CN117778334A - 表达猪瘟病毒e2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株及其制备方法和应用 - Google Patents
表达猪瘟病毒e2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株及其制备方法和应用。本发明以TK、gI、gE、US9和US2蛋白失活的猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株为载体，在其基因组中插入标记基因EGFP，经多轮荧光蚀斑筛选出表达绿色荧光蛋白EGFP的重组猪伪狂犬病毒株；在表达绿色荧光蛋白EGFP的重组猪伪狂犬病毒株的基础上，将EGFP基因替换为猪瘟病毒全长E2基因，经多重蚀斑单克隆化筛选出一种高效表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株。本发明毒株遗传稳定性好，增殖性能好，外源猪瘟病毒E2蛋白表达量高。该毒株可制备成活疫苗，该疫苗在靶动物仔猪具有较高的安全性和免疫保护效果，同时可以诱导产生高水平的猪瘟病毒特异性抗体，适于作为防治伪狂犬病及猪瘟的疫苗候选株。
Description
技术领域
本发明涉及猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株，尤其涉及表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株，还涉及所述表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株在制备预防或治疗猪瘟和/或猪伪狂犬病的疫苗或试剂中的应用，属于基因工程技术和动物病毒学领域。
背景技术
猪瘟(Classical Swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(CSF virus,CSFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、热性和高度接触传染的病毒性传染病，是一种严重危害养猪业的重大动物传染病。猪瘟病毒的结构蛋白E2是最主要的免疫原性蛋白，诱导机体产生中和抗体并且能够保护猪抵抗猪瘟病毒强毒株的攻击，也是猪瘟基因工程疫苗研发的重要靶蛋白。我国对猪瘟防控非常重视，对猪场猪瘟的净化提出明确要求，截止2020年底，全国所有种猪场和部分区域达到猪瘟净化标准，并进一步扩大猪瘟净化区域范围。免疫接种是预防和控制猪瘟发生和流行的主要措施，猪瘟疫苗质量的好坏直接影响猪瘟的免疫效果。
猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是感染猪的重要疫病之一，目前猪伪狂犬病在我国规模化猪场普遍存在，直接或间接影响养猪业的持续健康发展。伪狂犬病于1902年在匈牙利被首次报道，我国在70年代末从匈牙利引进的Bartha-K61基因缺失疫苗被广泛使用，大多数的猪场通过免疫该疫苗有效地控制了伪狂犬病。猪伪狂犬病的病原体是伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)，PRV能感染不同年龄段的猪，出现高热、精神消沉、厌食、咳嗽、打颤、腹泻、系统性神经紊乱、消瘦甚至死亡等系列临床表现。PRV能在感染动物体内终生潜伏，导致其在特定条件下成为新的传染源。然而，自2011年底开始，在我国华北和东北很多地区免疫过Bartha-K61疫苗的猪群接连暴发了伪狂犬病新疫情，发病率和死亡率较高，病原学研究证实病原体是PRV变种，与经典的PRV强毒株相比，变异毒株对易感动物猪、小鼠和绵羊的致病性都显著增强。针对现有商品苗对新出现的PRV变种保护效率存在局限性的现状，基于流行变异株的基因缺失疫苗成为近年来兽用生物制品研发的一个热点和重要方向。
以PRV基因缺失候选活疫苗株作为载体携带外源抗原基因进入生物体内，不仅可以诱导机体产生针对PRV的免疫反应，同时也可以产生针对外源抗原的免疫应答。目前采用伪狂犬病病毒基因缺失毒株作为载体已广泛应用于猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒性动物疫苗研发中。
中国发明专利CN104894076B公开了一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株及其应用，该发明以gE/gI双基因缺失重组病毒为基础，在基因组gE/gI基因缺失位置插入猪瘟病毒E2基因而构建得到重组毒株rPRVTJ-delgE/gI-E2。中国发明专利CN105802921B公开了一株表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株，是以gE、gI及TK三基因缺失的重组伪狂犬病病毒变异株为载体构建的表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2。与发明专利CN104894076B公布rPRVTJ-delgE/gI-E2病毒株相比，CN105802921B所公开的重组病毒rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2株其亲本毒株进一步缺失了TK基因，提高了毒株对靶动物的安全性。中国发明专利CN108753739B公开了一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒弱毒株，在基因缺失毒株PRV JS-2012-ΔgI/gE的基础上，分别将猪瘟病毒E2基因(猪瘟病毒shimen株E2基因第1-1026位碱基的核苷酸序列)插入gI/gE缺失位置和PRV JS-2012株基因组gG polyA的N端第133位碱基至第142位碱基之间，构建获得重组PRV毒株rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE。
发明内容
本领域专业人士所理解基因工程活载体疫苗开发的一个难点是外源基因或外源基因表达框在插入病毒载体的基因组后是否能够正常表达，且表达量的高低是否足以诱导靶动物机体产生抵抗强毒攻击的免疫保护效力。
为了克服上述技术难点，本发明目的之一是提供多个猪伪狂犬病病毒基因组外源基因插入位点，使外源基因能够经重组猪伪狂犬病病毒的感染后在细胞或机体正常表达，实现将该表达外源基因的重组猪伪狂犬病毒株制备成疫苗后，免疫该疫苗可同时产生针对PRV和外源蛋白的免疫应答。
基于此，本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病毒的插入位点在制备表达病原蛋白的重组病毒中的应用，所述插入位点为下述(1)-(4)中的至少一个位点：
(1)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组TK基因缺失位置，即PRV GX-2017变异株基因组中TK基因的CDS区的第303位碱基至第908位碱基之间；(2)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组IES基因缺失位置，即gI基因CDS区的第268位碱基至US2基因CDS区的第284位碱基之间；(3)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组gG(US4)和gD(US6)基因之间，即gG polyA的N端第167位碱基至第173位碱基之间；(4)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组gG基因第58位碱基之后。
