JP2019514366A - レオウイルス科ワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、複数の変異を含む単離アフリカ馬疫ウイルス（ＡＨＳＶ）ｓｓＲＮＡ；前記ｓｓＲＮＡからワクチン用ウイルス株を複製するための相補細胞；前記ｓｓＲＮＡに由来するワクチン用ウイルス株；ＡＨＳＶによる感染に対する動物のワクチン接種における前記ワクチン用ウイルス株および／または単離ｓｓＲＮＡの使用；それらを含むワクチン接種の方法；ならびに前記ワクチン用ウイルス株および／または前記単離ｓｓＲＮＡを含む医薬組成物に関する。【選択図】図７Ａ

Description

本発明は、複数の変異を含む単離アフリカ馬疫ウイルス（ＡＨＳＶ）ｓｓＲＮＡ；前記ｓｓＲＮＡからワクチン用ウイルス株を複製するための相補細胞；前記ｓｓＲＮＡに由来するワクチン用ウイルス株；ＡＨＳＶによる感染に対する動物のワクチン接種における前記ワクチン用ウイルス株および／または単離ｓｓＲＮＡの使用；それらを含むワクチン接種の方法；ならびに前記ワクチン用ウイルス株および／または前記単離ｓｓＲＮＡを含む医薬組成物に関する。

ブルータングウイルス（ＢＴＶ）、流行性出血熱ウイルス（ＥＨＤＶ）およびアフリカ馬疫ウイルス（ＡＨＳＶ）などの密接に関連するオルビウイルス（レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリー）のうち、最後のウイルスは感染した動物において最も重篤な罹病率および死亡率を引き起こすことが知られている。感染しやすいウマにおいて、ＡＨＳＶは、軽度の発熱から、死亡率が９５〜１００％に達する急性発熱に及ぶ様々な形態の疾患を引き起こし得る。ＡＨＳＶはサハラ以南のアフリカでの地域流行病であるが、北アフリカ、パキスタン、インド、スペインおよびポルトガルでも時折発生が報告されており、これらの発生は重大な社会的および経済的影響を与えてきた。上記３種のオルビウイルスは、ヨーロッパおよび米国全土にわたって確認されているクリコイデス（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ）属のユスリカによって伝染されるので、実際、ＢＴＶおよびＥＨＤＶについて報告されているように、ＡＨＳＶ発生の地理的リスクの可能性が増大している。

ＡＨＳＶのゲノム配列は、ＢＴＶおよびＥＨＤＶとは異なる。ＡＨＳＶウイルスの９種の血清型、ＡＨＳＶ１〜ＡＨＳＶ９だけが同定されている。現在、アフリカでは、弱毒化多価生ＡＨＳＶワクチン（ＬＡＶ）によるワクチン接種を使用して疾患をコントロールしている。しかし、このワクチンは、有害な副作用のため安全ではないと考えられている。このワクチンはウイルス血症を引き起こし、また、野生分離株と再集合する可能性もあることから、新しいウイルス血清型に未感作の地理的場所に導入することにはリスクがある。

したがって、合理的に設計された安全なＡＨＳＶワクチンが必要とされている。困難なことには、安全なワクチンの開発において見込まれる課題はこの特性に不可欠なものであり、安全で効果的なワクチンの調製が必要であるだけでなく、ワクチンは次のようでなければならない：（ｉ）技術的にシンプルで再現可能である、これは生産のスケールアップにおいて重要である；（ｉｉ）コスト効率が良い、これは、細胞１個当たりで産生されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）の数、ワクチンの異種性、ならびに後処理プロセスの容易性に直接依存する。残念なことに、精製されたタンパク質に基づくサブユニットワクチンは、一般に、十分かつ長期間の防御は提供せず、さらに生産するのにコストがかかる。

ＡＨＳＶは、１０個の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）セグメント（Ｓ１〜Ｓ１０）を含有する非エンベロープウイルスである。外殻は、２つの主要な構造タンパク質ＶＰ２およびＶＰ５を含有してなる。血清型決定ＶＰ２は、最も可変性のウイルスタンパク質であり、防御免疫応答の主要な標的である。コア粒子は、２つの同心円状の層：表面ＶＰ７層および内部ＶＰ３層からなり、これらは１０個のｄｓＲＮＡならびに複製酵素ＶＰ１、ＶＰ４およびＶＰ６の複合体を封入している。ＢＴＶ１０のカプシドタンパク質ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ５およびＶＰ７の配列とＥＨＤＶ１およびＡＨＳＶ４の配列とを比較することによって、これらのウイルス間の密接な関係が明らかになった。内部コアタンパク質ＶＰ３およびＶＰ７は最も保存されているが、最も外側のタンパク質ＶＰ２およびＶＰ５は最も可変性であった。ＢＴＶに関するこれまでの構造研究ではＢＴＶ粒子組織体の詳細が明らかにされているが、現在、ＡＨＳＶについてはＶＰ７の（トップ）ドメインの構造しか報告されておらず、したがって、ＡＨＳＶウイルス機能の解析およびその後の合理的な構造をベースとしたワクチン設計はＡＨＳＶについてはできていない。

過去１０年間、逆遺伝学（ＲＧ）技術は、ウイルスの複製および病原性の理解に革新をもたらし、ワクチン技術の開発に大いに寄与した。しかし、野生型ＡＨＳＶ株に対するＲＧ技術は開発されてきたが、レスキューウイルス産生の効率を増大させるためにはかなりの改善が必要とされている。

本明細書において、本発明者らは、変異した、複製能力があり増殖不可能なウイルス粒子の作製を開示する。特に、相補細胞株における継代は、任意の変異ＯＲＦを復元する、変異セグメントにおける変化を示さなかった。さらに、複製効率は野生型（ｗｔ）ＡＨＳＶに近かったため、ワクチン開発における実質的なタンパク質レベルが得られた。したがって、これは、安定性があり優れた効率的なワクチン療法である。

原理の証拠として、ＩＦＮＡＲ−／−のマウスに前記ワクチンを接種し、ＡＨＳＶの２つの毒性株でチャレンジしたところ、同種感染に対する効率的な防御を示した。さらに、ＡＨＳＶ天然宿主のワクチン接種、例えば、単一血清型（ＥＣＲＡ．Ａ４）ワクチンと１つの多価カクテル（ＥＣＲＡ．Ａ１／４／６／８）ワクチンを接種したポニーは、毒性ＡＨＳＶ４に対する防御を示した。さらに、多価カクテルワクチン接種したポニーは、カクテル中に存在するすべての血清型に対する中和抗体を産生し、治験中に誕生した仔ウマは健康であり、ウイルス血症もみられなかった。これらの結果は、ＡＨＳＶに対するワクチンとしての技術の適合性を証明している。

発明の記述
本発明の第１の態様によれば、アフリカ馬病ウイルス（ＡＨＳＶウイルス）のゲノムに由来する単離ウイルスｓｓＲＮＡであって、ｓｓＲＮＡが前記ウイルスのＳ９セグメントの少なくとも一部を含み、その中に前記ウイルスのＳ９セグメント内の複数の変異を有し、それぞれの変異が、少なくとも前記ｓｓＲＮＡに導入された後に、終止コドンを提供またはコードする、単離ウイルスｓｓＲＮＡを提供する。

多くのウイルスが多数の異なる血清型を有する。例えば、ＡＨＳＶは、９種の異なる血清型を有する。異なる血清型はわずかに異なる表面タンパク質を有し得る。またそれらのそれぞれのゲノムに含有されている遺伝子の数がさらに異なることもあり得る。さらに、今後、まだ未発見の血清型が発見されると思われる。したがって、本発明は、ＡＨＳＶの任意の可能性のある血清型を包含するものとする。さらに、本発明は、ＡＨＳＶ血清型の任意の可能性のある組み合わせも包含するものとする。

当業者には理解されるように、本明細書における終止コドンの言及は、メッセンジャーＲＮＡ内のヌクレオチドトリプレットであって、前記ＲＮＡのアミノ酸配列によってコードされているタンパク質の翻訳の終止をシグナル伝達するヌクレオチドトリプレットを意味する。限定されるものではないが、これには、ＲＮＡの周知の終止コドン、すなわちＵＡＧ、ＵＡＡまたはＵＧＡが包含される。したがって、Ｓ９セグメントのｓｓＲＮＡ中のいずれか１つのそのような終止コドンの産生によって、翻訳とそれによりコードされているタンパク質の産生が終止する。あるいは、当業者には知られているように、終止コドンは、フレームシフト変異の結果として導入することができ、その場合、１または２個のヌクレオチドの導入／欠失によってｓｓＲＮＡのリーディングフレームにシフトが起こり、結果として、その後終止コドンが生じる。

またさらなる好ましい実施形態において、前記変異は、少なくとも１つの必須遺伝子の機能を破壊する。

本明細書における用語「必須遺伝子」の言及は、ウイルスが病原性であるために必須である遺伝子を意味し、必須遺伝子の機能が破壊されるような場合、得られるワクチン用ウイルス株は非病原性である。これはワクチン生成における必要な要件である。変異が任意の必須遺伝子中にあってもよく、前記変異が導入された後、非病原性表現型に変換されているウイルスがもたらされる。

好ましくは、変異は、酵素タンパク質、例えば、ウイルスのポリメラーゼ、ヘリカーゼまたはキャッピング酵素に導入される。あるいは、任意の非構造タンパク質を不活性化することができる。この場合、必須遺伝子は、好ましくはＳ９セグメントによってコードされているもの、例えば限定するものではないがＶＰ６およびＮＳ４などである。

さらに好ましい実施形態において、変異は、１つ以上の必須遺伝子の機能が破壊されるようなものである。これは、ウイルスが病原性表現型に戻ることがないようにするのに役立つ。最も好ましくは、前記変異は、少なくともＶＰ６およびＮＳ４の機能を破壊する。

またさらなる好ましい実施形態において、前記変異は、Ｓ９セグメントのヌクレオチド２８８〜８７７にまたはその間に導入される。好ましくは、前記変異は、２８８〜３０４；３７７〜３８６；５９０〜６０８；および８７２〜８７７を含む群またはそれからなる群から選択されるヌクレオチド部位の１つもしくは複数にまたはその間に導入される。より理想的には、少なくとも１つの変異が前記ヌクレオチド部位のそれぞれに導入され、理想的には、複数の変異が前記ヌクレオチド部位のそれぞれに導入される。またより理想的には、少なくとも以下の変異が前記ヌクレオチド部位に導入される：
ａ．部位２８８〜３０４にまたはその間における少なくとも３つの変異；
ｂ．部位３７７〜３８６にまたはその間における少なくとも３つの変異；
ｃ．部位５９０〜６０８にまたはその間における少なくとも３つの変異；および、
ｄ．部位８７２〜８７７にまたはその間における少なくとも２つの変異。

より理想的には、追加的または代替的に、フレームシフト変異が、ＮＳ４の機能を破壊する、部位２８８〜３０４にまたはその間に導入される。

図１１に示したように、本発明者らは以下の置換を使用した：
２８９でのＣからＡ；
２９４でのＧからＴ；
２９５でのＧからＡ；
３００でのＧからＴ；
３０１でのＧからＡ；
３７８でのＧからＴ；
３８１でのＧからＴ；
３８２でのＧからＡ；
３８４でのＣからＴ；
３８６でのＧからＡ；
５９１でのＧからＴ；
５９８でのＣからＧ；
６００でのＡからＴ；
６０６でのＧからＴ；
６０７でのＡからＧ；
６０８でのＧからＡ；
８７３でのＡからＴ；
８７４でのＴからＡ；
８７５でのＧからＡ；
８７６でのＡからＴ；および、
８７７でのＴからＡ。

したがって、好ましい実施形態において、本発明は、複数の終止コドンを生じる上記の複数の終止変異の、すべての組み合わせおよび任意の組み合わせを含む、いずれか１つまたは複数の使用に関する。当業者であれば、同様の技術的効果を有する他の置換もまた本発明の実施に使用できることは理解されよう。

