序列表 本申請案含有根據37 C.F.R. 1.821 - 1.825之序列列。伴隨此申請案之序列表之全部內容以引用方式併入本文中。 本發明解決先前技術中之固有問題且提供最新技術之顯著改進。通常，本發明提供一種EHV載體，其包括 (i) 至少一個與感染產食動物之病原體相關之外源性抗原編碼序列， (ii) 該外源性抗原編碼序列插入ORF70中， (iii) 該外源性抗原編碼序列可操作地連接至啟動子序列。 另外，本發明提供包括如本文所闡述之EHV載體及視情況醫藥載劑之免疫原性組合物。 因此，本發明提供包括EHV載體之免疫原性組合物，該EHV載體包括 (i) 至少一個與感染產食動物之病原體相關之外源性抗原編碼序列， (ii) 該外源性抗原編碼序列插入ORF70中， (iii) 該外源性抗原編碼序列可操作地連接至啟動子序列。 有利的是，由本發明提供之實驗數據揭示，已在EHV載體內提供可用於插入且表現抗原之新穎插入位點。另外，提供新穎插入位點現容許自不同插入位點插入抗原並加以表現且分別表現一種以上抗原。另外，實驗數據展示，可使用具有新穎插入位點之EHV載體來分別用於提供具有一或兩個位點之免疫原性組合物及用於DIVA疫苗。 另外，本發明提供一種EHV載體，其包括 (i) 至少一個與感染產食動物之病原體相關之外源性抗原編碼序列， (ii) 該外源性抗原編碼序列插入插入位點中， (iii) 該外源性抗原編碼序列可操作地連接至包括4pgG600 (SEQ ID NO:1)或4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列之啟動子序列。 另外，本發明提供包括如本文所闡述之EHV載體及視情況醫藥載劑之免疫原性組合物。 因此，本發明提供包括EHV載體之免疫原性組合物，該EHV載體包括 (i) 至少一個與感染產食動物之病原體相關之外源性抗原編碼序列， (ii) 該外源性抗原編碼序列插入插入位點中， (iii) 該外源性抗原編碼序列可操作地連接至包括4pgG600 (SEQ ID NO:1)或4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列之啟動子序列。 有利的是，由本發明提供之實驗數據揭示，已提供可用於表現抗原之新穎啟動子序列。另外，提供新穎啟動子序列容許表現來自載體系統(例如EHV載體系統)之不同插入位點之抗原且分別表現一種以上抗原。另外，實驗數據展示，可使用啟動子序列來表現載體系統(例如EHV載體系統)中之抗原，從而用於分別提供具有一或兩個位點且用於DIVA疫苗之免疫原性組合物。 另外，本發明提供一種EHV載體，其包括 (i) 至少兩個與感染產食動物之病原體相關之外源性抗原編碼序列， (ii) 該等外源性抗原編碼序列插入插入位點中， (iii) 該等外源性抗原編碼序列可操作地連接至啟動子序列。 另外，本發明提供包括如本文所闡述之EHV載體及視情況醫藥載劑之免疫原性組合物。 因此，本發明提供包括EHV載體之免疫原性組合物，該EHV載體包括 (i) 至少兩個與感染產食動物之病原體相關之外源性抗原編碼序列， (ii) 該等外源性抗原編碼序列插入插入位點中， (iii) 該等外源性抗原編碼序列可操作地連接至啟動子序列。 另外，本發明提供包括如本文所闡述之兩個或更多個EHV載體之免疫原性組合物。較佳地，免疫原性組合物包括兩個、三個或四個EHV載體。 在本發明之一態樣中，免疫原性組合物包括兩個EHV載體。 在本發明之一態樣中，兩個或更多個EHV載體包括不同外源性抗原編碼序列。較佳地，兩個或更多個EHV載體包括與豬流感A病毒相關之不同外源性抗原編碼序列。更佳地，兩個或更多個EHV載體包括不同血球凝集素編碼序列。 另外，本發明提供包括一或多個如本文所闡述之EHV載體之DIVA疫苗。 在本發明之一態樣中，EHV載體係重組體。 在本發明之一態樣中，EHV載體係RacH或RacH SE。 在本發明之一態樣中，EHV載體係選自由以下組成之群：EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9。 在本發明之一態樣中，EHV載體係EHV-1。 在本發明之一態樣中，產食動物係豬。 在本發明之一態樣中，感染產食動物之病原體係流感病毒、較佳地豬流感A病毒。 在本發明之一態樣中，外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列。 在本發明之一態樣中，外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列且血球凝集素流感亞型係選自由以下組成之群：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及H18。 在本發明之一態樣中，外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列且血球凝集素流感亞型係H1及/或H3。 在本發明之一態樣中，外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列且血球凝集素流感A抗原具有豬起源。 在本發明之一態樣中，EHV載體包括至少兩個血球凝集素流感抗原編碼序列。 在本發明之一態樣中，EHV載體包括至少4個血球凝集素流感抗原編碼序列。 在本發明之一態樣中，EHV載體包括4個血球凝集素流感抗原編碼序列。 在本發明之一態樣中，外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列且血球凝集素流感抗原編碼序列係選自由以下組成之株群：A/豬/Italy/116114/2010(H1N2)、A/豬/Italy/7680/2001(H3N2)、A/豬/Gent/132/2005(H1N1)、A/豬/Italy/4675/2003(H1N2)、A/豬/Italy/259543/2003(H1N2)、A/豬/Denmark/13772-1/2003(H1N1)、A/豬/England/MD0040352R/2009(H1N1)、A/豬/Hungary/13509/2007(H3N2)、A/豬/Italy/13962/95(H3N2)、A/豬/Cotes d'Armor/1121/00(H1N1)、A/豬/Colorado/ 1/77、A/豬/Colorado/23619/99、A/豬/Cote d'Armor/3633/84、A/豬/England/ 195852/92、A/豬/Finistere/2899/82、A/豬/Hong Kong/10/98、A/豬/Hong Kong/9/98、A/豬/Hong Kong/81/78、A/豬/Illinois/100084/01、A/豬/Illinois/100085A/01、A/豬/Illinois/21587/99、A/豬/Indiana/1726/88、A/豬/Indiana/9K035/99、A/豬/Indiana/P12439/00、A/豬/Iowa/30、A/豬/Iowa/15/30、A/豬/Iowa/533/99、A/豬/Iowa/569/99、A/豬/Iowa/3421/90、A/豬/Iowa/8548-1/98、A/豬/Iowa/930/01、A/豬/Iowa/17672/88、A/豬/Italy/1513-1/98、A/豬/Italy/1523/98、A/豬/Korea/CY02/02、A/豬/Minnesota/55551/00、A/豬/Minnesota/593/99、A/豬/Minnesota/9088-2/98、A/豬/Nebraska/1/92、A/豬/Nebraska/209/98、A/豬/Netherlands/12/85、A/豬/North Carolina/16497/99、A/豬/North Carolina/35922/98、A/豬/North Carolina/93523/01、A/豬/North Carolina/98225/01、A/豬/Oedenrode/7C/96、A/豬/Ohio/891/01、A/豬/Oklahoma/18717/99、A/豬/Oklahoma/18089/99、A/豬/Ontario/01911-1/99、A/豬/Ontario/01911-2/99、A/豬/Ontario/41848/97、A/豬/Ontario/97、A/豬/Quebec/192/81、A/豬/Quebec/192/91、A/豬/Quebec/5393/91、A/豬/Taiwan/7310/70、A/豬/Tennessee/24/77、A/豬/Texas/4199-2/98、A/豬/Wisconsin/125/97、A/豬/Wisconsin/136/97、A/豬/Wisconsin/163/97、A/豬/Wisconsin/164/97、A/豬/Wisconsin/166/97、A/豬/Wisconsin/168/97、A/豬/Wisconsin/235/97、A/豬/Wisconsin/238/97、A/豬/Wisconsin/457/985 A/豬/Wisconsin/458/98、A/豬/Wisconsin/464/98及A/豬/Wisconsin/14094/99。 在本發明之一態樣中，外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列且血球凝集素流感抗原編碼序列係選自由以下組成之株群：A/豬/Italy/116114/2010(H1N2)、A/豬/Italy/7680/2001(H3N2)、A/豬/Gent/132/2005(H1N1)及A/豬/Italy/4675/2003(H1N2)。 在本發明之一態樣中，外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列且血球凝集素流感抗原編碼序列編碼選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29。 在本發明之一態樣中，外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列且血球凝集素流感抗原編碼序列包括編碼與SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29中所陳述之胺基酸序列至少70%一致之胺基酸序列之核酸序列。 在本發明之一態樣中，外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列且血球凝集素流感抗原編碼序列包括編碼與如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29中所陳述之胺基酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列之核酸序列。 在本發明之一態樣中，外源性抗原編碼序列係流感A病毒N (神經胺酸酶)編碼序列且N亞型係選自由以下組成之群：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9及N10。 在本發明之一態樣中，EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗不包括N (神經胺酸酶)流感抗原編碼序列。 在本發明之一態樣中，EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗不包括NP (核蛋白)流感抗原編碼序列。 在本發明之一態樣中，EHV載體包括其他調節序列，例如終止信號或多腺苷酸化序列。 插入位點： 在本發明之一態樣中，該插入位點係ORF1/3。 在本發明之一態樣中，該插入位點係ORF70。 在本發明之一態樣中，將與感染產食動物之病原體相關之第一外源性抗原編碼序列插入ORF70中。 在本發明之一態樣中，將與感染產食動物之病原體相關之第二外源性抗原編碼序列插入ORF1/3中。 在本發明之一態樣中，ORF70中之插入之特徵在於ORF70中之部分缺失、截短、取代、修飾或諸如此類，其中ORF71保留功能性。 在本發明之一態樣中，ORF70中之插入之特徵在於缺失RacH之ORF70內之大約801bp部分(SEQ ID NO: 20)或其70%、80%、85%、90%、95%、99%同源及/或一致序列。 在本發明載體之另一特定態樣中，ORF70中之插入之特徵在於缺失RacH之ORF70內之大約801bp部分(SEQ ID NO.: 20)或任一其他株中之其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列缺失。 在本發明載體之另一特定態樣中，ORF70中之插入之特徵在於缺失野生型EHV-1株ab4 (基因庫登錄號AY665713.1)之ORF70內之大約801bp部分，其中野生型ab4基因體序列中之缺失部分位於核苷酸127681與128482 (SEQ ID NO.: 19)之間或係其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。 在本發明載體之另一特定態樣中，ORF70中之插入之特徵在於缺失野生型EHV-1株ab4 (基因庫登錄號AY665713.1)之ORF70內之大約801bp部分，其中野生型ab4基因體序列中之缺失部分位於核苷酸127681與128482之間(SEQ ID NO.: 19)或任一其他株中之其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列缺失。 在本發明之一態樣中，EHV-1載體包括至少一個選自由以下組成之群之側接區：SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17及SEQ ID NO: 18及該等序列中之任一者之70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。 在本發明之一態樣中，EHV-1載體包括(i)至少一個選自由以下組成之群之左ORF70側接區：SEQ ID NO.: 13、SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 17；及(ii)至少一個選自由以下組成之群之右ORF70側接區：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16及SEQ ID NO: 18。 啟動子： 在本發明之一態樣中，啟動子序列係選自由以下組成之群：SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人類延長因子α啟動子、桿狀病毒多角體蛋白啟動子、4pgG600 (SEQ ID NO:1)之功能片段(較佳地，該功能片段係p430 (SEQ ID NO:3))、4pgG600 (SEQ ID NO:1)之互補核苷酸序列之功能片段、4pMCP600 (SEQ ID NO:2)之功能片段(較佳地，該功能片段係p455 (SEQ ID NO:4))、4pMCP600 (SEQ ID NO: 2)之互補核苷酸序列之功能片段。 在本發明之一態樣中，啟動子序列包括4pgG600 (SEQ ID NO:1)或4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列。 在本發明之一態樣中，啟動子序列之功能片段或衍生物具有80%、85%、較佳地90%、91%、92%、93%、94%、更佳地95%、96%、97%、98%、99%、99.9%之同源性。 在本發明之一態樣中，啟動子序列之功能片段或衍生物具有550個核苷酸、較佳地500、490、480、470、460、455、450、445、440、435、434、433、432、431、430個核苷酸、最佳地455或430個核苷酸之長度。 在本發明之一態樣中，啟動子序列之功能片段係4pgG600 (SEQ ID NO:1)之截短物或其互補核苷酸序列，較佳地，序列一致性為整個長度之(至少) 72% (或更高)。 在本發明之一態樣中，4pgG600 (SEQ ID NO:1)之啟動子序列之功能片段係指定片段430p430 (SEQ ID NO:3)。在另一態樣中，序列一致性為(至少) 70%、80%、85%、較佳地90%、91%、92%、93%、94%、更佳地95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%。 在本發明之一態樣中，啟動子序列之功能片段係4pMCP600 (SEQ ID NO:2)之截短物或其互補核苷酸序列，較佳地，序列一致性為整個長度之(至少) 78% (或更高)。 在本發明之一態樣中，4pMCP600 (SEQ ID NO:2)之啟動子序列之功能片段係指定片段p455 (SEQ ID NO:4)。在另一態樣中，序列一致性為(至少) 70%、80%、85%、較佳地90%、91%、92%、93%、94%、更佳地95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%。 在本發明之一態樣中，EHV載體包括一或多個其他調節序列，例如終止信號、多腺苷酸化信號或調節元件(例如IRES及/或2a肽)。 啟動子及抗原之特定組合： 在本發明之一態樣中，啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 28中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列。 在本發明之一態樣中，啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)之功能片段係指定片段p430 (SEQ ID NO:3)。 在本發明之一態樣中，啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 27中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列。 在本發明之一態樣中，啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)之功能片段係指定片段455p455 (SEQ ID NO:4)。 在本發明之一態樣中，啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 28中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列，且 其中啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 27中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列。 在本發明之一態樣中，啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)之功能片段係指定片段p430 (SEQ ID NO:3)，且其中啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)之功能片段係指定片段455p455 (SEQ ID NO:4)。 在本發明之一態樣中，免疫原性組合物或DIVA疫苗係二價。 在本發明之一態樣中，啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 29中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列。 在本發明之一態樣中，啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)之功能片段係指定片段p430 (SEQ ID NO:3)。 在本發明之一態樣中，啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 26中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列。 在本發明之一態樣中，啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)之功能片段係指定片段455p455 (SEQ ID NO:4)。 在本發明之一態樣中，啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 29中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列，且其中啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 26中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列。 在本發明之一態樣中，啟動子序列4pgG600 (SEQ ID No. 1)之功能片段係指定片段p430 (SEQ ID NO: 3)且其中啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO: 2)之功能片段係指定片段455p455 (SEQ ID NO:4)。 在本發明之一態樣中，免疫原性組合物或DIVA疫苗係二價。 在本發明之一態樣中，該免疫原性組合物包括第一EHV載體，該第一EHV載體包括：啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列，其可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 28中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列；及 啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列，其可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 27中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列，且 其中該免疫原性組合物包括第二EHV載體，該第二EHV載體包括：啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列，其可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 29中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列；及 啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列，其可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 26中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列。 在本發明之一態樣中，啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)之功能片段係指定片段p430 (SEQ ID NO:3)且其中啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID No. 2)之功能片段係指定片段455p455 (SEQ ID NO:4)。 在本發明之一態樣中，免疫原性組合物或DIVA疫苗係四價。 在本發明之一態樣中，該免疫原性組合物或DIVA疫苗皆調配用於單一劑量投與。 較佳地，單一劑量之總體積介於約0.2 ml與2.5 ml之間、更佳地介於約0.2 ml與2.0 ml之間、甚至更佳地介於約0.2 ml與1.75 ml之間、仍更佳地介於約0.2 ml與1.5 ml之間、甚至更佳地介於約0.4 ml與1.25 ml之間、甚至更佳地介於約0.4 ml與1.0 ml之間，其中單一0.5 ml劑量或1.0 ml劑量最佳。最佳地，單一劑量具有0.5 ml、1 ml、1.5 ml或2 ml之總體積。 另外已展示，在投與本發明之免疫原性組合物之一個劑量之後，該免疫原性組合物之該單一劑量較為有效。 在本發明之一態樣中，經肌內或鼻內投與該免疫原性組合物或DIVA疫苗。 在本發明之一態樣中，免疫原性組合物或DIVA疫苗對於前6週齡內、前兩週齡內、第一週齡內或第一天齡內之豬係安全的。 在本發明之一態樣中，免疫原性組合物或DIVA疫苗進一步包括醫藥上可接受之載劑。 在本發明之一態樣中，該醫藥上可接受之載劑係注射用水、細胞培養基或再懸浮緩衝劑。 在本發明之一態樣中，該再懸浮緩衝劑係磷酸鹽緩衝鹽水。 在本發明之一態樣中，免疫原性組合物或DIVA疫苗包括1×10
4
至1×10
9
組織培養感染劑量50 (TCID
50)
、較佳地介於1×10
4
至1×10
8
TCID
50
之間、甚至更佳地1×10
4
至1×10
7
TCID
50
