JP5619614B2 - レオウイルス科のウイルスのワクチン用ウイルス株を製造する方法 - Google Patents

Description

本発明は、レオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）科の一員であるウイルスの改変ウイルス株を製造する方法に関し、特に、オルビウイルス（Ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ）属のワクチン用ウイルス株に関する。

２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）からなるゲノムを有するレオウイルス科のウイルスは、多くの疾患を引き起こす。レオウイルス科のウイルスであるオルビウイルスも、広範な疾患を引き起こす。オルビウイルスの例は、アフリカ馬疫ウイルス（ＡＨＳＶ）、流行性出血熱ウイルス（ＥＨＤＶ）およびブルータングウイルス（ＢＴＶ）である。

アフリカ馬疫ウイルス（ＡＨＳＶ）、流行性出血熱ウイルス（ＥＨＤＶ）およびブルータングウイルス（ＢＴＶ）は、反芻動物の非接触感染性ウイルス疾患であり、通常、媒介昆虫により広がる。ＡＨＳＶは、通常、ウマ、ラバ、ロバおよびシマウマに罹患し、ＥＨＤＶは、通常、シカ、ウシおよびヒツジに罹患し、ＢＴＶは、通常、ウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、シカ、ヒトコブラクダおよびアンテロープに罹患する。

ブルータングウイルス（ＢＴＶ）は、野生反芻動物および家畜の媒介昆虫媒介性新興病原体であり、欧州の農業に対して大きい経済的影響をもたらした。ＢＴＶは、ヒツジ、ヤギおよびウシで疾患を引き起こし、ヒツジの品種によっては死亡率が７０％に到達する。ＢＴＶは、クリコイデス（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ）属のヌカカのいくつかの種により哺乳動物宿主間で伝染し、これらが地理的範囲を決定する。ＢＴＶは、多くの熱帯および亜熱帯の国々で地域流行性であるが、１９９８年から、ＢＴＶのヨーロッパ本土への侵入が通常の事象となり、２００７年にはＵＫまで北限が到達している。分子疫学研究は、６つの異なる血清型（ＢＴＶ１、２、４、８、９および１６）が、１９９８年から、少なくとも８回の別々の機会に、少なくとも３つの異なる経路により、１９９８年からほとんどの年に新しく導入されながらヨーロッパ本土に導入されていることを示す。媒介昆虫ベクター集団の分布およびサイズが増大していることと、中央および北部ヨーロッパに豊富にある新規な媒介種によるＢＴＶの伝染が、ＢＴＶの範囲が増大していることに対するおそらく直接的な原因である。家畜または野生反芻動物の診断されていない感染の存在は、媒介昆虫ベクターの移動による長距離にわたる迅速な広がりと結びついて、ヨーロッパにおいて流行病となったＢＴＶ予防の失敗をもたらした。よって、ＢＴＶは、現在、全てのヨーロッパの国々における家畜に対する重大な脅威である。４つのＢＴＶ血清型が、現在、ヨーロッパで一般的であり、１８０万頭の動物の死亡をもたらしている。

生ワクチンおよび不活化ワクチンの両方を少数の血清型に対して用いるワクチン接種によりＢＴＶを管理することが、ヨーロッパで試みられている。両方のタイプのワクチンは、ヨーロッパの領域でいくらかの防御を提供したが、問題点がわかっている。生弱毒化ＢＴＶワクチンは、いくつかの問題点を有する：１）典型的なブルータング臨床症状の発症を導く弱毒化不足；２）毒性の復帰または野生型ウイルスとの再集合と、それに続く媒介昆虫ベクターによる広がり；３）ワクチン接種動物から感染動物を区別する（ＤＩＶＡ）戦略の使用を妨げる、自然感染動物からのワクチン接種動物の区別の不能性；および４）新しく循環する血清型の弱毒化株を製造するまでの時間の遅延。

不活化ワクチンは、ヨーロッパにおいてＢＴＶ２およびＢＴＶ４を管理するために用いられている。これらは、不活化、バッチごとの不活化の確認および低い免疫原性に伴う高い生産コストの問題を有する。

本発明者らは、ＢＴＶ ｓｓＲＮＡが、ヘルパーウイルスを用いることなく感染性であり、感染性ＢＴＶを細胞から回収できることを以前に報告した（Ｂｏｙｃｅ，Ｍ．およびＲｏｙ，Ｐ．、２００７）。この文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、レオウイルス科の一員であるウイルスのウイルス株を改変すること、特に生弱毒化ワクチンの作成に伴う、既知の問題点の一部または全部の低減または解消を目的とする。

本発明は、レオウイルス科の一員であるウイルスのワクチン用ウイルス株を製造する方法であって、
必須遺伝子の機能が破壊されるようにレオウイルス科のウイルスに変異を導入するステップと、
前記ウイルスのゲノムに由来し、前記変異を含むウイルス一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を細胞に形質移入するステップと、
前記ワクチン用ウイルス株の製造を導くための適切な条件下で形質移入された前記細胞を培養するステップと
を含み、前記細胞が、前記必須ウイルス遺伝子の機能を補完し、それによりワクチン用ウイルス株の前記細胞内での複製を可能にする方法を提供する。

用語「ワクチン用ウイルス株」とは、野生型ウイルスに通常罹患される特定の宿主を免疫するためのワクチンに用いられるのに適するウイルス株を意味する。ワクチン用ウイルス株は、非病原性であり、感染を引き起こすことができない。よって、これは、野生型ウイルスに通常付随する疾患を引き起こさない。ワクチン用ウイルス株の概念は、当業者に周知である。例えば、野生型ウイルスは、弱毒化または不活化ウイルスで免疫された宿主に、本格的な感染を引き起こすことなく免疫応答を生じるように、弱毒化または不活化され得る。このことにより、宿主が野生型ウイルスに曝露された場合に、効果的な免疫応答を宿主に備え付けることが可能になる。

本発明において、ウイルスは、レオウイルス科の一員である任意のウイルスであり得る。好ましくは、ウイルスは、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）属、コルチウイルス（Ｃｏｌｔｉｖｉｒｕｓ）属またはオルビウイルス属の一員である。より好ましくは、ウイルスはオルビウイルス属の一員である。さらにより好ましくは、ウイルスは、ブルータングウイルス（ＢＴＶ）、アフリカ馬疫ウイルス（ＡＨＳＶ）または流行性出血熱ウイルス（ＥＨＤＶ）である。最も好ましくは、ウイルスはブルータングウイルス（ＢＴＶ）である。

多くのウイルスが、いくつかの異なる血清型を有する。例えば、ＢＴＶは、２４の異なる血清型を有する。異なる血清型は、わずかに異なるタンパク質を有することができ、異なるゲノムに含まれる遺伝子の数が違うこともあり得る。さらに、将来、まだ見出されていない血清型が生じる可能性がある。よって、本発明は、既知または未知で、上記のカテゴリーの定義にあてはまるウイルス、例えばＢＴＶの任意の可能な血清型を含むことを意図する。

用語「必須遺伝子」とは、ウイルスが病原性であるために必須の遺伝子を意味する。必須遺伝子の機能が破壊された場合、得られるワクチン用ウイルス株は非病原性である。必須遺伝子の機能は、遺伝子に変異を導入することにより破壊される。少なくとも１つの必須遺伝子の機能が破壊されるべきである。好ましくは、複数の必須遺伝子の機能が破壊される。このことは、ウイルスが病原性表現型に確実に復帰しないようにすることの助けとなる。好ましくは、必須遺伝子またはそれぞれの必須遺伝子中の変異は、必須遺伝子の配列の大部分に影響する広範囲の変異である。ここでまた、このことは、ウイルスが病原性表現型に確実に復帰しないようにすることの助けとなる。変異は、ウイルスが非病原性表現型に変換されることを可能にする任意の必須遺伝子におけるものであり得る。好ましくは、変異は、酵素タンパク質、例えばポリメラーゼ、ヘリカーゼまたはキャップ形成酵素に導入される。あるいは、非構造タンパク質が不活化され得る。このことにより、ＤＩＶＡ戦略の使用が可能になる。これは、ワクチン接種動物から感染動物を区別することである。例えば、ＮＳ１をコードする遺伝子がＢＴＶにおいて欠失されると、ワクチン用株は、ワクチン接種動物においてＮＳ１を発現しない。よって、ワクチン接種動物ではＮＳ１に対する抗体応答が生じない。このことは、ＮＳ１が発現され、動物において抗体応答が生じる通常の感染とは異なる。監視の間に、ＮＳ１に対する抗体が検出されることは、動物が、ワクチン株でなく野生型ＢＴＶに感染したことを示す。さらに、マーカー抗原をコードする遺伝子をゲノムに導入できる。これは、動物がワクチン接種されたことを示す明確な抗原マーカーである。

変異は、遺伝子またはそれぞれの遺伝子に、任意の適切な方法で導入できる。例えば、変異は、ウイルスのゲノムに導入できる。このゲノムから産生されるｓｓＲＮＡ転写産物も変異を含む。あるいは、変異は、ｓｓＲＮＡに直接導入できる。このことは、例えば、ｓｓＲＮＡのある区画を、置き換えられる区画に対応するが変異も含む人工的に創出されたｓｓＲＮＡで置き換えることにより行うことができる。ある実施形態において、細胞に形質移入するために用いられるｓｓＲＮＡは、完全に人工的に産生されたものであり得る。この完全に人工的に産生されたｓｓＲＮＡは、１つまたは複数の必須遺伝子における変異を有するウイルスのゲノム全体に相当する。例えば、ある実施形態において、ｃＤＮＡクローンを、ウイルスゲノムの一部分で作製できる。

あるいは、ｃＤＮＡクローンは、ウイルスゲノム全体で作製できる。次いで、変異をｃＤＮＡクローンに導入して、例えば、種々の異なる変異を有するｃＤＮＡクローンのライブラリーを生成できる。これらのｃＤＮＡクローンからの転写産物は、次いで、細胞に形質移入するために用いられるｓｓＲＮＡとして用いることができる。よって、ｓｓＲＮＡの一部分を、ｃＤＮＡクローンから創出できる。あるいは、細胞に形質移入するために用いられるｓｓＲＮＡの全体を、ｃＤＮＡクローンから創出できる。

変異は、遺伝子の機能を破壊する任意の適切な変異であり得る。変異は、例えば、変異した遺伝子から非機能的タンパク質が産生されるような欠失または挿入の変異であり得る。好ましくは、大きな欠失変異がウイルスに導入される。

ｓｓＲＮＡを形質移入する細胞は、ｓｓＲＮＡの形質移入およびウイルス株の培養に適する任意の細胞であり得る。細胞は、ウイルス許容細胞である。好ましくは、細胞は、ＢＨＫ２１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、２９３Ｔ細胞、ＢＳＲ細胞（特定のＢＨＫ２１細胞のクローン）、ＨｅＬａ細胞、Ｃ６／３６細胞（ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）に由来する蚊の株化細胞）またはＫＣ細胞（天然媒介昆虫ベクタークリコイデス・ソノレンシス（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）に由来する小媒介昆虫株化細胞）である。より好ましくは、細胞はＢＳＲ細胞である。

細胞に形質移入するために用いられるｓｓＲＮＡは、ウイルスのゲノムの転写産物であり、上記の変異も含む。この転写産物は、変異を含むウイルスのｄｓＲＮＡゲノムから直接得ることができる。あるいは、転写産物はウイルスゲノムから間接的に得ることができる。例えば、転写産物は、ウイルスゲノムのｃＤＮＡクローンであって変異を含むｃＤＮＡクローンから作製できる。レオウイルス科のウイルス、例えばＢＴＶにおいて、ウイルスｓｓＲＮＡは、ウイルス粒子により感染細胞の細胞質において合成され、ここでこれは、ウイルスタンパク質合成のためのｍＲＮＡおよび新しいゲノムｄｓＲＮＡの合成のための鋳型として働く。本発明のｓｓＲＮＡは、これらの機能も果たすので、ｓｓＲＮＡ中の変異は、ｄｓＲＮＡゲノムの合成の間にワクチン用ウイルス株に組み込まれる。

ｓｓＲＮＡは、ウイルスの所望の免疫学的に適切なタンパク質を含むように改変されてよい。例えば、ウイルスがＢＴＶである場合、ｓｓＲＮＡは対象の血清型のＶＰ２およびＶＰ５をコードすることが好ましい。いくつかの実施形態において、ｓｓＲＮＡは、いくつかの異なるウイルス血清型からの種々の免疫学的に重要なタンパク質をコードしてよい。次いで、このようなｓｓＲＮＡは、いくつかの異なるウイルス血清型に対するワクチン接種に用いることができる。

好ましくは、細胞に形質移入するために用いられるウイルスｓｓＲＮＡは、単離ｓｓＲＮＡである。このことは、ｓｓＲＮＡが他のウイルス成分、例えばウイルス粒子、ウイルスｄｓＲＮＡおよびウイルスタンパク質を実質的に有さないことを意味する。

形質移入された細胞は、ワクチン用ウイルス株の製造を可能にする任意の適切な方法で、かつ任意の適切な条件下で培養できる。細胞を培養するこのような方法は、当業者に周知である。

細胞に形質移入するステップは、２以上の形質移入ステップを含むことが好ましく：
（１）第１の形質移入ステップは、ウイルスカプシドの内層の組み立てに必要な成分を少なくともコードするｓｓＲＮＡを細胞に形質移入することを含み、
（２）第２の形質移入ステップは、ウイルスゲノムの転写産物であり、変異を含み、したがってウイルスの組み立てに必要な全ての成分をコードするｓｓＲＮＡを細胞に形質移入することを含む。

２回の形質移入を行うことにより、製造されるウイルスのレベルがおよそ１０倍増大することがわかった。さらに、ゲノムパッケージングに必要な少なくとも１つのウイルス成分が第１の形質移入ステップで形質移入されるｓｓＲＮＡに確実にコードされていないようにすることにより、製造されるウイルスのレベルが、単一形質移入ステップだけで達成されるレベルのおよそ１００倍を超えて増大する。ＢＴＶを用いる場合、ウイルス成分ＶＰ２、ＶＰ５、ＶＰ７およびＮＳ３の少なくとも１つが第１の形質移入ステップにおいて形質移入されるｓｓＲＮＡによりコードされていないことが好ましい。好ましくは、ウイルス成分ＶＰ２、ＶＰ５、ＶＰ７およびＮＳ３の全てが、第１の形質移入ステップの間に削除される。

