CN115927416A - 嵌合猪瘟病毒、猪瘟标记疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了嵌合猪瘟病毒、猪瘟标记疫苗及其制备方法和应用。本申请实施例采用反向遗传学操作技术将猪瘟减毒活疫苗C株的非编码区和E2蛋白的主要抗原区域替换为BVDV Hubei strain相对应的区域，构建了嵌合猪瘟病毒的感染性克隆。将感染性克隆通过细胞转染和传代拯救得到了特性稳定的嵌合猪瘟病毒。该嵌合猪瘟病毒可以在猪源细胞稳定复制，具有遗传稳定性和安全性；免疫机体后可诱导产生特异性抗体，还能够为猪体提供抵抗猪瘟病毒强毒致死感染的完全保护。并且，该毒株可免疫产生BVDV E2特异性抗体以达到区分疫苗接种猪和野生型猪瘟病毒感染猪，从而该毒株具有作为猪瘟标记疫苗的应用前景。

Description

嵌合猪瘟病毒、猪瘟标记疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及猪瘟病毒技术领域，具体嵌合猪瘟病毒、猪瘟标记疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

猪瘟(classical swine fever,CSF)是一种由猪瘟病毒(classical swine fevervirus,CSFV)感染引起的猪烈性、病毒性传染病。CSFV是一种具有囊膜的病毒，病毒粒子略呈圆形，粒子直径为34-50纳米，内部核心直径约30纳米，病毒粒子表面有脆弱的纤突结构。囊膜由双层脂质形成，结构糖蛋白E^rns、E1和E2镶嵌在膜上，囊膜内核衣壳蛋白Core呈正十二面体包裹着病毒基因组RNA。

猪瘟病毒是一种单股正链的RNA病毒，基因组全长约12.3kb，包含一个大的开放阅读框(open reading frame，ORF)和两端的非编码区(untranslated region，UTR)。其中5’UTR不含帽子结构，3’UTR没有poly A的尾巴。中间大的ORF编码一个大约3898个氨基酸(amino acid，aa)的多聚蛋白，多聚蛋白经过细胞或者病毒蛋白酶切割加工后，形成12种成熟的蛋白，包括4种结构蛋白Core、E^rns(E0)、E1、E2和8种非结构蛋白N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中，猪瘟病毒基因组两端的UTRs是病毒RNA复制和翻译的重要调节因子，结构蛋白E2是主要的抗原蛋白，可以诱导产生特异性抗体，起到防护猪瘟的作用。

接种疫苗是防护CSF强有力的手段，猪瘟病毒C株是一种兔化的减毒活疫苗，在中国得到了广泛的使用，并且可以为猪体提供抵抗CSFV强毒株感染的完全保护。但是作为减毒活疫苗，存在的最主要缺陷是不可以在血清学上区分疫苗接种猪和CSFV野毒感染猪(differentiate between infected and vaccinated animals,DIVA)，这严重阻碍了CSF净化。

发明内容

为此，本申请实施例公开了一种嵌合猪瘟病毒、猪瘟标记疫苗及其制备方法和应用。采用反向遗传学操作技术将猪瘟疫苗C株(C-strain)的非编码区(untranslatedregions,UTRs)和E2蛋白的主要抗原区域(aa 690-860)替换为牛病毒性腹泻病毒(bovineviral diarrhea virus,BVDV)Hubei strain相对应的区域，构建了嵌合猪瘟病毒感染性多核苷酸pC/bUTRs-tE2。通过将感染性多核苷酸pC/bUTRs-tE2转染细胞和传代拯救得到了减毒的、特性稳定的嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2以及其为主要活性成分的组合物及标记疫苗。该嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2不仅遗传和生物学特性稳定、可以稳定复制，还具有安全性；能够在机体内诱导产生特异性抗体，还能够保护猪体抵抗猪瘟病毒强毒感染；并且可诱导产生可区分的BVDV E2特异性抗体达到区分疫苗接种猪和猪瘟病毒野毒感染猪，具有作为猪瘟标记疫苗的应用前景。

为此，本申请实施例至少公共了以下技术方案：

第一方面，本申请实施例公开了一种分离的感染性多核苷酸或感染性克隆，所述感染性多核苷酸或所述感染性克隆携带嵌合基因组，所述嵌合基因组包含一个开放阅读框及处于所述开放阅读框两端的5’UTR区和3’UTR区；

所述5’UTR区和所述3’UTR区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～2所示；

所述开发阅读框编码Core、E^rns(E0)、E1、E2、N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B；Core、E^rns(E0)、E1、N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B以及E2的C端区域编码基因的核苷酸序列均来自于猪瘟疫苗C株的基因组；

所述E2蛋白N端抗原区编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

将所述感染性多核苷酸引入细胞并通过传代可以产生感染性猪瘟病毒颗粒。

第二方面，本申请实施例公开了一种载体，包含第一方面所述的感染性多核苷酸或所述感染性克隆。

第三方面，本申请实施例公开了一种细胞，携带第一方面所述的感染性多核苷酸或所述感染性克隆。

第四方面，本申请实施例公开了一种猪瘟病毒颗粒，所述猪瘟病毒颗粒包裹携带有嵌合基因组的单链RNA，所述嵌合基因组包含一个开放阅读框及处于所述开放阅读框两端的5’UTR区和3’UTR区；所述5’UTR区和所述3’UTR区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～2所示；所述开发阅读框编码Core、E^rns(E0)、E1、E2、N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B；Core、E^rns(E0)、E1、N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B以及E2的C端区域编码基因的核苷酸序列均来自于猪瘟疫苗C株的基因组；所述E2蛋白N端抗原区编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

第五方面，本申请实施例公开了一种组合物或标记疫苗，所述组合物或标记疫苗包含猪瘟病毒颗粒，所述猪瘟病毒颗粒包裹携带有嵌合基因组的单链RNA，所述嵌合基因组包含一个开放阅读框及处于所述开放阅读框两端的5’UTR区和3’UTR区；所述5’UTR区和所述3’UTR区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～2所示；所述开发阅读框编码Core、E^rns(E0)、E1、E2、N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B；Core、E^rns(E0)、E1、N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B以及E2的C端区域编码基因的核苷酸序列均来自于猪瘟疫苗C株的基因组；所述E2蛋白N端抗原区编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

第六方面，本申请实施例公开了第一方面所述的感染性多核苷酸或感染性克隆在制备猪瘟标记疫苗中的应用。

与现有技术相比，本申请至少具有以下有效效果：

本申请实施例构建了嵌合猪瘟病毒、其标记疫苗、其制备方法和应用。其中一个实施例提供了构建的嵌合减毒猪瘟疫苗C株的感染性克隆pC/bUTRs-tE2，通过转染细胞和传代拯救得到了减毒的、稳定传代的嵌合猪瘟病毒C株rC/bUTRs-tE2以及其为主要活性成分的疫苗及其组合物。该嵌合减毒活疫苗rC/bUTRs-tE2不仅可以稳定复制，还具有安全性；能够在机体内诱导产生特异性抗体，还能够保护猪体抵抗猪瘟病毒强毒感染；并且可诱导产生可区分的BVDV E2特异性抗体达到区分疫苗接种猪和野生型猪瘟病毒感染猪，具有作为猪瘟标记疫苗的应用前景。

附图说明

图1为本申请实施例提供的嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2的基因组构建示意图。

图2为本申请实施例提供的嵌合猪瘟病毒的感染性克隆pC/bUTRs-tE2的结构示意图，其中包括来自BVDV的5’UTR区和3’UTR区，以及来自于BVDV(GenBank：MZ484396)的E2抗原区。

