KR102566066B1 - 신규한 돼지 인플루엔자 백신 - Google Patents

신규한 돼지 인플루엔자 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 적어도 하나 (적어도 2개)의 외인성 항원 인코딩 서열, 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 삽입되는 삽입 부위 (바람직하게는 ORF70) 및 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 작동가능하게 연결되는 프로모터 서열 [바람직하게는 4pgG600 (서열번호 1) 또는 4pMCP600 (서열번호 2)을 포함하는 프로모터 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열]을 포함하는 EHV 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물을 식용 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 식용 동물을 면역화시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 돼지 인플루엔자 바이러스로 유발된 임상 증상의 치료 또는 예방을 필요로 하는 식용 동물에서 상기 임상 증상을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 돼지 인플루엔자 백신
서열 목록
본 출원은 37 C.F.R. 1.821 - 1.825에 따른 서열 목록을 포함한다. 본 출원에 첨부된 서열 목록은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 (벡터) 백신 분야, 특히 이러한 벡터 백신의 표적 항원을 발현하기에 적절한 삽입 부위 및 프로모터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 백신에 대한 것이다.
EHV 벡터 시스템
말 병원체인 말 알파헤르페스바이러스(Equid Alphaherpesvirus) 1 (말 유산 바이러스, EHV-1)는 헤르페스바이러스목 (Herpesvirales)의 헤르페스바이러스과 (Herpesviridae)의 알파헤르페스바이러스아과 (Alphaherpesvirinae)의 바리셀라바이러스(Varicellovirus) 속에 속한다. 이는 약 150,000개의 염기쌍의 이중 가닥 DNA 유전체를 갖는 거대한 외피보유 바이러스(enveloped virus)이다. 상기 바리셀라바이러스 아속의 다른 중요한 구성원으로는 인간 헤르페스바이러스 3 (바리셀라 조스터 바이러스), 수이드 헤르페스바이러스 1 (가성광견병 바이러스), 소 헤르페스바이러스 1 (전염성 기관지염 바이러스) 및 말 헤르페스 바이러스 4 (말 비강폐렴 바이러스, EHV-4)를 들 수 있다 (http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30). EHV-1과 EHV-4는 고질적인 것으로 전세계적으로 말에 악영향을 미치고 있다. EHV-4는 대부분 상기도에서 경미한 감염을 초래하는 반면, EHV-1은 균주와 숙주의 면역학적 상태에 따라 호흡기 증상에서부터 유산 및 치명적인 척수뇌병증에 이르기까지 다양한 질병의 전신성 감염을 야기한다. EHV-1에 대하여 허가된 2개의 변형 생독(modified live) 백신 (MLV)인 라이노뮨(Rhinomune™, 베링거 인겔하임)과 프레바시놀(Prevaccinol™, MSD)은 현재 미국과 유럽에서 각각 이용가능하다. 두 백신 모두 약독화를 위해 돼지 상피 세포에서 256번 계대배양시킨, 고전적 방식으로 약독화된 EHV-1 RacH 균주를 포함한다 (Ma et al. 2013). 약독화 기전은 분자 수준에 대하여 연구된 바 있다. 오스테리더(Osterrieder) 등 (1996)은 RacH가 orf67의 2개의 유전체 복제물을 결핍하고 있음과 한 복제물의 복원이 병독성을 회복시키기에 충분하다는 것을 밝혀냈다. 또한, RacH는 면역억제성 바이러스 단백질을 인코딩하는 orf1 코딩 서열의 90% 이상을 제거하는 1283 bp의 결실을 보유하고 있다. 다른 돌연변이들도 약독화에 영향을 미칠 수 있지만, 아직까지는 상세히 연구되지 않았다. 백신을 접종받은 동물에서의 계대배양에 의한 병독성으로의 복귀는 가능하기는 하지만 거의 가능성이 없기 때문에, 상기 모든 절차들은 RacH를 매우 안전한 백신 균주로 만든다.
말 헤르페스 바이러스 1 (EHV-1) 백신 균주 RacH (pRacH-SE)의 전체 유전체를 함유하는 이.콜라이(E.coli) 박테리아성 인공 염색체 (BAC)가 벡터 백신 개발을 위한 플랫폼으로 공지되어 있다. EHV-1 RacH 기반의 벡터 백신은 돼지, 소 및 개를 비롯한 여러 포유동물 종에서 면역력을 유도할 수 있음은 밝혀진 바 있다 (Rosas et al. 2007, Rosas et al. 2008, Trapp et al. 2005, Said et al. 2013). 병원체의 항원 단백질을 코딩하는 유전자는 재조합 EHV-1 RacH에 의해 발현될 수 있다. 상기 EHV-1-RacH 유전체는 이.콜라이에서 BAC 형태로 조작되며, 통상적으로 이식유전자 발현 카세트를 삽입하여 추가의 단백질을 발현하도록 제작된다 (Tischer et al., 2010). 배양된 허용 세포에서 pRacH-SE DNA의 형질감염시, EHV-1 복제는 세포 전사 인자에 의해 개시된다. 바이러스성 DNA 폴리머라제의 활성은 모든 BAC-벡터 연관 서열의 결실 및 EHV-1 RacH 유전체의 원상태로의 복원을 유도한다. RacH와 구별할 수 없는 감염성 바이러스가 생성된다.
pRacH-SE를 예컨대, 이식유전자 발현 카세트의 삽입에 의해 이.콜라이에서 조작하는 경우, 허용 세포에서 형질감염 후 재구성된 바이러스는 변형을 수행하여 추가의 유전자를 발현할 것이다. 상기 재조합 EHV-1 RacH는 벡터 백신으로 사용될 수 있다.
EHV 벡터 시스템을 위한 프로모터
그러나, 추가의 외인성 프로모터 없이 발현된 유전자이식 단백질의 양은 일반적으로 비교적 적다. 따라서, 이러한 벡터, 특히 재조합 EHV-1 RacH로부터 유전자이식 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있는 추가의 프로모터에 대한 필요성이 대두되고 있는 실정이다.
인간 시토메갈로바이러스 전초기 유전자(immediate-early gene) 1 프로모터-인핸서를 사용하여 (Boshart et al. 1985), 이식유전자가 orf1/3 삽입 부위로부터 효율적으로 발현되는 것으로 보고된 바 있다. 상기 연구에서는, 보다 나은 발현을 위해 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 신호를 사용하여 전사 산물을 안정화시켰다 (Ma et al. 2012; Said et al. 2013). HCMV가 인간에게 종양을 유발시킬 수 있다는 증거는 없다고 하더라도, 이론적인 위험성은 배제할 수 없다. HCMV-IE 인핸서가 기술되기 전에는 (Boshart et al. 1985), 대부분의 강한 인핸서들은 유인원 바이러스 40, 폴리오마 바이러스 또는 몰로니 설치류 육종 바이러스와 같이 공지된 종양원성 바이러스의 유전체에서 발견되었다. 상기 매우 강력하고 비조직 특이적인 HCMV 및 MCMV (마우스 시토메갈로바이러스) IE 프로모터-인핸서는 다양한 연구 활동에서는 매우 적합하지만, 이들은 일반적으로 유전자이식 벡터 백신을 위한 프로모터로서 첫번째 선택이 되지는 않을 것이다. 특히, 동물에게 백신을 접종하는 사람이 뜻하지 않은 사고에 노출될 위험성은 규제 당국에 의해 백신 허가에 있어서 장애물로 간주될 수 있다.
EHV 벡터 시스템을 위한 삽입 부위
야생형 EHV-1 균주는 이들의 유전체의 긴 고유의 세그먼트의 한 말단에 orf1, orf 2 및 orf3으로 불리는 3개의 오픈 리딩 프레임 (orf)을 보유한다 (서열 좌표 1298-3614; 도 1a). Orf1 및 orf3은 DNA의 한 가닥 상에 연속적으로 배치되고, orf2는 그 상보적 가닥에 의해 인코딩된다. 백신 균주 RacH는 orf1 및 orf2에 영향을 미치는 해당 영역에서 1283 bp의 결실을 지니는데, 이는 상기 유전자가 바이러스 복제에 필수적이지 않다는 것을 시사하는 것이다. 이러한 이유로, 해당 부위는 이식유전자 삽입 부위로 기능을 한다. 상기 삽입 부위를 orf1/3이라고 부른다.
그러나, 상기 orf1/3 삽입 부위에 삽입될 수 있는 이식유전자의 크기와 수는 보통 제한적이다. 따라서, EHV-1 벡터의 역량을 보강하기 위해, EHV-1 벡터, 특히 재조합 EHV-1 RacH 벡터에 이식유전자를 삽입하여 발현시키는 새롭고 대안적인 방법에 대한 필요성이 대두되고 있다.
돼지 인플루엔자 A형 바이러스 (SIAV)
돼지 인플루엔자는 돼지의 건강 및 행복을 감소시키는 오르토믹소바이러스 계열의 인플루엔자 A형 바이러스 (IAV)에 의해 유발되는 급성 호흡기 바이러스성 질환이다. 돼지에서 인플루엔자의 임상 증상은 그 중증도가 다양할 수 있지만, 이환율이 높고 빠른 회복을 보이는 경미한 호흡기 질환으로 나타나는 경우가 많고, 드물게는 치명적인 경우도 발생한다. 그러나, 이 질병은 체중 감소, 체중 증가 감소, 및 경우에 따라서는 고열로 인한 암퇘지의 번식 장해를 유발하기 때문에 상당한 경제적 부담을 가져온다. SIAV는 돼지의 가장 중요한 호흡기 병원체 중 하나이며, 전세계적으로 돼지 무리에서의 높은 유병율은 이 질병의 경제적 영향과 직접적으로 관련이 있다. 유럽에서는 현재 사육된 돼지 중에서 유행하여 경제적 손실을 초래하는 4가지의 주요 인플루엔자 A형 바이러스 아형이 존재한다 (Brown, 2000). H1N1 ("조류" 아형) 및 H3N2 돼지 인플루엔자 바이러스는 1980년대 이래로 주요 돼지 생산 국가들에서 널리 유행하였다. H1N2 바이러스는 약 20년 전에 유럽 돼지에 전해졌으며 (Brown et al., 1995), H1N1 "범유행(pandemic)" 아형 (HlpdmN1)은 2009년 인간에게 H1N1이 대유행하는 과정 중에 사람으로부터 돼지에게 전염되어 돼지 개체군에도 전해졌고, 계속해서 돼지 개체군에서 전반으로 퍼지고 있으며, 모든 돼지 인플루엔자 바이러스 감염체들 중 유럽에서의 평균 유병율은 8%로 추정되고 있다 (Watson et al., 2015). 또한, 돼지 인플루엔자는 인간 건강에도 영향을 미치는데, 그 이유는 IAV의 인수공통전염병 가능성이 널리 알려져 있기 때문이다 (Thacker&Janke 2008).
유럽 내에서 가장 유행하는 4개의 인플루엔자 A형 균주로는 H1N2, H3N2 및 H1N1 (H1N1 조류 및 H1N1 범유행) 아형이 있다. 따라서, H1N2, H3N2 및 H1N1 (H1N1 조류 및 H1N1 범유행) 아형에 대해 매우 효과적이어서 상기 돼지 IAV 야생형(field) 균주에 대해 매우 광범위하게 보호를 제공하는 백신이 필요하다.
또한, 일반적으로 다가 백신이 비용 효율적이고 1가 백신보다 더 시간 효율적이라는 점에서 다가 백신으로 만드는 것이 유리하다.
그러나, 일반적으로 백신 효능은 서로 다른 백신 균주들의 바이러스 간섭과 같은 간섭 효과 및/또는 해당 백신 성분들 중 하나에서의 바이러스박멸 효과에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 상술한 간섭에 의해 영향을 받지 않으면서 매우 효과적인 돼지 IAV 조합 백신에 대한 필요성이 대두되고 있는 실정이다.
또한, 유행중인 돼지 IAV 균주에 대한 광범위하고 다면적인 적용범위(multivalent coverage)는, 백신 균주/항원 및 야생형 바이러스가 서로 관련성이 미미한 경우 관찰될 수 있는 백신 접종된 동물의 야생형 바이러스 감염 후에 백신과 관련된 호흡기 질환의 증진(VAERD)을 효과적으로 방지해야 한다 (Rajao et al. 2016).
변형된 생독 백신 (MLV)이 아닌 본원에 기술된 EHV-벡터 기반의 백신은, 생독 IAV가 생성되거나 동물에게 제공되지 않으므로, 해당 백신 균주(들)의 병독성으로의 잠재적인 복귀 및 돼지 또는 인간의 야생형 균주에 대한 유전자 재조합 또는 재편성을 방지할 수 있기 때문에, 돼지 IAV에 대해서는 최상의 안전성을 제공한다. 게다가, 사독 백신 (현행 표준)과는 대조적으로, 벡터 백신은 돼지 IAV 중화 항체를 유도할 뿐만 아니라 MHC 클래스 I 및 II 경로 모두를 통해 돼지 IAV에 대한 세포성 면역을 강하게 자극할 것으로 예상된다. 따라서, 벡터 기반의 SIAV 백신이 필요하다.
게다가, 변형된 생독 백신 및 불활성화된 백신은 모두, 백신접종된 동물에서 감염축을 진단하여 구별(DIVA, differentiation of infected from vaccinated animals)하기 위한 고유 특징을 결여하고 있다. 따라서, SIAV DIVA 백신이 필요하다. DIVA는 돼지 IAV 야생형 균주에 의해 감염된 동물에서 NP (핵단백질) 또는 NA (뉴라미니다제)와 같은 돼지 IAV 단백질에 대한 항체를 검출함으로써 달성할 수 있다. 이와는 대조적으로, (야생형 바이러스 또는 MLV로 감염시키지 않고 불활성화 백신으로 백신접종시키지 않은) 본원에 기술된 바와 같은 백신으로만 접종된 동물은 돼지 IAV HA 단백질(들)만을 발현하고, 상기 백신접종된 동물에서는 NP 또는 NA와 같은 단백질 및 이에 따른 NP 또는 NA에 대한 항체도 검출될 수 없다.
불활성화된 (사독) 백신을 분만 전 어미 돼지에 적용하여, 모계 유래의 면역력으로 돼지 IAV에 대하여 새끼 돼지를 보호할 수 있다 (암퇘지 백신). 또한, 불활성화 백신을 새끼 돼지에게 직접 적용할 수도 있다 (새끼 돼지 백신). 그러나, 새끼 돼지 백신으로 적용되는 경우, 불활성화 백신은 어린 새끼 돼지에서 돼지 IAV에 대하여 모계 유래의 면역력을 극복할 수 없다. 따라서, 불활성화 백신을 이용한 새끼 돼지에서의 돼지 IAV 백신접종은, 새끼 돼지가 돼지 IAV에 대하여 모계 유래의 면역력으로 더이상 보호되지 않을 수 있고 새끼 돼지의 백신접종을 통하여 돼지 IAV에 대한 보호가 아직은 달성되지 않아 상기 동물들이 돼지 IAV에 걸리기 쉬운 면역학적 갭이 생기는 기간인, 생후 약 8주령에서 시작하여 약 12주령 또는 그 이후의 면역의 개시를 유도하는 시점에 적용된다. 사독 백신의 경우와는 달리, 본원에 기술된 백신은 모계 유래의 항-돼지 IAV 항체의 수준으로 새끼 돼지를 백신접종할 수 있도록 하여, 차후에도 계속 돼지 IAV 감염에 대한 보호를 제공한다. 따라서, 매우 효능이 있고 심지어 모계 유래의 항체가 존재하는 어린 나이때에도 투여가능한 돼지 IAV 백신이 필요하다.
상기한 난제들을 피하기 위해, 본 발명은 새로운 삽입 부위, 신규한 프로모터 서열 및 SIAV 백신을 제공한다.
따라서, 상술한 기술적 과제에 대한 해결책은 상세한 설명 및 청구범위에 특징을 드러낸 실시양태들에 의해 달성되며, 본 발명의 다른 양태들은 청구범위에 따라 구현된다.
EHV 벡터의 역량을 증강시키기 위해, 본 발명은 EHV 벡터 백본에 이식유전자를 삽입하고 발현시키는 신규하고 대안적인 방법을 제공한다.
본 발명은 본원에 기술된 ORF70 내에 새로운 삽입 부위를 갖는 EHV 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 하기를 포함하는 EHV 벡터를 제공한다:
(i) 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 적어도 하나의 외인성 항원 인코딩 서열,
(ii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 삽입되는 ORF70,
(iii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 작동가능하게 연결되는 프로모터 서열.
본 발명은 EHV 벡터, 특히 재조합 EHV-1 RacH에 외인성 항원 인코딩 서열을 삽입하여 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있는 신규하고 대안적인 삽입 부위 ORF70에 관한 것이다.
상기 EHV-1 벡터 내의 신규한 "ORF70 삽입 부위"는 ORF70에 대한 부분 결실, 절단, 치환, 변형 등을 특징으로 한다. 완전한 ORF70에 대한 결실은 바이러스 복제 및 이에 따른 백신 제조 및 효능에 불리할 것으로 예상되는데, 그 이유는 ORF70에 대한 완전한 결실이 gpII에 대하여 인코딩하는 ORF71의 프로모터에 영향을 미칠 것이기 때문이다. 상기 신규한 ORF70 삽입 부위 및/또는 (발현 카세트의) ORF70으로의 삽입은 상기 ORF71이 계속 기능을 할 수 있는 상태 또는 온전한 상태로 남아있을 수 있도록 기능적으로 정의된다.
특정 양태에서, 상기 ORF70 삽입 부위는 RacH에 있어서 ORF70 내에 약 801bp 부분 (서열번호 20) 또는 이와 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%의 상동성인 서열의 결실을 포함한다. RacH 유전체 서열 중의 결실된 부분은 서열번호 20으로 나타내었다 (완전한 RacH 유전체 서열이 공지되어 있지 않기 때문에 뉴클레오타이드 수는 알 수 없음). 또 다른 특정 양태에서, 상기 ORF70 삽입 부위는 야생형 EHV-1 균주 ab4 (Genbank 등록번호 AY665713.1)에 있어서 ORF70 내에 801bp의 이론적 결실을 포함한다. 상기 결실 부분은 야생형 ab4 (Genbank 등록번호 AY665713.1) 유전체 서열 내에 뉴클레오타이드 127681과 128482 사이에 위치한다 (서열번호 19).