ウイルスカプシドの内層の組み立てのために充分な時間があるように、第１と第２の形質移入ステップの間に間隔があることが好ましい。好ましくは、第１と第２の形質移入ステップの間は、少なくとも６時間、より好ましくは１２時間、最も好ましくは１８時間である。

細胞は、必須ウイルス遺伝子の機能を補完する。このことは、細胞が不活性化された必須遺伝子のコピーを含むように細胞が改変されていることを意味する。その結果、必須遺伝子により産生されるタンパク質は、ウイルスのｓｓＲＮＡよりもむしろ細胞からのｍＲＮＡから発現されるので、この遺伝子の機能が細胞により補完される。このことにより、ウイルスの複製に必要な全ての必須タンパク質が細胞内に確実に存在するようになる。よって、ワクチン用ウイルス株は細胞内で自由に複製できる。しかし、ワクチン用ウイルス株が補完性細胞以外の細胞に感染すると、必須遺伝子のタンパク質産物は存在しないので、ワクチン用ウイルス株は繰り返して複製できない。ワクチン用ウイルス株は、例えばワクチン接種された宿主において単一の複製サイクルを受ける。複数の必須遺伝子の機能が破壊される場合、細胞は、それぞれの必須ウイルス遺伝子の機能を補完する。

好ましくは、ワクチン用ウイルス株を製造する方法は、細胞からワクチン用ウイルス株を単離するステップをさらに含む。このことは、任意の適切な方法で行うことができる。このような方法は、当業者に周知である。例えば、ワクチン用ウイルス株は、ウイルスプラークから単離できる。

本発明は、レオウイルス科の一員であるウイルスのゲノムに由来する単離ウイルスｓｓＲＮＡであって、必須遺伝子の機能を破壊する変異を含み、細胞の形質移入について上記の方法での使用に適するｓｓＲＮＡも提供する。

本発明は、上記の方法により製造されるワクチン用ウイルス株もさらに提供する。

本発明は、本発明のｓｓＲＮＡからのワクチン用ウイルス株の複製を可能にする、レオウイルス科ウイルスの必須遺伝子を発現する細胞も提供する。

本発明は、本発明のｓｓＲＮＡに感染した本発明の細胞を提供する。

本発明は、治療で使用するための本発明のワクチン用ウイルス株も提供する。

本発明は、治療で使用するための本発明の単離ウイルスｓｓＲＮＡも提供する。

本発明は、レオウイルス科のウイルスに対して動物にワクチン接種する際に使用するための、本発明のワクチン用ウイルス株も提供する。

本発明は、レオウイルス科のウイルスに対して動物にワクチン接種する際に使用するための、本発明の単離ウイルスｓｓＲＮＡも提供する。

本発明は、レオウイルス科のウイルスに対して動物にワクチン接種する方法であって、有効量の本発明のワクチン用ウイルス株を動物に送達するステップを含む方法も提供する。

本発明は、レオウイルス科のウイルスに対して動物にワクチン接種する方法であって、有効量の本発明の単離ウイルスｓｓＲＮＡを動物に送達するステップを含む方法も提供する。

レオウイルス科のウイルスからの単離ウイルスｓｓＲＮＡは感染性であるので、単離ウイルスｓｓＲＮＡ自体を動物へのワクチン接種に用いることができる。ｓｓＲＮＡは、任意の適切な方法で動物の１つまたは複数の細胞に導入でき、そこで１つまたは複数の細胞により転写される。このことによりウイルスタンパク質が産生され、ウイルス粒子の産生を導き得る。しかし、ウイルスからのｓｓＲＮＡ中の必須遺伝子の機能が破壊されているので、ウイルスｓｓＲＮＡは、完全に機能的なウイルス粒子を産生できない。変異させる必須遺伝子がどれであるかに応じて、ウイルスは、せいぜい、１回の複製サイクルしか完了できない。

ワクチン接種するときに、ワクチン接種される動物は、レオウイルス科のウイルスがどれか、およびそれが感染する特定の動物に応じて変動する。ウイルスがＡＨＳＶである場合、動物はウマ、ラバ、ロバまたはシマウマから選択される。ウイルスがＥＨＤＶである場合、動物はシカ、ウシまたはヒツジから選択される。ウイルスがＢＴＶである場合、動物はウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、シカ、ヒトコブラクダおよびアンテロープから選択される。

本発明は、本発明のワクチン用ウイルス株を、医薬的に許容される担体、アジュバントまたは媒体とともに含む医薬組成物も提供する。

本発明は、本発明の単離ウイルスｓｓＲＮＡを、医薬的に許容される担体、アジュバントまたは媒体とともに含む医薬組成物も提供する。

医薬的に許容される担体、アジュバントおよび媒体は、当業者に周知である。例えば、用いることができる医薬的に許容される担体、アジュバントおよび媒体は、それらに限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、リン酸塩のような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミンのような塩または電解質、リン酸水素２ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、３ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ろう、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂を含む。

本発明のワクチン用ウイルス株、単離ウイルスｓｓＲＮＡまたは医薬組成物は、経口、非経口または吸入により投与してよい。好ましくは、ワクチン用ウイルス株、単離ウイルスｓｓＲＮＡまたは医薬組成物は、注射により投与される。本発明のワクチン用ウイルス株、単離ウイルスｓｓＲＮＡまたは医薬組成物は、任意の通常の非毒性で医薬的に許容される担体、アジュバントまたは媒体とともに製剤することができる。本明細書で用いられる非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内および頭蓋内の注射または点滴の技術を含む。

ワクチン用ウイルス株、単離ウイルスｓｓＲＮＡまたは医薬組成物は、例えば注射可能な水性または油性の懸濁物のような注射可能な調製物の形態であってよい。この懸濁物は、適切な分散剤または湿潤剤（例えばＴｗｅｅｎ８０など）および懸濁化剤を用いる当該技術分野において知られている技術に従って製剤することができる。注射可能な調製物は、非毒性で非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の注射可能な溶液または懸濁物、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。用いることができる許容される媒体および溶媒は、マンニトール、水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌された不揮発性油は、溶媒または懸濁媒として通常用いられる。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性の不揮発性油を用いてよい。オリーブ油またはひまし油のような天然の医薬的に許容される油、特にそのポリオキシエチレン化された型と同様に、オレイン酸のような脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、注射可能剤の調製に有用である。これらの油溶液または懸濁物は、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはスイス薬局方に記載されるような同様のアルコールも含んでよい。

ワクチン用ウイルス株、単離ウイルスｓｓＲＮＡまたは医薬組成物は、それらに限定されないが、カプセル剤、錠剤ならびに水性の懸濁剤および液剤を含む任意の経口的に許容される剤形で経口投与され得る。経口用の錠剤の場合、通常用いられる担体は、ラクトースおよびトウモロコシデンプンを含む。ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤も典型的に添加される。カプセル剤の形態での経口投与のために、有用な希釈剤は、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンを含む。水性懸濁剤を経口投与する場合は、有効成分を、乳化剤および懸濁化剤と組み合わせる。所望により、ある甘味料および／または香料および／または着色料を添加することができる。

動物に送達されるワクチン用ウイルス株の量は、標準的な技術を用いて決定できる。しかし、一般に、送達される量は、１０，０００〜１，０００，０００，０００感染単位／ｍｌの範囲であるべきである。

本発明は、上記の方法の単離ｓｓＲＮＡと、該ｓｓＲＮＡ中で変異した必須遺伝子を補完する細胞とを含むキットも提供する。

本発明は、レオウイルス科の一員であるウイルス中の必須遺伝子を同定するためのスクリーニング方法であって、
遺伝子の機能が破壊されるようにレオウイルス科のウイルスに変異を導入するステップと、
前記ウイルスのゲノムに由来し、前記変異を含むウイルスｓｓＲＮＡを細胞に形質移入するステップと、
適切な条件下で形質移入された前記細胞を培養するステップと
を含み、形質移入された前記細胞を培養した後に産生されるウイルスが病原性であれば、前記ウイルス遺伝子が必須遺伝子でない方法も提供する。

本発明は、レオウイルス科の一員であるウイルスの改変ウイルス株を製造する方法であって、
レオウイルス科のウイルスに変異を導入するステップと、
前記ウイルスのゲノムに由来し、前記変異を含むウイルス一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を細胞に形質移入するステップと、
前記改変ウイルス株の製造を導くために適切な条件下で形質移入された前記細胞を培養するステップと
を含み、前記細胞が、前記改変ウイルス株の前記細胞内での複製を可能にする方法も提供する。

改変ウイルス株を製造する方法は、ワクチン用ウイルス株の製造方法に関して上記で定義したとおりである。しかし、ウイルス株は、任意の様式で改変してよい。例えば、ウイルス株は、ゲノムに１つまたは複数の遺伝子を加え、１つまたは複数の遺伝子をゲノムから欠失させ、ゲノム内の制御配列を変化させることなどにより改変してよい。さらに、必須遺伝子の機能が破壊されないことを条件として、改変ウイルスの製造のために任意の適切な細胞を用いることができる。

上記のように、細胞に形質移入するステップは、２以上の形質移入ステップを含むことが好ましく、
（１）第１の形質移入ステップは、ウイルスカプシドの内層の組み立てに必要な成分を少なくともコードするｓｓＲＮＡを細胞に形質移入することを含み、
（２）第２の形質移入ステップは、ウイルスゲノムの転写産物であり、変異も含み、したがってウイルスの組み立てに必要な全ての成分をコードするｓｓＲＮＡを細胞に形質移入することを含む。

２ステップの形質移入を行うことの好ましい特徴は、上記で定義したとおりである。

好ましくは、改変ウイルス株を製造する方法は、細胞からウイルス株を単離するステップをさらに含む。

本発明は、レオウイルス科の一員であるウイルスのゲノムに由来する単離ウイルスｓｓＲＮＡであって、改変を含み、細胞の形質移入について上記の方法での使用に適するｓｓＲＮＡも提供する。

