JP2005535338A - C及び/又はe1タンパク質を発現しないペスチウイルスのレプリコン及びワクチンに使用できる前記レプリコンを含む感染性ウイルス粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
a.特定ペスチウイルス(例えばBVDV)に許容性であり、ペスチウイルスのE1及び/又はCタンパク質を発現する細胞を提供すること、
b.前記細胞を本発明に従ったレプリコンでトランスフェクトすること、
c.工程bで得たトランスフェクト細胞を培養すること、及び
d.前記細胞培養物からウイルス粒子を採集すること
を含みうる。
BVDV CP7についての感染性クローンの樹立後、ncp BVDV(26)の回収を可能にする、27ヌクレオチド挿入物の欠失を有する構築物の変異体を作製した。pA/BVDV/Ins−と称するこの構築物に基づき、BVDV ORF内にフレームシフトを導入することなくC及びE1をコードする配列を欠失させることによってレプリコンを構築した(図1)。図1に示す突然変異体BVDVクローンは、完全長cDNAクローンpA/BVDV/ins−に基づいて構築した。制限部位の位置は、BVDV/CP7ゲノム内のそれらの開列位置に相当する肩付き文字で指示している(図1)。
NCP7ΔC及びNCP7ΔE1プラスミドを2段階クローニング手順によって構築した。2個のPCRフラグメントを、XhoI209及びKpnI2447、3797で消化したプラスミドpA/BVDV/ins−に挿入した(表1)。
PCRのために、PTC−200熱サイクラー(MJ Research,Inc.)を使用した。DNAに基づく増幅を、供給者のプロトコールに従ってExpand High Fidelity PCR System(Roche Molecular Biochemicals)によって実施した。RT−PCRについては、TRIZOL試薬(Gibco−Life Technologies)を使用してウイルス感染細胞の全RNAを抽出した。逆転写酵素(Promega)及び配列特異的プライマーを使用してRNA鋳型からcDNAを増幅した。合成したcDNAを熱安定なTaqポリメラーゼ(Promega)で増幅し、PCR産物を直接配列決定した。配列決定は、Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit(Amersham Biosciences)を用いて実施した。ヌクレオチド配列をLICOR自動シーケンサー(NWG Biotech)で読み取り、Wisconsinソフトウエアパッケージバージョン9.1(Genetics Computer Group,USA)を用いて分析した。
その後、インビトロ転写した完全長レプリコンRNAをBVDV陰性PT細胞にトランスフェクトした。
BVDVタンパク質の検出のために、モノクローナル抗体(mab)WB210(抗ERNS、CVL、Weybridge)、WB215(抗E2、CVL、Weybridge)、CA3(抗E2、Institute for Virology,TiHo Hannover)、mab混合物WB103/105(抗NS3、CVL、Weybridge)、及びC16(抗NS3、Institute for Virology,TiHo,Hannover)を使用した(15、16、31)。
(C−ERNS−E1−E2発現PT細胞の樹立)
BVDVレプリコンに関する相補性研究を行うために、BVDV構造タンパク質を構成的に発現するウシ細胞系を確立した。
トランス相補性実験のために、インビトロ転写したBVDVレプリコンRNA又は完全長NCP7 RNAを電気穿孔によってPT_805細胞の単層にトランスフェクトした。トランスフェクション後(p.t.)24、48及び72時間目に細胞培養上清を収集し、遠心分離(10,000×g、5分間)によって清澄化して、高度感受性KOP−R細胞を用いて力価測定した。KOP−R細胞(RIE244、CCVL)は、Federal Research Center of Virus diseases of Animals,Insel Riems(CCLV)の獣医学科における細胞系統コレクションから入手した、二倍体ウシ食道細胞系の細胞である。KOP−R細胞は、それらのBVDV感染に対する感受性及びBVDV増殖のための適合性の故に選択した。細胞をPT細胞について前述したように増殖させた。複製に関する陰性対照として、複製不能(replication incompetent)対照を使用した(欠失突然変異体NCPΔNS5及びNCP7Δ3’ntraatll)。
ウエル中の細胞数×IF陽性細胞%×希釈係数=IU/mlでの力価
に従って感染単位(IU)を算定した。算定については、>5%及び<30%IF陽性細胞を含むウェルだけを考慮した。
BVDVレプリコンに関する相補性研究を行うために、BVDV構造タンパク質、Capsid及びERNSを構成的に発現するウシ細胞系を確立した。