本发明进一步提供了一种表达绿色荧光蛋白EGFP的重组猪伪狂犬病毒株，该重组毒株在猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组的插入了CMV启动子控制下的标记基因EGFP表达框的外源序列。
所述CMV启动子控制下的标记基因EGFP表达框的外源序列插入位置为下述(1)-(4)中的至少一个位点：(1)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组TK基因缺失位置，即PRV GX-2017变异株基因组中TK基因的CDS区的第303位碱基至第908位碱基之间；(2)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组IES基因缺失位置，即gI基因CDS区的第268位碱基至US2基因CDS区的第284位碱基之间；(3)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组gG(US4)和gD(US6)基因之间，即gG polyA的N端第167位碱基至第173位碱基之间；(4)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组gG基因第58位碱基之后。
更进一步的，本发明提供了表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株，其特征在于，该重组毒株在猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组插入了CMV启动子控制下的猪瘟病毒E2基因全长表达框的外源序列，或插入CMV启动子控制下的猪瘟病毒E2基因胞外区表达框的外源序列。
所述CMV启动子控制下的猪瘟病毒E2基因全长表达框的外源序列为序列1；所述CMV启动子控制下的猪瘟病毒E2基因胞外区表达框的外源序列为序列2。
CMV启动子控制下的猪瘟病毒E2基因全长表达框的外源序列，或CMV启动子控制下的猪瘟病毒E2基因胞外区表达框的外源序列的插入位置为上述的猪伪狂犬病毒的插入位点。
优选的，本发明以猪伪狂犬病病毒TK、gI、gE、US9和US2蛋白失活获得的减毒株为基础，以猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES为出发毒株。
本发明猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES为出发毒株，利用分子生物学和细胞生物学方法构建了4种高效表达绿色荧光蛋白的重组猪伪狂犬病毒株，包括PRVGX-ΔTK/IES+TK-EGFP、PRV
GX-ΔTK/IES+IES-EGFP、PRV GX-ΔTK/IES+gGD-EGFP、PRV
GX-ΔTK/IES+gG-EGFP。
本发明构建的4种表达绿色荧光蛋白的重组猪伪狂犬病毒株的4个外源基因插入位置包括：(1)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组TK基因缺失位置，即PRV GX-2017变异株基因组中TK基因的CDS区的第303位碱基至第908位碱基之间；(2)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组IES基因缺失位置，即gI基因CDS区的第268位碱基至US2基因CDS区的第284位碱基之间；(3)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组gG(US4)和gD(US6)基因之间，即gG polyA的N端第167位碱基至第173位碱基之间；(4)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组gG基因第58位碱基之后。
所述的4种表达绿色荧光蛋白的重组猪伪狂犬病毒株的构建方法，其构建步骤为：
(1)表达绿色荧光蛋白的转移载体pUC-TK-EGFP、pUC-IES-EGFP、pUC-gGD-EGFP和pUC-gG-EGFP的构建
首先，提取PRV GX-2017株的病毒基因组DNA，以其为模板分别扩增4个外源基因插入位点的左右同源臂，即TK-L/TK-R、IES-L/IES-R、gGD-L/gGD-R和gG-L/gG-R。然后，将PCR扩增左、右同源臂片段分别依次通过EcoRⅠ和HindⅢ、HindⅢ和MluⅠ装入载体pUC，构建得到转移质粒pUC-TK、pUC-IES、pUC-gGD和pUC-gG；以人工合成的EGFP基因为模板，用引物PCR扩增后通过HindⅢ分别装入转移质粒pUC-TK、pUC-IES、pUC-gGD和pUC-gG，构建得到携带标记基因EGFP的重组转移载体pUC-TK-EGFP、pUC-IES-EGFP、pUC-gGD-EGFP和pUC-gG-EGFP。
(2)表达绿色荧光蛋白的重组猪伪狂犬病毒株的构建
基因缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES感染的Vero细胞，分别将重组转移载体pUC-TK-EGFP、pUC-IES-EGFP、pUC-gGD-EGFP和pUC-gG-EGFP转染病毒感染后的细胞，通过绿色荧光蛋白的表达经至少5轮蚀斑筛选，获得表达绿色荧光蛋白的重组猪伪狂犬病毒毒株PRV GX-ΔTK/IES+TK-EGFP、PRV GX-ΔTK/IES+IES-EGFP、PRV GX-ΔTK/IES+gGD-EGFP、PRV GX-ΔTK/IES+gG-EGFP。
本发明所述表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株的构建方法，在高效表达绿色荧光蛋白的基础上，以重组猪伪狂犬病毒毒株PRV GX-ΔTK/IES+TK-EGFP、PRVGX-ΔTK/IES+IES-EGFP、PRV GX-ΔTK/IES+gGD-EGFP、PRV GX-ΔTK/IES+gG-EGFP为出发毒株，将表达EGFP基因的表达框完整地替换为表达猪瘟病毒E2基因的表达框，通过标记蛋白绿色荧光蛋白的不表达进行反向筛选，构建了4种表达猪瘟病毒全长E2基因的重组猪伪狂犬病毒株，以及4种表达猪瘟病毒截短E2基因的重组猪伪狂犬病毒株。其中在猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组TK基因缺失位置和在gG基因第58位碱基之后的位置插入外源E2基因的重组病毒，在病毒感染PK-15细胞系后能够检测到猪瘟病毒E2蛋白的高效表达。
具体包括以下步骤：
(1)表达全长猪瘟病毒E2蛋白的转移载体pUC-TK-E2、pUC-IES-E2、pUC-gGD-E2和pUC-gG-E2的构建
以NCBI公布猪瘟病毒石门株(GenBank:AY775178)E2基因序列为基础，将含CMV启动子、全长E2基因和SV40 poly(A)终止子的基因片段人工合成。以人工合成的基因片段为模板，将特异性PCR扩增后的CMV-E2通过酶切位点HindⅢ分别装入转移质粒pUC-TK、pUC-IES、pUC-gGD和pUC-gG，构建得到表达E2蛋白的重组转移载体pUC-TK-E2、pUC-IES-E2、pUC-gGD-E2和pUC-gG-E2。
(2)表达跨膜区截短的猪瘟病毒E2蛋白的转移载体pUC-TK-tE2、pUC-IES-tE2、pUC-gGD-tE2和pUC-gG-tE2的构建