本発明は、上記の方法により製造される改変ウイルス株もさらに提供する。

本発明は、治療で使用するための本発明の改変ウイルス株も提供する。

本発明は、治療で使用するための本発明の単離改変ウイルスｓｓＲＮＡも提供する。

本発明は、本発明の改変ウイルス株を、医薬的に許容される担体、アジュバントまたは媒体とともに含む医薬組成物も提供する。

本発明は、本発明の単離改変ウイルスｓｓＲＮＡを、医薬的に許容される担体、アジュバントまたは媒体とともに含む医薬組成物も提供する。

ここで、本発明を、一例として、図面を参照しつつ詳細に説明する。

ＢＴＶの２つの血清型からのコア由来転写産物のＢＳＲ細胞への同時形質移入から回収されたリアソータント後代ゲノムを示す図である。ゲノムｄｓＲＮＡを、９％非変性ポリアクリルアミドゲルで泳動する。（Ａ）同時転写されたＢＴＶ−１およびＢＴＶ−９転写産物のＢＳＲ細胞への同時形質移入により導かれる、救済されたＢＴＶからのｄｓＲＮＡ。レーン１〜３、両方の親の転写産物調製物からのゲノムセグメントを含むプラーク精製ウイルス。矢印は、最も少数のセグメントを与えた親からのセグメントを示す。ＢＴＶ−１ ｄｓＲＮＡおよびＢＴＶ−９ ｄｓＲＮＡマーカーレーンを示す。（Ｂ）調製後に混合したＢＴＶ−１およびＢＴＶ−９転写産物のＢＳＲ細胞への同時形質移入により導かれる、救済されたＢＴＶからのｄｓＲＮＡ。レーン１〜２、両方の親の転写産物調製物からのゲノムセグメントを含むプラーク精製ウイルス。矢印は、最も少ないセグメントを与えた親からのセグメントを示す。ＢＴＶ−１ ｄｓＲＮＡおよびＢＴＶ−９ ｄｓＲＮＡマーカーレーンを示す。 Ｔ７ ＢＴＶプラスミドクローンの模式図である。Ｔ７プラスミドは、Ｔ７プロモーターと、転写の間にＢＴＶの３’末端配列を規定するＢｓｍＢＩ、ＢｓａＩまたはＢｐｉＩ制限酵素部位とで挟まれた全長ＢＴＶゲノムセグメントを含む。ＢＴＶゲノムセグメントの５’および３’末端の配列と、隣接配列を示す；Ｔ７プロモーター（斜体）、保存ＢＴＶゲノムセグメント５’および３’末端配列（太字）、ならびにＢｓｍＢＩ部位（下線）。 プラスミド由来ＢＴＶ−１０セグメント１０を含むリアソータント後代ゲノムを示す図である。（Ａ）ＢＴＶ−１０セグメント１０ Ｔ７転写産物とコア由来ＢＴＶ−１転写産物とのＢＳＲ細胞への同時形質移入から回収されるＢＴＶから抽出された、９％非変性ポリアクリルアミドゲルで泳動したゲノムｄｓＲＮＡ。レーン１〜５、回収されたプラークに由来するウイルスｄｓＲＮＡ。レーン１、２および５、矢印を付したリアソータントは、より速く移動するＢＴＶ−１０セグメント１０ゲノムセグメントを示す。レーン３および４、野生型ＢＴＶ−１。ＢＴＶ−１ ｄｓＲＮＡおよびＢＴＶ−１０ ｄｓＲＮＡマーカーレーンを示す。（Ｂ〜Ｄ）セグメント１０ ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列電気泳動図。全ウイルスｄｓＲＮＡからのセグメント１０標的配列を、ＲＴ−ＰＣＲにより、プライマーＢＴＶ１０＿Ｓ１０＿２５９ＦおよびＢＴＶ１０＿Ｓ１０＿６１１Ｒを用いて増幅した。増幅された標的を、ＢＴＶ１０＿Ｓ１０＿２５９Ｆを用いて配列決定した。（Ｂ）ＢＴＶ−１０。（Ｃ）導入されたＢＴＶ−１０セグメント１０を含むＢＴＶ−１。（Ｄ）ＢＴＶ−１。 導入マーカー変異を有するプラスミド由来ＢＴＶ−１０セグメント１０を含むリアソータント後代ゲノムを示す図である。（Ａ）９％非変性ポリアクリルアミドゲルで泳動した、導入されたＨａｅＩＩ部位を有するＢＴＶ−１０セグメント１０を含むプラークからのゲノムｄｓＲＮＡ。レーン１〜３、より速く移動するＢＴＶ−１０セグメント１０を含む３つのプラーク精製リアソータントからのウイルスｄｓＲＮＡ。ＢＴＶ−１ ｄｓＲＮＡおよびＢＴＶ−１０ ｄｓＲＮＡマーカーレーンを示す。（Ｂ）セグメント１０ ＲＴ−ＰＣＲ産物のＨａｅＩＩ消化。セグメント１０プライマーＢＴＶ１０＿Ｓ１０＿２５９ＦおよびＢＴＶ１０＿Ｓ１０＿６１１Ｒを用いてゲノムｄｓＲＮＡから増幅し、２％アガロースゲルで分離したＨａｅＩＩ消化ＲＴ−ＰＣＲ産物。Ｕ＝未消化ＲＴ−ＰＣＲ産物、Ｄ＝ＨａｅＩＩ消化ＲＴ−ＰＣＲ産物。レーン１、鋳型なし、レーン２、ＢＴＶ−１０、レーン３、ＢＴＶ−１０セグメント１０が導入されたリアソータント、レーン４、ＨａｅＩＩ部位含有ＢＴＶ−１０セグメント１０が導入されたリアソータント、レーン５、ＢＴＶ−１。Ｍ＝ＳｔｙＩ消化ファージλＤＮＡマーカー、ｂｐでのサイズを示す。ＲＴ−ＰＣＲ産物および消化フラグメントのサイズを左にｂｐで示す。（ＣおよびＤ）セグメント１０ ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列電気泳動図。全ウイルスｄｓＲＮＡからのセグメント１０標的配列を、ＲＴ−ＰＣＲにより、プライマーＢＴＶ１０＿Ｓ１０＿２３８ＦおよびＢＴＶ１０＿Ｓ１０＿６５４Ｒを用いて増幅した。増幅された標的を、ＢＴＶ１０＿Ｓ１０＿２３８Ｆを用いて配列決定した。（Ｃ）ＢＴＶ−１０セグメント１０が導入されたリアソータント。（Ｄ）ＨａｅＩＩ部位含有ＢＴＶ−１０セグメント１０が導入されたリアソータント。矢印は、導入された点突然変異を示す。 プラスミド由来ＢＴＶ−１０セグメント２および５を含む二重リアソータント後代ゲノムを示す図である。（Ａ）ＢＴＶ−１０セグメント５ Ｔ７転写産物、ＢＴＶ−１０セグメント２ Ｔ７転写産物およびコア由来ＢＴＶ−１転写産物のＢＳＲ細胞への同時形質移入から回収されるＢＴＶからのゲノムｄｓＲＮＡ。９％非変性ポリアクリルアミドゲルで泳動した、後代プラークからのゲノムｄｓＲＮＡ。レーン１〜３、３つのプラーク精製リアソータントからのウイルスｄｓＲＮＡ。矢印は、よりゆっくり移動するＢＴＶ−１０セグメント２およびセグメント５を示す。ＢＴＶ−１ ｄｓＲＮＡおよびＢＴＶ−１０ ｄｓＲＮＡマーカーレーンを示す。（ＢおよびＣ）セグメント２およびセグメント５ ＲＴ−ＰＣＲ産物の制限消化分析。セグメント２およびセグメント５からの標的領域を、ゲノムｄｓＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ増幅し、ＢＴＶ−１０セグメントに特異的な制限酵素で消化し、１．５％アガロースゲルで分離した。（Ｂ）セグメント２ ＲＴ−ＰＣＲ産物のＳａｃＩ消化。ＳａｃＩは、血清型１０のセグメント２に特異的であり、標的配列内に２つの部位を有する。ゲノムｄｓＲＮＡからセグメント２プライマーＢＴＶ１０＿Ｌ２＿７２７ＦおよびＢＴＶ１０＿Ｌ２＿１５２３Ｒを用いて増幅したＲＴ−ＰＣＲ産物。Ｕ＝未消化ＲＴ−ＰＣＲ産物、Ｄ＝ＳａｃＩ消化ＲＴ−ＰＣＲ産物。プライマー対は、種々の血清型のうちでこのセグメントの相同性が低いために、ＢＴＶ−１セグメント２を増幅しないことに留意されたい。レーン１、ＢＴＶ−１、レーン２、ＢＴＶ−１０、レーン３、ＢＴＶ−１０セグメント２および５が導入されたリアソータント。ＳｔｙＩ消化ファージλＤＮＡマーカーサイズをｂｐで左に示す。ＲＴ−ＰＣＲ産物および消化フラグメントのサイズを右にｂｐで示す。（Ｃ）セグメント５ ＲＴ−ＰＣＲ産物のＤｒａＩ消化。ＤｒａＩは、血清型１０のセグメント５に特異的であり、標的配列内に２つの部位を有する。ゲノムｄｓＲＮＡからセグメント５プライマーＢＴＶ１０＿Ｍ５＿７２４ＦおよびＢＴＶ１０＿Ｍ５＿１５９０Ｒを用いて増幅されたＲＴ−ＰＣＲ産物。Ｕ＝未消化ＲＴ−ＰＣＲ産物、Ｄ＝ＤｒａＩ消化ＲＴ−ＰＣＲ産物。ＲＴ−ＰＣＲ反応における鋳型は、パネルＢに示すとおりである。ＲＴ−ＰＣＲ産物および消化フラグメントのサイズを右にｂｐで示す。 ＢＴＶ−１ゲノムセグメントのＴ７転写産物を示す図である。制限エンドヌクレアーゼ消化クローンから生じたＢＴＶ−１ Ｔ７転写産物の変性１％アガロースゲル電気泳動。Ｍ＝１μｇのｓｓＲＮＡマーカー（Ｐｒｏｍｅｇａ）、サイズをｎｔで示す。（Ａ）レーン１−セグメント１、レーン２−セグメント３、レーン３−セグメント５、レーン４−セグメント７、レーン５−セグメント９。（Ｂ）レーン１−セグメント２、レーン２−セグメント４、レーン３−セグメント６、レーン４−セグメント８、レーン５−セグメント１０。 １０個のＴ７転写産物を用いる形質移入による感染性ＢＴＶの回収を示す図である。（Ａ）アガロースを重層した形質移入ＢＳＲ単層。ウェル１、４μｇのＢＴＶ−１ Ｔ７転写産物を形質移入したＢＳＲ、ウェル２、形質移入していないＢＳＲ。単層を、形質移入の５日後に固定し、クリスタルバイオレットで染色した。（Ｂ）パネルＡに記載するようにしてＢＳＲ単層の形質移入から回収されるＢＴＶから抽出した、９％非変性ポリアクリルアミドゲルで泳動したゲノムｄｓＲＮＡ。レーン１、ＢＴＶ−１ストックウイルス、レーン２および３、Ｔ７転写産物の形質移入に由来する別々のプラークからのＢＴＶ−１。 １０個のＴ７転写産物を用いるマーカー変異を含む感染性ＢＴＶの回収を示す図である。（Ａ）アガロースを重層した形質移入ＢＳＲ単層。ウェル１、導入されたＢｇｌＩＩ部位を有するセグメント８転写産物を含む３μｇのＢＴＶ−１ Ｔ７転写産物を形質移入したＢＳＲ、ウェル２、形質移入していないＢＳＲ。単層を、形質移入の５日後に固定し、クリスタルバイオレットで染色した。（Ｂ）パネルＡに記載するようにしてＢＳＲ単層の形質移入から回収されるＢＴＶから抽出した、９％非変性ポリアクリルアミドゲルで泳動したゲノムｄｓＲＮＡ。レーン１、ＢＴＶ−１ストックウイルス、レーン２および３、Ｔ７転写産物の形質移入に由来する別々のプラークからのＢＴＶ−１。 １０個のＴ７転写産物から生じるＢＴＶ−１中の導入されたマーカー変異の検出を示す図である。（Ａ）セグメント８ ＲＴ−ＰＣＲ産物のＢｇｌＩＩ消化。ゲノムｄｓＲＮＡから、セグメント８プライマーＮＳ２＿Ｂａｍ＿Ｔ７＿ＦおよびＮＳ２＿Ｂａｍ＿Ｒを用いて増幅し、１％アガロースゲルで分離したＢｇｌＩＩ消化ＲＴ−ＰＣＲ産物。Ｕ＝未消化ＲＴ−ＰＣＲ産物、Ｄ＝ＢｇｌＩＩ消化ＲＴ−ＰＣＲ産物。レーン１、野生型ＢＴＶ−１、レーン２〜６、セグメント８ ＢｇｌＩＩ変異転写産物を含む形質移入に由来する５つの別々のプラーク、レーン７、鋳型なし。ＳｔｙＩ消化ファージλＤＮＡマーカーサイズをｂｐで左に示す。ＲＴ−ＰＣＲ産物および消化フラグメントのサイズを右にｂｐで示す。（Ｂ）セグメント８ ＢｇｌＩＩ変異転写産物を含む形質移入からのセグメント８ ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列電気泳動図。全ウイルスｄｓＲＮＡからのセグメント８標的配列を、ＲＴ−ＰＣＲにより、パネルＡに記載するプライマーを用いて増幅した。増幅された標的を、ＢＴＶ１＿Ｓ８＿６２７Ｒを用いて配列決定した。矢印は、導入された点突然変異を示す。 ＢＴＶ１デルタＶＰ６の作製に用いるｐＢＴＶ１ Ｓ９デルタクローンを示す図である。（Ａ）ｐＢＴＶ１ Ｓ９デルタクローンに保持されるゲノムセグメント９のヌクレオチド座標。（Ｂ）ｐＢＴＶ１ Ｓ９デルタは、Ｔ７プロモーターと、転写の間にＢＴＶ ３’末端配列を規定するＢｓｍＢＩ制限酵素部位とに挟まれた改変ＢＴＶゲノムセグメント９を含む。（Ｃ）ＢＴＶゲノムセグメントの５’および３’末端の配列と隣接配列とを示す。Ｔ７プロモーター（斜体）；保存ＢＴＶゲノムセグメント５’および３’末端配列（太字）；およびＢｓｍＢＩ部位（下線）。 ＢＴＶ１デルタＶＰ６が、ＣＰＥを、補完性ＢＳＲ ＶＰ６株化細胞において産生することを示す図である。単層に、０．１のＭＯＩにて感染させ、感染の４８時間後に位相差顕微鏡を用いて外観を記録した。（Ａ）ＢＴＶ１デルタＶＰ６に感染させたＢＳＲ ＶＰ６細胞。（Ｂ）野生型ＢＴＶ−１に感染させた野生型ＢＳＲ細胞。（Ｃ）模擬感染ＢＳＲ細胞。 ＢＴＶ１デルタＶＰ６が、補完性ＢＳＲ ＶＰ６株化細胞においてプラークを産生することを示す図である。ウイルスストックの１０倍希釈物を用いて、ウェル１〜ウェル６の集密細胞単層に感染させた。感染単層に固形培地を重層し、７２時間後にクリスタルバイオレットで染色した。（Ａ）ＢＴＶ１デルタＶＰ６に感染させたＢＳＲ ＶＰ６細胞。（Ｂ）野生型ＢＴＶ−１に感染させた野生型ＢＳＲ細胞。 ＢＴＶ１デルタＶＰ６が、より小さいゲノムセグメントで置き換えられたゲノムセグメント９を有することを示す図である。（Ａ）９％非変性ポリアクリルアミドゲルで泳動したゲノムｄｓＲＮＡ。矢印は、ＢＴＶ１デルタＶＰ６に存在する新しいゲノムセグメントを示す。ゲノムセグメントの数を右手側に示す。（Ｂ）ＥｃｏＴ７＿Ｓ９＿ＦおよびＥｃｏＢｓｍＢ＿Ｓ９＿Ｒプライマーを用いて記載される供給源に由来するゲノムｄｓＲＮＡから生じ、かつ１％アガロースゲルで分解したＲＴ−ＰＣＲ産物。ＤＮＡマーカーサイズを塩基対で示す。 ＢＴＶ１デルタＶＰ６が、感染ＢＳＲまたはＣ６／３６細胞において感染性の後代を産生しないことを示す図である。感染性後代の産生は、７２時間までの間隔で、補完性ＢＳＲ ＶＰ６株化細胞に対するプラークアッセイによりアッセイした。ＢＴＶ１デルタＶＰ６および野生型ＢＴＶ−１のＢＳＲ細胞（Ａ）またはＣ６／３６細胞（Ｂ）での複製のプロット。 ＢＴＶ１デルタＶＰ６が、非補完性ＢＳＲ細胞においてウイルスタンパク質を発現することを示す図である。ＢＳＲ細胞に３のＭＯＩにて感染させ、感染後の記載される数の時間で採集した。ＮＳ２発現を、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびそれに続くＮＳ２特異的抗血清を用いるイムノブロッティングにより検出した。（Ａ）ＢＴＶ１デルタＶＰ６に感染させたＢＳＲ、（Ｂ）野生型ＢＴＶ−１に感染させたＢＳＲ。染色前のタンパク質分子量マーカーのサイズをｋＤａで示す。 ＢＴＶ１ Ｓ１０ＧＦＰが、Ｓ１０セグメントを置き換えるより大きいゲノムセグメントを有することを示す図である。（Ａ）１１％非変性ポリアクリルアミドゲルで泳動したゲノムｄｓＲＮＡ。矢印は、ＢＴＶ１ Ｓ１０ＧＦＰ中に存在する新しいゲノムセグメントを示す。ゲノムセグメントの数を右手側に示す。（Ｂ）記載される供給源に由来するゲノムｄｓＲＮＡから生じ、１％アガロースゲルで分解したＲＴ−ＰＣＲ産物。ＤＮＡマーカーのサイズを塩基対で示す。 ＢＴＶゲノムからのマーカー抗原の発現を示す図である。Ｃ６／３６に、ＢＴＶ１ Ｓ１０ＧＦＰ（ＡおよびＢ）を感染させたか、または模擬感染させた（ＣおよびＤ）。感染の５日後に、細胞を４％ｗ／ｖパラホルムアルデヒドで固定し、それらの外観を位相差（ＡおよびＣ）またはＵＶ光（ＢおよびＤ）の下で記録した。 二重形質移入が、コア由来転写産物からのウイルスの回収を増大させることを示す図である。集密ＢＳＲ細胞単層に、１回（ウェル１）または２回（ウェル２）、ＢＴＶコアから合成した２００ｎｇのウイルスｓｓＲＮＡを形質移入した。ウェルに、本明細書に記載されるようにアガロースを重層した。 二重形質移入が、プラスミド由来転写産物からのウイルスの回収を増大させることを示す図である。集密ＢＳＲ細胞単層に、１回（ウェル１）または２回（ウェル２）、２μｇのプラスミド由来Ｔ７転写産物を形質移入した。ウェルに、本明細書に記載されるようにアガロースを重層した。 １回目の形質移入からゲノムセグメント２、５、７および１０を削除することにより、プラスミド由来転写産物からのウイルスの回収が増加することを示す図である。集密ＢＳＲ細胞単層に、１０個のＴ７転写産物の完全補完物（ウェル１）またはセグメント２、５、７および１０を欠くＴ７転写産物のセット（ウェル２）を、第１の形質移入において形質移入した。両方のウェルに、第２の形質移入にて１０個のＴ７転写産物の完全補完物を形質移入した。１００ｎｇのそれぞれのＴ７転写産物を両方の形質移入で用いた。