之EHV載體。 在本發明之一態樣中，該免疫原性組合物係疫苗。 在本發明之一態樣中，該免疫原性組合物或DIVA疫苗係多價疫苗。 在本發明之一態樣中，該免疫原性組合物或DIVA疫苗係二價疫苗、四價疫苗、六價疫苗或七價疫苗。 在本發明之一態樣中，該免疫原性組合物或DIVA疫苗係二價疫苗或四價疫苗。 在本發明之一態樣中，免疫原性組合物或DIVA疫苗可有效治療及/或預防有需要之產食動物中由豬流感A病毒引起之臨床徵象。 在本發明之一態樣中，免疫原性組合物或DIVA疫苗抵抗豬流感A病毒之同源及/或異源性攻毒。 在本發明之一態樣中，免疫原性組合物或DIVA疫苗抵抗血清型H1及/或H3之豬流感A病毒之攻毒。 套組 若期望，則可將組合物呈遞於包裝或分配器裝置中，該包裝或分配器裝置可含有一或多個含有活性成分之單位劑型。包裝可(例如)包括金屬或塑膠箔，例如泡罩包裝。包裝或分配器裝置可帶有用於投與、較佳地投與產食動物、尤其豬之說明書。該(等)容器可附帶有監管醫藥或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式之公告，該公告顯示該機構已批准用於動物投與之製造、使用或銷售。 本發明提供包括如本文所闡述之免疫原性組合物或DIVA疫苗之套組。 在本發明之一態樣中，套組進一步包括用於治療及/或預防豬流感A病毒之說明手冊。 治療方法 本發明提供對產食動物實施免疫之方法，其包括向該產食動物投與如本文所闡述之免疫原性組合物或DIVA疫苗。 較佳地，免疫化使得減小畜群中特定豬流感A病毒感染之發病率或減小由特定豬流感A病毒感染引起或與其有關之臨床徵象之嚴重程度。 另外，使用如本文所提供之免疫原性組合物對有需要之產食動物實施免疫使得產食動物可預防感染豬流感A病毒感染。甚至更佳地，免疫化針對豬流感A病毒感染產生有效、長效、免疫學反應。應理解，該時間段將持續大於2個月、較佳地大於3個月、更佳地大於4個月、更佳地大於5個月、更佳地大於6個月。必須理解，免疫化不能在實施免疫之所有動物中皆有效。然而，該術語需要畜群之大部分動物有效免疫。 較佳地，在此上下文中設計通常(亦即並無免疫化)發生通常由豬流感A病毒感染引起或與其有關之臨床徵象之產食動物畜群。熟習此項技術者可易於測定畜群之產食動物是否有效免疫。較佳地，若與未實施免疫或使用可在本發明之前獲得之免疫原性組合物實施免疫但隨後感染特定豬流感A病毒之產食動物相比，給定畜群中至少33%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、仍更佳地至少95%及最佳地100%之動物之臨床徵象之發生率或嚴重程度減弱至少10%、更佳地至少20%、仍更佳地至少30%、甚至更佳地至少40%、仍更佳地至少50%、甚至更佳地至少60%、仍更佳地至少70%、甚至更佳地至少80%、仍更佳地至少90%、仍更佳地至少95%及最佳地100%，則免疫化應係有效的。 本發明提供治療或預防有需要之產食動物中由流感A病毒引起之臨床徵象之方法，該方法包括向產食動物投與治療有效量之如本文所闡述之免疫原性組合物或DIVA疫苗。 較佳地，與未治療(未實施免疫)但隨後感染特定流感A病毒之產食動物相比，臨床徵象減輕至少50%、甚至更佳地至少60%、仍更佳地至少70%、甚至更佳地至少80%、甚至更佳地至少90%、仍更佳地至少95%、最佳地100%。 本發明提供與相同種之未免疫對照組之產食動物相比減小有需要之產食動物中肺中之病毒效價的方法，該方法包括向產食動物投與治療有效量之如本文所闡述之免疫原性組合物或DIVA疫苗。然而，必須理解，該病毒係流感A病毒、較佳地豬流感A病毒。 較佳地，與相同種之未免疫對照組中隨後感染特定流感A病毒之產食動物相比，肺中之病毒效價減小至少50%、甚至更佳地至少60%、仍更佳地至少70%、甚至更佳地至少80%、甚至更佳地至少90%、仍更佳地至少95%、最佳地100%。 有利的是，由本發明提供之實驗數據揭示本文所提供之免疫原性組合物在投與豬時之安全性及效能。實際上，與未接種疫苗之仔豬相比，在病毒感染攻毒之後，使用本文所提供之免疫原性組合物接種疫苗之豬具有減少之與疾病有關之臨床徵象(例如減小之病毒肺效價)。 本發明提供對具有抗豬流感A病毒抗體之有需要之產食動物接種疫苗之方法，其包括向該產食動物投與治療有效量之如本文所闡述之免疫原性組合物或DIVA疫苗之步驟。 然而，抗豬流感A病毒抗體可存在於由仔豬因應於豬流感A病毒感染所產生之未接種疫苗仔豬中。或者，未接種疫苗仔豬中之抗豬流感A病毒抗體係因應於使用豬流感A病毒疫苗對母豬接種疫苗或因應於母豬之豬流感A病毒感染所產生之母源抗體。母源抗體經由初乳及乳液自該等母豬被動轉移至仔豬中。 使用疫苗抗原干擾母源抗體可減小或甚至消除針對活疫苗以及失活疫苗之免疫反應。已針對活疫苗以及非複製者(亦即失活或亞單位疫苗)報導母源抗體對疫苗誘導之免疫反應之不同干擾程度。 因此，可在針對豬IAV之母源抗體存在下將本文所闡述之豬IAV疫苗成功施加至仔豬中且針對豬IAV感染提供保護。 另外，使用如本文所闡述之豬IAV疫苗對母豬接種疫苗會產生母豬免疫性且將母源抗體轉移至仔豬。 因此，本發明提供在幼小產食動物中提供針對流感A病毒之母源免疫性之方法，其包括在該幼小產食動物之母親懷有幼小產食動物的同時向該母親投與治療有效量之如本文所闡述之免疫原性組合物或DIVA疫苗。 因本文所闡述之豬IAV疫苗可在母源抗體存在下成功施加至仔豬，故該疫苗可用於母豬接種疫苗及由該母豬分娩之仔豬之後續接種疫苗。接種疫苗之母豬將包含抗體之母源免疫性轉移至仔豬。然而，因如本文所闡述之豬IAV疫苗不干擾母源抗體，故可使用相同疫苗在生命早期對仔豬接種疫苗。另外，藉由使用如本文所闡述之疫苗或任一其他豬IAV母豬疫苗對母豬以及由母豬分娩之幼小仔豬接種疫苗，可增加針對流感A病毒感染之保護。在生命之前幾天至幾週，仔豬由母源免疫性保護。另外，藉由仔豬之早期接種疫苗，仔豬衍生出針對流感A病毒感染之免疫性並由此得以保護，且未在母源免疫性消失與接種疫苗開始之間出現免疫學間隙。 本發明提供提供增加有需要之幼小產食動物中針對流感A病毒感染之保護之方法，其中 a) 在該幼小產食動物之母親懷有該幼小產食動物的同時使用治療有效量之如本文所闡述之免疫原性組合物或DIVA疫苗對該母親接種疫苗及/或 b) 使用治療有效量之該免疫原性組合物或DIVA疫苗在三週齡內對該幼小產食動物接種疫苗。 較佳地，在分娩之前、較佳地在已發生一個、更佳地兩個接種疫苗(「重複劑量」)之基礎免疫化之後，將該免疫原性組合物或DIVA疫苗投與懷孕母豬至少一次。在將免疫原性組合物或DIVA疫苗投與母豬三次時，第一基礎免疫化應發生於在分娩之前116天與60天之間、較佳地在分娩之前116天與58天之間及最佳地在分娩之前116天與56天之間。第二基礎免疫化應發生於在分娩之前95天與40天之間、較佳地在分娩之前95天與38天之間及最佳地在分娩之前95天與35天之間。在分娩之前之最終加強投與應發生於在分娩之前10天與20天之間、較佳地在分娩之前12天與18天之間及最佳地在分娩之前14天。 較佳地在達到三週齡之前將免疫原性組合物或DIVA疫苗投與仔豬。較佳地，在以下時間將免疫原性組合物或DIVA疫苗投與每一仔豬：1天齡至21天齡、更佳地在1天齡至10天齡之間、甚至更佳地在1天齡至9天齡之間、甚至更佳地在1天齡至8天齡之間、甚至更佳地在1天齡至7天齡之間、甚至更佳地在1天齡至6天齡之間、甚至更佳地在1天齡至5天齡之間、甚至更佳地在1天齡至4天齡之間、甚至更佳地在1天齡至3天齡之間、甚至更佳地在1天或2天齡及最佳地1天齡。 然而，可以兩個或更多個劑量將免疫原性組合物投與仔豬，其中第一劑量係在投與第二(加強)劑量之前投與。較佳地，第一劑量係在前兩週齡內、更佳地在第一週齡內及甚至更佳地在第一天齡內投與。較佳地，在第一劑量之後至少15天投與第二劑量。更佳地，在第一劑量之後15天與40天之間投與第二劑量。甚至更佳地，在第一劑量之後至少17天投與第二劑量。仍更佳地，在第一劑量之後17天與30天之間投與第二劑量。甚至更佳地，在第一劑量之後至少19天投與第二劑量。仍更佳地，在第一劑量之後19天與25天之間投與第二劑量。最佳地，在第一劑量之後至少21天投與第二劑量。在兩次投與方案之一較佳態樣中，免疫原性組合物之第一劑量及第二劑量皆以相同量投與。較佳地，每一劑量係以上文指定之較佳量，其中1 ml之第一劑量及第二劑量最佳。除第一劑量及第二劑量方案外，替代實施例包括其他後續劑量。舉例而言，可在該等態樣中投與第三、第四或第五劑量。較佳地，以與第一劑量相同之量投與後續第三、第四及第五劑量方案，其中各劑量之間之時間範圍與上文所提及第一及第二劑量之間之時間一致。因此，該方法係指對懷孕母豬以及所分娩仔豬接種疫苗。 在本發明之一態樣中，產食動物係豬、仔豬或母豬。 在本發明之一態樣中，流感A病毒係豬流感A病毒。 在本發明之一態樣中，投與免疫原性組合物或DIVA疫苗一次。 應理解，單一劑量僅投與一次。如實例中所展示，如本文所提供之免疫原性組合物已證實在投與單一劑量之後較為有效。 較佳地，單一劑量之總體積介於約0.2 ml與2.5 ml之間、更佳地介於約0.2 ml與2.0 ml之間、甚至更佳地介於約0.2 ml與1.75 ml之間、仍更佳地介於約0.2 ml與1.5 ml之間、甚至更佳地介於約0.4 ml與1.25 ml之間、甚至更佳地介於約0.4 ml與1.0 ml之間，其中單一0.5 ml劑量或1.0 ml劑量最佳。最佳地，單一劑量具有0.5 ml、1 ml、1.5 ml或2 ml之總體積。 在本發明之一態樣中，將免疫原性組合物或DIVA疫苗投與前6週齡內、前兩週齡內、第一週齡內或第一天齡內之產食動物。 較佳地，擬免疫化產食動物介於1天齡至40天齡、1天齡至30天齡、1天齡至21天齡之間，更佳地，該擬免疫化產食動物介於1天齡至10天齡之間、甚至更佳地介於1天齡至9天齡之間、甚至更佳地介於1天齡至8天齡之間、甚至更佳地介於1天齡至7天齡之間、甚至更佳地介於1天齡至6天齡之間、甚至更佳地介於1天齡至5天齡之間、甚至更佳地介於1天齡至4天齡之間、甚至更佳地介於1天齡至3天齡之間、甚至更佳地係1或2天年齡及最佳地1天齡或0天齡。 較佳地，擬免疫化產食動物係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天齡。更佳地，該擬免疫化產食動物係1、2、3、4、5、6或7天齡。然而，必須理解，在對數天齡產食動物接種疫苗之後，產食動物之免疫系統需要數天來建立針對豬流感A病毒感染之免疫性。因此，較佳地，在第一天齡內對產食動物實施免疫。 在本發明之一態樣中，以兩個劑量投與免疫原性組合物或DIVA疫苗。 如實例中所展示，已證實，如本文所提供之免疫原性組合物在投與兩個劑量之後較為有效。 然而，可以兩個或更多個劑量投與免疫原性組合物，其中第一劑量係在投與第二(加強)劑量之前投與。較佳地，第一劑量係在前兩週齡內、更佳地在第一週齡內及甚至更佳地在第一天齡內投與。較佳地，在第一劑量之後至少15天投與第二劑量。更佳地，在第一劑量之後15天與40天之間投與第二劑量。甚至更佳地，在第一劑量之後至少17天投與第二劑量。仍更佳地，在第一劑量之後17天與30天之間投與第二劑量。甚至更佳地，在第一劑量之後至少19天投與第二劑量。仍更佳地，在第一劑量之後19天與25天之間投與第二劑量。最佳地，在第一劑量之後至少21天投與第二劑量。在兩次投與方案之一較佳態樣中，免疫原性組合物之第一劑量及第二劑量皆以相同量投與。較佳地，每一劑量係以上文指定之較佳量，其中1 ml之第一劑量及第二劑量最佳。除第一劑量及第二劑量方案外，替代實施例包括其他後續劑量。舉例而言，可在該等態樣中投與第三、第四或第五劑量。較佳地，以與第一劑量相同之量投與後續第三、第四及第五劑量方案，其中各劑量之間之時間範圍與上文所提及第一及第二劑量之間之時間一致。 在本發明之一態樣中，在第一週齡內且然後在第二第、三或第四週齡內將免疫原性組合物或DIVA疫苗投與產食動物。 在本發明之一態樣中，經肌內或鼻內投與該免疫原性組合物或DIVA疫苗。 較佳地，局部或全身性投與免疫原性組合物或DIVA疫苗。常用之適宜投與途徑係經口或非經腸投與，例如鼻內、靜脈內、肌內、腹膜腔內、皮下以及吸入。然而，端視化合物之性質及作用模式，亦可藉由其他途徑投與免疫原性組合物或DIVA疫苗。然而，最佳地，經肌內或經鼻內投與免疫原性組合物或DIVA疫苗。 在本發明之一態樣中，產食動物係抗豬流感A病毒抗體陰性。 在本發明之一態樣中，產食動物係抗豬流感A病毒抗體陽性。較佳地，抗豬流感A病毒抗體效價係藉由血球凝集素抑制測試及/或病毒中和測試來測定且分別介於1:2與1:2,048之間、介於1:2與1:1,024之間、介於1:2與1:512之間、介於1:2與1:256之間、介於1:2與1:128之間、介於1:2與1:64之間、介於1:2與1:32之間、介於1:2與1:16之間、介於1:64與1:2,048之間、介於1:64與1:1024之間或介於1:64與1:512之間。或者或另外，藉由ELISA分析來測定抗鼠流感A病毒抗體效價，此係藉由分別使用抗豬流感A病毒抗體陽性及陰性試樣之確立或推薦測試特異性臨限值來進行評價。 熟習此項技術者熟知如何量測母源抗豬流感A病毒抗體。 較佳地，免疫原性組合物或DIVA疫苗包括1×10
4
至1×10
9
TCID
50
、較佳地介於1×10
4
至1×10
8
TCID
50
之間、甚至更佳地1×10
4
至1×10
7
TCID
50
之EHV載體。 在本發明之一態樣中，免疫原性組合物或DIVA疫苗包括1×10
4
至1×10
7
TCID
50
之EHV載體。 在本發明之一態樣中，該等方法產生與相同種之未免疫對照組之產食動物相比，選自由以下組成之群之效能參數改良：體重減輕降低、降低肺中之病毒負荷、減少肺病灶、減少及/或縮短病毒脫落、降低直腸溫度、減少臨床症狀(尤其呼吸症狀)、增加(中和)抗豬流感A病毒抗體之誘導、增加針對豬流感A病毒之T細胞刺激、增加針對豬流感A病毒之B細胞刺激及減少肺中之促發炎性細胞介素(例如IL1β)或其組合。 在本發明之一態樣中，治療或預防使得與相同種之非治療對照組之產食動物相比病毒負荷期縮短。 較佳地，與隨後由特定豬流感A病毒感染之相同種之未治療對照組之產食動物相比，治療或預防使得將病毒負荷期縮短至少50%、甚至更佳地至少60%、仍更佳地至少70%、甚至更佳地至少80%、甚至更佳地至少90%、仍更佳地至少95%、最佳地100%。 較佳地，與相同種之非免疫化對照組之產食動物相比，治療或預防使得自使用豬流感A病毒攻毒或感染之後第5天、更佳地自攻毒或感染之後第4天、更佳地自攻毒或感染之後第3天及最佳地自攻毒或感染之後第1或2天豬流感A病毒之脫落有所減小。 在本發明之一態樣中，治療或預防使得自攻毒(感染)之後第1天流感A之脫落有所減小。 在本發明之一態樣中，免疫原性組合物或DIVA疫苗保護抵抗流感A病毒之同源及/或異源性攻毒。 在本發明之一態樣中，免疫原性組合物或DIVA疫苗抵抗血清型H1及/或H3之流感A病毒之攻毒。 本發明亦係關於用於治療應用之如本文所闡述之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗。 本發明亦係關於用作免疫原或疫苗之如本文所闡述之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗。 本發明亦係關於用作藥劑之如本文所闡述之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗。 本發明亦係關於如本文所闡述之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗之用途，其用於製造藥劑。 本發明亦係關於如本文所闡述之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗之用途，其用於治療及/或預防產食動物之豬流感A病毒感染。 DIVA 有效DIVA疫苗之主要優點在於，其容許在接種疫苗之動物群體中獲取試樣之前檢測急性感染或感染一定時間(至少約3週)之產食動物(較佳地豬)，且由此可監測病原體(較佳地豬流感病毒)在動物群體中之傳播或再引入。因此，可以一定可信程度聲明，基於實驗室測試結果，接種疫苗之豬群體不含豬流感A病毒。 標記物疫苗促進快速且有效地投與且容許區別感染野生病毒(疾病相關)之動物與接種疫苗之動物。 本發明之免疫原性組合物或DIVA疫苗不包括任一編碼N (神經胺酸酶)流感抗原編碼序列及/或NP (核蛋白)流感抗原編碼序列之抗原編碼序列。 與之相比，在使用野生型豬流感A病毒感染動物或使用改質活疫苗接種疫苗或使用失活全病毒疫苗接種疫苗之後或對於具有殘餘母源抗體之動物，經感染/接種疫苗之動物產生/具有針對N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)之特異性抗體。然而，在使用本發明之免疫原性組合物接種疫苗之動物中，不能檢測針對N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)之該等特異性抗體。 藉由實例性免疫測試及/或基因體分析測試，可區分僅使用本發明之免疫原性組合物接種疫苗之動物與使用野生型豬流感病毒感染或使用改質活疫苗接種疫苗或使用失活全病毒疫苗接種疫苗之動物或具有殘餘母源抗體之動物，其中僅使用本發明之免疫原性組合物接種疫苗之動物不具有任何針對N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)及任一分別編碼 N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)之豬流感A病毒特異性序列之特異性抗體。 本發明提供區分感染豬流感A病毒之產食動物與使用如本文所闡述之免疫原性組合物或DIVA疫苗接種疫苗之產食動物之方法，其包括 a) 自產食動物獲得試樣，及 b) 在免疫測試及/或基因體分析測試中分析該試樣。 在本發明之一態樣中，免疫測試包括測試試樣是否包括特異性識別豬流感之N (神經胺酸酶)蛋白或NP (核蛋白)蛋白之抗體。 在本發明之一態樣中，若已檢測出抗體特異性識別豬流感之N (神經胺酸酶)蛋白或NP (核蛋白)蛋白，則產食動物感染豬流感A病毒。 在本發明之一態樣中，基因體分析測試包括測試試樣是否包括編碼N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)之豬流感A病毒特異性序列。 在本發明之一態樣中，若已檢測出編碼N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)之豬流感A病毒特異性序列，則產食動物感染豬流感A病毒。 在本發明之一態樣中，免疫測試係EIA (酶免疫分析)或ELISA (酶聯免疫吸附分析)，或其中基因體分析測試係PCR (聚合酶鏈反應)、RT-PCR (逆轉錄酶聚合酶鏈反應)或實時PCR (聚合酶鏈反應)。 在本發明之一態樣中，產食動物係豬。 在本發明之一態樣中，試樣係血清試樣。 較佳地，使用野生型SIAV之N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)之特異性抗體來檢測來自懷疑感染SIAV或使用本發明疫苗接種疫苗之豬中呼吸道切片中的SIAV抗原。在此一情形下，僅經感染豬或使用改質活疫苗接種疫苗或使用失活全病毒疫苗接種疫苗或具有殘餘母源抗體者之試樣展示關於該N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)特異性抗體之陽性結果。與之相比，使用本發明疫苗接種疫苗之豬之試樣並不展示關於該N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)特異性抗體之結果，此乃因在本發明疫苗中不存在該等抗原(僅血球凝集素)。 然而，N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)之表位在進化中保守且對於SIAV及中和抗體之靶具有特異性。 因此，測試可(例如)包括含有交聯至微孔分析板之野生型SIAV之N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)表位之孔。該交聯較佳地係經由錨蛋白(例如聚-L-離胺酸)來實施。熟習此項技術者熟知用於獲得野生型N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)表位之表現系統。或者，該等N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)表位可以化學方式合成。 僅使用本發明疫苗接種疫苗之動物尚未產生針對野生型N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)表位之抗體。然而，該等動物已產生針對本發明之HA (血球凝集素)表位之抗體。因此，並無抗體結合至經野生型N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)表位塗覆之孔。與之相比，若孔經本發明HA表位塗覆，則抗體結合至該經取代HA表位。 在本發明之一態樣中，ELISA係間接ELISA、夾心式ELISA、競爭性ELISA或阻斷性ELISA。 然而，熟習此項技術者熟知不同ELISA技術。ELlSA已由以下文獻實例性闡述：Wensvoort G.等人，1988 (Vet. Microbiol. 17(2): 129-140)、Robiolo B.等人，2010 (J. Virol. Methods. 166(1 -2): 21-27)及Colijn, E.O.等人，1997 (Vet. Microbiology 59: 15-25)。 較佳地，藉由以下方式來提供用於區分感染野生SIAV或使用改質活疫苗接種疫苗或使用失活全病毒疫苗接種疫苗之動物或具有殘餘母源抗體者及僅使用本發明疫苗接種疫苗者之測試：RNA分離呼吸細胞及逆轉錄酶，隨後擴增cDNA。使用N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)之特定引子，可實施PCR。在此一情形下，若存在陽性PCR信號，則豬感染野生型SIAV。然而，若不可擴增N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)特異性序列，則動物已使用本發明疫苗接種疫苗。 另外，可使用實時性技術引子及/或探針來識別N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)及/或特定HA (血球凝集素)。然而，該等方法在業內已眾所周知。 在本發明之另一態樣中，基因體分析測試係PCR (聚合酶鏈反應)、RT-PCR (逆轉錄酶聚合酶鏈反應)或實時PCR (聚合酶鏈反應)。
定義
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與歸檔時熟習本發明所屬技術領域者通常所理解含義相同之含義。術語之含義及範圍應較為明確；然而，倘若存在任何潛在歧義，則本文所提供之定義優先於任一字典或非固有定義。另外，除非上下文另外需要，否則單數術語包含複數形式且複數術語包含單數。在本文中，除非另外陳述，否則使用「或」意指「及/或」。另外，術語「包含(including)」以及其他形式(例如「包含(includes)」及「包含(included)」)之使用不具有限制性。本文所提及之所有專利及公開案皆以引用方式併入本文中。 除非另外指示，否則本發明實踐將採用熟習此項技術者熟知之病毒學、分子生物學、微生物學、重組DNA技術、蛋白質化學及免疫學之習用技術。該等技術全面闡釋於文獻中。例如參見Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第I、II及III卷，第二版(1989)；DNA Cloning，第I及II卷(D. N. Glover編輯，1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編輯，1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins編輯，1984)；Animal Cell Culture (R. K. Freshney編輯，1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986)；Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；the series, Methods In Enzymology (S. Colowick及N. Kaplan編輯，Academic Press, Inc.)；Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris及S. Angal編輯，IRL Press at Oxford University Press)；及Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷(D. M. Weir及C. C. Blackwell編輯，1986, Blackwell Scientific Publications)。 在詳細闡述本發明之前，應理解，本發明並不限於特定DNA、多肽序列或製程參數，此乃因該等因素當然可有所變化。亦應理解，本文所用之術語僅係出於闡述本發明之特定實施例之目的，而並非意欲為限制性。必須指出，除非內容另外明確說明，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一(a、an)」及「該(the)」皆包含複數個指示物。因此，舉例而言，所提及「抗原」包含兩種或更多種抗原之混合物，所提及「賦形劑」包含兩種或更多種賦形劑之混合物，及諸如此類。
分子生物學定義
業內已知之術語「載體」係指用於將基因材料傳遞至宿主細胞之多核苷酸構築體、通常質體或細菌人工染色體。載體可為(例如)細菌、病毒、噬菌體、細菌人工染色體、黏粒或質體。本文所用之載體可由DNA或RNA構成或含有DNA或RNA。在一些實施例中，載體係由DNA構成。在一些實施例中，載體係感染性病毒。此一病毒載體含有病毒基因體，該病毒基因體以以下方式處理：其攜載外來基因，該外來基因在細胞培養或宿主動物中在該病毒載體之複製中皆無作用。根據本發明之具體態樣，載體可用於各種態樣，例如僅傳遞基因材料、用於轉染宿主細胞或生物體、用作疫苗(例如DNA疫苗)或用於基因表現目的。基因表現係闡述蛋白質在細胞中之生物合成(如由稱為基因之特定多核苷酸序列所引導)之術語。在一具體態樣中，載體可為「表現載體」，其係在存在於適當環境中時能夠引導表現由藉由載體攜載之一或多種基因編碼之蛋白質之載體。 載體及製備載體及/或使用載體(或重組體)進行表現之方法可尤其由以下文獻揭示或類似於以下文獻中所揭示之方法：美國專利第4,603,112號、第4,769,330號、第5,174,993號、第5,505,941號、第5,338,683號、第5,494,807號、第4,722,848號、第5,942,235號、第5,364,773號、第5,762,938號、第5,770,212號、第5,942,235號、第382,425號、PCT公開案WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti, 「Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, 」PNAS USA 93: 11349-11353，1996年10月；Moss, 「Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety,」 PNAS USA 93: 11341-11348，1996年10月；Smith等人，美國專利第4,745,051號(重組桿狀病毒)；Richardson, C. D. (編者), Methods in Molecular Biology 39, 「Baculovirus Expression Protocols」 (1995 Humana Press Inc.)；Smith等人，「Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector」, Molecular and Cellular Biology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165頁；Pennock等人，「Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector」, Molecular and Cellular Biology March 1984，第4卷，第3期，第406頁；EPA0 370 573；1986年10月16日提出申請之美國申請案第920,197號；歐洲專利公開案第265785號；美國專利第4,769,331號(重組疱疹病毒)；Roizman, 「The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors,」 PNAS USA 93:11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，「The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,」 PNAS USA 93: 11313-11318，1996年10月；Robertson等人，「Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes」, PNAS USA 93: 11334-11340，1996年10月；Frolov等人，「Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications,」 PNAS USA 93: 11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；美國專利第5,591,439號、第5,552,143號；WO 98/00166；1996年7月3日提出申請之允許美國申請案第08/675,556號及第08/675,566號(重組腺病毒)；Grunhaus等人，1992, 「Adenovirus as cloning vectors,」 Seminars in Virology (第3卷)，第237-52頁，1993；Ballay等人，EMBO Journal，第4卷，第3861-65頁，Graham, Tibtech 8, 85-87，1990年4月；Prevec等人，J. Gen Virol. 70, 42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；及McClements等人，「Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease」, PNAS USA 93: 11414-11420，1996年10月；及美國專利第5,591,639號、第5,589,466號及第5,580,859號以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人，Nature及Furth等人，Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors。亦參見WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (慢病毒表現系統)；Sanford等人，美國專利第4,945,050號；Fischbachet等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人，Seminars in Immunology，第9卷，第271-283頁(1997), (DNA載體系統)；Szoka等人，該專利第4,394,448號(將DNA插入活細胞中之方法)；McCormick等人，美國專利第5,677,178號(致細胞病變病毒之使用)；及美國專利第5,928,913號(用於基因遞送之載體)；以及本文所引用之其他文件。 術語「病毒載體」闡述藉由重組DNA技術以其進入宿主細胞中會產生特定生物活性(例如表現由載體攜載之轉基因)之方式處理之基因修飾病毒。在一具體態樣中，轉基因係抗原。病毒載體可或可不在靶細胞、組織或生物體中為複製競爭性。 可使用業內熟知之任何適宜基因改造技術來生成病毒載體，包含(但不限於)細胞培養液中之限制性內核酸酶消解、連接、轉變、質體純化、DNA測序、轉染之標準技術，例如如Sambrook等人(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989))或K.Maramorosch及H. Koprowski (Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK (2014))中所闡述。 病毒載體可納入來自任一已知生物體之基因體之序列。該等序列可以其天然形式納入或可以任一方式進行改質以獲得期望活性。舉例而言，該等序列可包括插入、缺失或取代。 病毒載體可包含用於所關注兩種或更多種蛋白質之編碼區。舉例而言，病毒載體可包含用於第一關注蛋白之編碼區及用於第二關注蛋白之編碼區。第一關注蛋白及第二關注蛋白可相同或不同。在一些實施例中，病毒載體可包含用於所關注第三蛋白或第四蛋白之編碼區。所關注第三蛋白及第四蛋白可相同或不同。由一種病毒載體編碼之所關注兩種或更多種蛋白質之總長度可有所變化。舉例而言，兩種或更多種蛋白質之總長度可為至少約200個胺基酸。至少約250個胺基酸、至少約300個胺基酸、至少約350個胺基酸、至少約400個胺基酸、至少約450個胺基酸、至少約500個胺基酸、至少約550個胺基酸、至少約600個胺基酸、至少約650個胺基酸、至少約700個胺基酸、至少約750個胺基酸、至少約800個胺基酸或更長。 較佳病毒載體包含疱疹病毒載體，例如衍生自EHV-1或EHV-4者。 根據本發明之具體態樣，術語「病毒載體」或替代地「病毒構築體」係指衍生自病毒(其係選自疱疹病毒科之家族，例如EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9)之重組病毒構築體。較佳病毒載體包含(例如)衍生自EHV-1或EHV-4之疱疹病毒載體。 術語「病毒載體」及「病毒構築體」可互換使用。 本文所用之術語「構築體」係指重組核酸(例如質體、BAC)或人工生成之重組病毒。 術語「質體」係指獨立於細菌宿主細胞內之細菌染色體複製之細胞質DNA。在本發明之一具體態樣中，術語「質體」及/或「轉移質體」係指可用於構築(例如)用於插入病毒載體中之表現盒之重組DNA技術之元件。在另一具體態樣中，術語「質體」可用於指示可用於DNA接種疫苗目的之質體。 如本文中所使用，術語「核酸」及「多核苷酸」可互換使用且係指任一核酸。 本文所用之術語「核酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」、「多核苷酸」、「多核苷酸序列」、「RNA序列」、cDNA序列或「DNA序列」係指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段及部分且係指基因體或合成起源之DNA或RNA，其可為單鏈或雙鏈且代表有義或反義鏈。序列可為非編碼序列、編碼序列或二者之混合物。本發明核酸序列可使用熟習此項技術者熟知之標準技術製得。 術語「核酸」及「多核苷酸」亦特定而言包含由除5個生物鹼基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)外之鹼基構成之核酸。 術語「調節核酸」、「調節元件」及「表現控制元件」可互換使用且係指可影響可操作地連接之編碼序列在特定宿主生物體中之表現之核酸分子。該等術語可廣泛使用且涵蓋促進或調節轉錄之所有元件，包含啟動子、啟動子序列、RNA聚合酶與轉錄因子之鹼性相互作用之核心元件、上游元件、增強子及反應元件。原核生物中之實例性調節元件包含啟動子、處理子序列及核糖體結合位點。用於真核細胞中之調節元件可包含(但不限於)提供及/或調節宿主細胞中編碼序列之表現及/或編碼多肽之產生的轉錄及轉譯控制序列，例如啟動子、增強子、剪接信號、多腺苷酸化信號、終止子、蛋白質降解信號、內核糖體進入位點(IRES)、小核糧核酸病毒2A序列及諸如此類。 「內核糖體進入位點」或「IRES」闡述在功能上促進獨立於IRES之基因5´進行轉譯起始且容許兩個順反子(開放閱讀框)自單一轉錄物轉譯至動物細胞中之序列。IRES提供用於轉譯緊接其下游之開放閱讀框之獨立核糖體進入位點。不同於可為多順反子(亦即編碼若干自mRNA依序轉譯之不同多肽)之細菌mRNA，動物細胞之大部分mRNA係單順反子且編碼僅一種多肽之合成。在真核細胞中使用多順反子轉錄物，自5´最開始轉譯起始位點開始轉譯，並終止於第一終止密碼子，且自核糖體釋放轉錄物，從而使得僅轉譯mRNA中之第一編碼多肽。在真核細胞中，具有可操作地連接至轉錄物中之第二或後續開放閱讀框之IRES之多順反子轉錄物容許依序轉譯該下游開放閱讀框以產生由相同轉錄物編碼的兩種或更多種多肽。IRES可具有不同長度且來自各種來源(例如腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus) (EMCV)、小核糖核酸病毒(例如口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus) (FMDV)或小兒麻痹病毒(Polio virus) (PV)或C型肝炎病毒(HCV))。已闡述各種IRES序列及其在載體構築中之用途且在業內已眾所周知。下游編碼序列以任一並不不利地影響下游基因之表現之距離可操作地連接至IRES之3´端。可易於藉由改變距離且量測隨距離而變化之表現來測定IRES與下游基因之起始點之間之最佳或允許距離。 術語「2a」或「2a肽」意指闡述為2a及「2a樣」之短寡肽序列，其用作能夠藉由定義為核糖體跳躍之過程來調介蛋白質之間之共轉譯裂解的連接體。可使用該等2a及「2a樣」序列(來自小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)及其他病毒或細胞序列)來將多個基因序列串聯成單一基因，從而確保其共表現於相同細胞內(參見Luke及Ryan, 2013)。 如本文中所使用，術語「啟動子」或「啟動子序列」意指允許結合RNA聚合酶且引導轉錄基因之核苷酸序列。通常，啟動子位於基因中鄰近基因之轉錄開始位點之5'非編碼區中。啟動子內用於引發轉錄之序列元件之特徵通常在於共有核苷酸序列。啟動子之實例包含(但不限於)來自細菌、酵母、植物、病毒及動物(例如哺乳動物(包含馬、豬、牛及人類)、鳥或昆蟲)之啟動子。啟動子可為可誘導、可抑制及/或組成型啟動子。可誘導啟動子引發在其控制下因應於培養條件之一定變化(例如溫度變化)增加來自DNA之轉錄程度(Ptashne, 2014)。熟習此項技術者熟知之啟動子之實例係(例如) SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人類延長因子α啟動子、桿狀病毒多角體蛋白啟動子。 如本發明之上下文中所使用，術語啟動子尤其係指功能片段(例如4pgG600 (SEQ ID NO:1)之截短物或其互補核苷酸序列)，較佳地，序列一致性為整個長度之(至少) 72% (或更高)。另外，如本發明之上下文中所使用，術語啟動子尤其係指功能片段(例如4pMCP600 (SEQ ID NO:2)之截短物或其互補核苷酸序列)，較佳地，序列一致性為整個長度之(至少) 78% (或更高)。最佳地，「啟動子」係指p430 (SEQ ID NO:3)或p455 (SEQ ID NO: 4)。術語「p430」、「gG 430」及「430」遍及說明書、圖、序列表等同義且互換使用。術語「p455」、「MCP 455」及「455」遍及說明書、圖、序列表等同義且互換使用。 術語「增強子」表示在順位作用於啟動子之活性且由此刺激轉錄在功能上連結至此啟動子之基因或編碼序列之多核苷酸序列。不同於啟動子，增強子之效應與位置及定向無關且其可由此定位於轉錄單元之前面或後面、內含子內或甚至編碼區內。增強子可位於緊鄰轉錄單元處及距啟動子較大距離。其亦可與啟動子具有物理及功能重疊。熟習此項技術者將知曉諸多來自各種來源之增強子(且寄存於資料庫(例如基因庫)中，例如SV40增強子、CMV增強子、多瘤增強子、腺病毒增強子)，該等增強子可用作獨立元件或選殖於多核苷酸序列內之元件(例如沈積於ATCC或來自商業及個別來源)。諸多啟動子序列亦含有增強子序列，例如常用CMV啟動子。人類CMV增強子係迄今所鑑別之最強增強子之一。可誘導增強子之一種實例係金屬硫蛋白增強子，其可由糖皮質激素或重金屬刺激。 術語「互補核苷酸序列」闡述多核苷酸(例如DNA或RNA)之兩條配對鏈之一條鏈。互補鏈之核苷酸序列映現其配對鏈之核苷酸序列，從而對於每一腺苷而言其含有胸腺嘧啶(或對於RNA而言含有尿嘧啶)，對於每一鳥嘌呤而言其含有胞嘧啶，且反之亦然。舉例而言，5’-GCATAC-3’之互補核苷酸序列係3’-CGTATG-5’或對於RNA而言係3’-CGUAUG-5’。 本文所用之術語「基因」、「所關注基因」具有相同含義且係指編碼所關注產物之任一長度之多核苷酸序列。基因可進一步包括位於編碼序列之前(5´非編碼或未轉譯序列)及之後(3´非編碼或未轉譯序列)之調節序列。所選序列可為全長或截短、融合或加標籤基因，且可為cDNA、基因體DNA或DNA片段。通常應理解，編碼多肽或RNA之基因體DNA可包含自成熟信使RNA (mRNA)剪接且由此不存在於編碼相同多肽或RNA之cDNA中之非編碼區(亦即內含子)。其可為天然序列、亦即天然形式，或可經突變，或包括衍生自不同來源之序列或另外視需要經修飾。該等修飾包含密碼子最佳化以最佳化在所選宿主細胞中之密碼子使用或最佳化加標籤。另外，其可包含去除或添加順式作用位點(例如(隱性)剪接供體、受體位點及分支點、多腺苷酸化信號、TATA-盒、chi位點、核糖體進入位點、重複序列、二級結構(例如莖環)、用於轉錄因子或其他調節因子之結合位點、限制酶位點等)以得到僅少數(但不限於)實例。所選序列可編碼分泌、細胞質、細胞核、膜結合或細胞表面多肽。 本文所用之術語「所關注核苷酸序列」係較所關注基因更一般之術語，此乃因其未必包括基因，但可包括基因之要素或部分或其他基因資訊(例如
ori
(複製起點))。所關注核苷酸序列可為任一DNA或RNA序列，不論其是否包括編碼序列。 「開放閱讀框」或「ORF」係指核酸序列(DNA或RNA)中包括轉譯起始信號或起始密碼子(例如ATG或AUG)及終止密碼子且可潛在轉譯成多肽序列之長度。 術語「轉錄」闡述mRNA在細胞中之生物合成。 本文所用之術語「表現」係指在宿主細胞內轉錄及/或轉譯核酸序列。根據本發明之具體態樣，術語「表現」係指在宿主細胞內轉錄及/或轉譯異源性及/或外源性核酸序列。可基於存在於細胞中之相應RNA或mRNA之量或由所選序列所編碼期望多肽之量來測定期望產物在宿主細胞中的表現程度。舉例而言，可藉由北方印漬雜交、核糖核酸酶RNA保護、原位雜交至細胞RNA或藉由RTqPCR (逆轉錄且隨後定量PCR)來量化自所選序列轉錄之mRNA。可藉由各種方法來量化自所選序列表現之蛋白質，例如藉由ELISA、藉由西方印漬、藉由放射免疫分析、藉由免疫沈澱、藉由分析蛋白質之生物活性或藉由免疫染色蛋白質且隨後進行FACS分析。 術語「表現盒」或「轉錄單元」或「表現單元」定義載體、構築體或多核苷酸序列內含有一或多種擬轉錄基因之區域，其中含於表現盒內之編碼轉錄基因之核苷酸序列以及含有調節元件之多核苷酸序列彼此可操作地連接。其係自啟動子轉錄且藉由至少一個多腺苷酸化信號終止轉錄。在一個特定態樣中，其係自單一啟動子轉錄。因此，不同基因至少以轉錄方式連接。一種以上蛋白質或產物可自各轉錄單元(多順反子轉錄單元)轉錄及表現。各轉錄單元包括對於轉錄及轉譯含於該單元內之任一所選序列所需之調節元件。而且，各轉錄單元可含有相同或不同之調節元件。舉例而言，各轉錄單元可含有相同終止子，IRES元件或內含子可用於轉錄單元內基因之功能連接。載體或多核苷酸序列可含有一個以上之轉錄單元。 術語「增加之表現」、「增加之效價或生產力」或「改良之表現或生產力」意指與適宜對照相比(例如由cDNA編碼之蛋白質相對於由含內含子基因編碼之蛋白質)，引入宿主細胞中之異源性及/或外源性序列(例如編碼治療蛋白之基因)之表現、合成或分泌增加。若根據本文所闡述之本發明方法培養本發明細胞，且若此細胞之比生產力或效價增加至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍，則有增加之效價或生產力。若根據本文所闡述之本發明方法培養本發明細胞，且若此細胞之比生產力或效價增加至少1.2倍或至少1.5倍或至少2倍或至少3倍，則亦有增加之效價或生產力。若根據本文所闡述之本發明方法培養本發明細胞，且若此細胞之比生產力或效價增加至少1.2倍至5倍、較佳地1.5倍至5倍、更佳地2倍至5倍、尤佳地3倍至5倍，則亦尤其有增加之效價或生產力。「增加之表現」亦可意指更多細胞實際上表現所關注之基因/序列。舉例而言，增加之表現可意指本發明之新穎啟動子在病毒複製週期期間相對於其他啟動子有活性較長時間段。 可藉由使用本發明之異源性載體來獲得增加之表現、效價或生產力。此可與其他方式加以組合，例如FACS輔助性選擇含有一或多種螢光蛋白(例如GFP)或細胞表面標記物作為其他可選標記物之重組宿主細胞。亦可使用獲得增加之表現之其他方法及不同方法之組合，該等方法係(例如)基於以下方式：使用用於處理染色質結構之順式活性元件(例如LCR、UCOE、EASE、分離子、S/MAR、STAR元件)、使用(人工)轉錄因子、使用用於上調內源性或異源性及/或外源性基因表現之天然或合成藥劑處理細胞、改良mRNA或蛋白質之穩定性(半衰期)、改良mRNA轉譯之起始、藉由使用游離型質體來增加基因劑量(基於使用病毒序列作為複製起點，例如SV40、多瘤、腺病毒、EBV或BPV)、使用促進擴增之序列或基於DNA多聯體之活體外擴增系統。 量測「增加之表現」之分析係基於LC-MS/MS之蛋白質量測，例如多反應監測(MRM)；基於抗體之檢測方法，例如西方印漬、點印漬或免疫擴散及流式細胞術；及藉由血球凝集分析量測生物活性。 藉由量化mRNA轉錄在各別啟動子控制下來間接量測「啟動子活性」。藉由RTqPCR相對於內源性標準來量化mRNA。 熟習此項技術者已熟知術語「病毒負荷」。術語病毒負荷在本文中可與術語病毒效價互換使用。病毒負荷或病毒效價係活動性病毒感染之嚴重程度之量度，且可藉由熟習此項技術者已知之方法來測定。該測定可基於(例如)藉由至病毒蛋白之抗體結合來檢測病毒蛋白及另外或或者藉由擴增方法(例如RT-PCR)來檢測病毒核酸。藉由核酸擴增方法監測血漿中之病毒體相關性病毒RNA係廣泛用於評價逆轉錄病毒疾病之狀態及進展及評估預防性及治療性干預之有效性之參數。可藉由估計所涉及體液中之活病毒量(例如RNA拷貝數/毫升血樣血漿)來計算實例性病毒負荷或病毒效價。較佳地，術語「病毒負荷」或「病毒效價」係每體積病毒製劑之感染性單元之量度。病毒效價係生物程序中之終點且定義為平行實施之某一比例測試展示效應之稀釋度(Reed及Muench, 1938)。具體而言，組織培養感染劑量50/毫升(TCID50/ml)給出病毒製劑之如下稀釋度：以該稀釋度平行接種之諸多細胞培養液中之50%發生感染。 「轉錄調節元件」通常包括擬表現基因序列上游之啟動子、轉錄起始及終止位點及多腺苷酸化信號。 術語「轉錄起始位點」係指構築體中對應於納入一級轉錄物(亦即mRNA前體)中之第一核酸之核酸。轉錄起始位點可與啟動子序列重疊。 「終止信號」或「終止子」或「多腺苷酸化信號」或「聚A」或「轉錄終止位點」或「轉錄終止元件」係如下信號序列：其在真核mRNA之3'端之特定位點處引起裂解且在經裂解3'端轉錄後納入約100 - 200個腺嘌呤核苷酸之序列(polyA尾部)，且由此使得RNA聚合酶終止轉錄。多腺苷酸化信號包括裂解位點上游之約10-30個核苷酸之序列AATAAA及位於下游之序列。已知各種多腺苷酸化元件，例如tk聚A、SV40晚期及早期聚A、BGH聚A (例如闡述於美國專利第5,122,458號中)或倉鼠生長激素聚A (WO2010010107)。 「轉譯調節元件」包括用於每一擬表現個別多肽之轉譯起始位點(AUG)、終止密碼子及聚A信號。內核糖體進入位點(IRES)可包含於一些構築體中。為最佳化表現，可設計去除、添加或改變擬表現核酸序列之5'-及/或3'-未轉譯區以消除任何潛在額外不適當替代轉譯起始密碼子或其他可在轉錄或轉譯層面上干擾或減小表現之序列。可將共有核糖體結合位點(Kozak序列)插入緊鄰起始密碼子之上游處以增強轉譯且由此增強表現。增加此核糖體結合位點周圍之A/U含量可增進更有效之核糖體結合。 根據定義，在來自不同(病毒)物種時，插入宿主細胞中之每一多核苷酸序列或每一基因及由此編碼之各別蛋白質或RNA關於宿主細胞稱為「外源性」、「外源性序列」、「外源性基因」、「外源性編碼序列」、「外源性抗原編碼序列」。因此，本發明之基於EHV-4之啟動子就EHV-1病毒載體而言係外源性。如本文針對所關注序列或基因(例如抗原)所使用，術語「外源性」或「外源性抗原編碼序列」意指，該所關注序列或基因、具體而言該抗原表現於其天然物種背景之外。因此，來自豬IAV之H3抗原係關於EHV-1載體之外源性抗原之一個實例。所關注任一非馬科動物序列或基因(例如非馬科動物抗原)由此係所關注外源性序列或基因或根據本發明之一具體態樣之抗原。 根據定義，插入宿主細胞中之每一多核苷酸序列或每一基因及由此編碼之各別蛋白質或RNA關於宿主細胞稱為「異源性」、「異源性序列」、「異源性基因」、「異源性編碼序列」、「轉基因」或「異源性蛋白」。即使擬引入序列或擬引入基因與宿主細胞之內源性序列或內源性基因一致，此定義亦適用。舉例而言，根據定義，在不同位點引入EHV-4病毒載體中或相對於EHV-4野生型病毒中呈經修飾形式之EHV-4啟動子序列係異源性序列。如本文針對所關注序列或基因(例如抗原)所使用，術語「異源性」意指，該所關注序列或基因、具體而言該抗原表現於其天然亞物種背景之外。因此，所關注任一非EHV-1特異性序列或基因(例如抗原，例如來自任一馬科動物α疱疹病毒之除EHV-1外之抗原，例如EHV-3、EHV-8)由此係所關注異源性序列或基因或根據本發明之一具體態樣之抗原。 術語「非天然」意指並不天然出現於此背景中之任一所關注序列或基因(例如抗原)，例如來自不同物種之混合序列或所關注序列或基因(例如抗原)或因人工突變、插入、缺失或諸如此類而並非天然產物之所關注序列或基因(例如抗原)。 在本發明之整個說明書中，術語「重組」可與術語「非天然」、「異源性」及「外源性」互換使用。因此，「重組」蛋白係自異源性或外源性多核苷酸序列表現之蛋白質。如針對病毒所用之術語重組意指藉由人工處理病毒基因體產生之病毒。包括異源性或外源性序列(例如外源性抗原編碼序列)之病毒係重組病毒。術語重組病毒及術語非天然病毒可互換使用。 因此，術語「異源性載體」意指包括異源性或外源性多核苷酸序列之載體。術語「重組載體」意指包括異源性或重組多核苷酸序列之載體。 如本文中所使用，術語「可操作地連接」用於闡述調節元件與基因或其編碼區之間之連結。通常，基因表現係在一或多種調節元件(例如(但不限於)組成型或可誘導啟動子、組織特異性調節元件及增強子)之控制下進行。基因或編碼區可視為與調節元件「可操作地連接」或「可操作地連接」或「可操作地締合」，此意味著該基因或編碼區由調節元件控制或影響。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列。 另外，在本說明範圍內，術語「功能連接」、「在功能上連接」或「可操作地連接」意指，兩個或更多個核酸序列或序列元件以允許其以其預期方式發揮作用之方式進行定位。舉例而言，若啟動子/增強子或終止子能夠控制或調節所連接基因序列在順位之轉錄，則其在功能上連接至編碼基因序列。通常但未必，在功能上連接之DNA序列係鄰接的且在需要時接合兩個多肽編碼區或在分泌信號肽之情形下鄰接且位於閱讀框中。然而，儘管可操作地連接之啟動子通常位於編碼序列之上游或可操作地連接之終止子通常位於編碼序列之下游，但其未必鄰接。增強子並不必須鄰接，只要其增加編碼序列之轉錄即可。為此，其可位於編碼序列之上游或下游且甚至相距一定距離。若多腺苷酸化位點以經由編碼序列轉錄至多腺苷酸化信號中之方式位於編碼序列之3´端，則其可操作地連接至編碼序列。藉由業內已知之重組方法來達成連接，例如藉由在適宜限制位點處或鈍端連接或藉由使用融合PCR方法。若不存在適宜限制位點，則可根據習用實踐使用合成寡核苷酸連接體或適配體。 因此，術語啟動子序列之「功能片段或衍生物」意指，片段或衍生物仍實現啟動子活性。熟習此項技術者熟知如何評價啟動子活性之功能分析(Bustin 2000, Nolan等人，2006)。此一功能分析之一實例性實施例包含(例如)啟動子動力學實驗。將感染攜載表現盒(其中啟動子或其片段引導轉錄報告基因轉基因)之載體病毒之細胞培育不同時間。自在感染之後於不同時間收集之試樣製備總RNA。在藉由DNAse I消解破壞污染DNA之後，RNA發生逆轉錄。在添加逆轉錄酶(RT)下處理一種複製試樣，在不添加RT下處理第二複製物以證實污染DNA自RNA製劑之成功去除。純化所得cDNA且用作習用PCR中之模板。僅在添加RT下處理之試樣應產生PCR產物。然後可將該等cDNA用於使用報告基因轉基因之引子之qPCR及使用病毒載體之必需基因(內部標準基因，其轉錄提供感染及複製之效率之內部標準)之引子之平行qPCR。使用內部標準基因之qPCR值正規化不同構築體與感染後時間之間之報告基因之qPCR值。此容許詮釋不同啟動子及其片段之啟動子活性。 本文所用之「序列同源性」係指測定兩個序列之相關性之方法。為測定序列同源性，最佳地比對兩個或更多個序列，且視需要引入空位。然而，與「序列一致性」不同，在測定序列同源性時，保守胺基酸取代可視為匹配。換言之，為獲得與參考序列具有95%序列同源性之多肽或多核苷酸，參考序列中之85%、較佳地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%、99.9%之胺基酸殘基或核苷酸必須匹配或包括另一胺基酸或核苷酸之保守取代，或可將佔參考序列中之總胺基酸殘基或核苷酸(不包含保守取代)之最高15%、較佳地最高10%、9%、8%、7%、6%、甚至更佳地最高5%、4%、3%、2%、1%、0.1%之數量的胺基酸或核苷酸插入參考序列中。較佳地，同系物序列包括至少50、甚至更佳地100、甚至更佳地250、甚至更佳地500個核苷酸之延伸體。 業內已知之「序列一致性」係指兩個或更多個多肽序列或兩個或更多個多核苷酸序列、亦即參考序列與擬與參考序列進行比較之給定序列之間之關係。藉由在將序列最佳地比對以產生最高序列相似性程度之後比較給定序列與參考序列來測定序列一致性，如藉由該等序列串之間之匹配所測定。在該比對時，基於逐個位置來確定序列一致性，舉例而言，若在一個位置處核苷酸或胺基酸殘基一致，則該等序列在該位置處「一致」。然後將該等位置一致性之總數除以參考序列中之核苷酸或殘基之總數以得到序列一致性%。序列一致性可易於藉由已知方法來計算，包含(但不限於)闡述於以下文獻中之方法：Computational Molecular Biology, Lesk, A. N.編輯，Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編輯，Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.及Griffin, H. G.編輯，Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編輯，M. Stockton Press, New York (1991)；及Carillo, H.及Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)，其教示內容以引用方式併入本文中。設計用於測定序列一致性之較佳方法以得到所測試序列之間之最大匹配。將測定序列一致性之方法編成測定給定序列間之序列一致性之公開獲得之電腦程式。該等程式之實例包含(但不限於) GCG程式包(Devereux, J.等人，Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA (Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)。BLASTX程式可自NCBI及其他來源公開獲得(BLAST Manual, Altschul, S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)，其教示內容以引用方式併入本文中)。該等程式最佳地使用默認空位權重比對序列以在給定序列與參考序列之間產生最高序列一致性程度。作為闡釋，對於多核苷酸具有與參考核苷酸序列具有至少(例如) 85%、較佳地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%、99.9% 「序列一致性」之核苷酸序列而言，預計給定多核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致，只是給定多核苷酸序列可包含最高15、較佳地最高10、甚至更佳地最高5個點突變/參考核苷酸序列之100個核苷酸。換言之，在具有相對於參考核苷酸序列具有至少85%、較佳地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%、99.9%一致性之核苷酸序列之多核苷酸中，參考序列中最高15%、較佳地10%、9%、8%、7%、6%、甚至更佳地5%、4%、3%、2%、1%、0.1%之核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或參考序列中全部核苷酸中最高15%、較佳地10%、9%、8%、7%、6%、甚至更佳地5%、4%、3%、2%、1%、0.1%數量之核苷酸可插入參考序列中。參考序列之該等突變可發生在參考核苷酸序列之5’或3’末端位置或在彼等末端位置之間之任何位置，其係個別地散佈在參考序列中之各核苷酸之間或在參考序列內呈一或多個鄰接基團形式。類似地，對於多肽具有與參考胺基酸序列具有至少(例如) 85%、較佳地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之給定胺基酸序列而言，預計多肽之給定胺基酸序列與參考序列一致，只是給定多肽序列可包含最高15、較佳地最高10、9、8、7、6、甚至更佳地最高5、4、3、2、1個胺基酸改變/參考胺基酸序列之100個胺基酸。換言之，為獲得與參考胺基酸序列具有至少85%、較佳地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之給定多肽序列，參考序列中最高15%、較佳地最高10%、9%、8%、7%、甚至更佳地最高5%、4%、3%、2%、1%之胺基酸殘基可缺失或經另一胺基酸取代，或可將佔參考序列中之總胺基酸殘基數之最高15%、較佳地最高10%、9%、8%、7%、甚至更佳地最高5%、4%、3%、2%、1%之數量的胺基酸插入參考序列中。參考序列之該等改變可發生在參考胺基酸序列之胺基或羧基末端位置或在彼等末端位置之間之任何位置，其係個別地散佈在參考序列中之各殘基之間或在參考序列內呈一或多個鄰接基團形式。較佳地，不同殘基位置因保守胺基酸取代而不同。然而，在測定序列一致性時，並不包含保守取代作為匹配。 術語「序列一致性」或「一致性百分比」可在本文中互換使用。出於本發明目的，在本文中應明確，為測定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之百分比一致性，出於最佳對比目的對比該等序列(舉例而言，可將空位引入第一胺基酸或核酸之序列中以用於與第二胺基或核酸序列進行最佳對比)。然後比較相應胺基酸或核苷酸位置之胺基酸或核苷酸殘基。在第一序列中之位置被與第二序列中之相應位置相同之胺基酸或核苷酸殘基佔據，則該等分子在該位置一致。兩個序列之間之一致性%係該等序列所共用之一致位置數之函數(亦即，一致性% =一致位置數/總位置(亦即重疊位置)數×100)。較佳地，兩個序列具有相同長度。 可在兩個所比較序列之整個長度中或在兩個序列之片段中實施序列對比。通常，在兩個所比較序列之全長中實施對比。然而，可在(例如) 20、50、100或更多個鄰接胺基酸殘基之區域中實施序列一致性測定。 熟習此項技術者應知曉，實際上，可利用若干不同電腦程式來測定兩個序列之間之同源性。舉例而言，兩個序列之間之序列對比及一致性百分比之測定可使用數學算法來達成。在一較佳實施例中，使用Needleman及Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970))算法(其已納入Accelrys GCG軟體包(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/處獲得)中之GAP程式中)、使用Blosum 62矩陣或PAM250矩陣及空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6)來測定兩個胺基酸或核酸序列之間之百分比一致性。熟習此項技術者應瞭解，所有該等不同參數將產生略微不同之結果，但在使用不同算法時兩個序列之整體百分比一致性並不顯著改變。 可進一步使用本發明之蛋白質序列及核酸序列作為「詢問序列」來實施針對公共資料庫之檢索，以例如鑒定其他家族成員或相關序列。可使用Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10之BLASTN及BLASTP程式(2.0版)實施該等檢索。可使用BLASTP程式、評分=50、字長=3實施BLAST蛋白質檢索以獲得本發明之蛋白質分子之同源胺基酸序列。為獲得用於對比目的之空位對比，可如Altschul等人(1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402中所闡述來利用空位BLAST。在利用BLAST及空位BLAST程式時，可使用各別程式(例如BLASTP及BLASTN)之默認參數。參見國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/處之主頁。