图3为本申请实施例提供的嵌合猪瘟病毒的感染性克隆pC/bUTRs-tE2的酶切片段凝胶电泳结果图，电泳条带名称以于图上方注明，右侧注明了9208bp和5890bp代表图2中pC/bUTRs-tE2经由BamHI和MluI双酶切的目的片段。

图4为本申请实施例提供的嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs和rC/bUTRs-tE2转染PK15细胞的免疫荧光染色图。

图5为本申请实施例提供的嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs和rC/bUTRs-tE2转染PK15细胞拯救后上清RT-PCR结果图。

图6为本申请实施例提供的嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2的P0、P10、P20、P30和P40感染PK15细胞后的免疫荧光染色图。

图7为本申请实施例提供的嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2的P0、P10、P20、P30和P40在PK15细胞上的病毒滴度结果图。

图8为本申请实施例提供的猪瘟病毒C株、rC/bUTRs-tE2和rC/bUTRs分别感染PK15细胞和MDBK细胞的免疫荧光染色图。

图9为本申请实施例提供的猪瘟病毒C株、rC/bUTRs-tE2和rC/bUTRs在PK15细胞上基因组RNA复制的结果图。

图10为本申请实施例提供的猪瘟病毒C株、rC/bUTRs-tE2和rC/bUTRs分别在SK6细胞上形成的蚀斑(左图)及大小统计结果图(右图)。

图11为本申请实施例提供的猪瘟病毒C株、rC/bUTRs-tE2和rC/bUTRs分别在兔体诱导产生抗体的结果图。左图：rC/bUTRs-tE2在兔体诱导的CSFV特异性抗体，CSFV特异性抗体通过IDEXX商用的CSFV特异性抗体试剂盒检测，当抗体阻断值≥40％认为是阳性(Cut-off线)。右图：rC/bUTRs-tE2在兔体诱导病毒中和抗体滴度图，血清病毒中和抗体滴度通过血清中和CSFV强毒株石门株实验测得。

图12为本申请实施例提供的猪瘟病毒C株和rC/bUTRs-tE2分别免疫猪体的猪体肛温图。

图13为本申请实施例提供的猪瘟病毒C株和rC/bUTRs-tE2(DMEM作为对照)分别免疫和攻毒后猪体临床症状打分和存活曲线图。左图：猪体临床症状打分，依据Mittelholzer等人建立的猪瘟临床打分标准对所有猪体进行打分，包括活力、身体紧张度、体型、呼吸、行走、皮肤(特别是耳朵、鼻子、腿和尾巴)、眼睛/结膜、食欲、排便和残留饲料。正常临床症状0分，轻微临床症状1分，明显临床症状2分，严重临床症状3分，将所有分数相加，最大临床症状打分为30分。右图：猪体攻毒后存活曲线。

图14为本申请实施例提供的猪瘟病毒C株和rC/bUTRs-tE2(DMEM作为对照)免疫和攻毒后猪体白细胞和血小板计数结果。左图：免疫和攻毒后猪体白细胞计数。右图：免疫和攻毒后猪体血小板计数。

图15为本申请实施例提供的猪瘟病毒C株和rC/bUTRs-tE2(DMEM作为对照)免疫和攻毒后猪体CSFV特异性抗体和病毒中和抗体滴度结果。左图：猪瘟疫苗C株非编码区和E2替换重组嵌合病毒疫苗株rC/bUTRs-tE2在猪体诱导的CSFV特异性抗体，CSFV特异性抗体通过IDEXX商用的CSFV特异性抗体试剂盒检测，当抗体阻断值≥40％认为是阳性。右图：猪瘟疫苗C株非编码区和E2替换重组嵌合病毒疫苗株rC/bUTRs-tE2在猪体诱导病毒中和抗体滴度，血清中和抗体滴度通过血清中和CSFV强毒株石门株实验测得。

图16为本申请实施例提供的以CSFV E^rns作为包被抗原的间接ELISA检测重组嵌合病毒疫苗株rC/bUTRs-tE2免疫血清结果。左图：CSFV E^rns间接ELISA检测重组嵌合病毒疫苗株rC/bUTRs-tE2免疫兔血清。右图：CSFV E^rns间接ELISA检测重组嵌合病毒疫苗株rC/bUTRs-tE2免疫猪血清。

图17为本申请实施例提供的BVDV tE2作为包被抗原的间接ELISA检测重组嵌合病毒疫苗株rC/bUTRs-tE2免疫血清结果。左图：BVDV tE2间接ELISA检测重组嵌合病毒疫苗株rC/bUTRs-tE2免疫兔血清。右图：BVDV tE2间接ELISA检测重组嵌合病毒疫苗株rC/bUTRs-tE2免疫猪血清。

图18为本申请实施例提供的CSFV E^rns表达载体酶切产物的电泳鉴定结果图。泳道依次为DL5000marker，pET-28a-E^rns质粒，Ncol I单酶切产物，Xho I单酶切产物以及双酶切产物，5231bp为载体条带，689bp为目的条带。

图19为本申请实施例提供的CSFV E^rns目的蛋白诱导表达SDS-PAGE鉴定(左图)和Western-Blot鉴定(右图)。左图：CSFV E^rns目的蛋白诱导表达SDS-PAGE鉴定。M：marker；泳道1：BL21/pET28a未诱导全菌体；泳道2：BL21/pET28a诱导全菌体；泳道3：BL21/pET-28a-E^rns未诱导全菌体；泳道4：BL21/pET-28a-E^rns诱导全菌体；泳道5：BL21/pET-28a-E^rns诱导上清；泳道6：BL21/pET-28a-E^rns诱导沉淀。右图：CSFV E^rns目的蛋白诱导表达Western-Blot鉴定。M：marker；泳道1：BL21/pET28a未诱导；泳道2：BL21/pET28a诱导全菌体；泳道3：BL21/pET-28a-E^rns未诱导全菌体；泳道4：BL21/pET-28a-E^rns诱导全菌体；泳道5：BL21/pET-28a-E^rns诱导上清；泳道6：BL21/pET-28a-E^rns诱导沉淀。

图20为本申请实施例提供的CSFV E^rns目的蛋白洗脱液的SDS-PAGE鉴定结果。M：marker；泳道1：结合后的上清；泳道2-4：杂蛋白洗脱液；泳道5-14：目的蛋白洗脱液。

图21为本申请实施例提供的CSFV E^rns目的蛋白复性后的SDS-PAGE鉴定结果。M：Protein marker；泳道1：BL21/pET28a未诱导全菌体；泳道2：BL21/pET28a诱导全菌体；泳道3：BL21/pET-28a-Erns未诱导全菌体；泳道4：BL21/pET-28a-Erns诱导全菌体；泳道5：透析复性后的CSFV E^rns。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