ワクチン設計の新しいアプローチは、本発明者らにより開発された新規な逆遺伝学的方法を用いる。これは、ブルータングウイルス転写産物が形質移入により感染性であり［１］、かつ標的にされるセグメントをクローン化された型のウイルス遺伝子で置き換えることを可能にするという発見に基づく。この方法は、ウイルス許容細胞に、クローン化遺伝子に由来するＢＴＶセグメントのバクテリオファージＴ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物と混合したＢＴＶ転写産物を形質移入する新規なアプローチを用いる。置換用ゲノムセグメントを含むウイルスは、ウイルスプラークをスクリーニングすることにより単離される。この逆遺伝学の新しい方法は、レオウイルス科で用いられる現存する逆遺伝学の技術とは異なる。１）Ｒｏｎｅｒら［３］のヘルパーウイルス依存的な方法は、哺乳動物オルトレオウイルスにうまく用いられた。ウイルス転写産物とウイルスｄｓＲＮＡをＴ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物と混合し、ヘルパーウイルス感染を用いて救済する；２）Ｋｏｍｏｔｏら［２］のヘルパーウイルス依存的な方法は、ロタウイルスのカプシドタンパク質を変化させるのに用いられた。Ｔ７転写産物を細胞において、ワクシニアＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ系を用いて作製し、ヘルパーウイルス株を用いて救済する；３）Ｋｏｂａｙａｓｈｉら［４］のプラスミドに基づく方法は、哺乳動物オルトレオウイルス遺伝子において変異を作製することに用いた。全てのウイルスゲノムセグメントは、ワクシニアＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ系を用いて細胞で作製される。

新しいアプローチは、逆遺伝学を用いて、他のウイルスタンパク質の普遍的なバックグラウンドとともに対象の血清型からの免疫学的に関連するブルータングタンパク質（ＶＰ２およびＶＰ５）を含むワクチン株を製造する。これは、広範囲の変異による１つまたは複数の必須ウイルス遺伝子の逆遺伝学による不活性化と結びついており、該必須遺伝子は補完性株化細胞により提供される。製造されるウイルスは、補完性株化細胞内でのみ成長でき、ワクチン接種された動物の細胞のような他の細胞内では単一回の複製しかできない。逆遺伝学による不活性化のために１つもしくは複数のＢＴＶ酵素タンパク質（ポリメラーゼ、ヘリカーゼおよびキャップ形成タンパク質）またはＢＴＶ非構造ウイルスタンパク質を標的にすることにより、監視の目的のためにＤＩＶＡ戦略を用いることが可能になる。新しいアプローチは、弱毒化不足の問題も解消し、新しい株の弱毒化に付随する、新しい血清型の同定からワクチン株の製造までの時間の遅延も低減する。毒性の復帰の可能性は、標的にするウイルス遺伝子の広範囲な変異の使用により大きく低減される。感染性ウイルスを産生する野生型ウイルスとの再集合の可能性も、ワクチン株がワクチン接種された動物において単一複製サイクルしか受けないという事実により、大きく低減される。新しいアプローチは、不活化ワクチンに関連するワクチンバッチの不活化の確認の必要性も回避する。

本発明の技術を用いて、ＢＴＶについてのＤＩＳＣ（機能しない感染性単一サイクル）ワクチンを製造し、ここでは、必須遺伝子（ＶＰ６）を、逆遺伝学的機構により操作して、その機能を大きい欠失により破壊した。ＶＰ６欠失変異体（ＢＴＶ１デルタＶＰ６）を、ＶＰ６タンパク質をトランスに供給する補完性株化細胞と組み合わせた逆遺伝学の技術を用いて回収した。ＢＴＶ１デルタＶＰ６の成長特性の特徴決定により、これは、ＢＴＶ ＤＩＳＣワクチンについての必要な特徴、すなわちｉ）非補完性哺乳動物細胞におけるウイルスタンパク質の発現；ｉｉ）非補完性哺乳動物または媒介昆虫株化細胞における検出可能な感染性ウイルスの出現がないこと；およびｉｉｉ）補完性ＶＰ６株化細胞での安定した複製、を有することが示された。さらに、外来タンパク質／ペプチドを発現するウイルスの創出の能力が、ＮＳ３遺伝子の中央に挿入された高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を有するＢＴＶと組み合わせたＮＳ３補完性株化細胞を用いて示された。このことにより、ワクチン接種された動物において検出してそれらを感染動物から区別できる、すなわちＤＩＶＡ概念（感染動物とワクチン接種動物とを区別する）での免疫学的マーカーを含有するワクチン株の製造が可能になる。

材料および方法
株化細胞およびウイルス。ＢＳＲ細胞（ＢＨＫ−２１のクローン）を、５％ｖ／ｖ胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、３５℃にて５％ＣＯ_２中で培養した。

ＢＴＶストックを、ＢＳＲ細胞に０．１の感染効率（ＭＯＩ）にて感染させ、感染の３〜４日後に培地を採集することにより作製した。ウイルスストックは４℃にて貯蔵した。

ブルータングウイルスのコアの精製。ＢＳＲ培養物にＢＴＶを０．０２〜０．１のＭＯＩにて感染させた。転写活性のあるＢＴＶ−１コアを、以前に記載されたようにして精製し、４℃にて貯蔵した［１］。

ブルータングウイルスｍＲＮＡのＩｎ Ｖｉｔｒｏでの合成および精製。ＢＴＶコアを、４０μｇ／ｍｌで３０℃にて５〜６時間、ＢＴＶコア転写バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、４ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、２ｍＭ ＣＴＰ、２ｍＭ ＵＴＰ、５００μＭ Ｓ−アデノシルメチオニン、６ｍＭ ＤＴＴ、９ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｉｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ［Ｐｒｏｍｅｇａ］）中でインキュベートした。

ＢＴＶコア由来ｍＲＮＡを、以前に記載された方法を用いて精製し、−８０℃にて貯蔵した［１］。

ＢＴＶ−１ゲノムセグメントのＲＴ−ＰＣＲ増幅。それぞれのＢＴＶ−１ゲノムセグメントのｃＤＮＡコピーを、ウイルスｄｓＲＮＡから、配列依存的な様式でＦＬＡＣ法［１８］を用いて増幅した。簡単に、ヘアピンアンカープライマーを、記載されるようにウイルスｄｓＲＮＡに連結し、その後、ゲルから精製したゲノムセグメントから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１０Ｕ／μｌにて、５５℃で１時間用いてｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ増幅は、５’リン酸化ＦＬＡＣ２プライマー（５’ＧＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＴＴＡＧＡＡＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧＴＣ３’）をＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）とともに用いて行った。ＰａｃＩおよびＮｏｔＩ部位を太字で示す。

ＢＴＶ転写産物の合成のために用いるＴ７プラスミドクローン。ｃＤＮＡプラスミドクローンを、ＢＴＶ−１０ゲノムセグメント１０（ｐＮＳ３ＢｓｍＢＩ）、セグメント５（ｐＶＰ５ＢｓｍＢＩ）およびセグメント２（ｐＶＰ２ＢｓｍＢＩ）について、ならびにＢＴＶ−１ゲノムの１０個全てのセグメントについて構築した。導入されたＨａｅＩＩ部位を含むＢＴＶ−１０セグメント１０クローンの変異型（ｐＮＳ３Ｈａｅ）、および導入されたＢｇｌＩＩ部位を含むＢＴＶ−１セグメント８クローンの変異型（ｐＢＴＶ１Ｓ８Ｂｇｌ）も構築した。それぞれのプラスミドクローン内の機能的カセットは、Ｔ７プロモーターおよびＢｓｍＢＩ、ＢｓａＩまたはＢｐｉＩ部位を、これらのエレメントの間にあるＢＴＶゲノムセグメントとともに含んでいた。それぞれのクローン内のＢＴＶゲノムセグメントは、ＢｓｍＢＩ、ＢｓａＩまたはＢｐｉＩで消化されたプラスミドに由来するＴ７転写産物が、対応するＢＴＶゲノムセグメントのｍＲＮＡ鎖と全く同じ配列を有すると予測されるように他の２つの配列エレメントに対して配置した（図２）。

ｃＤＮＡプラスミドクローンからのＢＴＶ転写産物の合成。Ｔ７プラスミドクローンを、ＢｓｍＢＩ、ＢｓａＩまたはＢｐｉＩで消化し、次いで、フェノール／クロロホルムを用いて１回およびクロロホルムを用いて１回抽出した。それぞれの消化されたプラスミドを、０．１５Ｍ酢酸ナトリウムの存在下でイソプロパノールを用いて沈殿させた。ＤＮＡペレットを、７０％（ｖ／ｖ）エタノール中で２回洗浄し、１μｇ／μｌにて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０中に溶解した。５’キャップアナログを有する転写産物を、消化したＴ７プラスミドクローンから、ｒＧＴＰに対して４：１の比のアンチリバースキャップアナログを用いるｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７ ＵＬＴＲＡキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて作製した。Ｔ７ ＢＴＶ転写産物を、フェノール／クロロホルムを用いて１回抽出し、その後クロロホルムを用いて１回抽出した。取り込まれなかったｒＮＴＰを、製造業者の使用説明書に従ってＭｉｃｒｏｓｐｉｎ（商標）Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるサイズ分画により除去した。Ｔ７ ＢＴＶ転写産物を、０．１５Ｍ酢酸ナトリウムの存在下で等容量のイソプロパノールを用いて沈殿させた。ＲＮＡペレットを、７０％（ｖ／ｖ）エタノール中で２回洗浄し、滅菌ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水に溶解し、−８０℃にて貯蔵した。

変性アガロースゲル電気泳動。精製ＢＴＶ ｓｓＲＮＡを、ホルムアルデヒド存在下でのＭＯＰＳ（モルホリンプロパンスルホン酸）電気泳動バッファー中で、標準的な技術［１９］を用いて、１％アガロースでの電気泳動により分析した。

１つまたは２つのｃＤＮＡ由来ゲノムセグメントを有するブルータングウイルスを回収するための培養細胞の形質移入。転写性コアに由来するＢＴＶ ｍＲＮＡを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ中の１つまたは複数のＴ７ ＢＴＶ転写産物と、０．１Ｕ／μｌのＲＮａｓｉｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下で混合した。ＲＮＡ混合物を、２０℃にて３０分間インキュベートした後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した［以下を参照されたい］。６ウェルプレート内の集密なＢＳＲ単層に、０．７５μｇのそれぞれのＴ７ ＢＴＶ転写産物と混合した１．５μｇ ＢＴＶ ｍＲＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬を製造業者の使用説明書に従って用いて形質移入した。形質移入の４時間後に、培養培地を、最少必須培地（ＭＥＭ）、２％ ＦＢＳ、１．５％ ｗ／ｖ ＶＩＩ型アガロース（Ｓｉｇｍａ）からなる６ｍｌの上敷きで置き換えた。分析物を、３５℃、５％ＣＯ_２にて７２〜９６時間インキュベートしてプラークの出現を可能にした。

ｃＤＮＡ由来ゲノムセグメントに完全に由来するブルータングウイルスを回収するための培養細胞の形質移入。３００〜４００ｎｇのそれぞれのＴ７ ＢＴＶ転写産物を、上記のように混合して、Ｔ７ ＢＴＶ転写産物の完全ゲノムセットを作製した。ＢＳＲ単層の形質移入は、上記のようにして行った。

形質移入由来ＢＴＶプラークからのｄｓＲＮＡの調製。それぞれのプラークを、５００μｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、５％ＦＢＳ中に採集し、２００μｌを用いて１．５×１０^６ＢＳＲに感染させた。感染細胞を、３５℃にて５％ＣＯ_２中で７２〜９６時間インキュベートして、ＢＴＶの増幅を可能にした。ウイルスｄｓＲＮＡを、以前に記載されたように［１］、感染ＢＳＲ細胞から精製した。

