhagem Schwarz do vírus do sarampo para ATU2 e no sítio Spel (posição 9.174) para ATU3. A mutação que diferencia a ATU normal da bis (em pTM-MVSchw2-gfp e pTM-MVSchw2GFPbis) é um C substituído (letra maiúscula) no final da ATU.
[068] Figura 5. Sequência de nucleotídeo completa do plasmídeo pTM-MVSchw. A sequência pode ser descrita conforme segue com referência à posição dos nucleotídeos:
- 1-8: sítio de restrição Notl;
- 9-28: promotor T7;
- 29-82: ribozima do tipo cabeça de martelo;
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 32/86
18/44
- 83-15.976: antigenoma de MV Schwarz;
- 15.977-16.202: ribozima HDV e terminador T7;
- 16.203-16.210: sítio de restrição NotI;
- 16.211-16.216: sítio de restrição ApaI;
- 16.220-16.226: sítio de restrição KpnI; e
- 16.226-18.967: plasmídeo pBluescript KS (+) (Stratagene).
[069] Figura 6. Detecção de anticorpos anti-MV em macacos imunizados com diferentes linhagens de vacina de MV. Anticorpos anti-MV foram detectados por ELISA um mês após a imunização de macacos rhesus (2 macacos por grupo) com vírus Schwarz (barras cinza), vírus EdB-tag (barras brancas) e vacina Rouvax (barras pretas) nas doses indicadas. A Razão de “status” imune (ISR) foi calculada de acordo com a descrição em materiais e métodos. Somente valores ISR superiores a 0,9 foram considerados positivos (as determinações foram realizadas em triplicata mediante diluição 1/20 de amostras de soro e os resultados encontram-se apresentados como os valores médios ± desvio padrão).
[070] Figura 7. Titulação de anticorpos para MV em camundongos imunizados com diferentes linhagens de vacinas de MV. Anticorpos anti-MV foram detectados por ELISA um mês após a imunização de camundongos CD46 (A) e CD46/IFNAR (B) com 104 TCID50 de vírus EdB-tag (barras brancas), vírus Schwarz (barras cinza) e vacina Rouvax (barras pretas). Os resultados são expressos como valores de densidade ótica médios ± desvio padrão (4 camundongos por grupo) determinados em diluições de soro em série.
[071] Figura 8. Detecção de anticorpos anti-MV em macacos imunizados com diferentes preparações de vírus do sarampo Schwarz. Anticorpos anti-MV foram detectados por ELISA em diferentes momentos após a imunização de macacos cynomolgus (2 macacos por grupo) com TCID50 a
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 33/86
19/44
104 de vírus Schwarz industrial a granel (marcas brancas), vírus Schwarz recuperado do plasmídeo pTM-MVSchw e cultivado em FEG (barras cinza) ou células Vero (barras pretas). A razão de “status” imune (ISR) foi calculada de acordo com a descrição em materiais e métodos.
[072] Figura 9. Mudanças no número de leucócitos em circulação e resposta específica de células T contra MV em macacos imunizados com diferentes preparações de MV Schwarz. Contagem de glóbulos brancos (A), linfócitos (B), monócitos (C) e IFN-y-ELISpots específicos de hemaglutinina de MV (D) em PBMC de macacos cynomolgus coletados em diferentes momentos após a imunização com TCID50 a 104 de vírus Schwarz industrial a granel (marcas brancas), vírus Schwarz recuperado de plasmídeo pTM-MVSchw e cultivado em FEG (barras cinza) ou células Vero (barras pretas). IFN-γELISpots foram detectados após simulação de PBMC por 24 horas com MVA recombinante que expressa a hemaglutinina de MV. Os antecedentes obtidos com estímulo de MVA-wt foram subtraídos e os resultados são expressos em forma de células produtoras de γ-IFN específicas de MVA-HVS por milhão de PBMC.
[073] Figura 10. Representação esquemática dos plasmídeos pTM-MVSchw-ATU (A) e da expressão de GFP em células Vero infectadas por vírus recombinantes recuperados (B). As células Vero foram infectadas com MV-GFP Schwarz recombinante na posição ATU2 (lado esquerdo) ou na posição ATU3 (lado direito) e a fluorescência de GFP foi observada em sincícios.
Exemplos Comparação de Sequências Entre Linhagens de Vacina EdB-tag e Vacina CONTRA SARAMPO [074] Em análise anteriormente relatada (Parks, C. L., R. A.
Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu e S. A. Udem, 2001. “Analysis of the
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 34/86
20/44
Noncoding Regions of Measles Virus Strains in the Edmonston Vaccine Lineage”, J. Virol. 75: 921-933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu e S. A. Udem, 2001, “Comparison of Predicted Amino Acid Sequences of Measles Virus Strains in the Edmonston Vaccine Lineage”, J. Virol. 75: 910-920), as sequências codificadoras e não-codificadoras de linhagens de vacina de vírus derivados de Edmonston foram comparadas com as linhagens de um isolado de baixa passagem do vírus do sarampo Edmonston do tipo selvagem. Os autores identificaram 10 substituições de aminoácidos compartilhadas por quase todas as linhagens de vacinas. Compararam-se as sequências genômicas destas linhagens de vacinas derivadas de Edmonston e 2 isolados primários (Takeda, M., A. Kato, F. Kobune, H. Sakata, Y. Li, T. Shioda, Y. Sakai, M. Asakawa e Y. Nagai, 1998, “Measles Virus Attenuation Associated with Transcriptional Impediment and a few Amino Acid Changes in the Polymerase and Accessory Proteins”, J. Virol. 72: 8690-8696; Takeuchi, K., N. Miyajima, F. Kobune e M. Tashiro, 2000, “Comparative Nucleotide Sequence Analyses of the Entire Genomes of B95a Cell-Isolated and Vero Cell-Isolated Measles Viruses from the Same Patient”, Virus Genes, 20: 253-257) com as do cDNA infeccioso de Edmonston B relatado anteriormente (EdB-tag) (Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Dotsch, G. Christiansen e M. Billeter, 1995, “Rescue of Measles Viruses from Cloned DNA”, EMBO Journal, 14: 5773-5784). A Figura 1 mostra que a sequência de nucleotídeos de EdB-tag diferencia-se da Rubeovax (vacina Edmonston B) em 0,24% (38 mutações) e de
Schwarz/Moraten em 0,27% (44 mutações). As sequências de
Schwarz/Moraten e Edmonston B (Rubeovax®) diferem em apenas 0,1% (16 mutações). Dentre as 38 diferenças entre EdB-tag e Rubeovax, 17 são substituições de aminoácidos em regiões codificadoras e 7 estão localizadas em regiões não-codificadoras. Dentre as 44 diferenças entre EdB-tag e
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 35/86
21/44
Schwarz/Moraten, 22 são substituições de aminoácidos e 9 encontram-se em regiões não-codificadoras. As 10 substituições de aminoácidos compartilhadas por quase todas as linhagens de vacinas Edmonston, Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu e S. A. Udem, 2001, “Analysis of the Noncoding Regions of Measles Virus Strains in the Edmonston Vaccine Lineage”, J. Virol. 75: 921-933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu e S. A. Udem, 2001, “Comparison of Predicted Amino Acid Sequences of Measles Virus Strains in the Edmonston Vaccine Lineage”, J. Virol. 75: 910-920) são conservadas em cDNA de EdB-tag. Entretanto, 5 delas são específicas dos subgrupos AIK-C e Zabreg, indicando que o vírus do qual EdB-tag foi clonado diverge de Edmonston B e não corresponde a qualquer linhagem de vacina aprovada. Além disso, 10 substituições de aminoácidos em EdB-tag não se relacionam a qualquer subgrupo de Edmonston, o que provavelmente reflete a adaptação para crescimento em células HeLa e/ou erros introduzidos durante o procedimento de clonagem. Dentre as ditas substituições específicas, 5 foram localizadas nas sequências codificadoras de P/V/C e 3 foram localizadas no gene L polimerase, de forma a possivelmente afetar a capacidade de replicação do vírus in vivo. Estas substituições e outras em sequências de atuação cis podem influenciar a imunogenicidade ou patogenicidade do vírus recuperado do cDNA de EdB-tag. De fato, a adaptação de MV para crescimento em células Vero mostrou ser associada à perda de potencial patogênico (Kobune, F., H. Sakata e A. Sugiura, 1990, “Marmoset Lymphoblastoid Cells as a Sensitive Host for Isolation of Measles Vírus”, J. Virol. 64: 700-705) e com poucas substituições de aminoácidos localizadas nas proteínas polimerase (L) e acessórias (P/V/C), resultando em atenuação transcricional em células linfóides (Takeda, M., A. Kato, F. Kobune, H. Sakata, Y. Li, T. Shioda, Y. Sakai, M. Asakawa e Y. Nagai, 1998, “Measles Virus Attenuation Associated with Transcriptional Impediment and a few Amino Acid
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 36/86
22/44
Changes in the Polymerase and Accessory Proteins”, J. Virol. 72: 8690-8696; Takeuchi, K., N. Miyajima, F. Kobune e M. Tashiro, 2000, “Comparative Nucleotide Sequence Analyses of the Entire Genomes of B95a Cell-Isolated and Vero Cell-Isolated Measles Viruses from the Same Patient”, Virus Genes, 20: 253-257).