以NCBI公布猪瘟病毒石门株(GenBank:AY775178)E2基因序列为基础，将含CMV启动子、跨膜区截短的E2基因和SV40 poly(A)终止子的基因片段人工合成。以人工合成的基因片段为模板，将特异性PCR扩增后的CMV-tE2通过酶切位点HindⅢ分别装入转移质粒pUC-TK、pUC-IES、pUC-gGD和pUC-gG，构建得到表达E2蛋白的重组转移载体pUC-TK-tE2、pUC-IES-tE2、pUC-gGD-tE2和pUC-gG-tE2。
将上述步骤(1)(2)所构建表达猪瘟病毒E2蛋白的重组转移载体分别转染PK-15细胞系，在转染后24小时利用猪瘟病毒E2特异性单克隆抗体经间接免疫荧光分析显示，表达猪瘟病毒E2蛋白的重组转移载体在转染PK-15细胞后均能够正常高效表达E2全长蛋白。
(3)表达猪瘟病毒E2全长蛋白的重组猪伪狂犬病毒株的构建
分别将重组猪伪狂犬病毒毒株PRV GX-ΔTK/IES+TK-EGFP、PRV
GX-ΔTK/IES+IES-EGFP、PRV GX-ΔTK/IES+gGD-EGFP和PRV
GX-ΔTK/IES+gG-EGFP感染的Vero细胞，然后对应将重组转移载体pUC-TK-E2、pUC-IES-E2、pUC-gGD-E2和pUC-gG-E2转染病毒感染后的细胞，通过不表达绿色荧光蛋白进行反向筛选，经至少5轮蚀斑筛选，获得表达猪瘟病毒E2全长蛋白的重组猪伪狂犬病毒毒株PRV
GX-ΔTK/IES+TK-E2、PRV GX-ΔTK/IES+IES-E2、PRV
GX-ΔTK/IES+gGD-E2和PRV GX-ΔTK/IES+gG-E2。
(4)表达截短猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株的构建
分别将重组猪伪狂犬病毒毒株PRV GX-ΔTK/IES+TK-EGFP、PRV
GX-ΔTK/IES+IES-EGFP、PRV GX-ΔTK/IES+gGD-EGFP和PRV
GX-ΔTK/IES+gG-EGFP感染的Vero细胞，然后对应将重组转移载体pUC-TK-tE2、pUC-IES-tE2、pUC-gGD-tE2和pUC-gG-tE2转染病毒感染后的细胞，通过不表达绿色荧光蛋白进行反向筛选，经至少5轮蚀斑筛选，获得表达截短猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒毒株PRV
GX-ΔTK/IES+TK-tE2、PRV GX-ΔTK/IES+IES-tE2、PRV
GX-ΔTK/IES+gGD-tE2和PRV GX-ΔTK/IES+gG-tE2。
将上述表达猪瘟病毒全长E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株和表达猪瘟病毒截短E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株，分别感染PK-15细胞系，在感染后24小时利用猪瘟病毒E2特异性单克隆抗体经间接免疫荧光分析显示，重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2和PRV GX-ΔTK/IES+gG-E2感染PK-15细胞后能够正常高效表达E2全长蛋白，重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+TK-tE2和PRV GX-ΔTK/IES+gG-tE2感染PK-15细胞后能够正常高效表达截短的E2蛋白。
本发明的又一目的是提供一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒株，该毒株制备活疫苗后免疫靶动物仔猪后可产生高水平的猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒特异性抗体。对猪伪狂犬病病毒变异株强毒的攻击均能够提供完全保护，可作为防控当前流行的猪伪狂犬病毒变异株及猪瘟病毒混合感染的二价基因工程疫苗候选株。
靶动物安全性试验结果显示，PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2经肌肉注射免疫30日龄仔猪后的14天内体温正常、精神状态良好、没有任何临床症状。
PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2免疫仔猪后42天内的猪瘟病毒E2阻断ELISA抗体检测结果显示，在免疫后21天，接种疫苗的5头动物中有3头动物猪瘟病毒E2阻断ELISA抗体转为阳性，2头动物抗体结果可疑；在免疫后28天，疫苗接种仔猪猪瘟病毒E2阻断ELISA抗体全部为阳性。相比较地，对照组Bartha-K61株+猪瘟活疫苗C株免疫组在免疫后21天4头动物猪瘟病毒E2阻断ELISA抗体转为阳性，21天5头动物猪瘟病毒E2阻断ELISA抗体全部为阳性。
PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2免疫仔猪后针对PRV GX变异株进行攻毒保护试验。接种后的特异性抗体检测结果显示，所有疫苗接种动物在免疫后28天gE阻断ELISA抗体全部为阴性，与未免疫对照动物一致；在免疫后7天，疫苗接种动物中部分动物gB阻断ELISA抗体转阳，免疫后14天所有疫苗接种动物的gB阻断ELISA抗体转为阳性。在接种后28天用PRV变异株强毒GX-2017株攻毒，攻毒后对照组的4头动物在攻毒后第2天温度升高，随后1～3天出现伪狂犬病典型症状，表现出精神沉郁、四肢呈划水状、共济失调等症状；其中，1头动物在攻毒后第5天死亡，剩下3头动物一直表现高温稽留、伏地不起的状态直至试验结束。与之相反地，PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2疫苗免疫组的5头动物全部存活，针对PRV变异株强毒攻毒保护效率为100％。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明以TK、gI、gE、US9和US2蛋白失活的猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRVGX-ΔTK/IES为载体，构建筛选出4种遗传稳定好、外源标记绿色荧光蛋白表达量高的重组猪伪狂犬病毒株包括PRV
GX-ΔTK/IES+TK-EGFP、PRV GX-ΔTK/IES+IES-EGFP、PRV
GX-ΔTK/IES+gGD-EGFP、PRV GX-ΔTK/IES+gG-EGFP，对应4个外源基因插入位点，可用于1个和/或多个外源基因的插入。
(2)将所插入外源基因EGFP的表达框替换为猪瘟病毒E2基因的表达框后，在上述4个外源基因插入位点中的2个构建筛选出4种能够高效表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株，包括PRV GX-ΔTK/IES+TK-tE2、PRV GX-ΔTK/IES+IES-tE2、PRV GX-ΔTK/IES+gGD-tE2和PRV
GX-ΔTK/IES+gG-tE2。其中，在猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV
GX-ΔTK/IES基因组TK基因缺失位置，即PRV GX-2017变异株基因组中TK基因的CDS区的第303位碱基至第908位碱基之间插入全长猪瘟病毒E2基因表达框的重组毒株PRVGX-ΔTK/IES+TK-E2，该毒株对靶动物仔猪的安全性及免疫原性试验结果表明，重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2具有良好的安全性和免疫原性，免疫仔猪后能够对PRV变异株强毒攻击提供完全的保护，可诱导产生比得上商品化活疫苗的猪瘟病毒特异性抗体水平。以上试验结果表明，PRV GX-ΔTK/IES可作为一种安全有效的活病毒载体来构建多价疫苗。本发明表达猪瘟病毒E2蛋白的重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2株能够应用于制备预防或治疗猪瘟和/或伪狂犬病的疫苗或试剂。