EHV-1 及 EHV-4/ 重組載體技術定義
術語「馬科動物」或「馬」或「馬的」意指馬科家族或屬馬科(Equidae)，其包含馬、驢及斑馬、較佳地馬。另外，術語「馬科動物」或「馬」或「馬的」亦涵蓋馬科成員之雜合體(例如騾子、駃騠等)。 「疱疹病毒」或「疱疹病毒載體」係指疱疹病毒目之疱疹病毒科中之物種。 術語「馬科動物疱疹病毒載體」或「馬科動物疱疹病毒」或「EHV」意指影響馬之疱疹病毒科之成員。迄今為止，已經鑑別了八種不同物種之馬科動物疱疹病毒，其中五種屬α疱疹病毒亞科(EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9)且三種屬丙型疱疹病毒亞科。(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015年發佈，EC 47, London, UK，2015年7月；電子郵件批准2016 (MSL 30號)。 術語「EHV-1」意指馬科動物α疱疹病毒1，其係疱疹病毒科之α疱疹病毒亞科屬中之水痘病毒亞屬之成員。EHV-1之非限制性參考序列係(例如)野生型EHV-1株ab4 (基因庫登錄號AY665713.1)或RacH (Hübert 1996)。 術語EHV-4意指馬科動物α疱疹病毒4，其係疱疹病毒科之α疱疹病毒中之水痘病毒亞屬之成員。 術語「兩個或更多個EHV載體」涵蓋2、3、4、5或6個EHV載體。 術語「插入ORF70中」或「ORF70中之插入位點」意指，在編碼馬科動物疱疹病毒1開放閱讀框70之位置將DNA片段插入基因體DNA中。所提及之插入使得缺失ORF70之801個5'鹼基對，從而使得3'端之剩餘423個bp完整，但消除了orf70基因產物醣蛋白G之表現。包含EHV-1之若干α疱疹病毒之醣蛋白G展示可自感染細胞分泌並藉由結合促發炎細胞介素而用作免疫調節蛋白。與具有完整醣蛋白G表現之野生型EHV-1相比，消除其在病毒載體中之表現應增加病毒感染之免疫原性。 術語「插入ORF1/3中」及「ORF1/3中之插入位點」意指，在疫苗株EHV-1 RacH之減毒程序期間藉由傳代意外缺失使包括90% ORF1及整個ORF2之1283 bp片段失去的位置將DNA片段插入病毒基因體中。選擇此插入位點，此乃因自此位置之轉基因之表現可能干擾病毒複製之可能性預計將極低。
疫苗定義
「免疫原性或免疫組合物」係指包括至少一種抗原或其免疫原性部分之物質之組合物，其在宿主中引發細胞或抗體調介之對組合物之免疫反應的免疫學反應。較佳地，免疫原性組合物誘導免疫反應且更佳地賦予抵抗豬IAV感染之一或多種臨床徵象之保護免疫性。亦將宿主闡述為「產食動物」。若宿主顯示保護免疫學反應以便對新感染之抗性得以增強及/或疾病之臨床嚴重程度有所減小，則將免疫原性組合物闡述為「疫苗」。 本文使用之術語「抗原」在業內已眾所周知，且包含具有免疫原性之物質(亦即免疫原)以及誘導免疫學不反應性或無反應性(亦即身體之防禦機制對外來物質無反應)之物質。如本文中所使用，術語「抗原」欲指含有或包括表位之全長蛋白質以及其肽片段。另外，術語「抗原編碼序列」係關於編碼抗原之序列。較佳地，抗原編碼序列係核酸序列，例如cDNA序列。然而，術語「核酸序列」已定義於本文中其他處。 術語「至少一個外源性抗原編碼序列」亦涵蓋一個以上之外源性抗原編碼序列。因此， 必須理解，術語「至少一個外源性抗原編碼序列」涵蓋2、3、4、5或6個外源性抗原編碼序列。因此，術語「至少兩個外源性抗原編碼序列」涵蓋3、4、5或6個外源性抗原編碼序列。 術語「不同外源性抗原編碼序列」係序列彼此不同之序列。 本文所用之「免疫原性組合物」可係指多肽或蛋白質，例如引發如本文所闡述之免疫學反應之病毒表面蛋白。術語「免疫原性片段」或「免疫原性部分」係指蛋白質或多肽之片段或截短及/或取代形式，其包含一或多個表位且由此引發本文所闡述之免疫學反應。一般而言，該等截短及/或取代之形式或片段將包括來自全長蛋白質之至少六個鄰接胺基酸。該等片段可使用任一數量之業內熟知之表位定位技術來鑑別。例如參見Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E. Morris編輯，1996) Humana Press, Totowa, New Jersey。舉例而言，線性表位可藉由在固體載體上同時合成大量肽(該等肽對應於蛋白質分子之部分)且使肽與抗體反應同時肽仍附接至載體來測定。該等技術係業內已知且經闡述的，例如參見美國專利第4,708,871號；Geysen等人(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；及Geysen等人(1986) Molec. Immunol. 23:709-715。類似地，舉例而言，藉由(例如) x射線結晶學及二維核磁共振且藉由測定胺基酸之空間構形來容易地鑑別構形表位。參見Epitope Mapping Protocols (見上文)。該定義內亦包含合成抗原，例如多表位、側接表位及其他重組或合成源抗原。例如參見Bergmann等人(1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781；Bergmann等人(1996), J. Immunol. 157:3242-3249；Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408；及Gardner等人，(1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 1998年6月28日至7月3日。(其教示及內容皆以引用方式併入本文中。) 術語「實施免疫」係關於藉由以下方式達成之主動免疫化：向擬實施免疫之產食動物投與免疫原性組合物，由此引起針對該免疫原性組合物中所包含之抗原之免疫學反應。 本文所用之術語「有需要(in need或of need)」意指，投與/治療涉及加強或改良健康或臨床徵象或對於接受本發明之免疫原性組合物之動物之健康的任一其他陽性醫學效應。 本文所用之術語「疫苗」係指包括至少一種在動物中誘導免疫學反應之免疫活性組分且可能但不一定包括一或多種增強活性組分之免疫學活性之額外組分的醫藥組合物。疫苗可另外包括醫藥組合物之其他典型組分。藉由區別，疫苗之免疫學活性組分可包括呈其原始形式之完整病毒顆粒或所謂經修飾活疫苗(MLV)中之減毒顆粒或藉由適當方法在所謂死疫苗(KV)中不活化之顆粒。在另一形式中，疫苗之免疫學活性組分可包括生物體之適當元件(亞單位疫苗)，其中該等元件係藉由以下方式生成：藉由破壞整個顆粒或含有該等顆粒之生長培養液及視情況隨後之純化步驟以產生期望結構，或藉由合成方法，包含使用基於(例如)細菌、昆蟲、哺乳動物或其他物種之適宜系統的適當處理加上視情況隨後之分離及純化程序，或藉由使用適宜醫藥組合物直接納入遺傳物質來誘導需要疫苗之動物中之合成過程(多核苷酸接種疫苗)。疫苗可包括一種或同時一種以上之上述元件。如在本發明之具體態樣中所使用，「疫苗」係指活疫苗或活病毒，亦稱為重組疫苗。在本發明之另一具體態樣中，「疫苗」係指包含類病毒顆粒(VLP)之失活或死病毒。因此，疫苗可為亞單位疫苗或死(KV)或失活疫苗。 術語「DNA接種疫苗」或「多核苷酸接種疫苗」意指使用適宜醫藥組合物直接接種遺傳物質。 失活之各種物理及化學方法為業內已知。術語「失活」係指先前有毒或無毒之病毒經輻照(紫外線(UV)、X射線、電子束或γ輻射)、加熱或化學處理使該病毒失活或殺死該病毒，同時保留其免疫原性。適宜失活劑包含β-丙內酯、二元或β-或乙醯基-次乙亞胺、戊二醛、臭氧及福馬林(formalin) (甲醛)。 對於由福馬林或甲醛失活，通常將甲醛與水及甲醇混合以產生福馬林。添加甲醇可防止失活過程中之降解或交叉反應。一實施例使用約0.1%至1%之37%甲醛溶液來使病毒失活。至關重要的是，調節福馬林之量以確保材料失活，但不會多至發生高劑量之副效應。 更特定而言，病毒背景中之術語「失活」意指，病毒不能在活體內或在活體外複製。舉例而言，術語「失活」可係指已經在活體外繁殖且然後使用化學或物理方式使其失活以使其不再能夠複製之病毒。 如本文中所使用，術語「失活」、「殺死」或「KV」可互換使用。 術語「活疫苗」係指包括活生物體或複製勝任病毒或病毒載體之疫苗。 「醫藥組合物」基本上由一或多種能夠改變其所投與之生物體或生物體中或上面存活之生物體之生理學(例如免疫學)功能之成分組成。該術語包含(但不限於)抗生素或抗寄生蟲劑以及通常用於實現某些其他目的(例如但不限於處理性狀、不孕性、穩定性、經腸或非經腸途徑(例如經口、鼻內、靜脈內、肌內、皮下、真皮內或其他適宜途徑)投與組合物之可行性、投與後耐受性或受控釋放性質)之其他成分。該醫藥組合物之一個非限制性實例僅僅係用於顯示目的給出，可如下所述來製備：將經感染細胞培養液之細胞培養液上清液與穩定劑(例如亞精胺及/或牛血清白蛋白(BSA))混合且隨後將混合物藉由其他方法進行凍乾或去水。在接種疫苗之前，然後將混合物在水溶液(例如鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS))或非水溶液(例如油乳液、基於鋁之佐劑)中再水化。 如本文中所使用，「醫藥上或獸醫上可接受之載劑」包含任何及全部溶劑、分散介質、塗覆劑、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑及諸如此類。在一些較佳實施例及尤其包含凍乾之免疫原性組合物之彼等中，用於本發明之穩定劑包含用於凍乾或冷凍乾燥之穩定劑。 在一些實施例中，本發明之免疫原性組合物含有佐劑。本文所用之「佐劑」可包含氫氧化鋁及磷酸鋁、皂素，例如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA)、GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL)、油包水型乳液、水包油型乳液、水包油包水型乳液。特定而言，乳液可基於輕質液體石蠟油(歐洲藥典(European Pharmacopea)型)；類異戊二烯油，例如角鯊烷或角鯊烯；由烯烴(特定而言異丁烯或癸烯)寡聚產生之油；酸或含有直鏈烷基之醇之酯，更特定而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、三-(辛酸甘油酯/癸酸甘油酯)或丙二醇二油酸酯；具支鏈脂肪酸或醇之酯，特定而言異硬脂酸酯。將油與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳係非離子表面活性劑，特定而言係以下之酯：山梨醇酐、二縮甘露醇(例如無水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇及油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸(其視情況經乙氧基化)及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特定而言Pluronic產品，尤其L121。參見Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants (Stewart-Tull編輯，D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY，第51-94頁(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570 (1997)。實例性佐劑係由M. Powell及M. Newman編輯之「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」，Plenum Press, 1995之第147頁上闡述之SPT乳液及同一本書第183頁上闡述之乳液MF59。 佐劑之另一實例係選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物的化合物。有利佐劑化合物係丙烯酸或甲基丙烯酸尤其與醣或多元醇之聚烯基醚交聯之聚合物。該等化合物以術語卡波姆(carbomer)為人所知(Phameuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。熟習此項技術者亦可參照美國專利第2,909,462號，其闡述與具有至少3個、較佳地不超過8個羥基之多羥基化化合物交聯之該等丙烯酸聚合物，至少三個羥基之氫原子由具有至少2個碳原子之不飽和脂肪族基團代替。較佳基團係含有2至4個碳原子之基團，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不飽和基團。不飽和基團可自身含有其他取代基，例如甲基。以名稱CARBOPOL®; (BF Goodrich, Ohio, USA)銷售之產品尤其適合。其與烯丙基蔗糖或烯丙基新戊四醇交聯。其中，可提及Carbopol 974P、934P及971P。最佳係使用CARBOPOL® 971P。在馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物中，尤其係共聚物EMA (Monsanto)，其係馬來酸酐與乙烯之共聚物。該等聚合物在水中之溶解產生酸溶液，其將被中和、較佳地中和至生理pH以產生將引入免疫原性、免疫學或疫苗組合物本身之佐劑溶液。 其他適宜佐劑包含(但不限於)尤其RIBI佐劑系統(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx, Atlanta GA)、SAF-M (Chiron, Emeryville CA)、單磷醯脂質A、阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑、來自大腸桿菌(重組或其他)之熱不穩定腸毒素、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁醯二肽或其天然或重組細胞介素或其類似物或內源細胞介素釋放之刺激劑等。 預計佐劑可以每劑量約100 μg至約10 mg之量、較佳地以每劑量約100 μg至約10 mg之量、更佳地以每劑量約500 μg至約5 mg之量、甚至更佳地以每劑量約750 µg至約2.5 mg之劑量及最佳地以每劑量約1 mg之量添加。或者，以最終產物之體積計，佐劑可為約0.01%至50%之濃度，較佳為約2%至30%之濃度，更佳為約5%至25%之濃度，仍更佳為約7%至22%之濃度，且最佳為10%至20%之濃度。 「稀釋劑」可包含水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及諸如此類。等滲劑可尤其包含氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。穩定劑尤其包含白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼金屬鹽。 「分離」意指自其天然狀態「由人手」改變，亦即若其在自然界中存在，則其已經改變或自其初始環境中取出，或兩者兼而有之。舉例而言，天然存在於活生物體中之多核苷酸或多肽並非「分離的」，但自其天然狀態之共存物質分離之相同多核苷酸或多肽係「分離的」，如本文所用之術語。 「減毒」意指降低病原體之毒性。在本發明中，「減毒」與「無毒」同義。在本發明中，減毒病毒係毒性已降低從而不會引起感染之臨床徵象但能夠在目標哺乳動物中誘導免疫反應者，但亦可意指與感染非減毒病毒或病原體且未接受減毒病毒之動物之「對照組」相比在感染減毒病毒、尤其所主張之EHV-1 RacH病毒載體之動物中臨床徵象之發生率或嚴重程度有所降低。在此上下文中，術語「減小(reduce/reduced)」意指與如上文所定義之對照組相比減小至少10%、較佳地25%、甚至更佳地50%、仍更佳地60%、甚至更佳地70%、仍更佳地80%、甚至更佳地90%及最佳地100%。因此，減毒之無毒病原體(例如所主張之減毒之病毒載體、尤其所主張之EHV-1 (較佳地RacH)病毒載體)適於產生經修飾之活疫苗(MLV)或經修飾之活免疫原性組合物。 術語「治療及/或預防」係指減小畜群中特定豬流感A病毒感染之發病率或減小由特定豬流感A病毒感染引起或與其有關之臨床徵象之嚴重程度。因此，術語「治療及/或預防」亦係指與動物尚未接受如本文所提供之免疫原性組合物之動物群相比，在動物已接受有效量之該等免疫原性組合物之動物群中，減小畜群中感染特定豬流感A病毒之動物數量(=減小特定豬流感A病毒感染之發病率)或減小通常與豬流感A病毒感染有關或由其引起之臨床徵象之嚴重程度。 「治療及/或預防」通常涉及將有效量之本發明之免疫原性組合物投與需要此一治療/預防或可自其受益之動物或動物畜群。術語「治療」係指在動物或畜群之至少一些動物已感染該豬流感A病毒且其中該等動物已展示一些由該豬流感A病毒感染引起或與其有關之臨床徵象後，投與有效量之免疫原性組合物。術語「預防」係指在患有豬流感A病毒之該動物之任一感染或至少該動物或動物群中沒有動物並不展示任一由該豬流感A病毒感染引起或與其有關之臨床徵象之前，投與動物。術語「預防(prophylaxis及preventing)」在本申請案可互換使用。 本文所用之術語「臨床徵象」係指感染豬流感A病毒之動物之徵象。感染之臨床徵象取決於所選病原體。該等臨床徵象之實例包含(但不限於)呼吸窘迫、耳炎、被毛粗亂、微熱、抑鬱症及食慾減小
。
然而，臨床徵象亦包含(但不限於)可自活動物直接觀察到之臨床徵象。可自活動物直接觀察到之臨床徵象之實例包含流鼻涕與眼淚、嗜睡、咳嗽、哮鳴、重擊、高熱、失重、去水、跛行、消瘦、皮膚蒼白、羸弱及諸如此類。 較佳地，治療動物之發病率或嚴重程度之減弱之臨床徵象(與未治療或使用可在本發明之前獲得之免疫原性組合物治療但隨後感染特定豬流感A病毒之動物相比)係指體重減輕降低、降低肺中之病毒負荷、減小肺病灶、減小及/或縮短病毒之脫落、降低直腸溫度、減少臨床症狀(尤其係呼吸症狀)、增加(中和)抗豬流感A病毒抗體之誘導、增加針對豬流感A病毒之T細胞刺激、增加針對豬流感A病毒之B細胞刺激及減少肺中之促發炎性細胞介素(例如IL1β)或其組合。 在本文中，「有效劑量」意指(但不限於)引起或能夠引發免疫反應且在投與抗原之動物中使得減少臨床症狀之量。 如本文中所使用，術語「有效量」在組合物之背景中意指能夠誘導免疫反應且降低動物之疾病之感染或事件之嚴重程度之免疫原性組合物的量。該有效量能夠減小畜群中特定豬流感A病毒感染之發病率或減小特定豬流感A病毒感染之臨床徵象之嚴重程度。特定而言，有效量係指每劑量之菌落形成單位(CFU)。或者，在療法之背景中，術語「有效量」係指足以減輕或改善疾病或病症或其一或多種症狀之嚴重程度或持續時間、防止疾病或病症進展、引起疾病或病症消退、防止與疾病或病症相關之一或多種症狀之復發、發展、發作或進展或增強或改良另一療法之預防或治療的療法之量。 「免疫反應」或「免疫學反應」意指(但不限於)對所關注之(免疫原性)組合物或疫苗發生細胞及/或抗體介導之免疫反應。通常，免疫或免疫學反應包含(但不限於)以下效應中之一或多者：產生或活化特異性針對所關注組合物中所包含之一或多種抗原之抗體、B細胞、輔助性T細胞、阻抑性T細胞及/或細胞毒性T細胞。較佳地，宿主將展示治療性或保護性免疫(記憶)反應，從而對新感染之抗性將增強及/或疾病之臨床嚴重程度降低。該保護將藉由症狀數量之減少、症狀嚴重程度之降低或無與病原體感染相關之一或多種症狀、病毒血症發作之延遲、病毒持久性降低、整體病毒負荷之降低及/或病毒排泄之降低來展現。 「抵抗疾病」、「保護性免疫性」、「功能免疫性」、「臨床症狀之減少」、「中和抗體之誘導/產生及/或血清轉化」及類似片語意指藉由投與本發明之一或多種治療性組合物或其組合而產生之針對疾病或病狀之部分或完全反應，其導致比已暴露於疾病或感染之未經免疫個體所預計較不有害的效應。亦即，在接種疫苗之動物中，感染之有害效應之嚴重程度減輕。在接種疫苗之動物中，感染可經減輕、減緩或可能完全預防。在本文中，若意指完全預防感染，則對其進行具體陳述。若未陳述完全預防，則該術語包含部分預防。「保護性免疫學反應」或「保護性免疫性」顯示為減少或缺乏通常由受感染宿主顯示之臨床徵象、較快恢復時間及/或較低感染性持續時間或受感染宿主之組織或體液或排泄物中之較低病原體效價。 在本文中，「臨床徵象之發生率及/或嚴重程度之降低」或「臨床症狀之減少」意指(但不限於)與野生型感染相比，減少組中感染動物之數量、減少或消除展現感染之臨床徵象之動物之數量或降低一或多個動物中存在之任何臨床徵象之嚴重程度。舉例而言，其應係指病原體負荷之任何減少、病原體脫落、病原體傳播減少或瘧疾之症狀之任何臨床徵象減少。較佳地，與未接受組合物且被感染之動物相比，接受本發明之治療性組合物之一或多個動物之該等臨床徵象減少至少10%。更佳地，接受本發明組合物之動物之臨床徵象減少至少20%、較佳地至少30%、更佳地至少40%及甚至更佳地至少50%。 術語「增加之保護」在本文中意指(但不限於)相對於未接種疫苗之動物對照組，經疫苗接種之動物組之一或多種與由傳染原感染有關之臨床症狀在統計學上顯著減輕。術語「臨床症狀之統計學顯著減輕」意指(但不限於)經接種疫苗之動物組之至少一種臨床症狀的發病頻率比在攻毒傳染原後未接種疫苗之對照組中低至少10%、較佳地20%、更佳地30%、甚至更佳地50%及甚至更佳地70%。 術語「病原體」為熟習此項技術者所熟知。然而，術語「病原體」包括細菌及病毒。 術語「產食動物」意指用於人類消費之動物，例如豬、牛、家禽、魚及諸如此類、較佳地豬。術語「產食動物」不包含馬科，例如馬。 「持久保護」應係指持續至少3週、但更佳地至少3個月、仍更佳地至少6個月之改良之效能。在牲畜之情形下，最佳地，持久保護應持續直至動物出售用於肉類之平均年齡。 術語「脫落」係指諸如鼻涕等分泌物且另外係指藉由咳嗽或噴嚏產生之浮質。因此，可藉由檢驗鼻拭子中之病毒效價或藉由肺中之病毒效價來測定脫落。術語「脫落」另外涵蓋病毒轉移至易感動物中(亦即哨點)。熟習此項技術者熟知如何量測病毒脫落。 術語「抗豬流感A病毒抗體」係指特異性指向豬流感A病毒之抗體。該抗豬流感A病毒抗體之實例包括(但不限於)藉由使用豬流感A病毒疫苗對母豬接種疫苗所獲得之母源抗體或藉由母豬之豬流感A病毒感染所獲得之母源抗體。另外，仔豬中之抗豬流感A病毒抗體可因應於仔豬之豬流感A病毒感染而產生。術語「抗-豬流感A病毒抗體」應另外已知(但不限於)，仔豬具有或暴露於(母源抗體之被動轉移)可檢測抗SIAV抗體效價、較佳地至少1:10、更佳地大於1:20、甚至更佳地大於1:40、甚至更佳地大於1:80、甚至更佳地1:160、甚至更佳地大於1:320及最佳地大於1:640。較佳地，可在特定抗豬流感A病毒免疫分析(例如血球凝集抑制分析、ELISA或血清中和測試)中檢測及量化該抗豬流感A病毒抗體效價。 「安全性」係指在接種疫苗後，在經接種疫苗之動物中不存在不良後果，包含(但不限於)：基於細菌之疫苗潛在地逆轉成有毒、臨床上顯著之副效應，例如持久性、全身性疾病或在疫苗投與位點不可接受之發炎。 本文所用之術語「接種疫苗(vaccination或vaccinating)」或其變化形式意指(但不限於)包含投與本發明之免疫原性組合物之過程，在投與動物時，其引發或能夠引發(直接或間接)該動物之免疫反應。 在本發明之上下文中，「死亡率」係指由感染引起之死亡，且包含感染如此嚴重以致於將動物安樂死以防止痛苦並為其生命提供人道結局之情況。
調配物
本發明之調配物包括有效免疫量之一或多種免疫原性組合物及生理上可接受之媒劑。疫苗包括有效免疫量之一或多種免疫原性組合物及生理上可接受之媒劑。調配物應適用於投與方式。 免疫原性組合物(若需要)亦可含有極少量之潤濕劑或乳化劑或pH緩衝劑。免疫原性組合物可為液體溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或粉劑。口服調配物可包含標準載劑，例如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。 較佳投與途徑包含(但不限於)鼻內、口服、真皮內及肌內。期望在飲用水中、最佳以單一劑量投與。熟習此項技術者將認識到，本發明組合物亦可以一個、兩個或更多個劑量藉由其他投與途徑來投與。舉例而言，該等其他途徑包含皮下、皮內、腹膜內、皮內，且根據治療之期望持續時間及有效性，本發明組合物可以(例如)每日計一次或若干次、亦間歇地以不同劑量(例如約1×10
4
至1×10
9
TCID
50
(參見上述病毒效價))投與若干天、若干週或若干月。在本發明之一具體態樣中，劑量約為1×10
4
至1×10
7
TCID
50