Construção de cDNA Correspondente ao Antigenoma da Linhagem de Vacina Schwarz de Vírus do Sarampo:
[075] Partículas virais foram purificadas a partir de um lote de vacina de sarampo Schwarz gentilmente fornecido pela Aventis Pasteur (Lyon, França). Dita preparação de vacina a granel (50 ml, 3 x 104 TCID50/ml) foi obtida fragmentando-se células FEG infectadas, por meio de congelamento e descongelamento de células e meio e filtragem de fragmentos celulares. As partículas foram concentradas por centrifugação por meio de colchão de sacarose a 30%. O RNA viral foi purificado a partir de partículas lisadas utilizando-se uma membrana com base em sílica gel (QIAmp, Qiagen). O RNA viral foi transcrito de forma reversa em cDNA através do uso de uma mistura de hexâmeros aleatórios (pdN6, 1 pM) e um oligonucleotídeo específico que representa os 32 primeiros nucleotídeos de genoma do MV (MVSchwRT1 5' ACCAAACAAAGTTGGGTAAGGATAGTTCAATC-3', 10 pM), como primers. A fim de garantir a fidelidade da transcrição reversa e o rendimento de produtos de comprimento total, foi utilizada a DNA polimerase SuperScript II (GibcoBRL). Um conjunto de 6 fragmentos sobrepostos que cobrem o cDNA viral total (numerados de 1 a 6 na Fig. 2) foi gerado por meio de PCR através do uso de Turbo Pfu DNA polimerase (Stratagene) e um conjunto de primers específicos fechados para sítios de restrição exclusivos. O fragmento 1 na extremidade 5' do antigenoma viral foi elaborado por PCR com primers específicos a fim de conter um promotor da T7 RNA polimerase com a unidade GGG necessária para a eficiência total e uma sequência de ribozima do tipo cabeça de martelo
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 37/86
23/44 inserida entre o promotor T7 e o primeiro nucleotídeo viral. Para gerar este fragmento, 2 oligonucleotídeos sobrepostos foram combinados: Líder 1 (5'TATGCGGCCGCTAATACGACT CACTATAGGGCCAACTTTGTTTGGTCTGA3') que contém um sítio NotI, o promotor T7 (sublinhado) e os 19 primeiros nucleotídeos da sequência de ribozima do tipo cabeça de martelo, e Líder 2 (5'-GGTGACCCGGGACTCCGGGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGACCAAA CA-3') que contém a sequência do tipo cabeça de martelo com um sítio Smal/Xmal. Após amplificação por PCR, o fragmento resultante foi ligado por extensão de PCR a um segundo fragmento também gerado por PCR de cDNA Schwarz através do uso dos oligonucleotídeos MVSchw1 (5'GAGTCCCGGGTCACCAA ACAAAGTTGGGTAAG-3') em sobreposição com a sequência do tipo cabeça de martelo (sublinhada) e cobrindo o genoma de MV Schwarz 1-15, e MVSchw160 (5'-GGTTTGTCCTTGTTTCTTTT-3'; genoma de MV Schwarz 141-160). O fragmento 2 (2.173 nucleotídeos de comprimento, vide Fig. 2) foi amplificado utilizando-se os oligonucleotídeos MVSchwRT1 (5'ACCAAACAAAGTTGGGTAAGGATAGTTCAAT C-3', genoma de MV Schwarz
1-32) e MVSchw2173 (5'-ATTCCCTTAACCGCTTCACC-3', genoma de MV Schwarz 2.155-2.174). O fragmento 3 (3.142 nucleotídeos de comprimento) foi amplificado através do uso de oligonucleotídeos de MV Schw1901 (5'CTATGGCAGCATGGTCAGAAATA-3', genoma de MV Schwarz 1.901-1.924) e MVSch5043 (5'-ATTGTCGATGGTTGGGTGCT-3', genoma de MV Schwarz 5.024-5.043). O fragmento 4 (4.349 nucleotídeos de comprimento) foi amplificado através do uso de oligonucleotídeos MVSchw4869 (5'AAACTTAGGGCCAAGGAACATAC-3', genoma de MV Schwarz 4.869-4.891) e MVSchw9218 (5'-GGACCCTACGTTTTTCTTAATTCTG-3', genoma de MV Schwarz 9.194-9.218). O fragmento 5 (6.200 nucleotídeos de comprimento) foi amplificado através do uso de oligonucleotídeos MVSchw9119 (5'AGATAGGGCTGCTAGTGAACCAAT-3', genoma de MV Schwarz 9.119-9.142)
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 38/86
24/44 e MVSchw15.319 (5’-ATCAGCACCTGCTCTATAGGTGTAA-3’, genoma de MV Schwarz 15.295-15.319). Para obter o fragmento 6, 2 fragmentos sobrepostos gerados por PCR foram combinados entre si. Foram utilizados os seguintes oligonucleotídeos: MVSchw15155 (5’-GCAGCAGATAATTGAATCATCTGTGAG GACTTCAC, genoma de MV Schwarz 15.155-15.190) e MVSchw15570 (5’CCCGGAGTAAAGAAGAATGTGCCCCCAGAATTTGC-3’, genoma de MV Schwarz 15.535-15.570). Este fragmento foi combinado com um fragmento contendo a ribozima do vírus da hepatite delta (HDV) ligado ao terminador T7 que foi previamente obtido por amplificação através de PCR do plasmídeo p(MV+) (doado por M. Billeter), através do uso dos oligonucleotídeos MVSchw15547 (5’-GGCACATTCTTCTTTACTCCGGGAACAAAAAGTTG-3’, genoma de MV Schwarz 15.547-15.581) e MVSchwEnd (5’ATAGGGCCCGCGGCCGCATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCA-3’) que contém um sítio de restrição ApaI ligado aos últimos nucleotídeos do terminador T7. Os 6 fragmentos desta forma gerados, foram clonados no vetor pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen, Groningen, Holanda) e sequenciados. A fim de agrupar o DNA de MV Schwarz de comprimento total, foi construído um plasmídeo BlueScript KS (+) modificado: 2 oligonucleotídeos internamente complementares que geram uma poliligação NotI, KasI/NarI, SpeI e ApaI foram combinados e inseridos em um plasmídeo pTM digerido com NotI/ApaI (pTM foi derivado de pBluescript KS (+) (Stratagene) por deleção do promotor T7 (Tangy, F., A. McAlIlister e M. Brahic, 1989, “Molecular Cloning of the Complete Genome of Theiler’s Virus, strain GDVII, and Production of Infectious Transcripts”, J. Virol. 63: 1101-11066)). Os 6 fragmentos de cDNA de MV Schwarz foram agrupados entre si passo a passo através do uso de sítios de restrição exclusivos. Os fragmentos 1 e 2 foram agrupados entre si através do uso do sítio BlpI em sequência de MV (Fig. 2) e o sítio BgIII na estrutura do vetor pCR®2.1-TOPO®. O plasmídeo resultante foi agrupado com o fragmento 3
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 39/86
25/44 através do uso do sítio Sbfl em sequência de MV e o sítio BglII na estrutura do vetor pCR®2.1-TOPO®, gerando o plasmídeo pCR®2.1-TOPO®-MVSchw-1-2-3 que contém fragmentos 1 a 3 de MV Schwarz. Após a digestão com NotI/NarI deste plasmídeo, o fragmento contendo o promotor T7, ribozima do tipo cabeça de martelo e os 4.922 primeiros nucleotídeos do antigenoma de MV Schwarz foram inseridos em um vetor pTM digerido com NotI/NarI, gerando pTM-MVL. Ao mesmo tempo, os fragmentos 5 e 6 foram agrupados através do uso do sítio BsmBI na sequência de MV (Fig. 2) e do sítio BssHII na estrutura do vetor pCR®2.1-TOPO®, gerando o plasmídeo pCR®2.1-TOPO®-MVSchw-5-6 contendo os fragmentos 5 e 6 de MV Schwartz. Após a digestão desse plasmídeo com SpeI/ApaI, o fragmento contendo os 6.720 últimos nucleotídeos do antigenoma de MV Schwarz, ribozima HDV e sequências terminadoras T7 foi inserido em um vetor pTM digerido com SpeI/ApaI, gerando pTM-MVT. Para agrupamento final, 4 fragmentos foram preparados e ligados entre si: 1) um fragmento SapI/SapI de pTM-MVL (4.367 nucleotídeos de comprimento) que contém uma parte da estrutura de pTM, o promotor T7, ribozima do tipo cabeça de martelo e os 1.813 primeiros nucleotídeos do antigenoma de MV,
2) um fragmento SpaI/NarI do pTM-MVL (3.110 nucleotídeos de comprimento) contendo os nucleotídeos 1.813 a 4.923 do antigenoma de MV Schwarz, 3) um fragmento NarI/SpeI de pCR®2.1-TOPO®-MVSchw-3 (4.253 nucleotídeos de comprimento) contendo os nucleotídeos 4.923 a 12.157 do antigenoma de MV Schwarz, e 4) um fragmento SpeI/SapI de pTM-MVT (7.235 nucleotídeos de comprimento) contendo os nucleotídeos 12.157 a 15.894 do antigenoma de MV Schwarz, ribozima HDV, terminador T7 e uma parte da estrutura do vetor pTM. Após ligação e clonagem, foram obtidas várias construções completas. O plasmídeo resultante, denominado pTM-MVSchw, foi totalmente sequenciado (CNCM I-2889). Nenhuma mutação foi encontrada entre o dito cDNA e a sequência previamente relatada do genoma Schwarz (Parks, C. L., R. A. Lerch,
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 40/86
26/44
P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu e S. A. Udem, 2001, “Analysis of the Noncoding Regions of Measles Virus Strains in the Edmonston Vaccine Lineage”, J. Virol. 75: 921-933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu e S. A. Udem, 2001, “Comparison of Predicted Amino Acid Sequences of Measles Virus Strains in the Edmonston Vaccine Lineage”, J. Virol. 75: 910-920).