したがって、本発明者らは、ＶＰ６およびＮＳ４のＯＲＦは破壊するが、得られたＳ９ ｍｕｌｔｉｓｔｏｐの長さは保持しているため、欠損ＡＨＳＶ、理想的には株ＡＨＳＶ１のレスキューおよび複製に対する遺伝的圧力を最小限にする、Ｓ９遺伝子全体にわたる複数の（典型的に１１個の）終止コドン（典型的にはＴＡＡまたはＴＧＡ）の導入または提供を行った。本発明は、本明細書においては、１１個の終止コドンを使用して実施されているが、当業者には、より多数もしくは少数で使用することができること、また、本発明者らはＴＡＡおよびＴＧＡを理想的に使用したが、終止コドンは任意のタイプであり得ることが理解されよう。

実際、最も好ましい態様であるのは、本発明が、配列番号１を有するｓｓＲＮＡ、または優先順位の低い順にそれらと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含むことである。

本発明の第２の態様によれば、ＡＨＳＶのＳ９セグメントの少なくとも１つの必須遺伝子を発現し、本明細書に記載されているｓｓＲＮＡ中の変異した前記必須遺伝子（複数可）を相補する細胞であって、それにより、ｓｓＲＮＡに感染させた場合に、細胞におけるワクチン用ウイルス株の複製が可能である、細胞が提供される。

最も好ましくは、前記細胞は、前記変異（複数可）を有する前記必須ウイルス遺伝子（複数可）の機能を相補することによって、ワクチン用ウイルス株が細胞内で複製され得る。当業者には理解されるように、ｓｓＲＮＡは、前記必須遺伝子（複数可）の機能が破壊されるように変異している。前記必須ウイルス遺伝子（複数可）の機能を相補する細胞を有することにより、前記必須遺伝子（複数可）によって産生されるタンパク質は、ウイルスのｓｓＲＮＡからではなく、細胞ｍＲＮＡから発現され、それでこの遺伝子の機能は細胞によって相補される。このことによって、ウイルスの複製または繁殖に必要なすべての必須タンパク質が細胞内に存在することが確実となる。したがって、ワクチン用ウイルス株は、細胞内で自由に複製することが可能である。しかし、ワクチン用ウイルス株が相補細胞以外の細胞に感染した場合には、前記必須遺伝子（複数可）のタンパク質産物は存在せず、そのため、ワクチン用ウイルス株は繁殖できない。ワクチン用ウイルス株は、例えば、ワクチン接種した宿主において、一回の複製サイクルを経る。

好ましい実施形態において、前記細胞は、ｓｓＲＮＡをトランスフェクトされ、ウイルス株を培養するのに適した任意の細胞であってよい。細胞は、ウイルス許容細胞である。好ましくは、細胞は、ＢＨＫ２１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、２９３Ｔ細胞、ＢＳＲ細胞（特定のＢＨＫ２１細胞のクローン）、ＨｅＬａ細胞、Ｃ６／３６細胞（ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来の蚊の細胞株）、またはＫＣ細胞（天然昆虫ベクター、クリコイデス・ソノレンシス（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）由来のユスリカ細胞株）である。より好ましくは、細胞はＢＳＲ細胞である。

本明細書における用語「ワクチン用ウイルス株」の言及は、通常、野生型ウイルスに罹患する宿主を免疫するためのワクチンに使用するのに適したウイルス株を意味する。ワクチン用ウイルス株は、非病原性であり感染を引き起こすことができないものである。したがって、これは、野生型ウイルスに通常伴う疾患を引き起こさない。ワクチン用ウイルス株の概念は、当業者に周知である。例えば、野生型ウイルスは、弱毒化または不活化ウイルスで免疫された宿主において、悪化した感染を引き起こすことなく免疫応答を生じるように、弱毒化または不活化され得る。これによって、その後、宿主が野生型ウイルスに曝露されたとしても、宿主は効果的な免疫応答を獲得することができる。

したがって、本明細書で開示されているｓｓＲＮＡに感染した細胞も提供する。

本発明の第３の態様によれば、本明細書に開示されている単離ｓｓＲＮＡを含むワクチン用ウイルス株が提供される。

より好ましくは、前記ワクチン用ウイルス株は血清型特異的であり、そのため、ＡＳＨＶ１、ＡＨＳＶ２、ＡＨＳＶ３、ＡＨＳＶ４、ＡＨＳＶ５、ＡＨＳＶ６、ＡＨＳＶ７、ＡＨＳＶ８およびＡＨＳＶ９のいずれか１つを含む。より理想的には、前記ワクチン用ウイルス株は、ＡＨＳＶ１〜９の任意の組み合わせを含み、ＡＨＳＶ１〜９のすべてを含む、複数の前記血清型を含む。

当業者には、異なる血清型を使用することにより、本発明のワクチンがそれぞれのウイルス株に対して最大限の防御を提供することができることは理解されよう。そのウイルス株の毒性は変化し得る。例えば、ＡＨＳＶ４は、ＡＨＳＶ１よりもマウスモデルにおいて毒性がより高く、そのため、ＡＨＳＶ４株は、本発明のワクチンにおいてＡＨＳＶ１などよりもより好ましい可能性がある。

したがって、本発明者らの技術を使用し、本発明者らは、すべてのＡＨＳＶ血清型由来のカプシドタンパク質を用いて複製能力があり繁殖不可能なウイルス粒子を創製した。さらに、本発明者らは、相補細胞株において高力価のこれらの粒子を産生した。特に、相補細胞株における継代は、任意の変異ＯＲＦを復元する変異Ｓ９における変化は示さなかった。さらに、複製効率は野生型ＡＨＳＶに近かったため、ワクチンを開発するための実質的なタンパク質レベルが得られた。したがって、これは、安定性があり優れた効果的なワクチン療法である。

本発明の第４の態様によれば、治療において使用するための、本明細書に開示されている単離ｓｓＲＮＡ、または単離ｓｓＲＮＡを含むワクチン用ウイルス株が提供される。より好ましくは、前記単離ｓｓＲＮＡまたはワクチン用ウイルス株は、非ヒト動物にＡＨＳＶに対するワクチン接種をするために使用される。

本発明の第４の態様の好ましい実施形態において、前記非ヒト動物は、ウマ、ポニー、ラバ、ロバまたはシマウマを含む群またはそれらからなる群から選択される。

本発明の第５の態様によれば、本明細書に開示されている単離ウイルスｓｓＲＮＡまたは単離ｓｓＲＮＡを含むワクチン用ウイルス株を、薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルと組み合わせて含む、医薬組成物を提供する。

組成物は、理想的には滅菌されており、治療有効量の単離ｓｓＲＮＡまたはワクチン用ウイルス株を対象への投与に適した重量単位または容量単位で含有していなければならない。用語「薬学的に許容される」とは、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げない非毒性物質を意味する。用語「生理学的に許容される」とは、生物系、例えば、細胞、細胞培養物、組織または生物などと適合する非毒性物質を意味する。

投与用の製剤としては、経口投与、直腸内適用、経鼻投与、気管支（吸入）投与、局所投与（目薬、頬側投与および舌下投与を含む）、膣内投与または非経口投与（皮下投与、筋内投与、腹腔内投与、静脈内投与および皮内投与を含む）に適したものが挙げられ、薬学の分野において周知の任意の方法によって調製することができる。

好ましい投与経路は、静脈内投与、非経口投与、経口投与、経鼻投与、気管支投与または局所投与用に処方された治療薬を意味する。

組成物は、本発明の単離ｓｓＲＮＡまたはワクチン用ウイルス株と担体とを会合させることにより調製することができる。一般に製剤は、活性剤を、液体担体または細かく粉砕した固体担体またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで必要に応じ、生成物を成形することによって調製する。本発明は、本発明の単離ｓｓＲＮＡまたはワクチン用ウイルス株を、薬学的にまたは獣医学的に許容される担体またはビヒクルと組み合わせてまたは会合させることを含む、医薬組成物の調製方法に及ぶ。

本発明における経口投与用の製剤は、それぞれ所定量の活性薬剤を含有するカプセル、サッシェもしくは錠剤などの個別単位として；粉末もしくは顆粒として；水性液体もしくは非水性液体中の活性剤の溶液もしくは懸濁液として；または水中油型液体エマルジョンもしくは油中水型液体エマルジョンとして；またはボーラスなどとして調製することができる。

経口投与用の組成物（例えば、錠剤およびカプセル剤）に関して、用語「許容される担体」としては、一般的な賦形剤などのビヒクル、例えば結合剤、例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースおよびデンプン；充填剤および担体、例えばコーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸；ならびに滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウムおよび他の金属ステアリン酸塩、ステアリン酸グリセロール、ステアリン酸、シリコーン流体、タルクワックス、油ならびにコロイド状シリカが挙げられる。香味剤、例えばペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリー香料なども使用することができる。投薬剤形を容易に識別できるように、着色剤を添加することが望ましい場合がある。また錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングされていてもよい。

錠剤は、圧縮または成形により、任意選択で１種または複数の副成分とともに製造することができる。圧縮錠剤は、粉末剤または顆粒剤などの自由流動形態の活性剤を、任意選択で結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤または分散剤と混合して、適切な機械で圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を適切な機械で成形することによって製造することができる。錠剤は、任意選択でコーティングしても刻み目を入れてもよく、活性剤の徐放または制御放出を提供するように製剤化することができる。

経口投与に適した他の製剤としては、香味基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に活性剤を含むロゼンジ；不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア中に活性剤を含む香錠；ならびに適切な液体担体中に活性剤を含むうがい薬が挙げられる。

皮膚への局所適用については、製剤は、クリーム、軟膏、ゼリー、溶液または懸濁液などを製造することができる。薬物に使用することができるクリーム剤または軟膏剤は、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａのような医薬品の標準的な教科書に記載されているような、当技術分野で周知の従来の製剤である。

本発明の組成物は、例えば、薬理学的活性成分を粉末の形態で、または溶液もしくは懸濁液の点滴形態で分散させることが可能なエアロゾルもしくはスプレーの鼻、気管支もしくは頬側投与による気道の処置に使用することができる。粉末分散特性を有する医薬組成物は、通常、活性成分に加えて、沸点が室温より低い液体噴射剤、また所望により補助剤、例えば液体もしくは固体の非イオン性もしくはアニオン性界面活性剤および／または希釈剤などを含有する。薬理学的有効成分が溶液中にある医薬組成物は、これに加えて、適切な噴射剤、さらには、必要に応じて、追加の溶媒および／または安定剤を含有する。噴射剤の代わりに圧縮空気を使用することも可能であり、必要に応じて適切な圧縮および膨張デバイスによってこれを製造することができる。

非経口製剤は、一般に滅菌される。

治療的に有効な本発明の単離ｓｓＲＮＡまたはワクチン用ウイルス株の正確な量、およびそれが最良で投与される経路は、ワクチンの組織レベルを、治療効果を有するのに必要とされる濃度と比較することにより当業者によって容易に決定される。

本発明の第６の態様によれば、本発明による医薬組成物および１つまたは複数の異なる追加の抗ウイルス剤を含む、組み合わせ治療薬が提供される。

追加の抗ウイルス剤は従来から知られていることは、当業者には理解されよう。

本発明の第７の態様によれば、ＡＨＳＶに対する非ヒト動物のワクチン接種方法であって、本明細書において定義されている単離ｓｓＲＮＡまたは前記単離ｓｓＲＮＡを含むワクチンウイルス株の有効量を非ヒト動物に送達または投与することを含む、方法が提供される。

本発明の好ましい方法において、前記非ヒト動物は、ウマ、ポニー、ラバ、ロバまたはシマウマを含む群またはそれらからなる群から選択される。

本発明の第８の態様によれば、本明細書において開示されている単離ｓｓＲＮＡ、およびｓｓＲＮＡ中の変異した前記必須遺伝子（複数可）を相補する細胞を含むキットを提供する。

本明細書の記載および特許請求の範囲の全体を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」およびそれらの用語の変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むがこれに限定されない」ことを意味し、また他の部分、付加物、成分、整数または工程を排除するものではない。本明細書の記載および特許請求の範囲の全体を通して、文脈に別段の要求がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、文脈に別段の要求がない限り、明細書は、複数形ならびに単数形を考慮するものとして理解されたい。