本发明以TK、gI、gE、US9和US2蛋白失活的猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES为载体，在PRV GX-ΔTK/IES基因组中插入标记基因EGFP，经多轮荧光蚀斑筛选出表达绿色荧光蛋白EGFP的重组猪伪狂犬病毒株；在表达绿色荧光蛋白EGFP的重组猪伪狂犬病毒株的基础上，将EGFP基因替换为猪瘟病毒全长E2基因，经多重蚀斑单克隆化筛选出一种高效表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株。本发明所提供表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株遗传稳定性好，在PK-15细胞系的增殖性能好，外源猪瘟病毒E2蛋白表达量高。本发明提供的表达猪瘟病毒E2蛋白重组猪伪狂犬病毒株可制备成活疫苗，该疫苗在靶动物仔猪具有较高的安全性和免疫保护效果，同时可以诱导产生高水平的猪瘟病毒特异性抗体，适于作为防治伪狂犬病及猪瘟的疫苗候选株，在防控猪伪狂犬病和猪瘟具有重要的储备和战略意义。
附图说明
图1是表达绿色荧光蛋白的重组猪伪狂犬病毒株感染PK-15细胞后荧光显微镜观察结果图。
图2是表达绿色荧光蛋白的重组猪伪狂犬病毒株感染PK-15细胞后的荧光强度分析结果图。
图3是表达猪瘟病毒E2蛋白的重组转移质粒转染PK-15细胞的间接免疫荧光结果图。
图4是表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株感染PK-15细胞24小时后的间接免疫荧光结果图。
图5是表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株感染PK-15细胞24小时后的间接免疫荧光强度分析结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的优选实施方式进行进一步的说明。需要本领域普通技术人员理解的是，本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行修改和变更，但都落入本发明的保护范围之内。
下述实施例中所用的实验材料和实验试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的pEGFP-N1、pUC18购自美国CIontech公司；猪肾细胞系(Porcine Kidney,PK-15)和非洲绿猴肾细胞系Vero购自美国菌种中心ATCC。基因缺失重组病毒载体毒株PRV GX-ΔTK/IES由本发明人实验室构建(LingLi,Yongfeng Du,YanbinZhang,Pengyu Li,Xinyue Liu,Xin Zhang,Jing Li,Tong Zhang,Xin Li,Dong Xiao,PengLiu,Peng Qi and Jin Xiao.Comprehensive evaluation of the safety andimmunogenicity of a gene-deleted variant pseudorabies virus attenuatedvaccine.Veterinary Research.2022,53:73)，公众可从中牧实业股份有限公司获取。高保真DNA聚合酶LA Taq，限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和MluⅠ均为TaKaRa公司产品。质粒小提试剂盒TIANprep Mini Plasmid Kit为TIANGEN公司产品(TIANGEN Biotech Co.,Ltd,Beijing,China)。转染用脂质体LipofectamineTM 2000试剂为Thermofisher Scientific公司产品(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。病毒基因组DNA/RNA转染试剂盒为Axygen公司产品。FITC标记抗鼠IgG试剂为Sigma公司产品(Sigma-Aldrich-F0257,USA)。猪瘟病毒E2单克隆抗体为中国兽医药品监察所产品(Z294)。PRV gE阻断ELISA抗体检测试剂盒和CSFV E2阻断ELISA抗体检测试剂盒为IDEXX产品，PRV gB ELISA抗体检测试剂盒为BioChek公司产品。
实施例1、表达绿色荧光蛋白的重组猪伪狂犬病毒株的构建
本发明在PRV变异株GX-2017(CN113862230A，已于2021年08月19日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，保藏编号为CGMCC No.22110)全基因组序列的基础上，根据国内外文献报道关于不影响PRV基因组DNA复制和病毒粒子组装的非必需基因，在对全基因组分析和我们前期基因缺失疫苗毒株构建的基础上，筛选设计了4个不同外源基因插入位点，分别位于TK、US2和US9之间、gG、以及gG和gD之间。根据外源基因插入具体位置，以PRV GX-2017株全基因组序列为模板，设计了扩增左右同源臂的特异性引物(表1)，所有引物均在北京擎科生物科技有限公司合成。
表1本发明所涉及的相关引物信息
一、表达绿色荧光蛋白的重组转移载体pUC-TK-EGFP、pUC-IES-EGFP、pUC-gGD-EGFP和pUC-gG-EGFP的构建
1、载体pUC骨架是在质粒pUC18的基础上设计缺失57bp的一段多克隆位点并通过人工基因合成后环化获得，连同重组转移载体pUC-TK、pUC-TK-EGFP、pUC-IES和pUC-IES-EGFP均由本发明人实验室构建并保存(LingLi,Yongfeng Du,Yanbin Zhang,Pengyu Li,Xinyue Liu,Xin Zhang,Jing Li,Tong Zhang,Xin Li,Dong Xiao,Peng Liu,Peng Qi andJin Xiao.Comprehensive evaluation of the safety and immunogenicity of a gene-deleted variant pseudorabies virus attenuated vaccine.VeterinaryResearch.2022,53:73)，公众可从中牧实业股份有限公司获取。
2、重组转移载体pUC-gG和pUC-gG-EGFP的构建
(1)提取PRV GX-2017株的病毒基因组DNA，以其为模板用引物对P4-F/P4-R、P5-F/P5-R分别PCR扩增gG基因的左右同源臂gG-L(序列3)、gG-R(序列4)；
(2)将gG-L和gG-R片段分别依次通过EcoRⅠ和HindⅢ、HindⅢ和Mlu装入载体pUC，构建得到转移质粒pUC-gG；
(3)以pUC-TK-EGFP质粒为模板，利用引物P10F/P10R经特异性PCR扩增EGFP完整的表达框，得到EGFP基因片段完整的表达框(序列5)；
(4)将EGFP基因片段通过HindⅢ装入转移质粒pUC-gG，构建得到携带标记基因的转移重组质粒pUC-gG-EGFP。
3、转移载体pUC-gGD、pUC-gGD-EGFP的构建
(1)提取PRV GX-2017株的病毒基因组DNA，以其为模板用引物对P6-F/P6-R、P7-F/P7-R分别PCR扩增gGD基因的上下游同源臂gGD-L(序列6)、gGD-R(序列7)；