Recuperação de Vírus Schwarz Infeccioso a Partir do Plasmídeo pTMMVSchw [076] Para recuperar o vírus Schwarz do cDNA de pTM-MVSchw, utilizou-se o sistema de recuperação com base em células auxiliares descrito por Radecke et al. (Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Dotsch, G. Christiansen e M. Billeter, 1995, “Rescue of Measles Viruses from Cloned DNA”, EMBO Journal, 14: 5773-5784) e modificado por Parks et al. (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, M. S. Sidhu e S. A. Udem, 1999, “Enhanced Measles Virus cDNA Rescue and Gene Expression After Heat Shock”, J. Virol. 73: 3560-3566). Células auxiliares humanas que expressam T7 RNA polimerase de forma estável e proteínas N e P de sarampo (células 293-
3-46, descritas por Radecke et al. (17)) foram transfectadas através do uso do procedimento de fosfato de cálcio com o plasmídeo pTM-MVSchw (5 pg) e um plasmídeo que expressa o gene L polimerase de MV (pEMC-La, 20 ng, descrito por Radecke et al (17)). Após incubação durante a noite a 37°C, o meio de transfecção foi substituído por meio fresco e um choque térmico foi aplicado (43°C por 2 horas) (12). Após 2 dias de incubação a 37°C, as células transfectadas foram transferidas para uma camada de células FEG e incubadas a 32°C a fim de evitar qualquer adaptação da vacina Schwarz, selecionada originalmente das células FEG e atualmente cultivada em ditas células por motivo de segurança. Os fibroblastos de embriões de galinha (FEG) acima foram preparados conforme segue. Ovos fertilizados de galinha (EARL
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 41/86
27/44
Morizeau, 8 rue Moulin, 28190 Dangers, França) foram incubados a 38°C por 9 dias. Embriões foram coletados de forma estéril. Cabeça, membros e vísceras foram removidos e os embriões foram fatiados e submetidos à tripsinização por 5 a 10 minutos a 37°C (Tripsina/EDTA, 2,5 g/l). Após filtragem (70 pm) e diversas lavagens em DMEM alta glicose/10% FCS, as células foram semeadas (5 a 7 x 106 células/placa de petri) e incubadas durante a noite a 37°C. Vírus infecciosos foram facilmente recuperados de 3 a 7 dias seguindo co-cultivo. O sincício apareceu ocasionalmente em FEG, mas não sistematicamente. O vírus Schwarz também foi recuperado por meio da mesma técnica após co-cultivo de células auxiliares 293-3-46 transfectadas a 37°C em células Vero de primatas (rim de macaco verde africano). Neste caso, o sincício apareceu sistematicamente em todas as transfecções após 2 dias de co-cultivo. A fim de testar a adaptação viral em células Vero, uma preparação de vírus Schwarz clonados recuperados em células Vero foi passada 2 vezes em células Vero. Partículas virais foram purificadas e efetuou-se a transcrição reversa do RNA viral conforme descrito acima com os primers utilizados para clonagem (vide acima). O genoma viral foi totalmente sequenciado. 2 substituições de nucleotídeos foram encontradas dentre 15.894 entre o vírus recuperado/passado e o cDNA utilizado para transfecção. Estas mutações foram encontradas em 7 e 8, respectivamente, dentre 10 clones diferentes da mesma região, o que indica alto percentual de mutação entre a população viral. Além disso, as 2 mutações resultaram em substituições de aminoácidos na proteína de fusão (F): G->R na posição 266 e Y->S na posição 365.
[077] Por outro lado, a sequência genômica do vírus recuperado e passado sobre células FEG a 32°C foi idêntica à do vírus Schwarz original. Esta observação indica que a mudança da célula
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 42/86
28/44 hospedeira do vírus Schwarz leva a uma rápida adaptação que pode afetar as propriedades da vacina.
Capacidade de Crescimento do Vírus Recuperado [078] A capacidade do vírus Schwarz recuperado do cDNA de crescer em células Vero e FEG foi analisada e comparada com a vacina Schwarz industrial a granel da qual foi derivada (obtida da Aventis Pasteur) e com o vírus EdB-tag recuperado do seu cDNA. Monocamadas de células Vero em placas com 6 cavidades foram infectadas com vírus em diferente multiplicidade de infecções. Em tempo variado após a infecção (pi), as células foram fragmentadas em meio de cultura. Após congelamento e descongelamento, foram determinadas as titularidades de infecção por meio de medição do TCID50 em células Vero. Curvas de crescimento: monocamadas de células Vero em placas com 6 cavidades foram infectadas com vírus em diferentes multiplicidades de infecção (MOI). Em vários momentos após a infecção (pi), as células foram fragmentadas em meio de cultura. Após congelamento e descongelamento, titularidades de infecção foram determinadas por meio da medição do TCID50 em células Vero.
[079] Titulação de TCID50: células Vero foram semeadas em placa com 96 cavidades (7.500 células/cavidade) e infectadas por meio de diluições 1:10 em série de amostra de vírus em DMEM/5% FCS. Após incubação a 37°C por 4 a 5 dias para vírus Ed-B e 7 dias para vírus Schwarz, as células foram coradas com violeta de cristal e foi determinada a diluição de vírus que resultou em infecção em 50% de unidade de teste. O ponto final de 50% descrito como dose infecciosa para a cultura de tecidos (TCID50) foi calculado por meio do método de Karber (Karber, G., 1931, “Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche”, Arch. Exp. Path Pharmak. 162: 480-483). Testada em células Vero, a cinética de crescimento de vírus Schwarz e EdB-tag recuperados dos seus respectivos cDNAs foi
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 43/86
29/44 similar (Fig. 3). A produção viral Schwarz em células Vero atingiu altos rendimentos (107 a 108 TCID50/ml após 2 dias de infecção a partir do uso de multiplicidade de infecção de 0,01). Testado em células FEG, o vírus Schwarz foi capaz de crescer tão bem a 32°C quanto a 37°C, enquanto o EdB-tag não foi capaz (Fig. 3). Esta observação confirma que o vírus do qual EdB-tag foi clonado não se adaptou a células FEG. O rendimento de vírus Schwarz em FEG foi mais baixo que em células Vero (106 TCID5o/ml após 4 dias de infecção, utilizando multiplicidade de infecção de 0,05). Curvas de crescimento similares e titulações similares foram observadas quando células FEG foram infectadas com o vírus Schwarz original do qual foi clonado (Fig.
3). As ditas observações demonstram que o vírus Schwarz recuperado do seu cDNA possui as mesmas características de crescimento do lote de vacina original do qual foi clonado.
Introdução de uma Unidade de Transcrição Adicional no cDNA de Schwarz [080] No trabalho anterior que relata a clonagem de vírus EdBtag (17), os autores desenvolveram um método original de adaptação do cDNA viral como vetor apropriado para a expressão de transgenes exógenos. Eles inseriram uma unidade transcricional adicional (ATU) em diferentes posições do genoma viral. Dita ATU é uma cópia da região intergênica N-P de MV que contém as sequências atuantes cis necessárias para expressão dependente de MV de um transgene inserido em um cassete múltiplo de sítios de clonagem. Testada amplamente, a expressão de transgenes exógenos inseridos em dita ATU foi muito eficiente, dependendo da posição de inserção no genoma. Os diferentes genes do MV são expressos de acordo com um gradiente de transcrição ao longo do genoma, gerando uma alta expressão do gene N até baixa expressão do gene L (Lamb, R. e D. Kolakofsky, 1996, Paramyxoviridae: the Viruses and their Replication, págs. 1177-1199 em B. Fields, D. Knipe et al. (ed.), Fields Virology, Lippincott-Raven Publishers, Filadélfia, Estados Unidos).
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 44/86
30/44 [081] A inserção da ATU aproveita o dito gradiente, permitindo alta ou baixa expressão do transgene, dependendo da posição de inserção. Além disso, neste contexto, os transgenes exógenos são expressos utilizando os mesmos controles e vias dos genes do MV autênticos.
[082] A fim de transformar o cDNA de Schwarz em um vetor, construiu-se uma ATU similar que foi inserida em 2 posições diferentes do cDNA (Figura 4). O cDNA foi sequenciado e nenhuma mutação foi encontrada.
