CN101970645A - 呼肠弧病毒家族病毒的疫苗病毒株的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及作为呼肠弧病毒科家族成员的病毒的改良病毒株的制造方法，以及尤其涉及环状病毒属的疫苗病毒株。

Description

呼肠弧病毒家族病毒的疫苗病毒株的制造方法
本发明涉及产生病毒的改性病毒株的方法，该病毒为呼肠弧病毒家族成员，尤其涉及尤其涉及环状病毒属的疫苗病毒株。
呼肠弧病毒科(Reoviridae)病毒，其具有由双股RNA(dsRNA)构成的基因组，导致多种疾病。环状病毒为呼肠弧病毒家族病毒，也导致广泛传播的疾病。环状病毒的实例为非洲马瘟病毒(AHSV)、流行性出血热病毒(EHDV)及蓝舌病毒(BTV)。
非洲马瘟病毒(AHSV)、流行性出血热病毒(EHDV)及蓝舌病毒(BTV)为反刍动物的非接触传染的病毒性疾病，并通常经昆虫携带者传播。AHSV通常地感染马、骡、驴及斑马；EHDV通常地感染鹿、家牛及绵羊；及BTV通常地感染家牛、绵羊、山羊、水牛、鹿、单峰骆驼及羚羊。
蓝舌病毒(BTV)为昆虫媒介的野生反刍动物及家畜的新兴病原体，其对欧洲农业已经产生严重的经济影响。BTV导致绵羊、山羊及家牛疾病，在一些种的绵羊中死亡率达70％。BTV在哺乳动物宿主间通过库蠓属的几种蠓传播，该蠓决定了该病毒的地理范围。BTV在多个热带及亚热带国家为地方性的，但自1998年BTV入侵欧洲大陆已经成为常见的事件，并于2007年向北直至联合王国。分子流行病学研究显示自1998年六种不同血清型(BTV1、2、4、8、9及16)在至少八个独立的场合，通过至少三种不同渠道已被引入欧洲大陆，自1998年大多数年份都有新的引入。BTV的所述增加范围的可能直接原因为昆虫媒介种群的大小和分布的增加，BTV通过新媒介种类的传播，其在中欧及北欧大量存在。家畜或野生反刍动物未确诊感染的存在与通过昆虫媒介的迁徙而远距离迅速传播一起导致阻止BTV在欧洲开始地方性化的失败。因此，当前BTV对所有欧洲国家中的家畜表现出严重威胁。四种BTV血清型现在欧洲普遍存在，并已导致180万头动物的死亡。
在欧洲已经尝试了通过接种进行BTV控制，其对少数的血清型同时使用活的和灭活的疫苗。两种疫苗已为欧洲各地区提供了一些保护，但仍有已知的缺点。存活的减低毒性的BTV疫苗具有多种缺点：1)导致典型蓝舌临床症状的发生的under-attenuation；2)毒性恢复或与野生型病毒重组，之后通过昆虫媒介传播；3)不能区分接种疫苗的动物与自然地感染的动物，这妨碍了鉴别感染与接种动物策略(DIVA)的使用；以及4)制造新流行的血清型的毒性降低株的时间延迟。
在欧洲，灭活疫苗已被用于控制BTV2及BTV4。这些疫苗受与灭活、确认每一批已灭活以及低免疫原性相关的高制造成本影响。
此前发明人已报道了BTV ssRNA在不使用辅助病毒时仍然是有感染性的，同时有感染性的BTV可从细胞中回收(Boyce，M.和Roy，P.2007)。此文献以全文方式结合于本文。
本发明旨在减少或消除与改良病毒的病毒株相关的，尤其是与产生活的减低毒性的疫苗相关的部分或全部已知缺点，所述病毒为呼肠弧病毒家族的成员。
本发明提供了制造作为呼肠弧病毒家族成员的病毒的疫苗病毒株的方法，该方法包括：
在呼肠弧病毒科病毒中引入突变，从而摧毁必需基因的功能；
使用来自病毒基因组并包含所述突变的病毒单股RNA(ssRNA)转染细胞；
在适宜的条件下培养该被转染的细胞，以实现疫苗病毒株的制造，
其中所述细胞补充了必需病毒基因的功能，因此使得疫苗病毒株在细胞中复制。
术语“疫苗病毒株”指适用于使通常受野生型病毒感染的特定宿主免疫的疫苗的病毒株。疫苗病毒株为非致病性及不能导致感染的病毒株。因此，其不导致通常与野生型病毒关联的疾病。疫苗病毒株的概念是本领域技术人员熟知的。例如，野生型病毒可以被减低毒性或灭活从而其在接种了减低毒性的或灭活的病毒的宿主内产生免疫响应而不导致完全感染。这允许宿主当暴露于野生型病毒的时候发起有效的免疫响应。
在本发明中，所述病毒可为呼肠弧病毒家族成员的任意病毒。优选地，所述病毒为轮状病毒、呼肠病毒或环状病毒属的成员。更优选地，所述病毒为环状病毒属的成员。再更优选地，所述病毒为蓝舌病毒(BTV)、非洲马瘟病毒(AHSV)或流行性出血热病毒(EHDV)。最优选地，所述病毒为蓝舌病毒(BTV)。
很多病毒具有多种不同的血清型。例如，BTV具有24种不同的血清型。不同血清型可以具有略微不同的蛋白质并甚至可以在不同基因组中含有的基因数量不同。进一步地，到现在为止未发现的血清型很可能未来会产生。因此，本发明旨在涵盖病毒任何可能的血清型，已知的或到现在为止未知的，其落入前述类别的定义内，例如，BTV。
术语“必需基因”指病毒为致病性所必需的基因。当必需基因的功能被摧毁时，所产生的疫苗病毒株为非致病性的。通过向该基因引入突变，破坏所述必需基因的功能。应破坏至少一个必需基因的功能。优选地，破坏超过一种必需基因的功能。这帮助确保所述病毒不恢复为致病性的显型。优选地，在必需基因或各个必需基因中的突变为影响该必需基因的大部分序列的广泛突变。同样地，这帮助确保所述病毒不恢复为致病性的显型。此突变可以为在任何必需基因中并使所述病毒转化为非致病性的显型。优选地，所述突变引入酶蛋白中，例如，在聚合酶、螺旋酶或加帽酶中。可选地，非结构蛋白也可以被灭活。这允许DIVA策略的使用。这是鉴别感染与接种动物策略。例如，如编码NS1的基因在BTV中被删除，疫苗株在被接种的动物中将不表达NS1。因此，在被接种的动物中将不会产生对NS1的抗体响应。这与正常感染不同，在正常感染中NS1被表达，动物中出现抗体响应。在监控过程中，NS1抗体的检测证明该动物被野生型的BTV感染，而不是被疫苗株感染。此外，可以在基因组中引入编码标记抗原(marker antigen)的基因。这将是明确的抗原标记物，说明动物已经被接种了。
该突变可以以任何合适的方式引入基因或各个基因。例如，该突变可以被引入病毒的基因组中。由此基因组产生的ssRNA转录产物也将包含此突变。可选地，该突变可直接引入ssRNA中。这可以通过例如使用人工产生的对应于被替换的部分但仍包含突变的ssRNA替换ssRNA的一部分来完成。在一个实施例中，用于转染细胞的ssRNA可以是完全人工制造的。此完全人工制造的ssRNA将对应于在单个或多个必需基因中带有突变的整个病毒基因组。例如，在一个实施例中，cDNA克隆可以由病毒基因组的一部分制得。
可选地，cDNA克隆可由整个病毒基因组制得。随后突变可被引入到cDNA克隆中，例如，以产生带有各种不同突变的cDNA克隆的文库。来自这些cDNA克隆的转录产物可随后用作用于转染细胞的ssRNA。因此，该ssRNA的一部分可以由cDNA克隆创建。可选地，用于转染细胞的整个ssRNA可从cDNA克隆创建。
所述突变可以为破坏基因功能的任意突变。该突变可以为，例如，缺失或插入突变，以致该突变基因产生无功能的蛋白。优选地，在病毒中引入大范围缺失的突变。
转染ssRNA的细胞可以为适于ssRNA转染及培养病毒株的任意细胞。该细胞是病毒许可的细胞。优选地，该细胞为BHK 21细胞、非洲绿猴肾细胞、293T细胞、BSR细胞(特定BHK 21细胞的克隆)、HeLa细胞、C6/36细胞(来自白纹伊蚊的蚊细胞系)或KC细胞(来自天然昆虫媒介蠛蠓的蚊细胞系)。更优选地，该细胞为BSR细胞。
用于转染细胞的ssRNA为病毒基因组的转录产物，也包含所述突变。此转录产物可由含有突变的病毒的dsRNA基因组直接获得。可选地，该转录产物可从病毒基因组中非直接地获得。例如，该转录产物可由病毒基因组的cDNA克隆中制得，该cDNA克隆包含突变。在呼肠弧病毒科病毒中，例如BTV，病毒ssRNA在所感染的细胞的细胞质中由病毒颗粒合成，此处其用作病毒蛋白合成的mRNA及新基因组dsRNA合成的模板。本发明的ssRNA也表现出这些功能，因此ssRNA中的突变在dsRNA基因组的合成过程中被并入疫苗病毒株。
该ssRNA可以被修饰，以含有期待的病毒的免疫关联蛋白质。例如，当病毒为BTV时，所述ssRNA优选地编码来自感兴趣的一种血清型的VP2及VP5。在一些实施例中，该ssRNA可以编码来自多种不同病毒血清型的大量免疫学上重要的蛋白质。该ssRNA可随后被用于接种以抵抗多种不同病毒血清型。
优选地，用于转染细胞的该病毒ssRNA是经分离的ssRNA。这意味着该ssRNA基本不含其它病毒组分，例如病毒颗粒、病毒dsRNA及病毒蛋白质。
经转染的细胞可以在任何适合的条件下以任何适合的方式培养，以使其产生疫苗病毒株。培养细胞的这些方法为本领域技术人员所熟知。
转染该细胞的步骤优选地包含2个或多个转染步骤，其中：
(1)第一转染步骤包括使用ssRNA转染细胞，所述ssRNA至少编码组装病毒衣壳内层所需的组分；以及
(2)第二转染步骤包括使用ssRNA转染细胞，所述ssRNA为病毒基因组的转录产物且包含突变，并因此编码所有病毒组装所需的组分。
已发现通过执行2次转染，所产生的病毒的水平提高了～10倍。进一步地，通过确保基因组包装所需的至少一种病毒组分未被在第一转染步骤中转染的ssRNA编码，产生的病毒的水平相比当只有单独一步转染步骤时达到的增加了～100倍。当使用BTV操作时，优选为病毒组分VP2、VP5、VP7及NS3的至少一种不被第一转染步骤中转染的ssRNA编码。优选地，病毒组分VP2、VP5、VP7及NS3的全部在第一转染步骤中被省略(omit)。