。 抗原定義 熟習此項技術者已知術語「豬流感病毒」。術語豬流感病毒係指來自引起豬流感之正黏液病毒科之A型或C型流感病毒。儘管正黏液病毒具有三組：A型、B型及C型，但僅A型及C型流感病毒感染豬。較佳地，豬流感病毒係豬流感A病毒。豬流感病毒之亞型包含H1N1、H1N2、H3N2及H3N1。H9N2及H5N1亦可發現於豬中。較佳地，豬流感病毒係自豬分離之流感病毒。 熟習此項技術者已知術語「HA」或「H」、「NA」或「N」及「NP」。然而，一般而言，A型流感病毒細分成17 H (血球凝集素)及10 N (神經胺酸酶)亞型，其可產生許多可能組合(指定為H1N1、H1N2……、H2N1、H2N2……、H5N1、H5N2……等)。H (血球凝集素)及N (神經胺酸酶)係流感A病毒(例如SIAV)中之表面醣蛋白。另外，N係中和抗體之主要抗原性靶。另外，NP (核蛋白)形成核衣殼。 DIVA定義 術語「DIVA (區分經感染動物與經接種疫苗動物)「係指可使用疫苗來區分經接種疫苗動物與天然感染動物。 術語「試樣」係指體液試樣、經分離細胞試樣或來自組織或器官之試樣。可藉由熟知技術來獲得體液試樣且較佳地包含血液、血漿、血清或尿之試樣、更佳地血液、血漿或血清之試樣。可藉由(例如生檢)自任一組織或器官獲得組織或器官試樣。可藉由分離技術(例如離心或細胞分選)自體液或組織或器官來獲得經分離細胞。 術語「獲得」可包括熟習此項技術者已知之分離及/或純化步驟，較佳地使用沈澱、管柱等。 術語「免疫測試」及「基因體分析測試」係區分使用本發明免疫原性組合物接種疫苗之動物與感染天然(疾病相關)豬流感病毒之動物之基礎。免疫測試之實例包含任一酶-免疫學或免疫化學檢測方法，例如ELISA (酶聯吸附分析)、EIA (酶免疫分析)、RIA (放射免疫分析)、夾心式酶免疫測試、螢光抗體測試(FAT)、電化學發光夾心式免疫分析(ECLIA)、解離增強之鑭系元素螢光免疫分析(DELFIA)或固相免疫測試、免疫螢光測試(IFT)、免疫組織學染色、西方印漬分析或熟習此項技術者可獲得之任一其他適宜方法。端視所用分析，可藉由酶、螢光團或放射性同位素標記抗原或抗體。例如參見Coligan等人，Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc., New York, N.Y. (1994)；及Frye等人，Oncogen 4: 1153-1157, 1987。 術語「基因體分析測試」係指基於以下之基因體分析方法：聚合酶鏈反應(PCR)、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、實時PCR (r-PCR)或實時逆轉錄PCR (rRT-PCR)、Templex-PCR、基於核酸序列之擴增(NASBA)及使用聚合酶及特定寡核苷酸作為引子之等溫擴增方法。上文所提及之擴增方法在業內已眾所周知。 條款 本文闡述下列條款： 本發明提供下列條款： 化合物 1. 一種EHV載體，其包括 (i) 至少一個與感染產食動物之病原體相關之外源性抗原編碼序列， (ii) 該外源性抗原編碼序列插入ORF70中， (iii) 該外源性抗原編碼序列可操作地連接至啟動子序列。 2. 一種免疫原性組合物，其包括如條款1之EHV載體及視情況醫藥載劑。 3. 一種包括EHV載體之免疫原性組合物，該EHV載體包括 (i) 至少一個與感染產食動物之病原體相關之外源性抗原編碼序列， (ii) 該外源性抗原編碼序列插入ORF70中， (iii) 該外源性抗原編碼序列可操作地連接至啟動子序列。 4. 一種EHV載體，其包括 (i) 至少一個與感染產食動物之病原體相關之外源性抗原編碼序列， (ii) 該外源性抗原編碼序列插入插入位點中， (iii) 該外源性抗原編碼序列可操作地連接至包括4pgG600 (SEQ ID NO:1)或4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列之啟動子序列。 5. 一種免疫原性組合物，其包括如條款4之EHV載體及視情況醫藥載劑。 6. 一種包括EHV載體之免疫原性組合物，該EHV載體包括 (i) 至少一個與感染產食動物之病原體相關之外源性抗原編碼序列， (ii) 該外源性抗原編碼序列插入插入位點中， (iii) 該外源性抗原編碼序列可操作地連接至包括4pgG600 (SEQ ID NO:1)或4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列之啟動子序列。 7. 一種EHV載體，其包括 (i) 至少兩個與感染產食動物之病原體相關之外源性抗原編碼序列， (ii) 該等外源性抗原編碼序列插入插入位點中， (iii) 該等外源性抗原編碼序列可操作地連接至啟動子序列。 8. 一種免疫原性組合物，其包括如條款7之EHV載體及視情況醫藥載劑。 9. 一種包括EHV載體之免疫原性組合物，該EHV載體包括 (i) 至少兩個與感染產食動物之病原體相關之外源性抗原編碼序列， (ii) 該等外源性抗原編碼序列插入插入位點中， (iii) 該等外源性抗原編碼序列可操作地連接至啟動子序列。 10. 一種免疫原性組合物，其包括兩個或更多個如條款1至9中任一項之EHV載體。 11. 如條款10之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物包括兩個EHV載體。 12. 如條款10之免疫原性組合物，其中該兩個或更多個EHV載體包括不同外源性抗原編碼序列。 13. 一種DIVA疫苗，其包括一或多個如條款1至12中任一項之EHV載體。 14.如條款1至13中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該EHV載體係重組載體。 15. 如條款1至14中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該EHV載體係RacH或RacH SE。 16. 如條款1至14中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該EHV載體係選自由以下組成之群：EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9。 17. 如條款1至16中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該EHV載體係EHV-1。 18.如條款1至17中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該產食動物係豬。 19. 如條款1至18中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該感染產食動物之病原體係流感病毒、較佳地豬流感A病毒。 20. 如條款1至19中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列。 21. 如條款1至20中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列且該血球凝集素流感亞型係選自由以下組成之群：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及H18。 22. 如條款1至21中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列且該血球凝集素流感亞型係H1及/或H3。 23. 如條款1至22中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列且該血球凝集素流感A抗原具有豬起源。 24. 如條款1至23中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該EHV載體包括至少兩個血球凝集素流感抗原編碼序列。 25. 如條款1至24中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該EHV載體包括至少4個血球凝集素流感抗原編碼序列。 26. 如條款1至25中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該EHV載體包括4個血球凝集素流感抗原編碼序列。 27. 如條款1至26中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列且該血球凝集素流感抗原編碼序列係選自由以下組成之株群：A/豬/Italy/116114/2010 (H1N2)、A/豬/Italy/7680/2001(H3N2)、A/豬/Gent/132/2005(H1N1)、A/豬/Italy/4675/2003(H1N2)、A/豬/Italy/259543/2003(H1N2)、A/豬/Denmark/13772-1/2003(H1N1)、A/豬/England/MD0040352R/2009 (H1N1)、A/豬/Hungary/13509/2007(H3N2)、A/豬/Italy/13962/95 (H3N2)、A/豬/Cotes d'Armor/1121/00(H1N1)、A/豬/Colorado/1/77、A/豬/Colorado/23619/99、A/豬/Cote d'Armor/3633/84、A/豬/England/ 195852/92、A/豬/Finistere/2899/82、A/豬/Hong Kong/10/98、A/豬/Hong Kong/9/98、A/豬/Hong Kong/81/78、A/豬/Illinois/100084/01、A/豬/Illinois/100085A/01、A/豬/Illinois/21587/99、A/豬/Indiana/1726/88、A/豬/Indiana/9K035/99、A/豬/Indiana/P12439/00、A/豬/Iowa/30、A/豬/Iowa/15/30、A/豬/Iowa/533/99、A/豬/Iowa/569/99、A/豬/Iowa/3421/90、A/豬/Iowa/8548-1/98、A/豬/Iowa/930/01、A/豬/Iowa/17672/88、A/豬/Italy/1513-1/98、A/豬/Italy/1523/98、A/豬/Korea/CY02/02、A/豬/Minnesota/55551/00、A/豬/Minnesota/593/99、A/豬/Minnesota/9088-2/98、A/豬/Nebraska/1/92、A/豬/Nebraska/209/98、A/豬/Netherlands/12/85、A/豬/North Carolina/16497/99、A/豬/North Carolina/35922/98、A/豬/North Carolina/93523/01、A/豬/North Carolina/98225/01、A/豬/Oedenrode/7C/96、A/豬/Ohio/891/01、A/豬/Oklahoma/18717/99、A/豬/Oklahoma/18089/99、A/豬/Ontario/01911-1/99、A/豬/Ontario/01911-2/99、A/豬/Ontario/41848/97、A/豬/Ontario/97、A/豬/Quebec/192/81、A/豬/Quebec/192/91、A/豬/Quebec/5393/91、A/豬/Taiwan/7310/70、A/豬/Tennessee/24/77、A/豬/Texas/4199-2/98、A/豬/Wisconsin/125/97、A/豬/Wisconsin/136/97、A/豬/Wisconsin/163/97、A/豬/Wisconsin/164/97、A/豬/Wisconsin/ 166/97、A/豬/Wisconsin/168/97、A/豬/Wisconsin/235/97、A/豬/Wisconsin/238/97、A/豬/Wisconsin/457/985 A/豬/Wisconsin/458/98、A/豬/Wisconsin/464/98及A/豬/Wisconsin/14094/99。 28. 如條款1至27中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列且該血球凝集素流感抗原編碼序列係選自由以下組成之株群：A/豬/Italy/116114/2010(H1N2)、A/豬/Italy/7680/2001(H3N2)、A/豬/Gent/132/2005(H1N1)及A/豬/Italy/4675/2003(H1N2)。 29. 如條款1至28中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列且該血球凝集素流感抗原編碼序列編碼選自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29組成之群之胺基酸序列。 30. 如條款1至29中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列且該血球凝集素流感抗原編碼序列包括編碼與如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29中所陳述之胺基酸序列具有至少70%一致性之胺基酸序列之核酸序列。 31. 如條款1至30中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該外源性抗原編碼序列係血球凝集素編碼序列且該血球凝集素流感抗原編碼序列包括編碼與如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列。 32. 如條款1至31中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該外源性抗原編碼序列係N (神經胺酸酶)編碼序列且該N亞型係選自由以下組成之群：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9及N10。 33. 如條款1至32中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該EHV載體、該免疫原性組合物或該DIVA疫苗不包括 N (神經胺酸酶)流感抗原編碼序列。 34. 如條款1至33中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該EHV載體、該免疫原性組合物或該DIVA疫苗不包括NP (核蛋白)流感抗原編碼序列。 35. 如條款1至34中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該EHV載體包括其他調節序列，例如終止信號或多腺苷酸化序列。 插入位點： 36. 如條款4至34中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該插入位點係ORF1/3。 37. 如條款4至34中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該插入位點係ORF70。 38. 如條款1至37中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中將與感染產食動物之病原體相關之第一外源性抗原編碼序列插入ORF70中。 39. 如條款1至38中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中將與感染產食動物之病原體相關之第二外源性抗原編碼序列插入ORF1/3中。 40. 如條款1至39中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該插入ORF70中之特徵在於ORF70中之部分缺失、截短、取代、修飾或諸如此類，其中ORF71保留功能性。 41. 如條款1至40中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該插入ORF70中之特徵在於： i) 缺失RacH之ORF70內之大約801bp部分(SEQ ID NO: 20)或其70%、80%、85%、90%、95%、99%同源及/或一致序列，或 ii) 該插入ORF70中之特徵在於缺失RacH之ORF70內之大約801bp部分(SEQ ID NO.: 20)或任一其他株中之其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列缺失，或 iii) 該插入ORF70中之特徵在於缺失野生型EHV-1株ab4 (基因庫登錄號AY665713.1)之ORF70內之大約801bp部分，其中該野生型ab4基因體序列中之該缺失部分位於核苷酸127681與128482 (SEQ ID NO.: 19)之間或係其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列，或 iv) 該插入ORF70中之特徵在於缺失野生型EHV-1株ab4 (基因庫登錄號AY665713.1)之ORF70內之大約801bp部分，其中該野生型ab4基因體序列中之該缺失部分位於核苷酸127681與128482 (SEQ ID NO.: 19)之間或任一其他株中之其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列缺失。 42. 如條款1至41中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該EHV-1載體包括至少一個選自由以下組成之群之側接區：SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17及SEQ ID NO: 18及該等序列中之任一者之70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。 43. 如條款1至42中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該EHV-1載體包括(i)至少一個選自由以下組成之群之左ORF70側接區：SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 17；及(ii)至少一個選自由以下組成之群之右ORF70側接區：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16及SEQ ID NO: 18。 啟動子： 44. 如條款1至3及7至43中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列係選自由以下組成之群：SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人類延長因子α啟動子、桿狀病毒多角體蛋白啟動子；4pgG600 (SEQ ID NO:1)之功能片段，較佳地該功能片段係p430 (SEQ ID NO:3)；4pgG600 (SEQ ID NO:1)之互補核苷酸序列之功能片段；4pMCP600 (SEQ ID NO:2)之功能片段，較佳地該功能片段係p455 (SEQ ID NO:4)；4pMCP600 (SEQ ID NO:2)之互補核苷酸序列之功能片段。 45. 如條款1至3及7至44中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列包括4pgG600 (SEQ ID NO:1)或4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列。 46. 如條款4至6及45中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列之該功能片段或衍生物具有80%、85%、較佳地90%、91%、92%、93%、94%、更佳地95%、96%、97%、98%、99%、99.9%之同源性。 47. 如條款4至6及45或46中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列之該功能片段或衍生物具有550個核苷酸、較佳地500、490、480、470、460、455、450、445、440、435、434、433、432、431、430個核苷酸、最佳地455或430個核苷酸之長度。 48. 如條款4至6及45至47中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列之該功能片段係4pgG600 (SEQ ID NO:1)之截短物或其互補核苷酸序列，較佳地，該序列一致性為整個長度之(至少) 72% (或更高)。 49. 如條款4至6及45至48中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中4pgG600 (SEQ ID NO:1)之該啟動子序列之該功能片段係指定片段p430 (SEQ ID NO:3)或與SEQ ID NO:3具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%一致性之序列。 50. 如條款4至6及45至48中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列之該功能片段係4pMCP600 (SEQ ID NO:2)之截短物或其互補核苷酸序列，較佳地，該序列一致性為整個長度之(至少) 78% (或更高)。 51. 如條款4至6及45至48中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中4pMCP600 (SEQ ID NO:2)之該啟動子序列之該功能片段係指定片段p455 (SEQ ID NO:4)或與SEQ ID NO:4具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%一致性之序列。 52. 如條款1至51中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該EHV載體包括一或多個其他調節序列，例如終止信號、多腺苷酸化信號或諸如IRES及/或2a肽等調節元件。 啟動子及抗原之特定組合： 53. 如條款1至52中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 28中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列。 54. 如條款53之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)之該功能片段係指定片段p430 (SEQ ID NO:3)。 55. 如條款1至54中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 27中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列。 56. 如條款55之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)之該功能片段係指定片段455p455 (SEQ ID NO:4)。 57. 如條款1至56中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 28中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列，且 其中該啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 27中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列。 58. 如條款57之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列4pgG600 (SEQ ID No. 1)之該功能片段係指定片段p430 (SEQ ID NO:3)，且其中該啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)之該功能片段係指定片段455p455 (SEQ ID NO:4)。 59. 如條款57或58之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該免疫原性組合物或該DIVA疫苗為二價。 60. 如條款1至59中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 29中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列。 61. 如條款60之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)該之功能片段係指定片段p430 (SEQ ID NO:3)。 62. 如條款1至61中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 26中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列。 63. 如條款62之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)之該功能片段係指定片段455p455 (SEQ ID NO:4)。 64. 如條款1至63中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 29中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列，且 其中該啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 26中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列。 65. 如條款64之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列4pgG600 (SEQ ID No. 1)之該功能片段係指定片段p430 (SEQ ID NO:3)且其中該啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)之該功能片段係指定片段455p455 (SEQ ID NO:4)。 66. 如條款64或65之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該免疫原性組合物或該DIVA疫苗為二價。 67. 如條款1至66中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該免疫原性組合物包括第一EHV載體，該第一EHV載體包括：啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列，其可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 28中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列，及 啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列，其可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 27中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列，且其中該免疫原性組合物包括第二EHV載體，該第二EHV載體包括： 啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列，其可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 29中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列；及 啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列，其可操作地連接至編碼與如SEQ ID NO: 26中所陳述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之核酸序列。 68. 如條款67之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該啟動子序列4pgG600 (SEQ ID NO:1)之該功能片段係指定片段p430 (SEQ ID NO:3)且其中該啟動子序列4pMCP600 (SEQ ID NO:2)之該功能片段係指定片段455p455 (SEQ ID NO:4)。 69. 如條款67或68之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該免疫原性組合物或DIVA疫苗為四價。 70. 如條款1至69中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該免疫原性組合物或DIVA疫苗經調配用於單一劑量投與。 71. 如條款1至70中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中經肌內或經鼻內投與該免疫原性組合物或DIVA疫苗。 72. 如條款1至71中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該免疫原性組合物或DIVA疫苗可安全用於前6週齡內、前兩週齡內、第一週齡內或第一天齡內之豬。 73. 如條款1至72中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該免疫原性組合物或DIVA疫苗進一步包括醫藥上可接受之載劑。 74. 如條款73之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該醫藥上可接受之載劑係注射用水、細胞培養基或再懸浮緩衝劑。 75. 如條款74之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該再懸浮緩衝液係磷酸鹽緩衝鹽水。 76. 如條款1至75中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該免疫原性組合物或DIVA疫苗包括1×10