IMUNOGENICIDADE DE MV SCHWARZ RECUPERADO DE CDNA EM MACACOS Primeiro Experimento: Comparação com Vacina Schwarz [083] A imunogenicidade do vírus recuperado do plasmídeo pTMMVSchw e passada 2 vezes em células FEG foi comparada com a imunogenicidade da vacina Schwarz em macacos cynomolgus. As condições de passagem foram as seguintes:
[084] Após o resgate, o sincício isolado foi retirado das células FEG co-cultivadas com células auxiliares 293-3-46 e um único sincício foi diluído em 600 pl de OptiMEM 1 (Gibco) e turbilhonado. Este inoculado foi utilizado para infectar células FEG frescas (80% a 90% confluentes) em uma cavidade de 35 mm ou frasco T-25. Após 2 horas de adsorção a 37°C, o inoculado foi substituído por DMEM/5% FCS e as células foram incubadas a 32°C por 1 a 2 dias. Quando apareceram pequenos sincício, células infectadas foram expandidas para frascos T-75: células foram lavadas com PBS e dissociadas com PBS/1 mM de EDTA/0,25% de tripsina por 1 minuto, transferidas em seguida para frascos T-75 junto com células FEG frescas (1/4 de cultura em frasco T-75 confluente). Após 4 a 7 dias de incubação a 32°C em DMEM/5% FCS, o vírus (passagem 1) foi coletado: o meio de cultura foi removido e células infectadas foram fragmentadas em 3 ml de OptiMEM 1. Após um ciclo de congelamento e descongelamento, os fragmentos celulares foram descartados por centrifugação (1.500 rpm, 5 minutos, temperatura
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 45/86
31/44 ambiente). O dito estoque de semente foi mantido congelado a -80°C e utilizado para infectar FEG fresca da mesma forma para preparar o estoque de passagem 2.
[085] Formulações diferentes da vacina foram testadas através do uso da preparação a granel sem passagem da Aventis Pasteur, e a mesma preparação passada 2 vezes em células FEG. Os vírus foram preparados conforme segue: células FEG (obtidas a partir de embriões de galinhas incubados durante 9 dias) foram infectadas em MOI de 0,05 e incubadas a 32°C durante 7 dias. Os vírus foram purificados por meio de raspagem de células infectadas, congelamento/descongelamento e clarificação em baixa velocidade de fragmentos celulares. Os agentes estabilizantes utilizados na preparação de vacina de MV foram obtidos pela Aventis Pasteur. Diferentes preparações de vacina a granel com e sem agentes estabilizantes foram comparadas à mesma dosagem ao produto final liofilizado (Rouvax, Aventis Pasteur). Todas as preparações de vacina foram tituladas utilizando-se o método TCID50 em células Vero. Macacos foram injetados por via subcutânea e amostras de sangue foram retiradas em diferentes momentos. A fim de comparar as respostas celulares e humorais, a presença de anticorpos antiMV foi observada em soros por ELISA (Trinity Biotech, Estados Unidos) e a presença de células T anti- MV foi observada por ELISPOT em PBMCs.
Segundo Experimento: Comparação com Linhagem EdB-tag [086] Macacos rhesus (Macaca mulatta) ou cynomolgus (Macaca fascicularis) criados em colônias soro-negativos para o retrovírus de símios do tipo D, vírus linfotrópicos de células T de símios, vírus da imunodeficiência de símios e vírus do sarampo foram abrigados de acordo com a American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care. Macacos foram inoculados por via subcutânea com diferentes doses (103 a 105 TCID50) de MV EdB-tag ou Schwarz diluídas em OptiMEM (Gibco BRL) ou com 104 TCID50 da
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 46/86
32/44 vacina de MV de Rouvax liofilizada (Aventis Pasteur, Marcy l’Etoile, França) diluída em solução dada pelo fornecedor. Amostras de sangue foram coletadas em diferentes momentos após a inoculação.
[087] A presença de anticorpos anti-MV em soro foi observada por ELISA (Trinity Biotech, Estados Unidos) um mês após a vacina. Cada determinação foi realizada em triplicata em diluição 1/20 de amostras de soro. Uma mistura de 5 amostras de macacos negativos foi utilizada como controle negativo. Para determinar a razão de “status” imune (ISR) de cada amostra, a absorvância do controle negativo foi subtraída da absorvância da amostra positiva e o resultado foi dividido pela absorvância de um calibrador fornecido no kit ELISA, conforme recomendado pelo fornecedor. Somente valores de ISR superiores a 0,9 foram considerados positivos nesse teste.
[088] Respostas imunológicas celulares foram determinadas por testes γ-IFN ELISpot. PBMC congeladas foram descongeladas e incubadas durante a noite em RPMI, 10% FCS e 4 U/ml de rh-IL2 (Boehringer Mannheim). Placas com 96 cavidades Multiscreen-HA foram revestidas durante a noite a 4°C com 4 pg/ml de anti^-FN capturado (GZ-4, MabTech) em PBS, lavadas e incubadas em seguida com 100 pl de RPMI, 10% FCS por 1 hora a 37°C. O meio foi substituído por 5 x 105 PBMC em suspensão em 100 pl de RPMI-10% FCS e 100 pl de agente estimulante. O agente estimulante consistiu de 107 pfu de Vacina Modificada Ankara (32) recombinante MVA-Hmv ou MVA-wt como controle. As células foram estimuladas por 24 horas a 37°C. Fitohemaglutinina A (2,5 pg/ml, Sigma) foi utilizada como controle positivo e RPMI como controle negativo. As placas foram lavadas 2 vezes com PBS, 4 vezes com PBS, 0,05% Tween 20 (Sigma) e novamente por 2 vezes com PBS. Um anticorpo anti-γIFN biotinilado (7-B6-1, MabTech, 100 pl, 1 pg/ml em PBS) foi adicionado e as placas foram incubadas por 2 a 4 horas a 37°C. Um conjugado de estreptavidina e fosfatase alcalina (AP) (Roche, 100 pl, diluição 1/2.000 em
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 47/86
33/44
PBS) foi adicionado e desenvolveram-se amostras (spots) com BCIP/NBT (Promega) em 1 M de Tris, pH 9,5, 1,5 M de NaCl, 0,05 M de MgCl2. Após secagem durante a noite à temperatura ambiente, as amostras (spots) foram contadas utilizando-se um sistema de análise de imagens automatizado (ELISpot Reader, Bio-Sys). O fundo baixo obtido após estímulo de MVA-wt foi subtraído e os resultados foram apresentados na forma de células produtoras de γ-IFN específicas de MVA-Hmv por milhão de PBMC.
[089] Imunização de camundongos e caracterização de respostas imunológicas humorais. Camundongos FVB heterozigotos para o transgene CD46 (33) foram cruzados com camundongos 129sv IFN-α/β R-/que não contêm o receptor (30) de interferon do tipo I. A progênie F1 foi selecionada por PCR e os animais CD46+/- foram novamente cruzados com camundongos 129sv IFN-a^R-/-. Os animais IFN-a^R-/- CD46+/- foram selecionados e utilizados para experimentos de imunização. Os ditos camundongos são suscetíveis a infecções por MV (27, 29). Fêmeas de camundongos, CD46+/- ou CD46+/- IFN-a^R-/- (IFNAR) com 6 semanas de idade, foram inoculadas por via intraperitoneal com 104 TCID50 das diferentes preparações de vacina (4 camundongos por grupo). A presença de anticorpos anti-MV foi examinada por ELISA (Trinity Biotech, Estados Unidos) em soro coletado um mês após a vacinação. Nesse caso, Mab anti-IgG de camundongo (Amersham) foi utilizado como anticorpo secundário. Cada determinação foi realizada em triplicata. A absorvância determinada com uma mistura de soros negativos de camundongos foi subtraída da absorvância medida em camundongos positivos. Como não foi possível, neste caso, utilizar o ISR para comparar as amostras, diluições em série de soros de camundongos foram testadas para determinar a diluição positiva de limite de ponto final.
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 48/86
34/44
Resultados Comparação de Respostas Imunológicas Humorais após a Vacinação de Macacos e Camundongos com Vacinas MV EdB-tag e Schwarz [090] O MV EdB-tag é um MV clonado molecularmente derivado da linhagem Edmonston B (16). Comparou-se a sua imunogenicidade em macacos com a da vacina de MV Schwarz comercial. O vírus EdB-tag foi preparado em células Vero infectadas em multiplicidade de infecção (MOI) de 0,05. Quando o sincício ocupou de 80% a 90% da cultura, as células foram fragmentadas, as células e o meio foram congelados/descongelados e os fragmentos celulares foram eliminados por centrifugação em baixa velocidade. O MV Schwarz, obtido pela Aventis Pasteur (Marcy l’Etoile, França) foi preparado da mesma forma a partir de fibroblastos de embriões de galinhas infectados (FEG) cultivados a 32°C, temperatura na qual dita linhagem foi adaptada a FEG. As titulações das 2 preparações de vacinas foram determinadas por meio de testes de diluição de ponto final em células Vero e expressos na forma de TCID50. Diferentes doses (103 a 105 TCID50) de MV EdB-tag e Schwarz foram injetadas por via subcutânea em macacos (2 macacos por dose). Como controle, os animais também receberam injeção de 104 TCID50 da vacina Scharwz comercial liofilizada (Rouvax, Aventis Pasteur). Os níveis de anticorpos anti-MV foram determinados por ELISA em soro de macacos coletados um mês após a vacinação. Os macacos inoculados com 103 e 104 TCID50 do MV Schwarz apresentaram níveis de anticorpos similares aos induzidos por dose padrão de vacina Rouvax (Fig. 6). Os macacos inoculados com 104 TCID50 de vírus EdB-tag permaneceram negativos (não exibidos). A injeção de doses 10 vezes maiores (105 TCID50) induziu apenas uma resposta fraca que foi mais baixa que a observada com 103 TCID50 de MV Schwarz (Fig. 6). Vacinação com a vacina comercial induziu a melhor resposta, provavelmente devido ao efeito adjuvante da liofilização.