在第一及第二转染步骤之间，优选有一段时间间隔，以使有充足时间以组装病毒衣壳的内层。优选地，在第一和第二转染步骤之间为至少6小时，更优选地12小时以及最优选地18小时。
所述细胞补充必需病毒基因的功能。这意味着细胞已经被改性使得其含有灭活的必需基因的备份。结果，必需基因产生的蛋白质由细胞的mRNA表达，而不是由病毒的ssRNA表达，因此该基因的功能由细胞补充。这保证了所有对病毒复制而言必要的关键的蛋白均存在于细胞内。因此，疫苗病毒株可以自由地在细胞内复制。然而，若疫苗病毒株感染非该补充细胞(complementing cell)的细胞，必需基因的蛋白质产物将不出现，所以疫苗病毒株将不能重复复制。所述疫苗病毒株将经历单复制周期，例如，在被接种的宿主中。当多于一个必需基因的功能被破坏时，细胞补充每个必需病毒基因的功能。
优选地，制造疫苗病毒株的方法还包括将疫苗病毒株从细胞中分离。这可以通过任意合适的方式完成。这些方法为本领域技术人员熟知。例如，疫苗病毒株可从病毒斑中分离。
本发明同时提供了分离的病毒ssRNA，该ssRNA源于作为呼肠弧病毒家族成员的病毒的基因组，其中所述ssRNA包含破坏必需基因功能的突变，及其中所述病毒ssRNA适用于前述的转染细胞的方法中。
本发明进一步提供了上述方法所制备的疫苗病毒株。
本发明也提供了表达呼肠弧病毒科病毒的必需基因的细胞，其使得来自本发明ssRNA的疫苗病毒株可以复制。
本发明提供由本发明的ssRNA感染的本发明的细胞。
本发明还提供本发明的疫苗病毒株在治疗中的用途。
本发明还提供了本发明的分离的病毒ssRNA在治疗中的用途。
本发明还提供了本发明的疫苗病毒株在给动物接种抵抗呼肠弧病毒科病毒中的用途。
本发明同时提供了本发明分离的病毒ssRNA在给动物接种抵抗呼肠弧病毒科病毒中的用途。
本发明同时提供了给动物接种抵抗呼肠弧病毒科病毒的方法，包括将有效量的本发明的疫苗病毒株递送给动物。
本发明同时提供了给动物接种抵抗呼肠弧病毒科病毒的方法，包括将有效量的本发明的分离的病毒ssRNA递送给动物。
由于来自呼肠弧病毒科病毒的分离的病毒ssRNA是感染性的，可以使用分离的病毒ssRNA自身用于给动物接种。所述ssRNA可以任何合适的方式被引入动物的一个或多个细胞，在细胞中该ssRNA会被该细胞或多个细胞转录。这将产生病毒蛋白，并可以导致病毒颗粒的生成。然而，由于病毒中的ssRNA中必需基因的功能被破坏，病毒ssRNA将不能产生完全功能的病毒颗粒。最多，该病毒将能够完成一个复制周期，取决于所突变的必需基因的功能。
当进行接种时，要接种的动物将依据呼肠弧病毒科病毒的特性及其所感染的特定的动物而变化。当病毒为AHSV时，所述动物选自马、骡、驴或斑马。当病毒为EDHV时，所述动物选自鹿、家牛或绵羊。当病毒为BTV时，所述动物选自家牛、绵羊、山羊、水牛、鹿、单峰骆驼及羚羊。
本发明还提供含有本发明的疫苗病毒株与药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂的药物组合物。
本发明还提供了含有本发明的分离的病毒ssRNA与药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂的药物组合物。
药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂为本领域技术人员所熟知。例如，可使用的药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂包括但不限于离子交换剂，铝土，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白例如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如精蛋白硫酸盐，磷酸二氢钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶体硅，三硅酸镁，聚乙酰吡咯烷酮，基于纤维素的物质，羟甲基化纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚丙烯嵌段聚合物，聚乙烯醇及羊毛脂。
本发明的疫苗病毒株、分离的病毒ssRNA或药物组合物可以经口服、非肠道或吸入给药。优选地，疫苗病毒株、分离的病毒ssRNA或药物组合物通过注射给药。本发明的所述疫苗病毒株、分离的病毒ssRNA或药物组合物可与任何常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂共同制剂。此处使用的术语非肠道包括皮下、皮内、经静脉、经肌肉、关节内、滑液内、胸骨内、鞘膜内、病灶内及颅骨内注射或注入技术。
疫苗病毒株、分离病毒ssRNA或药物组合物可以为可注射制剂的形式，例如，为可注射水质或油质的悬液剂。该悬液剂可根据本领域已知技术使用合适的分散剂或增湿剂(例如，如吐温80)以及悬浮剂而制剂。所述可注射制剂也可以为无毒的非肠道-可接受稀释剂或溶剂中的可注射溶液剂或悬液剂，例如在1，3-丁二醇中的溶液剂。可接受的可以采用的赋形剂和溶剂为甘露醇、水、林格液及等压氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮媒介。为了这种目的，任何温和的不挥发性油都可使用，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物在可注射制剂的制备中是有用的，同样的天然的药学上可接受的油是有用的，例如橄榄油或蓖麻油，尤其以其聚氧乙烯化的形式。这些油溶液剂或悬液剂还可以包含长链醇稀释剂或分散剂，或瑞士药典(Pharmacopoea Helvetica)中描述的类似的醇。
所述疫苗病毒株、分离的病毒ssRNA或药物组合物可以以任何口服可接受的剂型口服给药，包括而不限于胶囊、片剂、以及水悬液剂和溶液剂。在口服用片剂的情况中，通常使用的载体包括乳糖及玉米淀粉。润滑剂，如硬脂酸镁，也典型地加入。对于以胶囊形式的口服给药而言，有用的稀释剂包括乳糖及干燥的玉米淀粉。当口服给药水悬液剂时，所述活性组分与乳化剂及悬浮剂组合。如果想要，某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂可以被加入。
递送到动物的疫苗病毒株的量可使用标准技术确定；然而，通常地，所递送的量应在10,000到1,000,000,000感染单位/ml范围内。
本发明还提供试剂盒，其包含上述方法中的分离的ssRNA及补充ssRNA中被突变的必需基因的细胞。
本发明还提供确定作为呼肠弧病毒家族成员的病毒中必需基因的筛选方法，该方法包括：
在呼肠弧病毒科病毒中引入突变，以破坏基因的功能；
使用来自病毒基因组并含有突变的病毒ssRNA转染细胞；和
在合适的条件下培养该转染细胞，
其中如果培养该转染细胞后产生的病毒为致病性的，所述病毒基因非必需基因。
本发明还提供制造作为呼肠弧病毒家族成员的病毒的改良病毒株的制造方法，所述方法包括：
向呼肠弧病毒科病毒中引入修饰；
向细胞中转染来自所述病毒基因组并包含该修饰的病毒单链RNA(ssRNA)；以及
在合适的条件下培养该转染的细胞，以导致改良病毒株的生成，
其中所述细胞使得所述改良病毒株在细胞内复制。
就疫苗病毒株的制备方法而言，制备改良病毒株的方法如前定义。然而，所述病毒株可以任意方式修饰。例如，所述病毒株可通过向基因组中加入一个或多个基因、从基因组中删除一个或多个基因、改变基因组内的控制序列等来修饰。进一步地，只要必需基因的功能未被破坏，任何合适的细胞都可用于此修饰的病毒的制备。
如前文所指出的，优选地，转染细胞的步骤含有两个或多个转染步骤，其中：
(1)第一转染步骤包含使用ssRNA转染细胞，该ssRNA至少编码组装病毒衣壳内层所需的组分；以及
(2)第二转染步骤包含使用ssRNA转染细胞，该ssRNA为病毒基因组的转录产物，并也含有所述修饰，并因此编码病毒组装所需的全部组分。
实施该2步转染的优选特征如前定义。
优选地，制备改良病毒株的方法进一步包含从细胞中分离所述病毒株。
本发明还提供了来自病毒基因组的分离的病毒ssRBA，该病毒为呼肠弧病毒科家族成员，其中所述ssRNA包含修饰，以及其中所述病毒ssRNA适用于前述的转染细胞的方法。
本发明进一步提供由上述方法制备的改良病毒株。
本发明也提供本发明的改良病毒株在治疗中的用途。
本发明也提供本发明的分离的修饰的病毒ssRNA在治疗中的用途。
本发明也提供包含本发明所述改良病毒株与药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂的药物组合物。
本发明还提供包含本发明的所述分离的修饰病毒ssRNA与药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂的药物组合物。
在此详细描述本发明，以实施例的形式，参考图，其中：