本明細書に引用されているあらゆる特許または特許出願を含むすべての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる参考文献も先行技術を構成すると認めるものでない。さらに、いずれかの先行技術が当技術分野における通常の一般的知識の一部を構成することを認めるものでない。

本発明のそれぞれの態様の好ましい特徴は、いずれかの他の態様と関連して記載されたものであり得る。

本発明の他の特徴は、以下の実施例から明白になるであろう。一般的に言えば、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲および図面を含む）に開示されている特徴の任意の新規なものまたは任意の新規な組み合わせにまで及ぶ。したがって、本発明の特定の態様、実施形態または実施例に関連して記載されている特徴、整数、特性、化合物または化学的部分は、それらと矛盾しない限り、本明細書に記載されている任意の他の態様、実施形態または実施例に適用可能であると理解されたい。

さらに、別段の記載のない限り、本明細書で開示されている任意の特徴は、同一目的または類似目的を果たす代替の特徴によって置き換えることができる。

ここで本発明を、以下の図面および表を参照しながら、単なる例示として説明する。

ＡＨＳＶ血清型の遺伝学的分析および表現型分析を示す図である。上図は、ＢＳＲ細胞の感染によって得られ４８時間インキュベートされたプラーク形態の分析を示す。下図は、大きなプラークの表現型、高力価および最小の遺伝的変異性を有する複製の良好なＡＨＳＶ血清型を選択して逆遺伝学のバックボーンとして活用する戦略を示す。 ＡＨＳＶ１に関する逆遺伝学の確立を示す図である。（Ａ）ＡＨＳＶ１の一次複製のための最小要件。ＢＳＲ細胞を、１行目に示した発現プラスミドのセットにより３つ組でトランスフェクトし、続いて、２行目に示した１０個のキャップドＡＨＳＶ１ Ｔ７−ＲＮＡ転写物（Ｓ１〜Ｓ１０）による２回目のトランスフェクションを行った。推定感染力は、２回目のトランスフェクションの４８時間後に、総Ｔ７ ＲＮＡの１μｇ当たりのＰＦＵとして示している。一番下の図は、上記のそれぞれの実験において、二度のトランスフェクションによって得られたプラークの代表的な写真である。（Ｂ）感染後４８時間でのＢＳＲ細胞に対する野生型（ｗｔ）およびレスキューされたｒｅｃＡＨＳＶ１ストックのプラークアッセイ。感染力価は、独立した５継代実験（ｗｔ ＡＨＳＶ１の場合）またはレスキュー実験（ｒｅｃＡＨＳＶ１の場合）から得られた範囲として示されている。（Ｃ）ｗｔＡＨＳＶ１およびｒｅｃＡＨＳＶ１に感染したＢＳＲ細胞から精製したゲノムｄｓＲＮＡのパターンを９％非変性ＰＡＧＥで分析した。ゲノムｄｓＲＮＡセグメントの位置は右側に示している。 ＶＰ６を発現する安定的な細胞株は、ＶＰ６／ＮＳ４欠損ＡＨＳＶ１を相補することを示す図である。（Ａ）ＡＨＳＶ１ ＶＰ６を発現する相補細胞株は、ＢＳＲ細胞のエレクトロポレーションおよびＶＰ６発現コロニーの選択によって作製した。選択したクローンを１：２０希釈で３０継代し、示した継代の同量の細胞を、ＶＰ６特異的抗体を使用するイムノブロッティングにより分析した。（Ｂ）相補介在型欠損ＡＨＳＶ１レスキューの概略図。ＢＳＲ−ＶＰ６細胞に５個の発現プラスミドのセット（ＶＰ１、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳ２）をトランスフェクトし、続いて１０個のＡＨＳＶ１ Ｔ７ ＲＮＡ転写物をトランスフェクションしたが、この場合、Ｓ９はＶＰ６／ＮＳ４発現が欠損しているＳ９ｍｕｌｔｉｓｔｏｐで置き換えられている。ＶＰ６はトランスで相補され、一度は複製されるが繁殖しない欠損ウイルスが生じた。（Ｃ）ＢＳＲ−ＶＰ６細胞に５個の発現プラスミド（それぞれ８０ｎｇ）のセットをトランスフェクトし、続いて、１０個のキャップドＡＨＳＶ１ Ｔ７−ＲＮＡ転写物の合計５０ｎｇの２回目トランスフェクションを行ったが、この場合、Ｓ９は、ＶＰ６／ＮＳ４発現が欠損しているＳ９ｍｕｌｔｉｓｔｏｐで置き換えられている。トランスフェクションしたウェルを固定し、２回目のトランスフェクションの５６時間後に染色した。モックおよびｒｅｃＡＨＳＶ１レスキューは、ｄｅｆ−ＡＨＳＶ１と同一条件での対照として使用する。 異なるセグメントの組み合わせによって得られた、ＶＰ６相補された複製の良好な欠損再集合体ＡＨＳＶバリアントを示す図である。（Ａ）選択したＡＨＳＶ２〜９の欠損再集合体の概略図。上図は、ＢＳＲ−ＶＰ６細胞株において高力価および大きなプラークの表現型を達成するために交換されたセグメントを示す。欠損ＡＨＳＶ粒子の描写は、ＡＨＳＶ１（青色）または他の血清型（赤色）として、４つの主要な構造タンパク質の起源を示す。赤色のｄｓＲＮＡセグメントは、交換されたセグメント（Ｓ２、Ｓ３、Ｓ６、Ｓ７およびＳ１０）を示す。それぞれの再集合体群について得られた血清型を下図に示している。（Ｂ）ｗｔＡＨＳＶ１、ｒｅｃＡＨＳＶ１および欠損ＡＨＳＶバリアント（ＢＳＲ−ＶＰ６細胞株にＭＯＩ ０．１で５回継代）を感染させたＢＳＲ−ＶＰ６細胞株から精製したゲノムｄｓＲＮＡのパターンを９％非変性ＰＡＧＥで分析した。ゲノムｄｓＲＮＡセグメントの位置は右側に示している。ｗｔ−Ｓ９ｄｓＲＮＡの位置は左側に示しており、欠損ＡＨＳＶバリアントのＳ９ｍｕｌｔｉｓｔｏｐ ｄｓＲＮＡは赤色で示し、ゲル上に赤色アスタリスク（＊）でマークしている。ゲル上の赤色の矢印は、欠損ＡＨＳＶバリアントのレスキューに使用されている交換されたセグメントに対応する。 ＶＰ６／ＮＳ４欠損ウイルスは、相補しているＢＳＲ−ＶＰ６細胞株において増殖することができるが、正常ＢＳＲ細胞、昆虫ＫＣ細胞またはウマＥ．Ｄｅｒｍ細胞においては増殖することができないことを示す図である。（Ａ）相補しているＢＳＲ−ＶＰ６細胞株におけるウイルス増殖動態。ＢＳＲ−ＶＰ６細胞をＭＯＩ ０．１で提示のウイルスのセットにより感染させ、感染の０、２４、４８および７２時間後、ＢＳＲ−ＶＰ６細胞に対するプラークアッセイによって分析した。それぞれのウイルスの最終力価は右図に示している。（Ｂ）正常ＢＳＲ細胞、昆虫ＫＣ細胞およびウマＥ．Ｄｅｒｍ細胞におけるウイルス増殖動態。３つの細胞株を、ＭＯＩ ５（ＢＳＲ）、２．５（ＫＣ）および１０（Ｅ．Ｄｅｒｍ）で感染させ、２回洗浄し、感染の０、２４、４８および７２時間後に、ＢＳＲ−ＶＰ６細胞に対するプラークアッセイによって分析した。 ｗｔ ＡＨＳＶ１ウイルスおよびｗｔ ＡＨＳＶ４ウイルスによる同種チャレンジ感染からのｄｅｆ−ＡＨＳＶ１およびｄｅｆ−ＡＨＳＶ４によるＩＦＮＡＲ−／−マウスの防御を示す図である。（Ａ）１０６ＰＦＵのｄｅｆ−ＡＨＳＶ１およびｄｅｆ−ＡＨＳＶ４で免疫化し、同種ｗｔ ＡＨＳＶ株の１０５ＴＣＩＤ５０でチャレンジした成体ＩＦＮＡＲ−／−マウス（１群当たり６匹）の生存プロット。動物の提示群における血液（Ｂ）および臓器（脾臓、肝臓、脳）（Ｃ）中のＲＮＡｅｍｉａはＲＴ−ｑＰＣＲにより取得したＣｔ値の反転グラフとして示した。４０を超えるＣｔ値は陰性と考えられた。各ドットは、分析した１つの動物試料に対応する。 ワクチン接種動物における臨床徴候およびウイルス複製を示す図である。動物に、０日目および２１日目（追加免疫）に２回ワクチン接種した。（Ａ）臨床徴候は体温、呼吸リズム、心拍数などに基づいてスコア化した。４頭の動物にＥＣＲＡ．Ａ４（Ａ群；上図）、４頭にＥＣＲＡ．Ａ１／４／６／８のカクテル（Ｂ群；下図）をワクチン接種し、２頭の動物（Ｃ１およびＣ２）を対照として使用した。（Ｂ）血清中のＡＨＳＶゲノムＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより決定し、Ｃｔ値として表示した。ウイルス負荷は、緑色（ＮＤ：非検出）から赤色（Ｃｔが２５未満）までの色勾配によって示されている。 ワクチン接種後の動物のセロコンバージョンを示す図である。ワクチン接種した動物の免疫応答を、ＶＰ７群特異的競合ＥＬＩＳＡによってモニターした。Ａ群の動物（左図）およびＢ群の動物（右図）に、ＥＣＲＡ．Ａ４またはＥＣＲＡ．Ａ１／４／６／８をそれぞれ２回、２１日間隔で接種し、Ｃ群（モックワクチン接種動物）と比較した。 毒性ウイルスチャレンジ後のワクチン接種したポニーにおける臨床上の防御を示す図である。３６日以降、臨床徴候をモニターした。（Ａ）ワクチン接種Ａ群およびＢ群（１８日まで）および対照群（１０日まで）について臨床徴候をスコア化した（それぞれ、上図、中央図および下図）。（Ｂ）両対照動物においてチャレンジした後の重篤な臨床徴候は、眼瞼および眼窩上窩（左）および結膜炎（右）の浮腫として明白であった。 ワクチン接種動物におけるウイルス複製の欠如を示す図である。血液試料中のウイルス血症は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。Ｃｔ値は、低〜高ウイルス負荷に対応する緑色（高）から赤色（低）への色勾配で示している。４０を超える値は非検出とみなした（ＮＤ）。Ｃ群の対照動物（Ｃ１およびＣ２）は、重篤なＡＨＳ症状のため（黒色）、チャレンジ後それぞれ１１日目および１０日目に安楽死させた。 図７〜図１０のデータを生成するために使用したＥＣＲＡワクチン株（Ａ群、ＥＣＲＡ．Ａ４ウイルスおよびＢ群、ＥＣＲＡ．Ａ１／４／６／８のカクテル）で使用されているセグメント９中の複数の変異の詳細を示す図である。

表１。ワクチン接種後のポニーにおける血清中和活性。血清中の中和活性は、示したＡＨＳＶ血清型１、４、６および８に対して３５日目（チャレンジの１日前）にプラーク減少アッセイによって決定した。力価は、プラーク数の５０％を減少させる血清の最大希釈として表した。非測定（ｎｄ）および非検出（−）を表している。

表２。毒性ウイルスチャレンジ後のポニーにおける血清中和活性。ワクチン接種した動物血清の中和抗体力価は、血清型ＡＨＳＶ１、４、５、６および８に対する４４日目および６０日目（チャレンジの８日後および２４日後）のＳＮアッセイによって決定した。力価は、完全中和される血清の最高希釈の逆数として表した。ＳＮアッセイは、４４日目の対照動物血清については実施しなかった。Ｃ１およびＣ２の両ポニーは、重篤なＡＨＳ症状のため、チャレンジ後の１１日目および１０日目にそれぞれ安楽死させた。非測定（ｎｄ）および非検出（−）を表している。