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 49/86
35/44 [091] As diferentes preparações de vacina também foram testadas em camundongos geneticamente modificados obtidos conforme descrito em Materiais e Métodos. Foram utilizados 2 tipos de camundongos: camundongos que expressam CD46 (33), o receptor humano para linhagens de vacina de MV (34), e camundongos que expressam CD46 e não contêm o receptor IFN do tipo I (29). Camundongos com 6 semanas de vida foram inoculados por via intraperitoneal com 104 TCID50 das diferentes preparações de vacina (4 camundongos por grupo). A Figura 7 exibe a detecção de anticorpos anti- MV em soro dos 2 tipos de camundongos coletados um mês após a vacinação. Nos camundongos CD46, o vírus EdB-tag foi menos imunogênico que a vacina Schwarz. A titulação média obtida com o primeiro foi de 1/80, enquanto que com o último foi de 1/1.280. O vírus EdB-tag também foi menos imunogênico em camundongos CD46 que não contêm o receptor IFN do tipo I, mas a diferença foi menos pronunciada que em camundongos imunocompetentes CD46, o que possivelmente indica uma diferença de sensibilidade à IFN α/β entre as 2 linhagens virais.
IMUNOGENICIDADE DE MV SCHWARZ RECUPERADO DE CDNA [092] A imunogenicidade para macacos cynomolgus do vírus recuperado do plasmídeo pTM-MVSchw e passado 2 vezes em células Vero ou FEG foi comparada com a da vacina Schwarz industrial. Macacos cynomolgus foram utilizados nesse experimento devido à dificuldade de obtenção de macacos rhesus da China que fossem MV negativos. Os ditos macacos são tão sensíveis ao MV quanto macacos rhesus, conforme exibido por diversos estudos (28, 26). Os macacos (2 animais por preparação) foram injetados por via subcutânea com 104 TCID50 de vacina de MV Schwarz da Aventis ou MV Schwarz recuperado de plasmídeo pTM-MVSchw e cultivado em células Vero ou FEG. A presença de anticorpos anti-MV foi determinada em soro coletado em diferentes momentos (Fig. 8). Todos os macacos vacinados tornaram-se
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 50/86
36/44 positivos. Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada, 1 ou 2 meses após a imunização, entre as diferentes preparações de vacina testadas. Este resultado demonstra que o vírus recuperado do plasmídeo pTMMVSchw possui a mesma imunogenicidade em primatas não-humanos que a vacina Schwarz parental. Nenhuma diferença foi detectada entre os vírus recuperados cultivados em células Vero ou FEG, o que indica que as 2 mutações geradas na proteína F pelas passagens em células Vero não afetaram a imunogenicidade do vírus.
[093] Mudanças na quantidade do total de glóbulos brancos (WBC), linfócitos e monócitos foram observadas durante o primeiro mês após a inoculação (Fig. 9). Houve suave leucopenia durante a primeira semana, conforme observado anteriormente após vacinação com MV (1). Durante a segunda semana, observou-se claro aumento da quantidade de monócitos e linfócitos em circulação. O dito aumento coincidiu com um pico da quantidade de linfócitos T específicos de MV, conforme detectado por meio de teste γ-IFN ELISpot (Fig. 9D). Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi detectada entre as respostas imunológicas celulares específicas induzidas pelo MV Schwarz recuperado do plasmídeo e a vacina Schwarz preparada pela Aventis.
Discussão [094] No presente trabalho, foi descrita a clonagem e o recuperação da linhagem atenuada Schwarz/Moraten de vírus do sarampo, componente de 2 vacinas contra sarampo amplamente utilizadas, Attenuavax (Merck and Co. Inc., West Point, Estados Unidos) e Rouvax (Aventis Pasteur, Marcy l’Etoile, França) e da vacina combinada contra sarampo, caxumba e rubéola (MMR) (35). Para utilização em teste clínico pediátrico, MV atenuado vivo produzido a partir de cDNA deve ser tão seguro e eficiente quanto a vacina parental. Considerando que a segurança e a eficiência dependem da
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 51/86
37/44 sequência genômica da linhagem atenuada, clonou-se o cDNA de MV Schwarz a partir de partículas virais preparadas a partir de um lote industrial de vacina, utilizando-se procedimentos otimizados para fidelidade de clonagem. Como resultado, a sequência do clone obtido foi idêntica à do genoma de MV Schwarz parental. Para maximizar o rendimento durante a recuperação, o cDNA antigênico viral foi colocado sob o controle de um promotor da T7 RNA polimerase com a unidade GGG necessário para eficiência total. Uma ribozima do tipo cabeça de martelo foi inserida entre a dita unidade GGG e o primeiro nucleotídeo viral para permitir a clivagem exata do RNA viral. A fim de evitar a adaptação da vacina de Schwarz a células não-certificadas durante a recuperação, células auxiliares transfectadas com o cDNA elaborado foram cocultivadas com FEG, as células nas quais esta vacina foi selecionada originalmente e é atualmente preparada. O vírus recuperado foi passado 2 vezes em FEG e o seu genoma foi totalmente sequenciado. Nenhuma mutação foi encontrada quando a sequência foi comparada com a do vírus original. Além disso, a cinética de crescimento e o rendimento do vírus recuperado e do vírus Schwarz original em FEG foram idênticos.
[095] O vírus Schwarz também foi recuperado após o co-cultivo de células auxiliares transfectadas com células Vero, que são muito permissivas a MV. Nesse caso, entretanto, 2 mutações surgiram na proteína de fusão viral (F) após 2 passagens em células Vero. Esta rápida adaptação correlacionou-se com fenótipo muito mais fusogênico em células Vero. Por outro lado, o MV Schwarz recuperado não foi fusogênico em FEG (apenas raro sincício pôde ser observado em FEG infectada). As 2 mutações ocorreram na proteína F (G->R na posição 266 e Y->S na posição 365). Ditas mutações estão presentes no vírus EdB-tag (vide Figura 6) que é cultivado em células Vero. Estas mutações também estão presentes na linhagem Hallé, que é altamente relacionada à linhagem Edmonston e não infecta FEG (31). Estas 2
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 52/86
38/44 mutações aparecem, portanto, correlacionadas com a fusão melhorada em células Vero. A rápida adaptação da proteína F após apenas 2 passagens do vírus Schwarz em células Vero demonstra que, a fim de manter a sua integridade genética, a vacina deve ser cultivada em FEG.
[096] O vírus recuperado do plasmídeo pTM-Schw apresentou a mesma imunogenicidade em macacos como os da vacina de Schwarz parental. É importante enfatizar que, nestes experimentos, macacos foram inoculados com baixa dose de vírus utilizada para imunização humana. Portanto, será possível realizar testes clínicos humanos com este vírus utilizando-se doses de vacina padrão (104 TCID50). Por outro lado, o MV EdB-tag previamente clonado não foi imunogênico em macacos e foi pouco imunogênico em camundongos transgênicos para CD46, quando utilizado na mesma dosagem do MV Schwarz clonado.
[097] Qual poderia ser a razão da maior imunogenicidade da linhagem de MV Schwarz? A indução de boa imunogenicidade com vacina viral viva atenuada requer replicação em tecidos em um nível suficientemente alto para preparar o sistema imunológico adequadamente. Diversas mutações entre os genomas de MV Schwarz e EdB-tag estão localizadas nos genes P/V/C e L, o que sugere diferença na eficiência da replicação. É possível que o MV Schwarz se replique em células linfóides in vivo de modo mais eficiente que o MV EdB-tag, embora eles se repliquem na mesma velocidade em células Vero. A replicação eficiente in vivo requer algum mecanismo de evasão da resposta de IFN-α/β. As células Vero, nas quais o vírus EdB-tag foi adaptado, não respondem ao estímulo de IFN-α/β. Portanto, o MV EdB-tag foi selecionado na ausência de uma resposta IFN-α/β e poderá ser particularmente sensível ao dito mecanismo de defesa hospedeiro. De fato, demonstrou-se que a passagem de MV do tipo selvagem em células Vero modifica o fenótipo do vírus de não-indutor de IFN para indutor de IFN (36). Além disso, o fato do MV
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 53/86
39/44 de Ed-tag ter sido imunogênico em camundongos transgênicos para o receptor de CD46, desde que também fossem decisivos para o receptor IFN-α/β, sugere que este vírus é, particularmente, sensível a IFN. De forma interessante, a resposta de IFN-α/β ajuda na preparação da resposta imunológica específica contra a vacina. Portanto, uma boa vacina viva deve ao mesmo tempo induzir uma resposta IFN-α/β e evadi-la até certo ponto. Por esta razão, a seleção de vacinas virais atenuadas em células primárias com intensa resposta de IFN-α/β, tais como FEG, poderá ser uma boa estratégia.