图1表示自共转染的BSR细胞回收的重配株(assortant)子代基因组，该BSR细胞用来自BTV两种血清型的源于核的转录产物共转染。基因组dsRNA跑9％非变性聚丙烯酰胺凝胶。(A)来自被拯救的BTV的dsRNA，BTV得自用共转录的BTV-1及BTV-9转录产物共转染的BSR细胞。道1-3，为含有来自两种亲代转录制备品的基因组片段的病毒斑纯化病毒。箭头指示来自提供了最少数量片段的亲代的片段。指示了BTV-1 dsRNA及BTV-9dsRNA标准带。(B)来自拯救的BTV的dsRNA，BTV得自用制备后混合的BTV-1及BTV-9转录产物共转染BSR细胞。道1-2，为含有来自两种亲代转录制备品的基因组片段的病毒斑纯化病毒。箭头指示来自提供了最少片段的亲代的片段。指示了BTV-1 dsRNA及BTV-9 dsRNA标准带。
图2为T7 BTV质粒克隆的示意图。T7质粒包含位于T7启动子和BsmBI、BSaI或BpiI限制性酶位点中间的全长BTV基因组片段，所述BTV基因组片段确定了转录时BTV3’的末端序列。指出了BTV基因组片段的5’及3’末端的序列以及侧翼的序列。T7启动子(斜体)，保守的BTV基因组片段5’及3’末端序列(黑体)及BsmBI位点(下划线)。
图3表示包含来自质粒的BTV-10片段10的重配株子代基因组。(A)基因组dsRNA跑9％非变性聚丙烯酰胺凝胶，其提取自BTV，该BTV回收自用BTV-10片段10 T7转录产物和得自核的BTV-1转录产物共转染的BSR细胞。道1-5，为回收的得自噬菌病毒斑的病毒dsRNA。道1、2和5，为带有箭头指示移动较快的BTV-10片段10基因组片段的重配株。道3和4，为野生型BTV-1。指示了BTV-1 dsRNA及BTV-10 dsRNA标准道。(B-D)片段10 RT-PCR产物的序列图。来自全部病毒dsRNA的片段10靶序列通过RT-PCR，使用引物BTV10_S10_259F和BTV10_S10_611F扩增。扩增的靶序列采用BTV10_S10_259F测序。(B)BTV-10。(C)含有引入的BTV-10片段10的BTV-1。(D)BTV-1。
图4表示含有得自质粒的BTV-10片段10的重配株子代基因组，BTV-10片段10带有引入的标记突变。(A)跑9％非变性聚丙烯酰胺凝胶的来自病毒斑的基因组dsRNA，其含具有引入的HaeII位点的BTV-10片段10。道1-3，为来自三个病毒斑纯化重配株的病毒dsRNA，重配株含有迁移较快的BTV-10片段10。指示了BTV-1 dsRNA及BTV-10 dsRNA标准道。(B)片段10的RT-PCR产物的HaeII消化。HaeII消化的RT-PCR产物，使用片段10引物BTV10_S10_259F及BTV10_S10_611R，从基因组的dsRNA扩增，在2％琼脂糖凝胶上分离。U＝未消化的RT-PCR产物，D＝HaeII消化的RT-PCR产物。道1，无模板，道2，BTV-10，道3，引入BTV-10片段10的重配株，道4，引入带有含HaeII位点的BTV-10片段10的重配株，道5，BTV-1。M＝StyI-消化的噬菌体λDNA标准物，大小以bp指示。RT-PCR产物及消化片段的大小在左侧以bp标示。(C与D)片段10RT-PCR产物的序列图。来自全部病毒dsRNA的片段10靶点序列使用引物BTV10_S10_238F及BTV10_S10_654R，通过RT-PCR扩增。扩增的靶序列使用BTV10_S10_238F测序。(C)引入BTV-10片段10的重配株。(D)引入了带有含HaeII位点的BTV-10片段10的重配株。箭头指示引入的点突变。
图5表示含有得自质粒的BTV-10片段2和5的双重重配株子代基因组。(A)来自BTV的基因组dsRNA，BTV回收自用BTV-10片段5T7转录产物、BTV-10片段2T7转录产物以及得自核的BTV-1转录产物共转染的BSR细胞。来自子代病毒斑的基因组dsRNA跑9％非变性聚丙烯酰胺凝胶。道1-3，为来自三种病毒噬菌斑纯化的重配株的病毒dsRNA。箭头指示迁移较慢的BTV-10片段2及片段5。BTV-1 dsRNA及BTV-10 dsRNA标记标准物条带被指出。(B和C)片段2及片段5RT-PCR产物的限制性酶切分析。片段2及片段5的靶区域使用RT-PCR从基因组dsRNA扩增，用对BTV-10片段特异的限制性酶消化并用1.5％琼脂糖凝胶分离。(B)片段2 RT-PCR产物的SacI消化。SacI对血清型10的片段2具有特异性，在靶序列中有两个位点。由从基因组dsRNA使用片段2引物BTV10_L2_727F及BTV10_L2_1523R扩增RT-PCR产物。U＝未消化RT-PCR产物，D＝SacI消化的RT-PCR产物。注意引物对不扩增BTV-1片段2，这是由于此片段在不同血清型之间的低同源性。道1为BTV-1，道2，为BTV10，道3，为带有BTV-10片段2及片段5导入的重配株。StyI-消化的噬菌体λDNA标记物大小以bp标于左侧。RT-PCR产物及消化片段的大小以bp标于右侧。(C)片段5RT-PCR产物的DraI消化。DraI具有对血清型10片段5的特异性，靶序列中存在两个位点。使用片段5引物BTV10_M5_724F及BTV10_M5_1590R自基因组dsRNA扩增RT-PCR产物。U＝未消化的RT-PCR产物，D＝DraI消化的RT-PCR产物。RT-PCR反应中的模板为如B图所列出的。RT-PCR产物及消化片段的的大小以bp列于右侧。
图6显示BTV-1基因组片段的T7转录产物。得自限制性内切酶消化的克隆的BTV-1 T7转录产物的变性1％琼脂糖凝胶电泳。M＝1μg ssRNA标准物(Promega)，其大小以nt表示。(A)道1-片段1，道2-片段3，道3-片段5，道4-片段7，道5-片段9。(B)道1-片段2，道2-片段4，道3-片段6，道4-片段8，道5-片段10。
图7显示通过转染以十个T7转录产物的感染性BTV的回收。(A)覆盖以琼脂糖的转染的BSR单层。孔1，为BSR转染以4μg BTV-1 T7转录产物，孔2，为未转染的BSR。转染后5天，单层被固定并以结晶紫染色。(B)提取自BTV的基因组dsRNA跑9％非变性聚丙烯酰胺凝胶，所述BTV回收自A图所描述的BSR单层转染。道1，为BTV-1储备病毒，道2及3，为来自得自转染以T7转录产物的不同病毒斑的BTV-1。
图8显示含有采用十种T7转录产物的标记突变的感染性BTV的回收。(A)覆盖以琼脂糖的转染的BSR单层。孔1，为转染以3μg BTV-1T7转录产物的BSR，所述转录产物包括带有导入的BglII位点的片段8转录产物，孔2，为未转染的BSR。在转染后5天，单层被固定并以结晶紫染色。(B)基因组的dsRNA跑9％非变性聚丙烯酰胺凝胶，所述dsRNA提取自BTV，所述BTV回收自如A图所描述的BSR单层转染。道1，为BTV-1储存病毒，道2及3，为来自得自转染以T7转录产物的不同病毒斑的BTV-1。
图9显示BTV-1中引入的标记突变的检测，所述标记突变产生自十种T7转录产物。(A)片段8RT-PCR产物的BglII消化。BglII-消化的RT-PCR产物，使用片段8引物NS2_Bam_T7_F及NS2_Bam_R扩增自基因组dsRNA，于1％琼脂糖凝胶上分离。U＝未消化的RT-PCR产物，D＝BglII消化的RT-PCR产物。道1，为野生型BTV-1，道2-6，为得自包括片段8BglII突变转录产物的转染的五个单独的病毒斑。道7，无模板。StyI-消化的噬菌体λDNA标记物大小以bp标于左侧。RT-PCR产物及消化片段的大小以bp标于右侧。(B)片段8 RT-PCR产物的序列图，所述产物来自包括片段8BglII突变转录产物的转染。来自病毒总dsRNA的片段8靶序列经RT-PCR使用图A中描述的引物扩增。所扩增的靶序列使用BTV1_S8_627R测序。箭头标出引入的点突变。
图10显示用于产生BTV1 delta VP6的pBTV1 S9delta克隆。(A)保留于pBTV1 S9delta克隆中的基因组片段9的互补核苷酸(nucleotide coordinate)。(B)pBTV1 S9delta含有修饰的BTV基因组片段9，该片段位于T7启动子及BsmBI限制性酶位点之间，其在转录时定义BTV 3’末端序列。(C)BTV基因组片段的5’及3’末端序列及侧翼的序列被标出：T7启动子(斜体)；保守的BTV基因组片段5’及3’末端序列(黑体)；及BsmBI位点(下划线的)。
图11显示BTV1 delta VP6在补充BSR VP6细胞系中产生CPE。单层在MOI为0.1时被感染，并于感染后48小时使用相差显微术记录外观。(A)感染BTV1 delta VP6的BSR VP6细胞。(B)感染野生型BTV-1的野生型BSR细胞。(C)Mock感染的BSR细胞。
图12显示BTV1 delta VP6在补充BSR VP6细胞系中产生病毒斑。病毒储藏液的十倍稀释液用于感染孔1到孔6中汇合的细胞单层。感染的单层覆盖以固态介质并于72小时后以结晶紫染色。(A)被BTV1 delta VP6感染的BSR VP6细胞。(B)被野生型BTV-1感染的野生型BSR细胞。
图13显示由更小的基因组片段取代基因组片段9的BTV1 delta VP6。(A)基因组dsRNA跑9％非变性聚丙烯酰胺凝胶。箭头标出存在于BTV1delta VP6中的新基因组片段。基因组片段数量标于右侧。(B)产生自基因组dsRNA的RT-PCR产物，所述dsRNA使用EcoT7_S9_F及EcoBsmB_S9_R引物得自所标出的来源，并在1％琼脂糖凝胶上分离。DNA标准物的大小以碱基对标出。