導入されたゲノムセグメントを含むリアソータントについての、形質移入由来ＢＴＶプラークのスクリーニング。導入されたゲノムセグメントがポリアクリルアミドゲル上で異なる速度で泳動される場合、スクリーニングは、ｄｓＲＮＡを９％ポリアクリルアミドゲル上でＴｒｉｓ／グリシンバッファー（ｐＨ８．３）中で電気泳動することにより行った。ゲルを臭化エチジウムで３０分間後染色した。泳動速度に基づいてスクリーニングを行うことができない場合、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）と、その後の制限エンドヌクレアーゼ消化を用いて、リアソータントと野生型ＢＴＶとを区別した。ｃＤＮＡを、１００ｎｇの熱変性ウイルスｄｓＲＮＡから、標的領域を挟むフォワードおよびリバースのプライマーを用いるＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、５５℃にて１時間合成した。標的領域を、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを同じフォワードおよびリバースのプライマーとともに用いてＰＣＲ増幅し、制限エンドヌクレアーゼを用いて消化した。産物を、臭化エチジウムを含むアガロースゲルでのＴｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡバッファー中での電気泳動により分解した。ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列分析を、ＭＷＧ ＢｉｏｔｅｃｈのＶａｌｕｅ Ｒｅａｄサービス［２０］を用いて、ＡＢＩ ３７３０ＸＬ配列決定装置で、ダイターミネーターを用いて行った。

ｐＮＳ３ＨａｅおよびｐＢＴＶ１Ｓ８Ｂｇｌの構築。ＰＮＳ３ＢｓｍＢＩを、Ｗｅｉｎｅｒらの方法［１７］によりプライマーＳ１０＿ｍｔ＿Ｈａｅ＿４０９ＦおよびＳ１０＿ｍｔ＿Ｈａｅ＿４０９Ｒを用いる部位特異的突然変異誘発により、追加のＨａｅＩＩ部位を含有するように変化させた。同様にして、野生型ＢＴＶ−１ Ｓ８クローンを、プライマー５’ＢＴＶ１＿Ｓ８＿ＢｇｌＩＩおよび３’ＢＴＶ１＿Ｓ８＿ＢｇｌＩＩを用いてＢｇｌＩＩ部位を導入するように変化させた。クローンを、ＨａｅＩＩまたはＢｇｌＩＩ消化により導入された部位の存在についてスクリーニングし、ＭＷＧ ＢｉｏｔｅｃｈのＶａｌｕｅ Ｒｅａｄサービスを用いて発現カセットを配列決定して、偶発的な変異を含有しないクローンを同定した。

プライマー。ｐＮＳ３ＨａｅをｐＮＳ３ＢｓｍＢＩから作製するために用いた突然変異誘発プライマー：Ｓ１０＿ｍｔ＿Ｈａｅ＿４０９Ｆ
（５’ＣＴＡＣＴＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＡＧＣＧＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＣＡＧＴＴＴＧ３’）およびＳ１０＿ｍｔ＿Ｈａｅ＿４０９Ｒ
（５’ＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＣＴＡＣＣＡＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＡＧＴＡＧ３’）。ｐＢＴＶ１Ｓ８Ｂｇｌを野生型ＢＴＶ−１ Ｓ８クローンから作製するために用いた突然変異誘発プライマー：５’ＢＴＶ１＿Ｓ８＿ＢｇｌＩＩ
（５’ＧＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＴＧＴＧＡＴＧＡＧＡＴＣＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＧＴＧＡＡＣ３’）および３’ＢＴＶ１＿Ｓ８＿ＢｇｌＩＩ
（５’ＣＧＡＡＣＡＴＣＧＴＡＧＴＴＡＧＡＴＣＴＣＡＴＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＡＡＡＴＣＧＧＧＣ３’）。突然変異誘発塩基に下線を引き、制限部位を太字で示す。

ＲＴ−ＰＣＲ増幅およびＢＴＶ−１０セグメント１０の配列決定のためのプライマー：ＢＴＶ１０＿Ｓ１０＿２３８Ｆ（５’ＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＣＡＴＴＣＧＣＡＴＣＧ３’）、ＢＴＶ１０＿Ｓ１０＿６５４Ｒ（５’ＣＴＣＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＣＧＴＣＡＴＴＡＴＡＴＧＡＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＡＴＣＡＣＴＴＣ３’）、
ＢＴＶ１０＿Ｓ１０＿２５９Ｆ（５’ＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＣＡＴＴＣＧＣＡＴＣＧ３’）、ＢＴＶ１０＿Ｓ１０＿６１１Ｒ（５’ＣＴＣＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＣＧＴＣＡＴＴＡＴＡＴＧＡＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＡＴＣＡＣＴＴＣ３’）。

ＢＴＶ−１０セグメント５からのＲＴ−ＰＣＲ増幅のためのプライマー：ＢＴＶ１０＿Ｍ５＿７２４Ｆ（５’ＡＴＧＡＣＡＧＣＡＧＡＣＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＣＧＧＣＡＴＣ３’）およびＢＴＶ１０＿Ｍ５＿１５９０Ｒ（５’ＧＣＧＴＴＣＡＡＧＣＡＴＴＴＣＧＴＡＡＧＡＡＧＡＧ３’）。

ＢＴＶ−１０セグメント２からのＲＴ−ＰＣＲ増幅のためのプライマー：ＢＴＶ１０＿Ｌ２＿７２７Ｆ（５’ＣＣＧＴＡＣＧＡＡＣＧＡＴＴＴＡＴＡＴＣＣＡＧＣ３’）およびＢＴＶ１０＿Ｌ２＿１５２３Ｒ（５’ＴＡＣＴＡＡＴＴＣＡＧＡＡＣＧＣＧＣＧＣＣ３’）。

ＢＴＶ−１セグメント８のＲＴ−ＰＣＲ増幅のためのプライマー：ＮＳ２＿Ｂａｍ＿Ｔ７＿Ｆ（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＴＣＣＴＴＧＡＧＴＣＡ３’）およびＮＳ２＿Ｂａｍ＿Ｒ（５’ＣＡＴＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＣＣＧＴＣＴＣＣＧＴＡＡＧＴＧＴＡＡＡＡＴＣＣＣＣ３’）。ＢＴＶ−１セグメント８を配列決定するためのプライマー：ＢＴＶ１＿Ｓ８＿６２７Ｒ（５’ＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＧＧ３’）。

ＢＴＶ ＶＰ６またはＮＳ３タンパク質を発現する安定株化細胞の構築。ＢＴＶ−１０ ＶＰ６およびＢＴＶ−１ ＮＳ３のコード領域をＰＣＲにより増幅し、ピューロマイシン選択性プラスミドｐＣＡＧＧＳ／ＭＣＳ−ＰＭ１［２９］にクローニングして、ｐＣＡＧＧ／ＶＰ６およびｐＣＡＧＧ／ＮＳ３をそれぞれ得た。ＢＳＲ細胞に、ｐＣＡＧＧ／ＶＰ６またはｐＣＡＧＧ／ＮＳ３を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて形質移入し、形質移入の４８時間後にトリプシン処理し、７．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択した。単離耐性コロニーを培養し、ＶＰ６またはＮＳ３タンパク質の発現を、適切な抗体を用いるイムノブロッティングにより試験した。ＶＰ６およびＮＳ３発現株を、ＢＳＲ ＶＰ６およびＢＳＲ ＮＳ３と称した。

補完性ＢＳＲ ＶＰ６またはＢＳＲ ＮＳ３株化細胞を用いるＢＴＶの回収。ヌクレオチド３０１〜７４３のアウトオブフレーム欠失（１０４９ｎｔのうち）を有するＢＴＶ−１セグメント９クローンであるｐＢＴＶ１ Ｓ９デルタを構築した（図１０）。対応する変異ウイルスであるＢＴＶ１デルタＶＰ６を、形質移入の間に野生型ＢＳＲ細胞の代わりにＢＳＲ ＶＰ６株化細胞を用いて回収した。同様にして、ＮＳ３遺伝子の中央に高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）が挿入されたＢＴＶ−１セグメント１０クローンであるｐＢＴＶ１ Ｓ１０ＧＦＰを構築した。対応するＧＦＰ発現ウイルスであるＢＴＶ１ Ｓ１０ＧＦＰを、形質移入の間にＢＳＲ ＮＳ３株化細胞を用いて回収した。

ＢＴＶ１デルタＶＰ６およびＢＴＶ１ Ｓ１０ＧＦＰの継代。ＢＴＶ１デルタＶＰ６は、ＢＳＲ ＶＰ６株化細胞で継代し、プラークアッセイによりこれもまたＢＳＲ ＶＰ６株化細胞を用いて力価を決定した。ＢＴＶ１ Ｓ１０ＧＦＰは、ＢＳＲ ＮＳ３株化細胞上で継代し、プラークアッセイによりこれもまたＢＳＲ ＮＳ３株化細胞を用いて力価を決定した。

ＢＴＶ１デルタＶＰ６の多段成長曲線。ＢＳＲまたはＣ６／３６細胞に、０．５のＭＯＩにて、１２ウェルディッシュ中で、それぞれ２５０μｌのＤＭＥＭまたはＬ１５培地中で感染させた。ウェルを１ｍｌ ＰＢＳで３回洗浄し、１ｍｌの成長培地中の標準的な成長条件下でインキュベートした。ウェルからある時間間隔で採集し、合計のウイルスを、ＢＳＲ ＶＰ６補完性株化細胞上でのプラークアッセイ力価決定により決定した。

プライマー。
ＥｃｏＴ７＿Ｓ９＿Ｆ
（５’ＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＴＣＧＣＡＴＡＴＧＴＣＡＧＣＴＧＣ３’）。
ＥｃｏＢｓｍＢ＿Ｓ９＿Ｒ
（５’ＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＴＣＴＣＣＧＴＡＡＧＴＧＴＡＡＡＡＴＣＧＣＣＣＴＡＣＧ３’）
ＢＴＶ１Ｓ１０Ｔ７ＥｃｏＲＩ（５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＴＡＡＡＡＡＧＴＧＴＣＧＣＴＧＣＣＡＴＧＣＴＡ３’）
ＮＳ３ＢｓｍＢｉ ｒｅｖ（５’ＧＴＡＡＧＴＧＴＧＴＡＧＴＡＴＣＧＣＧＣＡＣＣ３’）

結果２つの血清型からのＢＴＶ ｍＲＮＡを用いる同時形質移入によるゲノムセグメントの再集合。許容細胞の形質移入によるコア由来転写産物からの感染性ＢＴＶの回収が示されている［１］。ＢＴＶについての逆遺伝学的機構を作製することを目的として、あるＢＴＶ血清型から別の血清型へのゲノムセグメントの導入を、ｃＤＮＡ由来ゲノムセグメントの導入の前の中間ステップとして研究した。感染性コア由来転写産物を、以前に記載されたようにして［１］、ＢＴＶ−１およびＢＴＶ−９から調製した。２つの血清型からの転写産物を、同じ転写反応により同時に作製したか、または別々に作製してから混合した。集密ＢＳＲ単層に、転写産物混合物を形質移入し、ウイルスを、得られたプラークから増幅させた。ｄｓＲＮＡを、それぞれの増幅させたプラークから精製し、ゲノムセグメントの起源を、非変性ＰＡＧＥゲルでの電気泳動により決定し、これは、異なる単離株からのいくつかのゲノムセグメントの区別を可能にした。ＢＴＶ−１およびＢＴＶ−９からの同時合成転写産物を用いた場合、両方の親の供給源の転写産物からのゲノムセグメントを有する後代のウイルス［リアソータント］が生じた（図１Ａ）。レーン１は、ＢＴＶ−９のように移動するセグメントの遺伝的バックグラウンドでのＢＴＶ−１のセグメント１およびセグメント４を有するリアソータントを含む。同様に、レーン２は、ＢＴＶ−１遺伝的バックグラウンドでのＢＴＶ−９のセグメント３を有するリアソータントを含み、レーン３は、ＢＴＶ−１遺伝的バックグラウンドでのＢＴＶ−９のセグメント１を有するリアソータントを含む。ＢＴＶ−１およびＢＴＶ−９転写産物を別々に調製して形質移入の前に混合した場合も、リアソータント後代ウイルスが生じ、このことは、転写産物の同時合成が、再集合が生じるために必要でないことを示す（図１Ｂ）。これらのデータは、ウイルス転写産物の混合物での同時形質移入が、別々の供給源からのゲノムセグメントのＢＴＶゲノムへの導入のために実行可能な戦略であることを示した。

ｃＤＮＡクローンに由来するＢＴＶセグメントのＢＴＶ−１ゲノムへの導入。ｃＤＮＡクローンに由来するＴ７転写産物でのゲノムセグメントの標的化置き換えを、クローン化配列をＢＴＶゲノムに導入するためのモデルとして、その後、研究した。ＢＴＶ−１０セグメント１０ Ｔ７転写産物を、ＢＴＶ−１のゲノムへ導入することを選択して、ＰＡＧＥゲル上で、ＢＴＶ−１と比較してＢＴＶ−１０のセグメント１０がより速い移動速度を有することに基づく、プラークの迅速なスクリーニングを可能にした。ＢＴＶ−１０セグメント１０ Ｔ７転写産物は、正しい５’末端配列を生じるためのＴ７プロモーターと、正しい３’末端配列を生じるためのＢｓｍＢＩ部位とを有するｐＮＳ３ＢｓｍＢＩから作製した（図２）。転写性コアから産生したＢＴＶ−１転写産物を、ＢＴＶ−１０セグメント１０ Ｔ７転写産物と混合し、集密ＢＳＲ単層の形質移入に用いた。Ｔ７転写産物と対応するコア由来ｍＲＮＡとの５：１のモル比が最良であることが見出され、これを全ての実験において用いた。ＢＴＶ１転写産物に対するＴ７転写産物の比を増大させると、回収されるプラークの総数が低減した（データは示さず）。典型的には、１．５μｇのコア由来転写産物と０．７５μｇのＴ７転写産物とでの６ウェルディッシュの形質移入の後に、およそ５０個のプラークがそれぞれのウェルから回収された。ウイルスをこれらのプラークから増幅させ、ｄｓＲＮＡを精製した。ゲノムセグメント１０の起源を、ｄｓＲＮＡをＰＡＧＥゲル上で電気泳動することにより、まず決定した。ＢＴＶ−１０からのより速く移動するセグメント１０を含むｄｓＲＮＡゲノムプロフィールを、プラークのスクリーニングを実行可能な選択肢とするのに充分に高い頻度（１５〜８０％）で得た（図３Ａ）。セグメント１０は、ＲＴ−ＰＣＲと、その後、１型と１０型との間の可変性を示す領域の配列決定を行うことによりそれであることを確認した（図３Ｂ、ＣおよびＤ）。これらのデータは、プラスミド由来ＢＴＶ−１０セグメント１０が生存可能なＢＴＶ−１のゲノム中に回収されたことを示す。