[098] Os produtos de MV que contribuem para a resistência a IFN não foram identificados. Entretanto, demonstrou-se que a proteína C não estrutural do vírus Sendai intimamente relacionado combate o estado antiviral induzido por IFN (37). As 5 mutações não relacionadas a qualquer subgrupo Edmonston encontradas no gene P/V/C EdB-tag poderão ser responsáveis pela sua baixa imunogenicidade em macacos. Por outro lado, as 2 mutações geradas na proteína F por meio de passagem do vírus Schwarz em células Vero não afetaram o seu potencial imunológico, indicando que a propriedade fusogênica das proteínas do envelope viral pode não desempenhar papel importante na imunogenicidade.
[099] O plasmídeo pTM-MVSchw foi elaborado para a expressão de genes exógenos por meio da introdução de 2 ATU em diferentes posições do genoma. O MV Schwarz recombinante recuperado expressou a proteína fluorescente verde, de forma a demonstrar que esta nova vacina contra sarampo funciona como vetor. Em conclusão, este clone molecular permitirá a produção de vacina de MV sem depender de estoques de sementes. Com as suas ATUs, será possível utilizá-lo como vetor para a produção de vacinas recombinantes com base na linhagem de vacina aprovada, eficiente e utilizada mundialmente.
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 54/86
40/44
Bibliografia
1. Andino, R., D. Silvera, S. D. Suggett, P. L. Achacoso, C. J. Miller, D. Baltimore e M. B. Feinberg. 1994. Engineering Poliovirus as a Vaccine Vector for the Expression of Diverse Antigens. Science. 265: 1.448-1.451.
2. Ballart, I., D. Eschle, R. Cattaneo, A. Schmid, M. Metzler, J. Chan, S. Pifko-Hirst, S. A. Udem e M. A. Billeter. 1990. Infectious Measles Virus from Cloned cDNA. Embo J. 9: 379-384.
3. Crotty, S., C. J. Miller, B. L. Lohman, M. R. Neagu, L. Compton, D. Lu, F. X. Lu, L. Fritts, J. D. Lifson e R. Andino. 2001. Protection against Simian Immunodeficiency Virus Vaginal Challenge by Using Sabin Poliovirus Vectors. J. Virol. 75: 7.435-7.452.
4. Enders, J. F. e T. C. Peebles. 1954. Propagation in Tissue Cultures of Cytopathogenic Agents from Patients with Measles. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 277-286.
5. Felsenstein, J. 1989. Cladistics. 5: 164-166.
6. Griffin, D. e W. Bellini. 1996. Measles Virus, págs. 1.267-1.312. in B. Fields, D. Knipe et al (ed.), Virology, vol. 2. Lippincott-Raven Publishers, Filadélfia, Estados Unidos.
7. Hilleman, M. 2002. Current Overview of the Pathogenesis and Prophylaxis of Measles with Focus on Practical Implications. Vaccine. 20: 651-665.
8. Kobune, F., H. Sakata e A. Sugiura. 1990. Marmoset Lymphoblastoid Cells as a Sensitive Host for Isolation of Measles Virus. J. Virol. 64: 700-705.
9. Lamb, R. e D. Kolakofsky. 1996. Paramyxoviridae: the Viruses and their Replication, págs. 1.177-1.199. in B. Fields, D. Knipe et al (ed.), Fields Virology. Lippincott-Raven Publishers, Filadélfia, Estados Unidos.
10. Page, R. D. 1996. TreeView: an Application to Display Phylogenetic Trees on Personal Computers. Comput. Appl. Biosci. 12: 357-358.
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 55/86
41/44
11. Palese, P. 1998. RNA Virus Vectors: Where Are We and Where we Need to Go? Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95: 12.750-12.752.
12. Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, M. S. Sidhu e S. A. Udem. 1999. Enhanced Measles Virus cDNA Rescue and Gene Expression After Heat Shock. J. Virol. 73: 3.560-3.566.
13. Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu e S. A. Udem. 2001. Analysis of the Noncoding Regions of Measles Virus Strains in the Edmonston Vaccine Lineage. J. Virol. 75: 921-933.
14. Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu e S. A. Udem. 2001. Comparison of Predicted Amino Acid Sequences of Measles Virus Strains in the Edmonston Vaccine Lineage. J. Virol. 75: 910-920.
15. Racaniello, V. R. e D. Baltimore. 1981. Cloned Poliovirus Complementary DNA is Infectious in Mammalian Cells. Science. 214: 916-919.
16. Radecke, F. e M. Billeter. 1997. Reverse Genetics Meets the Nonsegmented Negative-Strand RNA Viruses. Reviews in Medical Virology, 7: 49-63.
17. Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Dotsch, G. Christiansen e M. Billeter. 1995. Rescue of Measles Viruses from Cloned DNA. EMBO Journal. 14: 5.773-5.784.
18. Singh, M. e M. Billeter. 1999. A Recombinant Measles Virus Expressing Biologically Active Human Interleukin-12. J. Gen. Virol. 80: 101106.
19. Singh, M., R. Cattaneo e M. Billeter. 1999. A Recombinant Measles Virus Expressing Hepatitis B Virus Surface Antigen Induces Humoral Immune Responses in Genetically Modified Mice. J. Virol. 73: 4823-4828.
20. Spielhofer, P., T. Bachi, T. Fehr, G. Christiansen, R. Cattaneo, K. Kaelin, M. Billeter e H. Naim. 1998. Chimeric Measles Viruses with a Foreign Envelope. J. Virol. 72: 2.150-2.159.
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 56/86
42/44
21. Takeda, M., A. Kato, F. Kobune, H. Sakata, Y. Li, T. Shioda, Y. Sakai, M. Asakawa e Y. Nagai. 1998. Measles Vírus Attenuation Associated with Transcriptional Impediment and a few Amino Acid Changes in the Polymerase and Accessory Proteins. J. Virol. 72: 8.690-8.696.
22. Takeuchi, K., N. Miyajima, F. Kobune e M. Tashiro. 2000. Comparative Nucleotide Sequence Analyses of the Entire Genomes of B95a Cell-Isolated and Vero Cell-Isolated Measles Viruses from the Same Patient. Virus Genes. 20: 253-257.
23. Tangy, F., A. McAllister e M. Brahic. 1989. Molecular Cloning of the Complete Genome of Theiler’s Virus, Strain GDVII, and Production of Infectious Transcripts. J. Virol. 63: 1.101-1.106.
24. Thompson, J. D., D. G. Higgins e T. J. Gibson. 1994. CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighing, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice. Nucleic Acids Res. 22: 4.673-4.680.
25. Wang, Z., T. Hangartner, L. Cornu, A. Martin, M. Zuniga, M. Billeter e H. Naim. 2001. Recombinant Measles Viruses Expressing Heterologus Antigens of Mumps and Simiam Immunodeficiency Viruses. Vaccine. 19: 2.329-2.336.
26. Van Binnendijk, R. S., R. W. J. Van der Heijden, G. Van Amerongen, F. UytdeHaag e A. D. M. E. Osterhaus. 1994. Viral Replication and Development of Specific Immunity in Macaques After Infection with Different Measles Virus Strains. The Journal of Infectious Diseases. 170: 443448.
27. Mrkic, B., B. Odermatt, M. Klein, M. Billeter, J. Pavlovic e R. Cattaneo. 1999. Lymphatic Dissemination and Comparative Pathology of Recombinant Measles Viruses in Genetically Modified Mice. Journal of Virology. 74: 1.364-1.372.
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 57/86
43/44
28. Kobune, F., H. Takahashi, K. Terao, T. Ohkawa, Y. Ami, Y. Suzaki, N. Nagata, H. Sakata, K. Yamanouchi e C. Kai. 1996. Nonhuman Primate Models of Measles. Laboratory Animal Science. 46: 315-320.
29. Mrkic, B., J. Pavlovic, T. Rulicke, P. Volpe, C. J. Buchholz, D. Hourcade, J. P. Atkinson, A. Aguzzi e R. Cattaneo. 1998. Measles Virus Spread and Pathogenesis in Genetically Modified Mice. J. Virol. 72: 7.420-7.427.
30. Müller, U., U. Steinhoff, L. F. L. Reis, S. Hemmi, J. Pavlovic, R. M. Zinkernagel e M. Aguet. 1994. Functional Role of Type I and Type II Interferons in Antiviral Defense. Science. 264: 1.918-1.921.
31. Escoffier, C. e D. Gerlier. 1999. Infection of Chicken Embryonic Fibroblasts by Measles Vírus: Adaptation at the Vírus Entry Level. J. Virol. 73: 5.220.5.224.