图14表示BTV1 delta VP6在感染的BSR或C6/36细胞中不产生感染性病原体子代。感染性子代的产生在72小时的间隔通过在补充BSR VP6细胞系上的病毒斑化验分析。BTV1 delta VP6及野生型BTV-1在BSR细胞(A)或者C6/36细胞(B)上的复制的图。
图15表示BTV1 delta VP6在非补充BSR细胞中表达病毒蛋白质。BSR细胞在MOI为3时被感染，并于感染后标出的小时数后收集。NS2表达由SDS PAGE检测，随后以NS-2特异性的抗血清进行免疫印迹。(A)使用BTV1 delta VP6感染的BSR，(B)使用野生型BTV-1感染的BSR。预染的蛋白分子量标准物的大小以kDa标出。
图16显示BTV1 S10 GFP具有更大的基因组片段以取代S10片段。(A)基因组dsRNA跑11％非变性聚丙烯酰胺凝胶。箭头标出在BTV1 S10GFP中的新的基因组片段。基因组片段数量标于右侧。(B)产生自基因组dsRNA的RT-PCR产物，所述dsRNA得自所标出的来源，所述产物在1％琼脂糖凝胶上分离。DNA标准物的大小以碱基对标出。
图17显示来自BTV基因组的标记抗原的表达。C6/36被BTV1 S10GFP感染(A及B)，或模拟感染(C及D)。感染后5天，所述细胞使用4％ w/v多聚甲醛固定，其外观使用相差记录(A及C)或紫外灯(B及D)下记录。
图18显示两次转染增加病毒自核来源的转录产物的回收。汇合的BSR细胞单层以200ng病毒的ssRNA转染一次(孔1)或两次(孔2)，所述ssRNA自BTV核合成。各孔覆盖以于此所描述的琼脂糖。
图19显示两次转染增加病毒自质粒来源的转录产物的回收。汇合的BSR细胞单层以2μg自质粒得到的T7转录产物转染一次(孔1)或两次(孔2)。各孔覆盖以于此所描述的琼脂糖。
图20显示基因组片段2、5、7及10从第一次转染的省略增加病毒自质粒得到的转录产物的回收。汇合的BSR细胞单层在第一次转染中以十种T7转录产物的完整补充转染(孔1)或一组缺少片段2、5、7及10的T7转录产物转染(孔2)。两个孔在第二次转染中均转染以十种T7转录产物的完整补充。两次转染中均使用100ng的每种T7转录产物。
实施例
疫苗设计的新手段使用发明人开发的新型反向遗传学方法。其建立在发现蓝舌病毒转录产物通过转染是感染性的[1]，该方法并允许靶片段被病毒基因的克隆版本替换。该方法使用新的手段，所述手段为使用和BTV片段的噬菌体T7体外转录产物相混合的BTV转录产物转染病毒容许的细胞，所述BTV片段得自克隆的基因。含有取代基因组片段的病毒通过筛选病毒斑分离。此反向遗传学的新方法与现存的用于呼肠弧病毒家族的反向遗传学技术不同：1)Roner等人的辅助病毒依赖的方法[3]成功地应用于哺乳动物正呼肠弧病毒。病毒转录产物及病毒dsRNA混合以T7体外转录产物并使用辅助病毒感染拯救；2)Komoto等人的辅助病毒依赖的方法[2]用于改变轮状病毒的衣壳蛋白。T7转录产物使用痘苗T7RNA聚合酶系统在细胞中产生，并使用辅助病毒拯救；以及3)Kobayashi等人的基于质粒的方法[4]用于在哺乳动物正呼肠弧病毒基因中产生突变。所有的病毒基因组片段都使用疫苗T7 RNA聚合酶系统在细胞中产生。
该新方法使用反向遗传学来产生疫苗株，所述疫苗株含有免疫相关的来自感兴趣的血清型的蓝舌蛋白(VP2及VP5)，对其他病毒蛋白具有广泛背景。这一点与一种或多种必需病毒基因的灭活结合，所述必需病毒基因通过反向遗传学经大规模突变，其由补充细胞系提供。产生的病毒只能在补充细胞系中生长，及在其他细胞中只能进行一轮复制，其他细胞例如所接种的动物的细胞。用于通过反向遗传学灭活的一种或多种BTV酶蛋白质(聚合酶、螺旋酶及加帽蛋白)或可选地BTV非结构病毒蛋白的靶向将允许使用DIVA策略用于监视的目的。所述新方法也消除了under-attenuation的难题，并减少了与减低毒性的新株相关的从确定新的血清型到生产疫苗株的时间延迟。通过靶向的病毒基因中广泛突变的使用，毒性恢复的可能性被极大减少。通过疫苗株仅在接种的动物里经历一个复制周期这一事实，与野生型病毒重组产生传染性病毒的可能性也被大大减少。该新方法也避免了确认与灭活疫苗关联的各批次疫苗的灭活的需要。
本技术已用于产生BTV的DISC(有缺陷的感染性单周期)疫苗，其中必需基因(VP6)通过反向遗传学系统控制，其功能通过大的删除被破坏。所述VP6删除突变体(BTV1 delta VP6)使用反向遗传学技术以及补充细胞系回收，所述细胞系提供顺式作用元件VP6蛋白。BTV1 delta VP6生长性质的表征显示其具有BTV DISC疫苗的必要特征，即i)病毒蛋白在非补充哺乳动物细胞中的表达；ii)在非补充哺乳动物或昆虫细胞系中无可检测的感染性病毒产生；及iii)在补充VP6细胞系中健全复制。此外，产生病毒，表达外来蛋白/多肽的能力已经使用NS3补充细胞系及BTV证实，所述BTV具有插入到NS3基因中心的增强的绿色荧光蛋白(eGFP)。这使得含有免疫标记物的疫苗株的产生，所述标记物在接种的动物中可被检测，以区分接种的动物及感染的动物，即DIVA概念(鉴别感染的和接种的动物)。
材料与方法
细胞系及病毒。BSR细胞(BHK-21的克隆)在补充了5％v/v胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改性Eagle氏培养基(DMEM)中，35℃下在5％CO2中培养。
BTV储藏液通过在感染倍率(MOI)为0.1的时候，感染BSR细胞并在感染后3-4天时收获培养基产生。病毒储藏液于4℃下储存。
蓝舌病毒核的纯化。BSR培养物在MOI为0.02-0.1时被BTV感染。具有转录活性的BTV-1核如前所述纯化并于4℃储存[1]。
蓝舌病毒mRNA的体外合成与纯化。BTV核在40μg/ml，30℃下在BTV核转录缓冲液(100mM Tris HCl pH8.0，4mM ATP，2mM GTP，2mMCTP，2mM UTP，500μM S-腺苷蛋氨酸，6mM DTT，9mM MgCl2，0.5U/μlRNasin
Figure BPA00001186392800151
Plus[Promega])中温育5-6小时。
BTV核产生的mRNA以前述的方法纯化并于-80℃储存[1]。
BTV-1基因组片段的RT-PCR扩增。各个BTV-1基因组片段的cDNA拷贝以序列独立的方式使用FLAC方法从病毒dsRNA扩增[18]。大体上，发夹锚状引物如所述地连接到病毒dsRNA上，随后从凝胶纯化的基因组片段进行cDNA合成，所述合成使用10U/μl SuperscriptTM III(Invitrogen)，在55℃下持续1小时。PCR扩增使用5′磷酸化的FLAC 2引物(5′GAGTTAATTAAGCGGCCGCAGTTTAGAATCCTCAGAGGTC3′)和KOD热启动DNA聚合酶(Novagen)进行。PacI及NotI位点为黑体。
用于合成BTV转录产物的T7质粒克隆。为BTV-10基因组片段10(pNS3BsmBI)、片段5(pVP5BsmBI)及片段2(pVP2BsmBI)，以及BTV-1基因组的所有10个片段构建了cDNA质粒克隆。也建立了含有引入的HaeII位点(pNS3Hae)的BTV-10片段10克隆的突变版本及含有引入的BglII位点(pNS3Hae)的BTV-1片段8克隆的突变版本。各个质粒克隆的功能盒含有T7启动子及BsmBI，BsaI或BpiH位点，BTV基因组片段位于这些元件之间。在各个克隆中的BTV基因组片段与其他两个序列元件相对定位，以使质粒被BsmBI、BsaI或BpiH消化产生的T7转录产物按预测具有与相应BTV基因组片段的mRNA链精确相同的序列(图2)
从cDNA质粒克隆合成BTV转录产物。T7质粒克隆以BsmBI、BsaI或BpiI消化，然后以苯酚/氯仿萃取一次，以氯仿萃取一次。各个消化的质粒使用异丙醇在0.15M乙酸钠的存在下沉淀。DNA沉淀物以70％(v/v)乙醇洗涤两次，并以10mM Tris HCl pH8.0溶至1μg/μl。使用mMESSAGEmMACHINE
Figure BPA00001186392800152
T7 ULTRA试剂盒(Ambion)，使用4∶1比例的抗逆封端类似物(anti-reverse cap analogue)比rGTP，由消化的T7质粒克隆产生带有5’封端类似物的转录产物。T7 BTV转录产物以苯酚/氯仿萃取一次，随后以氯仿萃取一次。未被加入的rNTP通过尺寸分馏法，使用MicrospinTMG-25柱(GE Healthcare)，按照制造商说明除去。所述T7 BTV转录产物以等体积的异丙醇，在0.15M乙酸钠的存在下沉淀。RNA沉淀物以70％(v/v)乙醇洗涤两次，并溶于无菌的焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水，并于-80℃储存。
变性琼脂糖凝胶电泳。纯化的BTV ssRNA在MOPS(吗啡啉丙磺酸)电泳缓冲液中的1％琼脂糖上，在甲醛存在下的以标准技术进行电泳分析[19]。
转染培养的细胞以回收带有一个或两个得自cDNA的基因组片段的蓝舌病毒。得自转录核的BTV mRNA与一个或多个T7 BTV转录产物在Opti-MEM
Figure BPA00001186392800161
I中，0.1U/μl RNasin
Figure BPA00001186392800162