(2)将gGD-L和gGD-R片段分别依次通过EcoRⅠ和HindⅢ、HindⅢ和Mlu装入载体pUC，构建得到转移质粒pUC-gGD；
(3)将步骤2(3)中EGFP基因片段通过HindⅢ装入转移质粒pUC-gGD，构建得到携带标记基因的转移重组质粒pUC-gGD-EGFP。
二、表达绿色荧光蛋白的重组猪伪狂犬病毒株构建
1、外源EGFP基因插入TK基因缺失位点的重组PRV毒株构建
提取基因缺失PRV GX-ΔTK/IES株的病毒基因组DNA，取2μg PRV GX-ΔTK/IES株病毒基因组DNA和2μg转移质粒pUC-TK-EGFP，利用脂质体LipofectamineTM 2000试剂共转染单层贴壁Vero细胞，然后取适量转染后72小时收获的上清接种新的PK-15细胞，孵育2小时后，将培养上清换为含1％低熔点琼脂糖的维持培养基，37℃继续培养4-5天，挑取荧光显微镜下紫外光激发的绿色荧光蚀斑于500μl DMEM培养基中。按照这个操作持续纯化5次，得到表达EGFP基因的PRV重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+TK-EGFP。
2、外源EGFP基因插入IES基因缺失位点的重组PRV毒株构建
提取基因缺失PRV GX-ΔTK/IES株的病毒基因组DNA，取2μg PRV GX-ΔTK/IES株病毒基因组DNA和2μg转移质粒pUC-IES-EGFP，利用脂质体LipofectamineTM 2000试剂共转染单层贴壁Vero细胞，然后取适量转染后72小时收获的上清接种新的PK-15细胞，孵育2小时后，将培养上清换为含1％低熔点琼脂糖的维持培养基，37℃继续培养4-5天，挑取荧光显微镜下紫外光激发的绿色荧光蚀斑于500μl DMEM培养基中。按照这个操作持续纯化5次，得到表达EGFP基因的PRV重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+IES-EGFP。
3、外源EGFP基因插入gG基因第58位碱基之后的重组PRV毒株构建
提取基因缺失PRV GX-ΔTK/IES株的病毒基因组DNA，取2μg PRV GX-ΔTK/IES株病毒基因组DNA和2μg转移质粒pUC-gG-EGFP，利用脂质体LipofectamineTM 2000试剂共转染单层贴壁Vero细胞，然后取适量转染后72小时收获的上清接种新的PK-15细胞，孵育2小时后，将培养上清换为含1％低熔点琼脂糖的维持培养基，37℃继续培养4-5天，挑取荧光显微镜下紫外光激发的绿色荧光蚀斑于500μl DMEM培养基中。按照这个操作持续纯化5次，得到表达EGFP基因的PRV重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+gG-EGFP。
4、外源EGFP基因插入gG和gD之间的重组PRV毒株构建
提取基因缺失PRV GX-ΔTK/IES株的病毒基因组DNA，取2μg PRV GX-ΔTK/IES株病毒基因组DNA和2μg转移质粒pUC-gGD-EGFP，利用脂质体LipofectamineTM 2000试剂共转染单层贴壁Vero细胞，然后取适量转染后72小时收获的上清接种新的PK-15细胞，孵育2小时后，将培养上清换为含1％低熔点琼脂糖的维持培养基，37℃继续培养4-5天，挑取荧光显微镜下紫外光激发的绿色荧光蚀斑于500μl DMEM培养基中。按照这个操作持续纯化5次，得到表达EGFP基因的PRV重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+gGD-EGFP。
将上述表达EGFP基因的重组猪伪狂犬病毒株分别感染PK-15细胞系，在感染后24小时，将细胞置于荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白的表达(图1)。通过ImageJ软件对EGFP绿色荧光强度进行分析比较，结果显示在PRV全基因组gG和gD之间插入EGFP表达框的重组病毒，即PRV
GX-ΔTK/IES+gGD-EGFP能够表达最高量的EGFP蛋白，其次是PRV
GX-ΔTK/IES+IES-EGFP和PRV GX-ΔTK/IES+TK-EGFP，而PRV
GX-ΔTK/IES+gG-EGFP的绿色荧光蛋白表达量最低(图2)。
实施例2、表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株的构建
一、表达猪瘟病毒E2蛋白的重组转移载体构建
1、表达猪瘟病毒E2蛋白的特异性PCR扩增
以NCBI公布猪瘟病毒石门株(GenBank:AY775178)E2基因序列为基础，将含CMV启动子和增强子(序列8)、信号肽序列(GenBank:AY775178)、全长E2基因(GenBank:AY775178)和SV40 poly(A)终止子基因(序列9)的特异性片段(序列1)，以及含CMV启动子和增强子(序列8)、信号肽序列(GenBank:AY775178)、截去跨膜区的E2基因(GenBank:AY775178)和SV40poly(A)终止子基因(序列9)的特异性片段(序列2)，这两个DNA片段通过人工基因合成获得。其中，在序列1中，CMV启动子和增强子的核苷酸序列从第62位核苷酸至第569位核苷酸，信号肽序列的核苷酸序列从第630位核苷酸至第692位核苷酸，全长E2基因的核苷酸序列从第693位核苷酸至第1811位核苷酸，SV40 poly(A)终止子的核苷酸序列从第1925位核苷酸至第2045位核苷酸。在序列2中，CMV启动子和增强子的核苷酸序列从第62位核苷酸至第569位核苷酸，信号肽序列的核苷酸序列从第630位核苷酸至第692位核苷酸，截去跨膜区的E2基因其核苷酸序列从第693位核苷酸至第1709位核苷酸，SV40poly(A)终止子的核苷酸序列从第1823位核苷酸至第1943位核苷酸。
分别以这两个DNA片段为模板，通过表1所示引物对P1-F/P1-R、P1-F/P2-R特异性PCR扩增，获得片段CMV-E2、CMV-tE2。
2、表达猪瘟病毒E2蛋白的重组转移载体的构建
将CMV-E2和CMV-tE2片段分别通过HindⅢ酶切位点装入载体pUC-TK，得到表达猪瘟病毒E2基因的重组转移质粒pUC-TK-E2和pUC-TK-tE2。将CMV-E2和CMV-tE2片段分别通过HindⅢ酶切位点装入载体pUC-IES，得到表达猪瘟病毒E2基因的重组转移质粒pUC-TK-E2和pUC-TK-tE2。将CMV-E2和CMV-tE2片段分别通过HindⅢ酶切位点装入载体pUC-gG，得到表达猪瘟病毒E2基因的重组转移质粒pUC-gG-E2和pUC-gG-tE2。将CMV-E2和CMV-tE2片段分别通过HindⅢ酶切位点装入载体pUC-gGD，得到表达猪瘟病毒E2基因的重组转移质粒pUC-gGD-E2和pUC-gGD-tE2。
各取2.5μg上述重组转移质粒pUC-TK-E2、pUC-TK-tE2、pUC-IES-E2、pUC-IES-tE2、pUC-gG-E2、pUC-gG-tE2、pUC-gGD-E2和pUC-gGD-tE2，利用脂质体LipofectamineTM 2000试剂分别转染Vero细胞单层，在转染后24小时，利用猪瘟病毒E2特异性单克隆抗体经间接免疫荧光分析显示，重组转移质粒pUC-TK-E2、pUC-IES-E2、pUC-gG-E2和pUC-gGD-E2在转染PK-15细胞后能够正常高效表达E2全长蛋白，重组转移质粒pUC-TK-tE2、pUC-IES-tE2、pUC-gG-tE2和pUC-gGD-tE2在转染PK-15细胞后能够正常高效表达截短的E2蛋白(图3)。