32. Koert J. Stittelaar, Linda S. Wyatt, Rik L. de Swart, Helma W. Vos, Jan Groen, Geert van Amerongen, Robert S. van Binnedijk, Shmuel Rozenblatt, Bernard Moss e Albert D. M. E. Osterhaus. Maio de 2000. Protective Immunity in Macaques Vaccinated with a Modified Vaccinia Virus ankara-Based Measles Virus Vaccine in the Presence of Passively Acquired Antibodies. Journal of Virology. Vol. 74, n° 9: 4.236-4.243.
33. Yannoutsos, N., J. N. Ijzermans, C. Harkes, F. Bonthuis, C. Y. Zhou, D. White, R. L. Marquet e F. Grosveld. 1996. A Membrane Cofactor Protein Transgenic Mouse Model for the Study of Discordant Xenograft Rejection (errata publicada aparece em Genes Cells, agosto de 1996; 1 (8): 785). Genes Cells. 1: 409-419.
34. Naniche, D., G. Varior-Krishnan, F. Cervoni, T. F. Wild, B. Rossi, C. Rabourdin-Combe e D. Gerlier. 1993. Human Membrane Cofactor Protein (CD46) Acts as a Cellular Receptor for Measles Virus. J. Virol. 67: 6.025-6.032.
Petição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 58/86
44/44
35. Buynak, E., R. Weibel, W. J. JE, J. Stokes Jr. e M. Hilleman. 1969. Combined Live Measles, Mumps and Rubella Vírus Vaccines. J. Am. Med. Assoc. 207: 2.259-2.262.
36. Naniche, D., A. Yeh, D. Eto, M. Manchester, R. M. Friedman e M. B. A. Oldstone. 2000. Evasion of Host Defenses by Measles Virus: WildType Measles Virus Infection Interferes with Induction of Alpha/Beta Interferon.
37. Garcin, D., P. Latorre e D. Kolakofsky. 1999. Sendai Virus C Proteins Counteract the Interferon-Mediated Induction of an Antiviral State. J. Virol. 73: 6.559-6.565.
Claims (3)
- Reivindicações1. VETOR, caracterizado por ser o plasmídeo pTM-MVSchw depositado na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 12 de junho de 2002 sob o número I-2889.2. VETOR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma sequência de DNA heteróloga nele inserida, que codifica uma sequência de aminoácido imunogênica de um patógeno, desde que a molécula de cDNA recombinante obtida seja um múltiplo de 6.3. VETOR, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela molécula de cDNA e a dita sequência de DNA heteróloga estarem contidas em uma unidade de replicação (replicon), onde dito replicon é um múltiplo de 6.4. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 3, caracterizado pela dita sequência de DNA heteróloga estar inserida em uma Unidade de Transcrição Adicional (ATU) que consiste em um cassete de múltiplos sítios de clonagem clonada na dita molécula de cDNA.5. VETOR, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela Unidade de Transcrição Adicional (ATU) ser clonada no segmento 5' da molécula de cDNA.6. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 5, caracterizado pela Unidade de Transcrição Adicional (ATU) ser clonada a montante do gene M do vírus do sarampo contido na molécula de cDNA.7. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 5, caracterizado pela Unidade de Transcrição Adicional (ATU) ser clonada entre os genes N e P do vírus do sarampo contidos na molécula de cDNA.8. VETOR, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser o plasmídeo pTM-MVSchw2-gfp depositado na Coleção Nacional dePetição 870190015827, de 15/02/2019, pág. 60/862/2Culturas de Microrganismos (CNCM) sob o número I-2890 ou o plasmídeo pTM-MVSchw2-GFPbis depositado na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) sob o número I-3034.9. PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PARTÍCULAS INFECCIOSAS DE VÍRUS DO SARAMPO, caracterizado por compreender:1) transfecção de células auxiliares com um vetor, conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que as ditas células auxiliares expressam uma T7 ácido ribonucleico (RNA) polimerase e proteínas N, P e L do vírus do sarampo (MV);
- 2) co-cultivo das ditas células auxiliares transfectadas da etapa 1) com células passadas apropriadas para a passagem da linhagem de vacina do vírus do sarampo (MV) da qual origina-se o cDNA; e
- 3) recuperação das partículas virais de sarampo (MV) infecciosas produzidas.10. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela etapa de transfecção ser seguida pela substituição do meio de transfecção por um meio fresco e aplicação de choque térmico antes da incubação.11. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizado pelas células auxiliares serem derivadas da linhagem 293 de células de rim embrionário humano (ATCC CRL-1573).12. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelas células apropriadas para passagem serem células de fibroblasto embrionário de galinha (FEG).13. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado por ser utilizado para a produção de vírus do sarampo infeccioso apropriado para uso como princípio ativo em composição de vacina.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP02291551A EP1375512B1 (en) | 2002-06-20 | 2002-06-20 | Infectious cDNA of an approved vaccine strain of measles virus. Use for immunogenic compositions |
| EP02291551.6 | 2002-06-20 | ||
| PCT/EP2003/007145 WO2004000876A1 (en) | 2002-06-20 | 2003-06-20 | INFECTIOUS cDNA OF AN APPROVED VACCINE STRAIN OF MEASLES VIRUS, USE FOR IMMUNOGENIC COMPOSITIONS |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR0312173A BR0312173A (pt) | 2005-04-05 |
| BRPI0312173B1 true BRPI0312173B1 (pt) | 2019-05-07 |
| BRPI0312173B8 BRPI0312173B8 (pt) | 2021-05-25 |
Family
ID=29716946
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0312173A BRPI0312173B8 (pt) | 2002-06-20 | 2003-06-20 | vetor e processo para a preparação de partículas infecciosas de vírus do sarampo |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9005961B2 (pt) |
| EP (5) | EP2110382A1 (pt) |
| KR (1) | KR101227128B1 (pt) |
| CN (1) | CN100577683C (pt) |
| AT (1) | ATE437175T1 (pt) |
| AU (1) | AU2003266950A1 (pt) |
| BR (1) | BRPI0312173B8 (pt) |
| CA (1) | CA2489052C (pt) |
| CY (1) | CY1109506T1 (pt) |
| DE (1) | DE60233038D1 (pt) |
| DK (2) | DK1375512T3 (pt) |
| ES (2) | ES2330309T3 (pt) |
| HK (1) | HK1061568A1 (pt) |
| PT (1) | PT1375512E (pt) |
| WO (1) | WO2004000876A1 (pt) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1201750A1 (en) | 2000-10-26 | 2002-05-02 | Genopoietic | Synthetic viruses and uses thereof |
| ATE437175T1 (de) * | 2002-06-20 | 2009-08-15 | Pasteur Institut | Infektiöse cdna eines zugelassenen impfstammes des masern virus. verwendung in immunogenen zusammensetzungen |
| ES2427139T3 (es) * | 2002-06-20 | 2013-10-29 | Institut Pasteur | Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna |
| CA2432738A1 (en) | 2003-02-26 | 2004-08-26 | Philippe Despres | New dengue and west nile viruses proteins and genes coding the foregoing, and their use in vaccinal, therapeutic and diagnostic applications |
| WO2009005917A2 (en) * | 2007-05-29 | 2009-01-08 | Vical Incorporated | Methods of treating measles infectious disease in mammals |
| EP3037526B1 (en) * | 2007-11-26 | 2018-03-14 | London School of Hygiene and Tropical Medicine | Method for producing vaccinal viral strain of a virus of the reoviridae family |
| EP2085479A1 (en) * | 2008-01-31 | 2009-08-05 | Institut Pasteur | Reverse genetics of negative-strand rna viruses in yeast |
| EP2420242A1 (en) | 2010-08-20 | 2012-02-22 | Lauer, Ulrich M. | Oncolytic measles virus |
| US20130122038A1 (en) | 2011-11-14 | 2013-05-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department | Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines |
| EP2712871A1 (en) | 2012-09-27 | 2014-04-02 | Institut Pasteur | Recombinant Measles virus expressing Chikungunya virus polypeptides and their applications |
| EP2759301A1 (en) | 2013-01-24 | 2014-07-30 | Institut Pasteur | Use of a genetically modified infectious measles virus with enhanced pro-apoptotic properties (MV-DeltaC virus) |
| WO2015092710A1 (en) | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Contralateral co-administration of vaccines |
| EP2959915A1 (en) | 2014-06-23 | 2015-12-30 | Institut Pasteur | A dengue virus chimeric polyepitope composed of fragments of non-structural proteins and its use in an immunogenic composition against dengue virus infection |
| EP3103474A1 (en) * | 2015-06-12 | 2016-12-14 | Institut Pasteur | Live recombinant measles-m2 virus and its use in eliciting immunity against influenza viruses |