Plus(Promega)存在下混合。该RNA混合物于20℃温育30分钟，随后与LipofectamineTM 2000试剂(Invitrogen)[见下文]混合。使用混合以0.75μg各个T7BTV转录产物的1.5μg BTVmRNA，使用LipofectamineTM 2000试剂，按照制造商说明转染6孔板中的汇合的BSR单层。转染后四小时，培养基以由最小必须培养基(MEM)，2％FBS，1.5％w/v琼脂糖类型VII(Sigma)组成的6mL覆盖物替换。试样于35℃，5％CO2下温育72-96小时以允许病毒斑的出现。
转染培养的细胞以从得自cDNA的基因组片段完全回收蓝舌病毒。如前所述混合300-400ng的各种T7BTV转录产物，以产生一套完整的T7BTV转录产物基因组。BSR单层的转染如前所述执行。
自得自转染的BTV病毒斑制备dsRNA。取各个病毒斑，放入500μl 5％FBS的Dulbecco氏修饰Eagle氏培养基(DMEM)中，200μl用于感染1.5×106 BSR。感染的细胞于35℃，5％CO2中温育72-96小时，以使得BTV扩增。如前所述从感染的BSR细胞纯化病毒dsRNA[1]。
从得自转染的BTV病毒斑筛选含有引入的基因组片段的重配株。在引入的基因组片段以不同的速率在聚丙烯酰胺凝胶上迁移的情况下，筛选通过dsRNA在Tris/甘氨酸(pH8.3)中的9％聚丙烯酰胺凝胶上的电泳完成。凝胶使用溴化乙锭后染30分钟。当筛选不可能基于迁移速率进行时，RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)，随后限制性内切酶消化被用于区分重配株与野生型BTV。cDNA从100ng热变性的病毒dsRNA，使用SuperscriptTM III(Invitrogen)，侧翼靶区域的正向及反向引物，55℃下合成1小时。所述靶区域使用Taq DNA聚合酶，及相同的正向及反向引物被PCR扩增，并以限制性内切酶消化。产物在Tris-硼酸盐-EDTA缓冲液中的含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶上通过电泳分离。RT-PCR产物的序列分析使用染料终止子，在ABI 3730 XL测序机上，使用MWG Biotech的数值显示服务完成[20]。
pNS3Hae及pBTV1S8Bgl的构建。pNS3BsmBI被改变以含有一额外的HaeII位点，所述改变通过使用Weiner等人的方法[17]，使用引物S10_mt_Hae_409F及S10_mt_Hae_409R定点突变进行。类似地，野生型BTV-1 S8克隆被改变以引入BglII位点，所述改变通过使用引物5′BTV1_S8_BglII及3′BTV1_S8_BglII进行。通过HaeII或BglII消化，筛选克隆中的引入位点的存在，以及使用MWG Biotech的数值显示服务测序对所述表达盒进行测序以确定克隆不含有随机突变。
引物。用于从pNS3BsmBI产生pNS3Hae的诱导突变引物：
S10_mt_Hae_409F
(5′CTACTAGTGGCTGCTGTGGTAGCGCTGCTGACATCAGTTTG3′)及
S10_mt_Hae_409R
(5′CAAACTGATGTCAGCAGCGCTACCACAGCAGCCACTAGTAG3′)。
用于从野生型BTV-I S8克隆产生pBTV1S8Bgl的诱导突变引物：
5′BTV1_S8_BglII
(5′GATTTACCAGGTGTGATGAGATCTAACTACGATGTTCGTGAAC3′)及
3′BTV1_S8_BglII
(5′CGAACATCGTAGTTAGATCTCATCACACCTGGTAAATCGGGC3′)。诱导突变碱基被下划线，限制性位点为粗体。
BTV-10片段10的RT-PCR扩增及测序的引物：
BTV10_S10_238F    (5′GGAGAAGGCTGCATTCGCATCG3′)，
BTV10_S10_654R
(5′CTCATCCTCACTGCGTCATTATATGATTGTTTTTTCATCACTTC3′)，
BTV10_S10_259F    (5′GGAGAAGGCTGCATTCGCATCG3′)，
BTV10_S10_611R               (5′
CTCATCCTCACTGCGTCATTATATGATTGTTTTTTCATCACTTC3′)。
从BTV-10片段5RT-PCR  扩增的引物：BTV10_M5_724F(5′ATGACAGCAGACGTGCTAGAGGCGGCATC3′)及BTV10_M5_1590R(5′GCGTTCAAGCATTTCGTAAGAAGAG3′)。
从BTV-10片段2RT-PCR扩增的引物：BTV10_L2_727F(5′CCGTACGAACGATTTATATCCAGC3′)及BTV10_L2_1523R
(5′TACTAATTCAGAACGCGCGCC3′)
从BTV-1片段8RT-PCR扩增的引物：NS2_Bam_T7_F(5′CGGGATCCTAATACGACTCACTATAGTTAAAAAATCCTTGAGTCA3′)及                                   NS2_Bam_R(5′CATGGGATCCGGACCGTCTCCGTAAGTGTAAAATCCCC3′)。
BTV-1片段8测序的引物：BTV1_S8_627R(5′CAGCTTCTCCAATCTGCTGG3′)。
表达BTV VP6或NS3蛋白的稳定细胞系的构建。BTV-10 V6及BTV-1NS3的编码区域以PCR扩增，并克隆入嘌呤霉素可选择的质粒pCAGGS/MCS-PM1[29]，以分别获得pCAGG/VP6及pCAGG/NS3。BSR细胞用LipofectamineTM 2000试剂(Invitrogen)转染以pCAGG/VP6或pCAGG/NS3，转染后48小时胰蛋白酶化并以浓度为7.5μg/ml的嘌呤霉素选择。培养分离的抗性克隆，VP6或NS3蛋白的表达使用适当的抗体通过免疫印记检验。所述VP6及NS3表达系命名为BSR VP6及BSR NS3。
使用补充BSR VP6或BSR NS3细胞系回收BTV。构建了BTV-1片段9克隆，所述克隆具有框架外核苷酸301-743的缺失(1049nt外)，即pBTV1 S9delta(图10)。在转染中使用BSR VP6细胞系取代野生型BSR细胞回收了相应的突变病毒，BTV1 delta VP6。类似地，构建了带有增强绿色荧光蛋白(eGFP)插入于NS3基因中心的BTV-1片段10克隆，即pBTV1S10GFP。在转染期间使用BSR NS3细胞系回收了相应的GFP表达病毒，BTV1 S10GFP。
BTV1 delta VP6及BTV1 S10GFP的传代。BTV1 delta VP6在BSRVP6细胞系上传代，同时通过病毒斑化验测定的滴度也使用BSR VP6细胞系。BTV1 S10GFP在BSR NS3细胞系上传代，同时通过病毒斑化验测定的滴度也使用BSR NS3细胞系。
BTV1 delta VP6的多步生长曲线。BSR或C6/36细胞在MOI为0.5时在12孔板上，分别地在250μl DMEM或L15培养基中转染。孔在1mLPBS中洗涤三次，并于标准生长条件下，1mL生长培养基中温育。在不同时间间隔，孔被收获，同时总病毒通过病毒斑化验滴定，在BSR VP6补充细胞系上测定。
引物。
EcoT7_S9_F
(5′CTAGGAATTCTAATACGACTCACTATAGTTAAAAAATCGATAGGCTGC3′)。
EcoBsmB_S9_R
(5′CAGTGAATTCGTCTCCGTAAGTGTAAAATCGCCCTACG3′)
BTV1S10T7EcoRI
(51CGGAATTCTAATACGACTCACTATAGTTAAAGGTCGTGCCATGCTA3′)
NS3BsmBi rev(5′GTAAGTGTGTAGTATCGCGCACCS′)
结果：
通过共转染以来自两种血清型的BTV mRNA的基因组片段的重组株。从来自核的转录产物通过允许细胞的转染而回收有传染性的BTV已经被证明[1]。为了产生BTV的反向遗传学系统，从一个BTV血清型到另一个的基因组片段导入被研究作为中间步骤，其先于源于cDNA的基因组片段的导入。如前所述，感染性的核产生的转录产物用从BTV-1及BTV-9制备[1]。来自该两个血清型的转录产物要么在同一转录反应中同时地产生或被分别制备而后混合。汇合的BSR单层被转染以转录混合物，同时病毒被从所产生的病毒斑中扩增。dsRNA被从每个扩增的病毒斑中纯化，同时基因组片段的来源通过非变性PAGE凝胶上的电泳测定，其使一些来自不同分离物的基因组片段可被辨别。当使用来自BTV-1及BTV-9的共合成转录产物时，子代病毒被产生，其具有来自两个亲代来源的转录产物的基因组片段[重配株](图1A)。道1含有在片段的遗传学背景中具有BTV片段1以及片段4的重配株，其如BTV-9迁移。类似地，道2含有在BTV-1遗传学背景中的BTV-9片段3的重配株，以及道3含有在BTV-1遗传学背景中具有BTV-9片段1的重配株。当BTV-1及BTV-9的转录产物在转染之前被分别地制备并混合时，重配株子代病毒也产生，这标志着转录产物的共合成对于重组发生不是必须的(图1B)。这些数据证实了对于将不同来源的基因组片段导入BTV基因组中，以病毒转录产物的混合物共转染是一个可行的策略。