본 발명에서, "인접 영역(flanking region)"은 외인성 항원 인코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 재조합을 EHV-1 유전체 내로 안내한다. 이러한 인접 영역들은 EHV-1에 원래부터 존재하고 있다. Up70 인접 영역 (417 bp, 서열번호 13) 및 Up71 인접 영역 (431 bp, 서열번호 14)은 상기 ORF70 부위에 사용된 모든 전달 벡터/플라스미드에서의 고전적인 상동성 재조합을 위해 선택된다. 야생형 EHV-1 균주 ab4 (Genbank 등록번호 AY665713.1)에서, 해당 서열은 뉴클레오타이드 127264 - 127680 (인접 영역 Up ORF70, 서열번호 15) 및 128483 - 128913 (인접 영역 Up ORF71, 서열번호 16)에 위치한다. RED 재조합을 위해, 상기 인접 영역을 XbaI 제한효소 분해에 의해 절단한다. 상기 절단된 인접 영역들은, 상기 기술한, 417 bp의 "고전적인" 인접 영역 중의 3' 283 bp (Up70 인접 영역, 서열번호 13) 및 431 bp "고전적인" 인접 영역 중의 5' 144 bp (Up71 인접 영역, 서열번호 14)와 같다. 상기 절단된 인접 영역들은 서열번호 17로서 포함된 Up70 인접 영역 (283 bp) 및 서열번호 18로서 포함된 Up71 인접 영역 (144 bp)으로 칭한다. 상기 다양한 인접 영역들은 동일한 ORF70 삽입 부위를 정의한다. 상기 인접 영역들은 하나는 "좌측" 인접 영역, 예컨대 서열번호 13, 15, 17 및 하나는 "우측" 인접 영역, 예컨대 서열번호 14, 16, 18로서 항상 쌍으로 사용된다.
추가로, 본 발명은 당업계에서의 문제점을 극복하는 이식유전자 발현을 위한 신규한 조절 핵산 서열/프로모터 서열, 면역원성 조성물, 백신 및 관련 방법들을 제공한다.
따라서, 본 발명은 하기를 포함하는 EHV 벡터를 제공한다:
(i) 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 적어도 하나의 외인성 항원 인코딩 서열,
(ii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 삽입되는 삽입 부위,
(iii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 작동가능하게 연결되는, 4pgG600 (서열번호 1) 또는 4pMCP600 (서열번호 2)을 포함하는 프로모터 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열.
따라서, 본 발명은 2개의 신규한 프로모터인 4pgG600 및 4pMCP600, 및 이보다 짧은 길이를 갖는 이의 유도체를 함유하는 EHV 벡터에 관한 것으로, 이들은 세포 배양물 중의 일시적 형질감염 후에 또는 세포 배양물 중의 rEHV1-RacH 복제에 있어서 기능성인 것으로 밝혀졌다. 신규한 프로모터 p430 및 p455는 세포 배양물 및 동물 (돼지 및 마우스) 중에서도 rEHV1-RacH 복제에 있어서 기능성인 것으로 밝혀졌다. 바이러스 복제 주기 동안의 상기 신규한 2개의 프로모터의 활성 수준은 시험관내 프로모터 동역학적 실험으로부터 추론할 수 있는 것과 매우 유사해 보인다.
이러한 특성들은 2개의 서로 다른 항원을 유사한 효율로 동시에 발현하는 EHV-1 RacH를 기반으로 하는 재조합 벡터 백신의 제조를 가능하게 한다. 백신 표적이 2개의 서로 다른 병원체로 구성되는 경우, 두 폴리아데닐화 서열과 조합된 2개의 삽입 부위 내의 2개의 신규한 프로모터의 적용을 통해 제품의 비용을 크게 줄일 수 있고, 단 하나의 항원 성분만을 발현하는 벡터에 비해 명백한 이점을 나타낼 수 있다.
추가로, 본 발명은 RNA-바이러스-유래된 작용기 (2a 펩타이드, IRES 부위)에 의해, 두 이식유전자를 결합시키지 않고 하나의 프로모터의 조절 하에 하나의 벡터 백본에서 2개의 서로 다른 이식유전자를 발현하는 EHV-1 벡터에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 하기를 포함하는 EHV 벡터를 제공한다:
(i) 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 적어도 2개의 외인성 항원 인코딩 서열,
(ii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 삽입되는 삽입 부위,
(iii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 작동가능하게 연결되는 프로모터 서열.
또한, 본 발명은 상술한 EHV 벡터를 포함하는 면역원성 조성물 및 DIVA 백신을 제공한다.
이러한 특성들은 서로 다른 항원을 유사한 효율로 동시에 발현하는 EHV-1 RacH를 기반으로 하는 재조합 벡터 백신의 제조를 가능하게 한다. 백신 표적이 2개의 서로 다른 병원체로 구성되는 경우, 두 폴리아데닐화 서열과 조합된 2개의 삽입 부위 내의 2개의 신규한 프로모터의 적용을 통해 제품의 비용을 크게 줄일 수 있고, 단 하나의 항원 성분만을 발현하는 벡터에 비해 명백한 이점을 나타낼 수 있다.
추가로, 본 발명은 SIAV 백신을 제공한다. 본 발명은 추가로 특정 헤마글루티닌 서열, 예컨대 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29 및 이의 서열 동족체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 안전하고 매우 효과적인 1가 및 다가 SIAV 백신을 제공한다.
추가로, 본 발명의 벡터 기반의 SIAV 백신은, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 감염된 식용 동물을 본원에 기술된 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신으로 백신 접종한 식용 동물과 구별하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 기재한 EHV 벡터를 포함하는 면역원성 조성물 및 DIVA 백신의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 식용 동물을 면역화시키는 방법, 식용 동물에서 돼지 IAV로 야기된 임상적 증상의 치료 또는 예방, 식용 동물의 폐에서 바이러스 역가를 감소시키는 방법 및 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체를 갖는 것이 필요한 식용 동물을 백신접종하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 선행 기술에 내재하고 있는 문제점을 해결하여 현재 기술 수준에 대하여 뚜렷하게 구별된 진전을 제공한다. 일반적으로, 본 발명은 하기를 포함하는 EHV 벡터를 제공한다:
(i) 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 적어도 하나의 외인성 항원 인코딩 서열,
(ii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 삽입되는 ORF70,
(iii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 작동가능하게 연결되는 프로모터 서열.
추가로, 본 발명은 본원에 기술된 EHV 벡터 및 임의로 약학적 담체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
따라서, 본 발명은 하기를 포함하는 EHV 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다:
(i) 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 적어도 하나의 외인성 항원 인코딩 서열,
(ii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 삽입되는 ORF70,
(iii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 작동가능하게 연결되는 프로모터 서열.
유리하게는, 본 발명에 제공된 실험 데이터는 항원을 삽입하여 발현시키는데 사용될 수 있는 EHV 벡터 내의 신규한 삽입 부위를 제공하였음을 개시하고 있다. 나아가, 상기 신규한 삽입 부위의 제공으로 이제는 서로 다른 삽입 부위의 항원들의 삽입과 발현 및 하나 이상의 항원의 발현이 각각 가능하게 되었다. 또한, 상기 실험 데이터는, 신규한 삽입 부위를 갖는 EHV 벡터가 1개 또는 2개의 부위의 면역원성 조성물 및 DIVA 백신을 위한 면역원성 조성물을 제공하는데 각각 사용될 수 있음을 보여준다.
추가로, 본 발명은 하기를 포함하는 EHV 벡터를 제공한다:
(i) 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 적어도 하나의 외인성 항원 인코딩 서열,
(ii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 삽입되는 삽입 부위,
(iii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 작동가능하게 연결되는, 4pgG600 (서열번호 1) 또는 4pMCP600 (서열번호 2)을 포함하는 프로모터 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열.
추가로, 본 발명은 본원에 기술된 EHV 벡터 및 임의로 약학적 담체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
따라서, 본 발명은 하기를 포함하는 EHV 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다:
(i) 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 적어도 하나의 외인성 항원 인코딩 서열,
(ii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 삽입되는 삽입 부위,
(iii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 작동가능하게 연결되는, 4pgG600 (서열번호 1) 또는 4pMCP600 (서열번호 2)을 포함하는 프로모터 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열.
유리하게는, 본 발명에 제공된 실험 데이터는 항원을 발현시키는데 사용될 수 있는 신규한 프로모터 서열을 제공하였음도 개시하고 있다. 나아가, 상기 신규한 프로모터 서열의 제공으로 EHV 벡터 시스템과 같은 벡터 시스템의 서로 다른 삽입 부위의 항원들의 발현 및 하나 이상의 항원의 발현이 각각 가능하게 되었다. 또한, 상기 실험 데이터는, 상기 프로모터 서열이 1개 또는 2개의 부위의 면역원성 조성물 및 DIVA 백신을 위한 면역원성 조성물을 각각 제공하기 위한 EHV 벡터 시스템과 같은 벡터 시스템에서 항원을 발현시키는데 사용될 수 있음을 보여준다.
추가로, 본 발명은 하기를 포함하는 EHV 벡터를 제공한다:
(i) 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 적어도 2개의 외인성 항원 인코딩 서열,
(ii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 삽입되는 삽입 부위,
(iii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 작동가능하게 연결되는 프로모터 서열.
추가로, 본 발명은 본원에 기술된 EHV 벡터 및 임의로 약학적 담체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
따라서, 본 발명은 하기를 포함하는 EHV 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다:
(i) 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 적어도 2개의 외인성 항원 인코딩 서열,
(ii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 삽입되는 삽입 부위,
(iii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 작동가능하게 연결되는 프로모터 서열.
추가로, 본 발명은 본원에 기술된 2개 이상의 EHV 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 면역원성 조성물은 2개, 3개 또는 4개의 EHV 벡터를 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 2개의 EHV 벡터를 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 2개 이상의 EHV 벡터는 상이한 외인성 항원 인코딩 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 2개 이상의 EHV 벡터는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스와 관련된 상이한 외인성 항원 인코딩 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 2개 이상의 EHV 벡터는 상이한 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열을 포함한다.
추가로, 본 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 EHV 벡터를 포함하는 DIVA 백신을 제공한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 EHV 벡터는 재조합체이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 EHV 벡터는 RacH 또는 RacH SE이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 EHV 벡터는 EHV-1, EHV-3, EHV-4, EHV-8 및 EHV-9로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 EHV 벡터는 EHV-1이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 식용 동물은 돼지이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 식용 동물을 감염시키는 병원체는 인플루엔자 바이러스, 바람직하게는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열은 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열은 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이고, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자 아형은 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 및 H18로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열은 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이고, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자 아형은 H1 및/또는 H3이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열은 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이고, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자 A형 항원은 돼지로부터 유래한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 EHV 벡터는 적어도 2개의 헤마글루티닌 인플루엔자 항원 인코딩 서열을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 EHV 벡터는 적어도 4개의 헤마글루티닌 인플루엔자 항원 인코딩 서열을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 EHV 벡터는 4개의 헤마글루티닌 인플루엔자 항원 인코딩 서열을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열은 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이고, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자 항원 인코딩 서열은 A/돼지/이탈리아/116114/2010(H1N2), A/돼지/이탈리아/7680/2001(H3N2), A/돼지/겐트/132/2005(H1N1), A/돼지/이탈리아/4675/2003(H1N2), A/돼지/이탈리아/259543/2003(H1N2), A/돼지/덴마크/13772-1/2003(H1N1), A/돼지/잉글랜드/MD0040352R/2009(H1N1), A/돼지/헝가리/13509/2007(H3N2), A/돼지/이탈리아/13962/95(H3N2), A/돼지/코트다르모르/1121/00(H1N1), A/돼지/콜로라도/1/77, A/돼지/콜로라도/23619/99, A/돼지/코트다르모르/3633/84, A/돼지/잉글랜드/195852/92, A/돼지/피니스테르/2899/82, A/돼지/홍콩/10/98, A/돼지/홍콩/9/98, A/돼지/홍콩/81/78, A/돼지/일리노이/100084/01, A/돼지/일리노이/100085A/01, A/돼지/일리노이/21587/99, A/돼지/인디애나/1726/88, A/돼지/인디애나/9K035/99, A/돼지/인디애나/P12439/00, A/돼지/아이오와/30, A/돼지/아이오와/15/30, A/돼지/아이오와/533/99, A/돼지/아이오와/569/99, A/돼지/아이오와/3421/90, A/돼지/아이오와/8548-1/98, A/돼지/아이오와/930/01, A/돼지/아이오와/17672/88, A/돼지/이탈리아/1513-1/98, A/돼지/이탈리아/1523/98, A/돼지/대한민국/CY02/02, A/돼지/미네소타/55551/00, A/돼지/미네소타/593/99, A/돼지/미네소타/9088-2/98, A/돼지/네브래스카/1/92, A/돼지/네브래스카/209/98, A/돼지/네덜란드/12/85, A/돼지/노스캐롤라이나/16497/99, A/돼지/노스캐롤라이나/35922/98, A/돼지/노스캐롤라이나/93523/01, A/돼지/노스캐롤라이나/98225/01, A/돼지/외덴로드/7C/96, A/돼지/오하이오/891/01, A/돼지/오클라호마/18717/99, A/돼지/오클라호마/18089/99, A/돼지/온타리오/01911-1/99, A/돼지/온타리오/01911-2/99, A/돼지/온타리오/41848/97, A/돼지/온타리오/97, A/돼지/퀘벡/192/81, A/돼지/퀘벡/192/91, A/돼지/퀘벡/5393/91, A/돼지/타이완/7310/70, A/돼지/테네시/24/77, A/돼지/텍사스/4199-2/98, A/돼지/위스콘신/125/97, A/돼지/위스콘신/136/97, A/돼지/위스콘신/163/97, A/돼지/위스콘신/164/97, A/돼지/위스콘신/166/97, A/돼지/위스콘신/168/97, A/돼지/위스콘신/235/97, A/돼지/위스콘신/238/97, A/돼지/위스콘신/457/985 A/돼지/위스콘신/458/98, A/돼지/위스콘신/464/98 및 A/돼지/위스콘신/14094/99로 이루어진 균주의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열은 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이고, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자 항원 인코딩 서열은 A/돼지/이탈리아/116114/2010(H1N2), A/돼지/이탈리아/7680/2001(H3N2), A/돼지/겐트/132/2005(H1N1) 및 A/돼지/이탈리아/4675/2003(H1N2)으로 이루어진 균주의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열은 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이고, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자 항원 인코딩 서열은 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 인코딩한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열은 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이고, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자 항원 인코딩 서열은 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열은 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이고, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자 항원 인코딩 서열은 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열은 인플루엔자 A형 바이러스 N (뉴라미니다제)를 인코딩하는 서열이고, 상기 N 아형은 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9 및 N10으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 EHV 벡터, 상기 면역원성 조성물 또는 상기 DIVA 백신은 N (뉴라미니다제) 인플루엔자 항원 인코딩 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 EHV 벡터, 상기 면역원성 조성물 또는 상기 DIVA 백신은 NP (핵단백질) 인플루엔자 항원 인코딩 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 EHV 벡터는 추가의 조절 서열, 예컨대 종결 신호 또는 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
삽입 부위:
본 발명의 한 양태에서, 상기 삽입 부위는 ORF1/3이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 삽입 부위는 ORF70이다.
본 발명의 한 양태에서, 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 제1 외인성 항원 인코딩 서열을 ORF70 내로 삽입한다.
본 발명의 한 양태에서, 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 제2 외인성 항원 인코딩 서열을 ORF1/3 내로 삽입한다.
본 발명의 한 양태에서, ORF70으로의 삽입은 ORF70에서의 부분 결실, 절단, 치환, 변형 등을 특징으로 하여, ORF71이 기능을 발휘할 수 있도록 한다.
본 발명의 한 양태에서, ORF70으로의 삽입은 RacH에 있어서 ORF70 내에 약 801bp 부분 (서열번호 20) 또는 이와 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%의 상동성인 서열 및/또는 동일한 서열의 결실을 특징으로 한다.
본 발명의 벡터의 또 다른 특정 양태에서, ORF70으로의 삽입은 RacH에 있어서 ORF70 내에 약 801bp 부분 (서열번호 20) 또는 임의의 다른 균주에서의 이와 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성인 서열 및/또는 동일한 서열의 결실을 특징으로 한다.
본 발명의 벡터의 추가의 특정 양태에서, ORF70으로의 삽입은 야생형 EHV-1 균주 ab4 (Genbank 등록번호 AY665713.1)에 있어서 ORF70 내의 약 801bp 부분 (서열번호 19) 또는 이와 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성인 서열 및/또는 동일한 서열의 결실을 특징으로 한다 [상기 야생형 ab4 유전체 서열 중의 결실된 부분은 뉴클레오타이드 127681과 128482 사이에 위치함].
본 발명의 벡터의 추가의 특정 양태에서, ORF70으로의 삽입은 야생형 EHV-1 균주 ab4 (Genbank 등록번호 AY665713.1)에 있어서 ORF70 내의 약 801bp 부분 (서열번호 19) 또는 임의의 다른 균주에서의 이와 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성인 서열 및/또는 동일한 서열의 결실을 특징으로 한다 [상기 야생형 ab4 유전체 서열 중의 결실된 부분은 뉴클레오타이드 127681과 128482 사이에 위치함].
본 발명의 한 양태에서, 상기 EHV-1 벡터는 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17과 서열번호 18 및 상기 서열들 중 임의의 한 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성인 서열 및/또는 동일한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 인접 영역을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 EHV-1 벡터는 (i) 서열번호 13, 서열번호 15 및 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 좌측 ORF70 인접 영역 및 (ii) 서열번호 14, 서열번호 16 및 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 우측 ORF70 인접 영역을 포함한다.
프로모터:
본 발명의 한 양태에서, 프로모터 서열은 SV40 대형(large) T, HCMV 및 MCMV 전초기(immediate early) 유전자 1, 인간 신장인자 알파 프로모터, 바큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터, 4pgG600 (서열번호 1)의 기능적 단편 [바람직하게는, 상기 기능적 단편은 p430 (서열번호 3)], 4pgG600 (서열번호 1)의 상보적인 뉴클레오타이드 서열의 기능적 단편 [바람직하게는, 상기 기능적 단편은 p455 (서열번호 4)], 및 4pMCP600 (서열번호 2)의 상보적인 뉴클레오타이드 서열의 기능적 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 양태에서, 프로모터 서열은 4pgG600 (서열번호 1) 또는 4pMCP600 (서열번호 2), 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 프로모터 서열의 기능적 단편 또는 유도체는 80%, 85%, 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%의 상동성을 가진다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 프로모터 서열의 기능적 단편 또는 유도체는 550개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 500, 490, 480, 470, 460, 455, 450, 445, 440, 435, 434, 433, 432, 431, 430개의 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 455 또는 430개의 뉴클레오타이드 길이를 가진다.
본 발명의 한 양태에서, 프로모터 서열의 기능적 단편은 4pgG600 (서열번호 1)의 절단부 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열이고, 바람직하게는 상기 서열 동일성은 전체 길이에 대하여 (적어도) 72% (또는 그 이상)이다.
본 발명의 한 양태에서, 4pgG600 (서열번호 1)의 프로모터 서열의 기능적 단편은 p430 (서열번호 3)으로 지정된 단편이다. 또 다른 양태에서, 상기 서열 동일성은 (적어도) 70%, 80%, 85%, 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%이다.
본 발명의 한 양태에서, 프로모터 서열의 기능적 단편은 4pMCP600 (서열번호 2)의 절단부 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열이고, 바람직하게는 상기 서열 동일성은 전체 길이에 대하여 (적어도) 78% (또는 그 이상)이다.
본 발명의 한 양태에서, 4pMCP600 (서열번호 2)의 프로모터 서열의 기능적 단편은 p455 (서열번호 4)로 지정된 단편이다. 또 다른 양태에서, 상기 서열 동일성은 (적어도) 70%, 80%, 85%, 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 EHV 벡터는 하나 이상의 추가의 조절 서열, 예컨대 종결 신호, 폴리아데닐화 신호, 또는 IRES 및/또는 2a 펩타이드와 같은 조절요소를 포함한다.
프로모터와 항원의 특이적 조합:
본 발명의 한 양태에서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1)의 기능적 단편은 p430 (서열번호 3)으로 지정된 단편이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2)의 기능적 단편은 p455 (서열번호 4)로 지정된 단편이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되며,
상기 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1)의 기능적 단편은 p430 (서열번호 3)으로 지정된 단편이고, 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2)의 기능적 단편은 p455 (서열번호 4)로 지정된 단편이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 2가이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1)의 기능적 단편은 p430 (서열번호 3)으로 지정된 단편이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2)의 기능적 단편은 p455 (서열번호 4)로 지정된 단편이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되며, 상기 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1)의 기능적 단편은 p430 (서열번호 3)으로 지정된 단편이고, 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2)의 기능적 단편은 p455 (서열번호 4)로 지정된 단편이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 2가이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물은, 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는, 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 및
서열번호 27에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는, 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 EHV 벡터를 포함하고,
상기 면역원성 조성물은, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는, 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 및
서열번호 26에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는, 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 EHV 벡터를 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1)의 기능적 단편은 p430 (서열번호 3)으로 지정된 단편이고, 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2)의 기능적 단편은 p455 (서열번호 4)로 지정된 단편이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 4가이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 1회 용량 투여용으로 제제화된다.
바람직하게는, 상기 1회 용량의 총 부피는 약 0.2 ml 내지 2.5 ml, 보다 바람직하게는 약 0.2 ml 내지 2.0 ml, 보다 더 바람직하게는 약 0.2 ml 내지 1.75 ml, 보다 더욱 바람직하게는 약 0.2 ml 내지 1.5 ml, 보다 더 바람직하게는 약 0.4 ml 내지 1.25 ml, 보다 더 바람직하게는 약 0.4 ml 내지 1.0 ml이고, 1회 0.5 ml 용량 또는 1.0 ml 용량이 가장 바람직하다. 상기 1회 용량의 총 부피가 0.5 ml, 1 ml, 1.5 ml 또는 2 ml인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 면역원성 조성물의 1회 용량은 이러한 면역원성 조성물의 1회 용량의 투여 후 효과적이라는 것이 추가로 밝혀졌다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 근육내 또는 비강내로 투여된다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 생후 첫 6주 이내, 생후 첫 2주 이내, 생후 첫 1주 이내 또는 생후 첫 1일 이내의 돼지에게 안전하다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 아쿠아 애드 인젝션엠(aqua ad injectionem, 주사용수), 세포 배양 배지 또는 재현탁 완충액이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 재현탁 완충액은 인산염 완충 식염수이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 1x104 내지 1x109의 조직 배양 감염 용량 50 (TCID50), 바람직하게는 1x104 내지 1x108의 TCID50, 보다 더 바람직하게는 1x104 내지 1x107의 TCID50의 EHV 벡터를 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 백신이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 다가 백신이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 2가 백신, 4가 백신, 6가 백신 또는 7가 백신이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 2가 백신 또는 4가 백신이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 돼지 인플루엔자 A형 바이러스로 야기된 임상 증상의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 식용 동물에서 상기 임상 증상의 치료 및/또는 예방에 효과적이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 돼지 인플루엔자 A형 바이러스의 동종성 및/또는 이종성 시험감염(challenge)으로부터 보호한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 혈청형 H1 및/또는 H3의 돼지 인플루엔자 A형 바이러스의 시험감염으로부터 보호한다.
키트
본 조성물은, 필요하다면, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 제형을 포함할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 상기 팩은, 예를 들어 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 블리스터 팩(blister pack)을 포함한다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여, 바람직하게는 식용 동물, 특히 돼지에게 투여하기 위한 지침서를 수반할 수도 있다. 이러한 용기(들)과 관련하여, 약제 또는 생물학적 제제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 규정한 형태의 통지가 있을 수 있으며, 이러한 통지는 동물 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 기관의 승인을 반영한 것이다.
본 발명은 본원에 기술된 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 키트는 추가로 돼지 인플루엔자 A형 바이러스의 치료 및/또는 예방을 위한 지침서를 포함한다.
치료 방법
본 발명은 본원에 기술된 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신을 식용 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 식용 동물을 면역화시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 면역화는 한 집단에 있어서 특정 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 발생률을 감소시키거나, 또는 특정 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 의해 초래되거나 이와 관련된 임상 증상의 중증도를 감소시킨다.
추가로, 본원에 제공된 면역원성 조성물을 필요로 하는 식용 동물의 상기 면역원성 조성물을 사용한 면역화는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 의한 식용 동물의 감염을 예방한다. 보다 더 바람직하게는, 면역화는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 대해 효과적이고, 장기간 지속되는 면역학적 반응을 유도한다. 상기 기간은 2개월 이상, 바람직하게는 3개월 이상, 보다 바람직하게는 4개월 이상, 보다 바람직하게는 5개월 이상, 보다 바람직하게는 6개월 이상 지속될 것이라는 점을 이해해야 할 것이다다. 상기 면역화는 면역화된 모든 동물에서 효과적이지 않을 수 있다는 점도 이해되어야 할 것이다 그러나, 상기 용어는 한 집단의 동물들 중 상당 부분이 효과적으로 면역화되어야 함을 필요로 한다.
바람직하게는, 이러한 맥락에서 식용 동물 집단이 구상되며, 이러한 집단은 일반적으로, 즉 면역화 없이, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 의해 통상 야기되거나 또는 이와 관련된 임상 증상을 나타낼 것이다. 상기 식용 동물의 집단이 효과적으로 면역화될지의 여부는 당업계의 숙련자라면 추가의 작업없이도 판단할 수 있다. 바람직하게는, 상기 면역화는, 주어진 집단의 동물들 중 적어도 33%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 100%에서의 임상 증상이, 면역화시키지 않았거나 본 발명 이전에 이용할 수 있었던 면역원성 조성물로 면역화시켰지만 그 후에 특정 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 감염된 식용 동물과 비교했을 때, 발병율 또는 중증도가 적어도 10%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 20%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 30%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 40%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 50%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 60%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 70%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 80%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 90%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 95%까지, 가장 바람직하게는 100%까지 감소되는 경우에 효과적일 것이다.
본 발명은 본원에 기술된 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신의 치료적 유효량을 식용 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스로 유발된 임상 증상의 치료 또는 예방을 필요로 하는 식용 동물에서 상기 임상 증상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 임상 증상은, 치료 (또는 면역화)하지 않아서 그 후에 특정 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 감염된 식용 동물과 비교했을 때, 적어도 50%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 60%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 70%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 80%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 90%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 95%까지, 가장 바람직하게는 100%까지 감소한다.
본 발명은, 본원에 기술된 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신의 치료적 유효량을 식용 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동일한 종의 면역화시키지 않은 대조군의 식용 동물에 비해 폐에서의 바이러스 역가를 감소시키는 것이 필요한 식용 동물에서 폐에서의 바이러스 역가를 감소시키는 방법을 제공한다. 그러나, 상기 바이러스는 인플루엔자 A형 바이러스, 바람직하게는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스인 것으로 이해해야 한다.
바람직하게는, 폐에서의 바이러스 역가는, 특정 인플루엔자 A형 바이러스에 차후 감염된 동일한 종의 면역화시키지 않은 대조군의 식용 동물과 비교했을 때, 적어도 50%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 60%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 70%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 80%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 90%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 95%까지, 가장 바람직하게는 100%까지 감소한다.
유리하게는, 본 발명에 제공된 실험 데이터는 본원에 제공된 면역원성 조성물을 돼지에게 투여하였을 때 그 안정성과 효능을 입증하고 있다. 실제로, 본원에 제공된 면역원성 조성물로 백신접종한 돼지는 백신접종을 하지 않은 새끼 돼지에 비해 해당 질병과 관련된 감소된 임상 증상, 예컨대 바이러스 감염 시험감염 후 감소된 바이러스 폐 역가를 가졌다.
본 발명은 본원에 기술된 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신의 치료적 유효량을 식용 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체를 보유하는 것이 필요한 식용 동물을 백신접종하는 방법을 제공한다.
그러나, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 반응하여 새끼 돼지에서 형성된 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체는 백신접종을 하지 않은 새끼 돼지에도 존재할 수 있다. 다르게는, 백신접종을 하지 않은 새끼 돼지에서의 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체는, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 백신을 사용한 암퇘지의 백신접종에 반응하여 형성된 모계 유래의 항체이거나, 또는 암퇘지의 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 반응하여 형성된 모계 유래의 항체이다. 상기 모계 유래의 항체는 초유 및 우유를 통해 이러한 암퇘지로부터 새끼 돼지에게 수동적으로 전달된다.
백신 항원에 대한 모계 유래의 항체의 간섭은 생독 백신 뿐만 아니라 불활성화 백신에 대한 면역 반응을 감소시키거나 심지어 없앨 수도 있다. 백신으로 유도된 면역 반응에 대한 모계 유래의 항체의 다양한 간섭 정도는 생독 백신 뿐만 아니라 비복제성 백신 (즉, 불활성화 또는 소단위 백신)에 대해서도 보고된 바 있다.
따라서, 본원에 기술한 돼지 IAV 백신은 돼지 IAV에 대한 모계 유래의 항체의 존재 하에서도 새끼 돼지에 성공적으로 적용되어, 돼지 IAV 감염으로부터 보호할 수 있다.
추가로, 본원에 기술된 돼지 IAV 백신으로 암퇘지를 백신접종하면 암퇘지의 면역력을 유도하고 모계 유래의 항체를 새끼 돼지에게 전달시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 본원에 기술된 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신의 치료적 유효량을 어린 식용 동물을 임신하고 있는 모체에게 투여하는 단계를 포함하는, 어린 식용 동물에서 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 모계 유래의 면역력을 제공하는 방법을 제공한다.
본원에 기술된 돼지 IAV 백신이 모계 유래의 항체의 존재 하에 새끼 돼지에 성공적으로 적용될 수 있기 때문에, 상기 백신은 암퇘지의 백신접종 및 이후 상기 암퇘지가 분만한 새끼 돼지의 백신접종에도 사용될 수 있다. 상기 백신접종된 암퇘지는 항체를 비롯한 모계 유래의 면역력을 새끼 돼지에게 전달한다. 그러나, 본원에 기술된 돼지 IAV 백신이 모계 유래의 항체를 방해하지 않기 때문에, 새끼 돼지는 어릴때 동일한 백신으로 백신접종할 수 있다. 추가로, 본원에 기술된 백신 또는 임의의 다른 돼지 IAV 암퇘지 백신을 사용하여 암퇘지와 상기 암퇘지가 분만한 어린 새끼 돼지를 백신접종함으로써, 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 대한 보호를 증진시킨다. 새끼 돼지는 생후 1일 내지 1주 동안은 모계 유래의 면역력으로 보호된다. 추가로, 새끼 돼지의 조기 백신접종으로, 상기 새끼 돼지는 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 대한 면역력을 얻기 때문에, 모계 유래의 면역력의 감퇴와 백신접종의 개시 사이에 면역학적 갭이 발생되는 일 없이 보호된다.
본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 대한 증진된 보호를 필요로 하는 어린 식용 동물에서 상기 바이러스 감염에 대한 증진된 보호를 제공하는 방법을 제공하는데, 여기서
a) 상기 어린 식용 동물을 임신하고 있는 모체는 본원에 기술된 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신의 치료적 유효량으로 백신접종되고/될 것이거나,
b) 상기 어린 식용 동물은 생후 3주 이내에 치료적 유효량의 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신으로 백신접종될 것이다.
바람직하게는, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 분만 전, 바람직하게는 1회의 기본 면역화 후, 보다 바람직하게는 2회의 백신접종의 면역화가 수행된 후 ("반복 용량") 임신한 암퇘지에게 적어도 1회 투여된다. 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 상기 암퇘지에게 3회 투여되는 경우, 제1 기본 면역화는 분만 전 116일 내지 60일, 바람직하게는 분만 전 116일 내지 58일, 가장 바람직하게는 분만 전 116일 내지 56일에 수행되어야 한다. 제2 기본 면역화는 분만 전 95일 내지 40일, 바람직하게는 분만 전 95일 내지 38일, 가장 바람직하게는 분만 전 95일 내지 35일에 수행되어야 한다. 분만 전 최종 촉진약량(booster) 투여는 분만 전 10일 내지 20일, 바람직하게는 분만 전 12일 내지 18일, 가장 바람직하게는 분만 전 14일에 수행되어야 한다.
상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 바람직하게는 새끼 돼지가 생후 3주가 되기 전에 상기 새끼 돼지에게 투여된다. 바람직하게는, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 생후 1일 내지 생후 21일, 보다 바람직하게는, 생후 1일 내지 생후 10일, 보다 더 바람직하게는, 생후 1일 내지 생후 9일, 보다 더 바람직하게는 생후 1일 내지 생후 8일, 보다 더 바람직하게는 생후 1일 내지 생후 7일, 보다 더 바람직하게는 생후 1일 내지 생후 6일, 보다 더 바람직하게는 생후 1일 내지 생후 5일, 보다 더 바람직하게는 생후 1일 내지 생후 4일, 보다 더 바람직하게는 생후 1일 내지 생후 3일, 보다 더 바람직하게는 생후 1일 또는 2일, 가장 바람직하게는 생후 1일의 새끼 돼지에게 각각 투여된다.
그러나, 상기 면역원성 조성물은 2회 이상의 용량으로 새끼 돼지에게 투여될 수 있으며, 제1 용량은 제2 용량(촉진약량)을 투여하기 전에 투여된다. 바람직하게는, 제1 용량은 생후 첫 2주 이내, 보다 바람직하게는 생후 첫 1주 이내, 보다 더 바람직하게는 생후 첫 1일 이내에 투여된다. 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 15일째에 투여된다. 보다 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 15일 내지 40일째에 투여된다. 보다 더 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 17일째에 투여된다. 보다 더 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 17일 내지 30일째에 투여된다. 보다 더 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 19일째에 투여된다. 보다 더 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 19일 내지 25일째에 투여된다. 가장 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 21일째에 투여된다. 2회 투여 처방계획의 바람직한 양태에서, 상기 면역원성 조성물의 제1 용량과 제2 용량은 모두 동일한 양으로 투여된다. 바람직하게는, 각 용량은 상기 특정된 바람직한 양이며, 제1 용량과 제2 용량으로 1 ml의 용량이 가장 바람직하다. 제1 용량과 제2 용량 처방계획 이외에, 대안적인 실시양태는 추가의 후속 용량을 포함한다. 예를 들어, 제3, 제4, 또는 제5 용량이 상기 양태에서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 제3, 제4 및 제5 용량의 후속 처방계획은 제1 용량과 동일한 양으로 투여되며, 상기 용량들 간의 시간 간격은 상기 언급한 제1 용량과 제2 용량 간의 시간대와 일치한다. 따라서, 상기 방법은 임신한 암퇘지 뿐만 아니라 분만된 새끼 돼지에 대한 백신접종에 대한 것이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 식용 동물은 돼지, 새끼 돼지 또는 암퇘지이다.
본 발명의 한 양태에서, 인플루엔자 A형 바이러스는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 1회 투여된다.
상기 1회 용량은 단 한번 투여되는 것으로 이해한다. 실시예에 나타난 바와 같이, 본원에 제공된 면역원성 조성물은 1회 용량의 투여 후에 효과적인 것으로 입증되었다.
바람직하게는, 상기 1회 용량의 총 부피는 약 0.2 ml 내지 2.5 ml, 보다 바람직하게는 약 0.2 ml 내지 2.0 ml, 보다 더 바람직하게는 약 0.2 ml 내지 1.75 ml, 보다 더욱 바람직하게는 약 0.2 ml 내지 1.5 ml, 보다 더 바람직하게는 약 0.4 ml 내지 1.25 ml, 보다 더 바람직하게는 약 0.4 ml 내지 1.0 ml이고, 1회 0.5 ml 용량 또는 1.0 ml 용량이 가장 바람직하다. 상기 1회 용량의 총 부피가 0.5 ml, 1 ml, 1.5 ml 또는 2 ml인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 생후 첫 6주 이내, 생후 첫 2주 이내, 생후 첫 1주 이내 또는 생후 첫 1일 이내의 식용 동물에게 투여된다.
바람직하게는, 상기 면역화시킬 식용 동물은 생후 1일 내지 생후 40일, 생후 1일 내지 생후 30일, 생후 1일 내지 생후 21일, 보다 바람직하게는, 상기 면역화시킬 식용 동물은 생후 1일 내지 생후 10일, 보다 더 바람직하게는, 생후 1일 내지 생후 9일, 보다 더 바람직하게는 생후 1일 내지 생후 8일, 보다 더 바람직하게는 생후 1일 내지 생후 7일, 보다 더 바람직하게는 생후 1일 내지 생후 6일, 보다 더 바람직하게는 생후 1일 내지 생후 5일, 보다 더 바람직하게는 생후 1일 내지 생후 4일, 보다 더 바람직하게는 생후 1일 내지 생후 3일, 보다 더 바람직하게는 생후 1일 또는 2일, 가장 바람직하게는 생후 1일 또는 생후 0일이다.
바람직하게는, 상기 면역화시킬 식용 동물은 생후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일 또는 21일이다. 보다 바람직하게는, 상기 면역화시킬 식용 동물은 생후 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일이다. 그러나, 생후 수일의 식용 동물의 백신접종 후, 상기 식용 동물의 면역계는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 대해 면역력을 형성하는데 수일까지 필요하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 바람직하게는, 상기 식용 동물은 생후 첫 1일 이내에 면역화된다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 2회 용량으로 투여된다.
실시예에 나타난 바와 같이, 본원에 제공된 면역원성 조성물은 2회 용량의 투여 후에 효과적인 것으로 입증되었다.
그러나, 상기 면역원성 조성물은 2회 이상의 용량으로 투여될 수 있으며, 제1 용량은 제2 용량(촉진약량)을 투여하기 전에 투여된다. 바람직하게는, 제1 용량은 생후 첫 2주 이내, 보다 바람직하게는 생후 첫 1주 이내, 보다 더 바람직하게는 생후 첫 1일 이내에 투여된다. 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 15일째에 투여된다. 보다 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 15일 내지 40일째에 투여된다. 보다 더 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 17일째에 투여된다. 보다 더 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 17일 내지 30일째에 투여된다. 보다 더 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 19일째에 투여된다. 보다 더 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 19일 내지 25일째에 투여된다. 가장 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 21일째에 투여된다. 2회 투여 처방계획의 바람직한 양태에서, 상기 면역원성 조성물의 제1 용량과 제2 용량은 모두 동일한 양으로 투여된다. 바람직하게는, 각 용량은 상기 특정된 바람직한 양이며, 제1 용량과 제2 용량으로 1 ml의 용량이 가장 바람직하다. 제1 용량과 제2 용량 처방계획 이외에, 대안적인 실시양태는 추가의 후속 용량을 포함한다. 예를 들어, 제3, 제4, 또는 제5 용량이 상기 양태에서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 제3, 제4 및 제5 용량의 후속 처방계획은 제1 용량과 동일한 양으로 투여되며, 상기 용량들 간의 시간 간격은 상기 언급한 제1 용량과 제2 용량 간의 시간대와 일치한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 생후 첫 1주 이내에 식용 동물에게 투여되고, 생후 2주, 3주 또는 4주 이내에 2회차가 투여된다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 근육내 또는 비강내로 투여된다.
상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은, 바람직하게는 국소 또는 전신으로 투여된다. 통상적으로 사용되는 적절한 투여 경로로는 경구 또는 비경구 투여, 예컨대 비강내, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하 뿐만 아니라 흡입을 들 수 있다. 그러나, 화합물의 성질과 작용 방식에 따라, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 다른 경로로도 투여될 수 있다. 그러나, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 근육내 또는 비강내로 투여되는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 식용 동물은 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체 음성이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 식용 동물은 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체 양성이다. 바람직하게는, 상기 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체 역가는 헤마글루티닌 억제 시험 및/또는 바이러스 중화 시험으로 측정되고, 각각 1:2 내지 1:2,048, 1:2 내지 1:1,024, 1:2 내지 1:512, 1:2 내지 1:256, 1:2 내지 1:128, 1:2 내지 1:64, 1:2 내지 1:32, 1:2 내지 1:16, 1:64 내지 1:2,048, 1:64 내지 1:1024, 또는 1:64 내지 1:512이다. 다르게는 또는 추가로, 상기 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체 역가는, 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체 양성 및 음성 샘플 각각에 대하여 확립되거나 권고된 시험에 특유한 역치를 사용하여 평가하는 ELISA 분석법으로 측정한다.
모계 유래의 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체를 판정하는 방법은 당업계의 숙련자의 일반적인 상식 범위 내에 있다.
바람직하게는, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 1x104 내지 1x109의 TCID50, 바람직하게는 1x104 내지 1x108의 TCID50, 보다 더 바람직하게는 1x104 내지 1x107의 TCID50의 EHV 벡터를 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 1x104 내지 1x107 TCID50의 EHV 벡터를 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 방법은, 면역화시키지 않은 동일한 종의 대조군 식용 동물과 비교하여, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 효능 파라미터에서의 개선을 유도한다: 체중 손실의 감소, 폐에서의 더 낮은 바이러스 부하량, 폐 병변의 감소, 바이러스 쉐딩(shedding)의 감소 및/또는 단축, 감소된 직장 온도, 감소된 임상 증상 (특히, 호흡기 증상), (중화성) 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체의 유도 증가, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 T-세포의 자극 증가, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 B-세포의 자극 증가 및 폐에서의 염증 유발성 사이토카인, 예컨대, IL-1β의 감소, 또는 이들의 조합.
본 발명의 한 양태에서, 치료 또는 예방은 치료하지 않은 동일한 종의 대조군 식용 동물과 비교하여 바이러스 부하 단계의 단축을 유도한다.
바람직하게는, 치료 또는 예방은, 치료하지 않아 그 후 특정 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 감염된 동일한 종의 대조군 식용 동물과 비교하여, 바이러스 부하 단계를 적어도 50%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 60%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 70%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 80%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 90%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 95%까지, 가장 바람직하게는 100%까지 단축시킨다.
바람직하게는, 치료 또는 예방은, 면역화시키지 않은 동일한 종의 대조군 식용 동물과 비교하여, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스의 시험감염 또는 감염 후 5일부터, 보다 바람직하게는 상기 시험감염 또는 감염 후 4일부터, 보다 바람직하게는 상기 시험감염 또는 감염 후 3일부터, 가장 바람직하게는 상기 시험감염 또는 감염 후 1일 또는 2일부터 돼지 인플루엔자 A형 바이러스의 쉐딩을 감소시킨다.
본 발명의 한 양태에서, 치료 또는 예방은 상기 인플루엔자 A형 바이러스의 시험감염 (감염) 후 1일부터 상기 바이러스의 쉐딩을 감소시킨다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 상기 인플루엔자 A형 바이러스의 동종성 및/또는 이종성 시험감염으로부터 보호한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 혈청형 H1 및/또는 H3의 상기 인플루엔자 A형 바이러스의 시험감염으로부터 보호한다.
또한, 본 발명은 치료에 사용하기 위한 본원에 기술된 EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 면역원 또는 백신으로 사용하기 위한 본원에 기술된 EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 약제로 사용하기 위한 본원에 기술된 EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 약제의 제조를 위한 본원에 기술된 EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 식용 동물에서 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 본원에 기술된 EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신의 용도에 관한 것이다.
DIVA
효과적인 DIVA 백신의 주요 이점은, 백신접종된 동물 집단에서 샘플을 채취하기 전에 급성 감염되거나 일정 기간 (적어도 약 3주) 감염된 식용 동물 (바람직하게는 돼지)을 감지해낼 수 있기 때문에, 동물 집단에서 병원체 (바람직하게는 돼지 인플루엔자 바이러스)의 확산 또는 재유입을 모니터링하는 것이 가능하다는 점이다. 따라서, 실험실 시험 결과를 기초로 백신접종된 돼지 집단에 돼지 인플루엔자 A형 바이러스가 없음을 구체적인 신뢰도로서 선언하는 것이 가능하다.
마커 백신은 신속하고 효과적인 투여를 용이하게 하고, 야생형 바이러스로 감염된 (질병과 연관된) 동물과 백신접종된 동물 간의 구별을 가능하게 한다.
본 발명의 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신은 N (뉴라미니다제) 인플루엔자 항원 인코딩 서열 및/또는 NP (핵단백질) 인플루엔자 항원 인코딩 서열을 인코딩하는 임의의 항원 인코딩 서열을 포함하지 않는다.
이와는 대조적으로, 동물을 야생형 돼지 인플루엔자 A형 바이러스로 감염시킨 후, 또는 동물을 변형된 생독 백신으로 백신접종한 후, 또는 동물을 불활성화 전바이러스 백신으로 백신접종한 후, 또는 잔류하는 모계 유래의 항체를 보유하는 동물을 감염시킨 후, 상기 감염/백신접종된 동물은 N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질)에 대한 특이적 항체를 생성/보유할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 면역원성 조성물로 백신접종된 동물에서는 이러한 N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질)에 대한 특이적 항체는 검출될 수 없다.
대표적인 면역 시험 및/또는 유전체 분석 시험에 의해, 본 발명의 면역원성 조성물로만 백신접종된 동물은, N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질)에 대한 임의의 특이적 항체 및 N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질)를 인코딩하는 임의의 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 특이적 서열을 각각 함유하지 않는다는 점에서, 야생형 돼지 인플루엔자 바이러스로 감염되거나, 변형된 생독 백신으로 백신접종되거나, 불활성화 전바이러스 백신으로 백신접종된 동물, 또는 잔류하는 모계 유래의 항체를 보유하는 동물과 구별될 수 있다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스로 감염된 식용 동물과 본원에 기술된 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신으로 백신접종된 동물을 구별하는 방법을 제공한다:
a) 식용 동물로부터 샘플을 수득하는 단계, 및
b) 상기 샘플을 면역 시험 및/또는 유전체 분석 시험에서 분석하는 단계.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역 시험은 해당 샘플이 돼지 인플루엔자의 N (뉴라미니다제) 단백질 또는 NP (핵단백질) 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는지의 여부를 시험하는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 식용 동물은, 돼지 인플루엔자의 N (뉴라미니다제) 단백질 또는 NP (핵단백질) 단백질을 특이적으로 인식하는 항체가 검출되었다면, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 감염된 것이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 유전체 분석 시험은 해당 샘플이 N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질)를 인코딩하는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 특이적 서열을 포함하는지의 여부를 시험하는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 식용 동물은, N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질)를 인코딩하는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 특이적 서열이 검출되었다면, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 감염된 것이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역 시험은 EIA (효소 면역분석법) 또는 ELISA (효소 결합 면역흡착 분석법)이거나, 또는, 상기 유전체 분석 시험은 PCR (중합효소 연쇄 반응), RT-PCR (역전사 중합효소 연쇄 반응) 또는 실시간 PCR (중합효소 연쇄 반응)이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 식용 동물은 돼지이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 샘플은 혈청 샘플이다.
바람직하게는, 야생형 SIAV의 N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질)에 특이적인 항체는, SIAV로 감염된 것으로 의심되거나 또는 본 발명에 따른 백신으로 백신접종된 돼지의 호흡기관의 절편에서 SIAV 항원을 검출하는데 사용된다. 그러한 경우, 상기 감염된 돼지 또는 변형된 생독 백신으로 백신접종된 돼지 또는 불활성화 전바이러스 백신으로 백신접종된 돼지 또는 잔류하는 모계 유래의 항체를 보유하는 돼지의 샘플만이 상기 N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질) 특이적 항체에 의해 양성적 결과를 나타낼 것이다. 이와는 대조적으로, 본 발명의 백신으로 백신접종된 돼지의 샘플은, 본 발명의 백신 중에 상기 항원의 부재로 인하여 (오직 헤마글루티닌), 상기 N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질) 특이적 항체에 의하여 결과를 나타내지 않을 것이다.
그러나, N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질)의 에피토프는 진화적으로 보존되며, SIAV 및 중화 항체에 대한 표적에 특이적이다.
따라서, 시험은 예컨대, 마이크로-웰 분석 플레이트에 가교결합된 야생형 SIAV의 N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질) 에피토프를 갖는 웰을 포함한다. 상기 가교결합은 바람직하게는 예를 들어, 폴리-L-리신과 같은 앵커 단백질을 통해 수행된다. 야생형 N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질) 에피토프를 수득하기 위한 발현 시스템은 당업계의 숙련자에게 널리 알려져 있다. 다르게는, 상기 N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질) 에피토프는 화학적으로 합성될 수도 있다.
오직 본 발명에 따른 백신으로 백신접종된 동물만이 야생형 N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질) 에피토프에 대한 항체를 형성하지 않았다. 그러나, 상기 동물은 본 발명에 따른 HA (헤마글루티닌) 에피토프에 대한 항체를 형성하였다. 그 결과, 야생형 N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질) 에피토프로 코팅된 웰에 어떠한 항체도 결합하지 않는다. 이와는 대조적으로, 웰이 본 발명에 따른 HA 에피토프로 코팅된 경우, 항체는 상기 치환된 HA 에피토프에 결합한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 ELISA는 간접 ELISA, 샌드위치 ELISA, 경쟁적 ELISA 또는 블로킹 ELISA이다.
그러나, 상기 서로 다른 ELISA 기법들은 당업계의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, ELlSA는 벤스부르트(Wensvoort) G. 등 (Vet. Microbiol. 17(2): 129-140, 1988), 로비올로(Robiolo) B. 등 (J. Virol. Methods. 166(1-2): 21-27, 2010) 및 콜리즌(Colijn), E.O. 등 (Vet. Microbiology 59: 15-25, 1997)에 의해 기술된 바 있다.
바람직하게는, 야생형 SIAV로 감염된 동물 또는 변형된 생독 백신으로 백신접종된 동물 또는 불활성화 전바이러스 백신으로 백신접종된 동물 또는 잔류하는 모계 유래의 항체를 보유하는 동물과 본 발명의 백신으로만 백신접종된 동물을 구별하기 위한 시험은 호흡기 세포와 역전사효소의 RNA 분리 후 cDNA의 증폭에 의해 제공된다. PCR은 N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질)에 대한 특정 프라이머를 사용하여 수행할 수 있다. 이 경우, 양성적 PCR 신호가 존재한다면, 돼지는 야생형 SIAV에 감염된 것이다. 그러나, 어떠한 N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질) 특이적 서열도 증폭될 수 없는 경우, 상기 동물은 본 발명의 백신으로 백신접종된 것이다.
추가로, N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질) 및/또는 특정 HA (헤마글루티닌)를 인식하는 실시간 기반 기법의 프라이머 및/또는 프로브를 사용할 수도 있다. 그러나, 이러한 방법들은 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 유전체 분석 시험은 PCR (중합효소 연쇄 반응), RT-PCR (역전사 중합효소 연쇄 반응) 또는 실시간 PCR (중합효소 연쇄 반응)이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 출원시에 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 용어의 의미 및 범위는 명확해야 하지만, 임의의 잠재적 모호성이 있는 경우에는 본 명세서에 제공된 정의가 임의의 사전 또는 외연적 정의보다 우선한다. 또한, 문맥상 다르게 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함하고, 복수의 용어는 단수를 포함한다. 본 명세서에서, "또는"의 사용은, 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, "포함하는"이라는 용어 뿐만 아니라 "포함한다" 및 "포함되는"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 본 명세서에서 언급되는 모든 특허 및 간행물은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
본 발명의 실시는, 달리 언급하지 않는 한, 당해 분야의 기술 범위에 속하는, 바이러스학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 단백질 화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989)], [DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985)], [Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)], [Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)], [Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986)], [Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986)], [Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)], [the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)], [Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press)] 및 [Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)]을 참조한다.
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 특정한 DNA, 폴리펩타이드 서열 또는 공정 파라미터에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 하는데, 이는 이러한 것들이 물론 다양할 수 있기 때문이다. 본 명세서에 사용되는 용어는 단지 본 발명의 특정 실시양태를 설명하기 위한 목적일 뿐이지, 이를 한정하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는, 문맥상 명백하게 달리 언급하지 않는 한, 복수에 대한 언급을 포함한다는 것에 주의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "항원"에 대한 언급은 2종 이상의 항원의 혼합물을 포함하며, "부형제"에 대한 언급은 2종 이상의 부형제의 혼합물을 포함하는 것 등을 들 수 있다.
분자 생물학 정의
당해 분야에 알려진 "벡터"라는 용어는, 숙주 세포에 유전 물질을 전달하는데 사용되는 폴리뉴클레오타이드 작제물, 일반적으로는 플라스미드 또는 박테리아 인공 염색체를 지칭한다. 벡터는, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 파지, 박테리아 인공 염색체, 코스미드 또는 플라스미드일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 벡터는 DNA 또는 RNA로 구성되거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 DNA로 구성된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 감염성 바이러스로 구성된다. 이러한 바이러스 벡터는 바이러스 벡터의 복제시에 세포 배양물에서나 숙주 동물에서 어떠한 기능도 갖지 않는 외래 유전자를 운반하는 방식으로 조작된 바이러스 유전체를 함유한다. 본 개시 내용의 특정 양태에 따르면, 벡터는 숙주 세포 또는 유기체의 형질감염을 위한, 백신, 예를 들어, DNA 백신으로서 사용하기 위한 또는 유전자 발현 목적을 위한 유전 물질의 단순한 전달과 같은 다양한 양태들에 대해 사용될 수 있다. 유전자 발현은 유전자로 불리는 특정 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 지시되는 세포에서 단백질의 생합성을 기술하는 용어이다. 특정 양태에서, 벡터는 적절한 환경에 존재할 때 벡터에 의해 운반되는 1종 이상의 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 발현을 지시할 수 있는 백터인 "발현 벡터"일 수 있다.