二、表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株构建
1、外源E2基因表达框插入TK基因缺失位点(即PRV GX-2017变异株基因组中TK基因的CDS区的第303位碱基至第908位碱基之间)的重组PRV毒株构建
提取PRV重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+TK-EGFP株的病毒基因组DNA，取2μgPRV GX-ΔTK/IES+TK-EGFP株病毒基因组DNA和2μg转移质粒pUC-TK-E2或者pUC-TK-tE2，利用脂质体LipofectamineTM 2000试剂共转染单层贴壁Vero细胞，然后取适量转染后72小时收获的上清接种新的PK-15细胞，孵育2小时后，将培养上清换为含1％低熔点琼脂糖的维持培养基，37℃继续培养4-5天，挑取没有绿色荧光蛋白表达的单个蚀斑于500μl DMEM培养基中。按照这个操作持续纯化5次，得到表达E2基因的PRV重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2和PRVGX-ΔTK/IES+TK-tE2。经验证表明E2或tE2插入到猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组TK基因缺失位置，即PRV GX-2017变异株基因组中TK基因的CDS区的第303位碱基至第908位碱基之间。
2、外源E2基因表达框插入IES基因缺失位点(gI基因CDS区的第268位碱基至US2基因CDS区的第284位碱基之间)的重组PRV毒株构建
提取PRV重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+IES-EGFP株的病毒基因组DNA，取2μgPRV GX-ΔTK/IES+IES-EGFP株病毒基因组DNA和2μg转移质粒pUC-IES-E2或者pUC-IES-tE2，利用脂质体LipofectamineTM 2000试剂共转染单层贴壁Vero细胞，然后取适量转染后72小时收获的上清接种新的PK-15细胞，孵育2小时后，将培养上清换为含1％低熔点琼脂糖的维持培养基，37℃继续培养4-5天，挑取没有绿色荧光蛋白表达的单个蚀斑于500μl DMEM培养基中。按照这个操作持续纯化5次，得到表达E2基因的PRV重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+IES-E2和PRV GX-ΔTK/IES+IES-tE2。经验证表明E2或tE2插入到猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRVGX-ΔTK/IES基因组IES基因缺失位置，即gI基因CDS区的第268位碱基至US2基因CDS区的第284位碱基之间。
3、外源E2基因表达框插入gG基因第58位碱基之后的重组PRV毒株构建
提取PRV重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+gG-EGFP株的病毒基因组DNA，取2μg PRV GX-ΔTK/IES+gG-EGFP株病毒基因组DNA和2μg转移质粒pUC-gG-E2或者pUC-gG-tE2，利用脂质体LipofectamineTM 2000试剂共转染单层贴壁Vero细胞，然后取适量转染后72小时收获的上清接种新的PK-15细胞，孵育2小时后，将培养上清换为含1％低熔点琼脂糖的维持培养基，37℃继续培养4-5天，挑取没有绿色荧光蛋白表达的单个蚀斑于500μl DMEM培养基中。按照这个操作持续纯化5次，得到表达E2基因的PRV重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+gG-E2和PRVGX-ΔTK/IES+gG-tE2。经验证表明E2或tE2插入到猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组gG基因第58位碱基之后。
4、外源E2基因表达框插入gG和gD之间(即gG polyA的N端第167位碱基至第173位碱基之间)的重组PRV毒株构建
提取PRV重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+gGD-EGFP株的病毒基因组DNA，取2μg PRVGX-ΔTK/IES+gGD-EGFP株病毒基因组DNA和2μg转移质粒pUC-gGD-E2或者pUC-gGD-tE2，利用脂质体LipofectamineTM 2000试剂共转染单层贴壁Vero细胞，然后取适量转染后72小时收获的上清接种新的PK-15细胞，孵育2小时后，将培养上清换为含1％低熔点琼脂糖的维持培养基，37℃继续培养4-5天，挑取没有绿色荧光蛋白表达的单个蚀斑于500μlDMEM培养基中。按照这个操作持续纯化5次，得到表达E2基因的PRV重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+gGD-E2和PRV GX-ΔTK/IES+gGD-tE2。经验证表明E2或tE2插入到猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组gG(US4)和gD(US6)基因之间，即gG polyA的N端第167位碱基至第173位碱基之间。
将上述表达猪瘟病毒全长E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株和表达猪瘟病毒截短E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株，分别感染PK-15细胞系，在感染后24小时利用猪瘟病毒E2特异性单克隆抗体经间接免疫荧光分析显示，重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2和PRV GX-ΔTK/IES+gG-E2感染PK-15细胞后能够正常高效表达E2全长蛋白，重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+TK-tE2和PRV GX-ΔTK/IES+gG-tE2感染PK-15细胞后能够正常高效表达截短的E2蛋白(图4)。通过ImageJ软件对重组病毒感染PK-15细胞后的间接免疫荧光结果图进行荧光强度分析，结果显示在PRV全基因组gG基因第58位碱基之后插入E2基因表达框的重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+gG-E2其外源蛋白表达量相对较高，其次表达量高的是在TK基因缺失位置插入E2基因表达框的重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2(图5)。
在接下来的动物试验评价中，我们选择这两个E2蛋白表达量相对较高的病毒株，分别将其制备成活病毒载体疫苗，接种靶动物仔猪开展攻毒保护评价试验。然而，猪瘟病毒E2阻断ELISA抗体水平监测结果显示，重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+gG-E2接种后的仔猪并未诱导产生E2特异性抗体。因此，我们选择重组病毒PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2重点评价其安全性和免疫原性。
实施例3、表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2株制备成活疫苗对靶动物仔猪的安全性