4
至1×10
9
TCID
50
、較佳地介於1×10
4
至1×10
8
TCID
50
之間、甚至更佳地1×10
4
至1×10
7
TCID
50
之EHV載體。 77. 如條款1至76中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該免疫原性組合物係疫苗。 78. 如條款1至77中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該免疫原性組合物或DIVA疫苗係多價疫苗。 79.如條款1至78中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該免疫原性組合物或DIVA疫苗係二價疫苗、四價疫苗、六價疫苗或七價疫苗。 80. 如條款1至79中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該免疫原性組合物或DIVA疫苗係二價疫苗或四價疫苗。 81. 如條款1至80中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該免疫原性組合物或DIVA疫苗可有效治療及/或預防有需要之產食動物中由豬流感A病毒引起之臨床徵象。 82. 如條款1至81中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該免疫原性組合物或DIVA疫苗抵抗豬流感A病毒之同源及/或異源性攻毒。 83. 如條款1至82中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其中該免疫原性組合物或DIVA疫苗抵抗血清型H1及/或H3之豬流感A病毒之攻毒。 套組 84.一種套組，其包括如條款2、3、5、6及8至83中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗。 85. 如條款84之套組，其中該套組進一步包括用於治療及/或預防豬流感A病毒之說明手冊。 治療方法 86. 一種對產食動物實施免疫之方法，其包括向該產食動物投與如條款2、3、5、6及8至83中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗。 87. 一種治療或預防有需要之產食動物中由流感A病毒引起之臨床徵象之方法，該方法包括向該產食動物投與治療有效量之如條款2、3、5、6及8至83中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗。 88. 一種與相同種之未免疫對照組之產食動物相比減小有需要之產食動物中之肺中病毒效價的方法，該方法包括向該產食動物投與治療有效量之如條款2、3、5、6及8至83中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗。 89. 一種對具有抗豬流感A病毒抗體之有需要之產食動物接種疫苗之方法，其包括向該產食動物投與治療有效量之如條款2、3、5、6及8至83中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗之步驟。 90. 一種在幼小產食動物中提供針對流感A病毒之母源免疫性之方法，其包括在該幼小產食動物之母親懷有該幼小產食動物的同時向該母親投與治療有效量之如條款2、3、5、6及8至83中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗。 91. 一種在有需要之幼小產食動物中提供針對流感A病毒感染之增加保護之方法，其中 a) 在該幼小產食動物之母親懷有該幼小產食動物的同時使用治療有效量之如條款2、3、5、6及8至83中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗對該母親接種疫苗及/或 b) 使用治療有效量之該免疫原性組合物或DIVA疫苗在三週齡內對該幼小產食動物接種疫苗。 92. 如條款2、3、5、6及8至83中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其用於對產食動物實施免疫之方法中，該方法包括向該產食動物投與治療有效量之該免疫原性組合物或DIVA疫苗。 93. 如條款2、3、5、6及8至83中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其用於治療或預防有需要之產食動物中由流感A病毒引起之臨床徵象之方法中，該方法包括向該產食動物投與治療有效量之該免疫原性組合物或DIVA疫苗。 94. 如條款2、3、5、6及8至83中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其用於與相同種之未免疫對照組之產食動物相比減小有需要之產食動物中之肺中病毒效價的方法中，該方法包括向該產食動物投與治療有效量之該免疫原性組合物或DIVA疫苗。 95. 如條款2、3、5、6及8至83中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其用於對具有抗豬流感A病毒抗體之有需要之產食動物接種疫苗之方法中，該方法包括向該產食動物投與治療有效量之該免疫原性組合物或DIVA疫苗。 96. 如條款2、3、5、6及8至83中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其用於在幼小產食動物中提供針對流感A病毒之母源免疫性之方法中，其包括在該幼小產食動物之母親懷有該幼小產食動物的同時向該母親投與治療有效量之該免疫原性組合物或DIVA疫苗。 97. 如條款2、3、5、6及8至83中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗，其用於在有需要之幼小產食動物中提供針對流感A病毒感染之增加保護之方法中，其中 a) 在該幼小產食動物之母親懷有該幼小產食動物的同時使用治療有效量之如條款2、3、5、6及8至83中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗對該母親接種疫苗及/或 b)使用治療有效量之該免疫原性組合物或DIVA疫苗在三週齡內對該幼小產食動物接種疫苗。 98. 如條款86至97中任一項之方法或用途，其中該產食動物係豬、仔豬或母豬。 99. 如條款86至98中任一項之方法或用途，其中該流感A病毒係豬流感A病毒。 100. 如條款86至99中任一項之方法或用途，其中投與該免疫原性組合物或DIVA疫苗一次。 101. 如條款86至100中任一項之方法或用途，其中在前6週齡內、前兩週齡內、第一週齡內或第一天齡內向該產食動物投與該免疫原性組合物或DIVA疫苗。 102. 如條款86至101中任一項之方法或用途，其中以兩個劑量投與該免疫原性組合物或DIVA疫苗。 103. 如條款102之方法或用途，其中在第一週齡內及第二、第三或第四週齡內之第二時間向該產食動物投與該免疫原性組合物或DIVA疫苗。 104. 如條款86至103中任一項之方法或用途，其中經肌內或經鼻內投與該免疫原性組合物或DIVA疫苗。 105. 如條款86至88及92至94及98至104中任一項之方法或用途，其中該產食動物係抗豬流感A病毒抗體陰性。 106. 如條款86至104中任一項之方法或用途，其中該產食動物係抗豬流感A病毒抗體陽性。 107. 如條款86至106中任一項之方法或用途，其中該免疫原性組合物或DIVA疫苗包括1×10
4
至1×10
7
TCID
50
之該EHV載體。 108. 如條款86至107中任一項之方法或用途，其中該方法產生與相同種之未免疫對照組之產食動物相比，選自由以下組成之群之效能參數改良：體重減輕降低、降低肺中之病毒負荷、減少肺病灶、減少及/或縮短病毒脫落、降低直腸溫度、減少臨床症狀(尤其呼吸症狀)、增加(中和)抗豬流感A病毒抗體之誘導、增加針對豬流感A病毒之T細胞刺激、增加針對豬流感A病毒之B細胞刺激及減少肺中之促發炎性細胞介素(例如IL1β)或其組合。 109. 如條款86至108中任一項之方法或用途，其中該治療或預防使得與相同種之非治療對照組之產食動物相比病毒負荷期縮短。 110. 如條款86至109中任一項之方法或用途，其中該治療或預防使得自在攻毒(感染)之後1天減小該流感A病毒之脫落。 111. 如條款86至110中任一項之方法或用途，其中該免疫原性組合物或DIVA疫苗抵抗流感A病毒之同源及/或異源性攻毒。 112. 如條款86至111中任一項之方法或用途，其中該免疫原性組合物或DIVA疫苗抵抗血清型H1及/或H3之流感A病毒之攻毒。 Swiss類型及其他措辭 113. 如條款2、3、5、6及8至83中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其用於治療應用。 114. 如條款2、3、5、6及8至83中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其用作免疫原或疫苗。 115. 如條款2、3、5、6及8至83中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗，其用作藥劑。 116. 一種如條款2、3、5、6及8至83中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗之用途，其用於製造藥劑。 117. 如條款2、3、5、6及8至83中任一項之EHV載體、免疫原性組合物或DIVA疫苗之用途，其用於治療及/或預防產食動物中之豬流感A病毒感染。 DIVA 118. 一種區分感染豬流感A病毒之產食動物與使用如條款2、3、5、6及8至83中任一項之免疫原性組合物或DIVA疫苗接種疫苗之產食動物的方法，其包括 a) 自產食動物獲得試樣，及 b) 在免疫測試及/或基因體分析測試中分析該試樣。 119. 如條款118之方法，其中該免疫測試包括測試該試樣是否包括特異性識別豬流感之該N (神經胺酸酶)蛋白或NP (核蛋白)蛋白之抗體。 120. 如條款118或119之方法，其中若已檢測出抗體特異性識別豬流感之該N (神經胺酸酶)蛋白或NP (核蛋白)蛋白，則該產食動物感染豬流感A病毒。 121. 如條款118之方法，其中該基因體分析測試包括測試該試樣是否包括編碼N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)之豬流感A病毒特異性序列。 122. 如條款118或121之方法，其中若已檢測出編碼N (神經胺酸酶)及/或NP (核蛋白)之豬流感A病毒特異性序列，則該產食動物感染豬流感A病毒。 123. 如條款118至122中任一項之方法，其中該免疫測試係EIA (酶免疫分析)或ELISA (酶聯吸附分析)，或其中該基因體分析測試係PCR (聚合酶鏈反應)、RT-PCR (逆轉錄酶聚合酶鏈反應)或實時PCR (聚合酶鏈反應)。 124.如條款118至123中任一項之方法，其中該產食動物係豬。 125. 如條款118至124中任一項之方法，其中該試樣係血清試樣。 126. 如條款118至125中任一項之方法，其中該ELISA係間接ELISA、夾心式ELISA、競爭性ELISA或阻斷性ELISA。 序列概述：
詳述下列序列並揭示於本發明中 ：
啟動子： SEQ ID NO: 1 EHV-4 600bp去氧核糖核酸序列4pgG600 SEQ ID NO: 2 EHV-4 600bp去氧核糖核酸序列4pMCP600 SEQ ID NO: 3 EHV-4 430bp去氧核糖核酸序列 p430 SEQ ID NO: 4 EHV-4 449bp去氧核糖核酸序列 p455 SEQ ID NO: 5 orf72之特異性引子1130號 SEQ ID NO: 6 orf72之特異性引子1131號 SEQ ID NO: 7 mCherry之特異性引子1079號 SEQ ID NO: 8 mCherry之特異性引子1080號 插入位點： SEQ ID NO: 9 orf70插入區之人工序列核酸PCR引子1017 SEQ ID NO: 10 orf70插入區之人工序列核酸PCR引子1018 SEQ ID NO: 11 orf1/3插入區之人工序列核酸PCR引子1007 SEQ ID NO: 12 orf1/3插入區之人工序列核酸PCR引子1008 SEQ ID NO: 13 左(Up70)側接區(417 bp) SEQ ID NO: 14 右(Up71)側接區(431 bp) SEQ ID NO: 15
野生型 EHV-1 株 ab4
(基因庫登錄號AY665713.1)中位於核苷酸127264 - 127680處之左側接區(上orf70) SEQ ID NO: 16
野生型 EHV-1 株 ab4
(基因庫登錄號AY665713.1)中位於核苷酸128484 - 128913處之右側接區(上orf71) SEQ ID NO: 17
RED 系統
中之截短之側接區：左(Up70)側接區(283 bp) = 與417 bp 「經典」側接區之3’ 283 bp一致 SEQ ID NO: 18
RED 系統
中之截短之側接區：右(Up71)側接區(144 bp) = 與431 bp 「經典」側接區之5’ 144 bp一致 SEQ ID NO: 19 野生型ab4 (基因庫登錄號AY665713.1)基因體序列中之缺失部分，nt 127681 - 128482 SEQ ID NO: 20 RacH基因體序列中之缺失部分(不可獲得nt編號，此乃因完全基因體序列未知) 質體/載體序列： SEQ ID NO: 21 轉移質體pU-mC70-BGH之核苷酸序列 SEQ ID NO.: 22 轉移載體pU70-p455-71K71之核苷酸序列 SEQ ID NO.: 23 轉移質體pU70-p455-H3-71K71之核苷酸序列 SEQ ID NO.: 24 轉移載體pU-1-3-p430-BGHKBGH之核苷酸序列 SEQ ID NO.: 25 轉移質體pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH之核苷酸序列 血球凝集素序列 SEQ ID NO: 26 血球凝集素[流感A病毒(A/豬/Italy/116114/2010 (H1N2))] 基因庫：ADR01746.1 H1pdm SEQ ID NO:27血球凝集素[流感A病毒(A/豬/Italy/7680/2001 (H3N2))] 基因庫：ABS50302.2 H3: SEQ ID NO:28血球凝集素[流感A病毒(A/豬/Gent/132/2005 (H1N1))] 基因庫：AFR76623.1 H1av: SEQ ID NO:29血球凝集素[流感A病毒(A/豬/Italy/4675/2003 (H1N2))] 基因庫：ADK98476.1* H1hu *胺基酸531 (X (終止密碼子)變為I)： 實例 本發明包含下列實例以證明本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，下列實例中所揭示之技術代表本發明者所發現在實踐本發明中運行良好之技術，且由此可認為構成其實踐之較佳方式。然而，熟習此項技術者由本揭示應瞭解，可對所揭示特定實施例作多種改變且仍獲得相同或類似結果，並不背離本發明之精神及範圍。 實例1：
新穎插入位點 ORF70 之確立
為增強EHV-1載體之能力，本發明者試圖發現自一個載體主鏈表現兩種不同轉基因而不需要兩種轉基因藉由RNA病毒衍生之功能偶聯在一個啟動子控制下的方式。本發明者假設疱疹病毒基因體可耐受平行使用兩個獨立之轉基因插入位點。為確定EHV-1 ORF70是否係適宜轉基因插入位點，藉由經典同源重組使用編碼自身螢光性mCherry蛋白(Shaner等人，2004)之表現盒代替orf70 (1236 bp)之5'端之801個鹼基對(圖1B)。質體pU-mC70-BGH之圖在圖2 (SEQUENCE ID NO. 21)中。使用XbaI自pU-mC70-BGH切除用於同源重組之DNA片段。將凝膠純化之片段與EHV-1 RacH之病毒基因體DNA共轉染至RK13細胞中。藉由活螢光及病毒滴定(未展示)來展示重組載體病毒之有效復活及在所培養細胞中之有效複製。缺失三分之二orf70具有另外益處，亦即消除由orf70編碼之醣蛋白G之表現。EHV-1之醣蛋白G顯示為抵抗宿主之免疫反應之非結構性分泌之趨化介素結合蛋白(Drummer等人，1998；Bryant等人，2003)。因載體疫苗旨在刺激接種者之免疫反應，故去除病毒載體之此特定免疫抑制功能可能另外改良病毒載體平臺EHV-1 RacH-SE之性能。 實例2：
新穎啟動子之鑑別及構築
鑑別適宜啟動子序列之策略如下：首先藉由與EHV-1基因體之各別序列片段進行對比來分析兩個已知orf上游之EHV-4序列之600 bp片段。所選基因係編碼主衣殼蛋白(MCP)之orf42及編碼醣蛋白G (gG)之orf70。主衣殼蛋白係病毒體中之最豐富組分之一且係在新合成病毒DNA準備包裝後立即在細胞核中組裝衣殼所需。其啟動子由此預計在病毒複製週期之早期及後期較為活躍。對於醣蛋白G而言，已知其基因(orf70)亦在複製週期之早期及後期較為活躍(Colle等人，1995；Drummer等人，1998)。序列一致性為82.2% (對於假定MCP啟動子)及82.3% (對於假定gG啟動子)。該等差異可一方面視為足夠大以防止同源重組，且另一方面足夠小以容許EHV-1複製期間之轉錄活化。為測試啟動子活性，合成600bp DNA片段4pgG600 GCAGACTTTGGAGCAGCACAATTTCCGGTTGTGGACCCCATGGACCTTGGTTTGGCTGGTACCGTGGAAACTAACGCTCCGGAAGTTTTGGCCAGAGCAAAATACAATTCGAAGGTAGACATATGGAGCGCCGGAATAGTTCTGTTTGAAATGCTCGCATATCCATCAACTCTATTTGAGGACCCGCCGAGTACCCCACAAGAGTATGTAAAAAGCTGTCATTCTCAACTACTGAGAATAATATCAAAGCTAAAGATAAACCCTGAGGAGTTTCCACGGGAACCAGAGTCTAGGCTCGTGCGCGGATACATCGAATACGCCAGCCTAGAGCGTAAGCCACATACGCGCTATCCTTGCTTCCAGCGCGTGAACCTACACATTGACGGGGAATTTTTGATCCATAAAATGCTAGCGTTCAATGCTGCGATGCGCCCATCCGCAGAAGAGTTGTTGTCCTACCCAATGTTTATGAATCTGTAGGATGACTAACAGATTTGGGGTGGAGACGGCGTGGGCGATACTGTATAAAGTTGTACTACTTACCAGCCCAGTCAGTGTGCTGTAGTGCCACCACCTGTAAAGCTGTGATAAGCTGCAGTT (SEQ ID NO:1) 及4pMCP600 AGCTGGGGGAGTTTGTACTATAGTGTATTACATGCGGCTTGCAATAACTGCCTGGTTTATGTTTCGCAACATTCAAGCAGACATGCTACCGCTAAACACTTTGCAACAATTTTTTATTGGGTGTTTGGCCTTTGGTAGAACTGTCGCGTTTTTGGTGGTAGCATATACTACCTTATTTATACGCTCCGAGCTGTTTTTCAGCATGCTAGCACCCAACGCCGAGCGAGAGTATATAACTCCCATCATTGCCCACAAGCTTATGCCACTTATTAGCGTCCGCTCTGCCGTTTGCTTAGTCATAATATCTACCGCCGTTTACGCAGCAGACGCTATCTGCGACACAATTGGATTTGCGATACCGCGCATGTGGATGTGTATTTTAATGAGATCAACCTCCATGAAGCGTAACTAGGGGGCCTCCCACTGAGGCACTACCGGCTTAGCAGCTGACTAACACAGTATAAAACGTGAGAAGAAATCAGTCTCATGCGCCATTAGCGCTAGGCTAGTTAGCGTGGAGGACCGGAGCGCTACCGCCAGCAGTTTCATCCGCCTGGTTACGGGTTTGTTAACACCTACCGGTGTTTTACCGCTACCATA (SEQ ID NO:2) 且選殖於編碼自身螢光性蛋白mCherry之報告基因上游(Shaner等人，2004)。對於轉錄終止信號及mRNA穩定功能而言，將牛生長激素多腺苷酸化序列(BGHpA；Goodwin & Rottman, 1992)選殖於緊接報告基因之3’端下游處。 為用作陽性對照，自市售質體pcDNA3.1 (Invitrogen)擴增CMV啟動子且選殖於mCherry報告基因上游，此處亦將BGHpA添加至報告基因之3’端。使用三個質體(pBlu-4pgGmCherry、pBlu-4pMCPmCherry及pBlu-CMVmCherry)轉染細胞培養液且藉由螢光顯微術檢查mCherry螢光。在轉染之後之不同時間，CMV啟動子具有顯著強烈活性。4pgG600啟動子在轉染之後亦較為活躍，亦可檢測4pMCP600啟動子之活性，但其弱於4pgG600啟動子，且即使在轉染之後三天與CMV啟動子進行比較時更甚。 為探究病毒基因產物對啟動子活性之效應，在使用綠色螢光EHV-1 RacHI-EF轉染之後一天重複感染經pBlu-4pgG600-mCherry或pBlu-4pMCP600-mCherry轉染之細胞培養液。病毒基因產物明顯轉活化4pMCP600啟動子以使活性顯著較於不存在 EHV-1 RacHI-EF複製下。該效應亦存在於經pBlu-4pgG600-mCherry轉染且使用EHV-1 RacHI-EF重複感染之細胞培養液中，但並不如此顯著，此乃因在不存在病毒複製下之初始活性高於針對pBlu-4pMCP600-mCherry所觀察。另外，對於兩種600 bp啟動子而言，已證實病毒複製對細胞培養液中之其活性之轉活化效應。 若600bp序列含有抑制元件(其通常位於活化元件上游)，則可闡釋此效應。因此，較短啟動子可在不存在病毒基因產物下更具活性。為測試此結論，將兩種EHV-4啟動子序列截短至其原始長度之大約75%且再次測試。 特定而言，將600 bp啟動子截短至430 bp (對於4pgG，新穎名稱：
p430
: TCTATTTGAGGACCCGCCGAGTACCCCACAAGAGTATGTAAAAAGCTGTCATTCTCAACTACTGAGAATAATATCAAAGCTAAAGATAAACCCTGAGGAGTTTCCACGGGAACCAGAGTCTAGGCTCGTGCGCGGATACATCGAATACGCCAGCCTAGAGCGTAAGCCACATACGCGCTATCCTTGCTTCCAGCGCGTGAACCTACACATTGACGGGGAATTTTTGATCCATAAAATGCTAGCGTTCAATGCTGCGATGCGCCCATCCGCAGAAGAGTTGTTGTCCTACCCAATGTTTATGAATCTGTAGGATGACTAACAGATTTGGGGTGGAGACGGCGTGGGCGATACTGTATAAAGTTGTACTACTTACCAGCCCAGTCAGTGTGCTGTAGTGCCACCACCTGTAAAGCTGTGATAAGCTGCAGTT (SEQ ID NO:3)) 及449 bp(對於4pMCP，新名稱：p455: TTGGTGGTAGCATATAC TACCTTATTTATACGCTCCGAGCTGTTTTTCAGCATGCTAGCACCCAACGCCGAGCGAGAGTATATAACTCCCATCATTGCCCACAAGCTTATGCCACTTATTAGCGTCCGCTCTGCCGTTTGCTTAGTCATAATATCTACCGCCGTTTACGCAGCAGACGCTATCTGCGACACAATTGGATTTGCGATACCGCGCATGTGGATGTGTATTTTAATGAGATCAACCTCCATGAAGCGTAACTAGGGGGCCTCCCACTGAGGCACTACCGGCTTAGCAGCTGACTAACACAGTATAAAACGTGAGAAGAAATCAGTCTCATGCGCCATTAGCGCTAGGCTAGTTAGCGTGGAGGACCGGAGCGCTACCGCCAGCAGTTTCATCCGCCTGGTTACGGGTTTGTTAACACCTACCGGTGTTTTACCGCTACCATA (SEQ ID NO:4))。 在細胞培養液中轉染含有縮短啟動子之mCherry-報告基因質體且藉由螢光顯微術檢查。儘管p430活性與600 bp形式(4pgG600)相當，但p455之活性顯著大於4pMCP600之活性。此結果與使用600bp形式之兩種啟動子之轉染/重複感染實驗之結果一致，亦即，在相同細胞中存在EHV-1複製提供關於以下之機制：4pMCP600啟動子之轉活化強烈增加其活性，而可看到4pgG600啟動子之轉活化，但較不明顯。 除兩種新穎啟動子外，亦需要新聚A序列以進行來自新穎orf70插入位點之表現。該元件稱為71pA。合成其核苷酸序列且選殖於含有靶向pRacH-SE中之orf70插入位點之p455之轉移質體中之mCherry orf下游。 接下來，生成rEHV-1 RacH-SE以分析病毒複製背景中之啟動子活性(表1)。使用兩種EHV-4啟動子(p430及p455)、CMV啟動子及小鼠巨細胞病毒IE1啟動子(MCMV)來引導表現mCherry與BGH聚A信號之組合以增加mRNA穩定性。合成如由Dorsch-Häsler等人(1985)所闡述之MCMV IE1啟動子(增強子)且選殖於自其亞選殖至轉移質體中之質體載體中。另外，亦將p455選殖至orf70中之新穎插入位點中，從而取得表現mCherry與新穎聚A信號71pA之組合。作為另一對照，將rEHV-1 RacHmC70包含於實驗中。經此重組病毒感染之細胞在內源性gG啟動子(egGp)之控制下表現mCherry (表1) 表1