발현용 벡터 (또는 재조합체)를 제조 및/또는 사용하기 위한 방법 및 벡터는, 특히 하기 문헌에 개시된 방법들 또는 이들과 유사한 방법들을 사용할 수 있다: 미국 특허 4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683, 5,494,807, 4,722,848, 5,942,235, 5,364,773, 5,762,938, 5,770,212, 5,942,235 및 382,425, PCT 국제공개공보 WO 94/16716, WO 96/39491 및 WO 95/30018; 문헌 [Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996], [Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996], 스미스 등의 미국 특허 4,745,051 (재조합 바큘로바이러스), 문헌 [Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.)], [Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165], [Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406], 유럽 공개특허 EPA 0 370 573, 1986년 10월 16일자로 출원된 미국 특허 출원 920,197, 유럽 공개특허 265 785; 미국 특허 4,769,331 (재조합 헤르페스바이러스), 문헌 [Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996], [Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996], [Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996], [Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996], [Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991], 미국 특허 5,591,439 및 5,552,143; 국제공개공보 WO 98/00166; 1996년 7월 3일자로 출원되고 특허결정된 미국 출원 08/675,556 및 08/675,566 (재조합 아데노바이러스); 문헌 [Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993], [Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65], [Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990], [Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434], PCT 국제공개공보 WO 91/11525, 문헌 [Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561], [Science, 259: 1745-49, 1993] 및 [McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996] 및 미국 특허 5,591,639, 5,589,466 및 5,580,859, 및 국제공개공보 WO 90/11092, WO 93/19183, WO 94/21797, WO 95/11307 및 WO 95/20660; 문헌 [Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors]. 또한, 국제공개공보 WO 98/33510; 문헌 [Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (lentiviral expression system)], 스탠포드 등의 미국 특허 4,945,050; 문헌 [Fischbachet al. (Intracel)]; 국제공개공보 WO 90/01543; 문헌 [Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (DNA vector systems)], 스조카 등의 미국 특허 4,394,448 (DNA를 생세포에 삽입하는 방법); 맥코믹 등의 미국 특허 5,677,178 (세포병변 바이러스의 용도) 및 미국 특허 5,928,913 (유전자 전달용 벡터); 및 본 명세서에 인용된 기타 문헌들을 참조한다.
"바이러스 벡터"라는 용어는, 바이러스의 숙주 세포 내로의 진입이 특정한 생물학적 활성을 유도하는 방식, 예컨대 벡터에 의해 운반된 이식유전자의 발현을 유도하는 방식으로, 재조합 DNA 기술에 의해 조작된 유전적으로 변형된 바이러스를 나타낸다. 특정 양태에서, 이식유전자는 항원이다. 바이러스 벡터는 표적 세포, 조직 또는 유기체에서 복제 능력이 있거나 있지 않을 수 있다.
바이러스 벡터의 제조는, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)] 또는 [K. Maramorosch and H. Koprowski (Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK (2014)]에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 제한효소인 엔도뉴클레아제 분해, 결찰, 형질전환, 플라스미드 정제, DNA 시퀀싱, 세포 배양에서의 형질감염의 표준 기술들을 포함하지만 이들에 한정되지는 않는, 당해 분야에 잘 알려진 임의의 적합한 유전 공학 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
바이러스 벡터는 임의의 공지된 유기체의 유전체로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 서열은 그 본래의 형태로 도입될 수 있거나, 또는 목적하는 활성을 수득하기 위해 임의의 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 서열은 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다.
바이러스 벡터는 2종 이상의 관심 대상 단백질에 대한 코딩 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 관심 대상의 제1 단백질에 대한 코딩 영역 및 관심 대상의 제2 단백질에 대한 코딩 영역을 포함할 수 있다. 관심 대상의 제1 단백질 및 관심 대상의 제2 단백질은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 관심 대상의 제3 또는 제4 단백질에 대한 코딩 영역(들)을 포함할 수 있다. 관심 대상의 제3 및 제4 단백질은 동일하거나 상이할 수 있다. 하나의 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 2종 이상의 관심 대상 단백질의 총 길이는 다를 수 있다. 예를 들어, 2종 이상의 단백질의 총 길이는 적어도 약 200개의 아미노산, 적어도 약 250개의 아미노산, 적어도 약 300개의 아미노산, 적어도 약 350개의 아미노산, 적어도 약 400개의 아미노산, 적어도 약 450개의 아미노산, 적어도 약 500개의 아미노산, 적어도 약 550개의 아미노산, 적어도 약 600개의 아미노산, 적어도 약 650개의 아미노산, 적어도 약 700개의 아미노산, 적어도 약 750개의 아미노산, 적어도 약 800개의 아미노산 또는 그 이상일 수 있다.
바람직한 바이러스 벡터로는 EHV-1 또는 EHV-4로부터 유래된 것과 같은 헤르페스 바이러스 벡터를 포함한다.
본 개시 내용의 특정 양태에 따르면, "바이러스 벡터" 또는 대안적으로 "바이러스 작제물"이라는 용어는, EHV-1, EHV-3, EHV-4, EHV-8 및 EHV-9와 같은 헤르페스바이러스과로부터 선택된 바이러스로부터 유래된 재조합 바이러스 작제물을 지칭한다. 바람직한 바이러스 벡터로는 EHV-1 또는 EHV-4로부터 유래된 것과 같은 헤르페스 바이러스 벡터를 포함한다.
"바이러스 벡터" 및 "바이러스 작제물"이라는 용어는 상호교환적으로 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "작제물"이라는 용어는, 인공적으로 생성된 플라스미드, BAC 또는 재조합 바이러스와 같은 재조합 핵산을 지칭한다.
"플라스미드"라는 용어는 박테리아 숙주 세포 내에서 박테리아 염색체와 독립적으로 복제하는 세포질 DNA를 지칭한다. 본 발명의 특정 양태에서, "플라스미드" 및/또는 "전달 플라스미드"라는 용어는, 예를 들어, 바이러스 벡터에 삽입하기 위한 발현 카세트의 작제에 유용한 재조합 DNA 기술의 성분을 지칭한다. 또 다른 특정 양태에서, "플라스미드"라는 용어는 DNA 백신 접종 목적으로 유용한 플라스미드를 특정하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 상호교환 가능하며, 임의의 핵산을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "핵산", "핵산 서열", "뉴클레오타이드 서열", "폴리뉴클레오타이드", "폴리뉴클레오타이드 서열", "RNA 서열", "cDNA 서열" 또는 "DNA 서열"이라는 용어는, 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 및 이들의 단편 및 일부를 지칭하거나, 또는 단일 또는 이중 가닥일 수 있고 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는 유전체 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 지칭한다. 서열은 비-코딩 서열, 코딩 서열 또는 이들 양자 모두의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
"핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 구체적으로 5개의 생체에 존재하는 염기 (아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신 및 우라실) 이외의 염기로 구성된 핵산도 포함한다.
"조절 핵산", "조절 요소" 및 "발현 제어 요소"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어들은 프로모터, 프로모터 서열, RNA 폴리머라아제와 전사 인자의 기본 상호 작용에 필요한 핵심 성분, 상향부 성분, 인핸서 및 반응 성분들을 비롯하여 전사를 촉진하거나 조절하는 모든 성분에 광범위하게 사용되거나 이들을 포함한다. 원핵 생물에서의 예시적인 조절 요소로는 프로모터, 작동유전자 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포에서 사용되는 조절 요소는, 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현 및/또는 인코딩된 폴리펩타이드의 생성을 제공하고/하거나 조절하는, 프로모터, 인핸서, 스플라이싱 신호, 폴리아데닐화 신호, 종결자, 단백질 분해 신호, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 피코르나바이러스 2A 서열 등과 같은 전사 및 번역 제어 서열을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
"내부 리보솜 진입 부위" 또는 "IRES"는 IRES의 유전자 5'와 독립적인 번역 개시를 기능적으로 촉진하여 2개의 시스트론 (오픈 리딩 프레임)이 동물 세포에서 단일 전사물로부터 번역되도록 하는 서열을 나타낸다. IRES는 그의 바로 하향부의 오픈 리딩 프레임의 번역을 위한 독립적인 리보솜 진입 부위를 제공한다. 다시스트론성(polycistronic), 즉 mRNA로부터 순차적으로 번역되는 수개의 상이한 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있는 박테리아 mRNA와는 달리, 동물 세포의 대부분의 mRNA는 단시스트론성이며 단 하나의 폴리펩타이드의 합성을 위한 코드이다. 진핵 세포에서 다시스트론성 전사물의 경우, 번역은 5' 최말단의 번역 개시 부위에서 개시하여 제1 정지 코돈에서 종결하며, 전사물은 리보솜에서 방출되어 mRNA에서 제1 인코딩된 폴리펩타이드만의 번역을 유도한다. 진핵 세포에서, 전사물에서 제2 또는 후속 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 IRES를 갖는 다시스트론성 전사물은, 그 하향부 오픈 리딩 프레임의 순차적 번역이 동일한 전사물에 의해 인코딩된 2종 이상의 폴리펩타이드를 생산할 수 있도록 한다. IRES는 길이가 다양할 수 있으며, 다양한 공급원, 예를 들어, 뇌심근염 바이러스 (EMCV), 피코르나바이러스 (예를 들어, 구제역 바이러스, FMDV 또는 폴리오 바이러스 (PV) 또는 C형 간염 바이러스 (HCV)로부터 유래할 수 있다. 다양한 IRES 서열 및 벡터 작제물에서의 이들의 사용은 기술된 바 있으며 당해 분야에 잘 알려져 있다. 하향부 코딩 서열은, 하향부 유전자의 발현에 부정적 영향을 미치지 않을 임의의 거리에서 IRES의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. IRES와 하향부 유전자의 개시 사이의 최적 또는 허용가능 거리는, 해당 거리를 달리 하고 거리의 함수로서 발현을 측정함으로써 용이하게 결정될 수 있다.
"2a" 또는 "2a 펩타이드"라는 용어는, 리보솜-스키핑으로서 정의되는 과정에 의해 단백질들 사이의 동시 번역 절단을 매개할 수 있는 링커의 역할을 하는, 2a 및 '2a-유사'로 기술되는 짧은 올리고펩타이드 서열을 의미한다. 이러한 2a 및 '2a-유사' 서열 (피코르나바이러스과 및 다른 바이러스 또는 세포 서열로부터 유래)은 복수의 유전자 서열을 단일 유전자로 연결시켜 동일한 세포 내의 공동 발현을 보장하는데 사용될 수 있다 (문헌 [Luke and Ryan, 2013] 참조).
본 명세서에서 사용되는 "프로모터" 또는 "프로모터 서열"이라는 용어는, RNA 폴리머라아제의 결합을 허용하여 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 전형적으로, 프로모터는 유전자의 전사 개시 부위에 근접한 유전자의 5'-비코딩 영역 내에 위치한다. 전사의 개시에서 기능하는 프로모터 내의 서열 요소는 흔히 공통 뉴클레오타이드 서열을 특징으로 한다. 프로모터의 예로는 박테리아, 효모, 식물, 바이러스 및 동물, 예컨대, 포유 동물 (말, 돼지, 소 및 인간 포함), 조류 또는 곤충으로부터 유래하는 프로모터를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 프로모터는 유도성, 억제성 및/또는 항시성일 수 있다. 유도성 프로모터는 온도 변화와 같은 배양 조건의 일부 변화에 대응하여 이의 제어하에 DNA로부터 전사의 증가된 수준을 개시한다 (문헌 [Ptashne, 2014]). 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 프로모터의 예로는, 예를 들어, SV40 대형 T, HCMV 및 MCMV 전초기 유전자 1, 인간 신장인자 알파 프로모터, 바큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터가 있다.
본 발명의 문맥상, 본 명세서에서 사용되는 프로모터라는 용어는, 특히 기능성 단편, 예를 들어, 4pgG600 (서열번호 1)의 절단부 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 지칭하며, 바람직하게는 서열 동일성은 전체 길이에 대해 (적어도) 72% (또는 그 이상)이다. 또한, 본 발명의 문맥상, 본 명세서에서 사용되는 프로모터라는 용어는, 특히 기능성 단편, 예를 들어, 4pMCP600 (서열번호 2)의 절단부 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 지칭하며, 바람직하게는 서열 동일성은 전체 길이에 대해 (적어도) 78% (또는 그 이상)이다. 가장 바람직하게는, "프로모터"는 p430 (서열번호 3) 또는 p455 (서열번호 4)를 지칭한다. "p430", "gG 430" 및 "430"이라는 용어는 명세서, 도면, 서열 목록 등 전체에 걸쳐 동의어이며 상호교환적으로 사용된다. "p455", "MCP 455" 및 "455"이라는 용어는 명세서, 도면, 서열 목록 등 전체에 걸쳐 동의어이며 상호교환적으로 사용된다.
"인핸서"라는 용어는, 시스 위치에서 프로모터의 활성에 작용하여 이 프로모터에 기능적으로 연결된 유전자 또는 코딩 서열의 전사를 자극하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 프로모터와 달리, 인핸서의 효과는 위치 및 배향과 무관하므로, 인트론 내에서 또는 심지어 암호화 영역 내에서 전사 단위의 앞 또는 뒤에 위치할 수 있다. 인핸서는 전사 단위의 바로 근처 및 프로모터로부터 상당한 거리에 모두 위치할 수 있다. 프로모터와 물리적 및 기능적 중첩을 갖는 것도 가능하다. 통상의 기술자라면 폴리뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, ATCC에 기탁되어 있거나, 시판 공급원 및 개인적인 공급원으로부터 유래함) 내에서 클로닝된 독립적인 요소 또는 요소들로서 이용가능한 다양한 공급원 유래의 다수의 인핸서 (및 GenBank와 같은 데이터뱅크에 기탁된 인핸서, 예를 들어, SV40 인핸서, CMV 인핸서, 폴리오마 인핸서, 아데노바이러스 인핸서)를 알 수 있을 것이다. 다수의 프로모터 서열은 흔히사용되는 CMV 프로모터와 같은 인핸서 서열도 함유한다. 인간 CMV 인핸서는 지금까지 확인된 가장 강력한 인핸서 중 하나이다. 유도성 인핸서의 하나의 예로는 글루코코르티코이드 또는 중금속에 의해 자극될 수 있는 메탈로티오네인 인핸서가 있다.
"상보적인 뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 DNA 또는 RNA와 같은 폴리뉴클레오타이드의 2쌍의 가닥 중 한 가닥을 나타낸다. 상보적인 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 각각의 아데노신에 대해 티민 (또는 RNA 경우에는 우라실), 각각의 구아닌에 대해 사이토신 및 그 반대를 함유하도록 짝지어진 가닥의 뉴클레오타이드 서열을 반영한다. 예를 들어, 5'-GCATAC-3'의 상보적인 뉴클레오타이드 서열은 3'-CGTATG-5' 또는 RNA 경우에는 3'-CGUAUG-5'이다.
본 명세서에서 사용되는 "유전자" 및 "관심 대상 유전자"라는 용어는 동일한 의미를 가지며, 관심 대상 산물을 암호화하는 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 유전자는 코딩 서열에 선행하는 조절 서열 (5'-비코딩 또는 비번역 서열) 및 코딩 서열에 후행하는 조절 서열 (3'-비코딩 또는 비번역 서열)을 추가로 포함할 수 있다. 선택된 서열은 전장 또는 절단된 융합 또는 태그된 유전자일 수 있으며, cDNA, 유전체 DNA 또는 DNA 단편일 수 있다. 폴리펩타이드 또는 RNA를 인코딩하는 유전체 DNA는, 성숙한 전령 RNA (mRNA)로부터 스플라이싱되어 동일한 폴리펩타이드 또는 RNA를 인코딩하는 cDNA에는 존재하지 않는 비암호화 영역 (즉, 인트론)을 포함할 수 있는 것으로 일반적으로 이해된다. 이것은 본래의 서열, 즉, 자연 발생적인 형태(들)일 수 있거나, 돌연변이될 수 있거나, 상이한 공급원으로부터 유래되거나 그렇지 않으면 목적하는 바에 따라 변형된 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 선택된 숙주 세포에서 코돈 사용 또는 태그화를 최적화하기 위한 코돈 최적화를 포함한다. 또한, 이들은 몇 가지 예를 들면, (잠재) 스플라이스 공여체, 수용체 부위 및 분지점, 폴리아데닐화 신호, TATA-박스, 카이-부위, 리보솜 진입 부위, 반복 서열, 2차 구조 (예를 들어, 스템 루프), 전사 인자 또는 다른 조절 인자에 대한 결합 부위, 제한 효소 부위 등과 같은 시스 작용 부위의 제거 또는 부가를 포함할 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 선택된 서열은 분비된 세포질, 핵, 막 결합 또는 세포 표면 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "관심 대상 뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는, 반드시 유전자를 포함하는 것은 아니지만 유전자 또는 다른 유전 정보의 요소 또는 부분, 예를 들어, ori (복제 원점)을 포함할 수 있기 때문에 관심 대상 유전자 보다 더 일반적인 용어이다. 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열은 코딩 서열을 포함하는지 여부와는 관계없이 임의의 DNA 또는 RNA 서열일 수 있다.
"오픈 리딩 프레임" 또는 "ORF"는 ATG 또는 AUG와 같은 번역 시작 신호 또는 개시 코돈 및 종결 코돈을 포함하는 핵산 서열, 즉, DNA 또는 RNA의 길이를 지칭하며, 잠재적으로 폴리펩타이드 서열로 번역될 수 있다.
"전사"라는 용어는 세포에서 mRNA의 생합성을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 "발현"이라는 용어는 숙주 세포 내에서 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다. 본 발명의 특정 양태에 따르면, "발현"이라는 용어는 숙주 세포 내에서 이종 및/또는 외인성 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다. 숙주 세포에서 목적하는 산물의 발현 수준은, 세포에 존재하는 상응하는 RNA 또는 mRNA의 양, 또는 선택된 서열에 의해 암호화된 목적하는 폴리펩타이드의 양을 기초로 결정할 수 있다. 예를 들어, 선택된 서열로부터 전사된 mRNA는 노던 블롯 하이브리드화, 리보뉴클레아제 RNA 보호, 세포 RNA에 대한 원위치 하이브리드화에 의해 또는 RTqPCR (역전사 후 정량적 PCR)에 의해 정량화될 수 있다. 선택된 서열로부터 발현된 단백질은 다양한 방법에 의해, 예를 들어, ELISA에 의해, 웨스턴 블롯팅에 의해, 방사선 면역 검정법에 의해, 면역침전법에 의해, 단백질의 생물학적 활성에 대한 검정에 의해, 또는 단백질의 면역염색 후의 FACS 분석에 의해 수행될 수 있다.