方法および材料
細胞およびウイルス
ＢＳＲ細胞（ＢＨＫ−２１サブクローン）を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）中で維持した。安定的な細胞株ＢＳＲ−ＶＰ６を、７．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を補充したＤＭＥＭ−５％ＦＢＳ中で増殖させた。ウマ皮膚（Ｅ．Ｄｅｒｍ）細胞（ＮＢＬ−６、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−５７）を、１０％ＦＢＳおよび１％非必須アミノ酸を補充した最小必須培地イーグル（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）中で培養した。哺乳動物細胞株を、５％ ＣＯ２加湿雰囲気中、３７℃で培養した。クリコイデス属（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ）（２４）に由来する昆虫ＫＣ細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＳｃｈｎｅｉｄｅｒ昆虫培地中、２８℃で維持した。

ＡＳＨＶ血清型１〜９は、Ｚｉｅｎｔａｒａ博士（ＡＮＳＥＳ Ｆｒａｎｃｅ）のご厚意により提供されたものである。すべてのＡＨＳＶ血清型をＢＳＲ細胞で１回継代し、滴定し、その後の実験に使用した。

プラスミド
ＡＨＳＶ１のＲＧ系において、対応するセグメントのコード領域を、ＡｆｌＩＩ制限部位およびＰａｃＩ制限部位を使用して、ｐＣＡＧ−ＰＭベクター（１８）に挿入した。対応する発現プラスミドをｐＣＡＧ−ＡＨＳＶ１ＶＰ１、ｐＣＡＧ−ＡＨＳＶ１ＶＰ３、ｐＣＡＧ−ＡＨＳＶ１ＶＰ４、ｐＣＡＧ−ＡＨＳＶ１ＶＰ６、ｐＣＡＧ−ＡＨＳＶ１ＶＰ７、ｐＣＡＧ−ＡＨＳＶ１ＮＳ１およびｐＣＡＧ−ＡＨＳＶ１ＮＳ２と命名し、配列決定により確認した。ＡＨＳＶ転写物用のＴ７プラスミドを、先に記載されているような配列非依存的クローニングシステム（１７）を使用して生成した。簡単に説明すると、濃縮ウイルスから精製されたｄｓＲＮＡを、アダプタープライマーとのＲＴ−ＰＣＲ増幅の前に、自己アニーリングプライマーに連結させた。ＡＨＳＶセグメントから増幅されたそれぞれのｃＤＮＡをｐＵＣ１９ベクターにクローニングし、配列決定した。

ＡＨＳＶ１ Ｓ９ｍｕｌｔｉｓｔｏｐ変異体を遺伝子アセンブリにより作製し、２８８〜３０４位（３終止コドン＋ＮＳ４フレームシフト）、３７７〜３８６位（３終止コドン）、５９０〜６０８位（３終止コドン）および８７２〜８７７位（２終止コドン）に変異が導入された。この配列を確認し、必要な際に利用可能であった。

ＡＨＳＶ１ ＶＰ６を恒常的に発現するＢＳＲ−ＶＰ６細胞株の開発
ＡＨＳＶ１ ＶＰ６を発現する相補細胞株のＢＳＲ−ＶＰ６は、先に記載されているとおり（１８）、いくつかの改変を含めて生成した。簡単に説明すると、ＡＨＳＶ１−ＶＰ６発現ベクターのｐＣＡＧ−ＡＨＳＶ１ＶＰ６を用いて、２４０Ｖおよび９７５μＦでエレクトロポレーションを行うことによりＢＳＲ細胞をトランスフェクトした。エレクトロポレーション後、細胞懸濁液を１５０ｍｍ培養プレート上に播種し、ＶＰ６発現コロニーを７．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンの存在下で選択した。生存クローンをイムノブロット分析により試験し、最適発現クローンをＶＰ６欠損ウイルスのレスキューに使用した。ＡＨＳＶ１ ＶＰ６の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによりＡＨＳＶ６ ＶＰ６に対して生じさせたポリクローナルモルモット抗血清を使用して評価した。

Ｔ７ ＲＮＡからのｗｔ ＡＨＳＶ１ウイルスの回収。Ｔ７プロモーターおよび正確な３’末端含有ＤＮＡを鋳型として等モル比で使用し、製造業者の指示に従ってｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用い、１０個のＡＨＳＶ１用のキャップドＴ７ ＲＮＡの混合物を製造した。ｒｅｃＡＨＳＶ１のレスキューについては、１２ウェルプレート中の５０％コンフルエンスのＢＳＲ細胞に、ＡＨＳＶ１ ＶＰ１、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７、ＮＳ１およびＮＳ２をコードする発現プラスミドのセットを異なる組み合わせでトランスフェクションした（各ウェル当たりそれぞれ８０ｎｇのプラスミド）。トランスフェクションの１６時間後、トランスフェクトされた単層を、合計５００ｎｇの１０個全部のキャップドＲＮＡ転写物で再度トランスフェクトした。ＲＮＡ感染性を評価するため、２回目のトランスフェクションの４時間後に、１％ＦＢＳを含有するＭＥＭの１．５％寒天で単層を覆い、３５℃で２〜３日間、プラークが形成されるまでインキュベートした。あるいは、レスキューされたウイルスを回収するため、１％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭでトランスフェクション培地を交換し、ＣＰＥが出現するまで２〜３日間インキュベートした。

Ｔ７ ＲＮＡからのｄｅｆ−ＡＨＳＶの回収
ｄｅｆ−ＡＨＳＶ１のレスキューについては、１２ウェルプレート中の５０％コンフルエンスのＢＳＲ−ＶＰ６細胞を、ＶＰ１、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳ２をコードする５個のｐＣＡＧプラスミド（各８０ｎｇ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの１６時間後、ＢＳＲ−ＶＰ６単層を、合計５００ｎｇの１０個のキャップドＡＨＳＶ１ ＲＮＡ転写物、Ｓ１〜８、Ｓ１０およびＳ９ｍｕｌｔｉｓｔｏｐでトランスフェクトした。再集合体ｄｅｆ−ＡＨＳＶを得るため、いくつかのセグメントを使用して親ＡＨＳＶ１を置き換えた。それぞれの欠損ウイルスをプラーク精製し、ＢＳＲ−ＶＰ６細胞に対して滴定した。安定性を評価するため、それぞれの欠損ウイルスを０．１のＭＯＩでＢＳＲ−ＶＰ６細胞において少なくとも５回継代した。ｄｓＲＮＡプロファイルの分析およびＲＴ−ＰＣＲ／シークエンシングを使用し、導入されたＡＨＳＶセグメントの完全性を確認した。

ＡＨＳＶのｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖動態
ｗｔ ＡＨＳＶおよび欠損ウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖動態を、それぞれ、０．１、５、２．５および１０のＭＯＩで１．５時間感染させた後にＢＳＲ−ＶＰ６細胞、ＢＳＲ細胞、ＫＣ細胞およびＥ．Ｄｅｒｍ細胞において決定した。感染後、接種材料を除去し、１％ＦＢＳを補充した培地で細胞を２回洗浄した。感染の０、２４、４８および７２時間後に、上清を採取し、ＢＳＲ−ＶＰ６細胞に対するプラークアッセイによって力価を決定した。それぞれの実験は３つ組で実施し、２回繰り返した。

マウス
Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的バックグラウンドの３０匹のＩＦＮＡＲ−／−マウスを、ＦＬＩの特異的病原体フリーの繁殖ユニットから取得し、５つの群に割り当てた。オスおよびメス動物を等しく分配した。６匹の各マウスに、１０６ＰＦＵ（１００μｌ）のｄｅｆ−ＡＨＳＶ１およびｄｅｆ−ＡＨＳＶ４ウイルスを３週間間隔で２回ワクチン接種し、２回目の免疫化の２１日後に、１００μｌ中のＡＨＳＶ血清型１（ｄｅｆ−ＡＨＳＶ１群）または４（ｄｅｆ−ＡＨＳＶ４群）のいずれかで１０５ ５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）により感染させた。１２匹のマウスに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でモックワクチン接種し、そのうちの６匹をＡＨＳＶ１に感染させ、６匹をＡＨＳＶ４に感染させた。さらに６匹のマウスを対照として飼育した。

すべてのマウスを、ワクチン接種および感染後の１０日間、毎日体重測定し、臨床徴候について調べ、重症症状を示す動物については直ちに安楽死させ、チャレンジ感染の２週間後の感染動物および３週間後の未処置対照動物はすべて残っていた。すべてのマウスについて、感染の３、７および１０日後に採血した。剖検では、血液、脾臓、肝臓および脳の試料を取り、臓器試料を１ｍｌの無血清ＭＥＭ中でホモジナイズした。２０μｌの血液または１００μｌの組織ホモジェネート由来のＲＮＡは、ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ Ｖｉｒｕｓ Ｍｉｎｉ Ｍ４８キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と組み合わせたＫｉｎｇ Ｆｉｓｈｅｒ ９６ Ｆｌｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の指示に従って使用して抽出し、ハウスキーピングベータ−アクチン遺伝子（２６）を標的とする内部制御系と組み合わせたＶＰ７ベースのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ（２５）により分析した。

ポニー
図１１は、セグメント９に導入され、ポニーのその後のワクチン接種に使用された多重終止コドンの詳細を示しており、初期継代したＥＣＲＡ．ＡＨＳＶストック（ＢＳＲ−ＶＰ６細胞における１〜２継代）は、ＢＳＲ−ＶＰ６細胞においてＭＯＩ ０．１で抗生物質非含有培地にて培養した。得られたＥＣＲＡ．ＡＨＳＶストックに１０％トレハロース（Ｓｉｇｍａ）を補充し、アリコートし、液体窒素中で凍結し、ワクチン接種まで−８０℃で保存した。凍結ストックのアリコートをＢＳＲ−ＶＰ６細胞に対して滴定し、典型的な細胞変性効果（ＣＰＥ）の不存在の視覚化とＲＴ−ＰＣＲによる確認によって、少なくとも３回の盲検継代でナイーブＢＳＲ細胞における複製の不存在について試験した。モックワクチン用量は、超音波処理による溶解によって、等量のＢＳＲ−ＶＰ６細胞から調製した。ワクチン安定性は、異なる保存条件、より詳細には異なる温度（＋４℃、−２０℃および−８０℃）、直接凍結または１０％最終濃度でのトレハロース（Ｓｉｇｍａ）の補充有無の液体窒素中凍結後に試験した。

ポニーにおける単一血清型とカクテルＥＣＲＡ．ＡＨＳＶのワクチン接種
４頭の動物の２つの群にＥＣＲＡワクチン株を皮下接種し、Ａ群にはＥＣＲＡ．Ａ４ウイルス（１×１０^７ＰＦＵ／動物、Ａ群）を、Ｂ群にはＥＣＲＡ．Ａ１／４／６／８のカクテル（１×１０^７ＰＦＵの各血清型／動物）を０日目に接種した。さらに、２頭の動物に、非感染細胞溶解物をモックワクチン接種した（Ｃ群）。最初のワクチン接種の２１日後に、追加免疫注射を行った。追加免疫ワクチン接種の３６日後または２週間後に、すべての動物にＡＨＳＶ４の毒性単離物（Ｍｏｒｏｃｃｏ １９９０）を２×１０^６ＴＣＩＤ_５０で静脈内にチャレンジした。チャレンジしたウイルスストックは、ＡＨＳＶ４感染ウマ由来の脾臓抽出物のＶｅｒｏ細胞での５継代およびＶｅｒｏ細胞またはＫＣ細胞での追加の一継代後に得られた。各ウマに、Ｖｅｒｏ細胞で得られた１０^６ＴＣＩＤ_５０およびＫＣ細胞から回収された１０^６ＴＣＩＤ５０でチャレンジした。すべての動物の全血試料および血清試料を、ワクチン接種およびチャレンジの前後に、規則的間隔で取った。この研究は、動物実験および保護に関するフランスのガイドラインおよび推奨に厳密に従って実施した。プロトコルは、ＡＮＳＥＳ／ＥＮＶＡ／ＵＰＥＣ動物倫理委員会の承認を受けた。

ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ。
ＲＮＡは、１０％ｗ／ｖのＰＢＳ中でホモジナイズした血液試料および臓器（脾臓、肺および心臓）からＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡキットおよびＱｉａｃｕｂｅロボット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出した。ゲノム二本鎖ＲＮＡ抽出物は、ＲＴ−ＰＣＲ反応混合物に添加する前に熱処理した（１０％ＤＭＳＯの添加および９５℃で５分間の加熱）。Ｓ１セグメントを標的とするリアルタイムＡＨＳＶ ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲキットの代わりにＡｇＰａｔｈ−ＩＤ（商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に対して、またＳｔｅｐＯｎｅまたはＡＢ７３００サーモサイクラーのサイクル条件：４５℃で１０分間、９５℃で１０分間、続いて９５℃で１０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の４５サイクルに対して必要な変更をして、３つの複製で２回実施した。サイクル閾値（Ｃｔ）の値を測定し、閾値４０を超える値を陰性とみなした。

単一血清型ＥＣＲＡ．Ａ４およびカクテルＥＣＲＡ．Ａ１／４／６／８試験の血清学。
血清試料を、市販の競合ＥＬＩＳＡ ＡＨＳＶ ＶＰ７抗体試験キット（ＥＬＩＳＡ Ｉｎｇｅｚｉｍ ＡＨＳＶ Ｃｏｍｐａｑ）により製造業者の指示に従って分析した。血清学的状態は、陽性（≧５０％）、疑わしい（＞４５％および＜５０％）または陰性（≦４５％）として定義した。

中和抗体応答を検出するため、標準血清中和（ＳＮ）アッセイまたはプラーク減少アッセイを使用した。標準ＳＮアッセイについては、血清試料ならびに陽性および陰性対照血清を９６ウェルプレートに連続希釈し、１００個の感染性ＡＨＳＶ粒子（ＡＨＳＶ１、４、５、６または８）と３７℃で６０分間混合した。１ウェル当たり１０^４個のＶｅｒｏ細胞を添加した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で７日間インキュベートし、４％ＰＦＡで固定し、メチレンブルー０．５％で染色した。中和力価は、細胞培養物の完全防御を付与する血清の最高希釈度として定義した。プラーク減少アッセイについては、血清試料を９６ウェルプレートで連続希釈し、約２５個の感染性ＡＨＳＶ粒子を各ウェルに添加した。すべての希釈は３つ組で実施した。血清−ウイルス混合物を振盪機で２時間、室温にてインキュベートし、１２ウェルプレート中のコンフルエントな単層のＢＳＲ細胞に１時間添加した。インキュベーション後、感染した細胞をＭＥＭ中の０．６％Ａｖｉｃｅｌ（ＩＭＣＤ ＬＴＤ）で覆い、３日間インキュベートした。中和力価は、対照（ＦＢＳおよび対照動物由来の血清）と比較した各ウェルで観察されたプラーク数から算出したウイルスプラークの５０％減少を示す血清の最高希釈として定義した。

臨床モニタリング
ポニーは、ワクチン接種後の８日間およびチャレンジ後の３週間、ＡＨＳＶ臨床徴候の発症について毎日モニターした。一般的な徴候（行動変化、高熱、心拍数および呼吸リズム、発汗）、ならびに浮腫、異常出血（点状出血）、呼吸困難、鼻汁および結膜炎の兆候を記録し、以下の基準に従って採点した。
行動：正常−０ポイント、無関心−１ポイント、うつ状態−２ポイント、全身衰弱−３ポイント
一般的なパラメータ：直腸温度（Ｔ）＝正常−０ポイント、３９℃≦Ｔ≦４０℃−１ポイント、４０℃＜Ｔ−３ポイント；心拍数＝正常−０ポイント、＞５０−２ポイント；呼吸リズム＝正常−０ポイント、＞２５−２ポイント
特定の徴候：浮腫−部位（眼瞼、上眼窩、唇、頭部、頚部、躯幹または散在性）当たり−１ポイント、鼻汁−分泌の種類（漿液性、粘液性、化膿性、出血性）当たり−１ポイント、点状出血病変−部位（結膜炎、口腔、皮膚）当たり−１ポイント、呼吸困難−１ポイント、咳−１ポイント、結膜炎−１ポイント、異常発汗−１ポイント、疝痛−１ポイント。

結果
ＡＳＨＶの逆遺伝学の確立
効果的かつ迅速なウイルス逆遺伝学（ＲＧ）は、ウイルスゲノムを操作することによって分子メカニズムを理解するための鍵である。これまでに公表されたＡＨＳＶ ＲＧは、混合血清型トランスフェクション、すなわちＡＨＳＶ６の６個の発現プラスミド、続いてＡＨＳＶ４の１０個のＴ７−ＲＮＡ転写物に対して構成されていた（２３）。この組み合わせは、レスキュー効率が低く、組換えウイルス力価が不十分であるため（＜１０６ＰＦＵ／ｍｌ）、分子操作には不十分であることが判明した。したがって、本発明者らは、効果的なＲＧ系のバックボーンとして使用することができる、均一で大きなプラークを形成する複製が良好なＡＨＳＶ株を発見することを第１の目的とした。最初に、９つすべてのＡＨＳＶ血清型をＢＳＲ細胞で試験し、感染力価およびプラークの表現型を評価した（図１）。ＡＨＳＶ血清型の次の２つの個別の群が観察された：大きく明瞭なプラークの表現型および高力価（ＡＨＳＶ１、３、５、６）と、小さく／明瞭でないプラークの表現型（ＡＨＳＶ２、４、７、８、９）で低力価（ＡＨＳＶ７）。４つの複製が良好なＡＨＳＶ血清型（ＡＨＳＶ１、３、５、６）を、いくつかのプラーク精製単離物を配列決定することにより遺伝的安定性について試験した。分析した血清型の３つ（ＡＨＳＶ３、５、６）は、遺伝的多様性が高く単一ゲノム由来ＲＧ系の開発を複雑にする可能性があるので、この時点で排除された。最も有望なＲＧ候補として１つのプラーク精製ＡＨＳＶ１を選択したが、その理由は、この株は高力価（５×１０８ＰＦＵ／ｍｌ）で、大きく均一なプラークの表現型と、１０個すべてのセグメントの配列決定により明らかにされた単一表現性クローンの両方を示したからである。

１０個のＡＨＳＶ１ ＲＮＡセグメントの完全コピーの回収は、配列に依存しない方法により実施した。各セグメントについて、正確な３’末端を有するＴ７プロモーター由来のプラスミドを生成し、１０個のキャップドＴ７ ＲＮＡ転写物を産生した。ＶＰ１、−３、−４、−６、−７およびＮＳ１、−２のタンパク質コード配列を使用して、ｐＣＡＧプロモーターの制御下で発現プラスミドを生成した。関連のＢＴＶについては、ＶＰ１、−３、−４、−６、ＮＳ１および−２のセットによるトランスフェクション、続いて翌日の１０個のＴ７ＲＮＡ転写物のトランスフェクションが効果的なＢＴＶレスキューを得るために十分であったことが実証されている。ＡＳＨＶ１の回収については、本発明者らは、一次複製複合体のプリフォームを模倣するいくつかの条件を試験した。まず、図２Ａに示したように、３〜７個の発現プラスミドのトランスフェクションを実施した。１０個のキャップドＴ７−ＲＮＡ転写物による第２回目のトランスフェクション後、寒天で重層したＢＳＲ単層を使用して、ＡＨＳＶ１レスキューの効率を評価した。最初のトランスフェクションにおける発現プラスミドの異なる組み合わせにより５個のプラスミド（ＶＰ１、−３、−４、−６およびＮＳ２）の十分なセットが明らかになり、これをその後のすべての実験全体にわたって使用した（図２Ａ）。培地で重層したＢＳＲ単層をＣＰＥについてモニターし、組換えＡＳＨＶ１（ｒｅｃＡＨＳＶ１）を採取した。レスキューされたウイルスをナイーブＢＳＲ細胞において増幅し、力価は４×１０８ＰＦＵ／ｍｌに達した。プラーク形態は、ＡＨＳＶ１親ウイルスと類似していた（図２Ｂ）。天然のポリアクリルアミドゲル上で抽出されたｄｓＲＮＡの分析からは、典型的なＡＨＳＶ１ゲノムｄｓＲＮＡプロファイルが示された（図２Ｃ）。まとめると、効果的ＡＨＳＶ１ ＲＧ系では、５個の発現プラスミドのトランスフェクション、続いて１０個のＡＨＳＶ１ Ｔ７−ＲＮＡランオフ転写物のトランスフェクションが必要であった。

ＶＰ６／ＮＳ４欠損ＡＨＳＶを相補するＡＨＳＶ１ ＶＰ６を発現する安定的な細胞株
次に、本発明者らは、ウイルスベースの実験を低レベルの封じ込めレベルに移し、機能的および構造的研究を実施するための欠損ＡＨＳＶプラットフォームを開発することとした。関連のＢＴＶからのＶＰ６のトランス相補能力により、相補細胞株では複製可能であるが、親ＢＳＲ細胞または昆虫ＫＣ細胞では複製不可能なＶＰ６欠損変異ウイルスが開発された。本発明者らは、さらにこの技術を開発し、ＢＳＲ細胞をｐＣＡＧ−ＡＨＳＶ１ＶＰ６でエレクトロポレーションし、続いてピューロマイシン選択することにより、ＡＨＳＶ１ ＶＰ６発現ＢＳＲ細胞株（ＢＳＲ−ＶＰ６）を作製した。選択したクローンは、低希釈で３０継代の間、ＶＰ６を安定的に発現していた（図３Ａ）。ＶＰ６欠損ＡＨＳＶの設計は、ＮＳ４ ＯＲＦの破壊を相補していた。ＮＳ４の発現は、ＢＳＲ細胞におけるＢＴＶ複製に必須でないことが明らかであった。これがＡＨＳＶの場合であれば、ＮＳ４の欠失はさらなる減弱段階を示す。ＶＰ６／ＮＳ４欠損ＡＨＳＶ１（ｄｅｆ−ＡＨＳＶ１）を構築するため、本発明者らは、ＡＨＳＶ１のＳ９に複数のヌクレオチド変化を導入した。ＶＰ６欠損ＢＴＶウイルスについて報告されている欠失の代わりに、本発明者らは、ＶＰ６およびＮＳ４のＯＲＦを破壊するが、得られたＳ９ｍｕｌｔｉｓｔｏｐの長さは保持しているため、欠損ＡＨＳＶ１のレスキューおよび複製に対する遺伝的圧力を最小限にする、Ｓ９遺伝子全体にわたる１１個の終止コドン（ＴＡＡまたはＴＧＡ）の導入を行った。ｄｅｆ−ＡＨＳＶ１におけるＶＰ６の不存在は、相補細胞株によって相補されることが予想された。

ＢＳＲ−ＶＰ６相補細胞株を使用し、５個の発現プラスミドのトランスフェクション、続いて１０個のキャップドＴ７ ＲＮＡ転写物のトランスフェクションによりｄｅｆ−ＡＳＨＶ１を回収したが、この場合、Ｓ９はＳ９ｍｕｌｔｉｓｔｏｐにより置き換えられていた（図３Ｂ）。２回目のトランスフェクション後、寒天を重層したＢＳＲ単層を使用し、ＲＮＡ感染性を評価したが、これはＴ７ ＲＮＡのＡＨＳＶ１ ｗｔセットに匹敵した（図３Ｃ）。培地を重層したＢＳＲ単層をＣＰＥについてモニターし、組換えｄｅｆ−ＡＳＨＶ１を採取した。レスキューされたウイルスは、ＢＳＲ−ＶＰ６細胞株を使用してプラーク精製し、１回の増幅により８×１０７ＰＦＵ／ｍｌの力価（相補ＢＳＲ−ＶＰ６細胞株で滴定）に達した。プラーク形態および天然ポリアクリルアミドゲルでの抽出されたｄｓＲＮＡの分析は、予想されるｄｓＲＮＡプロファイルを示した（図３Ｃおよび図４Ｂ）。これらの結果から、ＡＨＳＶ ＶＰ６がトランスで効率的に相補され得ること、ＮＳ４がＢＳＲ細胞におけるＡＨＳＶ複製に必須ではないことが確認された。