感染性多核苷酸或感染性克隆

本申请实施例公开了猪瘟病毒(CFSV)的感染性多核苷酸/或感染性克隆。本文所用的术语“感染性克隆”是具有两个及以上核苷酸的多核苷酸，其指能够在原核宿主细胞或真核细胞中复制的多核苷酸序列，其在本文中与“感染性多核苷酸”可互换使用。当体外转录得到RNA多核苷酸并引入感受细胞时，作为RNA能够在细胞内复制并产生感染性病毒颗粒。因此，嵌合猪瘟病毒基因组可以DNA形式存在于载体中，以RNA形式存在于病毒颗粒中，或者以分离的DNA或RNA形式存在。术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，无论是核糖核苷酸还是脱氧核糖核苷酸，其包括双链和单链DNA和RNA。除非另有说明，否则多核苷酸包括其互补形式。本领域技术人员可以容易地确定多核苷酸的互补核苷酸序列。多核苷酸可包括具有不同功能的核苷酸序列，包括例如编码序列和非编码序列(例如调节序列和/或非翻译区)。可直接从天然来源获取多核苷酸，或者借助于重组技术、酶促技术或化学技术而制备多核苷酸。多核苷酸在拓扑学上可以是线状或环状的。多核苷酸可以是例如载体(例如表达载体或克隆载体)的组成部分或片段。

如果是天然存在的话，多核苷酸优选是“分离的”，更优选是纯化的。“分离的”化合物(例如多核苷酸、蛋白或病毒颗粒)是与其天然环境中分开和分离的化合物。“纯化的”化合物是至少60％不含与其天然缔合的其它成分，优选75％、最优选90％不含与其天然缔合的其它成分。在天然生物体之外产生(例如通过化学方法或重组方法产生)的诸如多核苷酸和多肽等化合物，按定义就认为是分离和纯化的，因为它们在天然环境中不存在。

本申请实施例公开了一种分离的感染性多核苷酸或感染性克隆，所述感染性多核苷酸或感染性克隆携带至少一个嵌合基因组。在一些实施例中，该感染性多核苷酸或感染性克隆可以携带多个拷贝的嵌合基因组，以增强其感染性或病毒拯救效率。该嵌合基因组包含一个大的开放阅读框(open reading frame，ORF)和两端的非编码区(untranslatedregion，UTR)，ORF编码一个大约3898个氨基酸(amino acid，aa)的多聚蛋白，多聚蛋白经过细胞或者病毒蛋白酶切割加工后，形成12种成熟的蛋白，包括4种结构蛋白Core、E^rns(E0)、E1、E2和8种非结构蛋白N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中，该嵌合基因组全长为约12.3kb的多核苷酸，5’UTR区区位于1～375nt区间，3’端UTR区位于12068～12300nt区间，E2蛋白的编码区位于2441～3559nt区。其中，5’UTR区来自于牛病毒性腹泻病毒(bovineviral diarrhea virus,BVDV Hubei株)，如SEQ ID NO.1所示。3’UTR区来自于BVDV Hubei株，如SEQ ID NO.2所示。E2蛋白编码区的抗原区(如SEQ ID NO.3所示)来自于BVDV Hubei株E2蛋白编码区(GenBank accession number：MZ484396)相对应的区域。其中，Core、E^rns(E0)、E1、N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B以及E2的C端区域的编码基因的核苷酸序列均来自于猪瘟疫苗C株的基因组(GenBank accession number AY805221)。

在一个实施例中，以CSFV疫苗C株cDNA感染性克隆pSPT_Ⅰ/C为基础，构建了嵌合猪瘟病毒cDNA感染性克隆pC/bUTRs。pC/bUTRs携带的一个拷贝的嵌合基因组是将C株的基因组两端非编码区UTRs替换为BVDV对应的区域得到的感染性克隆。在该实施例中，将pC/bUTRs经细胞转染和传代，能够得到一种嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs；较之C株病毒，嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs的复制效率显著增加。

进一步地，在一个实施例中，构建了另一CSFV疫苗C株cDNA感染性克隆pC/bUTRs-tE2，pC/bUTRs-tE2携带一个拷贝的嵌合基因组，该嵌合基因组是将C株的基因组两端非编码区UTRs替换为BVDV对应的区域，并且将将E2蛋白的N端(氨基酸690-860，主要抗原区)替换为BVDV对应的区域得到的基因组。通过将该cDNA感染性克隆pC/bUTRs-tE2转染细胞和传代，能够拯救得到一株嵌合猪瘟病毒pC/bUTRs-tE2。该嵌合猪瘟病毒pC/bUTRs-tE2不仅遗传和生物学特性稳定、可以稳定复制，还具有安全性；能够在机体内诱导产生特异性抗体，还能够保护猪体抵抗猪瘟病毒强毒感染；并且可诱导产生可区分的BVDV E2特异性抗体达到区分疫苗接种猪和猪瘟病毒野毒感染猪，具有作为猪瘟标记疫苗的应用前景。

“载体”是指包含待被体外或体内递送至靶细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒或病毒。出于预防或治疗的目的，异源多核苷酸可包含目标序列，并且可以任选地以表达盒的形式存在。如本文中所用，载体不需要能够在最终靶细胞或受试者中复制。该术语包括克隆载体和病毒载体。

术语“核酸”和“核酸序列”是指核苷酸寡核苷酸多核苷酸或其任何片段。这些术语还指基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的，并且可以代表肽核酸(PNA)或任何DNA样或RNA样物质的有义或反义链。术语“可操作连接”是指第一核酸序列氨基酸序列或配体与第二核酸序列氨基酸序列或配体处于功能关系的情况。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接到编码序列。可操作地连接的DNA序列或蛋白质或配体可以是紧密接近的或邻接的，并且在需要时将两个蛋白质编码区连接在同一阅读框中。

术语“插入”是指氨基酸或核苷酸序列的改变，分别导致一个或多个氨基酸残基或核苷酸的添加。

术语“重组”意指半合成或合成来源的多核苷酸，其在自然界中不存在或以自然界中未发现的排列与另一多核苷酸连接。术语“重组”相对于病毒载体是指载体，例如，已经在体外操作的病毒基因组，例如，使用重组核酸技术表达异源病毒核酸序列。

术语“嵌合”是指通过重组由来源与功能不同的多核苷酸序列剪接而形成的杂合多核苷酸序列。术语“嵌合猪瘟病毒”是指通过“重组”和/或“嵌合”技术对其基因组进行改造得到的一种突变的猪瘟病毒。

由此，在一些实施例中，将该感染性多核苷酸引入细胞时，所述感染性多核苷酸经转录、病毒基因组复制并产生感染性病毒颗粒。

在一些实施例中，该感染性基因组cDNA还包含在原核宿主细胞中复制的载体序列。

在一些实施例中，该感染性基因组cDNA存在于载体中。

在一些实施例中，该感染性多核苷酸转录产生病毒基因组存在于病毒颗粒中。

在一些实施例中，该感染性多核苷酸是DNA和/或RNA多核苷酸。

在一些实施例中，该感染性基因组质粒转录产生病毒基因组存在于细胞中。

嵌合猪瘟病毒

另一方面，本申请实施例公开了一种嵌合猪瘟病毒颗粒。该猪瘟病毒颗粒具有呈微观正十二面体的囊膜以及包装在所述囊膜中的单链RNA，所述单链RNA携带嵌合基因组，所述嵌合基因组包含一个开放阅读框及位于该开放阅读框两端的5’UTR区和3’UTR区。其中，5’UTR区和3’UTR区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～2所示。该开发阅读框编码Core、E^rns(E0)、E1、E2、N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B；Core、E^rns(E0)、E1、N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B以及E2蛋白C端区域编码基因的核苷酸序列均来自于猪瘟疫苗C株的基因组。E2蛋白N端抗原区编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

如图1所示，一些实施例提供了嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2，该病毒是将上述实施例提供的感染性克隆pC/bUTRs-tE2转染PK15细胞并在PK15细胞进行传代拯救得到的。细胞水平上特性研究表明，嵌合猪瘟病毒一些实施例还将rC/bUTRs-tE2免疫兔体，发现免疫14天后rC/bUTRs-tE2可以在兔体内检测到CSFV特异性抗体和中和抗体。