"발현 카세트" 또는 "전사 단위" 또는 "발현 단위"라는 용어는, 전사하고자 하는 1종 이상의 유전자를 함유하는 벡터, 작제물 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 내의 영역을 정의하며, 여기서, 발현 카세트 내에 함유된 조절 요소를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 서열 뿐만 아니라 전사된 유전자(들)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열도 서로 작동가능하게 연결되어 있다. 이들은 프로모터로부터 전사되고, 전사는 적어도 하나의 폴리아데닐화 신호에 의해 종결된다. 하나의 특정 양태에서, 이들은 하나의 단일 프로모터로부터 전사된다. 결과적으로, 상이한 유전자들은 적어도 전사적으로 연결되어 있다. 하나 이상의 단백질 또는 산물은 각 전사 단위 (다시스트론성 전사 단위)로부터 전사되고 발현될 수 있다. 각 전사 단위는 해당 단위 내에 함유되는 임의의 선택된 서열의 전사 및 번역에 필요한 조절 요소를 포함할 것이다. 각 전사 단위는 동일하거나 상이한 조절 요소를 함유할 수 있다. 예를 들어, 각 전사 단위는 동일한 종결자를 함유할 수 있으며, IRES 요소 또는 인트론은 전사 단위 내에서 유전자의 기능적 연결을 위해 사용될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 전사 단위를 함유할 수 있다.
"증가된 발현", "증가된 역가 또는 생산성" 또는 "개선된 발현 또는 생산성"이라는 용어는, 적절한 대조군과의 비교에서, 예를 들어, cDNA에 의해 인코딩되는 단백질 대 인트론-함유 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 비교에서, 숙주 세포 내로 도입된 이종성 및/또는 외인성 서열, 예를 들어, 치료학적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현, 합성 또는 분비의 증가를 의미한다. 본 발명에 따른 세포가 본 명세서에 기재된 본 발명에 따른 방법에 따라 배양되는 경우에 역가 또는 생산성은 증가하며, 이 세포의 특정 생산성 또는 역가는 적어도 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 5배 증가한다. 본 발명에 따른 세포가 본 명세서에 기재된 본 발명에 따른 방법에 따라 배양되는 경우에 역가 또는 생산성도 또한 증가하며, 이 세포의 특정 생산성 또는 역가는 적어도 1.2배 또는 적어도 1.5배 또는 적어도 2배 또는 적어도 3배 증가한다. 본 발명에 따른 세포가 본 명세서에 기재된 본 발명에 따른 방법에 따라 배양되는 경우에 특히 역가 또는 생산성도 또한 증가하며, 이 세포의 특정 생산성 또는 역가는 적어도 1.2배 내지 5배, 바람직하게는 1.5배 내지 5배, 보다 바람직하게는 2배 내지 5배, 특히 바람직하게는 3배 내지 5배 증가한다. "증가된 발현"은 더 많은 세포가 실제로 관심 대상 유전자/서열을 발현하고 있다는 것도 의미할 수 있다. 예를 들어, 증가된 발현은 본 발명의 신규한 프로모터가 다른 프로모터와 비교하여 바이러스 복제 주기 동안 더 긴 시간 동안 활성이다는 것을 의미할 수 있다.
증가된 발현, 역가 또는 생산성은 본 발명에 따른 이종성 벡터를 사용함으로써 수득될 수 있다. 이것은 추가의 선택가능한 마커로서 1종 이상의 형광 단백질 (예를 들어, GFP) 또는 세포 표면 마커를 함유하는 재조합 숙주 세포의 FACS-보조된 선별과 같은 다른 접근법과 조합될 수 있다. 증가된 발현을 수득하는 다른 방법 및 상이한 방법들의 조합이 또한 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어, 염색질 구조를 조작하기 위한 시스-활성 요소 (예를 들어, LCR, UCOE, EASE, 격리체 (isolator), S/MAR, STAR 요소)의 사용, (인공) 전사 인자의 사용, 내인성 또는 이종 및/또는 외인성 유전자 발현을 상향조절하거나 mRNA 또는 단백질의 안정성 (반감기)을 개선시키거나 mRNA 전사의 개시를 개선시키거나 에피솜 플라스미드 (예를 들어, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, EBV 또는 BPV와 같은 복제 원점으로서 바이러스 서열의 사용에 기초)의 사용에 의해 유전자 용량을 증가시키기 위한 천연 또는 합성 제제에 의한 세포의 처리, 증폭-촉진 서열 또는 DNA 연쇄체 기반의 시험관내 증폭 시스템의 사용에 기초한다.
"증가된 발현"을 측정하기 위한 검정법에는 다중 반응 모니터링 (MRM)과 같은 LC-MS/MS-기반 단백질 측정법; 웨스턴 블롯, 도트 블롯 또는 면역 확산 및 유세포 분석법과 같은 항체-기반 검출 방법; 및 헤마글루티닌화 검정에 의한 생물학적 활성 측정법이 있다.
"프로모터 활성"은 각각의 프로모터의 제어하에 전사된 mRNA의 정량화에 의해 간접적으로 측정된다. mRNA는 내인성 표준물에 대한 RTqPCR에 의해 정량화된다.
"바이러스 부하"라는 용어는 당업계의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 바이러스 부하라는 용어는 본원에서 "바이러스 역가"라는 용어와 서로 교환하여 사용할 수 있다. 바이러스 부하 또는 바이러스 역가는 활성 바이러스 감염의 중증도의 척도이며, 당업계의 숙련자에게 공지된 방법으로 측정될 수 있다. 상기 측정은 바이러스 단백질에 대한 항체의 결합 및 추가의 검출에 의하거나, 또는 다르게는, RT-PCR과 같은 증폭 방법에 의한 바이러스 핵산의 검출에 의한 것과 같은 바이러스 단백질의 검출을 기초로 할 수 있다. 핵산 증폭 방법에 의한 혈장에서의 비리온 결합된 바이러스 RNA의 모니터링은 레트로바이러스성 질환의 상태 및 진행을 평가하고, 예방적 및 치료적 개입의 효율성을 평가하는데 널리 사용되는 파라미터이다. 예를 들어, 바이러스 부하 또는 바이러스 역가는 관련된 체액 중의 살아있는 바이러스의 양, 예컨대 혈장 1밀리리터당 RNA 복제물의 수를 추정하여 계산될 수 있다. 바람직하게는, "바이러스 부하" 또는 "바이러스 역가"라는 용어는 바이러스 제제의 부피당 감염성 단위의 척도이다. 바이러스 역가는 생물학적 절차의 종말점이며, 병행하여 수행된 특정 비율의 시험물들이 효과를 나타내는 희석률로서 정의된다 (문헌 [Reed and Muench, 1938]). 구체적으로, 1 밀리리터 당 조직 배양 감염 용량 50 (TCID50/ml)은, 희석과 병행하여 접종된 세포 배양물 수의 50%가 감염되는 바이러스 제제의 희석을 나타낸다.
"전사-조절 요소"는 일반적으로 발현시키고자 하는 유전자 서열의 프로모터 상향부, 전사 개시 및 종결 부위 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
"전사 개시 부위"라는 용어는 1차 전사물, 즉, mRNA 전구체에 혼입된 제1 핵산에 상응하는 작제물 내의 핵산을 지칭한다. 전사 개시 부위는 프로모터 서열과 중첩될 수 있다.
"종결 신호" 또는 "종결자" 또는 "폴리아데닐화 신호" 또는 "폴리A" 또는 "전사 종결 부위 " 또는 "전사 종결 인자"는, 진핵세포 mRNA의 3'-말단의 특정 부위에서의 절단 및 절단된 3'-말단에서 약 100~200개의 아데닌 뉴클레오타이드 (폴리 A 테일)의 서열의 전사후 도입을 유발시켜서, RNA 폴리머라아제가 전사를 종결하게 하도록 하는 신호 서열이다. 폴리아데닐화 신호는 절단 부위의 약 10~30개의 뉴클레오타이드 상향부의 서열 AATAAA 및 하향부에 위치한 서열을 포함한다. tk 폴리 A, SV40 후기 및 초기 폴리A, BGH 폴리A (예를 들어, 미국 특허 5,122,458에 개시되어 있음) 또는 햄스터 성장 호르몬 폴리 A (국제공개공보 WO 2010010107)와 같은 다양한 폴리아데닐화 성분들이 공지되어 있다.
"번역 조절 요소"는 발현하고자 하는 각각의 개별 폴리펩타이드에 대한 번역 개시 부위 (AUG), 정지 코돈 및 폴리A 신호를 포함한다. 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)가 일부 작제물에 포함될 수 있다. 발현을 최적화하기 위해, 발현하고자 하는 핵산 서열의 5'- 및/또는 3'-비번역 영역을 제거, 부가 또는 변경하여 전사 또는 번역의 수준에서 발현을 감소시키거나 방해할 수 있는 임의의 잠재적인 여분의 부적절한 대체 번역 개시 코돈 또는 다른 서열을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 공통 리보솜 결합 부위 (Kozak 서열)는 개시 코돈의 바로 상향부에 삽입되어 번역을 증진시키고, 이에 따라 발현을 증진시킬 수 있다. 이러한 리보솜 결합 부위 주변의 A/U 함량이 더욱 증가하면 리보솜 결합은 더욱 효율적이다.
정의에 따르면, 숙주 세포에 삽입된 모든 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 모든 유전자 및 이에 의해 암호화된 각각의 단백질 또는 RNA는, 상이한 (바이러스) 종으로부터 유래하는 경우, 숙주 세포에 대하여 "외인성", "외인성 서열", "외인성 유전자", "외인성 코딩 서열", "외인성 항원 인코딩 서열"로 지칭한다. 따라서, 본 발명의 EHV-4 기반 프로모터는 EHV-1 바이러스 벡터의 관점에서 외인성이다. 항원과 같은 관심 대상 서열 또는 유전자와 관련하여, 본 명세서에서 사용되는 "외인성" 또는 "외인성 항원 인코딩 서열"이라는 용어는, 상기 관심 대상 서열 또는 유전자, 구체적으로는 상기 항원이 이의 천연 종의 환경에서 발현된다는 것을 의미한다. 따라서, 돼지 IAV로부터 유래된 H3 항원은 EHV-1 벡터에 대한 외인성 항원의 하나의 예이다. 따라서, 말에서 유래하지 않은 항원과 같은 임의의 관심 대상의 말에서 유래하지 않은 서열 또는 유전자는, 관심 대상의 외인성 서열 또는 유전자 또는 본 발명의 특정 양태에 따른 항원이다.
정의에 따르면, 숙주 세포에 삽입된 모든 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 모든 유전자 및 이에 의해 암호화된 각각의 단백질 또는 RNA는, 숙주 세포에 대하여 "이종성", "이종성 서열", "이종성 유전자", "이종성 코딩 서열", "이식유전자" 또는 "이종성 단백질"로서 지칭한다. 이것은, 심지어 도입하고자 하는 서열 또는 도입하고자 하는 유전자가 숙주 세포의 내인성 서열 또는 내인성 유전자와 동일한 경우에도 적용된다. 예를 들어, EHV-4 야생형 바이러스에서와 상이한 부위에서 또는 변형된 형태로 EHV-4 바이러스 벡터에 도입된 EHV-4 프로모터 서열은 정의에 의하자면 이종성 서열이다. 항원과 같은 관심 대상 서열 또는 유전자와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "이종성"이라는 용어는, 상기 관심 대상 서열 또는 유전자, 구체적으로는 상기 항원이 이의 천연 아종의 환경에서 발현된다는 것을 의미한다. 따라서, EHV-1을 제외한 임의의 말 알파헤르페스 바이러스, 예를 들어, EHV-3 및 EHV-8로부터 유래된 항원과 같은 임의의 관심 대상의 비-EHV-1 특정 서열 또는 유전자는, 관심 대상의 이종성 서열 또는 유전자 또는 본 발명의 특정 양태에 따른 항원이다.
"비자연 발생적"이란 용어는 이러한 맥락에서 자연 발생적이지 않은 항원과 같은 임의의 관심 대상 서열 또는 유전자, 예를 들어, 상이한 종으로부터 유래된 항원과 같은 관심 대상 하이브리드 서열 또는 서열 또는 유전자, 또는 인공 돌연변이, 삽입, 결실 등으로 인해 자연적인 산물이 아닌 항원과 같은 관심 대상 서열 또는 유전자를 의미한다.
"재조합체"라는 용어는 본 발명의 명세서 전체에 걸쳐 "자연 발생적이지 않은", "이종성" 및 "외인성"이라는 용어와 서로 교환하여 사용된다. 따라서, "재조합" 단백질은 이종성 또는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 발현된 단백질이다. 바이러스와 관련하여 사용되는 재조합체라는 용어는, 바이러스 유전체의 인공적 조작에 의해 생성된 바이러스를 의미한다. 외인성 항원 인코딩 서열과 같은 이종성 또는 외인성 서열을 포함하는 바이러스는 재조합 바이러스이다. 재조합 바이러스라는 용어 및 비자연 발생적인 바이러스라는 용어는 서로 교환하여 사용된다.
따라서, "이종성 벡터"라는 용어는 이종성 또는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 의미한다. "재조합 벡터"라는 용어는 이종성 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "작동가능하게 연결되는"이라는 용어는, 조절 요소와 유전자 또는 이의 코딩 영역 사이의 연결을 기술하는데 사용된다. 통상적으로, 유전자 발현은 1종 이상의 조절 요소, 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 항시성 또는 유도성 프로모터, 조직 특이적인 조절 요소 및 인핸서의 제어 하에 놓이게 된다. 유전자 또는 코딩 영역은 조절 요소에 "작동가능하게 연결된다" 또는 "작동적으로 연결된다" 또는 "작동가능하게 결합된다"고 하며, 유전자 또는 코딩 영역이 조절 요소에 의해 제어되거나 영향을 받는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 암호화 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면, 프로모터는 암호화 서열에 작동가능하게 연결되어 있다.
또한, 본 명세서의 범위 내에서, "기능적 연결", "기능적으로 연결된" 또는 "작동가능하게 연결된"이라는 용어는, 2종 이상의 핵산 서열 또는 서열 요소를 의도한 방식으로 기능하도록 하는 방식으로 위치시키는 것을 의미한다 . 예를 들어, 프로모터/인핸서 또는 종결자는, 시스 위치에서 연결된 유전자 서열의 전사를 제어하거나 조절할 수 있다면, 암호화 유전자 서열에 기능적으로 연결되어 있다. 일반적으로, 반드시 다 그런 것은 아니지만, 기능적으로 연결된 DNA 서열은 2개의 폴리펩타이드 코딩 영역을 연결하는데 필요한 경우에 연속적이거나, 분비 신호 펩타이드의 경우에 리딩 프레임에서 연속적이다. 그러나, 작동가능하게 연결된 프로모터가 일반적으로 상향부에 위치하거나 작동가능하게 연결된 종결자가 일반적으로 코딩 서열의 하향부에 위치하더라도, 반드시 이와 인접하는 것은 아니다. 인핸서는 암호화 서열의 전사를 증가시키는 한 연속적일 필요는 없다. 이를 위해, 이들은 암호화 서열의 상향부 또는 하향부에 위치할 수 있으며, 심지어 얼마간의 거리를 두고 위치할 수 있다. 폴리아데닐화 부위는, 전사가 암호화 서열을 통해 폴리아데닐화 신호로 진행하는 방식으로 암호화 서열의 3'-말단에 위치하는 경우, 암호화 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 연결은 당해 분야에 알려진 재조합 방법에 의해, 예를 들어, 적절한 제한 부위 또는 평활 말단에서의 접합에 의해 또는 융합 PCR 방법을 사용하여 수행된다. 합성 올리고뉴클레오타이드 링커 또는 아답터는, 적절한 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상적인 실시에 따라 사용될 수 있다.
따라서, 프로모터 서열의 "기능성 단편 또는 유도체"라는 용어는, 단편 또는 유도체가 여전히 프로모터 활성에 영향을 미친다는 것을 의미한다. 프로모터 활성의 평가 방법의 기능성 검정은 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다 (문헌 [Bustin 2000, Nolan et al. 2006]). 이러한 기능성 검정의 예시적인 실시형태는, 예를 들어, 프로모터 동역학 실험이다. 프로모터 또는 이의 단편이 리포터 이식유전자의 전사를 지시하는 발현 카세트를 운반하는 벡터 바이러스로 감염된 세포는 서로 다른 시간 동안 항온배양 처리한다. 감염 후 서로 다른 시간에 수집된 샘플로부터 총 RNA를 추출한다. DNA 분해효소 I의 분해에 의해 오염 DNA를 파괴한 후, RNA를 역전사시킨다. 하나의 복제 샘플을 역전사 효소 (RT)의 첨가로 처리하고, RNA 추출물로부터 오염 DNA의 성공적인 제거를 입증하기 위해서 제2 복제를 RT의 첨가 없이 처리한다. 생성된 cDNA를 정제하고, 통상적인 PCR에서 주형으로서 사용한다. RT의 첨가로 처리된 샘플만이 PCR 산물을 생성한다. 이어서, 이들 cDNA는 바이러스 벡터 (내부 표준 유전자)의 필수 유전자를 위한 프로모터와 병행하여 리포터 이식유전자를 위한 프라이머와 함께 qPCR에 사용될 수 있으며, 이들의 전사는 감염 및 복제의 효율성을 위한 내부 표준을 제공한다. 리포터의 qPCR 값은 내부 표준 유전자의 qPCR 값을 사용하여 서로 다른 작제물과 감염 후 시간 사이에서 보정한다. 이것은 상이한 프로모터 및 이의 단편의 프로모터 활성의 해석을 가능하게 한다.