キメラＡＨＳＶ粒子の効率的なアセンブリはいくつかのセグメントの再集合を必要とする
再集合するオルビウイルスの能力により、保存されたレプリカーゼまたは内部コアをリコートすることが可能となり、その結果、血清型特異的粒子が生じる。そのような粒子は、ワクチン候補または構造研究および分子研究用の安全なプラットフォームなどの幅広い適用スペクトルを有し得る。これまでに、ＡＨＳＶ ＶＰ２を交換すると再集合体ウイルス力価が最大３ログに低減し、複製の低下および／または粒子の不安定性が起こることが実証されている。したがって、本発明者らは、他の８個すべてのＡＨＳＶ血清型（２〜９）について複製の良好な候補を得るために、他の血清型とは異なるセグメントの組み合わせを使用してｄｅｆ−ＡＳＨＶ１をリコートすることとした。

まず、ＡＨＳＶ血清型２〜９の正確なコピーセグメントＳ２（ＶＰ２）、Ｓ６（ＶＰ５）、Ｓ７（ＶＰ７）、Ｓ３（ＶＰ３）およびＳ１０（ＮＳ３／ＮＳ３Ａ）を、配列非依存的方法を使用してクローニングした。９個のＡＨＳＶ血清型の主要構造タンパク質のアミノ酸配列分析は、予想したオーダーの保存の増加を示した：最下位保存のＶＰ２（同一性１３〜７１％、類似性２７〜８４％）、続いてＶＰ５（同一性７５〜９９％、類似性９０〜９９％）、続いてＶＰ７およびＶＰ３（同一性＞９８％、類似性＞９９％）。

ＡＨＳＶ１と同様に、Ｔ７プロモーターおよび正確な３’末端ＤＮＡを生成し、Ｔ７ ＲＮＡ転写物を産生した。欠損ウイルス回収のため、ＢＳＲ−ＶＰ６細胞にＡＨＳＶ１の１０個のＴ７ ＲＮＡをトランスフェクトし、Ｓ９をＳ９ｍｕｌｔｉｓｔｏｐで置き換え、血清型に応じて、Ｓ２＋Ｓ６、Ｓ２＋Ｓ６＋Ｓ７、Ｓ２＋Ｓ６＋Ｓ７＋Ｓ３またはＳ２＋Ｓ６＋Ｓ７＋Ｓ３＋Ｓ１０を使用してｄｅｆ−ＡＨＳＶ１の類似セグメントを置き換えた。得られた欠損ウイルスの最終評価は、ＢＳＲ−ＶＰ６細胞株（１０７ＰＦＵ／ｍｌ以上、ｗｔ参照株として）に対して実施したプラーク精製ウイルスのプラークサイズ（３５℃で２〜３日間インキュベーションした後の透明なプラーク）および最終力価について選択した。これらの要件は、改変ｄｓＲＮＡゲノムの組換えおよび不安定性を回避するよう可能なかぎり圧力を最小限にするように選択した。選択基準を満たすのに、ＡＨＳＶ血清型２〜９は異なる要件を実証した（図４Ａ）。複製が良好なｄｅｆ−ＡＨＳＶ８およびｄｅｆ−ＡＨＳＶ９を開発するには、外殻タンパク質ＶＰ２およびＶＰ５をコードする２個のセグメントのみによる再集合が必要であった（Ｓ２＋Ｓ６）。ｄｅｆ−ＡＨＳＶ３およびｄｅｆ−ＡＨＳＶ４の開発は、中間コアタンパク質ＶＰ７を含めた３個のセグメント（Ｓ２＋Ｓ６＋Ｓ７）の再集合により可能であった。さらなる３個の血清型が、４個のセグメント（Ｓ２＋Ｓ６＋Ｓ７＋Ｓ３）を用いる再集合によって作製され、ｄｅｆ−ＡＨＳＶ５、ｄｅｆ−ＡＨＳＶ６およびｄｅｆ−ＡＨＳＶ７が得られた。このセットは、主要な構造タンパク質殻を完全に置き換えることによって作製された。最後に、血清型２に対する複製の良好な再集合体欠損ウイルスを開発するため、５個のセグメント（Ｓ２＋Ｓ６＋Ｓ７＋Ｓ３＋Ｓ１０）を置き換えて相補ＢＳＲ−ＶＰ６細胞株での高い力価を達成する必要があり、それによりｄｅｆ−ＡＨＳＶ２が得られた。これらの欠損ウイルス（ＡＨＳＶ２、３、４、５、６、７）については、レスキュー効率が低く、プラークの表現型が小さく、１０４〜１０６ＰＦＵ／ｍｌの範囲の力価が観察され、上記で示したものより小さいセグメントが再集合で使用される場合は、したがって、これらはその後の試験から除外した。選択したすべての欠損ウイルスの概略図を図４Ａに要約する。９個すべての欠損ウイルスを、相補ＢＳＲ−ＶＰ６細胞株においてＭＯＩ ０．１で５回継代し、各段階で、試験したストックのいずれもがナイーブＢＳＲ細胞で複製できないことを確認した。最初にレスキューされたウイルスストックおよび最終の５回継代ウイルスストックを使用してｄｓＲＮＡを抽出し、再集合欠損ウイルスの安定性および完全性を評価した。分析したすべてのウイルスは、正確なｄｓＲＮＡモビリティを実証した（図４Ｂ）。さらに、ＲＴ−ＰＣＲおよびシークエンシングによっても、９個のｄｅｆ−ＡＨＳＶすべてにおいてセグメントの確実性が確認された。

欠損ＡＨＳＶはＡＨＳＶ感受性細胞株においては増殖しないが相補細胞株では高力価に達する
相補ＢＳＲ−ＶＰ６細胞における作製した欠損ウイルスのパネルの増殖動態を決定するため、本発明者らは、低ＭＯＩでＢＳＲ−ＶＰ６細胞を感染させ、感染の２４、４８および７２時間後に力価を測定した。ｗｔ ＡＨＳＶ１ウイルスと同様に、９個すべての欠損ウイルスは、相補ＢＳＲ−ＶＰ６細胞における複製が可能であり、１０７〜１０８ＰＦＵ／ｍｌの範囲の力価に達し、感染の２〜３日後にプラークを形成した（図５Ａ）。

親ｄｅｆ−ＡＳＨＶ１と８個の再集合ウイルスの両方が正常細胞において増殖することができないことを確認するため、高ＭＯＩで３つの細胞株（ＢＳＲ、ＫＣおよびＥ．Ｄｅｒｍ）を感染させ、感染の２４、４８および７２時間後にウイルス力価を測定することによって、それぞれの無効化ウイルスの増殖動態を評価した。得られた結果からは、これらの無効化ウイルスがＢＳＲ、ＫＣ（昆虫）およびＥ．Ｄｅｒｍ（ウマ）の細胞株において増殖できなかったことが実証された（図５Ｂ〜図５Ｄ）。遅延複製がないことを確認するため、すべてのｄｅｆ−ＡＨＳＶ感染細胞（ＢＳＲ、ＫＣおよびＥ．Ｄｅｒｍ）をさらに７日間インキュベートしたが、感染の徴候は検出されなかった。この実験においては、３つのｗｔ ＡＨＳＶ１株：ｒｅｃＡＨＳＶ１（正確なコピーＴ７−ＲＮＡからＲＧにより取得したもの）、ｗｔＡＨＳＶ１（元のＡＨＳＶ１ストックからの第２ＢＳＲ継代）、およびＡＨＳＶＫＣ（ＭＯＩ ０．１でＫＣ細胞において２回継代したもの）を使用した。３つのＡＨＳＶストックはすべて同様の結果を示したので（データは示さず）、１つだけ（ｒｅｃＡＨＳＶ１）示す（図５）。要約すると、本発明者らは、９個のすべての欠損ウイルスが相補細胞株において高力価（１０７〜１０８ＰＦＵ／ｍｌの間）まで増殖するが、ＢＳＲ、ＫＣおよびＥ．Ｄｅｒｍ細胞においては粒子を産生しないとの結論を出した。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果は、これらの欠損ウイルスが将来的なＡＨＳＶワクチン候補として使用される可能性が大きいことを実証している。

欠損ＡＨＳＶ１およびＡＨＳＶ４はＩＦＮＡＲ−／−マウスを同種感染から効率的に防御する
原理の証明として、ｄｅｆ−ＡＨＳＶ１および再集合体ｄｅｆ−ＡＨＳＶ４を使用し、マウスモデルにおいてＡＨＳＶ感染に対する防御効率を実証した。これについて、成体ＩＦＮＡＲ−／−マウスを、１０６ＰＦＵのｄｅｆ−ＡＨＳＶ１およびｄｅｆ−ＡＨＳＶ４で２回免疫化した。ワクチン接種の後、有害な副作用は観察されず、体重は免疫動物と対照動物との間に有意差は認められなかった（すべての群において最大１０％変動）。２回目の免疫化の３週間後、免疫動物および対照動物にＡＨＳＶ１およびＡＨＳＶ４を皮下チャレンジした。ワクチン接種せずＡＨＳＶ−４に感染させたマウスは、チャレンジ感染の３日後または４日後に体重が減少し始め、４匹の動物を感染の７日後に安楽死させ（重度の体重減少、粗い体毛、無反応）、２匹の残りのマウスは８日目に安楽死させた。他のすべての群マウスには臨床的徴候は認められなかった（図６Ａ）。

ＲＮＡｅｍｉａのレベルを、すべてのマウスに対して感染の３日後、７日後および１０日後に測定した。モック感染マウスではＡＨＳＶ特異的ＲＮＡは検出されなかった。ＡＨＳＶ４に感染したマウスは、ＡＨＳＶ１に感染したマウスを比較すると有意に高いＡＨＳＶ ＲＮＡレベルを有していた（図６Ｂ）。このデータはマウスの生存時間と相関しており（図６Ａ）、ＡＨＳＶ１が毒性の低い血清型であることが示唆されている。免疫した動物群において、ＲＮＡｅｍｉａのレベルは有意に低下した（図６Ｂ）。ＡＨＳＶ特異的ＲＮＡの分析は、収集したすべての血液試料（Ｃｔ２６〜３２）中に存在するハウスキーピングベータアクチン遺伝子を標的とする内部制御系と組み合わせた。

ＲＮＡ抽出および定量用の脾臓、肝臓および脳の組織試料は、材料および方法にて記載されているようにして取得した。前述のデータ（図６Ａ〜図６Ｂ）と一致して、ＡＨＳＶ４感染マウスについてはサンプリングされたすべての臓器で高負荷のＡＨＳＶ ＲＮＡが測定されたが、ＡＨＳＶ１感染群では分析した臓器でＡＨＳＶ ＲＮＡのレベルが低レベル〜無レベルであることを実証した。同種ＡＨＳＶチャレンジ前のｄｅｆ−ＡＨＳＶ１およびｄｅｆ−ＡＨＳＶ４によるワクチン接種は、マウス臓器においてＡＨＳＶ ＲＮＡレベルが有意に低下した（図６Ｃ）。

この研究において使用した防御指標には、体重測定、生存時間、血液および組織のＲＮＡｅｍｉａが含まれた。ＡＨＳＶ１およびＡＨＳＶ４に感染した非免疫化マウスは、検出可能なレベルのＲＮＡｅｍｉａを示したが、ＡＨＳＶ１感染マウスは、ＡＨＳＶ４とは対照的に死亡率および体重減少を示さなかった。このため、ワクチン候補の効力を分析する主要な保防御指標としてＲＮＡｅｍｉａを選択した。