ＢＴＶは、天然では、細胞が２つの異なる株に感染した場合に、再集合した後代ゲノムを生成する［２１］。セグメント１０リアソータントの起源である２つのウイルス間の天然再集合の可能性をなくすために、マーカーとしてサイレントＨａｅＩＩ部位が導入されたＢＴＶ−１０セグメント１０クローン（ｐＮＳ３Ｈａｅ）を、ｐＮＳ３ＢｓｍＢＩの部位特異的突然変異誘発により作製した。ＢＳＲ単層に、ＢＴＶ−１コア由来ｍＲＮＡと、ｐＮＳ３Ｈａｅに由来する、変異が導入されたＢＴＶ−１０セグメント１０ Ｔ７転写産物との混合物を形質移入した。この変異ＢＴＶ−１０セグメント１０配列を含むウイルスの回収を、ＰＡＧＥゲル上でその移動速度が増大することにより、まずスクリーニングした（図４Ａ）。ＨａｅＩＩ部位がＢＴＶゲノムのセグメント１０に導入されたことを、プラーク精製ウイルスからのｄｓＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲと、その後のＨａｅＩＩ消化（図４Ｂ）、およびＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定（図４ＣおよびＤ）により確認した。セグメント１０は、ｐＮＳ３Ｈａｅにコードされるセグメントとその全長にわたって同じであることが、全長ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定により決定された（データは示さず）。

ｃＤＮＡクローンに由来する２つのＢＴＶ−１０セグメントの、ＢＴＶ−１ゲノムへの同時導入。２つのゲノムセグメントを同時に変化させるこの可能性を評価するために、ＢＴＶ−１０からの外殻タンパク質をコードするセグメント（セグメント２および５）を、ＢＴＶ−１ゲノムセグメントのバックグラウンドに導入することを研究した。これらのゲノムセグメントを別の血清型からのセグメントに置き換えることにより、ウイルスの血清型を変化させることができるだろう。ＢＴＶ−１０のセグメント２および５に由来するＴ７転写産物を、それぞれｐＶＰ２ＢｓｍＢＩおよびｐＶＰ５ＢｓｍＢＩから作製し、ＢＴＶ−１コア由来ｍＲＮＡと、それぞれのＴ７転写産物と対応するコア由来転写産物との比５：１で混合した。集密ＢＳＲ細胞単層に、ＲＮＡ混合物を形質移入し、ｄｓＲＮＡを、回収したプラークから調製した。セグメント２および５の起源を、ＰＡＧＥゲル上でのそれらの移動速度により、まず評価した（図５Ａ）。ＢＴＶ−１０からの両方のセグメント２および５は、高い頻度でともに回収された（２０〜８０％）。セグメントは、ＲＴ−ＰＣＲと、その後の制限消化によりそれであることを確認した（図５ＢおよびＣ）。セグメント２およびセグメント５の完全配列は、ＢＴＶ−１０の完全配列であることが、ＲＴ−ＰＣＲ増幅および配列決定により決定された（データは示さず）。ＢＴＶ−１０からのセグメント２のみまたはセグメント５のみを含む後代は回収されず（３回の独立した実験からの１９プラークのうち０）、このことは、一方の親からのセグメント２を含むウイルスと、他方の親からのセグメント５を含むウイルスは、生存性が低いか、または二重リアソータントとよりも低い頻度で生じるかであることを示唆した。この現象は、ＢＴＶ−１０からのセグメント２またはセグメント５をＢＴＶ−１に導入することを試みたときに、１つもリアソータント後代が回収されなかったことによってもさらに支持された（データは示さず）。

Ｔ７転写産物に完全に由来するＢＴＶの回収。上記の方法は、ＢＴＶゲノムセグメントの操作を可能にする実行可能な逆遺伝学的機構であるが、野生型プラークからのリアソータントプラークのスクリーニングは、成長が遅い変異体の回収を妨げ得る。理想的な逆遺伝学的機構は、Ｔ７転写産物に完全に由来する感染性ウイルスの組み立てを可能にする。全てのゲノムセグメントについて生存可能なクローンを有する可能性を最大限にするために、それぞれのゲノムセグメントのＲＴ−ＰＣＲ増幅を、ＢＴＶ−１のｄｓＲＮＡを用いて、ｄｓＲＮＡ鋳型について開発された配列非依存性ＦＬＡＣ法［１８］を用いて行った。それぞれのＲＴ−ＰＣＲ産物をｐＵＣ１９中にクローニングし［２２］、それぞれのクローンの完全配列を、それぞれのＲＴ−ＰＣＲ産物の完全配列と比較して、代表的分子がそれぞれの場合にクローン化されたかを決定した（データは示さず）。クローン化されたゲノムセグメントの末端の２００ｎｔ以内にコードの変化または任意の違いが存在した場合は、代替のクローンを配列決定した。１０クローンの完全セットが一旦得られると、それぞれのゲノムセグメントを、高忠実度ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いてＰＣＲ増幅して、Ｔ７プロモーターを、ゲノムセグメントのすぐ上流に、そして制限酵素部位をすぐ下流に導入した（図２）。これらの機能的カセットも、ｐＵＣ１９にクローニングした。制限消化プラスミドクローンを用いて合成したＴ７転写産物は、１％変性アガロースゲルで分解したときに予測されるサイズであることが決定された（図６ＡおよびＢ）。

制限消化プラスミドから作製されたＴ７転写産物を、等重量比で混合し、合計で３〜４μｇを用いて集密ＢＳＲ単層に形質移入した。形質移入された単層に、アガロースを重層し、形質移入の３〜６日後にプラークが出現した（図７Ａ）。増幅したプラークからのｄｓＲＮＡを、ＢＴＶ−１ストックウイルスとＰＡＧＥゲル上で比較し、区別がつかないことがわかり、このことにより、ＢＴＶ−１が回収したことを確認した（図７Ｂ）。ＢＴＶをＴ７転写産物から導くことができることをさらに裏付けるために、導入されたサイレントＢｇｌＩＩ部位を含むＢＴＶ−１セグメント８ Ｔ７クローンの変異体であるｐＢＴＶ１Ｓ８Ｂｇｌを作製した。Ｔ７転写産物の完全なセットでの形質移入からのプラークを回収し、ここでは、セグメント８ ＢｇｌＩＩマーカー転写産物が野生型Ｓ８転写産物を置き換えていた（図８Ａ）。増幅したプラークからのｄｓＲＮＡは、ＢＴＶ−１ストックウイルスとＰＡＧＥゲル上で比較したときに、区別がつかないことがわかった（図８Ｂ）。プラークを、ＢＳＲ細胞への感染により増幅し、Ｓ８セグメントを、ＲＴ−ＰＣＲにより、プライマーＮＳ２＿Ｂａｍ＿ＲおよびＮＳ２＿Ｂａｍ＿Ｔ７＿Ｆを用いて増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ産物の消化により、ＢｇｌＩＩ部位が導入されたことが示された（図９Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、ＢＴＶ１＿Ｓ８＿６２７Ｒプライマーを用いて配列決定して、マーカー配列が導入されたことを確認した（図９Ｂ）。これらのデータは、Ｔ７転写産物の完全ゲノムセットからＢＴＶを回収でき、この機構を用いて実行可能な変異を導入できることを示す。

ＢＴＶ１デルタＶＰ６ウイルスの回収。ＤＩＳＣワクチン株を作製するために、必須タンパク質ＶＰ６中の大きいアウトオブフレーム欠失を野生型セグメント９クローン中で作製して、ｐＢＴＶ１ Ｓ９デルタを作製した（図１０）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成Ｔ７転写産物の完全ゲノムセットを、野生型セグメント９転写産物の代わりに欠失セグメント９転写産物を含めて上記のようにして作製した。対応する変異ウイルスであるＢＴＶ１デルタＶＰ６を、形質移入の間に野生型ＢＳＲ細胞の代わりにＢＳＲ ＶＰ６株化細胞を用いて回収した。形質移入の５日後に、形質移入されたウェルではＢＴＶ ＣＰＥとは区別がつかない細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察され、このことは、感染性ウイルスの回収を示す（データは示さず）。

ＢＴＶ１デルタＶＰ６は、ＢＳＲ ＶＰ６株化細胞中で複製する。ＢＴＶ１デルタＶＰ６ウイルスがＢＳＲ ＶＰ６株化細胞において安定して複製されるかを決定するために、これを、野生型ＢＳＲ細胞における野生型ＢＴＶ−１の複製と比較した。ＢＳＲ ＶＰ６株化細胞にＢＴＶ１デルタＶＰ６を感染させることにより生じるＣＰＥは、野生型ＢＴＶ−１を野生型ＢＳＲ細胞に感染させるために用いたときに生じるものと等しく、このことは、ＢＴＶ１デルタＶＰ６の複製に著しい欠陥がないことを示した（図１１を参照されたい）。ＢＴＶ１デルタＶＰ６のプラーク形成能力を、ＢＳＲ ＶＰ６株化細胞を用いて評価した（図１２を参照されたい）。ＢＳＲ ＶＰ６株化細胞は、正常な外観のプラークが産生されるようにＢＴＶ１デルタＶＰ６の成長を補完して、ＢＴＶ１デルタＶＰ６の正常な力価を可能にすることがわかった。ＢＴＶ１デルタＶＰ６ウイルスは、ＢＳＲ ＶＰ６株化細胞を用いて、野生型ＢＴＶ−１に匹敵する力価まで（１０^７感染単位／ｍｌを超える）成長できた。これらのデータは、ＢＴＶ１デルタＶＰ６ウイルスが、補完性ＢＳＲ ＶＰ６株化細胞中で有効に複製されることを示す。

ＢＴＶ１デルタＶＰ６のゲノムセグメント９の特徴決定。ＢＴＶ１デルタＶＰ６をＢＳＲ ＶＰ６株化細胞上で増殖させ、ウイルス２本鎖ＲＮＡを抽出し、上記のようにして精製した。ＢＴＶ１デルタＶＰ６ゲノムは、野生型Ｓ９セグメントを欠いており、かつ欠失Ｓ９セグメントでの野生型Ｓ９セグメントの置き換えに相当するより小さいゲノムセグメントを含む（図１３Ａ）。ＢＴＶ１デルタＶＰ６からのＳ９セグメントを、ＲＴ−ＰＣＲにより、Ｓ９セグメントの両末端にアニールするプライマー（ＥｃｏＴ７＿Ｓ９＿ＦおよびＥｃｏＢｓｍＢ＿Ｓ９＿Ｒ）を用いて増幅し、６５０ｎｔの予測される産物を生じ（図１３Ｂ）、これを同じプライマーを用いて配列決定した。増幅されたゲノムセグメントの観察された配列は、ｐＢＴＶ１ Ｓ９デルタのものと同一であり（データは示さず）、このことは、回収されたウイルスが正しく構築されたことを示した。

非補完性株化細胞でのＢＴＶ１デルタＶＰ６の成長の特徴決定。ＤＩＳＣワクチン株のある重要な特徴は、宿主生物において複製サイクルを完了できないはずであることである。ＢＴＶ１デルタＶＰ６が欠陥性であるかを評価するために、ともにＢＴＶが有効に複製する系統である哺乳動物系統ＢＳＲ （ＢＨＫ−２１サブクローン）および媒介昆虫株化細胞Ｃ６／３６を、哺乳動物および媒介昆虫の宿主の代理として用いた。これらの株化細胞はともにＢＴＶ１デルタＶＰ６に感染し、産生したウイルスの合計を、７２時間にわたって、ＢＳＲ ＶＰ６補完性株化細胞を用いるプラークアッセイにより監視した。ＢＴＶ１デルタＶＰ６はいずれの株化細胞でも複製しなかったが、野生型ＢＴＶ−１は両方の系統において有効に複製した（図１４ＡおよびＢ）。このデータは、ＶＰ６遺伝子の破壊により、補完性株化細胞によりＶＰ６タンパク質が供給されない場合は、ウイルスが複製できなくなっていることを示す。

ＢＴＶ１デルタＶＰ６は、非補完性ＢＳＲ細胞においてウイルスタンパク質を発現する。いずれのＤＩＳＣワクチンも、免疫応答を誘発するために、宿主生物内でウイルスタンパク質を発現しなければならない。ＢＴＶ１デルタＶＰ６がウイルスタンパク質を発現できるかを評価するために、野生型ＢＳＲ細胞を哺乳動物宿主の代理として用いた。非構造タンパク質ＮＳ２の検出を、ウイルスタンパク質発現のマーカーとして用いた。ＢＴＶ１デルタＶＰ６ウイルスと野生型ＢＴＶ−１とのタンパク質発現の比較において、ＮＳ２タンパク質は、ＢＴＶ１デルタＶＰ６に感染したＢＳＲおよびＢＴＶ−１に感染したＢＳＲの両方において時間とともにその発現レベルが増大した（図１５）。ＢＴＶ１デルタＶＰ６ウイルスからのタンパク質発現レベルは、欠陥ウイルスについて予測されるように、野生型ＢＴＶ−１についてのものよりも低かった。このデータは、ＢＴＶ１デルタＶＰ６ウイルスが、非補完性ＢＳＲ細胞においてウイルスタンパク質を発現することを示す。

マーカー抗原をＢＴＶゲノムに加えることができる。ＢＴＶゲノムからのマーカー抗原／ペプチドを発現する能力により、ＤＩＶＡ準拠ワクチン株を創出することが可能になる（ＤＩＶＡ：感染動物からワクチン接種動物を区別する）。逆遺伝学のアプローチを補完性株化細胞と組み合わせて用いてこのことが可能であることを示すために、ＮＳ３とｅＧＦＰとのインフレーム融合体を含むクローンであるｐＢＴＶ１ Ｓ１０ＧＦＰを作製した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成したＴ７転写産物の完全ゲノムセットを、野生型セグメント１０転写産物の代わりにＮＳ３−ｅＧＦＰ融合転写産物を含んで、上記のようにして作製した。対応する変異ウイルスであるＢＴＶ１ Ｓ１０ＧＦＰを、形質移入の間に野生型ＢＳＲ細胞の代わりにＢＳＲ ＮＳ３相補性株化細胞を用いて、記載されたようにして回収した。非補完性Ｃ６／３６細胞にＢＴＶ１ Ｓ１０ＧＦＰが感染した場合、ｅＧＦＰの発現が、ＵＶ光の下でその蛍光により確認された（データは示さず）。