以m.o.i. 1 (感染複數)使VERO或PK/WRL細胞感染所有6種表現mCherry之病毒。在注射後0、4、8及12小時收集經感染細胞且製備總RNA。藉由DNAse I消解破壞污染RNA製劑之病毒及細胞基因體DNA。藉由以下方式來展示RNA完整性及病毒DNA去除：在添加及不添加逆轉錄酶下實施逆轉錄，隨後使用編碼EHV-1之必需結構醣蛋白D之orf72之特異性引子對(引子編號1130/1131, (TGTCTACCTTCAAGCTTATG (SEQ ID NO:5)/ CTAGCGCAGTCGCGTTG (SEQ ID NO:6))實施PCR。僅自已添加逆轉錄酶之逆轉錄試樣(cDNA) (具體而言係在t1=注射後4h、t2=注射後8h及t3=注射後12h製得之試樣)擴增預期196bp PCR產物，且並不自在t0=注射後0 h製得之試樣擴增。尚未向反應中添加逆轉錄酶之所有試樣皆不產生任一預期PCR產物。因此，其展示，用作qPCR模板之試樣(cDNA)不含病毒基因體DNA。 然後藉由qPCR使用mCherry之特異性引子(引子編號1079/1080, (GCGAGGAGGATAACATGG (SEQ ID NO:7)/ ACCCTTGGTCACCTTCAG (SEQ ID NO:8))及orf72引子對1130/1131 (TGTCTACCTTCAAGCTTATG (SEQ ID NO:5)/ CTAGCGCAGTCGCGTTG (SEQ ID NO:6))來分析使用所添加酶自逆轉錄所獲得之cDNA。使用orf72 qPCR之Ct (循環臨限值)值來評價不同病毒感染平行試驗之可比性且正規化用於mCherry qPCR之Ct值。因此，相對於感染後時間及不同病毒來量化mCherry之轉錄(圖3)。 如圖3a所展示，對於6種不同病毒而言，orf72轉錄物在感染之後4個不同時間之Ct值接近相同。理想地，所有6種病毒將在所探究時間下產生相同值且僅可看到一條線。接近相同之線證實實驗之充分品質，另外，p.i. (注射後) 12 h時間之結果係有效的，此乃因與注射後8 h相比之降低指示轉錄物數量之進一步增加，此僅可發生於複製尚未通過其最大值時。計算注射後每一時間之統計學平均值。將每一病毒在某一時間下之值除以針對該時間所計算之平均值且用作因子，使用該因子將mCherry qPCR之Ct值正規化以使其直接可比。mCherry qPCR之正規化Ct值以圖形發生展示於圖3b中之右圖中。線分散指示在不同病毒感染細胞中產生之mCherry轉錄物之數量之差異。 在不同類型之圖形中，組合兩個實驗(一個使用VERO-EU細胞(V)且一個使用PK/WRL細胞(P)) (圖4)。如上所述藉由使用及不使用逆轉錄酶進行逆轉錄、隨後使用orf72引子實施PCR來證實RNA製劑之品質及隨時間而變化之病毒複製。如上所述基於orf72之qPCR Ct值將針對mCherry所獲得之qPCR Ct值正規化。自t0之正規化Ct值扣除t1=注射後4h、t2=注射後8h及t3=注射後12h之正規化Ct值(Δ正規化Ct)，從而得到與轉錄活性之正關聯。 儘管不能直接比較VERO (V)或PK/WRL (P)細胞中之兩個實驗，但PK/WRL細胞中之較高表現程度最可能反映PK/WRL細胞對EHV-1複製之優良允許性，其通常產生10倍高之感染性病毒之效價。 儘管EHV源啟動子p430、p455及egGp之活性針對所用細胞系在各別注射後時間幾乎相同，且不論其插入位點或所用poly A (BGH或71pA)如何，CMV-及MCMV啟動子在PK/WRL細胞中之活性較高。在VERO-EU細胞中，僅MCMV啟動子展示具有較高活性，CMV啟動子並不優於EHV啟動子。 自該等實驗可推斷出，EHV-4啟動子p430及p455適用於EHV-1 RacH主鏈中以驅使表現來自orf1/3及orf70插入位點之插入轉基因。 實例3：
重組 EHV-1 載體疫苗中新穎 p455 啟動子之使用及重組病毒之構築
p455啟動子： 對於第一動物實驗而言，使用來自豬源流感A病毒(A/豬/Italy/7680/2001(H3N2)，基因庫登錄號ABS50302.2，SEQ ID NO:27)之流感血球凝集素亞型H3。合成其編碼序列並亞選殖至轉移載體pU70-p455-71K71 (圖5)中，從而生成轉移載體pU70-p455-H3-71K71，其中將H3置於新穎p455啟動子及新穎71pA多腺苷酸化信號之控制下且使用重組區構造盒以用於插入orf70中(圖6)。 藉由使用RED重組系統之進行中誘變(Tischer等人，2006)，將表現盒p455-H3-71插入pRacH-SE之orf70中以生成pRacH-SE70-p455-H3 (圖7)。 使用pRacH-SE70-p455-H3轉染PK/WRL細胞，使重組病毒rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3復活且進行斑塊純化兩次。藉由對插入區之高保真度PCR產物之測序來驗證表現盒之正確插入。藉由間接免疫螢光分析(IFA，圖8)分析轉基因在感染細胞中之表現。 使用單株抗體Ai2G7 (由BI擁有)，藉由IFA (未展示)及西方印漬(圖9)證實編碼EHV-1 gpII之orf71的恢復。藉由使用雞紅血球(未展示)之血細胞吸附測試分析感染細胞之質膜上之H3之三聚體的外觀。在PK/WRL細胞中以TCID
50
/ml測定之峰值效價與親代病毒rEHV-1 RacH-SE之效價在相同範圍內，此指示該轉基因表現對病毒複製沒有有害效應(未展示)。此係藉由使rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3在PK/WRL細胞中傳代直至復活後第20代(P20)來證實。在P5、P10、P15及P20，藉由滴定、測序及西方印漬(圖9)表徵病毒，在P10及P20，另外藉由IFA表徵病毒，且證實HA編碼插入物以及啟動子及聚A序列之HA表現及遺傳穩定性。 圖9中所展示之兩個印漬係與具體而言檢測EHV-1醣蛋白II (gpII)之單株抗體Ai2G7 (左)或與抵抗流感血球凝集素亞型H3之兔(PA5-34930)之商業多株抗體(右)一起培育的複製物。如所預計，在經重組EHV-1感染之所有細胞培養液中皆檢測到gpII。如所預計，在所有感染rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3之不同傳代之細胞中皆檢測到全長H3。H3-抗血清之特異性展示於相同西方印漬中，參見泳道gG430mC。如所預計，此處僅gpII細胞產生反應，而抗H3抗體在各別複製泳道中並不結合。 藉由使用單株抗H3抗體及馬抗EHV抗血清之經P20感染之細胞中之病毒斑塊之雙重免疫螢光分析(dIFA)，可證實實際上所有EHV-1誘導之斑塊皆亦表現H3 (未展示)。所有測試皆證實重組EHV-1 RacH-SE-70-p455-H3之穩定性。 實例4：
使用 p455 啟動子之概念驗證動物研究 (POC I) 及血清學反應之評價 ：
測試動物：納入準則及實驗設計： 將10隻天生流感A之仔豬(首次實驗之母豬)之五組包含於POC-I研究中，如表2中所概述。 表2
將1×10
7
TCID50之感染劑量之rEHV-1 RacH-70-p455-H3 (EHV-1)在5週齡施加一次或在2週齡及5週齡施加兩次。出於對比，將市售失活疫苗(Inact)在2週齡及5週齡施加兩次。為不消除失活疫苗(Inact)之效應，所有仔豬皆不含母源抗體。兩組未接種疫苗，但接受生理學氯化鈉溶液(NaCl)之注射，其分別用作攻毒對照或嚴格陰性對照。在第二接種疫苗之後21天，除嚴格陰性對照組外之所有組皆經1×10
7
TCID
50
之異源性流感A (IAV)株(來自豬R452-14之H3N2流感A病毒，由BI擁有之攻毒分離物)攻毒。儘管在未接種疫苗之攻毒對照組(Chall ctrl)中，所有豬在攻毒感染之後1天及3天皆在其肺中具有高流感病毒效價，但嚴格陰性對照組(neg ctrl)及經rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3接種疫苗兩次(EHV 2×)之組中的所有豬在此兩天中皆對IAV呈陰性。在失活對照疫苗(Inact 2×)接種疫苗兩次之組中，五隻動物中之一隻在攻毒之後第3天具有低IAV效價。在攻毒之前21天經rEHV-1 RacH-SE-70-455-H3接種疫苗一次(EHV 1×)之組中，五隻動物中之兩隻在攻毒感染之後1天且五隻中之一隻在攻毒之後3天在其肺中具有低IAV效價。(圖10)。 使用1× 10
7
TCID50之rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3接種疫苗兩次可完全保護豬免於異源性IAV、亞型H3N2之攻毒感染。其可證實EHV-1載體RacH-SE適於豬之疫苗接種，且新穎啟動子455在驅動疫苗接種之豬中之IAV血球凝集素之免疫原性表現中發揮作用。 實例5：
重組 EHV-1 載體疫苗中新穎 p430 啟動子之使用及重組病毒之構築
p430啟動子： 使用新鑑別p430啟動子來驅動表現來自H1N1病毒((A/豬/Gent/132/2005(H1N1)，基因庫登錄號：AFR76623.1，SEQ ID NO:28)之另一流感血球凝集素。由於此病毒分離物中之血球凝集素基因係來自「禽類」型IAV之豬IAV，故其將稱為H1av。合成H1av且亞選殖於orf1/3插入區之轉移載體pU1/3-p430-BGH_K_BGH中(圖11)以生成pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH。將H1av之表現置於p430啟動子及牛生長激素(BGH)聚A信號之控制下(圖12)。 藉由使用RED重組系統之進行中誘變(Tischer等人，2006)，將表現盒p430-H1av-BGH插入pRacH-SE之orf1/3中以生成pRacH-SE1/3-p430-H1av (圖13)。 使用pRacH-SE1/3-p430-H1av轉染PK/WRL細胞，使重組病毒rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av復活且進行斑塊純化兩次。藉由對插入區之高保真度PCR產物之測序來驗證表現盒之正確插入。藉由間接免疫螢光分析(IFA)及西方印漬使用市售單株及多株抗體分析轉基因在經感染細胞中之表現(圖14)。 使用單株抗體Ai2G7 (由BI擁有)，藉由IFA及西方印漬證實編碼EHV-1 gpII之orf71的恢復(未展示)。藉由使用雞紅血球(未展示)之血細胞吸附測試分析H1av之正確處理及轉運及經感染細胞之質膜中之定位。在PK/WRL細胞中以TCID
50
/ml測定之峰值效價與親代病毒RacH-SE之效價在相同範圍內，此指示該轉基因表現對病毒複製沒有有害效應(未展示)。 藉由抗體PA-34929在75 kDa遷移之寬帶之特異性檢測與自其序列預測之重組HA醣蛋白的預期外觀一致。經單株抗體C102之細胞膜表觀染色符合如所預計之亞細胞定位(圖14)。 為測試經表現重組血球凝集素是否如預計經處理及轉運，使用rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3、rEHV-1 RacH-SE (親代)以0.01之m.o.i.感染VERO細胞，或未經感染。在培育之前24 h，將活的經感染及未經感染之細胞與雞紅血球於PBS中之懸浮液一起培育，使用PBS洗滌並使用螢光Hoechst 33342核染色劑染色。因禽類紅血球含有細胞核，故可經Hoechst33342染色且藉由螢光顯微術表現為微小藍斑，與不表現血球凝集素之rEHV-1 RacH-SE感染之細胞相比，在rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av或rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3感染之細胞上，雞紅血球之吸附顯著增加(未展示)。自其可推斷出，將血球凝集素以如同其係藉由真正的流感病毒感染所產生一樣之方式轉譯、處理並轉運至載體病毒感染細胞之質膜上。 感染細胞之血細胞吸附之清晰表型支持西方印漬及免疫螢光分析之發現，從而展示轉基因蛋白之有效表現並表明在EHV-1載體感染細胞之細胞表面上形成功能性HA三聚體。 實例6：
兩種新穎啟動子 p455 及 p430 在重組 EHV-1 載體疫苗中於兩個插入位點中之平行使用
為展示兩種新穎啟動子可平行使用，生成表現兩種不同流感A病毒亞型之兩種不同血球凝集素之重組EHV-1 RacH。 藉由經單次插入病毒rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3及rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av感染之感染細胞之西方印漬驗證多株商業抗體對H3 (PA5-34930)及H1 (PA5-34929)之特異性及無交叉反應性(未展示)。 自重組BAC pRacH-SE-70-p455-H3開始，藉由兩步RED重組將組裝於轉移載體pU1/3-p430-H1av-BGHKBGH (圖12)中之表現盒p430-H1av-BGH插入orf1/3插入位點中以生成pRacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3。使用pRacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3轉染PK/WRL細胞，並使重組病毒rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3復活並進行斑塊純化兩次(圖15)。 此重組病毒之簡稱為rEHV-1 RacH-SE_B。藉由對插入區之高保真PCR產物與側接序列一起測序來驗證表現盒之正確插入。藉由間接免疫螢光分析(IFA，未展示)及西方印漬使用市售單株及多株抗體(圖16)分析轉基因在感染細胞中之表現。使用單株抗體Ai2G7 (由BI擁有)，藉由IFA (未展示)及西方印漬(圖16)證實編碼EHV-1 gpII之orf71的恢復。 如圖16中所展示，兩種轉基因H3及H1av在經雙重插入重組rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3感染之細胞培養液中平行表現。轉基因表現係穩定的且不損害在PK/WRL細胞中直到第11代測試之病毒效價(未展示)。 兩種新穎啟動子p430及p455在細胞培養液中之rEHV1-RacH複製之背景中展示功能性。病毒複製週期期間之活性程度似乎與自活體外啟動子動力學實驗所推斷非常相似。該等性質容許基於以類似效率平行表現兩種不同抗原之EHV-1 RacH或其他載體平臺來產生重組載體疫苗。若疫苗靶係由兩種不同病原體組成，則在與兩個多腺苷酸化序列組合之兩個插入位點中施加兩種新穎啟動子可顯著降低物品成本且明顯優於僅表現一種抗原性組分之載體。 實例7：
用於豬之單價 EHV-1 載體裝載之流感 A 病毒疫苗 (H3 疫苗 ) 之生成、活體外表徵及活體內測試
選擇血清型H3之豬IAV流感病毒血球凝集素(SEQ ID NO 27) (A/豬/Italy/7680/2001(H3N2)，基因庫登錄號：ABS50302.2)作為擬測試之抗原用於豬中之接種疫苗研究。此針對豬IAV之新穎疫苗提供DIVA特徵，例如藉由在由豬IAV野生株感染之動物中、而非僅經本文所闡述疫苗接種疫苗之動物中檢測到針對豬IAV蛋白NP或NA之抗體，此乃因其僅表現一種豬IAV HA蛋白。合成其編碼序列並亞選殖，從而生成轉移載體pU70-p455-H3-71K71，其中將H3置於新穎p455啟動子及新穎71pA多腺苷酸化信號之控制下並使用重組區構造盒以用於插入orf70中(圖1B)。 藉由使用RED重組系統之進行中誘變，將表現盒p455-H3-71插入pRacH-SE之orf70中以生成pRacH-SE70-p455-H3。 使用pRacH-SE70-p455-H3轉染PK/WRL細胞，使重組病毒rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3復活且進行斑塊純化兩次(圖7)。 藉由對插入區之高保真度PCR產物之測序來驗證表現盒之正確插入。藉由間接免疫螢光分析(IFA，圖8)及西方印漬(圖9)使用市售單株及多株抗體分析轉基因在感染細胞中之表現。 使用單株抗體Ai2G7 (由BI擁有)，藉由IFA (未展示)及西方印漬(圖9)證實編碼EHV-1 gpII之orf71的恢復。藉由使用雞紅血球(未展示)之血細胞吸附測試分析感染之質膜上之H3之三聚體的外觀。在PK/WRL細胞中以TCID
50
/ml測定之峰值效價與親代病毒RacH-SE之效價在相同範圍內，此指示該轉基因表現對病毒複製沒有有害效應(未展示)。此係藉由使rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3在PK/WRL細胞中傳代直至復活後第20代(P20)來證實。在P5、P10、P15及P20，藉由滴定、測序及西方印漬(圖9)表徵病毒，在P10及P20，另外藉由IFA表徵病毒，且證實HA編碼插入物以及啟動子及聚A序列之HA表現及遺傳穩定性。 圖9中所展示之兩個印漬係與具體而言檢測EHV-1醣蛋白II (gpII)之單株抗體Ai2G7 (左)或與抵抗流感血球凝集素亞型H3之兔(PA5-34930)之商業多株抗體(右)一起培育的複製物。如所預計，在經重組EHV-1感染之所有細胞培養液中皆檢測到gpII。如所預計，在所有感染rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3之不同傳代之細胞中皆檢測到全長H3。亦藉由經表現H1亞型病毒之流感血球凝集素之其他重組EHV-1 RacH-SE感染的細胞之西方印漬展示H3-抗血清之特異性，參見下文(圖16)。 藉由使用單株抗H3抗體及馬抗EHV抗血清之經P20感染之細胞中之病毒斑塊之雙重免疫螢光分析(dIFA)，可證實實際上所有EHV-1誘導之斑塊皆亦表現H3 (未展示)。所有測試皆證實重組EHV-1 RacH-SE-70-p455-H3之穩定性。 為探究rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3在幼小仔豬中作為載體疫苗之性質，在接種疫苗-攻毒研究中對其進行測試。詳細而言，在2及5週齡時(雙注射接種疫苗，2× EHV-1)或僅在5週齡時(單注射接種疫苗，1× EHV-1)使用含有1×10^7 TCID50之劑量之RacH-SE-70-p455-H3之細胞培養上清液對針對豬IAV無母源免疫性(非母源抗體)的仔豬進行兩次肌內接種疫苗。未接種疫苗之組用作陰性對照且在2及5週齡時根據製造商說明書(除接種疫苗之時間點)經市售失活豬IAV疫苗接種之一組動物用作陽性對照(死)。在8週齡時，藉由1×10^7 TCID50之氣管內施加劑量之H3N2豬IAV攻毒株(歐洲野生病毒分離物R452-14，其H3與RacH-SE-70-p455-H3中所用之H3疫苗抗原異源)攻毒除陰性對照外之所有動物。未疫苗接種且未經攻毒之動物用作陰性對照，而未疫苗接種但經攻毒之動物用作攻毒對照。在接種疫苗時及之後及在攻毒之前及之後，量測體溫並在不同時間點獲取血樣。在攻毒之後一天，每組之一半動物被殺死且針對豬IAV感染典型病灶對肺進行評分，每隻動物分別獲取每個左肺及右肺之三個肺試樣以測定肺均質物中之感染性豬IAV效價，且對支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行採樣。在攻毒之後3天，對每組之其餘一半動物實施相同程序。 在探究豬IAV攻毒病毒施加之後之體溫升高時，未疫苗接種之動物展示在攻毒之後1天約1℃之體溫升高。對於經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種疫苗兩次之組，防止攻毒後1天之此體溫增加(圖17)。 來自在豬IAV攻毒病毒施加之後1或3天殺死之動物之肺評分的評價揭示，陰性對照不展示豬IAV感染之典型肺病灶，攻毒對照展示在6-7%之平均範圍內之肺病灶，且就組平均值而言，對於經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種疫苗兩次之組而言，肺病灶評分顯著降低至1%至小於4% (圖18)。 來自在豬IAV攻毒病毒施加之後1或3天殺死之動物之平均豬IAV肺效價展示陰性對照在肺試樣中不展示豬IAV，而攻毒對照展示每g肺組織之病毒效價在超過5 log (第3天)至超過7 log (第1天)範圍內。形成鮮明對比的是，對於經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種疫苗一次之組，組平均值顯著降低至約2 log或更少，並且對於經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種疫苗兩次之組而言降低至不可檢測之含量(圖10)。 在測試接種疫苗之後豬IAV中和抗體之誘導時，在首次疫苗接種之後3週，經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種疫苗一次之動物之血清展示在約160範圍內之中和效價倒數，且在第2次接種疫苗之後3週，經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種疫苗兩次之動物之血清展示約2560之中和效價，而未疫苗接種之組之血清具有不可檢測之豬IAV中和抗體含量(圖19)。 在豬IAV攻毒之後1或3天測定來自動物之BALF中促發炎細胞介素IL-1β的量時，在第1天測試之四隻動物之三隻中可檢測到超過100 pg/ml至高達900 pg/ml之IL-1β含量，而對於經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種疫苗一次之動物之BALF而言，該等含量降低至100-300 pg/ml IL-1β，且對於經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種疫苗兩次之所有動物而言，甚至進一步降低至0 pg/ml至小於100 pg/ml IL-1β之含量(圖20)。此展示在豬IAV感染之後，經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種疫苗可有效防止促發炎細胞介素IL-1β之誘導。 在測試在研究第28天採樣並使用不同刺激之外周血單核細胞(PBMC)之再刺激時，未經接種疫苗之動物之PBMC之刺激在IFNγ-ELISpot中展示小於75/1×10^6計數，而與所用刺激無關(圖21 A)。已接受兩次失活疫苗(死)之動物之PBMC在經重組豬IAV核蛋白NP再刺激時展示約150/1×10^6計數，且在經豬IAV H3N2攻毒株R452-14再刺激時在IFNγ-ELISpot中展示約3000/1×10^6計數，但在使用重組豬IAV HA或EHV-1病毒時不展示PBMC之再刺激(含量為75/1×10^6計數或更低) (圖21 B)。與之相比，經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種疫苗一次或兩次之動物在經豬IAV H3N2攻毒株R452-14再刺激時亦在IFNγ-ELISpot中展示約200 (1× EHV-1)至300 (2× EHV-1)/1×10^6計數，但在使用重組豬IAV NP時不展示PBMC之再刺激(含量為75/1×10^6計數或更低) (圖21 C及D)。分別地，在使用EHV-1病毒進行再刺激時，經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種疫苗一次或兩次之動物在經空EHV-1疫苗RacH-SE再刺激時在IFNγ-ELISpot中展示約300/1×10^6計數，且在使用表現豬IAV H3之RacH-SE-70-p455-H3疫苗時，此值進一步增加至超過400/1×10^6計數(圖21 C及D)。因此，在使用重組豬IAV HA進行再刺激時，僅經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種疫苗一次或兩次之動物在IFNγ-ELISpot中展示約100-150 (1×EHV-1)至150-200 (2× EHV-1)/1×10^6計數(圖21 C及D)。 實例8
用於豬之四價 EHV-1 載體裝載之流感 A 病毒疫苗之生成、活體外表徵及活體內測試
如下文所述，在所闡述發明中，源自H1N2、H3N2、H1N1禽類及H1N1大流行豬IAV亞型/血清型之四種上述豬IAV血球凝集素(HA)抗原由兩種重組EHV-1載體病毒表現。此針對豬IAV之新穎四價疫苗提供DIVA特徵，例如藉由在由豬IAV野生株感染之動物中、而非僅經本文所闡述疫苗接種疫苗之動物中檢測到針對豬IAV蛋白NP或NA之抗體，此乃因其僅表現豬IAV HA蛋白。 在活體外表徵新穎四價豬IAV疫苗且在活體內測試其針對豬IAV之效能。 使用新鑑別p430啟動子來驅動豬IAV H1N1 ((A/豬/Gent/132/2005(H1N1)，基因庫登錄號：AFR76623.1)之表現。由於此病毒分離物中之血球凝集素係源自禽類IAV，故其將稱為H1av。合成H1av並將其亞選殖至轉移載體中用於orf1/3插入區以生成pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH。將H1av之表現置於p430啟動子及牛生長激素(BGH)多A信號之控制下並使用重組區構造以用於插入orf1/3中(圖12)。 藉由使用RED重組系統之進行中誘變，將表現盒p430-H1av-BGH插入pRacH-SE之orf1/3中以生成pRacH-SE1/3-p430-H1av。使用pRacH-SE1/3-p430-H1av轉染PK/WRL細胞，使重組病毒rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av (圖13)復活且進行斑塊純化兩次。藉由對插入區之高保真度PCR產物之測序來驗證表現盒之正確插入。藉由間接免疫螢光分析(IFA)及西方印漬使用市售單株及多株抗體分析轉基因在經感染細胞中之表現(圖14)。使用單株抗體Ai2G7 (由BI擁有)，藉由IFA及西方印漬證實編碼EHV-1 gpII之orf71的恢復(未展示)。藉由使用雞紅血球(未展示)之血細胞吸附測試分析H1av之正確處理及轉運及感染細胞之質膜中之定位。在PK/WRL細胞中以TCID
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/ml測定之峰值效價與親代病毒RacH-SE之效價在相同範圍內，此指示該轉基因表現對病毒複製沒有有害效應(未展示)。 藉由抗體PA-34929在75 kDa遷移之寬帶之特異性檢測與自其序列預測之重組HA醣蛋白的預期外觀一致。經單株抗體C102之細胞膜表觀染色符合如所預計之亞細胞定位。 為測試經表現重組血球凝集素是否如預計經處理及轉運，使用rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3、rEHV-1 RacH-SE (親代)以0.01之m.o.i.感染VERO細胞，或未經感染。在培育之前24 h，將活的經感染及未經感染之細胞與雞紅血球於PBS中之懸浮液一起培育，使用PBS洗滌並使用螢光Hoechst 33342核染色劑染色。因禽類紅血球含有細胞核，故可經Hoechst 33342染色且藉由螢光顯微術表現為微小藍斑，與不表現血球凝集素之rEHV-1 RacH-SE感染之細胞相比，在rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av或rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3感染之細胞上，雞紅血球之吸附顯著增加(未展示)。由此可推斷出，將血球凝集素以如同其係藉由真正流感病毒複製所產生一樣之方式轉譯、處理並轉運至載體病毒感染細胞之質膜上。感染細胞之血細胞吸附之表型支持西方印漬及免疫螢光分析(對於H1av，圖14)之發現，從而展示轉基因蛋白之有效表現並表明在EHV-1載體感染細胞之細胞表面上形成功能性HA三聚體。 藉由經單次插入病毒rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3及rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av感染之感染細胞之西方印漬驗證多株商業抗體對H3 (PA5-34930)及H1 (PA5-34929)之特異性及無交叉反應性(未展示)。 接下來，生成表現兩種不同流感A病毒亞型/血清型之兩種不同血球凝集素的重組EHV-1 RacH-SE。 以重組BAC pRacH-SE-70-p455-H3開始，藉由兩步RED重組將組裝於轉移載體pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH (圖12)中之表現盒p430-H1av-BGH插入orf1/3插入位點中以生成pRacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3。使用pRacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3轉染PK/WRL細胞，並使重組病毒rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3復活並進行斑塊純化兩次。此重組病毒之簡稱為