ポニーにおける単一血清型およびカクテルワクチン接種
本発明者らは、ＡＨＳＶ天然宿主、例えばポニーにおけるこれらの欠損ウイルスの防御有効性を評価した。血清型ＡＨＳＶ４（ＥＣＲＡ．Ａ４）ワクチンについては、正式にはＤＩＳＣとして知られている１つの単一血清型Ｅｎｔｒｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−Ａｂｏｒｔｉｖｅ（ＥＣＲＡ）ウイルス株、および血清型１、４、６および８については１つの多価カクテル（ＥＣＲＡ．Ａ１／４／６／８）ワクチンを試験し、毒性ＡＨＳＶ４でポニーをチャレンジした。Ｓ９における複数の終止コドンの詳細を図１１に示す。

ウマにおけるＡＨＳＶ４感染に対するＥＣＲＡ．ＡＨＳＶ株の防御有効性を評価するため、２つの群（ＡおよびＢ）のポニーを、１×１０^７ＰＦＵ（ＥＣＲＡ．Ａ４、Ａ群）またはカクテル用の合計４×１０^７ＰＦＵ（ＥＣＲＡ．Ａ１／４／６／８、Ｂ群）で、それぞれ１×１０^７ＰＦＵのｄｅｆ−ＡＨＳＶとともに、２回免疫化した。対照動物には非感染細胞溶解物を接種した（Ｃ群）。動物数の制限のため（ポニー１０頭）、この研究においては１つのカクテルしか試験しなかった。０日目に最初のワクチン接種を行い（「初回」）、２１日目に追加免疫ワクチン接種のために同じ用量を接種し（「追加」）、次いで、３６日目に動物を毒性ＡＨＳＶ４でチャレンジした。血液試料を定期的に収集し、Ｃ群（対照動物）については０日目から４４〜４６日目まで、動物Ａ４およびＢ４を除くすべてのワクチン接種動物については０日目から６０日目まで、ウイルス負荷および中和抗体産生をモニターした。両動物は、１０２日目まで、できる限り長くウイルス血症についてモニターした。試験中に妊娠したポニーＢ４は、仔ウマの誕生までウイルス複製をモニターした。

ワクチン接種したポニーを０日目から３５日目まで日常的にモニターしたところ、予想したとおり、対照動物とは対照的に、ＡＨＳＶ臨床反応を示さなかった（図７Ａおよび図７Ｂ）。したがって、ＥＣＲＡ．ＡＨＳＶワクチン株は、動物において有害な作用を引き起こさなかった。またウイルス複製も、動物の血液試料のＲＴ−ＰＣＲによってモニターした。図７Ｂに示したように、０日目から３５日目まで、ウイルスＲＮＡは、両群のワクチン接種動物において全く検出できないか、非常に低いレベルで存在しており、対照動物と等しかった。データは、ウイルス複製が２回のワクチン接種後に存在しないことを示した。

ポニーにおけるＥＣＲＡ．ＡＨＳＶ株の抗体応答の発生は、まず、標準的なＡＨＳＶ群特異的ＶＰ７抗原ＥＬＩＳＡ試験によってモニターした。初回のワクチン接種後であっても、ワクチンは動物において免疫応答を誘発し、２回目のワクチン接種後はさらに増強された（図８）。予想したとおり、２つの対照動物Ｃ１およびＣ２の血清はＶＰ７抗体を有していなかったが、Ａ群およびＢ群のワクチン接種を受けたすべての動物は血清転換され、ＶＰ７に対する抗体は、それぞれ、追加免疫注射の７日後および１４日後の２８日目および３５日目に検出することができた（図８）。

さらに免疫応答を、ワクチン接種した動物の対照動物に対する中和抗体力価を測定することにより分析した（表１）。ワクチン製剤に含まれるすべての血清型に対する中和は、３５日目（チャレンジ前）にプラーク減少アッセイにより試験した。２１日目に収集した血清試料は、いずれの血清型に対しても中和抗体（ＮＡ）力価が検出された場合、非常に低かった（データは示さず）。しかし、すべてのＥＣＲＡ．Ａ４一価ワクチン接種動物の３５日目（追加免疫ワクチン接種の２週間後）に収集された血清は、ＡＨＳＶ４に対してＮＡ力価（１６〜６４）を有していた（表１）。カクテルワクチンでワクチン接種したＢ群のすべての動物は、ワクチンカクテル中に存在していた４つの血清型すべてに対するＮＡを有していた。ほとんどが強いＮＡ力価（１６〜６４）を有していたが、数頭のポニーは、いくつかの血清型（例えば、ＡＨＳＶ６および８）に対して１２８の高いＮＡ力価を生じた（表１）。

したがって、新たに開発されたワクチンは、ワクチン接種した宿主において複製されず、効率的な中和抗体応答を生じさせることができる。さらに、カクテルワクチン接種は、４つの血清型すべてに対する中和抗体を産生させ得る。

チャレンジ後の中和抗体産生および臨床防御
ワクチンの防御有効性を決定するため、追加免疫ワクチン接種の２週間後、最も病原性が高いと考えられていることから、毒性ＡＨＳＶ４をわずか２×１０^６ＴＣＩＤ_５０で対照動物およびワクチン接種動物をチャレンジした。各動物の免疫応答および臨床徴候をモニターした。ＡＨＳＶ４に対する中和抗体の高力価は、ＳＮアッセイにより、Ａ群およびＢ群の両方の動物では４４日目（チャレンジ後８日目）に検出され、３頭のポニーでは最大２５６で検出された（表２）。また３２までの中和抗体力価も、ＡＨＳＶ６に対してＢ群の２頭のポニーで、およびＡＨＳＶ８に対しては３頭のポニーで検出された。チャレンジの２４日後（６０日目）、ＡＨＳＶ４に対する高力価の中和抗体は両群のすべての動物において依然として検出可能であったが、これはおそらく、チャレンジしたウイルスによって引き起こされた記憶応答によるものである。またＡＨＳＶ６およびＡＨＳＶ８に対する中和抗体を誘発したＢ群のポニーも、６０日目に中和抗体産生を維持しており（表２）、このことは、単独で、または混合物として使用された場合の天然宿主におけるワクチン株の強い免疫応答を示している。

中和抗体は、対照動物Ｃ１およびＣ２においては検出されなかった（表２）。予想したとおり、両対照動物は、毒性ウイルスによるチャレンジの直後（６〜７日）に臨床徴候を、アパシー、高体温および呼吸困難、眼瞼および眼窩上窩の浮腫、ならびに鼻汁を伴って示すようになった。これらの動物は、チャレンジの１０日後（Ｃ２）および１１日後（Ｃ１）にそれぞれ安楽死させた（図９Ｂ）。両対照動物に対して実施した剖検では、顕著な肺水腫ならびにＡＨＳＶ感染と一致する心膜および胸膜滲出液が注目された。対照的に、Ａ群およびＢ群のワクチン接種動物は臨床徴候を示さなかった（それぞれ、図９Ａの上図および中央図）。ワクチン接種した１頭の動物Ａ２のみが、わずか２日で（チャレンジの６〜８日後）、軽度の循環症状（眼瞼の浮腫、鼻汁および中度の呼吸困難）ならびに呼吸器症状を示した（図９Ａ、上図）。これはおそらく、中和抗体力価が低いためと思われる（表２）。

ウイルス複製は、チャレンジ後の血液試料においてＲＴ−ＰＣＲによりモニターした。対照群の両動物は、チャレンジの４日後に高いウイルス負荷を示し（Ｃｔが２６．９および２７．１）、チャレンジ後８日まで増加した（Ｃｔが１７．５および１５．６）（図１０）。これらのデータは、臨床モニタリング中に観察された重篤な症状と一致していた（図９Ａの下図、および図９Ｂ）。死後動物のＲＴ−ＰＣＲ分析では、Ｃ１およびＣ２ポニーの心臓、脾臓および肝臓におけるＡＨＳＶ４ ＲＮＡの存在が検出された（Ｃｔは１４．８５〜２０．３７、データは示さず）。対照的に、Ａ群およびＢ群のすべてのワクチン接種動物は、毒性ウイルス株でチャレンジした２〜８日後、非常に低レベルのＡＨＳＶ４を示した（Ｃｔは３１．４〜３７．２）。特定の動物のＡ４、Ｂ２およびＢ４については、チャレンジの１２日後、血液試料中にウイルスＲＮＡが検出されたが（Ｃｔは３０．１〜３８．１、図１０）、Ｖｅｒｏ細胞において４回継代した後であってもＣＰＥは観察されなかった（データは示さず）。Ｂ４動物は妊娠していたため、他のウイルスと比較した場合、より長期間、その動物血液中のウイルスＲＮＡの存在を説明することができた可能性がある（Ｃｔは最大で３６、図１０）。しかし、仔ウマは、ＲＴ−ＰＣＲによって検出され得るウイルスＲＮＡを示さなかった。仔ウマは、最初のワクチン接種後の５９日目、おそらく３４５日（±７日間）の妊娠期間後に誕生した。毒性ウイルスチャレンジが妊娠の３２２日目（第１のワクチン接種後３６日目）に実施され、第１および第２のワクチンがそれぞれ妊娠の２８６日目および３０７日目に接種されたことに注目されたい。誕生した仔ウマは、初回ワクチン接種の６０日後に検出されたＡＨＳＶ母体抗体を有し、完全に正常で健康であり、いかなるＡＨＳ疾患の兆候もなかった。このデータは、チャレンジした毒性ウイルスが胎盤を通過しなかったことを示唆している。チャレンジの１４日後、ＡＨＳＶ４ ＲＮＡがＡ群の４頭の動物のうち１頭（Ａ４）で検出された（図１０）。しかし、臨床症状はみられなかった（図９Ａ、上図）。さらに、Ａ４ポニーの血清は、ＡＨＳＶ４に対する中和抗体力価のレベルが、４４日目（チャレンジ８日後）の６４から、６０日目（チャレンジの２４日後）の２５６まで増加した（表２）。まとめると、これらのデータは、ＥＣＲＡ．Ａ４およびＥＣＲＡ．Ａ１／４／６／８ワクチン接種の両方の安全性、および毒性ＡＨＳＶ４に対してワクチン接種動物に付与された臨床上の防御を実証している。

概要
アフリカ馬疫ウイルス（ＡＨＳＶ）は、４つの主要な構造タンパク質：外殻タンパク質ＶＰ２およびＶＰ５、中間コアＶＰ７およびサブコアＶＰ３を発現する。ウイルス粒子形成におけるこれらタンパク質の役割を研究する効率的な逆遺伝学（ＲＧ）系を生成するため、本発明者らは、トランスでのＶＰ６欠損ウイルス相補のための異種ＶＰ６を発現する細胞株を開発した。ＡＨＳＶのセグメント９における、必須複製酵素ＶＰ６のＯＲＦならびにまだそれほど研究されていないＮＳ４タンパク質のオーバーラッピングＯＲＦを、複数の終止コドンを導入することによって破壊した。

Ｓ９遺伝子の全体にわたって１１個の終止コドン（ＴＡＡまたはＴＧＡ）を導入することによって、本発明者らはＶＰ６およびＮＳ４のＯＲＦを破壊したが、得られたＳ９ｍｕｌｔｉｓｔｏｐの長さは保持され、有利には、欠損ＡＨＳＶのレスキューおよび複製の遺伝的圧力が最小限にされた。

並行して、ＡＨＳＶ ＶＰ６を発現する細胞株を樹立し、ｍｕｌｔｉｓｔｏｐ無効化ウイルスのレスキュー時に機能性遺伝子産物の相補を提供した。最終的に、無効化ウイルスプラットフォームの繁殖欠損表現型を確認した後、異なる血清型決定カプシドタンパク質をコードするウイルスＲＮＡセグメントを交換し、ＡＨＳＶの抗原スペースの大部分をカバーする血清型またはキメラを取得した。