본 명세서에서 사용되는 "서열 상동성"이란 2개의 서열의 관련성을 결정하는 방법을 지칭한다. 서열 상동성을 결정하기 위해, 2개 이상의 서열을 최적으로 정렬하고, 필요에 따라, 갭을 도입한다. 그러나, "서열 동일성"과 대조적으로, 보존적 아미노산 치환은 서열 상동성을 결정할 때 정합성으로 간주된다. 다시 말해서, 기준 아미노산 서열과 95%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 수득하기 위해, 기준 서열 내의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드 중 85%, 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 보다 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%가 또 다른 아미노산 또는 뉴클레오타이드와 일치하거나 이들과의 보존적 치환을 포함해야 하거나, 또는 기준 서열 내의 보존적 치환을 포함하지 않는 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 총수 중 15% 이하, 바람직하게는 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 보다 더 바람직하게는 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.1% 이하의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 수를 기준 서열에 삽입할 수 있다. 동족체 서열은 바람직하게는 적어도 50, 보다 더 바람직하게는 100, 보다 더 바람직하게는 250, 보다 더 바람직하게는 500 뉴클레오타이드의 스트레치(stretch)를 포함한다.
당해 분야에 알려진 "서열 동일성"은 2개 이상의 폴리펩타이드 서열들 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열들, 즉, 기준 서열과 기준 서열과 비교되는 주어진 서열 사이의 관계를 지칭한다. 서열 동일성은, 이러한 서열들의 줄 사이의 정합성으로 결정할 때, 최고 수준의 서열 유사성을 생성하기 위해 서열을 최적으로 정렬한 후에, 주어진 서열을 기준 서열과 비교함으로써 결정된다. 이러한 정렬에서, 서열 동일성은 위치별 기반으로 확인되며, 예를 들어, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 특정 위치에서 동일하면, 서열은 그 위치에서 "동일"하다. 이어서, 이러한 위치 동일성의 총수를 기준 서열의 뉴클레오타이드 또는 잔기의 총수로 나누어 % 서열 동일성을 수득한다. 서열 동일성은 다음 문헌에 기재된 것들을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있으며, 이들 문헌의 교시 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다: 문헌 [Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993)], [Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)], [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)], [Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)] 및 [Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)]. 서열 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험되는 서열들 사이에서 최대 정합성을 제공하도록 설계된다. 서열 동일성을 결정하기 위한 방법은 주어진 서열들 사이의 서열 동일성을 결정하는 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 명문화되어 있다. 이러한 프로그램의 예로는 GCG 프로그램 패키지 (문헌 [Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)]), BLASTP, BLASTN 및 FASTA (문헌 [Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)]가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 출처에서 공개적으로 이용가능하다 (문헌 [BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)], 이 문헌의 교시 내용은 본 명세서에 참조로 포함됨). 이들 프로그램은 주어진 서열과 기준 서열 사이에 최고 수준의 서열 동일성을 생성하기 위해 디폴트 갭 가중치를 사용하여 서열을 최적으로 정렬한다. 한 예로서, 기준 뉴클레오타이드 서열과, 예를 들어, 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 보다 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%의 "서열 동일성"을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오타이드란, 주어진 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 기준 서열과 동일하지만, 주어진 폴리뉴클레오타이드 서열이 기준 뉴클레오타이드 서열의 각 100개의 뉴클레오타이드 당 15개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 보다 더 바람직하게는 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 다시 말해서, 기준 뉴클레오타이드 서열에 비해 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 보다 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오타이드에서, 기준 서열 내의 뉴클레오타이드의 15% 이하, 바람직하게는 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 보다 더 바람직하게는 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.1%가 또 다른 뉴클레오타이드로 결실 또는 치환될 수 있거나, 기준 서열 내의 총 뉴클레오타이드의 15% 이하, 바람직하게는 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 보다 더 바람직하게는 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.1%의 뉴클레오타이드 수가 기준 서열에 삽입될 수 있다. 이들 기준 서열의 돌연변이는 기준 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 이러한 말단 위치들 사이에 어디에서나 일어날 수 있거나, 기준 서열 내의 뉴클레오타이드들 중에서 개별적으로 또는 기준 서열 내에서 1종 이상의 연속 그룹으로 산발적으로 일어날 수 있다. 유사하게, 기준 아미노산 서열과, 예를 들어, 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 보다 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 주어진 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩타이드란, 폴리펩타이드의 주어진 아미노산 서열이 기준 서열과 동일하지만, 주어진 폴리펩타이드 서열이 기준 아미노산 서열의 각 100개의 아미노산 당 15개 이하, 바람직하게는 10, 9, 8, 7, 6개 이하, 보다 더 바람직하게는 5, 4, 3, 2, 1개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 다시 말해서, 기준 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 보다 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 주어진 폴리펩타이드 서열을 수득하기 위해, 기준 서열 내의 아미노산 잔기의 15% 이하, 바람직하게는 10%, 9%, 8%, 7%, 보다 더 바람직하게는 5%, 4%, 3%, 2%, 1%가 또 다른 아미노산으로 결실 또는 치환될 수 있거나, 기준 서열 내의 아미노산 잔기의 총 수의 15% 이하, 바람직하게는 10%, 9%, 8%, 7%, 보다 더 바람직하게는 5%, 4%, 3%, 2%, 1%의 아미노산 수가 기준 서열에 삽입될 수 있다. 이들 기준 서열의 변경은 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카복시 말단 위치에서 또는 이러한 말단 위치들 사이에 어디에서나 일어날 수 있거나, 기준 서열 내의 잔기들 중에서 개별적으로 또는 기준 서열 내에서 1종 이상의 연속 그룹으로 산발적으로 일어날 수 있다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 달라진다. 하지만, 보존적 치환은 서열 동일성을 결정할 때 정합성에 포함되지 않는다.
"서열 상동성" 또는 "% 동일성"이라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 동일성을 결정하기 위해서는 서열을 최적의 비교 목적을 위해 정렬시킨다 (예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산의 서열에 갭을 도입할 수 있다)고 본 명세서에서 정의된다. 이어서, 상응하는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 또는 뉴클레오타이드 잔기를 비교한다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 또는 뉴클레오타이드 잔기에 의해 점유될 때, 분자들은 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 % 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 (즉, 중첩 위치) × 100)이다. 바람직하게는, 2개의 서열은 동일한 길이이다.
서열 비교는 비교하고자 하는 2개의 서열의 전체 길이 또는 2개의 서열의 단편에 대해 수행될 수 있다. 전형적으로, 비교는 비교하고자 하는 2개의 서열의 전체 길이에 대해 수행될 것이다. 그러나, 서열 동일성은, 예를 들어, 20, 50, 100개 또는 그 이상의 연속 아미노산 잔기의 영역에 걸쳐 수행될 수 있다.
통상의 기술자라면 2개의 서열 사이의 상동성을 결정하기 위해 여러 가지 상이한 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다는 사실을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 2개의 서열 사이의 서열의 비교 및 퍼센트 동일성의 측정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 2개의 아미노산들 또는 핵산 서열들 사이의 % 동일성은 Accelrys GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.accelrys.com/products/gcg/에서 이용가능)의 GAP 프로그램 내에 통합된 니들만 및 운치 알고리즘 (문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)])을 사용하고, Blosum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 결정한다. 통상의 기술자라면, 이러한 모든 상이한 파라미터가 약간 상이한 결과를 산출하지만, 상이한 알고리즘을 사용할 때 2개의 서열들의 전반적인 % 동일성이 현저하게 달라지지 않는다는 것을 알 것이다.
본 발명의 단백질 서열 또는 핵산 서열은, 예를 들어, 다른 계열 구성원 또는 관련 서열을 확인하기 위해서 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 BLASTN 및 BLASTP 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해 BLASTP 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 수득하기 위해, Gapped BLAST는 문헌 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, BLASTP 및 BLASTN)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/에 있는 미국 국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information)의 홈페이지를 참조한다.
EHV-1 및 EHV-4/ 재조합 벡터 기술 정의
말 관련 용어("equid" 또는 "equine" 또는 "equin")는, 말, 당나귀 및 얼룩말, 바람직하게는 말을 포함하는 말과를 의미하거나 이에 속한다. 또한, 말 관련 용어("equid" 또는 "equine" 또는 "equin")는 용어는 말과 구성원의 잡종 (예를 들어, 노새, 버새 등)을 포함한다.
"헤르페스 바이러스" 또는 "헤르페스 바이러스 벡터"는 헤르페스바이러스 목의 헤르페스바이러스 과에 속하는 종을 지칭한다.
"말 헤르페스 바이러스 벡터" 또는 "말 헤르페스 바이러스" 또는 "EHV"라는 용어는, 말에 영향을 미치는 헤르페스바이러스 과의 구성원을 의미한다. 지금까지, 8종의 말 헤르페스바이러스가 확인되었는데, 5종은 알파헤르페스바이러스 아과 (EHV-1, EHV-3, EHV-4, EHV-8 및 EHV-9)에 속하며, 3종은 감마헤르페스바이러스 아과에 속한다. (http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30).
"EHV-1"이라는 용어는 헤르페스바이러스 과의 알파헤르페스바이러스 속의 바리셀로바이러스 아속의 구성원인 말 알파헤르페스바이러스 1을 의미한다. EHV-1에 대한 비제한적인 기준 서열은, 예를 들어, 야생형 EHV-1 균주 ab4 (Genbank 수탁 번호 AY665713.1) 또는 RacH (Hubert 1996)이다.
"EHV-4"라는 용어는 헤르페스바이러스 과의 알파헤르페스바이러스 속의 바리셀로바이러스 아속의 구성원인 말 알파헤르페스바이러스 4를 의미한다.
"2종 이상의 EHV 벡터"라는 용어는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 EHV 벡터를 포함한다.
"ORF70에 삽입된" 및 "삽입 부위는 ORF70"이라는 용어는, DNA 단편이 말 헤르페스바이러스 1의 오픈 리딩 프레임 70을 인코딩하는 위치에서 유전체 DNA에 삽입되었다는 것을 의미한다. 상기 언급한 삽입은 ORF70의 801 5' 염기쌍의 결실을 유도하여 3' 말단의 나머지 423 bp를 온전하게 그대로 두었지만 orf70 유전자 산물 당단백질 G의 발현을 제거하였다. EHV-1을 비롯한 여러 알파헤르페스바이러스의 당단백질 G는 감염된 세포로부터 분비되어 염증 촉진성 사이토카인에 결합함으로써 면역 조절 단백질로서 기능하는 것으로 밝혀졌다. 바이러스 벡터에서의 발현을 제거하면, 온전한 당단백질 G 발현을 갖는 야생형 EHV-1과 비교하여 바이러스 감염의 면역원성을 증가시켜야 한다.
"ORF1/3에 삽입된" 및 "삽입 부위는 ORF1/3"이라는 용어는, 백신 균주 EHV-1 RacH의 약독화 절차 동안 계대 배양을 통한 우발적인 결실에 의해 ORF1의 90%를 포함하는 1283 bp 단편 및 전체 ORF2가 소실된 위치에서 DNA 단편이 바이러스 유전체에 삽입되었다는 것을 의미한다. 이러한 삽입 부위는, 이 위치로부터 이식유전자의 발현이 바이러스 복제를 방해할 가능성이 매우 낮을 것으로 예상되었기 때문에, 선택되었다.
백신 정의
"면역원성 또는 면역학적 조성물"은 조성물에 대한 세포 또는 항체-매개된 면역 반응의 숙주에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 항원 또는 이의 면역 원성 부분을 포함하는 물질의 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 면역원성 조성물은 면역 반응을 유도하고, 보다 바람직하게는 돼지 IAV 감염의 하나 이상의 임상 증상에 대해 방어 면역력을 부여한다. 숙주는 "식용 동물"로도 기술한다. 숙주가 보호 면역 반응을 나타내어 신규한 감염에 대한 내성이 향상될 것이고/것이거나 질병의 임상적 중증도가 감소될 것인 경우에, 상기 면역원성 조성물을 "백신"으로 기술한다.
본 명세서에서 사용되는 "항원"이라는 용어는 당해 분야에서 잘 이해되고 있으며, 면역원성인 물질, 즉, 면역원 뿐만 아니라, 면역 무반응 또는 아네르기, 즉, 이물질에 대한 신체 방어 기작에 의한 반응의 결핍을 유도하는 물질을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "항원"이라는 용어는, 전장 단백질 뿐만 아니라 에피토프를 함유하거나 포함하는 이의 펩타이드 단편을 의미한다. 추가로, "항원 인코딩 서열"이라는 용어는 항원을 인코딩하는 서열에 대한 것이다. 바람직하게는 상기 항원 인코딩 서열은 핵산 서열, 예컨대 cDNA 서열이다. 그러나, "핵산 서열"이라는 용어는 본원 다른 곳에 정의된 바 있다.
"적어도 하나의 외인성 항원 인코딩 서열"이라는 용어는 하나 이상의 외인성 항원 인코딩 서열도 포함한다. 따라서, "적어도 하나의 외인성 항원 인코딩 서열"이라는 용어는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 외인성 항원 인코딩 서열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, "적어도 2개의 외인성 항원 인코딩 서열"이라는 용어는 3개, 4개, 5개 또는 6개의 외인성 항원 인코딩 서열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"상이한 외인성 항원 인코딩 서열"이라는 용어는 이들의 서열이 서로 간에 다른 서열이다.
본 명세서에서 사용되는 "면역원성 조성물"은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역학적 반응을 유도하는 바이러스 표면 단백질과 같은 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. "면역원성 단편" 또는 "면역원성 부분"이라는 용어는, 1종 이상의 에피토프를 포함하고, 따라서 본 명세서에 기재된 면역학적 반응을 유도하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 단편 또는 절단된 형태 및/또는 치환된 형태를 지칭한다. 일반적으로, 이러한 절두된 형태 및/또는 치환된 형태, 또는 단편은 전장 단백질로부터 유래된 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함할 것이다. 이러한 단편은 당해 분야에 잘 알려진 임의의 수의 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey]을 참조한다. 예를 들어, 선형 에피토프는, 단백질 분자의 일부에 상응하는 다수의 펩타이드를 고체 지지체 상에서 동시에 합성하고, 펩타이드가 여전히 지지체에 부착되어 있는 동안 펩타이드를 항체와 반응시킴으로써, 결정될 수 있다. 이러한 기술은 당해 분야에 공지되어 있고 기술되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 4,708,871; 문헌 [Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002] 및 [Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715]을 참조한다. 유사하게, 입체형태 에피토프는, 예를 들어, x선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명 등에 의해 아미노산의 공간적 입체형태를 결정함으로써 용이하게 확인할 수 있다. 문헌 [Epitope Mapping Protocols, 상기와 동일]을 참조한다. 합성 항원은 또한, 예를 들어, 폴리에피토프, 인접 에피토프 및 다른 재조합 또는 합성 유도된 항원의 정의 내에도 포함된다. 예를 들어, 문헌 [Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781], [Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249], [Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408] 및 [Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998]을 참조한다. (이들의 교시 내용 및 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다.)
"면역화시키는"이라는 용어는 면역화시킬 식용 동물에게 면역원성 조성물을 투여함으로써 이러한 면역원성 조성물에 포함되어 있는 항원에 대한 면역학적 반응을 유발시키는 활성 면역화에 대한 것이다.
본원에서 "~이(가) 필요한"이라는 용어는 해당 투여/치료가 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 투여받는 동물의 건강 또는 임상 증상에서의 증진 또는 개선, 또는 해당 동물의 건강에 대한 기타 양성적인 의료 효과와 관련이 있음을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "백신"이란 용어는, 동물에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 1종의 면역학적 활성 성분 및 가능하게는 반드시 그런 것은 아니지만 활성 성분의 면역 활성을 증진시키는 1종 이상의 추가 성분을 포함하는 약제학적 조성물을 지칭한다. 백신은 약제학적 조성물에 통상적인 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 구별로서, 백신의 면역학적 활성 성분은 완전한 바이러스 입자를 원래의 형태로 또는 소위 변형된 생독 백신 (MLV) 중의 약독화된 입자로서 또는 소위 사독 백신 (KV) 중의 적절한 방법으로 불활성화된 입자로서 포함할 수 있다. 또 다른 형태에서, 백신의 면역학적 활성 성분은 유기체의 적절한 성분들 (소단위 백신)을 포함할 수 있으며, 여기서, 이들 성분들은 전체 입자 또는 이러한 입자를 함유하는 성장 배양물의 파괴, 및 임의로 목적하는 구조(들)를 제공하는 후속적인 정제 단계에 의해, 또는, 예를 들어, 박테리아, 곤충, 포유 동물 또는 다른 종에 기반한 적합한 시스템의 사용에 의한 적절한 조작을 포함하는 합성 공정 및 임의로 후속적인 분리 및 정제 절차에 의해, 또는 적합한 약제학적 조성물을 사용하는 유전 물질의 직접적인 도입 (폴리뉴클레오타이드 백신 접종)에 의해 백신을 필요로 하는 동물에서 합성 공정의 유도에 의해 생성된다. 백신은 상기에서 기재된 성분들 중 하나 또는 동시에 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 양태 내에서 사용되는 "백신"은 재조합 백신으로도 불리는 생독 백신 또는 생독 바이러스를 지칭한다. 본 발명의 또 다른 특정 양태에서, "백신"은 바이러스 유사 입자 (VLP)를 포함하는 불활성화 또는 사독 바이러스를 지칭한다. 따라서, 백신은 소단위 백신 또는 사독 백신 (KV) 또는 불활성화 백신일 수 있다.
"DNA 백신 접종" 또는 "폴리뉴클레오타이드 백신 접종"이라는 용어는, 적절한 약제학적 조성물을 사용하는 유전 물질의 직접적인 접종을 의미한다.
다양한 물리적 및 화학적 불활성화 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. "불활성화"라는 용어는 방사선 (자외선 (UV), X선, 전자 빔 또는 감마선)을 조사하거나, 가열하거나, 또는 화학적으로 처리하여 면역원성을 유지하면서 이러한 바이러스를 불활성화시키거나 사멸시킨 이전에 병독성이었거나 비병독성인 바이러스를 지칭한다. 적합한 불활성화제로는 베타-프로피오락톤, 이성분(binary) 또는 베타- 또는 아세틸-에틸렌이민, 글루테르알데하이드, 오존 및 포르말린 (포름알데하이드)가 포함된다.