| EP3184119A1 (en) | 2015-12-23 | 2017-06-28 | Themis Bioscience GmbH | Chromatography based purification strategies for measles scaffold based viruses |
| JP6949468B2 (ja) * | 2016-10-17 | 2021-10-13 | ルプレヒト−カールス−ウニベルジテート ハイデルベルク | 腫瘍抗原をコードする麻疹ウイルス |
| WO2018206512A1 (en) * | 2017-05-09 | 2018-11-15 | Invectys | Recombinant measles vaccine expressing htert |
| EP3412307A1 (en) | 2017-06-07 | 2018-12-12 | Institut Pasteur | Recombinant measles virus expressing zika virus proteins and their applications |
| EP3707154A1 (en) | 2017-11-09 | 2020-09-16 | Institut Pasteur | A zika virus chimeric polyepitope comprising non-structural proteins and its use in an immunogenic composition |
| SG11202004899SA (en) * | 2017-12-21 | 2020-06-29 | Pasteur Institut | Lassa vaccine |
| CN111218475A (zh) * | 2018-11-23 | 2020-06-02 | 成都生物制品研究所有限责任公司 | 一种拯救麻疹Schwarz/Moraten疫苗株的系统和方法 |
| KR20220141332A (ko) * | 2020-02-13 | 2022-10-19 | 앵스티띠 파스퇴르 | 홍역-벡터화된 covid-19 면역원성 조성물 및 백신 |
| EP3865180A1 (en) * | 2020-02-13 | 2021-08-18 | Institut Pasteur | Live recombinant measles virus expressing coronavirus antigens - its use in eliciting immunity against coronaviruses |
| EP3936517A1 (en) | 2020-07-08 | 2022-01-12 | Institut Pasteur | An improved measles virus vaccine vector based on multiple tandem additional transcription units |
| AU2022208199A1 (en) | 2021-01-13 | 2023-07-13 | Centre National De La Recherche Scientifique | Measles-hiv or measles-htlv vaccine |
| CN113293148B (zh) * | 2021-03-10 | 2022-10-25 | 上海青赛生物科技有限公司 | 一种h基因替换的嵌合麻疹减毒株的构建 |
| WO2022195900A1 (ja) * | 2021-03-15 | 2022-09-22 | 国立大学法人東京大学 | 組換え麻疹ウイルス |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU7007491A (en) | 1990-02-02 | 1991-08-08 | Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern | Cdna corresponding to the genome of negative-strand rna viruses, and process for the production of infectious negative-strand rna viruses |
| JP3045581B2 (ja) | 1991-10-14 | 2000-05-29 | 社団法人北里研究所 | 麻疹ワクチンウイルス株同定方法 |
| DE69510207T3 (de) * | 1995-08-09 | 2007-02-15 | Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern | Verfahren zur Herstellung von infektiösen minussträngigen RNA-Viren |
| CA2265554A1 (en) * | 1996-09-27 | 1998-04-02 | American Cyanamid Company | 3' genomic promoter region and polymerase gene mutations responsible for attenuation in viruses of the order designated mononegavirales |
| JP4504464B2 (ja) | 1997-02-28 | 2010-07-14 | サノフィ パスツール バイオロジクス カンパニー | キメラフラビウイルスワクチン |
| BRPI9701774B8 (pt) * | 1997-04-11 | 2015-09-29 | Fundação Oswaldo Cruz Fiocruz | cdna mutante e infeccioso do vírus da febre amarela, constructo de dna, vírus recombinante de febre amarela e vacina para humanos contra infecções de febre amarela. |
| US6410023B1 (en) * | 1997-05-23 | 2002-06-25 | United States Of America | Recombinant parainfluenza virus vaccines attenuated by deletion or ablation of a non-essential gene |
| KR20010080863A (ko) * | 1998-03-26 | 2001-08-25 | 윌리암 에이취 캘넌, 에곤 이 버그 | 마진 바이러스 또는 인간 호흡기 합포체 바이러스서브그룹 비에서 감쇠 담당 돌연변이 |
| WO1999063064A1 (en) * | 1998-06-03 | 1999-12-09 | American Cyanamid Company | Novel methods for rescue of rna viruses |
| US6146642A (en) | 1998-09-14 | 2000-11-14 | Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York | Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines |
| KR100884673B1 (ko) | 1999-08-02 | 2009-02-18 | 와이어쓰 | 씨디엔에이로부터 멈프스 바이러스의 구제 |
| HU229101B1 (en) * | 2000-04-28 | 2013-07-29 | St Jude Childrens Res Hospital | Dna transfection system for the generation of infectious influenza virus |
| ES2427139T3 (es) | 2002-06-20 | 2013-10-29 | Institut Pasteur | Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna |
| ATE437175T1 (de) * | 2002-06-20 | 2009-08-15 | Pasteur Institut | Infektiöse cdna eines zugelassenen impfstammes des masern virus. verwendung in immunogenen zusammensetzungen |
| CA2432738A1 (en) | 2003-02-26 | 2004-08-26 | Philippe Despres | New dengue and west nile viruses proteins and genes coding the foregoing, and their use in vaccinal, therapeutic and diagnostic applications |
| CA2508266A1 (fr) | 2005-06-20 | 2006-12-20 | Institut Pasteur | Polypeptides chimeriques et leurs applications therapeutiques contre une infection a flaviviridae |
| DK1939214T3 (da) | 2006-12-22 | 2013-10-14 | Pasteur Institut | Celler og metodik til at generere ikke-segmenterede negativstrengede RNA-vira |
| EA027784B1 (ru) * | 2008-05-26 | 2017-09-29 | Кадила Хелзкэр Лимитед | Комбинированная вакцина против кори и вируса папилломы человека |
| UA104180C2 (uk) * | 2009-05-05 | 2014-01-10 | Каділа Хелткере Лімітед | Комбінована вакцина проти кору та малярії |
-
2002
- 2002-06-20 AT AT02291551T patent/ATE437175T1/de active
- 2002-06-20 DK DK02291551T patent/DK1375512T3/da active
- 2002-06-20 PT PT02291551T patent/PT1375512E/pt unknown
- 2002-06-20 EP EP09165802A patent/EP2110382A1/en not_active Withdrawn
- 2002-06-20 EP EP02291551A patent/EP1375512B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-20 DE DE60233038T patent/DE60233038D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-20 ES ES02291551T patent/ES2330309T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-06-20 EP EP03747858A patent/EP1513872A1/en not_active Ceased
- 2003-06-20 CA CA2489052A patent/CA2489052C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-20 ES ES10184511.3T patent/ES2663224T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-20 CN CN03814471A patent/CN100577683C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-20 WO PCT/EP2003/007145 patent/WO2004000876A1/en not_active Application Discontinuation
- 2003-06-20 AU AU2003266950A patent/AU2003266950A1/en not_active Abandoned
- 2003-06-20 EP EP10184511.3A patent/EP2311853B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-20 KR KR1020047020803A patent/KR101227128B1/ko active IP Right Grant
- 2003-06-20 EP EP08169719A patent/EP2065393A1/en not_active Withdrawn
- 2003-06-20 DK DK10184511.3T patent/DK2311853T3/en active
- 2003-06-20 BR BRPI0312173A patent/BRPI0312173B8/pt active IP Right Grant
-
2004
- 2004-06-16 HK HK04104400.2A patent/HK1061568A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2004-12-17 US US11/013,786 patent/US9005961B2/en active Active
-
2008
- 2008-07-24 US US12/219,570 patent/US9005925B2/en active Active
-
2009
- 2009-09-18 CY CY20091100970T patent/CY1109506T1/el unknown
-
2015
- 2015-03-24 US US14/667,088 patent/US9701944B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9701944B2 (en) | Infectious cDNA of an approved vaccine strain of measles virus, use for immunogenic compositions | |
| Combredet et al. | A molecularly cloned Schwarz strain of measles virus vaccine induces strong immune responses in macaques and transgenic mice | |
| JP5902371B2 (ja) | 非分節型マイナス鎖ｒｎａウイルスを作出するための細胞及び方法 | |
| Zuniga et al. | Attenuated measles virus as a vaccine vector | |
| KR101020532B1 (ko) | ｃＤＮＡ로부터의 비분절 네가티브 쇄 ＲＮＡ 바이러스의 회수를 위한 개선된 방법 | |
| CN1688702B (zh) | 表达rna病毒抗原表位的重组麻疹病毒在制备疫苗组合物中的用途 | |
| Tangy et al. | Live attenuated measles vaccine as a potential multivalent pediatric vaccination vector | |
| CN103160473B (zh) | 用于拯救麻疹病毒的组合物、试剂盒、用途及方法 | |
| US11976305B2 (en) | Lassa vaccine | |
| Skiadopoulos et al. | Long nucleotide insertions between the HN and L protein coding regions of human parainfluenza virus type 3 yield viruses with temperature-sensitive and attenuation phenotypes | |
| Strong | A Molecularly Cloned Schwarz Strain of | |
| Rennick et al. | Modification of measles virus and application to pathogenesis studies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B08E | Application fees: payment of additional fee required [chapter 8.5 patent gazette] |
Free format text: COMPLEMENTAR A RETRIBUICAO DA 9A ANUIDADE, DE ACORDO COM TABELA VIGENTE, REFERENTE A GUIA A GUIA DE RECOLHIMENTO 22110681725-1. |
|
| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] | ||
| B08G | Application fees: restoration [chapter 8.7 patent gazette] | ||
| B07E | Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette] | ||
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 07/05/2019, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. (CO) 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 07/05/2019, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS |
|
| B16C | Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 20/06/2003 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF |