CN109312351B9

CN109312351B9 - 呼肠孤病毒科疫苗

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Publication number: CN109312351B9
Application number: CN201780036893.7A
Authority: CN
Inventors: P·罗伊
Original assignee: London School of Hygiene and Tropical Medicine
Current assignee: London School of Hygiene and Tropical Medicine
Priority date: 2016-04-26
Filing date: 2017-04-10
Publication date: 2020-10-23
Anticipated expiration: 2037-04-10
Also published as: US10688176B2; IL262510B2; AU2017256071B2; WO2017187131A1; JP2019514366A; EP3449003A1; MA43503B2; EP3449003B1; IL262510B1; CN109312351A; CA3022392A1; JP7053488B2; ZA201807035B; MA43503A1; CN109312351B; IL262510A; AU2017256071A1; US20190060442A1

Abstract

本发明涉及包含多个突变的分离的非洲马瘟病毒(AHSV)ssRNA；用于从所述ssRNA复制疫苗病毒株的互补细胞；来源于所述ssRNA的疫苗病毒株；所述疫苗病毒株和/或分离的ssRNA在对动物接种以抵抗AHSV感染中的用途；包含其的接种疫苗的方法；和包含所述疫苗病毒株和/或所述分离的ssRNA的药物组合物。

Description

呼肠孤病毒科疫苗

背景技术

在密切相关的环状病毒(呼肠孤病毒科(Reoviridae))(例如蓝舌病病毒 (Bluetongue virus)(BTV)、流行性出血病病毒(EHDV)和非洲马瘟病毒(AHSV))中，已知后者在受感染动物中引起最严重的发病率和死亡率。在易感染的马中， AHSV可引起不同形式的疾病，范围从轻度发热到死亡率达到95-100％的急性发热。虽然AHSV是撒哈拉以南非洲的地方病，但已报道在北非、巴基斯坦、印度、西班牙和葡萄牙偶尔爆发，并且这些爆发已产生了重大的社会和经济影响。前三种环状病毒是由库蠓属(Culicoides)的蠓传播的，这些蠓在整个欧洲和美国也有发现，因此增加了AHSV爆发的潜在地理风险，事实上，BTV和EHDV也有报道。

AHSV的基因组序列与BTV和EHDV不同。仅鉴别出AHSV病毒的9种血清型，即AHSV1-AHSV9。用减毒多价AHSV活疫苗(LAV)接种目前被用于控制非洲的疾病。然而，该疫苗由于不良副作用而被认为是不安全的；它引起病毒血症，并且还具有与野外分离株重配的可能性，从而有将新的病毒血清型引入天然地理位置的风险。

因此，需要合理设计的安全AHSV疫苗。具有挑战性的是，开发安全疫苗可能遇到的障碍是其特性的根本，除了需要安全且有效的疫苗制剂外，疫苗还必须：(i)技术上简单且可重复再现，这对于按比例放大生产至关重要；(ii)经济有效，这直接取决于：每个细胞所产生的病毒样粒子(VLP)的数目、疫苗的异源性质以及下游加工的容易性。遗憾的是，基于纯化蛋白质的亚单位疫苗通常不提供足够且持久的保护，而且它们生产成本高。

AHSV是含有10个双链RNA(dsRNA)区段(S1-S10)的无包膜病毒。外衣壳由两种主要的结构蛋白质VP2和VP5构成。决定血清型的VP2是最易变的病毒蛋白质，是保护性免疫应答的主要靶标。核心粒子由两个同心层组成：表面VP7 层和内部VP3层，这两个同心层包封10个dsRNA以及复制酶VP1、VP4和VP6 的复合物。BTV10的衣壳蛋白质VP2、VP3、VP5和VP7的序列与EHDV1和 AHSV4的序列之间的比较已揭示这些病毒之间的密切关系：内核蛋白质VP3和 VP7是最保守的，而最外层蛋白质VP2和VP5是变化最大的。虽然先前对BTV 的结构研究已揭示BTV粒子组织的细节，但目前对于AHSV仅报道了VP7(顶部)域的结构，因此对AHSV病毒功能的分析和任何随后基于结构的合理疫苗设计对于AHSV都是不可能的。

在过去十年中，反向遗传学(RG)技术彻底改变了对病毒复制和发病机理的理解，并为疫苗技术的发展做出了巨大贡献。然而，虽然已开发出用于野生型 AHSV毒株的RG技术，但它需要显著改善以增加拯救病毒生产的效率。

在本文中，我们公开了突变、有复制能力、无增殖能力的病毒粒子的产生。值得注意的是，在互补细胞系中的传代未揭示会恢复任何突变的ORF的突变区段变化。此外，复制效率接近野生型(wt)AHSV，因此产生用于疫苗开发的显著蛋白质水平。因此，这代表了稳定、优越且有效的疫苗疗法。

作为原理的证据，用所述疫苗接种IFNAR-/-小鼠并用AHSV的两种强毒株攻击显示出对同源感染的有效保护。此外，用单血清型(monoserotype)(ECRA.A4) 疫苗和一种多价混合剂(cocktail)(ECRA.A1/4/6/8)疫苗接种AHSV天然宿主(例如矮种马)显示出针对强毒AHSV4的保护。此外，接种多价混合剂的矮种马产生针对混合剂中存在的所有血清型的中和抗体，并且在试验期间出生的小马驹是健康的且没有病毒血症。这些结果验证了所述技术作为用于AHSV的疫苗的适合性。

发明内容

因此，根据本发明的第一方面，提供了来源于非洲马瘟病毒(AHSV病毒) 的基因组的分离的病毒ssRNA，其中所述ssRNA包含所述病毒的S9区段的至少一部分并且在其中具有所述病毒的S9区段中的多个突变，其中每个突变，至少在被引入所述ssRNA中后，提供或编码终止密码子。

许多病毒具有很多不同的血清型。例如，AHSV具有9种不同的血清型。不同的血清型可具有略微不同的表面蛋白质，甚至可在它们各自的基因组中所含基因的数目上不同。此外，在将来，至今尚未发现的血清型可能有待开发。因此，本发明旨在涵盖AHSV的任何可能的血清型。另外，本发明旨在涵盖AHSV 血清型的任何可能组合。

如本领域技术人员将了解的，本文中对终止密码子的提及是指信使RNA内的这样的核苷酸三联体：发出由所述RNA的氨基酸序列编码的蛋白质的翻译终止信号。这可包括但不限于已知的RNA终止密码子，即UAG、UAA或UGA。因此，在ssRNA中产生S9区段的任何一个此类终止密码子均导致翻译终止并因此产生由其编码的蛋白质。或者，还如本领域技术人员已知的，可作为移码突变的结果引入终止密码子，其中一个或两个核苷酸的引入/缺失引起ssRNA的阅读框中的移位，使得然后产生终止密码子。

在再又一优选的实施方案中，所述突变破坏至少一种必需基因的功能。

本文中对术语“必需基因”的提及是指对病毒具有致病性所必需的基因，因此当必需基因的功能被破坏时，所得的疫苗病毒株是非致病性的。这是疫苗产生的必需要求。突变可在任何必需基因中，所述必需基因在引入所述突变后导致病毒转变成非致病性表型。

优选地，在酶性蛋白质中，例如，在病毒聚合酶、解旋酶或加帽酶中引入突变。或者，可使任何非结构蛋白质灭活。在这种情况下，必需基因优选由S9 区段编码的基因，例如但不限于VP6和NS4。

在又一优选的实施方案中，突变使得超过一种必需基因的功能被破坏。这有助于确保病毒不会恢复到致病性表型。最优选地，所述突变破坏至少VP6和 NS4的功能。

在再又一优选的实施方案中，所述突变在S9区段的核苷酸288-877处或之间引入。优选地，所述突变在选自包括以下的组或由以下组成的组的一个或多个下列核苷酸位点处或之间引入：288-304；377-386；590-608；和872-877。更理想地，将至少一个突变引入所述核苷酸位点中的每一个中，理想地，将多个突变引入所述核苷酸位点中的每一个中。仍更理想地，在所述核苷酸位点中引入至少下列突变：

a.位点288-304处或之间的至少3个突变；

b.位点377-386处或之间的至少3个突变；

c.位点590-608处或之间的至少3个突变；和

d.位点872-877处或之间的至少2个突变。

最理想地，另外地或可选择地，在位点288-304处或之间引入破坏NS4的功能的移码突变。

如图11中所示，我们使用了以下取代：

289处的C取代为A；

294处的G取代为T；

295处的G取代为A；

300处的G取代为T；

301处的G取代为A；

378处的G取代为T；

381处的G取代为T；

382处的G取代为A；

384处的C取代为T；

386处的G取代为A；

591处的G取代为T；

598处的C取代为G；

600处的A取代为T；

606处的G取代为T；

607处的A取代为G；

608处的G取代为A；

873处的A取代为T；

874处的T取代为A；

875处的G取代为A；

876处的A取代为T；和

877处的T取代为A。

因此，在优选的实施方案中，本发明涉及前述多个产生多个终止密码子的终止突变中的任何一个或多个(包括所有和任何组合)用途。尽管本领域技术人员将了解，具有相同技术效果的其他取代也可用于实施本发明。

因此，我们已在整个S9基因中引入或提供了多个(通常为11个)终止密码子 (通常为TAA或TGA)，破坏了VP6和NS4的ORF，但保留了获得的S9多重终止物(multistop)的长度，从而将对缺陷型AHSV(理想地为毒株AHSV1)的拯救和复制的遗传压力降到最低。虽然本文使用11个终止密码子实施本发明，但本领域技术人员将了解，可使用更多或更少个终止密码子，并且终止密码子可以是任何类型，尽管我们已理想地使用TAA和TGA。

实际上，最优选的方面是本发明包括具有SEQ ID NO:1或以优选的升序与之具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的ssRNA。

SEQ ID NO:1S9多重终止物：

GTTAAATAAGTTGTCTCATGTCTTCGGCATTACTCCTCGCACCTGGCG ATCTAATCGAAAAAGCAAAGCGCGAGCTCGAGCAGCGCTCGATAACTCC GCTCTTGCGGGAGAAAAAATCGAAAGAAGCCAAATCTAAATTAAAAGAA GATGGGGAGAAGAAGAACAAGAGTGAAGAGGAAAAGAACAAAATACGT GATGATCGAAGAGTGGAGAGCCAGAAATCTGAGGGAGGCGGATCAGCCG ATTGTCAACGCGGCGCAGGAAGCGCAGGAGCAAATTGCGCAACATAAAC ATAAGGATAAGTGGAAGTGCAGGAGCAAGGACCGGGGTTGAAGAGGGA GGAGTGGGAGAAGCGGATTCGAGATCTGGAGGACATTGATAATAAGGTG CAGCCTCGGATGGAAAGGGAGTGGGTAAATCTAAGACCGGAGTAGATCG TGTCGCTAATGATGATGCAACACGCAATGTTGGTTCCAGTGAGGTATCAT CTGGTGGAATCACTTCAGGAGGTCTTCAAGGCCGAGGAGGACTCGTTGCA AAGAGTAGTGAATGTGGCGGGGAACCATTGGATAGGACAGGCGGCCGCA GCTGAAATTGATAAACTTGAGGAGAGGAGGCAAAGGCTGGAGGGGGCGA TAGACGGATTGGAGGATTAGCTACGCAGGAGATTGCCGACTTTGTGAAGA AGAAGATCGGAGTTGAAGTTCAGGTCTTTTCCAAAGGAATGACCAACTTA TTTACTGTAGATAAATCATTGCTTGAGCGGGATGGGTTAGGGAGGGAGGA CATTCTACATCAATCAGATATTGTAAAAGAGATTAGAGTAAGTGATAAAA AAGTCAAGATTATTCCTCTTTCTACAGTGAAGAGATAATAAGCGGAATTC GGAGGAACAGAGGAGGATGAAATCAAAGTTGTTCAAACTCAAAGCTCTT CTATCAGGTATATTAGTAATAGAATGGAAGATGTTTTAAGGGCGAAGGCG ATGTTCACAGCGCCGACAGGTGATGAGGGGTGGAAGGAGGTTGCTAAAG CAGCGACTCAGCGTCCTAACATCATGGCGTATGTGCACGAAGGGGAAGG CGATGGATTGAAAGAGCTTTTACATTTGATTGATCATATCTAGGTCCAGG GGTAAACGGCAGCTTGAGGGCAACTTAAAAACTTAC

根据本发明的第二方面，提供了一种细胞，其表达AHSV的S9区段的至少一个必需基因，并互补如本文所公开的ssRNA中突变的所述必需基因，从而使得疫苗病毒株能够在所述细胞被ssRNA感染时在其中复制。

最优选地，所述细胞互补携带所述突变的所述必需病毒基因的功能，从而允许疫苗病毒株在细胞中复制。如本领域技术人员将了解的，ssRNA已经突变，使得所述必需基因的功能已被破坏。通过具有互补所述必需病毒基因的功能的细胞，使由所述必需基因产生的蛋白质从细胞mRNA表达，而不是从病毒的 ssRNA表达，因此该基因的功能被所述细胞互补。这确保了病毒复制或增殖所必要的所有必需蛋白质存在于细胞内。因此，疫苗病毒株可在细胞内自由复制。然而，如果疫苗病毒株感染除互补细胞以外的细胞，则所述必需基因的蛋白质产物将不存在，因此疫苗病毒株将不能增殖。疫苗病毒株将例如在接种疫苗的宿主中经历单一复制循环。

在优选的实施方案中，所述细胞可以是适合用ssRNA转染并用于培养病毒株的任何细胞。所述细胞是病毒允许的细胞。优选地，所述细胞是BHK 21细胞、 Vero细胞、293T细胞、BSR细胞(特定BHK 21细胞的克隆)、HeLa细胞、C6/36 细胞(来源于白纹伊蚊(Aedes albopictus)的蚊细胞系))或KC细胞(来源于天然昆虫载体北美库蠓(Culicoides sonorensis)的蠓细胞系)。更优选地，所述细胞是BSR 细胞。

本文中对术语“疫苗病毒株”的提及意指适用于用以使通常受野生型病毒影响的宿主免疫的疫苗中的病毒株。疫苗病毒株是非致病性的并且不会引起感染的病毒株。因此，它并不引起通常与野生型病毒相关的疾病。疫苗病毒株的概念是本领域技术人员众所周知的。例如，野生型病毒可被减毒或灭活，使得它们在用减毒或灭活病毒免疫的宿主中产生免疫应答，而不会引起完全感染。如果宿主随后暴露于野生型病毒，则这允许宿主产生有效的免疫应答。

因此，还提供了用如本文所公开的ssRNA感染的细胞。

根据本发明的第三方面，提供了包含如本文所公开的分离的ssRNA的疫苗病毒株。

更优选地，所述疫苗病毒株是血清型特异性的，因此包括下列中的任一种： ASHV1、AHSV2、AHSV3、AHSV4、AHSV5、AHSV6、AHSV7、AHSV8和 AHSV9。更理想地，所述疫苗病毒株包括多种所述血清型，包括AHSV1-9中的任一组合，包括所有AHSV1-9。

本领域技术人员将了解，使用不同血清型使得本发明的疫苗能够提供针对每种病毒株的最大保护，所述病毒株的毒力可变化，例如AHSV 4在小鼠模型中显示比AHSV 1更具毒力，因此在本发明的疫苗中可能相对于AHSV1等优选毒株AHSV4。

因此，使用我们的技术，我们已用来自所有AHSV血清型的衣壳蛋白产生了有复制能力、无增殖能力的病毒粒子。此外，我们在互补细胞系中产生了高滴度的这些粒子。值得注意的是，在互补细胞系中的传代未揭示在会突变的S9 中恢复突变ORF的任一个的变化。此外，复制效率接近野生型AHSV，因此产生用于疫苗开发的显著蛋白质水平。因此，这代表了稳定、优越且有效的疫苗疗法。

根据本发明的第四方面，提供了用于疗法的如本文所公开的分离的ssRNA 或包含分离的ssRNA的疫苗病毒株。更优选地，所述分离的ssRNA或疫苗病毒株用于对非人动物接种以抵抗AHSV。

在本发明第四方面的优选实施方案中，所述非人动物选自包括以下各项或由以下各项组成的组：马、矮种马、骡、驴或斑马。

根据本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体、佐剂或媒介物组合的如本文所公开的分离的病毒ssRNA或包含分离的 ssRNA的疫苗病毒株。

所述组合物理想地应当是无菌的，并且含有适于向受试者施用的重量或体积单位的治疗有效量的分离的ssRNA或疫苗病毒株。术语“药学上可接受的”意指不干扰活性成分的生物活性有效性的无毒材料。术语“生理上可接受的”是指与诸如细胞、细胞培养物、组织或生物体的生物系统相容的无毒材料。

用于施用的制剂包括适于口服、直肠、鼻、支气管(吸入)、局部(包括滴眼剂、颊和舌下)、阴道或胃肠外(包括皮下、肌内、腹膜内、静脉内和真皮内)施用的那些，并且可通过药学领域众所周知的任何方法制备。

优选的施用途径意指将治疗剂配制用于静脉内、胃肠外、口服、鼻、支气管或局部施用。

可通过使本发明的分离的ssRNA或疫苗病毒株与载体结合来制备组合物。通常，通过如下方式制备所述制剂：均匀且紧密地使活性剂与液体载体或微细的固体载体或二者缔合，然后(如有必要)，使产品成形。本发明扩展到用于制备药物组合物的方法，所述方法包括使本发明的分离的ssRNA或疫苗病毒株与药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物结合或缔合。

本发明中用于口服施用的制剂可呈现为：各自含有预定量的活性剂的离散单位，例如胶囊、小袋或片剂；作为粉末或颗粒；呈现为活性剂在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或呈现为水包油液体乳液或油包水乳液；或呈现为推注等。

对于用于口服施用的组合物(例如片剂和胶囊)，术语“可接受的载体”包括媒介物，例如常用赋形剂，例如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和淀粉；填料和载体，例如玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸二钙、氯化钠和海藻酸；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钠和其他金属硬脂酸盐、硬脂酸甘油酯、硬脂酸、硅酮油、滑石、蜡、油和胶体二氧化硅。还可使用调味剂，例如薄荷、冬青油、樱桃调味剂等。可能期望添加着色剂以使剂型易于鉴别。片剂还可通过本领域众所周知的方法包衣。

片剂可通过压缩或模制，任选地利用一种或多种辅助成分制得。压缩片剂可通过在适合的机器中压缩自由流动形式的活性剂(例如粉末或颗粒)，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合的自由流动形式的活性剂来制备。模制片剂可通过在适合的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物来制得。片剂可任选地被包衣或刻痕，并且可被配制成提供活性剂的缓慢或控制释放。

适于口服施用的其他制剂包括包含于调味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的活性剂的锭剂；包含于惰性基质(例如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶) 中的活性剂的软锭剂(pastille)；和包含于适合的液体载体中的活性剂的漱口剂。

对于局部施加于皮肤，可将制剂制成乳膏、软膏、胶状物、溶液或悬浮液等。可用于药物的乳膏或软膏制剂是本领域众所周知的常规制剂，例如，如药剂学标准教科书例如英国药典(British Pharmacopoeia)中所述。

本发明的组合物可用于通过鼻、支气管或颊施用例如气溶胶或喷雾剂来治疗呼吸道，所述气溶胶或喷雾剂可以粉末形式或以溶液或悬浮液滴形式分散药理活性成分。具有粉末分散性质的药物组合物除活性成分之外，通常还含有沸点低于室温的液体推进剂，以及(如果期望)辅助剂，例如液体或固体非离子型或阴离子型表面活性剂和/或稀释剂。其中药理活性成分在溶液中的药物组合物除药理活性成分之外，还含有适合的推进剂，以及此外(如果需要)另外的溶剂和/ 或稳定剂。还可使用压缩空气代替推进剂，可能借助于适合的压缩和膨胀装置根据需要产生压缩空气。

胃肠外制剂将通常是无菌的。

本领域普通技术人员通过比较疫苗的组织水平和具有治疗作用所需的浓度，可容易地确定治疗有效的本发明分离的ssRNA或疫苗病毒株的精确量以及最佳施用途径。

根据本发明的第六方面，提供了包含根据本发明的药物组合物和一种或多种不同的另外的抗病毒剂的组合治疗剂。

本领域技术人员将了解，另外的抗病毒剂是常规已知的。

根据本发明的第七方面，提供了用于对非人动物接种疫苗以抵抗AHSV的方法，所述方法包括向非人动物递送或施用有效量的如本文所定义的分离的 ssRNA或包含所述分离的ssRNA的疫苗病毒株。

在本发明的优选方法中，所述非人动物选自包括以下各项或由以下各项组成的组：马、矮种马、骡、驴或斑马。

根据本发明的第八方面，提供了试剂盒，其包含如本文所公开的分离的 ssRNA和与ssRNA中突变的所述必需基因互补的细胞。

在本说明书的说明和权利要求书通篇中，词语“包括(comprise)”和“含有”以及这些词的其他变化形式(例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”)意指“包括但不限于”且并不排除其他部分、添加剂、组份、整数或步骤。在本说明书的说明和权利要求书通篇中，除非上下文另有要求，否则单数涵盖复数。特别是，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则申请文件应被理解为涵盖复数以及单数。

本说明书中引用的所有参考文献，包括任何专利或专利申请，均在此以引用方式并入。不承认任何参考文献构成现有技术。此外，不承认任何现有技术构成本领域公知常识的一部分。

本发明的每个方面的优选特征可如结合任何其他方面所描述。

根据下文实施例将明了本发明的其他特征。一般地说，本发明扩展到本说明书(包括所附权利要求书和附图)中所公开的任一新颖特征或特征的任一新颖组合。因此，结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特点、整数、特征、化合物或化学部分应被理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。

此外，除非另有说明，否则本文所公开的任何特征均可由用于相同或类似目的的替代特征代替。

现在将参照附图和表仅以举例方式对本发明进行描述，其中：-

图1.AHSV血清型的遗传和表型分析。上图表示通过感染BSR细胞并培育 48小时获得的噬斑形态的分析。下部分表示用于选择具有大噬斑表型、高滴度和最低遗传变异性的最佳复制性AHSV血清型用作反向遗传学的基础的策略；

图2.用于AHSV1的反向遗传学的建立。(A)对于AHSV1的初级复制的最低要求。用第一行所示的一组表达质粒以一式三份转染BSR细胞，之后进行如第二行所示的10种加帽的AHSV1T7-RNA转录物(S1到S10)的第二次转染。在第二次转染后48小时，将估计的感染性呈现为每1μg总T7RNA的PFU。最下面的图是对于上文所示每次实验通过双重转染获得的噬斑的代表性图。(B)感染后 48小时的BSR细胞上的野生型(wt)和拯救的recAHSV1原种(stock)的噬斑测定。感染滴度呈现为从5次独立的传代(对于wtAHSV1)或拯救(对于recAHSV1)实验获得的范围。(C)在9％非变性PAGE上分析从被wtAHSV1和recAHSV1感染的 BSR细胞纯化的基因组dsRNA的图。基因组dsRNA区段的位置示于右侧；

图3.表达VP6的稳定细胞系互补VP6/NS4缺陷型AHSV1。(A)通过BSR细胞的电穿孔和表达VP6的集落的选择产生表达AHSV1VP6的互补细胞系。将所选克隆以1:20稀释度传代30次，并通过使用VP6特异性抗体进行免疫印迹来分析等量的所示传代细胞。(B)互补辅助缺陷型AHSV1拯救的示意图。用一组五种表达质粒(VP1、VP3、VP4、VP6和NS2)转染BSR-VP6细胞，之后进行 10种AHSV1T7RNA转录物的转染，其中S9被缺乏VP6/NS4表达的S9多重终止物代替。VP6被反式互补，产生单轮复制、但非增殖的缺陷病毒。(C)用一组5种表达质粒(各80ng)转染BSR-VP6细胞，之后进行总共50ng 10种加帽的 AHSV1T7-RNA转录物的第二次转染，其中S9被缺乏VP6/NS4表达的S9多重终止物代替。在第二次转染后56小时将转染的孔固定并染色。模拟物和 recAHSV1拯救物在与def-AHSV1相同的条件下用作对照；

图4.通过组合不同区段获得的互补VP6的良好复制的缺陷型重配AHSV变体。(A)AHSV2-9的所选缺陷型重配株的示意性图示。上图指示已经交换以在 BSR-VP6细胞系中实现高滴度和大噬斑表型的区段。缺陷型AHSV粒子的草图图解说明四种主要结构蛋白质的来源为AHSV1(蓝色)或另一血清型(红色)。红色dsRNA片段指示交换的片段(S2、S3、S6、S7和S10)。针对每个重配组获得的血清型示于下图中。(B)在9％非变性PAGE上分析从被wtAHSV1、recAHSV1 和缺陷型AHSV变体(在BSR-VP6细胞系上以MOI 0.1的第5次传代)感染的 BSR-VP6细胞系纯化的基因组dsRNA的图式。基因组dsRNA区段的位置示于右侧。wt-S9dsRNA位置指示在左侧，而缺陷型AHSV变体的S9多重终止物 dsRNA以红色指示，并在凝胶上以红色星号(*)标记。凝胶上的红色箭头对应于用于拯救缺陷型AHSV变体的交换区段；

图5.VP6/NS4缺陷型病毒能够在互补BSR-VP6细胞系中生长，但在正常 BSR细胞、昆虫KC细胞或马真皮(E.Derm)细胞中不能生长。(A)互补BSR-VP6 细胞系中的病毒生长动力学。用一组所示病毒以MOI 0.1感染BSR-VP6细胞，并在感染后0小时、24小时、48小时和72小时通过BSR-VP6细胞上的噬斑测定进行分析。右图指示每种病毒的最终滴度。(B)正常BSR细胞、昆虫KC细胞和马真皮细胞中的病毒生长动力学。以MOI 5(BSR)、2.5(KC)和10(马真皮)感染三种细胞系，洗涤两次并在感染后0小时、24小时、48小时和72小时通过 BSR-VP6细胞上的噬斑测定进行分析；

图6.用def-AHSV1和def-AHSV4保护IFNAR-/-小鼠免受wt AHSV1和wt AHSV4病毒的同源攻击感染。(A)用10⁶PFU的def-AHSV1和def-AHSV4免疫并用10⁵TCID50的同源wt AHSV毒株攻击的成年IFNAR-/-小鼠(每组6只)的存活图。所示动物组中的血液(B)和器官(脾、肝、脑)(C)中的RNA血症，通过 RT-qPCR获得的Ct值的反转图呈现。高于40的Ct值被认为是阴性。每个点对应一个分析的动物样品；

图7.接种疫苗动物中的临床体征和病毒复制。在第0天和第21天(加强)将动物接种疫苗两次。(A)根据体温、呼吸节律、心脏脉搏等对临床体征进行评分。对4只动物接种ECRA.A4(A组；上图)，4只接种ECRA.A1/4/6/8的混合剂(B 组；下图)，且两只动物用作对照(C1和C2)。(B)通过RT-PCR确定血清中的AHSV 基因组RNA并表示为Ct值。病毒载量由绿色(ND：未检测到)到红色(Ct小于25) 的颜色梯度表示；

图8.接种疫苗后的动物的血清转化。通过VP7组特异性竞争ELISA监测接种疫苗动物的免疫应答。将A组(左图)和B组(右图)中的动物分别用ECRA.A4 或ECRA.A1/4/6/8接种两次，间隔21天，并与C组(接种模拟物的动物)比较；

图9.接种疫苗的矮种马在强毒病毒攻击后的临床保护。从第36天开始监测临床体征。(A)对接种疫苗组A和B(长达18天)和对照组(长达10天)的临床体征进行评分(分别为上图、中图和下图)。(B)两只对照动物中攻击后的严重临床体征明显为眼睑和眶上窝水肿(左)以及结膜炎(右)；

图10.在接种疫苗的动物中不存在病毒复制。通过RT-PCR确定血液样品中的病毒血症。用对应于低到高的病毒载量的绿色(高)到红色(低)的颜色梯度表示 Ct值。高于40的值被认为未检测到(ND)。由于严重的AHS症状而分别在攻击后第11天和第10天将C组(C1和C2)中的对照动物无痛致死(黑色)；

图11.用于ECRA疫苗株(A组(ECRA.A4病毒)和B组(ECRA.A1/4/6/8的混合剂))中的区段9中的多个突变的细节，其用于产生图7-10中的数据；

表1.接种疫苗后的矮种马中的血清中和活性。通过在第35天(攻击前一天) 针对如所示的AHSV血清型1、4、6和8的噬斑减少测定来确定血清中的中和活性。滴度表示为使噬斑数减少50％的血清的最高稀释度。指示了未确定(nd) 且未检测到(-)；并且

表2.强毒病毒攻击后的矮种马中的血清中和活性。通过在第44天和60天(攻击后8天和24天)针对血清型AHSV 1、4、5、6和8的SN测定来确定接种疫苗动物血清的中和抗体滴度。滴度表示为允许完全中和的血清最高稀释度的倒数。在第44天未对对照动物血清进行SN测定。由于严重的AHS症状而分别在攻击后第11天和第10天将C1和C2矮种马两者均无痛致死。指示了未确定(nd) 和未检测到(-)。

方法和材料

细胞和病毒。

将BSR细胞(BHK-21亚克隆)维持在补充有5％胎牛血清(FBS,Invitrogen)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco modified Eagle medium)(DMEM,Sigma) 中。使稳定的细胞系BSR-VP6在补充有7.5μg/ml嘌呤霉素(Sigma)的DMEM-5％ FBS中生长。在补充有10％FBS和1％非必需氨基酸的伊格尔最低必需培养基 (minimum essential medium eagle)(MEM，Sigma)中培养马真皮细胞(NBL-6, ATCC CCL-57)。在5％CO₂加湿的气氛中在37℃培养哺乳动物细胞系。在28℃ 在补充有10％FBS的施氏昆虫培养基(Schneider’s insect medium)中维持来源于库蠓属(Culicoides)(24)的昆虫KC细胞。

ASHV血清型1到9由Zientara博士(ANSES France)友情供应。将所有AHSV 血清型在BSR细胞中传代一次，滴定并用于后续实验。

质粒

对于AHSV1RG系统，使用AflII和PacI限制性位点将相应区段的编码区插入pCAG-PM载体(18)中。将相应的表达质粒命名为pCAG-AHSV1VP1、 pCAG-AHSV1VP3、pCAG-AHSV1VP4、pCAG-AHSV1VP6、pCAG-AHSV1VP7、 pCAG-AHSV1NS1和pCAG-AHSV1NS2，并通过测序确认。使用如前所述的序列非依赖性克隆系统产生AHSV转录物的T7质粒(17)。简单地说，在用衔接子引物进行RT-PCR扩增之前，将来自浓缩病毒的纯化的dsRNA连接到自退火引物。将从AHSV区段扩增的每个cDNA克隆到pUC19载体中并测序。

通过基因组装产生AHSV1S9多重终止物突变体，并且引入在位置288-304 (3个终止密码子+NS4移码)、377-386(3个终止密码子)、590-608(3个终止密码子)和872-877(2个终止密码子)处的突变。确认所述序列，并且在请求时可获得。

组成型表达AHSV1VP6的BSR-VP6细胞系的开发

如先前所述(18)(有一些修改)产生表达AHSV1VP6的互补细胞系BSR-VP6。简单地说，通过在240V和975μF下电穿孔，用表达AHSV1-VP6的载体 pCAG-AHSV1VP6转染BSR细胞。在电穿孔后，将细胞悬浮液接种到150mm 培养板上，并在7.5μg/ml嘌呤霉素存在下选择表达VP6的集落。通过免疫印迹分析测试存活的克隆，并将最佳表达的克隆用于拯救VP6缺陷型病毒。通过 SDS-PAGE和使用针对AHSV6VP6产生的多克隆豚鼠抗血清的蛋白质印迹评估 AHSV1VP6的表达。

从T7RNA恢复wt AHSV1病毒。根据制造商说明书，使用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra试剂盒(Ambion)，将含有T7启动子和精确3'末端的DNA 以等摩尔比例用作模板，以产生用于AHSV1的10种加帽的T7RNA的混合物。为了拯救recAHSV1，用不同组合的编码AHSV1VP1、VP3、VP4、VP6、VP7、 NS1和NS2的表达质粒组(每孔每种质粒80ng)转染12孔板中50％汇合的BSR 细胞。在转染后16小时，再次用总共500ng的所有10种加帽的RNA转录物转染被转染的单层。为了评估RNA感染性，在第二次转染后4小时，将单层用含有1％FBS的MEM中的1.5％琼脂覆盖，并在35℃培育2-3天直到形成噬斑。或者，为了收集拯救的病毒，用含有1％FBS的DMEM替换转染培养基并培育 2-3天直到出现CPE。

从T7 RNA恢复def-AHSV

为了拯救def-AHSV1，用编码VP1、VP3、VP4、VP6和NS2的5种pCAG 质粒(各80ng)转染12孔板中50％汇合的BSR-VP6细胞。在转染后16小时，用总共500ng的10种加帽的AHSV1RNA转录物转染BSR-VP6单层：S1-8、S10 和S9多重终止物。为了获得重配的def-AHSV，使用了几个片段来代替亲代 AHSV1。将每种缺陷病毒进行噬斑纯化并在BSR-VP6细胞上滴定。为了评估稳定性，将每种缺陷病毒在BSR-VP6细胞中以0.1的MOI传代至少5次。dsRNA 谱的分析和RT-PCR/测序用于确认引入的AHSV区段的完整性。

AHSV的体外生长动力学

在分别以0.1、5、2.5和10的MOI感染1.5小时后的BSR-VP6细胞、BSR 细胞、KC细胞和马真皮细胞中确定wt AHSV和缺陷病毒的体外生长动力学。在感染后，去除接种物，用补充有1％FBS的培养基将细胞洗涤两次。在感染后 0小时、24小时、48小时和72小时，收获上清液并通过BSR-VP6细胞上的噬斑测定来确定滴度。以一式三份进行每个实验并重复两次。

小鼠

从FLI的无特定病原体的繁育单位获得C57BL/6遗传背景的30只IFNAR-/- 小鼠，并将其分成5组；将雄性动物和雌性动物均等分配。间隔三周，对6只小鼠各自分别接种10⁶PFU(100μl)def-AHSV1和def-AHSV4病毒两次，并在第二次免疫后21天用100μl AHSV血清型1(def-AHSV1组)或4(def-AHSV4组) 中的10⁵ 50％组织培养感染剂量(TCID50)感染。对12只小鼠模拟接种磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中6只用AHSV1感染，且6只用AHSV4感染。将另外6只小鼠保持作为对照。

在接种疫苗和感染后每天称量所有小鼠并持续10天，并且检查临床体征，将显示严重症状的动物立即无痛致死，将攻击感染后2周的所有剩余感染动物以及3周后的未处理对照动物无痛致死。在感染后第3天、第7天和第10天对所有小鼠进行血液取样。在尸体解剖时，取血液、脾、肝和脑样品，并将器官样品在1ml无血清MEM中均质化。根据制造商说明书，与MagAttract Virus Mini M48试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)组合使用King Fisher 96 Flex(Thermo Scientific,Braunschweig,Germany)提取来自20μl血液或100μl组织均质物的 RNA，并通过与靶向持家性β-肌动蛋白基因的内部对照系统(26)组合的基于VP7 的实时RT-PCR测定(25)进行分析。

矮种马

图11显示了引入区段9中并用于随后的矮种马接种的多个终止密码子的细节，将早期传代的ECRA.AHSV原种(BSR-VP6细胞中的1-2次传代)在无抗生素培养基中以0.1的MOI在BSR-VP6细胞中扩增。将所得ECRA.AHSV原种用 10％海藻糖(Sigma)补充，等分，在液氮中冷冻并储存在-80℃直到接种。在 BSR-VP6细胞上滴定冷冻原种的等分试样，并通过在幼稚BSR细胞中针对至少 3次盲传目测不存在典型的致细胞病变效应(CPE)，并通过RT-PCR确认测试复制的不存在。通过超声裂解从等量的BSR-VP6细胞制备模拟疫苗剂量。在经过不同的储存条件后测试疫苗稳定性，所述储存条件更具体地说是不同的温度 (+4℃、-20℃和-80℃)，直接冷冻或在液氮中冷冻，补充或不补充10％最终浓度的海藻糖(Sigma)。

矮种马中的单血清型和混合剂ECRA.AHSV接种。

在第0天对两组4只动物皮下接种ECRA疫苗株，A组接种ECRA.A4病毒 (1×10⁷PFU/动物，A组)，B组接种ECRA.A1/4/6/8混合剂(1×10⁷PFU每种血清型/动物)。另外，对2只动物模拟接种未感染的细胞裂解物(C组)。在第一次接种后21天给予加强注射。在第36天或在加强疫苗接种后两周，用2×10⁶TCID₅₀ 的AHSV4强毒分离物静脉内攻击所有动物(Morocco 1990)。在来自AHSV4感染的马的脾提取物的Vero细胞上传代5次并且在Vero细胞或KC细胞上另外传代一次后获得攻击病毒原种：用在Vero细胞上获得的10⁶TCID50和从KC细胞恢复的10⁶TCID50攻击每只马。在接种疫苗和攻击之前和之后定期获取所有动物的全血和血清样品。本研究严格按照法国关于动物实验和福利的指南和建议进行。该方案经ANSES/ENVA/UPEC动物伦理委员会(Animal Ethics Committee) 批准。

RNA提取和RT-PCR。

利用QIAamp病毒RNA试剂盒和Qiacube机器人(QIAGEN)，从血液样品和在10％w/v PBS中均质化的器官(脾、肺和心脏)中提取RNA。在添加到RT-PCR 反应混合物中之前，对基因组双链RNA提取物进行热处理(添加10％DMSO并在95℃加热5分钟)。靶向S1区段的实时AHSV RT-PCR以三次重复进行两次，其中需要对RT-PCR试剂盒(AgPath-ID^TM一步RT-PCR试剂盒(ThermoFisher Scientific)代替SuperScript III/Platinum Taq一步qRT-PCR试剂盒)以及对StepOne 或AB7300热循环仪中的循环条件进行修改：45℃ 10min、95℃ 10min，之后是45个循环的95℃ 10s、55℃ 30s和72℃ 30s。测量循环阈值(Ct)，并且将高于40阈值的值视为阴性。

单血清型ECRA.A4和混合剂ECRA.A1/4/6/8试验的血清学。

根据制造商说明书，通过市售的竞争性ELISA AHSV VP7抗体测试试剂盒 (ELISA Ingezim AHSV Compaq)分析血清样品。血清学状态被定义为阳性(≥50％)、可疑(>45％和<50％)或阴性(≤45％)。

为了检测中和抗体应答，使用标准血清中和(SN)测定或噬斑减少测定。对于标准SN测定，将血清样品以及阳性和阴性对照血清在96孔板中连续稀释，并在37℃与100个感染性AHSV粒子(对于AHSV 1、4、5、6或8)混合60分钟。在每孔添加10⁴个Vero细胞后，将板在37℃、5％CO₂下培育7天，用4％PFA 固定，并用0.5％亚甲蓝染色。中和滴度被定义为提供对细胞培养物的完全保护的血清的最高稀释度。对于噬斑减少测定，将血清样品在96孔板中连续稀释，并向每个孔中添加约25个感染性AHSV粒子。以一式三份进行所有稀释。将血清-病毒混合物在振荡器上在室温下培育2小时，并添加到12孔板中汇合的BSR 细胞单层中且保持1小时。在培育后，将感染的细胞用含有0.6％Avicel(IMCD LTD)的MEM覆盖并培育3天。中和滴度被定义为展现病毒噬斑减少50％的血清的最高稀释度，根据与对照(FBS和来自对照动物的血清)相比在每个孔中观察到的噬斑数来计算。

临床监测

在接种疫苗后8天和攻击后3周期间每天监测矮种马的AHSV临床体征发展。记录一般体症(行为改变、体温过高、心率和呼吸节律、出汗)，以及水肿、异常出血(瘀点)、呼吸困难、鼻涕和结膜炎的体征，并根据以下准则评分：

行为：正常-0pt，冷漠-1pt，抑郁-2pt，虚脱-3pt

一般参数：直肠温度(T)＝正常-0pt，39℃≤T≤40℃-1pt，40℃<T-3pt；心率＝正常-0pt，>50-2pt；呼吸节律＝正常-0pt，>25-2pt

特定体征：水肿-每个部位(眼睑、眶上窝、嘴唇、头部、颈部、躯干或播散性)1pt、鼻涕-每种类型的分泌物(浆液性、粘液性、化脓性、出血性)1pt、瘀点性病变-每个部位(结膜炎、口腔、皮肤)1pt、呼吸困难-1pt、咳嗽-1pt、结膜炎 -1pt、异常出汗-1pt、绞痛-1pt。

结果

用于ASHV的反向遗传学的建立

有效且快速的病毒反向遗传学(RG)是通过操纵病毒基因组来理解分子机制的关键。先前公布的AHSV RG包括混合血清型转染，即AHSV6的六种表达质粒，之后是AHSV4的10种T7-RNA转录物(23)。发现该组合由于低拯救效率和不足的重组病毒滴度(<10⁶PFU/ml)而不足以进行分子操作。因此，我们首先的目的在于寻找形成均匀大噬斑的良好复制的AHSV毒株，其可用作用于有效RG 系统的基础。首先，在BSR细胞上测试所有9种AHSV血清型，以评估感染滴度和噬斑表型(图1)。观察到两组不同的AHSV血清型：大的轮廓分明的噬斑表型和高滴度(AHSV1、3、5、6)以及具有低滴度的小/轮廓不分明的噬斑表型 (AHSV2、4、7、8、9)(AHSV7)。通过对几个噬斑纯化的分离物进行测序，测试四种良好复制的AHSV血清型(AHSV1、3、5、6)的遗传稳定性。此时由于高遗传多样性而排除了三种分析的血清型(AHSV3、5、6)，这可能使单基因组来源的RG系统的开发复杂化。选择一种噬斑纯化的AHSV1作为最有前景的RG候选物，因为该毒株已表现出高滴度(5×10⁸PFU/ml)、大的均匀噬斑表型和通过对所有10个片段测序所揭示的单一代表性克隆。

通过序列非依赖性方法进行10个AHSV1RNA区段的完整拷贝的恢复。对于每个区段，产生具有精确3'末端的T7启动子来源的质粒以产生10种加帽的 T7RNA转录物。将VP1、VP3、VP4、VP6、VP7和NS1、NS2的蛋白质编码序列用于在pCAG启动子的控制下产生表达质粒。对于相关的BTV，已证实通过一组VP1、VP3、VP4、VP6、NS1和NS2进行转染，之后在第二天进行10 种T7RNA转录物的转染足以获得有效的BTV拯救。对于ASHV1恢复，我们已测试了几种模拟初级复制复合物预形成的条件。首先，如图2A中所示进行3 到7种表达质粒的转染。在用10种加帽的T7-RNA转录物进行第二次转染后，使用琼脂覆盖的BSR单层来评估AHSV1拯救的效率。第一次转染中表达质粒的不同组合揭示了用于所有后续实验中的一组足够的5种质粒(VP1、VP3、VP4、 VP6和NS2)(图2A)。监测培养基覆盖的BSR单层的CPE以收获重组ASHV1 (recAHSV1)。在幼稚BSR细胞中扩增拯救的病毒，达到4×10⁸PFU/ml的滴度。噬斑形态类似于AHSV1亲代病毒(图2B)。在天然聚丙烯酰胺凝胶上对提取的 dsRNA的分析显示典型的AHSV1基因组dsRNA谱(图2C)。总之，有效的AHSV1 RG系统需要5种表达质粒的转染，之后10种AHSV1T7-RNA失控(run-off)转录物的转染。

互补VP6/NS4缺陷型AHSV的表达AHSV1VP6的稳定细胞系

接下来，我们的目的是开发一种缺陷型AHSV平台，以将基于病毒的实验转移到较低的防护等级(containment level)，以进行功能和结构研究。由相关BTV 反式互补VP6的能力已使得VP6缺陷型突变病毒得以开发，所述病毒能够在互补细胞系中复制，但不能在亲代BSR或昆虫KC细胞中复制。我们进一步发展了该技术，通过用pCAG-AHSV1VP6电穿孔BSR细胞并随后嘌呤霉素选择产生表达AHSV1VP6的BSR细胞系(BSR-VP6)。所选克隆以低稀释度稳定表达VP6 30次传代(图3A)。VP6缺陷型AHSV的设计与NS4ORF的破坏互补。已显示 NS4的表达对于BSR细胞中的BTV复制是不必要的。如果AHSV是这种情况，则NS4的缺失代表了额外的减毒步骤。为了构建VP6/NS4缺陷型AHSV1 (def-AHSV1)，我们在AHSV1的S9中引入了多个核苷酸变化。代替针对VP6 缺陷型BTV病毒所报告的缺失，我们已在整个S9基因中引入11个终止密码子 (TAA或TGA)，破坏了VP6和NS4的ORF，但保留了获得的S9多重终止物的长度，从而将对缺陷型AHSV1的拯救和复制的遗传压力降到最低。预计 def-AHSV1中不存在VP6可通过互补细胞系补偿。

使用BSR-VP6互补细胞系，通过5种表达质粒的转染，之后10种加帽的 T7RNA转录物的转染，恢复def-ASHV1，其中S9被S9多重终止物代替(图3B)。在第二次转染后，使用琼脂覆盖的BSR单层来评估RNA感染性，其与T7RNA 的AHSV1wt组相当(图3C)。监测培养基覆盖的BSR单层的CPE以收获重组 def-ASHV1。使用BSR-VP6细胞系对拯救的病毒进行噬斑纯化，并且一旦达到 8×10⁷PFU/ml的滴度(在互补的BSR-VP6细胞系上滴定)就扩增。噬斑形态和在天然聚丙烯酰胺凝胶上对提取的dsRNA的分析显示了预计的dsRNA谱(图3C 和4B)。这些结果已确认AHSV VP6可被有效地反式互补，并且NS4对于BSR 细胞中的AHSV复制是不必要的。

嵌合AHSV粒子的有效组装需要几个区段的重配

环状病毒重配的能力提供了重新包覆保守复制酶或内核、从而产生血清型特异性粒子的可能性。此类粒子可具有广泛的应用谱，例如疫苗候选物或用于结构和分子研究的安全平台。先前已证实，仅AHSV VP2的交换可使重配的病毒滴度降低高达3log，导致受损的复制和/或粒子不稳定性。因此，我们的目的在于通过使用来自其他血清型的不同区段的组合来重新包覆def-ASHV1，以便实现用于所有其他8种AHSV血清型(2到9)的良好复制候选物。

首先，使用与序列无关的方法克隆AHSV血清型2到9的精确拷贝区段S2 (VP2)、S6(VP5)、S7(VP7)、S3(VP3)和S10(NS3/NS3A)。9种AHSV血清型的主要结构蛋白质的氨基酸序列分析揭示了预计顺序的保守性增加：最低保守的 VP2(同一性13-71％，相似性27-84％)，其次是VP5(同一性75-99％，相似性 90-99％)，其次是VP7和VP3(同一性>98％，相似性>99％)。类似于AHSV1，产生T7启动子和精确的3'末端DNA以产生T7RNA转录物。对于缺陷病毒的恢复，用AHSV1的10种T7RNA转染BSR-VP6细胞，由S9多重终止物代替 S9，并且取决于血清型，使用S2+S6、S2+S6+S7、S2+S6+S7+S3或 S2+S6+S7+S3+S10的组合来代替def-AHSV1的类似区段。对所得缺陷病毒的最终评估被选择为噬斑大小(在35℃培育2-3天后的清楚噬斑)和在BSR-VP6细胞系上进行的噬斑纯化病毒的最终滴度(10⁷PFU/ml和更高，作为wt参考株)。选择这些要求以将任何可能的压力降到最低，以避免修饰的dsRNA基因组的重组和不稳定性。为了满足所选准则，AHSV血清型2-9已表现出不同的要求(图4A)。为了产生良好复制的def-AHSV8和def-AHSV9，需要仅2个编码外壳蛋白质VP2 和VP5的区段的重配(S2+S6)。通过3个区段(S2+S6+S7)(包括中核蛋白质VP7) 的重配，def-AHSV3和def-AHSV4的产生已成为可能。通过4个区段 (S2+S6+S7+S3)的重配产生另外三种血清型，得到def-AHSV5、def-AHSV6和 def-AHSV7。该组是通过完全替换主要结构蛋白质壳而产生的。最后，为了开发用于血清型2的良好复制的重配缺陷病毒，需要代替五个区段 (S2+S6+S7+S3+S10)以在互补BSR-VP6细胞系上实现高滴度，从而产生 def-AHSV2。如果将少于上文所示的区段用于重配，则对于这些缺陷病毒(AHSV2、 3、4、5、6、7)观察到差拯救效率、小噬斑表型和10⁴-10⁶PFU/ml的滴度，因此，它们被排除在后续研究之外。所有选定缺陷病毒的示意性图示汇总于图4A上。将所有9种缺陷病毒以MOI 0.1在互补BSR-VP6细胞系中传代5次，在每一步骤中确认测试的原种均不能在幼稚的BSR细胞上复制。将最初拯救的和最终第 5次传代的病毒原种用于提取dsRNA以评估重配缺陷病毒的稳定性和完整性。所有分析的病毒均已表明正确dsRNA迁移率(图4B)。另外，RT-PCR和测序也验证了所有9种def-AHSV中区段的真实性。

缺陷型AHSV不在AHSV易感细胞系中生长，但在互补细胞系中达到高滴度为了确定所产生的缺陷病毒组在互补BSR-VP6细胞中的生长动力学，我们以低MOI感染BSR-VP6细胞并在感染后24小时、48小时和72小时测量滴度。与wt AHSV1病毒类似，所有9种缺陷病毒均能够在互补的BSR-VP6细胞中复制，达到10⁷-10⁸PFU/ml范围的滴度，并在感染后2-3天形成噬斑(图5A)。

为了确认亲代def-ASHV1病毒和8种重配病毒均不能在正常细胞中生长，通过以高MOI感染3种细胞系(BSR、KC和马真皮)并在感染后24小时、48小时和72小时测量病毒滴度来评价每种失能病毒的生长动力学。所获得的结果证实这些失能病毒不能在BSR、KC(昆虫)和马真皮(马)细胞系中生长(图5B-D)。为了确保没有延迟复制，将所有def-AHSV感染的细胞(BSR、KC和马真皮)再培育7天，但没有检测到感染迹象。在该实验中使用三种wt AHSV1毒株： recAHSV1(通过RG从精确拷贝的T7-RNA获得)、wtAHSV1(来自原始AHSV1 原种的第二次BSR传代)和AHSVKC(以MOI 0.1在KC细胞中传代两次)。所有三种AHSV原种均显示类似的结果(数据未显示)，因此仅显示一种(recAHSV1) (图5)。总之，我们推断所有9种缺陷病毒均在互补细胞系中生长到高滴度(10⁷ 到10⁸PFU/ml)，但不在BSR、KC和马真皮细胞中产生粒子。这些体外结果证实这些缺陷病毒用作有前景的AHSV疫苗候选物的巨大潜力。

缺陷型AHSV1和AHSV4有效保护IFNAR-/-小鼠不受同源感染

作为原理的证据，使用def-AHSV1和重配def-AHSV4来证实小鼠模型中针对AHSV感染的保护效率。为此，用10⁶PFU的def-AHSV1和def-AHSV4将成年IFNAR-/-小鼠免疫两次。接种疫苗后没有观察到不良副作用，在免疫动物和对照动物之间体重未显示显著差异(所有组的最大变异为10％)。在第二次免疫后三周，用AHSV1和AHSV4皮下攻击免疫动物和对照动物。未接种疫苗且感染 AHSV-4的小鼠从攻击感染后第3或4天开始减轻重量，将4只动物在感染后7 天(严重重量减轻，毛发蓬乱，无反应)无痛致死，并且第8天将剩下的两只无痛致死。所有其他组的小鼠均未显示临床体征(图6A)。

在感染后3天、7天和10天测量所有小鼠的RNA血症水平。在任何模拟感染的小鼠中未检测到AHSV特异性RNA。与受AHSV1感染的小鼠相比，受 AHSV4感染的小鼠具有显著更高的AHSV RNA水平(图6B)。该数据与小鼠存活时间相关(图6A)，表明AHSV1代表毒力较小的血清型。在免疫动物组中， RNA血症的水平显著降低(图6B)。将AHSV特异性RNA分析与靶向存在于所有收集的血液样品(Ct 26-32)中的持家β-肌动蛋白基因的内部对照系统组合。

如材料和方法中所述，取脾、肝和脑组织样品用于RNA提取和定量。与先前的数据一致(图6A-B)，在AHSV4感染的小鼠的所有取样器官中测得高载量的 AHSV RNA，而AHSV1感染组在分析的器官中表现出较低到无的水平的AHSV RNA。在同源AHSV攻击之前用def-AHSV1和def-AHSV4接种导致小鼠器官中AHSV RNA水平的显著降低(图6C)。

用于本研究中的保护指标包括体重测量、存活时间、血液和组织RNA血症。用AHSV1和AHSV4感染的未免疫小鼠显示出可检测的RNA血症水平，但与 AHSV4相比，受AHSV1感染的小鼠没有死亡和重量减轻。为此，已选择RNA 血症作为主要保护指标来分析疫苗候选物的效力。

矮种马中的单血清型和混合剂接种

我们评价了这些缺陷病毒在AHSV天然宿主(例如矮种马)中的保护功效。测试血清型AHSV4的一种单血清型可进入复制失败型(Entry Competent Replication-Abortive)(ECRA)病毒株(正式称为DISC)(ECRA.A4)疫苗和血清型1、 4、6和8的一种多价混合剂(ECRA.A1/4/6/8)疫苗并用强毒AHSV4攻击矮种马。 S9中多个终止密码子的细节示于图11中。

为了评估ECRA.AHSV菌株对马中AHSV4感染的保护功效，用1×10⁷PFU (ECRA.A4，A组)或总共4×10⁷PFU的混合剂(ECRA.A1/4/6/8，B组)(各自具有 1×10⁷PFU def-AHSV)将两组(A和B)矮种马免疫两次。将未感染的细胞裂解物接种到对照动物(C组)。由于对动物数目的限制(10只矮种马)，因此在该研究中仅测试了一种混合剂。在第0天进行第一次疫苗接种(“初次”)，在第21天接种相同剂量用于加强疫苗接种(“加强”)，然后在第36天用强毒AHSV4攻击动物。定期收集血液样品，以监测C组(对照动物)第0天到第44-46天以及除动物A4和 B4以外的每只接种疫苗的动物从第0天到第60天的病毒载量和中和抗体产生。针对可能长期持续的病毒血症，对两只动物进行长达102天的监测。监测在试验期间怀孕的矮种马B4的病毒复制直到小马驹出生。

从第0天到第35天对接种疫苗的矮种马进行常规监测，并且如所预计的，与对照动物相比，均未显示AHSV临床反应(图7A和图7B)。因此，ECRA.AHSV 疫苗株未在动物中诱导不利作用。还通过RT-PCR监测动物血液样品的病毒复制。如图7B中所示，从第0天到第35天，病毒RNA在两组中在接种疫苗的动物中均未检测到或以非常低的水平存在，并且等同于对照动物。数据表明在两个剂疫苗接种后不存在病毒复制。

首先通过标准AHSV组特异性VP7抗原ELISA测试监测矮种马中 ECRA.AHSV毒株的抗体应答的发展。甚至在第一剂疫苗接种后，疫苗在动物中诱发免疫应答，其在第二次接种疫苗后进一步增强(图8)。如所预计的，两只对照动物(C1和C2)的血清没有VP7抗体，而A组和B组的所有接种疫苗动物在第28天和第35天(分别在加强注射后7天和14天)均经过血清转化并且可检测到高水平的针对VP7的抗体(图8)。

通过相对于对照动物确定接种疫苗动物的中和抗体滴度来进一步分析免疫应答(表1)。在第35天(攻击前)通过噬斑减少测定测试针对疫苗制剂中包含的所有血清型的中和。在第21天收集的血清样品具有非常低的(如果有的话)针对可检测的任何血清型的中和抗体(NA)滴度(数据未显示)。然而，在所有ECRA.A4 单价接种动物的第35天(加强疫苗接种后两周)收集的血清具有针对AHSV4的 NA滴度(16-64)(表1)。接种混合剂疫苗的B组中的所有动物都具有针对存在于疫苗混合剂中的所有4种血清型的NA。大多数具有强NA滴度(16-64)，而一些矮种马则产生针对一些血清型(例如，AHSV6和8)高达128的NA滴度(表1)。

因此，新开发的疫苗在接种疫苗的宿主中是非复制型的，并且可产生有效的中和抗体应答。此外，混合剂接种允许产生针对所有四种血清型的中和抗体。

攻击后的中和抗体产生和临床保护

为了确定疫苗的保护功效，在加强疫苗接种后两周，仅用2×10⁶TCID₅₀的强毒AHSV4攻击对照动物和接种疫苗的动物，因为它被认为是最致病的。监测每只动物的免疫应答和临床体征。在A组和B组动物中，在第44天(攻击后8天) 通过SN测定检测到高滴度的针对AHSV4的中和抗体，并且3只矮种马的滴度高达256(表2)。还在B小组的2只矮种马中针对AHSV6以及在3只矮种马中针对AHSV8检测到高达32的中和抗体滴度。在攻击后24天(第60天)，在两组的所有动物中仍然可检测到高滴度的针对AHSV4的中和抗体，推测归因于由攻击病毒触发的记忆应答。诱发针对AHSV6和AHSV8的中和抗体的B组矮种马还在第60天维持中和抗体产生(表2)，表明疫苗菌株无论是单独使用还是以混合物形式使用，均在天然宿主中有强免疫应答。

在对照动物C1和C2中未检测到中和抗体(表2)。如所预计的，两只对照动物在受到毒性病毒攻击后不久(6到7天)均开始显示临床体征，有冷漠、体温过高和呼吸窘迫、眼睑和眶上窝水肿以及鼻涕。分别在攻击后10天(C2)和11天(C1) 将这些动物无痛致死(图9B)。对两只对照动物进行的尸检突显出明显的肺水肿以及心包和胸腔积液，这与AHSV感染一致。相比之下，来自A组和B组的接种疫苗动物未显示出临床体征(分别为图9A的上图和中图)。仅一只接种疫苗的动物A2显示轻微的循环(眼睑水肿、鼻涕和中度呼吸困难)和呼吸症状持续仅两天(攻击后6到8天)(图9A，上图)。这可能归因于较低的中和抗体滴度(表2)。

通过RT-PCR在攻击后的血液样品中监测病毒复制。对照组的两只动物均显示在攻击后4天的高病毒载量(Ct为26.9和27.1)并且增加直到攻击后8天(Ct为 17.5和15.6)(图10)。这些数据与临床监测期间观察到的严重症状一致(图9A下图和图9B)。对死后动物的RT-PCR分析检测到C1和C2矮种马的心、脾和肝中存在AHSV4RNA(Ct从14.85到20.37，数据未显示)。相反，A组和B组的所有接种疫苗的动物均显示在用强毒病毒株(Ct从31.4到37.2)攻击后2到8天非常低水平的AHSV4。对于某些动物(A4、B2和B4)，在攻击后12天可在血液样本中检测到病毒RNA(Ct从30.1到38.1，图10)，但在Vero细胞中即使传代4 次后也没有观察到CPE(数据未显示)。由于B4动物怀孕，因此这可能解释了其血液中病毒RNA与其他动物相比存在更长时间(Ct高达36，图10)。然而，小马驹没有显示出可通过RT-PCR检测到的病毒RNA。小马驹在第一次接种疫苗后第59天，据推断在345天(±7天)妊娠期后出生。值得注意的是，在妊娠的322 天(第一次接种疫苗后第36天)进行强毒病毒攻击，并且分别在妊娠的286天和 307天接种第一疫苗剂量和第二疫苗剂量。新生小马驹在初次疫苗接种后第60 天检测到AHSV母体抗体，并且完全正常且健康，没有任何AHS疾病迹象。数据表明攻击的毒力病毒没有穿过胎盘。在攻击后14天，在A组的4只动物中的一只(A4)中检测到AHSV4RNA(图10)。但没有临床症状(图9A，上图)。此外， A4矮种马的血清具有增加的针对AHSV4的中和抗体滴度水平(表2)，从第44 天(攻击后8天)的64到第60天(攻击后24天)的高达256。

总之，这些数据证实ECRA.A4和ECRA.A1/4/6/8接种的安全性以及向接种疫苗的动物提供的抵抗强毒AHSV4的临床保护。

概述

非洲马瘟病毒(AHSV)表达四种主要的结构蛋白质：外壳蛋白质(VP2和VP5)、中核VP7和亚核VP3。为了产生有效的反向遗传学(RG)系统，用于研究这些蛋白质在病毒粒子形成中的作用，我们开发了一种表达异源VP6的细胞系，用于反式互补VP6缺陷型病毒。通过引入多个终止密码子破坏AHSV的区段9中的必需复制酶VP6的ORF以及较少研究的NS4蛋白质的重叠ORF。

通过在整个S9基因中引入11个终止密码子(TAA或TGA)，我们破坏了VP6 和NS4的ORF，但保留了获得的S9多重终止物的长度，有利地，将缺陷型AHSV 的拯救和复制的遗传压力隆到最低。

同时，建立表达AHSV VP6的细胞系以在拯救多重终止物失能病毒期间提供功能性基因产物的互补。最后，在确认失能病毒平台的增殖缺陷表型后，交换编码不同血清型决定性衣壳蛋白质的病毒RNA片段以获得将覆盖AHSV的较大部分抗原空间的血清型或嵌合体。

因此，(缺乏蛋白质)的互补代表了安全的AHSV疫苗平台，其具有最小化的朝向恢复病毒毒力的遗传压力。值得注意的是，通过引入多个终止密码子来破坏AHSV区段9的ORF(例如编码VP6和NS4)，在互补细胞系中的传代未揭示突变S9将恢复任何突变ORF的变化。此外，我们的结果已证实，所有9种ASHV 失能性病毒均能够以接近wt AHSV的滴度在互补细胞系中复制。同时，所有缺陷病毒在哺乳动物和昆虫来源的其他测试细胞系中均失能。

因此，我们的方法和产生的分离的ssRNA/疫苗株提供了优异、安全且有效的AHSV疫苗。实际上，我们评价了这些缺陷病毒在AHSV天然宿主(例如矮种马)中的保护功效。测试了一种单血清型(ECRA.A4)疫苗和一种多价混合剂 (ECRA.A1/4/6/8)疫苗，并用强毒AHSV4攻击矮种马。所有接种疫苗的矮种马均受到保护，并且没有产生AHS的严重临床症状。此外，接种多价混合剂的矮种马产生针对混合剂中存在的所有血清型的中和抗体，并且在试验期间出生的矮种马驹是健康的且没有病毒血症。这些结果验证了这些ECRA毒株作为用于 AHSV的新一代疫苗的适合性。

参考文献

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23.Kaname Y,Celma CC,Kanai Y,Roy P.2013.从合成的RNA恢复非洲马瘟病毒(Recovery of African horse sickness virus from synthetic RNA).J Gen Virol 94:2259–2265.

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表1

表2

序列表

<110> 伦敦卫生及热带医学学院

<120> 呼肠弧病毒科疫苗

<130> 0241P/WO

<150> GB1607196.1

<151> 2016-04-26

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1169

<212> DNA

<213> 非洲马瘟病毒

<400> 1

gttaaataag ttgtctcatg tcttcggcat tactcctcgc acctggcgat ctaatcgaaa 60

aagcaaagcg cgagctcgag cagcgctcga taactccgct cttgcgggag aaaaaatcga 120

aagaagccaa atctaaatta aaagaagatg gggagaagaa gaacaagagt gaagaggaaa 180

agaacaaaat acgtgatgat cgaagagtgg agagccagaa atctgaggga ggcggatcag 240

ccgattgtca acgcggcgca ggaagcgcag gagcaaattg cgcaacataa acataaggat 300

aagtggaagt gcaggagcaa ggaccggggt tgaagaggga ggagtgggag aagcggattc 360

gagatctgga ggacattgat aataaggtgc agcctcggat ggaaagggag tgggtaaatc 420

taagaccgga gtagatcgtg tcgctaatga tgatgcaaca cgcaatgttg gttccagtga 480

ggtatcatct ggtggaatca cttcaggagg tcttcaaggc cgaggaggac tcgttgcaaa 540

gagtagtgaa tgtggcgggg aaccattgga taggacaggc ggccgcagct gaaattgata 600

aacttgagga gaggaggcaa aggctggagg gggcgataga cggattggag gattagctac 660

gcaggagatt gccgactttg tgaagaagaa gatcggagtt gaagttcagg tcttttccaa 720

aggaatgacc aacttattta ctgtagataa atcattgctt gagcgggatg ggttagggag 780

ggaggacatt ctacatcaat cagatattgt aaaagagatt agagtaagtg ataaaaaagt 840

caagattatt cctctttcta cagtgaagag ataataagcg gaattcggag gaacagagga 900

ggatgaaatc aaagttgttc aaactcaaag ctcttctatc aggtatatta gtaatagaat 960

ggaagatgtt ttaagggcga aggcgatgtt cacagcgccg acaggtgatg aggggtggaa 1020

ggaggttgct aaagcagcga ctcagcgtcc taacatcatg gcgtatgtgc acgaagggga 1080

aggcgatgga ttgaaagagc ttttacattt gattgatcat atctaggtcc aggggtaaac 1140

ggcagcttga gggcaactta aaaacttac 1169

Claims

1.一种来源于非洲马瘟病毒(AHSV)的基因组的分离的病毒ssRNA，其中所述ssRNA包含所述病毒的S9区段的至少一部分并且在其中具有所述病毒的S9区段中的多个突变，并且进一步其中每个突变，至少在被引入所述ssRNA中后，提供或编码终止密码子，所述突变破坏所述S9区段中对所述病毒具有致病性所必需的至少VP6和NS4的功能。

2.根据权利要求1所述的分离的病毒ssRNA，其中所述突变在核苷酸 288-877处或之间引入。

3.根据权利要求1或2所述的分离的病毒ssRNA，其中所述突变在选自包括以下的组的一个或多个下列核苷酸位点处或之间引入：288-304；377-386； 590-608；和872-877。

4.根据权利要求3所述的分离的病毒ssRNA，其中至少一个突变被引入每个核苷酸位点。

5.根据权利要求3所述的分离的病毒ssRNA，其中将至少下列突变引入每个核苷酸位点：

a.288-304处或之间的至少3个突变；

b.377-386处或之间的至少3个突变；

c.590-608处或之间的至少3个突变；

d.872-877处或之间的至少2个突变。

6.根据权利要求5所述的分离的病毒ssRNA，其中在位点288-304处或之间引入又一移码突变，所述又一移码突变至少在被引入所述ssRNA中后，编码破坏 NS4的功能的终止密码子。

7.一种细胞，其表达AHSV的S9区段的至少一个必需基因并且互补根据权利要求1-6中任一项所述的ssRNA中突变的所述必需基因，从而使得疫苗病毒株能够在所述细胞被所述ssRNA感染时在所述细胞中复制。

8.根据权利要求7所述的细胞，其被根据权利要求1-6中任一项所述的 ssRNA感染。

9.一种疫苗病毒株，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的分离的病毒 ssRNA。

10.根据权利要求9所述的疫苗病毒株，其中所述疫苗病毒株是血清型特异性的，因此包括下列中的任一种：AHSV1、AHSV2、AHSV3、AHSV4、AHSV5、 AHSV6、AHSV7、AHSV8和AHSV9。

11.根据权利要求10所述的疫苗病毒株，其包括多种所述血清型。

12.根据权利要求10所述的疫苗病毒株，其包括所有AHSV1-9。

13.根据权利要求10-12中任一项所述的疫苗病毒株在制备用于抵抗非人动物中AHSV感染的疫苗中的用途。

14.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的病毒ssRNA在制备用于抵抗非人动物中AHSV感染的疫苗中的用途。

15.一种药物组合物，其包含根据权利要求10-12中任一项所述的疫苗病毒株与药学上可接受的载体、佐剂或媒介物的组合。

16.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的分离的病毒 ssRNA与药学上可接受的载体、佐剂或媒介物的组合。

17.一种组合治疗剂，其包含根据权利要求15或16所述的药物组合物和一种或多种另外的抗病毒剂。

18.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的分离的ssRNA和根据权利要求7-8中任一项所述的细胞。

19.一种用于产生给定血清型的缺陷型AHSV病毒的方法，其包括：

a)在所述病毒的S9区段中引入多个突变，其中每个突变，至少在被引入所述ssRNA中后，提供或编码终止密码子，所述突变破坏所述S9区段中对所述病毒具有致病性所必需的至少一种必需基因的功能；和

b)还使下列所选片段重配或交换以产生下列血清型：

使编码外壳蛋白质VP2和VP5的两个区段(S2+S6)重配以产生def-AHSV8 和def-AHSV9血清型；和/或

使编码外壳蛋白质VP2和VP5的两个区段(S2+S6)和编码中核蛋白质VP7 的区段(S7)重配以产生def-AHSV3和def-AHSV4；和/或

使编码外壳蛋白质VP2和VP5的两个区段(S2+S6)和编码中核蛋白质VP7 的区段(S7)以及编码中核蛋白质VP3的区段(S3)重配以产生def-AHSV5、 def-AHSV6和def-AHSV7；和/或

使编码外壳蛋白质VP2和VP5的两个区段(S2+S6)和编码中核蛋白质VP7 的区段(S7)和编码中核蛋白质VP3的区段(S3)以及编码NS3/NS3A的区段(S10) 重配以产生def-AHSV2。