另外，一些实施例还将rC/bUTRs-tE2免疫猪体并评价了rC/bUTRs-tE2的疫苗安全性、免疫原性以及保护强毒感染的效果。结果发现，嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2免疫猪体后，猪体肛温正常，无明显临床症状，白细胞和血小板数目均在正常范围内，且未检测到病毒血症和病毒排毒，说明rC/bUTRs-tE2具有作为疫苗的良好的安全性。免疫21天后rC/bUTRs-tE2可以在猪体内检测到CSFV特异性抗体和中和抗体。嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2免疫组猪体在攻毒后6-8天左右，体温略微升高但未有明显发烧，具有轻微的临床症状，但这些症状均在3-4天后恢复。攻毒后7天，rC/bUTRs-tE2免疫组猪体在全血和咽拭子中检测出了10²较低的病毒拷贝数，但是在攻毒后14天，在全血、咽拭子和肛拭子中均未检测出病毒。攻毒后，rC/bUTRs-tE2免疫组猪体CSFV特异性抗体和中和抗体滴度显著增加，直至实验结束，rC/bUTRs-tE2免疫组所有猪体均存活良好。攻毒后21天，安乐死所有猪体并解剖，在rC/bUTRs-tE2免疫组猪体的组织中均未检测到病毒。表明嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2具有良好的免疫原性且可以保护猪体抵抗CSFV强毒的感染。

另外，为了评价rC/bUTRs-tE2作为标记疫苗的识别潜力，利用CN113512098A公开的基于BVDV tE2血清抗体间接ELISA方法以及本申请实施例中建立的基因CSFV E^rns血清抗体间接ELISA方法分别去检测rC/bUTRs-tE2免疫的兔体和猪体血清，发现rC/bUTRs-tE2免疫的兔体和猪体血清均呈现出CSFV E^rns和BVDV E2抗体双阳性，但是C株免疫的兔体和猪体血清呈现出CSFV E^rns抗体阳性和BVDV E2抗体阴性。当血清学检测呈现出CSFV E^rns和BVDVE2抗体双阳性可以认为是免疫了rC/bUTRs-tE2，而野生型CSFV感染后血清中只能检测出CSFV E^rns抗体阳性而BVDV E2抗体阴性，以此达到区分免疫和野生型感染猪体的目的。由此表明，嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2具有作为标记疫苗的识别潜力，并为进一步研发CSFV和BVDV的E2蛋白嵌合标记疫苗奠定了重要的理论和技术基础。

组合物或标记疫苗

基于此，本申请实施例还公开了一种组合物或疫苗。该组合物或疫苗包含嵌合猪瘟病毒颗粒及药学上或兽医学上可接受的运载体、赋形剂、媒介物或佐剂。该嵌合猪瘟病毒颗粒为上述实施例提供，其包含呈微观正十二面体的囊膜以及包装在所述囊膜中的单链RNA，该单链RNA具有对猪瘟疫苗C株进行修饰的嵌合基因组。该嵌合基因组具有与上述实施例提供的感染性多核苷酸相同的序列；囊膜中的E2蛋白为上述实施例提供的囊膜蛋白。

可以与本申请的疫苗组合使用的运载体、赋形剂、媒介物或佐剂是能增强所述猪对所述组合物或标记疫苗的免疫应答。所述运载体、赋形剂、媒介物或佐剂可以在与所述疫苗相同的时间和相同的部位使用，或者在不同的时间施用，例如，作为加强剂使用。运载体、赋形剂、媒介物或佐剂还可优选以与施用疫苗不同的方式和部位给所述猪施用。合适的运载体、赋形剂、媒介物或佐剂选自氢氧化铝(明矾)，免疫刺激复合物(ISCOMS)，非离子嵌段聚合物或共聚物，细胞因子(如IL-1，IL-2，IL-7，IFN-α，IFN-β，IFN-γ等)，皂苷，单磷酰脂质A(MLA)，和胞壁酰二肽(MDP)等。其他合适的佐剂包括，例如，硫酸铝钾，从大肠杆菌中分离的热不稳定性或热稳定性肠毒素，霍乱毒素或它的B亚基，白喉毒素，破伤风毒素，百日咳毒素，弗氏不完全或完全佐剂等。在使用之前，可以使诸如白喉毒素，破伤风毒素和百日咳毒素的基于毒素的佐剂失活，例如，通过用甲醛处理使它失活。

本申请的新的疫苗不局限于任何特定类型或制备方法。所述克隆的病毒疫苗包括，但不局限于传染性DNA疫苗(即利用质粒，载体或其他常规载体将DNA直接注射到猪体内)，活的疫苗，修饰过的活的疫苗，失活的疫苗，亚单位疫苗，减毒疫苗，遗传工程疫苗等。所述疫苗是通过本领域已知的标准方法制备的。所述活的病毒疫苗通常是最需要的疫苗，就是说，能在所述疫苗受体内激活所有可能的免疫应答，包括系统性，局部，体液和细胞介导的免疫应答。另一方面，灭活的疫苗只能诱导体液免疫应答。不过，虽然活的病毒疫苗是最理想的，但是它具有若干缺陷，例如，受活的意外病毒剂污染的潜在危险或所述病毒在野外恢复毒力的危险。值得注意的是，本申请实施例提供了一株嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2，其能在体内产生特异性抗体和中和抗体，为猪体提供抵抗强毒感染的保护，并且对猪体不产生病毒血症和病毒排毒，具有良好的安全性；该嵌合猪瘟病毒还可以在机体内诱导产生特异性的BVDV E2抗体可有效区分疫苗接种猪和野生型感染猪，具有标记疫苗的应用前景。

尽管活的病毒疫苗是最优选的，可用于接种猪的其他类型的疫苗具有本文所披露的新嵌合猪瘟病毒。为了制备失活的病毒疫苗，例如，来自传染性cDNA克隆的病毒增殖，是通过本领域已知方法或本文所披露的方法进行的。然后，通过本领域普通技术人员所普遍公知的方法优化系列病毒灭活。

术语“免疫应答”指受试者(例如人)的免疫系统对抗原或抗原决定簇的任何应答。示例性的免疫应答包括体液免疫应答(例如抗原特异性抗体的产生)和细胞介导的免疫应答(例如抗原特异性T细胞的产生)。用于评估免疫应答的测定法是本领域已知的，并且可以包括体内测定法，例如测量抗体应答和延迟型超敏反应的测定法。在一个实施方案中，测量抗体应答的分析主要可以测量B细胞功能以及B细胞/T细胞相互作用。对于抗体应答测定，在抗原攻击后可以比较血液中的抗体效价。本文所用的“抗体效价”可定义为免疫后血清中最高的稀释度，其导致的值大于每个受试者的免疫前样品的值。体外测定可包括测定细胞分裂的能力或为其它细胞分裂提供帮助或释放淋巴因子和其它表达活化和裂解靶细胞标志物的因子。在一个实施方案中，比较来自相似来源的淋巴细胞，例如外周血细胞，脾细胞或淋巴结细胞。然而，与人的外周血细胞和小鼠的脾细胞的非限制性例子一样，比较来自不同来源的淋巴细胞是可能的。对于体外测定，可以纯化细胞(例如B细胞，T细胞和巨噬细胞)或使细胞保持其天然状态(例如脾细胞或淋巴结细胞)。纯化可以通过给出所需结果的任何方法进行。可以在体外用促分裂原或特异性抗原测试细胞的增殖能力。在存在特异性抗原的情况下，细胞分裂的能力可以使用混合淋巴细胞反应(MLR)测定法来测定。可以测试来自培养细胞的上清液以定量细胞分泌特异性淋巴因子的能力。可以从培养物中除去细胞，并测试它们表达活化抗原的能力。这可以通过任何适合的方法来实现，如在使用结合活化抗原的抗体或配体以及结合编码活化抗原的RNA的探针的非限制性例子中那样。