したがって、（欠損タンパク質の）相補は、ウイルス毒性の回復に向けての遺伝的圧力を最小限にする安全なＡＨＳＶワクチンプラットフォームを表している。特に、複数の終止コドンを導入して（例えば、ＶＰ６およびＮＳ４をコードする）ＡＨＳＶセグメント９のＯＲＦを破壊することにより、相補細胞株における継代で、いずれかの突然変異ＯＲＦを回復する突然変異Ｓ９における変化は示されなかった。また、本発明者らの結果は、９つのすべてのＡＳＨＶ無効化ウイルスが、相補細胞株においてｗｔ ＡＨＳＶに近い力価で複製され得ることを実証した。同時に、すべての欠損ウイルスは、哺乳動物起源および昆虫起源の他の試験細胞株において無効化された。

したがって、本発明者らのアプローチおよび生成した単離ｓｓＲＮＡ／ワクチン株は、優れた安全かつ効率的なＡＨＳＶワクチンを提供する。実際、本発明者らは、ＡＨＳＶ天然宿主、例えばポニーにおけるこれら欠損ウイルスの防御有効性を評価した。１つの単一血清型（ＥＣＲＡ．Ａ４）ワクチンおよび１つの多価カクテル（ＥＣＲＡ．Ａ１／４／６／８）ワクチンを試験し、ポニーを毒性ＡＨＳＶ４でチャレンジした。ワクチン接種したすべてのポニーは防御され、ＡＨＳの重度の臨床症状を発症することはなかった。さらに、多価カクテルをワクチン接種したポニーは、カクテル中に存在するすべての血清型に対する中和抗体を産生し、治験中に誕生した仔ウマは健康であり、ウイルス血症もみられなかった。これらの結果は、これらのＥＣＲＡ株のＡＨＳＶに対する新世代ワクチンとしての適合性を証明している。

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１７． Ｂｏｙｃｅ Ｍ，Ｃｅｌｍａ ＣＣ，Ｒｏｙ Ｐ．２００８．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ：ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２：８３３９〜８３４８。
１８． Ｍａｔｓｕｏ Ｅ，Ｒｏｙ Ｐ．２００９．Ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ＶＰ６ ａｃｔｓ ｅａｒｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｃａｎ ｆｏｒｍ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｖｉｒｕｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８３：８８４２〜８８４８。
２３． Ｋａｎａｍｅ Ｙ，Ｃｅｌｍａ ＣＣ，Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｒｏｙ Ｐ．２０１３．Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ａｆｒｉｃａｎ ｈｏｒｓｅ ｓｉｃｋｎｅｓｓ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＲＮＡ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ９４：２２５９〜２２６５。
２４． Ｗｅｃｈｓｌｅｒ ＳＪ，ＭｃＨｏｌｌａｎｄ ＬＥ，Ｔａｂａｃｈｎｉｃｋ ＷＪ．１９８９．Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ ｖａｒｉｉｐｅｎｎｉｓ（Ｄｉｐｔｅｒａ：Ｃｅｒａｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅ）ｓｕｐｐｏｒｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ Ｐａｔｈｏｌ ５４：３８５〜３９３。
２５． Ｑｕａｎ Ｍ，Ｌｏｕｒｅｎｓ ＣＷ，ＭａｃＬａｃｈｌａｎ ＮＪ，Ｇａｒｄｎｅｒ ＩＡ，Ｇｕｔｈｒｉｅ ＡＪ．２０１０．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｕｐｌｅｘ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＶＰ７ ａｎｄ ＮＳ２ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ａｆｒｉｃａｎ ｈｏｒｓｅ ｓｉｃｋｎｅｓｓ ｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １６７：４５〜５２。
２６． Ｔｏｕｓｓａｉｎｔ ＪＦ，Ｓａｉｌｌｅａｕ Ｃ，Ｂｒｅａｒｄ Ｅ，Ｚｉｅｎｔａｒａ Ｓ，Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ Ｋ．２００７．Ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｗｏ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ｑＰＣＲｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｇｍｅｎｔｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４０：１１５〜１２３。

Claims (28)

1. アフリカ馬疫ウイルス（ＡＨＳＶ）のゲノムに由来する単離ウイルスｓｓＲＮＡであって、ｓｓＲＮＡが前記ウイルスのＳ９セグメントの少なくとも一部を含み、その中に前記ウイルスのＳ９セグメント内の複数の変異を有し、さらに、それぞれの変異が、少なくとも前記ｓｓＲＮＡに導入された後に、終止コドンを提供またはコードする、単離ウイルスｓｓＲＮＡ。
2. 前記変異が少なくとも１つの必須遺伝子の機能を破壊する、請求項１に記載の単離ウイルスｓｓＲＮＡ。
3. 前記少なくとも１つの必須遺伝子がＶＰ６およびＮＳ４を含む群から選択される、請求項２に記載の単離ウイルスｓｓＲＮＡ。
4. 前記変異が少なくともＶＰ６およびＮＳ４の機能を破壊する、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離ウイルスｓｓＲＮＡ。
5. 前記変異がヌクレオチド２８８〜８７７にまたはその間に挿入される、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離ウイルスｓｓＲＮＡ。
6. 前記変異が、２８８〜３０４；３７７〜３８６；５９０〜６０８；および８７２〜８７７を含む群から選択される１つまたは複数のヌクレオチド部位にまたはその間に導入される、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離ウイルスｓｓＲＮＡ。
7. 少なくとも１つの変異がそれぞれのヌクレオチド部位に導入される、請求項６に記載の単離ウイルスｓｓＲＮＡ。
8. 少なくとも以下の変異がそれぞれのヌクレオチド部位に導入される、請求項６に記載の単離ウイルスｓｓＲＮＡ：
   ａ．２８８〜３０４にまたはその間における少なくとも３つの変異；
   ｂ．３７７〜３８６にまたはその間における少なくとも３つの変異；
   ｃ．５９０〜６０８にまたはその間における少なくとも３つの変異；
   ｄ．８７２〜８７７にまたはその間における少なくとも２つの変異。
9. さらなるフレームシフト変異が、部位２８８〜３０４にまたはその間に導入され、これが、少なくとも前記ｓｓＲＮＡに導入された後に、ＮＳ４の機能を破壊する終止コドンをコードする、請求項８に記載の単離ウイルスｓｓＲＮＡ。
10. ＡＨＳＶのＳ９セグメントの少なくとも１つの必須遺伝子を発現し、請求項１から９のいずれか一項に記載のｓｓＲＮＡ中の変異した前記必須遺伝子を相補する細胞であって、それにより、ｓｓＲＮＡに感染した場合に、細胞におけるワクチン用ウイルス株の複製が可能である、細胞。
11. 請求項１から９のいずれか一項に記載のｓｓＲＮＡに感染した、請求項１０に記載の細胞。
12. 請求項１から９のいずれか一項に記載の単離ウイルスｓｓＲＮＡを含む、ワクチン用ウイルス株。
13. ワクチン用ウイルス株が血清型特異的であり、そのため、ＡＳＨＶ１、ＡＨＳＶ２、ＡＨＳＶ３、ＡＨＳＶ４、ＡＨＳＶ５、ＡＨＳＶ６、ＡＨＳＶ７、ＡＨＳＶ８およびＡＨＳＶ９のいずれか１つを含む、請求項１２に記載のワクチン用ウイルス株。
14. ＡＨＳＶ１〜９の任意の組み合わせを含み、ＡＨＳＶ１〜９のすべてを含む、複数の前記血清型を含む、請求項１３に記載のワクチン用ウイルス株。
15. 治療において使用するための、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のワクチン用ウイルス株。
16. 治療において使用するための、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離ウイルスｓｓＲＮＡ。
17. ＡＨＳＶに対する非ヒト動物のワクチン接種において使用するための、請求項１２から１４または１６のいずれか一項に記載のワクチン用ウイルス株。
18. ＡＨＳＶに対する非ヒト動物のワクチン接種において使用するための、請求項１から９または１７のいずれか一項に記載の単離ウイルスｓｓＲＮＡ。
19. 非ヒト動物がウマ、ポニー、ラバ、ロバまたはシマウマを含む群から選択される、請求項１７に記載のワクチン用ウイルス株または請求項１８に記載の単離ウイルスｓｓＲＮＡ。
20. 請求項１２から１４のいずれか一項に記載のワクチン用ウイルス株を、薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルと組み合わせて含む、医薬組成物。
21. 請求項１から９のいずれか一項に記載の単離ウイルスｓｓＲＮＡを、薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルと組み合わせて含む、医薬組成物。
22. 請求項２０または２１に記載の医薬組成物および１種または複数の追加の抗ウイルス剤（複数可）を含む、組み合わせ治療薬。
23. ＡＨＳＶに対する非ヒト動物のワクチン接種方法であって、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のワクチン用ウイルス株、または請求項２０もしくは２２に記載の医薬組成物の有効量を非ヒト動物に送達または投与することを含む、方法。
24. ＡＨＳＶに対する非ヒト動物のワクチン接種方法であって、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離ウイルスｓｓＲＮＡ、または請求項２１もしくは２２に記載の医薬組成物の有効量を非ヒト動物に送達または投与することを含む、方法。
25. 前記非ヒト動物がウマ、ポニー、ラバ、ロバまたはシマウマを含む群から選択される、請求項２３または２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 請求項１から９のいずれか一項に記載の単離ｓｓＲＮＡおよび請求項１０または１１に記載の細胞を含む、キット。
27. 所与の血清型の欠損ＡＨＳＶウイルスの生成方法であって、
    ａ）それぞれが少なくとも前記ｓｓＲＮＡに導入された後に終止コドンを提供またはコードする複数の変異を、前記ウイルスのＳ９セグメントに導入することと、
    ｂ）以下の選択されたセグメントＳ２＋Ｓ６；Ｓ２＋Ｓ６＋Ｓ７；Ｓ２＋Ｓ６＋Ｓ７＋Ｓ３；またはＳ２＋Ｓ６＋Ｓ７＋Ｓ３＋Ｓ１０を再集合または交換して、以下の血清型ｄｅｆ−ＡＨＳＶ８およびｄｅｆ−ＡＨＳＶ９血清型；ｄｅｆ−ＡＨＳＶ３およびｄｅｆ−ＡＨＳＶ４；ｄｅｆ−ＡＨＳＶ５、ｄｅｆ−ＡＨＳＶ６およびｄｅｆ−ＡＨＳＶ７；ならびにｄｅｆ−ＡＨＳＶ２をそれぞれ生成することと
    を含む、方法。
28. 所与の血清型の欠損ＡＨＳＶウイルスの生成方法であって、
    ａ）それぞれが少なくとも前記ｓｓＲＮＡに導入された後に終止コドンを提供またはコードする複数の変異を、前記ウイルスのＳ９セグメントに導入することと、
    ｂ）やはり以下の選択されたセグメントを再集合または交換して、以下の血清型を生成することと：
    外殻タンパク質ＶＰ２およびＶＰ５をコードする２つのセグメント（Ｓ２＋Ｓ６）を再集合してｄｅｆ−ＡＨＳＶ８およびｄｅｆ−ＡＨＳＶ９血清型を生成すること；ならびに／または
    外殻タンパク質ＶＰ２およびＶＰ５をコードする２つのセグメント（Ｓ２＋Ｓ６）と中間コアタンパク質ＶＰ７をコードするセグメント（Ｓ７）を再集合してｄｅｆ−ＡＨＳＶ３およびｄｅｆ−ＡＨＳＶ４を生成すること；ならびに／または
    外殻タンパク質ＶＰ２およびＶＰ５をコードする２つのセグメント（Ｓ２＋Ｓ６）と中間コアタンパク質ＶＰ３をコードするセグメント（Ｓ３）を再集合してｄｅｆ−ＡＨＳＶ５、ｄｅｆ−ＡＨＳＶ６およびｄｅｆ−ＡＨＳＶ７を生成すること；ならびに／または
    外殻タンパク質ＶＰ２およびＶＰ５をコードする２つのセグメント（Ｓ２＋Ｓ６）と中間コアタンパク質ＶＰ７をコードするセグメント（Ｓ７）と中間コアタンパク質ＶＰ３をコードするセグメント（Ｓ３）とＮＳ３／ＮＳ３Ａをコードするセグメント（Ｓ１０）を再集合してｄｅｆ−ＡＨＳＶ２を生成すること
    を含む、方法。