得自cDNA克隆的BTV片段导入BTV-1基因组。基因组片段用得自cDNA克隆的T7转录产物的靶向替换随后作为克隆序列导入BTV基因组的模型被研究。选择将BTV-10片段10T7转录产物导入BTV-1基因组，以使得进行病毒斑的快速筛选，其基于BTV-10片段10在PAGE凝胶上的迁移速度比BTV-1快。BTV-10片段10的T7转录产物从pNS3BsmBI产生，其具有T7启动子，以产生正确的5’末端，以及BsmBI位点，以产生正确的3’末端序列(图2)。从转录核心产生的BTV-1转录产物与BTV-10片段10的T7转录产物混合，并用于转染汇合的BSR单层。T7转录产物与对应的核产生的mRNA的摩尔比为5∶1被发现是最好的并用于所有实验中，提高T7转录产物对BTV-1转录产物的比例，降低了回收的病毒斑的总数(数据未显示)。典型地，在六孔板中使用1.5μg得自核的转录产物及0.75μg T7转录产物转染后，从每个孔中回收～50个病毒斑。从这些病毒斑中扩增病毒，并纯化dsRNA。基因组片段10的来源一开始用dsRNA在PAGE凝胶上的电泳测定。以足够高的频率(15-80％)获得了包含来自BTV-10的更快迁移的片段10的dsRNA基因组型，使病毒斑的筛选是可实施的选择(图3A)。片段10的一致性使用RT-PCR，随后通过对显示出类型1和类型10之间差异的区域进行测序来确认(图3B、C和D)。这些数据证实了自质粒得到的BTV-10片段10回收到活的BTV-1的基因组中。
当细胞被两种不同的株感染时，BTV天然地产生重组的子代基因组[21]。为了破坏两种病毒之间的天然重组成为片段10重配株的来源的可能性，含有引入的沉默HaeII位点(pNS3Hae)作为标记物的BTV-10片段10克隆通过pNS3BsmBI的定点突变产生。使用来自BTV-1核的mRNA及得自pNS3Hae的含有引入突变的BTV-10片段10T7转录产物的混合物转染BSR单层。含有此突变的BTV-10片段10序列的病毒回收最初通过其在PAGE凝胶上提高的迁移速率进行筛选(图4A)。HeaII位点向BTV基因组片段10的引入通过来自病毒斑纯化病毒的dsRNA的RT-PCR，随后用HaeII消化(图4B)，以及通过所述RT-PCR产物的测序确认(图4C和D)。通过测序全长RT-PCR产物，确定片段10与在pNS3Hae中编码的片段在其全部长度上都相同(数据未显示)。
来自cDNA克隆的两种BTV-10片段同时导入BTV-1基因组。为了估计同时改变两个基因组片段的可能性，研究了将来自BTV-10的编码外壳蛋白的片段(片段2和5)导入BTV-1基因组片段的背景中。这些基因组片段替换以另一血清型的片段，将使得该病毒的血清型被改变。得自BTV-10片段2及5的T7转录产物分别由pVP2BsmBI及pVP5BsmBI制备，并与来自BTV-1核的mRNA以每个T7转录产物与所相应的来自核的转录产物5∶1的比例混合。汇合的BSR细胞单层由该RNA混合物转染，从回收的病毒斑制备dsRNA。片段2和5的来源一开始由它们在PAGE凝胶上的迁移速率评估(图5A)。来自BTV-10的片段2及5都以高频率(20-80％)共同回收。所述片段的一致性由RT-PCR，随后限制性内切确定(图5B和C)。通过RT-PCR扩增及测序，片段2和片段5的全部序列被确定为BTV-10的序列(数据未显示)。未回收到只含有来自BTV-10的片段2或者只含有片段5的子代(三次独立实验中的19个病毒斑中的0个)，说明含有来自一个亲代的片段2的病毒和来自另一个亲代的片段5的病毒或者具有降低的生存能力，或者相比双重重配株以更低的频率产生。当来自BTV-10的片段2或片段5导入BTV-1被单独地尝试，并没有回收到重配株子代时，该现象进一步被支持(数据未显示)。
BTV完全从T7转录产物回收。尽管上述方法是可实施的反向遗传学系统，其使BTV基因组片段可以操作，从野生型病毒斑中筛选重配株病毒斑会阻碍缓慢生长的突变株的回收。理想的反向遗传学系统会允许完全来自T7转录产物的感染性病毒的组装。为了使每一个基因组片段产生活的克隆的可能性最大化，各个基因组片段的RT-PCR扩增与BTV-1的dsRNA，使用不依赖序列的为dsRNA模板开发的FLAC方法进行[18]。各个RT-PCR产物被克隆入pUC19[22]，各个克隆的全序列被与各个RT-PCR产物的全序列比较，以确定是否代表性的分子在每个情况下被克隆(数据未显示)。当编码变化或任何在所克隆的基因组片段末端上200nt之内的区别存在时，将可选的克隆测序。一旦获得全套的十个克隆，各个基因组片段被使用高保真KOD热启动DNA聚合酶(Novagen)进行PCR扩增，以在基因组片段上游直接引入T7启动子，及在下游直接引入限制性酶切位点(图2)。这些功能性盒也在pUC19中被克隆。当在1％非变性琼脂糖凝胶上分析时，确定了使用限制性消化的质粒克隆合成的T7转录产物具有所期待的大小(图6A和B)。
从限制性消化质粒制备的T7转录产物以按重量的均等的比例混合，并使用总计3-4μg，以转染汇合的BSR单层。转染的单层覆盖以琼脂糖，病毒斑在转染后3-6日出现(图7A)。从病毒斑扩增的dsDNA与BTV-1病毒保存株在PAGE凝胶上比较，并发现其是不可区别的，确认了BTV-1已经被回收(图7B)。为了进一步证实BTV可以得自T7转录产物，制备了BTV-1片段8的T7克隆的突变体，其含有引入的沉默的BglII位点，pBTV1S8Bgl。在转染了全套T7转录产物的转染中，并其中片段8 BglII标记转录产物替换了野生型S8转录产物，回收病毒斑(图8A)。得自扩增的病毒斑的dsDNA与BTV-1病毒保存株在PAGE凝胶上相比时，发现其是不可区别的(图8B)。通过转染BSR细胞扩增病毒斑，并通过用引物NS2_Bam_R及NS2_Bam_T7F通过RT-PCR扩增S8片段。所述RT-PCR产物的消化证实了已经引入了BglII位点(图9A)。所述RT-PCR产物使用BTV1_S8_627R引物测序，证实了标记序列的引入(图9B)。这些数据证实了从T7转录产物的全套基因组回收BTV，并用此系统引入可行的突变是可能的。
BTV1 delta VP6病毒的回收。为了产生DISC疫苗株，在野生型片段9的克隆中在必需蛋白VP6中进行了框架外大段删除，以产生pBTV1S9delta(图10)。体外合成的T7转录产物的全套基因组如前述制备，然而含有被删除的片段9转录产物，而不是野生型片段9转录产物。在转染阶段使用BSR VP6细胞系代替野生型BSR细胞，回收了相应的突变病毒株，BTV1 delta VP6。不可区分自BTV CPE的细胞病变效应(CPE)在转染后5天，在转染孔中可见，标志着回收到感染性病毒(数据未显示)。
BTV1 delta VP6在BSR VP6细胞系中复制。通过与野生型BTV-1在野生型BSR细胞中复制相比，确定BTV1 delta VP6病毒是否在BSR VP6细胞系中健壮地复制。通过用BTV1 delta VP6感染BSR VP6细胞系产生的CPE等价于当使用野生型BTV-1转染野生型BSR细胞所产生的CPE，标志着在BTV1 Delta VP6的复制中没有显而易见的缺陷(参见图11)。使用BSR VP6 cell line评估了BTV1 delta VP6形成病毒斑的潜能(参见图12)。所述BSR VP6被发现补充BTV1 delta VP6的生长，以至于产生正常外观的病毒斑，使BTV1 delta VP6可以正常滴定。采用BSR VP6细胞系，BTV delta VP6病毒可以生长到与野生型BTV-1可比的滴度(超过107感染单位/ml)。这些数据证实了BTV1 delta VP6病毒在补充BSR VP6细胞系中有效复制。
BTV delta VP6的基因组片段9的表征。BTV1 delta VP6在BSR VP6细胞系中繁殖，病毒双链RNA如前所述地提取及纯化。所述BTV1 delta VP6基因组缺少野生型S9片段并含有更小的基因组片段，对应于将野生型S9片段替换以删除的S9片段(图13A)。来自BTV1 delta VP6的S9片段通过RT-PCR，使用在S9片段末端退火的引物(EcoT7_S9_F及EcoBsmB_S9_R)进行扩增，产生期待的650nt的产物(图13B)，并使用相同的引物测序。扩增的基因片段的所看到的序列与pBTV1 S9delta中的序列相同(数据未显示)，证明所回收的病毒被正确地构建。
BTV1 delta VP6在非补充细胞系中的生长的表征。DISC疫苗株的重要特征是其应该不能在宿主有机体内完成复制周期。为了评估BTV1 deltaVP6是否是有瑕疵的，BTV有效地在其中复制的哺乳动物BSR细胞系(BHK-21亚克隆)以及昆虫细胞系C6/36，被用作哺乳动物及昆虫宿主的代表。两种细胞系使用BTV1 delta VP6感染，同时产生的全部病毒使用BSR VP6补充细胞系，经72小时由病毒斑化验监测。BTV1 delta VP6不在任一个细胞系中复制，但野生型BTV-1在两个细胞系中都显示出有效的复制(图14A及B)。该数据证实VP6基因的破坏导致了当VP6蛋白不由补充细胞系提供时，病毒不能复制。