NCP7_ΔCによるトランスフェクションは、PT細胞で得られたのと同様の免疫蛍光パターンを導いた。トランスフェクト細胞の80%〜95%がNS3特異的抗体と反応性であった。KOP−R細胞の感染によって示されるように、NCP7ΔCでトランスフェクトされたPT875細胞の上清において感染性組換えBVDVが検出された。生じた相補ウイルスNCP7ΔC_transのウイルス力価は、トランスフェクション後24時間目で103.0〜105IU/mlの範囲であった(データは示していない)。
(試験材料及び方法)
免疫のためのトランス相補したNCP7ΔCレプリコン(NCP7_ΔC_trans)
インビトロ転写したNCP7_ΔC RNAをPT_805ヘルパー細胞にトランスフェクトした。ヘルパー細胞の上清をトランスフェクション後24及び48時間眼に収集し、−70℃で保存した。KOP−R細胞を使用してトランス相補ビリオンを力価測定し、IUでの力価を決定した。免疫のために使用するビリオン製剤を細菌及びウイルス夾雑物に関して試験した。さらに、KOP−R細胞での継代とRT−PCR分析を使用することにより、復帰突然変異型BVDVならびに野生型BVDVを除外した。
BVDV及びBHV−1に血清陰性な3〜5ヶ月齢の10頭の健常ウシ(「Simmental」品種)をこの実験において使用した。5頭の動物に、29日の間隔を置いて2回、筋肉内(i.m.)及び鼻内(i.n.)経路でワクチン接種した。ワクチン群の各々の動物(動物番号173、537、554、758、977)は、106IU/mlのNCP7_ΔC_transを含有するウイルス懸濁液4ml(MUTO(商品名)注射器に取り付けたエーロゾルディスペンサーを使用して2ml i.n.及び2ml i.m.)を接種した。5頭の仔ウシを非ワクチン接種対照(動物番号97、99、172、610、611)として使用した。全ての動物を、初回免疫から62日目にMUTO(商品名)注射器に取り付けたエーロゾルディスペンサーを使用して野生型BVDV菌株SE5508で攻撃誘発した(Wolfmeierら、Arch.Virol.,142、2049−2057,1997)。各々の動物は、106TICID50の力価で各鼻孔当りウイルス懸濁液1mlを接種した。各々の免疫後及び攻撃誘発感染後(p.chall.)最初の10日間毎日鼻スワブ及びEDTA血液試料を採取した。それぞれ免疫後/攻撃誘発後14、21及び28日目に追加試料を採集した。免疫後/攻撃誘発後0、3、7、14、21及び29日目に全ての動物から血清試料を採集した。
中和アッセイ
全ての動物からの血清をBVDV菌株CP7及びSE5508に対する標準血清中和試験(SNT)において試験した。血清を不活性化し(30分間、56℃)、96穴プレートにおいて細胞培地(MEM、10%FBS)を使用して3倍に希釈した(log2;50μl)。50μl中100TCID50BVDVを添加し、プレートを37℃でインキュベートした。2時間のインキュベーション後、細胞培地100μl中2×104/穴のBVDV陰性KOP−R細胞を添加し、プレートを37℃、5%CO2で5日間インキュベートした。BVDV抗体陽性及び陰性血清を対照として使用し、ウイルス力価を逆滴定(log10、n=8)によって確認した。間接免疫蛍光染色によって細胞におけるBVDV感染を検出した。中和力価を、IFシグナルが全く認められなかった逆最終希釈(reciprocal last dilution)(n=3)の幾何平均値として算定した。
間接BVDV ANTIBODY ELISA(IDEXX)及びNS3遮断BVDV ANTIBODY CEDI−TEST(Cedi−Diagnostics)を使用してBVDV特異的ならびにBVDV NS3特異的抗体を測定した。どちらのアッセイも製造者の指示に従って使用した。
KOP−R細胞と血液白血球の共培養又はKOP−R細胞の単層への鼻スワブの接種を使用してウイルスを単離した。4〜6日間のインキュベーション期間後、IF染色を使用することによって細胞をBVDV NS3に関して分析した。
107白血球を含むEDTA血液を溶血後に遠心分離し、氷冷PBSで2回洗い、PBS1mlに再懸濁した。PBS100μl中106洗浄白血球(n=2)を使用してKOP−R細胞培養物を接種し、4〜6日間インキュベートした。NS3特異的mabでのIF染色を用いてBVDVを検出した。
鼻スワブ(約100mg分泌物/スワブ)を、抗生物質及び5%BVDV抗体不含ウシ血清を含むPBS1ml中で安定化した。20秒間攪拌した後、100μlアリコートをKOP−R細胞培養物(n=2)に接種した。4〜6日間のインキュベーション期間後、IF染色を使用して細胞をBVDV NS3−抗原に関して検討した。
攻撃誘発感染後のBVDV抗原の検出のために、全ての動物からの血液試料を、製造者の指示に従って市販のERNS捕獲ELISAシステム(Checkit BVDV III、Dr.Bommeli AG,Switzerland)で試験した。