ＢＴＶ１ Ｓ１０ＧＦＰのゲノムセグメント１０の特徴決定。ＢＴＶ１ Ｓ１０ＧＦＰのゲノムは、野生型Ｓ１０セグメントを欠いており、かつＳ１０ ＧＦＰ融合体に相当するより大きいセグメントを含む（図１６Ａ）。ＢＴＶ１ Ｓ１０ＧＦＰからのＳ１０セグメントを、ＲＴ−ＰＣＲにより、Ｓ１０セグメントの両末端にアニールするプライマー（ＢＴＶ１Ｓ１０Ｔ７ ＥｃｏＲＩおよびＮＳ３ＢｓｍＢｉ ｒｅｖ）を用いて増幅し、１４４６ｎｔの予測される産物が増幅された（図１６Ｂ）。ＢＴＶ１ Ｓ１０ＧＦＰからのＲＴ−ＰＣＲ産物を配列決定し、ｅＧＦＰ遺伝子の存在を確認し（図１７を参照されたい）、このことは、回収されたウイルスが正しく構築されたことを示した。

プラスミド由来転写産物からのウイルス回収の効率の増大
プラスミド由来Ｔ７転写産物からのブルータングウイルス回収の効率を増大させる２つの変更を行った。これらの変更はともに、上記の形質移入方法に対する変化である。それぞれの改良は、プラスミド由来転写産物からのウイルスの回収効率をおよそ１０倍増大させ、併せておよそ１００倍のウイルスの回収の増大をもたらす。

改変番号１、二重形質移入
細胞に、上記のように、それぞれの場合に１０個のプラスミド由来転写産物の完全セットを２回（１回ではなく）形質移入する。形質移入は１８時間の間隔で行い、単一形質移入を用いる場合のおよそ１０倍にウイルス回収が増大する。二重形質移入方法を用いるウイルスの回収の増大は、ＢＴＶコアから作製したｓｓＲＮＡを用いた場合（図１８）と、１０個のｃＤＮＡクローンから作製したＴ７転写産物の完全セットを用いた場合（図１９）とで観察された。

改変番号２、第１の形質移入からのゲノムセグメント２、５、７および１０の削除：
細胞に、改変番号１と同様であるが、ゲノムセグメント２、５、７および１０をコードするＴ７転写産物を第１の形質移入から削除して２回形質移入した。第２の形質移入は、１０個の転写産物の完全セットを用いる。形質移入は１８時間の間隔で行い、上記の二重形質移入を用いる場合のおよそ１０倍にウイルス回収がさらに増大する（図２０）。

考察
上記の２つのアプローチは、真のウイルス転写産物とＴ７転写産物の混合物、またはＴ７転写産物の完全ゲノムセットのいずれかを用いる、ＢＴＶについての代替の逆遺伝学的機構を示す。これらにより、ＢＴＶ転写産物を許容細胞に形質移入するために用いたときにこれらの転写産物が感染性である［１］という発見を拡張し、５’末端のキャップアナログを有するｉｎ ｖｉｔｒｏ合成Ｔ７転写産物がコア粒子により合成された転写産物を機能的に置換できることを示す。

２つの別々のコア由来ｍＲＮＡ調製物に由来するゲノムセグメントを有する後代ウイルスの回収は、真のウイルス転写産物と混合することによりＢＴＶのゲノムに外因性転写産物を導入するという原理を確立した（図１Ｂ）。転写後にｍＲＮＡ調製物を混合することがリアソータントの生成に効果的であるとの知見により、プラスミド由来転写産物をコア由来ｍＲＮＡと組み合わせて、ＢＴＶゲノムに標的変異を導入するという可能性が可能になった。ＢＴＶ−１０セグメント１０転写産物をＢＴＶ−１のゲノムに導入することを研究して、プラスミド由来転写産物が感染性ＢＴＶに容易に導入され得たかを決定した。このモデル機構は、Ｔ７転写産物を過剰に用いることにより、個別のプラークのスクリーニングを実行可能にする頻度（１５〜８０％）でリアソータントプラークが生じたことを示した。ＰＡＧＥゲル上でのセグメント１０ ｄｓＲＮＡの移動速度によるプラークの当初のスクリーニング（図３）を、ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定により確認した（図３）。Ｔ７転写産物と真のウイルス転写産物との間の再集合の高い効率は、選択マーカーアプローチが必要なかったことを意味する。ＢＴＶのセグメント１０へのＨａｅＩＩ部位マーカー変異の導入により、リアソータントが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたセグメント１０ Ｔ７転写産物に由来したことが確認された（図４）。ＨａｅＩＩ含有セグメント１０は、野生型ＢＴＶ−１０セグメント１０と同様の効率で回収された。これらのセグメント１０リアソータントウイルスはともに、野生型ＢＴＶ−１と比較して、著しい複製の欠陥を示さなかった（データは示さず）。このことは、ＢＴＶ−１０からのゲノムセグメント１０がＲＮＡパッケージングおよび複製、ならびにＮＳ３／ＮＳ３Ａタンパク質機能のレベルの両方において、ＢＴＶ−１ゲノムセグメントのバックグラウンドに機能的に適合することを示す。

２つのＴ７転写産物がＢＴＶゲノムに同時再集合してＢＴＶ−１の抗原性に重要な外殻タンパク質をＢＴＶ−１０ ｃＤＮＡクローンからのものに置き換えることが可能であることが、両方のＴ７転写産物を過剰に用いることにより示された（図５）。ＢＴＶ−１０セグメント２および５を含む後代プラークが、２０〜８０％の頻度で回収されたが、ＢＴＶ−１０からのセグメント２またはセグメント５のみを含むリアソータントは単離されなかった。このことは、ＢＴＶ−１０のセグメント２および５が一緒に、対応するＢＴＶ−１ゲノムセグメントを機能的に置換できることを示し、これらの２つの血清型からのセグメント２とセグメント５の間にはあるレベルの不適合があることを示唆する。コードされるタンパク質ＶＰ２およびＶＰ５は、ウイルス粒子表面で免疫選択圧にさらされていることから、高度に可変性である。本発明者らの好ましい説明は、ＶＰ２およびＶＰ５タンパク質がともに進化し、一方の血清型からのＶＰ２の３次元構造が他方の血清型からのＶＰ５と必ずしも適合性でないということである。このことは、ＢＴＶウイルス様粒子の作製において観察された、いくつかの血清型の組み合わせからのＶＰ２およびＶＰ５タンパク質の不適合性が以前に報告されたこととも一致する［２３、２４］。ＲＮＡパッケージングレベルでのいくつかの血清型組み合わせにおけるセグメント２およびセグメント５の不適合性は、別の可能性である。別の血清型からの両方の外殻タンパク質を同時に導入することは、遺伝的バックグラウンドが一致している異なる血清型に対するワクチン株を製造する可能性を可能にする。ＢＴＶ−１とＢＴＶ−１０のＶＰ２タンパク質間のアミノ酸配列の高い相違（４０％のアミノ酸同一性）は、ＢＴＶビリオンの保存されたコア上への種々のＶＰ２＋ＶＰ５対の組み立てが可能であることを示唆する。

Ｔ７転写産物の完全セットからのＢＴＶ−１の回収を研究して、完全に規定されたゲノムを有するウイルスがｃＤＮＡクローンから回収できたかを決定した。１０個のＴ７転写産物のＢＳＲ単層への形質移入は、プラークの産生を導くことがわかった（図７）。ＢｇｌＩＩマーカー変異のＳ８セグメント中への回収により、回収されたウイルスが形質移入に用いたＴ７転写産物に由来することが確かめられた（図８および９）。感染性ＢＴＶをＴ７転写産物だけから回収することは、キャップアナログの存在下で合成されたＴ７転写産物が、複製サイクルの全ての段階において真のウイルス転写産物と機能的に同等であることを示す。Ｔ７転写産物は、ビリオンが作製されるのであれば翻訳され、ゲノムパッケージングの間に選択され、マイナス鎖合成の鋳型として作用しなければならない。さらに、マイナス鎖合成の後に、得られたｄｓＲＮＡゲノムセグメントは、次の回の感染における転写のために能力を有さなければならない。Ｔ７転写産物からのＢＴＶの回収は、等量のコア由来ウイルス転写産物を用いる場合よりもおよそ１００倍少ないプラークの回収を導く。より低い効率は、キャップアナログの存在下で生じるＴ７転写産物の一部分だけが５’末端に組み込まれたキャップアナログを有するという事実に由来し得る。翻訳されにくいということに加えて、キャップを有さない転写産物はＲＮＡパッケージングの間、マイナス鎖合成または次の回の感染における転写の間に欠陥があり得る。重要なことには、キャップを有さない転写産物は、ＲＩＧ−Ｉにより認識され、抗ウイルス性の応答を誘導する病原体関連分子構造（ＰＡＭＰ）であることが知られている５’三リン酸部分を有する［２５〜２８］。あるいは、保存されたインタクトな末端配列を有する１０個のｓｓＲＮＡ分子の作製に関連する技術的な問題が、Ｔ７転写産物で観察されるより低い回収に寄与し得る。

プラスミド由来転写産物に完全に由来するＢＴＶの回収は、遺伝的バックグラウンドが一致するＢＴＶ変異体の作製を可能にする。このアプローチは、遅い複製表現型を有すると予測される変異体の回収に有用である。なぜなら、野生型プラークから所望の変異体についてのプラークをスクリーニングする必要がないからである。このような場合、より遅く複製する変異体の回収を妨げる可能性があるより速く複製するウイルスのバックグラウンドがない。このアプローチは、ＢＴＶの初代／低世代の単離株を回収するために用いることもでき、これらの株が細胞培養条件に対して徐々に変化することを回避する。１つのプラスミド由来ゲノムセグメントを有するリアソータントの回収は、単一クローンまたはＰＣＲ産物の構築を必要とし、いずれのゲノムセグメントにも用い得る。この単一構築物アプローチは、１０個のクローン全部のセットを構築する必要なく、個別のウイルス遺伝子を研究するために用いることができる。レオウイルス科の構成員は共通の複製戦略を有するので、再集合およびＴ７のみの両方の逆遺伝学的アプローチを、逆遺伝学的機構を欠く広範囲のウイルスに適用することができる。両方のアプローチにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたＴ７転写産物を用いることにより、ウイルスの複製の回収を妨げ得る組換えポックスウイルスでの感染によりＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを供給する必要がなくなる。

代替の逆遺伝学的戦略が、レオウイルス科の他の属についてうまく用いられている［２〜４］。最初の逆遺伝学的機構は、哺乳動物オルトレオウイルスについてのヘルパーウイルス系であった［３］。このアプローチは、許容細胞のレオウイルス感染と、ウイルスｄｓＲＮＡ、ウイルスｍＲＮＡ、Ｔ７転写産物およびｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳されたウイルスｍＲＮＡの形質移入とを組み合わせた。別のヘルパーウイルスアプローチは、ロタウイルスの外殻タンパク質を別の血清型からの対応するタンパク質で置き換えることを可能にした［２］。導入されたゲノムセグメントの発現は、組換えＴ７ワクシニアウイルス系によりｉｎ ｖｉｖｏで駆動され、同等のヘルパーウイルスタンパク質に対する選択圧は、抗体選択の使用により提供された。直近では、哺乳動物オルトレオウイルスが、マイナス鎖ウイルスで最初に用いられたＴ７駆動機構と同様のプラスミドに基づく機構を用いて回収された［４］。この場合、１０ゲノムセグメント全ての発現は、組換えＴ７ワクシニアウイルス系によりｉｎ ｖｉｖｏで駆動された。全ての成功した逆遺伝学的戦略は、いくつかの共通する著しい特徴を有する；１）ｃＤＮＡクローンに由来するゲノムセグメントが、形質移入された細胞においてメッセージセンス転写産物として提供される。２）用いられるｃＤＮＡ由来転写産物が、対応するウイルス転写産物と同じ５’末端および３’末端の配列を有する。５’末端は、適切な配列とともにＴ７プロモーターを用いることにより作製され、３’末端はｉｎ ｖｉｖｏでデルタ肝炎リボザイムを用いるか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで制限酵素部位を用いて作製される。レオウイルス科構成員の全てのゲノムセグメントは、それらの最も５’および３’末端に短い保存配列を有し、これらの機能はまだ明らかにされていない。３）真のウイルス転写産物のように、ｃＤＮＡ由来転写産物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでキャップアナログにより、またはｉｎ ｖｉｖｏでワクシニアＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ組換え体に付随する交差キャップ形成活性によりキャップ形成される［１３］。感染性ウイルスを回収するために、遺伝子発現は、後代コア粒子の組み立てを可能にするのに充分でなければならず、これらの粒子は転写活性があり、遺伝子発現の増幅を導く。高いレベルの遺伝子発現が、これらの不完全ビリオンの組み立てに必要であり、ｃＤＮＡ由来転写産物の５’末端にキャップ構造が存在しなければ、それらの安定性および翻訳のレベルは大きく低減されるだろう［１４］。

ウイルス遺伝子を欠くＤＩＳＣウイルスを、ＢＴＶ逆遺伝学的機構と補完性株化細胞との組み合わせを用いて生成した。回収されたウイルスは、ＢＴＶ ＤＩＳＣウイルスワクチン株についての以下の基準を充足する：１）非補完性哺乳動物細胞におけるウイルスタンパク質の発現（図１５）；２）非補完性哺乳動物または媒介昆虫株化細胞において生じる検出可能な感染性ウイルスがないこと（図１４）；および３）対応する補完性株化細胞での安定した複製（図１２）。さらに、外来タンパク質またはペプチドを発現する能力が、ｅＧＦＰタンパク質をＮＳ３オープンリーディングフレームに挿入することにより示され、このことは、感染動物から区別するためにワクチン接種された動物で検出できる免疫学的マーカーを含むワクチン株の生成、ＤＩＶＡ概念（感染動物とワクチン接種動物とを区別する）を可能にする。