选取PRV抗体和抗原阴性的哺乳仔猪8头，随机分成2组。其中，疫苗接种实验组5头，分别颈部肌肉注射重组病毒活载体疫苗PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2株，接种剂量为107TCID50/头份；同时，设不接种对照组3头仔猪。免疫后连续观察14日，免疫前、免疫后每天对所有接种猪只进行体温测定，并观察、记录临床症状。临床观察结果显示，接种PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2株活疫苗后，14天内所有动物均没有表现出任何临床症状，接种部位正常，采食规律无异常，精神状态良好，与对照组3头仔猪的临床表现没有任何差异。体温检测结果如表2所示，整个监测期间所有动物未出现发热现象、体温正常。以上结果说明，PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2株用于仔猪没有致病性，对靶动物安全。
表2重组病毒活载体疫苗PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2株接种仔猪后14天的体温监测结果
中国发明专利CN108753739B所公布的2株表达猪瘟病毒E2蛋白的重组PRV毒株rPRV JS-2012-△gI/gE+E2和rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE，分别以105TCID50/头份的剂量接种哺乳仔猪，结果显示其对靶动物安全。相比较地，在本发明专利中，将PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2株以107TCID50/头份的高剂量接种靶动物仔猪，安全性观察和检测结果显示其对靶动物无致病性，安全性好。
实施例4、表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2用于靶动物仔猪的免疫效力评价
选取CSFV抗体阴性，以及PRV抗体和抗原阴性的哺乳仔猪13头，随机分成3组。其中，第1组试验组5头仔猪，经颈部肌肉接种重组猪伪狂犬病毒株PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2活疫苗，接种剂量为106TCID50/头份；第2组5头仔猪，作为市场化活疫苗对照组，经颈部肌肉接种市场化猪伪狂犬病活疫苗Bartha-K61株(海博莱，批号56J0)+猪瘟活疫苗C株(中牧股份江西生物药厂，批号2204018)，接种剂量各为1头份；第3组3头仔猪，不接种疫苗对照组。动物数目、分组、免疫剂量及动物编号见下表3所示。在免疫后28天，针对所有13头动物，用PRV变异株强毒GX按照106TCID50/头滴鼻攻毒。
表3实验动物分组及接种剂量
一、重组猪伪狂犬病毒株PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2免疫仔猪后诱导产生的E2特异性ELISA抗体和抗猪瘟病毒中和抗体
采用市场化IDEXX猪瘟病毒E2阻断ELISA抗体检测试剂盒检测免疫后42天内的猪瘟病毒E2特异性ELISA抗体水平，结果显示，重组猪伪狂犬病毒PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2株免疫组在免疫后21天开始转阳，免疫后28天全部转为阳性；相比较地，市场化疫苗免疫组第2组Bartha-K61株+猪瘟活疫苗C株在免疫后14天3头动物抗体可疑，21天5头动物抗体全部阳性(表4)。
表4重组猪伪狂犬病毒株PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2接种仔猪后的CSFV E2特异性阻断ELISA抗体检测结果
备注：判定标准：阴性阻断率＜30％，可疑30％≤S/N值≤40％，阳性S/N值＞40％。
中国发明专利CN104894076B和CN105802921B所公布表达猪瘟病毒E2蛋白的2株重组PRV毒株rPRVTJ-delgE/gI-E2、rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2，以106TCID50/头份剂量两次免疫靶动物仔猪，在加强免疫后1周仔猪诱导产生的猪瘟病毒E2特异性抗体可转为阳性。相比较地，本发明中重组猪伪狂犬病毒PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2株，在以106TCID50/头份剂量单次免疫靶动物仔猪后21天抗体开始转阳，免疫后28天全部转为阳性。
利用猪瘟病毒毒株Thiverval株(中国兽医药品监察所CVCC AV65)对血液中的中和抗体水平进行检测，简单操作如下：将浓度为2.0×105个/ml的PK-15细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，直至细胞长至80％～90％铺满孔底。将待检血清和阴、阳性对照血清于56℃灭活30分钟。在血清灭活期间，另取1块96孔细胞培养板。对待检血清进行倍比稀释，起始稀释倍数为1:10。将血清-病毒混合细胞板置于37℃含5％ CO2的培养箱中孵育1小时后，将孵育后血清-病毒混合液加入到对应的细胞孔中，每份血清重复加4孔，将细胞板置于30℃含5％ CO2的培养箱中培养72小时。弃去培养液，用猪瘟病毒E2单克隆抗体(韩国金诺Anti-CSFV LOM1，货号9011)和FITC标记羊抗鼠二抗(Sigma)开展间接免疫荧光试验。中和抗体检测结果显示，免疫后28天重组猪伪狂犬病毒株PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2免疫组和市场化Bartha-K61株+猪瘟活疫苗C株免疫组产生了显著的抗猪瘟病毒中和抗体，随着时间的延长抗体水平升高，且两组之间没有显著差异(表5)。
表5疫苗免疫和致死剂量强毒攻毒后动物体内的CSFV特异性中和抗体效价测定
二、重组猪伪狂犬病毒株PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2免疫仔猪后对猪伪狂犬病病毒变异株产生的攻毒保护
在接种后28天攻毒猪伪狂犬病病毒变异株PRV GX株(PRV GX株由本发明人实验室分离、鉴定和保存(Ling Li,Yongfeng Du,Yanbin Zhang,Pengyu Li,Xinyue Liu,XinZhang,Jing Li,Tong Zhang,Xin Li,Dong Xiao,Peng Liu,Peng Qi and JinXiao.Comprehensive evaluation of the safety and immunogenicity of agene-deleted variant pseudorabies virus attenuated vaccine.VeterinaryResearch.2022,53:73)，公众可从中牧实业股份有限公司获取)，免疫重组猪伪狂犬病毒PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2株、Bartha-K61株+猪瘟活疫苗C株的所有动物，部分动物出现一过性发热现象(表6)，PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2疫苗免疫组的5头动物全部存活，针对PRV变异株强毒攻毒保护效率为100％。然而，攻毒后对照组的3头动物在攻毒后第2天温度升高，随后1～3天出现伪狂犬病典型症状，表现出精神沉郁、四肢呈划水状、共济失调等症状；其中，1头动物在攻毒后第5天死亡，剩下2头动物一直表现高温稽留、伏地不起的状态直至试验结束(表6)。