术语“标记疫苗”是指借助基因工程技术在病毒基因组中引入分子标记，以区别于野毒株的新一代重组活疫苗。

鉴于目前的猪瘟减毒活疫苗C株虽然具有较好的保护效果，但是其复制效率低，免疫后血清型检测不能区别感染猪和免疫猪。而本申请实施例提供嵌合猪瘟病毒中，将C株的非编码区和E2蛋白的主要抗原区域同时替换为BVDV相对应的区域以得到一种嵌合的猪瘟病毒株(命名为rC/bUTRs-tE2)，该嵌合猪瘟病毒株rC/bUTRs-tE2不仅可以为猪体提供抵抗强毒感染的保护效果，还可以在兔体和猪体内诱导产生CSFV E^rns和BVDV E2特异性抗体，而野生型猪瘟病毒感染机体只能诱导产生CSFV E^rns特异性抗体，不能诱导BVDV E2特异性抗体，因此可以在血清学上区分免疫接种猪和野生型猪瘟病毒感染猪，重组嵌合病毒疫苗株rC/bUTRs-tE2具有标记疫苗的识别潜力。

pC/bUTRs-tE2感染性克隆的构建

为此，如图1所示，本申请实施例还提供了猪瘟病毒C株的嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2，该病毒是将猪瘟减毒活疫苗C株中的非编码区和E2主要抗原区域替换为BVDV毒株来源而得到的毒株。用BVDV非编码区(5’UTR区和3’UTR区)进行双区替换猪瘟病毒C株非编码区，以得到嵌合猪瘟病毒的cDNA感染性克隆pC/bUTRs，再将E2的主要抗原区域domainI和domainII(aa 690-860)的编码区替换成BVDV相对应的区域，以此得到构建猪瘟嵌合猪瘟病毒cDNA感染性克隆pC/bUTRs-tE2。

在一些实施例中，该pC/bUTRs-tE2的构建方法采用overlap和酶切连接。具体的，该构建过程包括：

1)得到BVDV 5’UTR片段

以BVDV cDNA为模板和特异性引物b5’UTR-F/b5’UTR-R扩增得到BVDV 5’UTR；

2)得到猪瘟疫苗C株感染性克隆pPST₁/C

然后用overlap PCR得到融合后片段将BVDV 5’UTR利用限制性内酶切位点AatⅡ/Cla I插入到猪瘟疫苗C株感染性克隆pPST₁/C，具体参照“Li,L.,Pang,H.,Wu,R.,Zhang,Y.,Tan,Y.,Pan,Z.,2016.Development of a novel single-step reverse geneticssystem for the generation of classical swine fever virus.Arch Virol 161,1831-1838”进行。

3)得到嵌合病毒感染性克隆pC/bUTRs

在此基础上，以BVDV cDNA为模板和特异性引物b3’UTR-F/b3’UTR-R扩增得到BVDV3’UTR，然后用overlap PCR得到融合后片段将BVDV 3’UTR利用限制性内酶切位点SpeⅠ/MluI插入到猪瘟疫苗C株感染性克隆pPST₁/C得到非编码替换的嵌合病毒感染性克隆pC/bUTRs。替换非编码区的嵌合病毒全长感染性克隆pC/bUTRs的构建过程参照“Pang,H.；Li,L.；Liu,H.；Pan,Z.Proline to Threonine Mutation at Position 162of NS5B ofClassical Swine Fever Virus Vaccine C Strain Promoted Genome Replication andInfectious Virus Production by Facilitating Initiation of RNASynthesis.Viruses 2021,13,1523.”进行。

4)得到嵌合猪瘟病毒感染性克隆pC/bUTRs-tE2

最有以BVDV cDNA为模板和特异性引物btE2-F/btE2-R扩增得到BVDV tE2(aa690-860)，然后用overlap PCR得到融合后片段将BVDV tE2利用限制性内酶切位点SpeⅠ/NcoⅠ插入到感染性克隆pC/bUTRs得到非编码区和E2替换的嵌合病毒感染性克隆pC/bUTRs-tE2。

pC/bUTRs-tE2的结构如图2所示，对其采用BamHI和MluI对pC/bUTRs-tE2进行双酶切后的SDS-PAGE如图3所示，条带大小正确(图中阴影区段为5890bp，其余区段为9208bp)，并经测序鉴定序列正确，表明成功构建了猪瘟病毒C株5’UTR区、3’UTR区和E2主要抗原区域替换的嵌合猪瘟病毒感染性克隆pC/bUTRs-tE2。

本实施例中涉及的引物如表1所示，表1中划线为限制性内切酶识别序列。

表1

拯救得到嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2

在一些实施例中，将感染性cDNA克隆pC/bUTRs-tE2利用Lip3000转染PK15细胞，并同时转染pC/bUTRs(上述实施例提供的替换非编码区(5’UTR和3’UTR)的嵌合病毒全长感染性克隆)作为对照。转染后72h，收集细胞用Anti-NS3兔多抗作为一抗进行免疫荧光染色鉴定；收上清提RNA，用特异性的引物进行RT-PCR鉴定并将替换的区域送测序。再者，取上清再感染PK15细胞，48h后收细胞用Anti-NS3兔多抗作为一抗进行免疫荧光染色来鉴定拯救的猪瘟病毒C株非编码区和E2替换嵌合猪瘟病毒的感染性。结果如图4所示，转染后细胞免疫荧光结果显示，细胞中均有rC/bUTRs和rC/bUTRs-tE2的NS3的蛋白表达，说明感染性cDNA克隆质粒转染后在细胞中正确表达，但从阳性细胞数目初步分析，rC/bUTRs-tE2的阳性细胞明显少rC/bUTRs。转染后上清RT-PCR结果如图5所示，rC/bUTRs和rC/bUTRs-tE2在BVDV 5’UTR和3’UTR检测中均是阳性，rC/bUTRs在BVDV E2检测中是阴性而rC/bUTRs-tE2是阳性，目的条带大小和预期结果一致，初步证明拯救的上清中有嵌合猪瘟病毒颗粒释放，后续的RT-PCR目的条带测序结果证明上清病毒可以的基因组被正确替换。

rC/bUTRs-tE2的细胞传代

在一些实施例中，对转染后的细胞进行细胞传代，分别取代表性代次带毒细胞反复冻融三次，离心收上清感染PK15细胞，48h后收细胞用Anti-NS3兔多抗作为一抗进行免疫荧光染色来鉴定传代的猪瘟病毒C株非编码区和E2替换嵌合猪瘟病毒的感染性，取转染后的PK15细胞命名为rC/bUTRs-tE2 P0、P10、P20、P30和P40，结果如图6和7所示。从rC/bUTRs-tE2 P20开始，随着细胞传代rC/bUTRs-tE2对PK15细胞的感染性逐渐增加并趋于稳定，rC/bUTRs-tE2 P20开始其在K15细胞上病毒滴度明显升高，并趋于稳定。由此说明，rC/bUTRs-tE2从第20代后感染性增加并趋于稳定。