Ｔ７転写産物またはウイルスｓｓＲＮＡは、レオウイルス科の構成員の複製サイクルにおいて２つの機能を有する；１）翻訳されてウイルスタンパク質を生じる；そして２）新しい２本鎖ゲノムセグメントの合成のための複製中間体として作用する。単一形質移入アプローチを用いて細胞において救済が成功するために、転写産物の一部分は、後代ウイルス粒子の組み立てにおいてパッケージングされかつ複製されるために利用可能なままでなければならない。このことは、ウイルス回収の効率において制限ステップであると考えられる。なぜなら、通常の感染とは異なって、新しい転写産物は感染するコア粒子から継続的に合成されないからである。回収効率を増大させるために、第２の形質移入を行って、形態形成がパッケージング段階に到達したと予測されるときに、パッケージングのためのさらなる転写産物を導入した。ウイルスの回収の予測された増大が、ウイルスｓｓＲＮＡまたはＴ７転写産物を用いて観察され（図１８および１９）、これはおよそ１０倍であることがわかった。

回収効率をさらに増大させるために、ゲノムセグメントを１回目の形質移入から削除して、形態形成がカプシドの内層の組み立てより先に進むことができないようにした。このアプローチは、パッケージングが起こると予測される段階で組み立てを停止させるために採択した。削除されたセグメントのゲノムセグメントがコードする割り当ては、次のとおりである：セグメント２はＶＰ２（外殻）をコードし、セグメント５はＶＰ５（外殻）をコードし、セグメント７はＶＰ７（カプシドの中間層）をコードし、セグメント１０はＮＳ３（ウイルス放出に必要）をコードする。セグメント２、５、７および１０を削除することにより、３層のカプシドの中間層および外層が合成されず、放出タンパク質ＮＳ３が存在しない。このようにして形態形成を停止させることにより、第２の形質移入において１０個の転写産物の完全セットが提供される場合に、ウイルスの回収がさらにおよそ１０倍増大することがわかった（図２０）。

形質移入プロトコルへのこれらの２つの改良を併せて、単一形質移入を用いる場合のおよそ１００倍のウイルス回収の増大をもたらし、このことにより、野生型または変異ウイルスの信頼性のある回収が可能になる。これらの改良により、補完性株化細胞を用いて本来欠陥のあるウイルスの信頼性のある回収が可能になった。

他のウイルスを用いた場合と同様に、逆遺伝学は、いくつかの研究領域におけるＢＴＶの理解に貢献できる。いずれかの機構を用いてＢＴＶゲノムに特定の変異を回収する能力は、ＢＴＶおよび関連するオルビウイルスの分子分析のための新規なツールを提供するだけでなく、これらのウイルスに対する特に弱毒化されたワクチンの開発の機会も提供する。現在までのＢＴＶタンパク質機能の研究は、組換えタンパク質発現に主に基づいていた。ＢＴＶの遺伝子に特定の変異を導入する能力は、複製するウイルスにおけるウイルスタンパク質の機能の理解をさらに深め、すでに割り当てられた機能の確証を可能にする。オルビウイルスゲノムの複製、パッケージング、および発現を制御するシス作用性ＲＮＡ配列はマッピングされないままであり、あまり理解されていない。逆遺伝学は、これらの調節配列のマッピングを可能にし、それらがどのように作用するかの研究を補助できる。外殻タンパク質の置き換えを用いて、共通の遺伝的バックグラウンドに基づく異なる血清型に対するワクチン株を作製できる。さらに、ＢＴＶおよび関連するオルビウイルスの病原性の決定因子を同定し、多様に弱毒化されたワクチン株を設計できる。

（参考文献）
1. Boyce, M. and Roy, P. 2007. Recovery of Infectious Bluetongue Virus from RNA. J. Virol. 81(5): 2179-2186.
2. Komoto, S., J. Sasaki, and K. Taniguchi. 2006. Reverse genetics system for introduction of site-specific mutations into the double-stranded RNA genome of infectious rotavirus. Proc, Natl. Acad. ScL USA 103:4646-4651.
3. Roner, M. R., and W. K. Joklik. 2001. Reovirus reverse genetics: incorporation of the CAT gene into the reovirus genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:8036-8041.
4. Kobayashi, T., et al. 2007 A Reverse Genetics System for dsRNA Viruses. Cell Host & Microbe. 1(2): 147-157.
5. Roy, P., Towards the control of emerging Bluetongue disease. 1991, London: Oxford Virology. 1-71.
6. Patton, J.T., Rotavirus VPl alone specifically binds to the 3' end of viral mRNA, but the interaction is not sufficient to initiate minus-strand synthesis. J. Virol, 1996. 70(11): p. 7940-7.
7. Patton, J. T., et al., cis-Acting signals that promote genome replication in rotavirus mRNA. J. Virol, 1996. 70(6): p. 3961-71.
8. Poncet, D., C. Aponte, and J. Cohen, Rotavirus protein NSP3 (NS34) is bound to the 3' end consensus sequence of viral mRNAs in infected cells. J. Virol, 1993. 67(6): p. 3159-65.
9. Chizhikov, V. and J.T. Patton, A four-nucleotide translation enhancer in the 3'- terminal consensus sequence of the nonpolyadenylated mRNAs of rotavirus. RNA, 2000. 6(6): p. 814-25.
10. Roner, M.R., K. Bassett, and J. Roehr, Identification of the 5' sequences required for incorporation of an engineered ssRNA into the Reovirus genome. Virology, 2004. 329(2): p. 348-60.
11. Roner, M. R. and J. Roehr, The 3' sequences required for incorporation of an engineered ssRNA into the Reovirus genome. Virol J, 2006. 3: p. 1.
12. Roner, M.R. and B. G. Steele, Localizing the reovirus packaging signals using an engineered ml and s2 ssRNA. Virology, 2007. 358(1): p. 89-97.
13. Fuerst, T.R. and B. Moss, Structure and stability of mRNA synthesized by vaccinia virus-encoded bacteriophage T7 RNA polymerase in mammalian cells. Importance of the 5' untranslated leader. J MoI Biol, 1989. 206(2): p. 333-48.
14. Muthukrishnan, S., et al., 5'-Terminal 7-methylguanosine in eukaryotic mRNA is required for translation. Nature, 1975. 255: p. 33-37.
15. Wirblich, C, B. Bhattacharya, and P. Roy, Nonstructural protein 3 of bluetongue virus assists virus release by recruiting ESCRT-I protein TsglOl. J. Virol. 2006. 80(1): p. 460-73.
16. Bhattacharya, B., RJ. Noad, and P. Roy, Interaction between Bluetongue virus outer capsid protein VP2 and vimentin is necessary for virus egress. Virol J, 2007. Jan 15; 4:7.
17. Weiner M. P., C, G.L., Schoelttin, W., Cline, J., Mathur, E., amd Bauer, J.C., Site directed mutagenesis of double stranded DNA by the polymerase chain reaction. Gene, 1994. 151: p. 119-123.
18. Maan, S., S. Rao, N. S. Maan, S. J. Anthony, H. Attoui, A. R. Samuel, and P. P. Mertens. 2007. Rapid cDNA synthesis and sequencing techniques for the genetic study of bluetongue and other dsRNA viruses. J. Virol. Methods 143:132-9.
19. Sambrook, J., and D. W. Russell. 2001. Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY.
20. Sanger, F., S. Nicklen, and A. R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain- terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-7.
21. Kahlon, J., K. Sugiyama, and P. Roy. 1983. Molecular basis of bluetongue virus neutralization. J. Virol. 48:627-32.
22. Yanisch-Perron, C₅ J. Vieira, and J. Messing. 1985. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene 33:103-19.
23. Loudon, P. T., T. Hirasawa, S. Oldfield, M. Murphy, and P. Roy. 1991. Expression of the outer capsid protein VP5 of two bluetongue viruses, and synthesis of chimeric double-shelled virus-like particles using combinations of recombinant baculoviruses. Virology 182:793-801.
24. Roy, P., B. D.H.L., H. LeBlois, and B. J. Erasmus. 1994. Long-lasting protection of sheep against bluetongue challenge after vaccination with virus-like particles: Evidence for homologous and partial heterologous protection. Vaccine 12:805-811.
25. Cui, S., K. Eisenacher, A. Kirchhofer, K. Brzozka, A. Lammens, K. Lammens, T. Fujita, K. K. Conzelmann, A. Krug, and K. P. Hopfner. 2008. The C-terminal regulatory domain is the RNA 5'-triphosphate sensor of RIG-I. MoI. Cell 29:169-79.
26. Hornung, V., J. Ellegast, S. Kim, K. Brzozka, A. Jung, H. Kato, H. Poeck, S. Akira, K. K. Conzelmann, M. Schlee, S. Endres, and G. Hartmann. 2006. 5'- Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science 314:994-7.
27. Pichlmair, A., O. Schulz, C. P. Tan, T. I. Naslund, P. Liljestrom, F. Weber, and C. Reis e Sousa. 2006. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5 '-phosphates. Science 314:997-1001.
28. Plumet, S., F. Herschke, J. M. Bourhis, H. Valentin, S. Longhi, and D. Gerlier. 2007. Cytosolic 5 '-triphosphate ended viral leader transcript of measles virus as activator of the RIG I-mediated interferon response. PLoS ONE 2:e279.
29. Tani, H. et al., Replication-competent recombinant vesicular stomatitis virus encoding hepatitis C vims envelope proteins. J Virol 81 (16), 8601 (2007).

Claims (15)

1. レオウイルス科の一員であるウイルスのワクチン用ウイルス株を製造する方法であって、
   必須遺伝子の機能が破壊されるようにレオウイルス科のウイルスに変異を導入するステップと、
   前記ウイルスのゲノムに由来し、前記変異を含むウイルス一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を細胞に形質移入するステップと、
   前記ワクチン用ウイルス株の製造を導くために適切な条件下で形質移入された前記細胞を培養するステップと
   を含み、
   前記細胞が、前記必須ウイルス遺伝子の機能を補完し、それによりワクチン用ウイルス株の前記細胞内での複製を可能にし、
   前記の細胞に形質移入するステップが、
   （１）第１の形質移入ステップが、ウイルスカプシドの内層の組み立てに必要な成分をコードするｓｓＲＮＡを細胞に形質移入することを含むものであり、
   （２）第２の形質移入ステップが、ウイルスゲノムの転写産物であり、前記変異を含み、前記ウイルスの組み立てに必要な全ての成分をコードするｓｓＲＮＡを細胞に形質移入することを含むものである、２以上の形質移入ステップを含む、方法。
2. 第１と第２の形質移入ステップの間に少なくとも６時間の間隔がある、請求項１に記載の方法。
3. 前記ウイルスが、ロタウイルス属またはオルビウイルス属の一員である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記ウイルスが、ブルータングウイルス、アフリカ馬疫ウイルスまたは流行性出血熱ウイルスである請求項１または２に記載の方法。
5. 前記ウイルスがブルータングウイルスである、請求項１または２に記載の方法。
6. 前記ｓｓＲＮＡの一部分が、前記変異を含むウイルスゲノムのｃＤＮＡクローンの転写産物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. ｓｓＲＮＡが全て、前記変異を含むウイルスゲノムのｃＤＮＡクローンの転写産物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
8. 複数の必須遺伝子の機能が破壊される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記必須遺伝子が、ポリメラーゼ、ヘリカーゼ、キャップ形成酵素または非構造タンパク質である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記細胞が、ｓｓＲＮＡの形質移入に適し、かつ、ＢＨＫ ２１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、２９３Ｔ細胞、ＢＳＲ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ６／３６細胞またはＫＣ細胞などのウイルス株の培養に適する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 細胞に形質移入するために用いられるウイルスｓｓＲＮＡが、単離ｓｓＲＮＡである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. ワクチン用ウイルス株を細胞から単離するステップをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. レオウイルス科の一員であるウイルスの必須遺伝子を同定するためのスクリーニング方法であって、
    遺伝子の機能が破壊されるようにレオウイルス科のウイルスに変異を導入するステップと、
    前記ウイルスのゲノムに由来し、前記変異を含むウイルスｓｓＲＮＡを細胞に形質移入するステップと、
    適切な条件下で形質移入された前記細胞を培養するステップと
    を含み、
    形質移入された前記細胞を培養した後に産生されるウイルスが病原性であれば、前記ウイルス遺伝子が必須遺伝子でなく、
    前記の細胞に形質移入するステップが、
    （１）第１の形質移入ステップが、ウイルスカプシドの内層の組み立てに必要な成分をコードするｓｓＲＮＡを細胞に形質移入することを含むものであり、
    （２）第２の形質移入ステップが、ウイルスゲノムの転写産物であり、前記変異を含み、前記ウイルスの組み立てに必要な全ての成分をコードするｓｓＲＮＡを細胞に形質移入することを含むものである、２以上の形質移入ステップを含む、方法。
14. レオウイルス科の一員であるウイルスの改変ウイルス株を製造する方法であって、
    レオウイルス科のウイルスに変異を導入するステップと、
    前記ウイルスのゲノムに由来し、前記変異を含むウイルス一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を細胞に形質移入するステップと、
    前記改変ウイルス株の製造を導くために適切な条件下で形質移入された前記細胞を培養するステップと
    を含み、
    前記細胞が、前記改変ウイルス株の細胞内での複製を可能にし、
    前記の細胞に形質移入するステップが、
    （１）第１の形質移入ステップが、ウイルスカプシドの内層の組み立てに必要な成分をコードするｓｓＲＮＡを細胞に形質移入することを含むものであり、
    （２）第２の形質移入ステップが、ウイルスゲノムの転写産物であり、前記変異を含み、前記ウイルスの組み立てに必要な全ての成分をコードするｓｓＲＮＡを細胞に形質移入することを含むものである、２以上の形質移入ステップを含む、方法。
15. 第１と第２の形質移入ステップの間に少なくとも６時間の間隔がある、請求項１３に記載のスクリーニング方法または請求項１４に記載の方法。