表6猪伪狂犬病病毒变异株PRV GX株攻毒后14天的体温监测结果
采用市场化IDEXX PRV gE阻断ELISA抗体检测试剂盒检测免疫后42天内的猪伪狂犬病病毒gE阻断ELISA抗体，结果显示，所有免疫组动物在免疫后28天gE抗体全部为阴性，与未免疫对照动物一致；在攻毒后7天，部分动物抗体转阳，攻毒后14天全部转为阳性(表7)。
采用市场化BioChek PRV gB ELISA抗体检测试剂盒检测免疫后42天内的猪伪狂犬病病毒gB ELISA抗体，结果显示，在免疫后7天部分免疫动物gB抗体转阳，免疫后14天所有动物gB抗体转为阳性(表8)。
表7重组猪伪狂犬病毒株PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2接种仔猪后的PRV gE特异性阻断ELISA抗体检测结果
备注：判定标准：阴性S/N值＞0.7，可疑0.6≤S/N值≤0.7，阳性S/N值＜0.6。
表8重组猪伪狂犬病毒株PRV GX-ΔTK/IES+TK-E2接种仔猪后的PRV gB特异性阻断ELISA抗体检测结果
备注：判定标准：S/P≤0.499为阴性；S/P≥0.5为阳性。
Claims (10)
1.猪伪狂犬病毒的插入位点在制备表达病原蛋白的重组病毒中的应用，所述插入位点为下述(1)-(4)中的至少一个位点：
(1)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组TK基因缺失位置，即PRVGX-2017变异株基因组中TK基因的CDS区的第303位碱基至第908位碱基之间；
(2)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组IES基因缺失位置，即gI基因CDS区的第268位碱基至US2基因CDS区的第284位碱基之间；
(3)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组gG(US4)和gD(US6)基因之间，即gG polyA的N端第167位碱基至第173位碱基之间；
(4)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组gG基因第58位碱基之后。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病原蛋白为猪瘟病毒E2蛋白；
优选的，所述猪伪狂犬病毒为猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES。
3.表达绿色荧光蛋白EGFP的重组猪伪狂犬病毒株，其特征在于，该重组毒株在猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组中插入了CMV启动子控制下的标记基因EGFP表达框的外源序列。
4.如权利要求1所述的表达绿色荧光蛋白EGFP的重组猪伪狂犬病毒株，所述CMV启动子控制下的标记基因EGFP表达框的外源序列插入位置为下述(1)-(4)中的至少一个位点：
(1)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组TK基因缺失位置，即PRVGX-2017变异株基因组中TK基因的CDS区的第303位碱基至第908位碱基之间；
(2)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组IES基因缺失位置，即gI基因CDS区的第268位碱基至US2基因CDS区的第284位碱基之间；
(3)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组gG(US4)和gD(US6)基因之间，即gG polyA的N端第167位碱基至第173位碱基之间；
(4)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组gG基因第58位碱基之后。
5.表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株，其特征在于，该重组毒株在猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组的插入了CMV启动子控制下的猪瘟病毒E2基因全长表达框的外源序列，或插入CMV启动子控制下的猪瘟病毒E2基因胞外区表达框的外源序列；所述CMV启动子控制下的猪瘟病毒E2基因全长表达框的外源序列为序列1；所述CMV启动子控制下的猪瘟病毒E2基因胞外区表达框的外源序列为序列2。
6.如权利要求5所述的表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株，其特征在于，CMV启动子控制下的猪瘟病毒E2基因全长表达框的外源序列，或CMV启动子控制下的猪瘟病毒E2基因胞外区表达框的外源序列的插入位置为下述(1)-(4)中的至少一个位点：
(1)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组TK基因缺失位置，即PRVGX-2017变异株基因组中TK基因的CDS区的第303位碱基至第908位碱基之间；
(2)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组IES基因缺失位置，即gI基因CDS区的第268位碱基至US2基因CDS区的第284位碱基之间；
(3)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组gG(US4)和gD(US6)基因之间，即gG polyA的N端第167位碱基至第173位碱基之间；
(4)猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES基因组gG基因第58位碱基之后。
7.权利要求5所述的表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建含有EGFP基因表达框的转移载体；
(2)构建含有猪瘟病毒E2基因表达框的转移载体；
(3)将含有EGFP基因表达框的转移载体转染经基因缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES感染的Vero细胞，通过多轮绿色荧光蚀斑筛选纯化，获得表达绿色荧光蛋白的缺失病毒；
(4)将含有猪瘟病毒E2基因表达框的转移载体转染经表达绿色荧光蛋白缺失病毒感染的Vero细胞，通过多轮蚀斑筛选纯化，获得表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株。
8.权利要求3-6中任一项所述毒株作为病毒载体可插入一种和/或多种核酸序列，以获得表达外源基因的重组病毒，在制备重组载体基因工程疫苗中的应用。
9.权利要求5或6所述的表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株在制备预防或治疗猪伪狂犬病和猪瘟病毒疫苗中的应用或在制备诊断或检测猪伪狂犬病和猪瘟病毒的试剂中的应用。
10.一种预防或治疗猪伪狂犬病和猪瘟病毒疫苗，其特征在于，包括权利要求5或6所述的表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪伪狂犬病毒株。
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