rC/bUTRs-tE2的遗传稳定性

表2 rC/bUTRs-tE2于第0、30、40和60代的核苷酸突变和氨基酸突变

对rC/bUTRs-tE2 P0、P30和P40全基因组测序，测序结果如表2所示。表2中，“a”代表核苷酸位点，将5’UTR第一个核苷酸位置定为1；“b”代表氨基酸位点，将多聚蛋白第一个氨基酸位置定为1。

rC/bUTRs-tE2 P30较于原基因组P0，在E2基因上发生2处核苷酸突变，在NS5B上发生1出核苷酸突变。相对应的，E2蛋白上发生2处氨基酸突变，分别是M834K和M979K，但是在NS5B上发生的是同义突变，及核苷酸突变未导致氨基酸发生变化。rC/bUTRs-tE2第40代相较于第30代基因组，突变位点的核苷酸和氨基酸均为发生变化。从基因组测序的结果来看，与病毒传代的结果相一致，嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2 P30特性发生了显著变化，同样的，rC/bUTRs-tE2 P30基因组也发生了改变。rC/bUTRs-tE2 P40较于P30病毒特性没有明显差异，同样的，基因组也未发生改变。这些结果表明，rC/bUTRs-tE2 P30后，在PK15细胞上相对遗传稳定。

rC/bUTRs-tE2D病毒作为标记疫苗的安全性

本试验例对嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2(本文中均指其第30代及后代)的细胞嗜性、生长曲线、基因组复制效率以及蚀斑的形成能力进行研究。

在一个测试例中，将rC/bUTRs-tE2分别感染PK15细胞和MDBK细胞，并分别用猪瘟病毒C株和嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs当作对照。感染后48h后用Anti-NS3兔多抗作为一抗对细胞进行间接免疫荧光染色。结果如图8所示，rC/bUTRs-tE2和rC/bUTRs保留了猪瘟病毒C株对PK15细胞的感染能力，但rC/bUTRs-tE2较之rC/bUTRs和猪瘟病毒C株对PK15细胞感染性明显下降；猪瘟病毒C株、rC/bUTRs-tE2和rC/bUTRs对MDBK细胞均表现极低的感染性。

在一个测试例中，将猪瘟病毒C株、rC/bUTRs和rC/bUTRs-tE2以MOI＝0.001分别感染PK15细胞，于感染后6h、12h收细胞，提取总RNA，用RT-qPCR测定病毒基因组拷贝数，结果如图10所示，rC/bUTRs在6h和12h的基因组拷贝数均显著高于C株，这说明非编码区替换可以提高猪瘟病毒C株的复制效率；而rC/bUTRs-tE2在6h和12h的基因组拷贝数均显著低于猪瘟病毒C株，表明E2的替换显著下调了病毒在PK15细胞中的复制。

在一个测试例中，将猪瘟病毒C株、rC/bUTRs和rC/bUTRs-tE2分别以300TCID₅₀接毒SK6细胞，孵育1h后换1.5％羧甲基纤维素培养96h，显色测定突变体病毒的蚀斑形成能力。结果如图11所示，通过ImageJ软件分析发现，rC/bUTRs形成的蚀斑大小与C株无显著差异，而嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2形成的蚀斑小于C株。这些结果表明，非编码区替换对猪瘟病毒C株蚀斑形成能力无影响，即不影响病毒在细胞之间传递的速度；E2的替换显著下调了病毒的蚀斑形成能力，显著降低病毒在细胞之间传递的速度。

这些结果表明非编码区和E2替换对猪瘟病毒C株细胞嗜性没有明显的影响，说明了嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2的宿主范围不会扩大，具有安全性。

rC/bUTRs-tE2的兔体免疫原性

猪瘟病毒C株是通过强毒石门珠在兔体多次传代得到的兔化弱毒株，猪瘟病毒C株可以在兔体脾脏复制、诱导兔热反应，引起抗体免疫反应，所以兔体是评价猪瘟减毒活疫苗的良好机体。本申请实施例进一步研究非编码区和E2替换对猪瘟病毒C株兔体病毒特性和免疫原性的影响。

在一个测试例中，将猪瘟病毒C株、rC/bUTRs和rC/bUTRs-tE2分别免疫兔体，于免疫后0～72h每隔6h分别测定兔体肛温；免疫后3天每组随机安乐死一半(3只)兔体，取脾脏组织，测定病毒拷贝数；分别于免疫后7和14天取血清，测定血清CSFV E2特异性抗体和血清病毒中和滴度。结果如表3所示，rC/bUTRs和rC/bUTRs-tE2均不能诱导兔热产生，但是可以在兔体脾脏内复制，而C株既可以诱导典型兔热产生又可以在兔体脾脏复制。

表3 C株、rC/bUTRs和rC/bUTRs-tE2的兔体试验

如图12左图所示，在免疫后第7天，分别免疫了C株和rC/bUTRs兔体血清CSFV特异性抗体检测阳性；而在免疫后第14天，免疫了rC/bUTRs-tE2的兔体血清才出现CSFV特异性抗体检测阳性；并且，在免疫后第7天和第14天，C/bUTRs-tE2诱导产生的CSFV特异性抗体水平均显著低于C株和rC/bUTRs。

如图12右图所示，在免疫后第14天，rC/bUTRs-tE2诱导产生的病毒中和抗体滴度为1:16-1:32，而猪瘟疫苗C株和重组嵌合病毒疫苗株rC/bUTRs诱导产生的病毒中和抗体滴度为1:32-1:64。血清病毒中和抗体滴度和血清CSFV E2特异性抗体结果类似，rC/bUTRs-tE2于兔体中诱导的抗体免疫显著低于猪瘟疫苗C株和重组嵌合病毒疫苗株rC/bUTRs，表明E2替换虽然导致嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2在兔体诱导的特异性的抗体免疫反应减弱，但依然可以在兔体诱导产生CSFV E2特异性抗体和中和抗体。

rC/bUTRs-tE2的猪体免疫原性及保护效果

在一个测试例中，将11只5周龄、猪瘟病毒抗体和抗原均阴性的仔猪随机分为3组，其中3只免疫猪瘟病毒C株免疫组3只，5只免疫rC/bUTRs-tE2，3只免疫DMEM培养基，实验开始前先适应饲养一周；猪体免疫，猪瘟疫苗C株通过肌肉注射接种，接种剂量为10⁴TCID₅₀/只(1mL)，重组嵌合病毒疫苗株rC/bUTRs-tE2通过肌肉注射接种，接种剂量为10^4.5TCID₅₀/只(1mL)，DMEM通过肌肉注射接种，接种剂量1mL/只，接种后观察动物30min；所有猪体在免疫后14天以相同的剂量和相同的方式加强免疫一次。猪体攻毒，于免疫后28天，通过滴鼻的方式对所有猪体进行CSFV强毒石门株攻毒，攻毒剂量为10^5.5TCID₅₀/只(1mL)，攻毒后观察动物30min。猪体肛温，从免疫0天开始，每天监测所有猪体肛温并记录，当猪体肛温≥40.5℃认定为发烧。猪瘟临床症状打分，从免疫0天开始，依据Mittelholzer等人建立的猪瘟临床打分标准对所有猪体进行打分，包括活力、身体紧张度、体型、呼吸、行走、皮肤(特别是耳朵、鼻子、腿和尾巴)、眼睛/结膜、食欲、排便和残留饲料。正常临床症状0分，轻微临床症状1分，明显临床症状2分，严重临床症状3分，将所有分数相加，最大临床症状打分为30分。分别于免疫后0、7、14、21、28和攻毒后0、3、7、14、21天通过前腔静脉采猪血，一部分分装于EDTA抗凝管中，用于后续检测病毒血症以及白细胞和血小板计数，病毒血症检测是通过提取全血RNA，然后利用RT-qPCR测定血液中病毒拷贝数，白细胞和血小板计数是在武汉市儿童医院利用SYSMEX血细胞分析仪测定；另一部分用于分离猪血清，将采集的猪血于37℃静置1h，然后4℃静置过夜，再于4℃、5000rpm离心20min，收集血清，分装后于-80℃保存备用。分别于免疫后0、7、14、21、28天和攻毒后0、3、7、14、21天用棉签采集咽拭子和肛拭子，溶于1mL PBS中(加入2％的抗生素)，然后提取总RNA，利用RT-qPCR测定拭子中病毒拷贝数，用于检测病毒排毒情况。对攻毒后濒死的猪体以及攻毒后21天存活的猪体安乐死并进行解剖，取扁桃体、下颌淋巴结、肾脏和脾脏组织，然后提取总RNA，利用RT-qPCR测定组织中病毒拷贝数，用于检测猪体组织中病毒含量。

结果如图13所示，嵌合猪瘟病毒株rC/bUTRs-tE2免疫组猪体在攻毒后7天前后出现了肛温轻微升高，但未见明显发烧，低于40.5℃，且在2-3天后均恢复正常直到实验结束。如图14左图所示，嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2免疫组猪体在攻毒后7天前后出现了轻微的临床症状，包括轻微腹泻，食欲不振，体力不支导致平躺，但这些轻微的临床症状均在2-3天后恢复，猪体存活良好直到实验结束(图14右图)。如图15所示，嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2免疫组猪体在攻毒后7天白细胞和血小板数目出现了轻微的下降，但均在攻毒14天后恢复正常，直到实验结束。

表4示出了RT-qPCR检测猪全血、咽拭子和肛拭子病毒RNA拷贝数结果，其中，“-”表示未检出，“/”表示死亡，免疫后第某天括号中数量为出现死亡或者检出到病毒RNA的免疫猪体数量。

表4 RT-qPCR检测猪全血、咽拭子和肛拭子病毒RNA拷贝数

如表4所示，嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2免疫组猪体在攻毒后7天全血中检测到了(9.27±9.95)×10²极低拷贝数的病毒RNA，但随后在攻毒后14天全血中未检测到病毒RNA，即攻毒后7天出现了轻微的病毒血症，然后在攻毒14天后恢复正常。嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2免疫组猪体从攻毒到实验结束在肛拭子中均未检测到病毒RNA，但攻毒后7天在咽拭子中检测到(6.90±10.2)×10²极低拷贝数的病毒RNA，随后在攻毒后14天在咽拭子中未检测到病毒RNA，在咽拭子中检测到了较低水平的排毒，但在14天后恢复正常。

表5示出了通过RT-qPCR检测猪组织(扁桃体、颌下淋巴结、脾脏、肾脏)的病毒RNA含量，表5中，“-”表示未检出。如表5所示，嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2免疫组所有猪体的组织中均未检测到病毒RNA。这些结果表明重组嵌合病毒疫苗株rC/bUTRs-tE2可以诱导猪体产生抵抗强毒致死的保护效果。

表5 RT-qPCR检测猪组织病毒RNA含量

分组	扁桃体	颌下淋巴结	脾脏	肾脏
					C株	-	-	-	-
rC/bUTRs-tE2	-	-	-	-
					DMEM	<![CDATA[(6.81±8.74)×10<sup>6</sup>]]>	<![CDATA[(9.37±4.55)×10<sup>6</sup>]]>	<![CDATA[(5.15±3.71)×10<sup>5</sup>]]>	<![CDATA[(5.59±3.52)×10<sup>4</sup>]]>

如图16左图所示，免疫后21天，rC/bUTRs-tE2免疫组猪体呈现CSFV抗体阳性；在免疫后28天，rC/bUTRs-tE2免疫组猪体CSFV抗体阻断值为是48.44-63.37％(阻断值≥40％认为抗体阳性)。在攻毒后rC/bUTRs-tE2免疫组猪体CSFV抗体水平均显著增加，在攻毒后21天，rC/bUTRs-tE2免疫组CSFV特异性抗体平均阻断88.17％。嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2免疫猪体后可以诱导产生CSFV特异性抗体和病毒中和抗体。

如图16右图所示，通过病毒中和实验测定血清中的病毒中和抗体滴度，一般的当中和抗体滴度≥1:16时认为是阳性。发现在免疫后14天，rC/bUTRs-tE2免疫组的病毒中和抗体滴度很低，抗体滴度≤1:16；在免疫后28天，rC/bUTRs-tE2免疫组猪体的病毒中和抗体滴度1:16-1:64。在攻毒后，rC/bUTRs-tE2免疫组猪体的中和抗体滴度均显著增加，在攻毒后21天，rC/bUTRs-tE2免疫组的中和抗体滴度达到了1:256-1:1024。

基于rC/bUTRs-tE2的间接ELISA

由于标记疫苗在起到良好保护效果的同时，可以区分疫苗接种猪和野生感染猪，使得标记疫苗是目前猪瘟疫苗非常有潜力的研究方向。根据前面的研究发现，嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2可以作为潜在的一种猪瘟病毒候选的标记疫苗。为了评价嵌合猪瘟病毒rC/bUTRs-tE2作为标记疫苗的潜在作用，本申请实施例还使用特异性的CSFV E^rns和BVDVE2蛋白作为包被抗原，建立了两种血清抗体检测的间接ELISA方法，旨在区分疫苗接种猪和野生感染猪。

在一个实施例中，基于CSFV E^rns蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法参照CN113512098A公开的方法建立间接ELISA方法分别检测rC/bUTRs-tE2免疫的兔血清和猪血清。其中，CSFV E^rns抗原(参照CN113512098A)可通过构建重组表达载体，于大肠杆菌中重组表达和纯化得到。利用建立的CSFV E^rns间接ELISA方法分别检测rC/bUTRs-tE2免疫的兔血清和猪血清。如图17左图，发现免疫后14天的兔血清，猪瘟疫苗C株、rC/bUTRs和rC/bUTRs-tE2免疫组均呈现CSFV E^rns抗体阳性；如图17右图，免疫后21天的猪血清，猪瘟疫苗C株和rC/bUTRs-tE2免疫组均呈现CSFV E^rns抗体阳性；在兔血清和猪血清中，DMEM免疫组均为检测出CSFV E^rns抗体。

在一个实施例中，基于BVDV tE2蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法参照CN113512098A公开的方法建立间接ELISA方法分别检测rC/bUTRs-tE2免疫的兔血清和猪血清。结果如图18所示，发现免疫后14天的兔血清，rC/bUTRs-tE2免疫组兔血清呈现BVDV E2抗体阳性，但C株和DMEM组免疫组兔血清均BVDV E2抗体阴性。免疫后21天的猪血清，rC/bUTRs-tE2免疫组猪血清中开始呈现BVDV E2抗体阳性，但C株和DMEM组免疫组猪血清均BVDV E2抗体阴性。结果表明重组嵌合病毒疫苗株rC/bUTRs-tE2可以在兔体内以及猪体内诱导产生区别于野生型猪瘟病毒感染的BVDV E2抗体，并且可以被BVDV tE2间接ELISA方法所甄别，说明rC/bUTRs-tE2具有作为标记疫苗的识别能力。当CSFV E^rns和BVDV E2特异性抗体呈现双阳性的时候即可认为是免疫了嵌合rC/bUTRs-tE2，而野生型猪瘟病毒感染只能诱导产生CSFV E^rns特异性抗体，不能诱导产生BVDV E2特异性抗体，以此达到区分免疫接种猪和野生型猪瘟病毒感染猪的目的。

CSFV E^rns重组表达及纯化

在一个CSFV E^rns表达载体的构建与鉴定实施例中，设计特异性引物E^rns-F(如SEQID NO.4所示)和E^rns-R，以合成的基因(如SEQ ID NO.5所示)为模板PCR扩增CSFV E^rns目的基因。并在两端分别引入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点，通过酶切连接将CSFV E^rns目的基因插入到pET-28a的载体中，pET-28a表达载体在插入基因的末端含有6×His标签。随后转化DH10B或者DH5α克隆感受态细胞中。通过菌落PCR筛选阳性克隆。提质粒通过NcoⅠ和KpnⅠ进行酶切鉴定，结果如图19所示。选取酶切鉴定的质粒送测序，将构建正确的CSFV E^rns表达载体命名为pET-28a-E^rns。

在一个CSFV E^rns蛋白诱导表达及鉴定实施例中，将pET-28a-E^rns转化表达感受态细胞E.coli BL21，挑取单克隆，在37℃含有卡那霉素的LB培养基中震荡培养，当OD₆₀₀值达到0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG，在37℃继续诱导培养4h。收集菌体，超声破碎，对全菌体、裂解上清和菌体沉淀进行SDS-PAGE分析，结果如图19左图所示。通过软件分析表达的CSFV E^rns蛋白大小约为26.7kDa。从SDS-PAGE结果可知，CSFV E^rns目的蛋白成功诱导表达，大小在25kDa-35kDa之间，和预期符合。且从条带分析，CSFV E^rns目的蛋白表达于菌体沉淀之中。由于CSFV E^rns目的蛋白C末端融合表达6×His标签，用Anti-His作为一抗进行和Western-Blot分析，结果如图19右图所示，Western blot的目的条带与SDS-PAGE的目的条带大小一致说明CSFV E^rns目的蛋白表达正确。

在一个CSFV E^rns重组蛋白表达纯化实施例中，将诱导表达正确的BL21/pET-28a-E^rns菌液按照1:100的体积比，接种于1L的含卡那霉素的LB培养基中，于37℃细菌培养箱震荡培养，当OD₆₀₀值达到0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG，在37℃继续诱导培养4h。诱导培养结束后，离心弃上清，收集沉淀。用裂解缓冲液重悬沉淀，低温超声破碎，再离心收集沉淀用Ni-His镍柱亲和层析纯化得到目的蛋白CSFV E^rns，将纯化后的洗脱液进行SDS-PAGE分析，结果如图20所示。泳道1为结合后上清，只有少量目的蛋白，说明目的蛋白绝大部分都和镍柱结合了；泳道2-4分别为杂蛋白洗脱液的开始、中间和结束，可见只有少量的目的蛋白被洗脱；泳道5-14为目的蛋白洗脱液，可见在25-35kDa之间有一条单一且蛋白量大的条带，和预期大小一致，即为纯化后的目的蛋白CSFV E^rns。

再将收集的目的蛋白洗脱液进行蛋白透析复性，在4℃使用梯度稀释的复性液，以除去蛋白中的咪唑和尿素，取透析复性后的目的蛋白CSFV E^rns进行SDS-PAGE分析，结果如图21所示。泳道5为透析复性后目的蛋白CSFV E^rns，条带单一，纯度较高，大小位于25-35kDa之间，与预期一致。测定透析复性后CSFV E^rns蛋白浓度，最后分装保存于-80℃备用。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种分离的感染性多核苷酸或感染性克隆，所述感染性多核苷酸或所述感染性克隆携带嵌合基因组，所述嵌合基因组包含一个开放阅读框及处于所述开放阅读框两端的5’UTR区和3’UTR区；

所述5’UTR区和所述3’UTR区来源于BVDV，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1～2所示；

所述开发阅读框编码Core、E^rns(E0)、E1、E2、N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B；Core、E^rns(E0)、E1、N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B以及E2的C端区域编码基因的核苷酸序列均来自于猪瘟疫苗C株的基因组；

所述E2蛋白N端抗原区来源于BVDV，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

将所述感染性多核苷酸或所述感染性克隆引入细胞并通过传代可以产生感染性猪瘟病毒颗粒。

2.权利要求1所述感染性多核苷酸或感染性克隆，还包含在原核宿主细胞中复制的载体序列。

3.权利要求1所述感染性多核苷酸或感染性克隆，所述感染性多核苷酸或感染性克隆是DNA多核苷酸或RNA多核苷酸。

4.一种载体，包含权利要求1～3任一所述的感染性多核苷酸或感染性克隆。

5.一种细胞，携带权利要求1～3任一所述的感染性多核苷酸或感染性克隆。

6.一种猪瘟病毒颗粒，所述猪瘟病毒颗粒包裹携带有嵌合基因组的单链RNA，所述嵌合基因组包含一个开放阅读框及处于所述开放阅读框两端的5’UTR区和3’UTR区；

所述5’UTR区和所述3’UTR区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～2所示；

所述开发阅读框编码Core、E^rns(E0)、E1、E2、N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B；Core、E^rns(E0)、E1、N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B以及E2的C端区域编码基因的核苷酸序列均来自于猪瘟疫苗C株的基因组；

所述E2蛋白N端抗原区编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.一种组合物或标记疫苗，所述组合物或标记疫苗包含猪瘟病毒颗粒，所述猪瘟病毒颗粒包裹一携带有嵌合基因组的单链RNA，所述嵌合基因组包含一个开放阅读框及处于所述开放阅读框两端的5’UTR区和3’UTR区；

所述5’UTR区和所述3’UTR区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～2所示；

所述开发阅读框编码Core、E^rns(E0)、E1、E2、N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B；Core、E^rns(E0)、E1、N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B以及E2的C端区域编码基因的核苷酸序列均来自于猪瘟疫苗C株的基因组；

所述E2蛋白N端抗原区编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

8.根据权利要求7所述的组合物或标记疫苗，还包括药学上或兽医学上可接受的运载体、赋形剂、媒介物或佐剂；

可选地，所述运载体、赋形剂、媒介物或佐剂均选自氢氧化铝，免疫刺激复合物，非离子嵌段聚合物或共聚物，细胞因子，皂苷，单磷酰脂质A，和胞壁酰二肽，硫酸铝钾，从大肠杆菌中分离的热不稳定性或热稳定性肠毒素，霍乱毒素或它的B亚基，白喉毒素，破伤风毒素，百日咳毒素，弗氏不完全或完全佐剂中的一种。

9.根据权利要求7所述的组合物或标记疫苗，所述组合物或标记疫苗为传染性DNA疫苗、活的疫苗、修饰过的活的疫苗、失活的疫苗、亚单位疫苗、减毒疫苗或遗传工程疫苗；可选地，所述组合物或标记疫苗为减毒疫苗。

10.权利要求1～3任一所述的感染性多核苷酸或感染性克隆在制备猪瘟标记疫苗中的应用。

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