BTV1 Delta VP6在非补全BSR细胞系中表达病毒蛋白。任意DISC疫苗必须在宿主中表达病毒蛋白，以诱导免疫响应。为了评估BTV1 deltaVP6是否能够表达蛋白质，使用野生型BSR细胞作为哺乳动物宿主的代表。非结构蛋白NS2的检测，被用做病毒蛋白表达的标记。在BTV1 deltaVP6病毒与野生型BTV-1的蛋白质表达的比较中，NS2蛋白的表达水平在BTV1 delta VP6感染的BSR及BTV-1感染的BSR中均随时间提高(图15)。来自BTV1 delta VP6病毒的蛋白质表达水平低于野生型BTV-1的蛋白质表达水平，这对于有缺陷的病毒是可以预知的。该数据证实了BTV1 deltaVP6病毒在非补充BSR细胞中表达病毒蛋白质。
标记抗原可被加入到BTV基因组中。从BTV基因组表达标记抗原/多肽的能力将使得可以产生适合DIVA的疫苗株(DIVA：鉴别感染的和接种的动物)。为了证实可以连同补充细胞系使用反向遗传学方法，制备了含有带eGFP的框架融合的NS3的克隆，pBTV1 S10GFP。如前所述制备了体外合成的T7转录产物完整基因组，但其含有所述的NS3-eGFP融合转录产物，而不含有野生型片段10转录产物。相应的突变病毒，BTV1S10GFP，在转染中使用BSR NS3补充细胞系，而不是用野生型BSR细胞，如前所述地被回收。当非补充C6/36细胞使用BTV1 S10GFP感染时，eGFP的表达由其在紫外线下的荧光确定(数据未显示)。
BTV1 S10GFP的基因组片段10的表征。BTV1 S10GFP的基因组缺少野生型S10片段，并含有更大的片段，对应于S10 GFP融合(图16A)。来自BTV1 S10GFP的所述S10片段使用在S10片段末端退火的引物(BTV1S 10T7 EcoRI及NS3BsmBirev)，由RT-PCR扩增，所期待的1446nt的产物被扩增(图16B)。对BTV1 S10GFP的RT-PCR产物测序，从而eGFP基因的存在被确认(参见图17)，证明了所回收的病毒被正确地构建。
从自质粒得到的转录产物的提高的病毒回收效率。
作出了增强从自质粒得到的T7转录产物的蓝舌病毒回收效率的两个变化。这些变化都是前述转染方法的变化。每个改进导致从自质粒得到的转录产物回收病毒的效率提高～10倍，共计导致病毒回收的～100倍的提高。
修改#1，双重转染
如前所述，每次使用整组十种来自质粒的转录产物对细胞转染两次(而不是一次)。所述转染相隔18小时进行，并导致病毒回收相对于采用单次转染～10倍的提高。使用双重转染方法的病毒回收的提高当使用制自BTV核的ssRNA时(图18)，及当使用整组十种cDNA克隆制得的T7转录产物时(图19)被观测到。
修改#2，基因组片段2、5、7和10从第一次转染的省略：
如修改#1所述，细胞被转染两次，然而编码基因组片段2、5、7和10的T7转录产物被从第一转染中省略。第二次转染使用整套的十种转录产物。所述转染间隔18小时进行，比使用前述的双重转染时导致病毒恢复～10倍的进一步增强(图20)。
讨论
所描述的两种方法代表BTV的可选的反向遗传学系统，使用真实的病毒转录产物及T7转录产物的混合物，或T7转录产物的整套基因组。其拓展了当用于转染许可的细胞时，BTV转录产物是感染性的这一发现[1]，并证实了在体外合成的在5’末端有帽类似物的T7转录产物可以从功能上代替由核颗粒合成的转录产物。
回收到子代病毒，盖子代病毒带有源自两个独立的来自核mRNA制备品的基因组片段，这建立了通过与真实的病毒转录产物混合向BTV基因组中引入外来转录产物的原理(图1B)。在转录后混合mRNA制备品的观点在制备重配株中是有效的，所述重配株被允许将得自质粒的转录产物与得自核的mRNA一起使用，以向BTV基因组中引入靶向的突变的可能性。研究了BTV-10片段10转录产物向BTV-1基因组中的引入，以确定将自质粒得到的转录产物引入到感染性的BTV中是否可以容易地实现。该模型系统显示，使用过量的T7转录产物以一定频率产生了重配株病毒斑，该频率使得个别病毒斑的筛选是实用的(15-80％)。病毒斑最初通过片段10dsRNA在PAGE凝胶上迁移速率的的筛选(图3)被通过RT-PCR产物的测序证实(图3)。T7转录产物及真实的病毒转录产物间的高效重组意味着可选的标记物途径不是必须的。HaeII位点标记物突变引入BTV的片段10，证实了重配株得自体外合成的片段10T7转录产物(图4)。含有HaeII的片段10以类似于野生型BTV-10片段10的效率回收。两种片段10重配株病毒均证实了相比野生型BTV-1而言，没有显而易见的复制缺陷(数据未显示)。这表示得自BTV-10的基因组片段10在功能上与BTV-1基因组片段背景，在RNA包装及复制的水平及NS3/NS3A蛋白功能上是可比的。
使用过量的两种T7转录产物，将两种T7转录产物同时重组进入BTV基因组，从而以得自BTV-10 cDNA克隆的病毒外壳蛋白替代作为抗原重要的BTV-1外壳蛋白，表现为可行的(图5)。含有BTV-10片段2及5的子代病毒斑以20到80％的频率被回收，然而未分离得到只含有BTV-10片段2或片段5的重配株。这证明了BTV-10的片段2及5一起可以在功能上代替相应的BTV-1的基因组片段，说明来自这些血清型的片段2及片段5在某种程度上具有不相容性。编码的蛋白，VP2和VP5，由于它们在病毒颗粒表面暴露于免疫选择压力，是高度可变的。我们偏好的解释是VP2及VP5蛋白已共进化，及一种血清型的VP2的三维结构不必然地与另一种血清型的VP5相容。这与前面报道的来自一些血清型组合的VP2和VP5在BTV病毒样颗粒的传代中所观察到的的不相容性相一致[23，24]。在一些血清型组合中，在RNA包装层面上的片段2及片段5的不相容性是另一种可能性。来自另一血清型的两种外壳蛋白同时引入使得基于相同的遗传学背景，产生对于不同血清型的疫苗株成为可能。BTV-1及BTV-10的VP2蛋白之间的高度氨基酸序列差异性(40％氨基酸相同)暗示多种VP2+VP5对加到BTV病毒保守的核上的组装是可行的。
研究了BTV-1从一套完整的T7转录产物的回收，以确定具有完全确定的基因组的病毒是否可以从cDNA克隆中回收。由十种T7转录产物转染的BSR单层被发现导致病毒斑的产生(图7)。BglII标记物突变到S8片段的回收证实了所回收的病毒是得自转染中所使用的T7转录产物(图8和9)。单独从T7转录产物回收到到有感染性的BTV证明了在帽类似物存在下合成的T7转录产物在复制周期的所有阶段在功能上等价于真实的病毒转录产物。如果病毒粒子要传代，T7转录产物必须在基因组包装阶段被翻译、选择，并充当负链合成的模板。进一步地，在负链合成后，所产生的dsRNA基因组片段必须有能力在下一轮感染中转录。BTV从T7转录产物的回收导致，相比使用等量的得自核的病毒转录产物时，～100倍少的病毒斑的回收。较低的效率可能源于在帽类似物的存在下产生的T7转录产物只有一部分具有结合于5’末端的帽类似物。除了较差地被翻译，未带帽的转录产物可能在RNA包装过程中、负链合成中或在下一轮感染的转录中出错。重要地，该未加帽的转录产物具有5’三磷酸部分，其已知为病原体相关的分子样式(PAMP)，该样式由RIG-I识别，并导致引起抗病毒应答[25-28]。可选地，与产生十种具有完整保守末端序列的ssRNA分子相关的该技术问题可能促使用T7转录产物所观察到的较低回收。
全部从自质粒得到的转录产物的BTV回收使具有相同遗传学背景的BTV突变产生。该方法在突变体的回收中有用，所述突变体预料具有缓慢复制的显型，因为不需要在野生型病毒斑中筛选期待的变异株的病毒斑。在此类情况下，将没有可能阻碍回收复制较慢变异株的复制较快病毒的背景。该方法也能用于回收初代及低次代的BTV分离株，避免了这些株对细胞培养条件的逐步改变。含有一个自质粒得到的基因组片段的重配株的回收要求单克隆或PCR产物的构建，并且对于任意基因组片段都是可行的。此单构建方法可用于研究单独的病毒基因，而不需要构建整套的十个克隆。由于呼肠弧病毒科成员具有共同的复制策略，重组株及仅有T7的反向遗传学方法可对于缺少反向遗传学系统的广泛病毒是适用的。在两个方法中体外合成的T7转录产物的使用，避免了通过使用重组痘病毒感染提供T7RNA聚合酶的需要，所述重组痘病毒可以妨碍所回收的病毒的复制。
可选的反向遗传学方法已经在呼肠弧病毒科的其他属中成功应用[2-4]。第一种反向遗传学系统为哺乳动物正呼肠弧病毒的辅助病毒系统[3]。该方法将许可的细胞的呼肠弧病毒感染与用病毒dsRNA、病毒mRNA、T7转录产物及体外翻译的病毒mRNA转染相结合。另一种辅助病毒方法使得轮状病毒的外壳蛋白替换为另一种血清型的对应蛋白[2]。所述引入基因组片段的表达在体内由重组的T7痘苗病毒系统驱动，以及对等价的辅助病毒蛋白的选择性压力由选用抗体提供。最近，哺乳动物正呼肠弧病毒已经通过基于质粒的系统被回收，该系统类似首先和负链病毒使用的T7驱动的系统[4]。在本案中，所有十种基因组片段的表达在体内由重组T7痘苗病毒系统驱动。所有成功的反向遗传学策略具有几个共同的显著特征：1)得自cDNA克隆的基因组片段在被转染的细胞中作为信号感受转录产物被提供。2)所使用的得自cDNA的转录产物与对应的病毒转录产物具有同样的5’及3’末端序列。所述5’末端通过使用具有适当的序列的T7启动子产生，而3’末端通过体内使用丁型肝炎病毒核酶或者体外限制性酶位点来产生。呼肠弧病毒科成员中的所有基因组片段在其5’及3’最末端具有短的保守序列，其功能仍需阐明。3)类似真正的病毒转录产物，得自cDNA的转录产物被加帽，或者在体外使用帽类似物或者在体内通过与痘苗T7RNA聚合酶重组体相关的交叉加帽活性[13]。为了达到感染性病毒的回收，基因表达必须足以使子代核颗粒可以组装，其本身为具有转录活性的，并导致基因表达的扩增。为了组装这些不完全的病毒粒子，高水平的基因表达是必须的，以及在得自cDNA的转录产物的5’末端无帽结构的情况下，其稳定性和翻译水平会被大大降低[14]。
缺乏病毒基因的DISC病毒已经使用BTV反向遗传学系统结合补充细胞系获得。所回收的病毒满足以下BTV DISC病毒疫苗株的准则：1)在非补充哺乳动物细胞中表达病毒蛋白(图15)；2)在非补充哺乳动物或昆虫细胞系中无可检测到的感染性病毒产生(图14)；以及3)在相应的补充细胞系中健壮的复制(图12)。除此之外，表达外来蛋白或多肽的能力已经被使用eGFP蛋白插入NS3开放读写框证实了，使得产生含有免疫标记的病毒疫苗株，所述标记可以在接种的动物中检测，以将其从感染的动物区分开，也即DIVA概念(鉴别感染的和接种的动物)。
T7转录产物或病毒ssRNA在呼肠弧病毒科家族成员的复制周期中具有两种功能：1)被翻译以产生病毒蛋白；2)作为复制中间体起作用，以合成新的双链基因组片段。为了使在细胞中成功拯救，使用单转染方法，一部分转录产物必须在装配子代病毒颗粒中保持可以包装和复制。期待这在病毒回收效率中成为限制性的步骤，这是由于不像正常的感染，没有新的转录产物被持续地从感染性核颗粒处合成。为了增加回收的效率，当期待形态发生学上已经达到了包装阶段时，进行了第二次转染，以引入额外转录产物用于包装。使用病毒ssRNA或者T7转录产物观察到病毒回收中所预测的增长(图18及19)以及被发现为十倍。
为了进一步提高回收的效率，从第一次转染中省略了基因组片段，以使得形态发生学上不超过衣壳内层的组装。使用该方法以捕获在包装即将发生的阶段的组装体。编码所忽略的片段的基因组片段为：片段2编码VP2(外壳)，片段5编码VP5(外壳)，片段7编码VP7(衣壳中层)以及片段10编码NS3(病毒释放所需)。忽略片段2，5，7，10的结果是三层衣壳的中间层及外层未被合成，以及释放蛋白NS3不存在。发现以这种方式捕获形态，当整套十种转录产物在第二次转染中提供时，进一步增加了病毒回收的10倍(图20)。
转染步骤这两个改进共计导致病毒回收相对使用单转染100倍的提高，使得野生型或突变病毒可以可靠地回收。这些改进使得遗传地有缺陷的病毒使用补充细胞系可以可靠地回收。
反向遗传学，及其他病毒，可以帮助对BTV在数个研究领域内的理解。使用任一系统将特定突变回收进入BTV基因组的能力不仅提供了BTV及相关环状病毒的分子剖分的新工具，也提供了开发针对这些病毒的特异性地减低毒性的疫苗的机会。至今，BTV蛋白质功能的研究主要基于重组蛋白表达。将特定的突变引入BTV基因中的能力将使我们进一步了解病毒蛋白质在复制病毒中的功能，并使得进一步证实已经被指出的功能。控制环状病毒基因组复制、包装及表达的顺式作用RNA序列还未被绘制图谱，被了解得很少。反向遗传学使得绘制这些调控序列的图谱成为可能，并可以协助研究其如何起效。外壳蛋白质的替换可以在普通遗传学背景上，用于产生不同血清的疫苗株。进一步地，可以确定BTV及相关的环状病毒的致病性的决定性因素，并设计多重的毒性减低的疫苗株。
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Claims (36)

1.制备作为呼肠弧病毒科家族成员的病毒的疫苗病毒株的方法，所述方法包括：
向呼肠弧病毒科病毒中引入突变，以使必需基因的功能被破坏；
使用得自病毒基因组并含有所述突变的病毒单链RNA(ssRNA)转染细胞；和
在合适的条件下培养该转染的细胞以导致疫苗病毒株的产生，
其中所述细胞补充关键病毒基因的功能，从而使得所述疫苗病毒株在细胞中复制。
2.如权利要求1所述的方法，其中转染细胞包括2或更多转染步骤，其中：
(1)第一转染步骤包括使用ssRNA转染细胞，所述ssRNA至少编码病毒衣壳内层的组装所需的组分；以及
(2)第二转染步骤包括使用ssRNA转染细胞，所述ssRNA为病毒基因组的转录产物及包含所述突变，并编码病毒组装所需的所有组分。
3.如权利要求2所述的方法，其中在第一及第二转染步骤之间有至少6个小时的时间间隔。
4.如权利要求1到3任一项所述的方法，其中所述病毒为环状病毒属的成员。
5.如权利要求1到3任一项所述的方法，其中所述病毒为蓝舌病毒、非洲马瘟病毒或流行性出血热病毒。
6.如权利要求1到3任一项所述的方法，其中所述病毒为蓝舌病毒。
7.如前述任一项权利要求所述的方法，其中部分ssRNA是含有所述突变的病毒基因组cDNA克隆的转录产物。
8.如权利要求1到6任一项所述的方法，其中所有ssRNA为含有所述突变的病毒基因组cDNA克隆的转录产物。
9.如前述任一项权利要求所述的方法，其中多于一个必需基因的功能被破坏。
10.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述必需基因为聚合酶、螺旋酶、加帽酶或非结构蛋白。
11.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述细胞为BHK 21细胞、Vero细胞，293T细胞、BSR细胞、HeLa细胞、C6/36细胞或KC细胞。
12.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述用于转染细胞的病毒ssRNA是分离的ssRNA。
13.如前述任一项权利要求所述的方法，还包括从细胞分离所述疫苗病毒株。
14.得自病毒的基因组的分离的病毒ssRNA，所述病毒为呼肠弧病毒科家族成员，其中所述ssRNA包含突变，该突变破坏必需基因的功能，及其中所述病毒ssRNA适用于权利要求1到3任一项所述的转染细胞方法中。
15.表达呼肠弧病毒科病毒必需基因的细胞，其使得来自权利要求14所述ssRNA的疫苗病毒株可以复制。
16.如权利要求15所述的细胞，其由权利要求14所述的ssRNA感染。
17.由权利要求1到3任一项所述方法制备的疫苗病毒株。
18.药物组合物，其含有权利要求7所述的疫苗病毒株及药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。
19.药物组合物，其含有权利要求4所述的分离的病毒ssRNA及药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。
20.如权利要求17所述的疫苗病毒株在治疗中的应用。
21.如权利要求14所述的分离的病毒ssRNA在治疗中的应用。
22.如权利要求17所述的疫苗病毒株在给动物接种抵抗病毒中的应用。
23.如权利要求14所述的分离的病毒ssRNA在给动物接种抵抗病毒中的应用。
24.如权利要求22所述的疫苗病毒株或权利要求23所述的分离的病毒ssRNA，其中所述病毒为AHSV及所述动物选自马、骡、驴或斑马。
25.如权利要求22所述的疫苗病毒株或权利要求23所述的分离的病毒ssRNA，其中所述病毒为EHDV及所述动物选自鹿、家牛或绵羊。
26.如权利要求22所述的疫苗病毒株或权利要求23所述的分离的病毒ssRNA，其中所述病毒为BTV，及所述动物选自家牛、绵羊、山羊、水牛、鹿、单峰骆驼或羚羊。
27.接种动物抵抗病毒的方法，所述病毒为呼肠弧病毒科家族成员，所述方法包括递送有效量的根据权利要求17所述的疫苗病毒株到动物。
28.接种动物抵抗病毒的方法，所述病毒为呼肠弧病毒科成员，所述方法包括递送有效量的根据权利要求14所述的分离的病毒ssRNA到动物。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中所述病毒为AHSV，及所述动物选自马、骡、驴或斑马。
30.如权利要求27或28所述的方法，其中所述病毒为EHDV及所述动物选自鹿、家牛或绵羊。
31.如权利要求27或28所述的方法，其中所述病毒为BTV，及所述动物选自家牛、绵羊、山羊、水牛、鹿、单峰骆驼或羚羊。
32.试剂盒，其含有权利要求14所述的分离的ssRNA及细胞，所述细胞补充ssRNA突变的必需基因。
33.确定病毒必需基因的筛选方法，所述病毒为呼肠弧病毒科家族成员，所述方法包括：
向呼肠弧病毒科病毒中引入突变，以使必需基因的功能被破坏；
使用得自病毒基因组并含有所述突变的ssRNA转染细胞；和
在合适的条件下培养该转染的细胞，
其中如果培养所述转染的细胞后产生的病毒为致病性的，所述病毒基因不是必需基因。
34.本发明还提供产生作为呼肠弧病毒科家族成员的病毒的改良病毒株的方法，所述方法包括：
向呼肠弧病毒科病毒中引入修饰；
向细胞中转染病毒单链RNA(ssRNA)，所述RNA得自病毒基因组并包含所述修饰；及
在适宜的条件下培养该转染的细胞以导致改良病毒株的产生；
其中所述细胞使得改良病毒株在细胞中复制。
35.如权利要求1所述的方法，其中转染细胞包括2个或更多转染步骤，其中：
(1)第一转染步骤包括使用ssRNA转染细胞，所述ssRNA至少编码病毒衣壳内层的组装所需的组分；以及
(2)第二转染步骤包括使用ssRNA转染细胞，所述ssRNA为病毒基因组的转录产物及包含突变，并编码病毒组装所需的所有组分。
36.如权利要求2所述的方法，其中第一及第二转染步骤之间有至少6小时的时间间隔。
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