rEHV-1 RacH-SE_B
(圖15)。藉由對插入區之高保真PCR產物與側接序列一起測序來驗證表現盒之正確插入。 藉由間接免疫螢光分析(IFA，未展示)及西方印漬使用市售單株及多株抗體(圖16)分析轉基因在感染細胞中之表現。使用單株抗體Ai2G7 (由BI擁有)，藉由IFA (未展示)及西方印漬(圖16)證實編碼EHV-1 gpII之orf71的恢復。 兩種轉基因H3及H1av在經雙重插入重組rEHV-1 RacH-SE_B感染之細胞培養液中平行表現。轉基因表現係穩定的且不損害在PK/WRL細胞中直到第11代測試之病毒效價。 具有兩個插入位點及兩個新穎啟動子之增強之EHV-1載體展示平行表現兩種流感病毒血球凝集素。如藉由IFA測定之亞細胞定位及如藉由西方印漬測定之SDS-PAGE中之遷移率對應於自文獻已知之流感A病毒感染細胞中表現之真正的血球凝集素。 接下來，生成表現血球凝集素H1hu (SEQ ID NO:29，A/豬/Italy/4675/2003(H1N2)；基因庫登錄號ADK98476.1))及H1pdm (SEQ ID NO:26，A/豬/Italy/116114/2010(H1N2)；基因庫登錄號ADR01746.1)之第二雙重插入rEHV-1 RacH。 合成H1hu之編碼序列並亞選殖至轉移載體中用於orf1/3插入區以生成pU1/3-p430-H1hu-BGHKBGH。將H1hu之表現置於p430啟動子及牛生長激素(BGH)聚A信號之控制下並使用重組區構造以用於插入orf1/3中(圖22)。 合成H1pdm之編碼序列並亞選殖，從而生成轉移載體pU70-p455-H1pdm-71K71，其中將H1pdm置於新穎p455啟動子及新穎71pA多腺苷酸化信號之控制下並使用重組區構造盒以用於插入orf70中(圖23)。 隨後，藉由使用RED重組系統之進行中誘變將表現盒p430-H1av-BGH及p455-H1pdm-71插入pRacH-SE中，從而首先生成pRacH-SE-1/3-p430-H1hu。使用此經修飾之BAC作為靶，藉由使用RED重組系統之進行中誘變插入p455-H1pdm-71，從而生成pRacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm。在PK/WRL細胞中轉染pRacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm並使rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm復活並進行斑塊純化三次。新穎重組載體病毒之簡稱為rEHV-1 RacH-SE_D (圖24)。 藉由間接免疫螢光分析(IFA，未展示)及西方印漬使用市售單株及多株抗體(圖25)分析轉基因在感染細胞中之表現。使用單株抗體Ai2G7 (由BI擁有)，藉由IFA (未展示)及西方印漬(圖25)證實編碼EHV-1 gpII之orf71的恢復。 藉由在細胞培養液中傳代、每5代測定病毒效價來展示重組rEHV-1之遺傳及表型穩定性。每10代證實插入區之序列，且藉由西方墨點法(未展示)證實轉基因表現。藉由在覆蓋下斑塊之雙重IFA、對經抗EHV-抗體及轉基因特異性抗體染色之斑塊進行計數來評價表現保真度(未展示)。 為探究由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗在幼小仔豬中作為載體疫苗之性質，在疫苗接種-攻毒研究中對其進行測試。詳細而言，在1及4週齡時(雙注射接種疫苗，2× EHV-1)或在僅4週齡時(單注射接種疫苗，1× EHV-1)使用每個疫苗株1×10^7 TCID50之劑量之rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D對針對豬IAV具有母源免疫性(對母源抗體呈陽性)之仔豬進行兩次肌內接種疫苗。未疫苗接種組用作陰性對照。在11週齡時，藉由1×10^6 TCID50之氣管內施加劑量之H3N2豬IAV攻毒株(歐洲野生病毒分離株R452-14，其H3與rEHV-1 RacH-SE_B中所用之H3疫苗抗原異源)攻毒除陰性對照外之所有動物。未疫苗接種且未經攻毒之動物用作陰性對照，而未疫苗接種但經攻毒之動物用作攻毒對照。在接種疫苗時及之後及在攻毒之前及之後，量測體溫並在不同時間點獲取血樣。在攻毒之後一天，每組之一半動物被殺死且針對豬IAV感染典型病灶對肺進行評分，每隻動物分別獲取每個左肺及右肺之三個肺試樣以測定肺均質物中之感染性豬IAV效價，且對支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行採樣。在攻毒之後3天，對每組之其餘一半動物實施相同程序。分析試樣物質及收集之數據以尤其測定攻毒之後之體溫變化、豬IAV感染之後之臨床徵象、肺評分、豬IAV肺效價、肺組織之組織學變化、豬IAV血清中和效價、BALF中之細胞介素含量、如藉由IFNγ-ELISpot所量測之PBMCS之再刺激以及B細胞活化。 實例9 經二價rEHV-1 RacH載體疫苗接種疫苗之小鼠中針對兩種抗原之中和抗體反應的誘導 使用rEHV-1 RacH SE B (rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-7-p455-H3，參見圖15)來對Balb/c小鼠實施免疫以證實，經表現轉基因在除豬外之另一物種中具有免疫原性且藉由鼻內施加針對兩種抗原中之一者誘導中和抗體。 詳細而言，在研究第0及21天向三組3-5週齡之Balb/c小鼠(每組5隻)分別經鼻內接種40 µl rEHV-1 RacH SE B (rEHV-1 RacH-SE-1/3-430-H1av-7-455-H3，組1)或40 µl空載體(rEHV-1 RacH-SE，組2，載體對照)或40 µl組織培養基(組3，陰性對照)。對於組1及組2而言，感染性重組EHV-1劑量分別為1× 10^5 TCID50/40 µl。在研究第0天(在首次接種之前)、第7、14、21天(在第2次接種之前)、第28天及第35天將小鼠放血。自血樣製備血清並於-80℃下冷凍儲存。
用於檢測針對載體病毒之抗體之免疫螢光分析
將AI-ST細胞以0.001之感染複數(MOI)使用rEHV-1 RacH-SE1212 (一種自空載體BAC pRacH-SE1.2復活之病毒)感染。在培育之前24小時，觀察到特異性斑塊且對細胞進行處理用於間接免疫螢光分析(IFA)。測試在PBS中1:50稀釋之所有三組最終出血(在第二接種疫苗之後14天獲得)的血清。作為陽性對照，經EHV-1接種疫苗之馬之血清係以1:500之稀釋度使用。二級抗體對於小鼠血清係市售FITC偶聯之兔抗小鼠IgG且對於馬血清係Cy5偶聯之山羊-抗馬IgG且係以1:200稀釋度使用。藉由螢光顯微術評估抗體結合。所有經接種疫苗之小鼠皆在IFA中利用rEHV-1 RacH-SE感染之細胞發生抗體反應性。未感染細胞不由任何測試血清結合。來自小鼠之陰性對照組之血清不展示針對經感染細胞或未感染細胞之任何特異性結合。數據概述於下表中。 表3.抗EHV-1抗體之IFA之螢光顯微術結果
自此可推斷出，將rEHV-1接種至小鼠之鼻孔中導致感染及病毒複製，從而刺激小鼠免疫系統以產生抗EHV-1抗體。
病毒中和測試
為展示針對源自流感A病毒(IAV) (A/豬/Italy/7680/2001(H3N2))或(A/豬/Gent/132/2005(H1N1))之表現之轉基因之保護性免疫性的誘導，測試小鼠血清針對各別病毒之中和活性(Allwinn等人，2010；Trombetta等人，2014)。用於中和測試之IAV係來自2014年德國之豬之分離物，具體而言係A/豬/Germany/AR452/2014 (H3N2)及A/豬/Germany/AR1181/2014 (H1N1)。因該等分離株與疫苗靶源自之株異源，故該等病毒由小鼠血清之任何中和將指示藉由rEHV-1接種疫苗廣泛且有效地誘導保護性免疫。作為陰性對照血清，使用已展示對流感病毒抗體呈陰性之豬的血清。
流感 A 病毒中和測試 (VNT) ：
在使用之前，將用於病毒中和以及反滴定之MDCK細胞在96孔板中於37℃/5%CO
2
下培育2天。將各別IAV儲備液H3N2及H1avN1在冰上解凍並稀釋於含有慶大黴素(Gentamycin)及雙倍濃度之胰蛋白酶(MEM/Genta/2×胰蛋白酶)之MEM中。 所測試血清係來自組1 (rEHV-1 RacH SE
B
)、組2(空載體)、陽性對照(經失活多價IAV疫苗接種疫苗之豬之血清)及陰性對照之最終出血。 將血清熱滅活，且分別在兩個及三個獨立試驗中1:2連續稀釋，以1:16開始直至1:4096。將IAV稀釋至約100 TCID50/中和反應。將中和反應液在37℃、5% CO
2
下培育2小時。所用病毒之反滴定係一式四份進行。去除生長培養基，且然後使用含有慶大黴素及胰蛋白酶之培養基洗滌MDCK細胞，然後添加中和反應液或反滴定之病毒稀釋液。在分別向MDCK-細胞添加中和反應液或病毒稀釋液之後，將VNT及滴定板在37℃ /5% CO2下培育1 h。然後，取出接種物並使用含有慶大黴素及胰蛋白酶之新鮮培養基覆蓋細胞。在培育之後5天，監測並記載CPE。根據Reed及Münch將測試中實際使用之病毒效價計算為TCID50/ml，且報告測試血清防止流感病毒典型CPE之誘導之稀釋度，參見下表。 表4：流感H1avN1 VNT之結果
表5：流感H3N2 VNT之結果
為比較獨立測試之結果，藉由將血清稀釋度倒數乘以由其中和之各別效價來計算中和能力。然後將三個測試之平均值除以100以反映100 TCID50之中和(表3、4及5)。數據概述且以圖解方式展示於圖26中。 所有經rEHV-1 RacH SE
B
接種疫苗之小鼠皆針對各別IAV (亦即亞型H3N2及H1avN1之異源性株)產生中和抗體。因此，在p455啟動子(H3)控制下自orf70插入位點及在p430啟動子(H1av)控制下自orf1/3插入位點平行表現IAV之血球凝集素之rEHV-1 RacH-SE的兩倍鼻內施加成功地刺激BALB/c小鼠中之保護性免疫反應。 可推斷出，載體rEHV-1 RacH-SE可用於兩種不同轉基因之平行表現以刺激鼻內接種疫苗後之免疫反應。 實例10
仔豬中針對豬 IAV H3N2 攻毒之由 rEHV-1 RacH-SE_B 及 rEHV-1 RacH-SE_D 組成之四價豬 IAV 疫苗的效能
為探究由rEHV-1 RacH-SE_B (rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3，參見圖15)及rEHV-1 RacH-SE_D (rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm，參見圖24)組成之四價豬IAV疫苗在幼小仔豬中作為載體疫苗之性質，在第二接種疫苗-攻擊攻毒研究中對其進行測試。 在此第二研究中，將來自未接種疫苗之母豬及在首次接種疫苗時藉由使用H3特異性ELISA (圖30)及藉由病毒中和測試(數據未展示)經血清學測試對於豬IAV特異性抗體呈陰性的仔豬使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價疫苗接種疫苗兩次。分別在生命之第一週(研究第0天，SD0)對動物進行首次接種疫苗且在其生命之第4週(研究第21天，SD21)進行第二次接種疫苗，其中以肌內方式且然後以肌內方式進行(2× IM)，或首先以鼻內方式且然後以肌內方式進行(IN+IM)，或以鼻內方式進行兩次(2× IN)，劑量為1×10^7 TCID50，每一疫苗株、動物及疫苗接種分別使用2 ml劑量。一未接種疫苗之組用作陰性對照且另一未接種疫苗之組用作攻毒對照。在生命之第7週(研究第69或70天，SD42/43)，藉由2×10^7 TCID50之氣管內施加劑量之H3N2豬IAV攻毒株(歐洲野生病毒分離物R452-14，其H3與rEHV-1 RacH-SE_B中所用之H3疫苗抗原異源)攻毒除陰性對照外之所有動物。未接種疫苗且未經攻毒之動物用作陰性對照(neg. ctrl.)，而未接種疫苗但經攻毒之動物用作攻毒對照(chall. ctrl.)。在疫苗接種時及之後以及攻毒之前，在不同時間點獲取血樣。 在攻毒之後1天，將每組之一半動物殺死，且每隻動物分別取每個左肺及每個右肺之三個肺試樣。然後，以每一動物之左肺及右肺之平均值測定每一動物之每克肺均質物之感染性豬IAV效價，該等效價各自係自每一左肺或右肺之所彙集三個試樣之均質物獲得且分別針對左肺或右肺之三個試樣之總重量正規化。在攻毒之後3天，對每組之其餘一半動物實施相同程序。對於所有接種疫苗之組而言，與攻毒對照組相比，對於在攻毒之後第1天(CH+1)獲取之試樣而言，自組中之個別動物獲得之感染性豬IAV之效價的中值在統計學上顯著降低，而來自陰性對照組之所有動物在其肺均質物中皆不展示感染性豬IAV病毒效價(圖27)。此外，對於所有接種疫苗之組而言，與攻毒對照組相比，對於在攻毒之後第3天(CH+3)獲取之試樣而言，自組中之個別動物獲得之感染性豬IAV之效價的中值在統計學上顯著降低，而來自陰性對照組之所有動物在其肺均質物中皆不展示感染性豬IAV病毒效價(圖28)。因此，分別在仔豬中經異源豬IAV H3N2株攻毒之後1天及3天，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗接種疫苗在統計學上顯著降低豬IAV肺負荷。因此，本文所闡述之疫苗針對豬中之豬IAV有效。 此外，藉由針對與由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之H3同源之重組表現之豬IAV H3抗原的豬免疫球蛋白G (IgG)特異性酶聯免疫吸附分析(ELISA)分析在研究第0天(SD0，在首次疫苗接種之前)、在研究第21天(SD21，在第二接種疫苗之前)及在研究第42或43天(SD42/43，在施加攻毒材料之前)自研究動物獲取之血清。儘管來自陰性對照組之血清之平均OD值於所有量測之時間點僅給出極低之值，但在兩次肌內施加(2× IM；SD21及SD42/43)之後、首先鼻內施加且然後肌內施加(IN+IM；SD42/43)之後及兩次鼻內施加(2× IN；SD42/43)之後，來自接種疫苗組之血清展現OD值強烈增加；圖30。因此，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗接種疫苗分別引發仔豬中針對由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之豬IAV血球凝集素H3的血清學免疫反應。 另外，自研究第28天(SD28)開始自研究動物獲取之血液純化外周血單核細胞(PBMC)。然後使用H3N2豬IAV攻毒株R452-14以1之感染複數(H3N2 MOI 1)再刺激PBMC，或使用與由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之H3同源之重組表現之豬IAV H3抗原以1µg/ml (rH3 1µg/ml)之濃度再刺激。使用再刺激之PBMC，實施干擾素γ特異性酶聯免疫吸附斑點分析(IFNγ ELISpot)，且將所獲得值分別正規化至10
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6個細胞並計算為每組之平均值(圖32)。儘管來自攻毒對照組之再刺激之PBMC (用作此測試之陰性對照，動物未接種疫苗)展示在任一再刺激之後，每組之平均斑點低於45，但在任一再刺激之後，分別地，在兩次肌內施加之後來自接種疫苗之動物之再刺激之PBMC展示每組之平均斑點高於85，首先鼻內施加且然後肌內施加(IN+IM)之後超過100個斑點，且在兩次鼻內施加(2× IN)之後超過150個斑點(圖32)。因此，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗接種疫苗在仔豬中分別針對由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之豬IAV血球凝集素H3及針對用於異源攻毒病毒感染之豬IAV H3N2 R452-14引發細胞免疫反應。 因此，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗對仔豬接種疫苗在仔豬中誘導可檢測之血清學及細胞免疫反應，且藉由在統計學上顯著降低在異源豬IAV攻毒之後1天及3天之肺均質物中之豬IAV負荷展現疫苗效能。 實例11
具有母源抗體之仔豬中針對豬 IAV H3N2 攻毒之由 rEHV-1 RacH-SE_B 及 rEHV-1 RacH-SE_D 組成之四價豬 IAV 疫苗的效能
為研究由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗在幼小仔豬中作為載體疫苗之性質，在第三疫苗接種-攻毒研究中對其進行測試。 在此第三研究中，使用由母豬生產並由母豬初乳及乳液餵養之仔豬，該等母豬在懷孕期間使用針對豬IAV之市售失活疫苗接種疫苗兩次。在首次接種疫苗時，藉由使用H3特異性ELISA (圖31)及藉由使用市售豬IAV特異性抗體ELISA (
IDEXX Influenza A (Virus Antibody Test) ®
; IDEXX, Westbrook, Maine 04092, USA)遵循製造商之測試建議(數據未展示)，仔豬經血清學測試對於豬IAV特異性抗體呈陰性，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價疫苗對其接種疫苗兩次。分別在生命之第一週(研究第0天，SD0)對動物進行首次接種疫苗且在其生命之第4週(研究第21天，SD21)進行第二次接種疫苗，其中以肌內方式且然後以肌內方式進行(2× IM)，或首先以鼻內方式且然後以肌內方式進行(IN+IM)，或以鼻內進行兩次(2× IN)，劑量為1×10^7 TCID50，每個疫苗株、動物及疫苗接種分別使用2 ml劑量。未接種疫苗之組用作陰性對照且另一經接種疫苗之組用作攻毒對照。在生命之第11週(研究第69或70天，SD69/70)，藉由2×10^7 TCID50之氣管內施加劑量之H3N2豬IAV攻毒株(歐洲野生病毒分離物R452-14，其H3與rEHV-1 RacH-SE_B中所用之H3疫苗抗原異源)攻毒除陰性對照外之所有動物。未接種疫苗且未經攻毒之動物用作陰性對照(neg. ctrl.)，而未接種疫苗但經攻毒之動物用作攻毒對照(chall. ctrl.)。在疫苗接種時及之後以及攻毒之前，在不同時間點獲取血樣。 在攻毒之後5天，殺死動物，且每隻動物分別取每個左肺及每個右肺之三個肺試樣。然後，以每隻動物之左肺及右肺之平均值測定每一動物之每克肺均質物之感染性豬IAV效價，該等效價各自係自每個左肺或右肺之所彙集三個試樣之均質物獲得且分別針對左肺或右肺之三個試樣之總重量正規化。對於所有接種疫苗之組而言，與攻毒對照組相比，對於在攻毒之後第5天(CH+5)獲取之試樣而言，自組中之個別動物獲得之感染性豬IAV之效價的中值在統計學上顯著降低，而來自陰性對照組之所有動物在其肺均質物中皆不展示感染性豬IAV病毒效價(圖29)。因此，分別在仔豬中經異源豬IAV H3N2株攻毒之後5天，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗接種疫苗在統計學上顯著降低豬IAV肺負荷。因此，本文所闡述之疫苗針對豬中之豬IAV有效。 此外，藉由針對與由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之H3同源之重組表現之豬IAV H3抗原的豬免疫球蛋白G (IgG)特異性酶聯免疫吸附分析(ELISA)分析在研究第0天(SD0，在首次疫苗接種之前)、在研究第21天(SD21，在第二疫苗接種之前)及在研究第35天(SD35，在第二疫苗接種之後2週)自研究動物獲取之血清。儘管來自陰性對照組之血清之平均OD值對於SD21及SD35僅給出極低之值，但在兩次肌內施加(2× IM；SD35)之後、首先鼻內施加且然後肌內施加(IN+IM；SD35)之後及兩次鼻內施加(2× IN；SD35)之後，來自接種疫苗組之血清展現OD值強烈增加；圖31。因此，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗接種疫苗分別引發仔豬中針對由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之豬IAV血球凝集素H3的血清學免疫反應。 另外，自研究第28天(SD28)開始自研究動物獲取之血液純化外周血單核細胞(PBMC)。然後使用H3N2豬IAV攻毒株R452-14以1之感染複數(H3N2 MOI 1)再刺激PBMC，或使用與由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之H3同源之重組表現之豬IAV H3抗原以1µg/ml (rH3 1µg/ml)之濃度再刺激。使用再刺激之PBMC，實施干擾素γ特異性酶聯免疫吸附斑點分析(IFNγ ELISpot)，且將所獲得值分別正規化至10
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6個細胞並計算為每組之平均值(圖33)。儘管來自攻毒對照組之再刺激之PBMC (用作此測試之陰性對照，動物未接種疫苗)展示在任一再刺激之後，每組之平均斑點低於15，但在任一再刺激之後，分別地，在兩次肌內施加之後來自接種疫苗之動物之再刺激之PBMC展示每組之平均斑點高於30，首先鼻內施加且然後肌內施加(IN+IM)之後超過55個斑點，且在兩次鼻內施加(2× IN)之後超過65個斑點(圖33)。因此，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗接種疫苗在仔豬中分別針對由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之豬IAV血球凝集素H3及針對用於異源攻毒病毒感染之豬IAV H3N2 R452-14引發細胞免疫反應。 因此，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗對仔豬接種疫苗在仔豬中誘導可檢測之血清學及細胞免疫反應，且藉由在統計學上顯著降低在異源豬IAV攻毒之後5天之肺均質物中之豬IAV負荷展現疫苗效能。 實例12
由 rEHV-1 RacH-SE_B 及 rEHV-1 RacH-SE_D 組成之四價豬 IAV 疫苗基於 IAV 核蛋白 (NP) 特異性抗體來診斷性區分經感染動物與經接種疫苗動物 (DIVA) 之特徵
為評價由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗之血清學DIVA性質，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價疫苗對由母豬(在懷孕期間使用針對豬IAV之市售失活疫苗接種疫苗兩次)生產並由母豬初乳及乳液餵養之仔豬接種疫苗兩次。分別在生命之第一週對動物進行首次接種疫苗且在其生命之第4週進行第二次接種疫苗，其中以肌內方式且然後以肌內方式進行(2× IM)，或首先以鼻內方式且然後以肌內方式進行(IN+IM)，或以鼻內方式進行兩次(2× IN)，劑量為1×10^7 TCID50，每一疫苗株、動物及疫苗接種分別使用2 ml劑量。未接種疫苗組用作陰性對照(neg. ctrl.)。對於2× IM、IN+IM、2× IN及neg. ctrl.組而言，每組使用5隻動物且分別在第一接種疫苗之前(圖34，在接種疫苗之前)及在第二接種疫苗之後14天(圖34，在接種疫苗之後)獲取血清試樣。作為陽性對照，使用針對豬IAV之市售失活含IAV疫苗(pos. ctrl.)對來自在第一接種疫苗時間點之前針對IAV特異性抗體測試為陰性(數據未展示及圖34，在接種疫苗之前)之未接種疫苗母豬的兩頭仔豬接種疫苗兩次。分別在生命之第二週首次對pos. ctrl.仔豬接種疫苗且在其生命之第五週第二次接種疫苗，且分別在第一接種疫苗之前(圖34，在接種疫苗之前)及在第二接種疫苗之後22天(圖34，在接種疫苗之後)獲取血清試樣。 在檢測豬IAV核蛋白(NP)特異性IgG之ELISA中測試上述血清(圖34)。來自經接種疫苗母豬(neg. ctrl.、2× IM、IN+IM、2× IN組)之仔豬之血清試樣皆展示每組在接種疫苗之前之平均OD值為0.7或更高，由此證實在該等未接種疫苗之動物中存在母源IAV NP特異性抗體(圖34)。與之相比，在接種疫苗之前來自pos. ctrl.組之仔豬血清之平均組值低於0.15在，從而不存在/存在極低濃度之IAV NP特異性抗體。在使用市售失活含NP豬IAV疫苗進行第二接種疫苗之後22天(圖34，在接種疫苗之後)，來自pos. ctrl.組之血清之平均組值增加至大於1.9，由此證實在仔豬中強烈誘導可檢測豬IAV NP特異性IgG。與之相比，在使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗(其不含或不表現豬IAV NP)接種疫苗之後14天，來自2× IM、IN+IM、2× IN組亦及來自未接種疫苗neg. ctrl.組之仔豬之血清試樣分別展示每組之平均OD值低於0.15，由此證實在接種疫苗之前存在之IAV NP特異性抗體濃度下降至極低濃度且接種疫苗並不使得在仔豬中強烈誘導可檢測豬IAV NP特異性IgG。總而言之，儘管習用含NP失活豬IAV疫苗使得在經接種疫苗之仔豬中強烈誘導可檢測NP特異性抗體，但使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗接種疫苗並不誘導在經接種疫苗之仔豬中強烈誘導可檢測NP特異性抗體。 由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗並不誘導在經接種疫苗仔豬中強烈誘導可檢測NP特異性抗體之事實證實了容許區分經感染動物與經接種疫苗動物(DIVA)且區分經接種疫苗動物與使用習用含NP失活豬IAV疫苗接種疫苗之動物的血清學診斷標記物。 此DIVA特徵可用於伴隨使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗之商業測試研發且用以支持針對豬IAV之根除措施。 根據本發明，本文中所揭示及所主張之所有組合物及方法皆可在無需過度實驗之情形下進行及執行。儘管本發明之組合物及方法已根據較佳實施例予以闡述，但熟習此項技術者應明瞭，可改變該等組合物及方法及本文所闡述方法之步驟或步驟順序，此並不背離本發明之概念、精神及範圍。更具體而言，應明瞭，某些在化學及生理上皆相關之試劑可代替本文所闡述試劑且同時可達成相同或類似結果。熟習此項技術者顯而易見之所有該等類似代替物及修改皆被視為涵蓋於由隨附申請專利範圍所界定之本發明精神、範圍及概念內。 參考文獻 就提供補充本文所陳述內容之實例性程序或其他細節而言，下列參考文獻以引用方式具體併入本文中。 1. Allwinn R, Geiler J, Berger A, Cinatl J, Doerr HW.
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