(NCP7_ΔC_transの適用後の健康状態)
全ての動物がNCP7_ΔC_transによる免疫後健康なままであり、異常な臨床スコアは全く認められなかった。白血球減少あるいは体温上昇は測定されなかった(データは示していない)。
全ての動物が実験開始時にはBVDV抗体を有しておらず(BVDV抗体ELISA及びBVDV I型及びII型に対する中和アッセイ)、また全ての対照動物がBVDV攻撃誘発感染までBVDV抗体陰性のままであった。NCP7_ΔC_transによる初回免疫後、ワクチン群の全ての動物が免疫後29日目にNS3特異的抗体に関して陽性スコアだった(平均値:66%)が、間接BVDV ELISAでは陰性であった(平均値:0.13)。NS3特異的抗体応答は、ワクチン接種動物からの血清では免疫後14日目に早くも検出することができた(図2a)。初回免疫後、BVDV菌株SE5508に対する1:3〜1:12の中和抗体力価が検出できた(図3)。
NCP7_ΔC_trans接種後のいずれの動物においても複製BVDVは単離できなかった。KOP−R細胞を使用した血液白血球及び鼻スワブに関する全てのウイルス検出アッセイが陰性スコアだった(表4)。
攻撃誘発感染後、感染の臨床的徴候、白血球減少あるいは発熱は、トランス相補レプリコンでワクチン接種した動物のいずれにおいても検出できなかった(図4a及びb)。これに対し、ナイーブ対照動物の大部分が呼吸器症状(鼻分泌物、咳)及び抑うつを伴うBVDV感染の臨床的徴候を呈した(データは示していない)。全ての対照動物において、攻撃誘発感染後3日目〜8日目まで著明な白血球減少ならびに40℃以上の高い体温が認められた(図4a及びb)。
攻撃誘発感染後、全ての対照動物がELISAシステム(図2a及びb)及び中和アッセイ(データは示していない)において陽性スコアだった。攻撃誘発感染後14日目からBVDV抗体が検出できた(図2a及びb)。ワクチン接種群では、間接ELISAで著明なブースター効果が検出できたが(攻撃誘発感染後0日目の0.8から28日目の1.9までの平均値)、NS3遮断ELISAでは検出できなかった(図2a及びb)。
全てのワクチン接種動物がNCP7_ΔC_transの接種後健康なままであった。臨床症状は認められず、発熱も白血球減少も検出されなかった。ワクチン接種後、鼻スワブからも血液白血球からもBVDVは再単離できなかった。合わせて考えると、復帰突然変異型NCP7様ウイルスの発生は除外することができない。本発明者らは、それ故、NCP7_ΔC_transはウシにとって非病原性であり、第二周期ビリオンにおける欠損(DISC)又は複製不能の「偽ビリオン」のように作用すると結論する。
Claims (12)
- 機能性C及び/又はE1タンパク質を除くペスチウイルスの全ての構造タンパク質を発現することを特徴とする、ペスチウイルスの1個以上の構造タンパク質を発現することができないペスチウイルスのレプリコン。
- E1又はCタンパク質のコード配列の少なくとも一部が前記レプリコンから欠失している、請求項1に記載のレプリコン。
- 前記レプリコンが機能性Cタンパク質をコードしないことを特徴とする、請求項1又は2に記載のレプリコン。
- 前記レプリコンがウシウイルス性下痢性ウイルス(BVDV)である、請求項1又は2に記載のレプリコン。
- Cタンパク質のアミノ酸位置201−243をコードするコード領域が欠失していることを特徴とする、請求項4に記載のレプリコン。
- 前記レプリコンが機能性E1タンパク質をコードしないことを特徴とする、請求項1又は2に記載のレプリコン。
- E1タンパク質のアミノ酸位置498−653をコードするコード領域が欠失していることを特徴とする、請求項4に記載のレプリコン。
- 請求項1から7のいずれかに記載のレプリコンを含むことを特徴とする、ペスチウイルスの感染性ウイルス粒子。
- 以下の工程:
a.ペスチウイルスに許容性であり、ペスチウイルスのE1及び/又はCタンパク質を発現する細胞を提供すること、
b.前記細胞を請求項1から7のいずれかに記載のレプリコンのインビトロ転写RNAでトランスフェクトすること、
c.工程bで得たトランスフェクト細胞を培養すること、及び
d.前記培養細胞からウイルス粒子を採集すること
を含むことを特徴とする、請求項8に記載のペスチウイルスのウイルス粒子の生産のための方法。 - 前記ペスチウイルスがBVDVであることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記細胞がBVDVのE1及び/又はCタンパク質を発現することを特徴とする、請求項10又は11に記載の方法。
- 請求項8に記載の感染性ウイルス粒子及び医薬適合性の担体を含有するワクチン。
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