포르말린 또는 포름알데하이드에 의한 불활성화의 경우, 포름알데하이드는 전형적으로 물 및 메틸 알콜과 혼합되어 포르말린을 생성한다. 메틸 알콜의 첨가는 활성화 과정에서 분해 또는 교차 반응을 방지하다. 하나의 실시형태는 37% 포름알데하이드 용액을 약 0.1 내지 1%로 사용하여 바이러스를 불활성화시킨다. 포르말린의 양을 조절함으로써 물질이 불성활화되지만 너무 많아서 높은 투약량으로 인한 부작용이 발생하지 않도록하는 것이 중요하다.
특히, 바이러스와 관련하여 "불활성화"라는 용어는, 바이러스가 생체내 또는 시험관내에서 복제할 수 없다는 것을 의미한다. 예를 들어, "불활성화"라는 용어는, 시험관내에서 증식한 후, 화학적 또는 물리적 수단을 사용하여 불활성화되어 더 이상 복제할 수 없게 된 바이러스를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "불활성화", "사멸" 또는 "KV"라는 용어는 상호교환적으로 사용된다.
"생독 백신"이라는 용어는 생물체 또는 복제 가능 바이러스 또는 바이러스 벡터를 포함하는 백신을 지칭한다.
"약제학적 조성물"은, 투여되는 유기체, 또는 유기체 내에 또는 유기체에 살고 있는 유기체의 생리학적 기능, 예를 들어, 면역 기능을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 성분으로 본질적으로 이루어진다. 상기 용어는 항생제 또는 항기생충제 뿐만 아니라, 가공 특성, 무균성, 안정성, 소화관내 또는 비경구 경로, 예컨대 경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하, 피부내 또는 기타 적절한 경로를 통해 조성물을 투여할 실현가능성, 투여 후 내성 또는 방출 제어 특성 (이들에 한정되는 것은 아님)과 같은 다른 특정 목적을 달성하기 위해 일반적으로 사용되는 다른 성분을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 입증 목적만을 위해 제공된 이러한 약제학적 조성물의 하나의 비제한적인 예는 다음과 같이 제조될 수 있다: 감염된 세포 배양물의 세포 배양 상청액을 안정화제 (예를 들어, 스페르미딘 및/또는 소 혈청 알부민 (BSA))와 혼합한 후, 혼합물을 다른 방법으로 동결 건조하거나 탈수시킨다. 다음으로, 백신 접종 전에, 혼합물을 수용액 (예를 들어, 식염수, 인산염 완충 식염수 (PBS)) 또는 비수용액 (예를 들어, 오일 유화액, 알루미늄계 아쥬반트) 중에 재수화시킨다.
본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체"로는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 아쥬반트, 안정화제, 희석제, 보존제, 항균제, 항진균제, 등장화제, 흡착 지연제 등이 포함된다. 일부의 바람직한 실시형태, 특히 동결 건조된 면역원성 조성물을 포함하는 것들에서, 본 발명에 사용하기 위한 안정화제로는 동결 건조 또는 냉동 건조용 안정화제가 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 아쥬반트를 함유한다. 본 명세서에서 사용되는 "아쥬반트"로는 수산화 알루미늄 및 인산 알루미늄, 사포닌,, 예를 들어, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), 유중수형 유화액, 수중유형 유화액, 수중유중수형 유화액이 포함될 수 있다. 유화액은 특히 경질 액체 파라핀 오일 (유럽 약전 타입); 스쿠알란 또는 스쿠알렌과 같은 이소프레노이드 오일; 알켄, 특히 이소부텐 또는 데센의 올리고머화에 의해 생성되는 오일; 선형 알킬기를 함유하는 산 또는 알코올의 에스테르, 보다 특히, 식물 오일, 에틸 올리에이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올리에이트; 분지형 지방산 또는 알코올의 에스테르, 특히 이소스테아르산 에스테르를 기반으로 할 수 있다. 오일은 유화제와 함께 사용되어 유화액을 형성한다. 상기 유화제는 바람직하게는 비이온성 계면활성제, 특히, 소르비탄의 에스테르, 만나이드의 에스테르 (예를 들어, 안하이드로만니톨 올리에이트), 글리콜의 에스테르, 폴리글리세롤의 에스테르, 프로필렌 글리콜의 에스테르 및 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르 (이들은 임의로 에톡시화된다), 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 특히, 플루로닉 (Pluronic) 제품, 특히, L121이다. 문헌 [Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995)] 및 [Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)]을 참조한다. 예시적인 아쥬반트는 문헌 ["Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995]의 147 페이지에 기술된 SPT 유화액 및 동 문헌의 183 페이지에 기술된 유화액 MF59이다.
아쥬반트의 추가 예로는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체 중으로부터 선택되는 화합물이 있다. 유리한 아쥬반트 화합물은 특히 당류 또는 다가 알코올의 폴리알케닐 에테르와 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이다. 이들 화합물은 카보머라는 용어로 공지되어 있다 (문헌 [Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996]). 당해 분야의 통상의 기술자는 또한 적어도 3개, 바람직하게는 8개 이하의 하이드록실기를 가지며 적어도 3개의 하이드록실기의 수소 원자가 적어도 2개의 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 대체되어 있는 폴리하이드록실화 화합물과 가교된 이러한 아크릴계 중합체를 기술하는 미국 특허 2,909,462를 참조할 수 있다. 바람직한 라디칼은 2 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 것들, 예를 들어, 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화기이다. 불포화 라디칼은 자체에 메틸과 같은 다른 치환체를 함유할 수 있다. CARBOPOL® (BF Goodrich, Ohio, USA)의 명칭으로 시판되는 제품이 특히 적절하다. 이들은 알릴 슈크로스 또는 알릴 펜타에리트리톨과 가교되어 있다. 이들 중에서, Carbopol 974P, 934P 및 971P가 언급될 수 있다. CARBOPOL® 971P의 사용이 가장 바람직하다. 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체 중에서도, 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체인 공중합체 EMA (Monsanto)가 있다. 이들 중합체가 물에 용해되면, 면역원성 조성물, 면역학적 조성물 또는 백신 조성물 자체가 혼입될 아쥬반트 용액을 수득하기 위해서는 바람직하게는 생리학적 pH로 중화될 산 용액이 생성된다.
또 다른 적절한 아쥬반트는 다수의 다른 것들 중에서도 RIBI 아쥬반트 시스템 (Ribi Inc.), 블록 공중합체 (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), 모노포스포릴 지질 A, 아비리딘 지질-아민 아쥬반트, 이. 콜라이 (재조합체 또는 기타)로부터 유래된 열-불안정성 장독소, 콜레라 독소, IMS 1314 또는 뮤라밀 디펩타이드, 또는 자연 발생 또는 재조합 사이토카인 또는 이의 유사체 또는 내인성 사이토카인 방출 자극제가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
아쥬반트는 약 100 μg 내지 약 10 mg/용량의 양으로, 바람직하게는 약 100 μg 내지 약 10 mg/용량의 양으로, 보다 바람직하게는 약 500 μg내지 약 5 mg/용량의 양으로, 보다 더 바람직하게는 약 750 μg 내지 약 2.5 mg/용량의 양으로, 가장 바람직하게는 약 1 mg/용량의 양으로 첨가될 수 있는 것으로 예상된다. 그렇지 않으면, 아쥬반트는 최종 생성물의 약 0.01 부피% 내지 50 부피%의 농도, 바람직하게는 약 2 부피% 내지 30 부피%의 농도, 보다 바람직하게는 약 5 부피% 내지 25 부피%의 농도, 보다 더 바람직하게는 약 7 부피% 내지 약 22 부피%의 농도, 가장 바람직하게는 10 부피% 내지 20 부피%의 농도로 존재할 수 있다.
"희석제"는 물, 식염수, 덱스트로오스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장화제는 특히 염화 나트륨, 덱스트로오스, 만니톨, 소르비톨 및 락토오스를 포함할 수 있다. 안정화제는 다른 것들 중에서도 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리염을 포함한다.
"분리된"은 자연 상태로부터 "사람의 수작업에 의해" 변경된 것으로 의미하며, 즉 자연에서 발생한다면 원래 환경으로부터 변화 또는 제거되거나, 변화 및 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 생물체에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 "분리된" 것이 아니지만, 자연 상태의 공존 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 본 명세서에 사용되는 용어처럼 "분리된" 것이다.
"약독화"는 병원체의 병독성을 감소시키는 것을 의미한다. 본 발명에서, "약독화"는 "무독성"과 동의어이다. 본 발명에서, 약독화 바이러스는, 비-약독화 바이러스 또는 병원체로 감염되고 약독화 바이러스를 제공받지 않은 동물의 "대조군"과 비교하여, 병독성이 감소되어 표적 동물에서 감염의 임상 징후를 일으키지 않지만 면역 반응을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 약독화 바이러스, 특히, 청구된 바와 같은 EHV-1 RacH 바이러스 벡터로 감염된 동물에서 발병률 또는 중증도의 임상 징후가 감소한다는 것을 의미할 수도 있다. 이러한 맥락에서, "감소한다/감소된"이라는 용어는, 상기에서 정의된 바와 같은 대조군과 비교하여, 적어도 10%, 바람직하게는 25%, 보다 더 바람직하게는 50%, 보다 더 바람직하게는 60%, 보다 더 바람직하게는 70%, 보다 더 바람직하게는 80% 보다 더 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 100%의 감소를 의미한다. 따라서, 예를 들어, 약독화 바이러스 벡터, 특히, 청구된 바와 같은 EHV-1 (바람직하게는 RacH) 바이러스 벡터와 같은 약독화된 무독성 병원체는, 변형된 생독 백신 (MLV) 또는 변형된 생독 면역원성 조성물의 제조에 적합하다.
"치료 및/또는 예방"이라는 용어는 한 집단에 있어서 특정 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 발생률을 감소시키거나, 또는 특정 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 의해 초래되거나 이와 관련된 임상 증상의 중증도를 감소시키는 것을 지칭한다. 따라서, "치료 및/또는 예방"이라는 용어는 또한 특정 돼지 인플루엔자 A형 바이러스로 감염되는 집단 내 동물의 수의 감소(= 특정 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 발생률의 감소), 또는 본원에 제공된 면역원성 조성물을 투여받지 않은 동물 그룹과 비교했을 때 본원에 제공된 면역원성 조성물의 유효량을 투여받은 동물 그룹에서 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염과 통상적으로 관련되거나 이에 의해 유발된 임상적 증상의 중증도의 감소도 지칭한다.
"치료 및/또는 예방"은 일반적으로 본 발명의 면역원성 조성물의 유효량을 이러한 치료/예방을 필요로 하거나 이러한 치료/예방으로부터 이득을 얻을 수 있는 동물 또는 동물의 집단에 투여하는 것을 수반한다. "치료"라는 용어는 해당 동물 또는 해당 동물 집단의 적어도 일부 동물이 이러한 SIV로 이미 감염되었을 때 유효량의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 지칭하며, 이 경우 상기 동물은 이러한 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 의해 유발되거나 이와 관련된 일부 임상적 증상을 이미 나타내고 있다. "예방"이라는 용어는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스로 감염되기 전의 동물에게 투여하거나, 또는 적어도 이러한 동물 또는 동물 그룹 내 동물 중 어느 것도 이러한 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 의한 감염에 의해 유발되거나 이와 관련된 어떠한 임상적 증상도 나타내지 않는 경우의 동물에게 투여하는 것을 지칭한다. "예방(prophylaxis)"과 "예방하는(preventing)"이라는 용어는 본 출원에서 상호교환하여 사용된다.
본원에 사용된 "임상 증상"이라는 용어는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스로 인한 동물의 감염 증상을 지칭한다. 감염의 임상 증상은 선택된 병원체에 따라 다르다. 상기 임상 증상의 예로는 호흡 곤란, 이염, 거친 털 코트(roughened hair coat), 미열, 우울증 및 식욕 감소를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 그러나, 상기 임상 증상은 살아있는 동물로부터 직접적으로 관찰가능한 임상 증상을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 살아있는 동물로부터 직접적으로 관찰가능한 임상 증상의 예로는 콧물 및 눈 분비물, 기면, 기침, 천명, 텀핑(thumping), 고열, 체중 감소, 탈수, 파행, 쇠약, 창백한 피부, 수척 등을 포함한다.
바람직하게는, 치료되지 않거나 본 발명 이전에 이용가능한 면역원성 조성물로 치료했으나 차후에 특정 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 의해 감염된 동물과 비교했을 때 치료된 동물에서 발생률 또는 중증도가 감소된 임상 증상들로는, 체중 손실의 감소, 폐에서의 더 낮은 바이러스 부하량, 폐 병변의 감소, 바이러스 쉐딩의 감소 및/또는 단축, 감소된 직장 온도, 감소된 임상 증상 (특히 호흡기 증상), (중화성) 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체의 유도 증가, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 T-세포의 자극 증가, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 B-세포의 자극 증가, 및 폐에서의 염증 유발성 사이토카인, 예컨대, IL-1β의 감소, 또는 이들의 조합을 들 수 있다.
본 명세서에서, "유효 용량"은, 항원이 투여되는 동물에서 임상 증상의 감소를 제공하는 면역 반응을 유도하거나 유도할 수 있는 항원의 양을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 "유효량"이라는 용어는, 조성물과 관련하여, 동물에서 감염 및 질병의 발생 빈도를 감소시키거나 감염의 중증도 또는 질병의 사건을 완화시키는 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물의 양을 의미한다. 이러한 유효량은 한 집단에 있어서 특정 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 발생율을 감소시키거나, 또는 특정 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 임상 증상의 중증도를 감소시킬 수 있다. 특히, 유효량은 용량당 콜로니 형성 단위 (CFU)를 지칭한다. 다르게는, 치료법과 관련하여, "유효량"이라는 용어는 질환 또는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 중증도 또는 지속 기간을 감소 또는 개선시키거나, 질환 또는 장애의 진전을 방지하거나, 질환 또는 장애의 퇴행을 일으키거나, 질환 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 재발, 발생, 발병 또는 진행을 방지하거나, 또 다른 요법 또는 치료제의 예방 또는 치료를 증진 또는 향상시키기에 충분한 치료량을 지칭한다.
"면역 반응" 또는 "면역학적 반응"은 관심 대상의 (면역원성) 조성물 또는 백신에 대한 세포성 및/또는 항체-매개된 면역 반응의 발생을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 면역 반응 또는 면역학적 반응은 다음과 같은 효과 중 하나 이상을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다: 관심 대상 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 유도된, 항체, B 세포, 헬퍼 T-세포, 억제 T-세포 및/또는 세포독성 T-세포의 생성 또는 활성화. 바람직하게는, 숙주는 새로운 감염에 대한 내성이 증진되고/되거나 질환의 임상적 중증도가 감소하도록 치료적인 또는 방어적인 면역학적 (기억) 반응을 나타낼 것이다. 이러한 방어는 병원체의 감염과 관련된 증상의 수 또는 증상의 중증도의 감소 또는 증상 중 하나 이상의 결핍, 바이러스혈증의 발병 지연, 바이러스의 지속성 감소, 전반적인 바이러스 부하의 감소 및/또는 바이러스 배출의 감소에 의해 입증될 것이다.
"질병에 대한 보호", "보호 면역", "기능 면역", "임상 증상의 감소", "중화 항체의 유도/생산 및/또는 혈청 전환" 및 유사한 문구는, 질병 또는 감염에 노출된 비면역화된 동물에서 예상되는 것보다 유해 효과가 더 적게 나타나는 본 발명의 하나 이상의 치료학적 조성물 또는 이의 조합물의 투여에 의해 발생된 질병 또는 병태에 대한 부분적 또는 완전한 반응을 의미한다. 즉, 감염의 유해 효과의 심각성은 백신 접종된 동물에서는 완화된다. 백신 접종된 동물에서, 감염은 감소하거나, 느려지거나, 가능하게는 완전히 예방된다. 본 명세서에서, 감염의 완전한 예방을 의미하는 경우, 구체적으로 명시된다. 완전한 예방이 명시되지 않는다면, 당해 용어는 부분 예방을 포함한다. "보호 면역 반응" 또는 "보호 면역성"은 감염된 숙주에 의해 일반적으로 나타나는 임상 증상의 감소 또는 결여, 신속한 회복 시간 및/또는 감염력의 감소된 지속시간, 또는 감염된 숙주의 조직 또는 체액 또는 분비물에서의 감소된 병원체 역가에 의해 입증될 것이다.
본 명세서에서, "임상 증상의 발병률 및/또는 중증도의 감소" 또는 "임상 증상의 감소"는, 야생형 감염과 비교하여, 그룹 내에서 감염된 동물의 수를 감소시키거나, 감염의 임상 증상을 나타내는 동물의 수를 감소 또는 제거하거나, 하나 이상의 동물에 존재하는 임의의 임상 증상의 중증도를 감소시키는 것을 의미하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 이것은 병원체 부하의 임의의 감소, 병원체 쉐딩 (shedding), 병원체 전파의 감소 또는 말라리아 증상을 보이는 임의의 임상 증상의 감소를 지칭한다. 바람직하게는, 이들 임상 증상은, 본 발명의 치료학적 조성물을 제공받지 않아 감염된 동물과 비교하여, 상기 조성물을 제공받은 하나 이상의 동물에서 적어도 10%까지 감소된다. 보다 바람직하게는, 임상 증상은 본 발명의 조성물을 제공받은 동물에서 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 50%까지 감소한다.
본 명세서에서 사용되는 "증가된 보호"라는 용어는, 백신 접종되지 않은 동물 대조군에 비해 백신 접종된 동물 그룹에서 감염체에 의한 감염과 관련되는 하나 이상의 임상 증상의 통계학적으로 유의한 감소를 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. "임상 증상의 통계학적으로 유의한 감소"라는 용어는, 백신 접종된 동물 그룹에서 적어도 하나의 임상 증상의 발생 빈도가 감염체의 투여 후에 백신 접종되지 않은 대조군보다 적어도 10%, 바람직하게는 20%, 보다 바람직하게는 30%, 보다 더 바람직하게는 50%, 보다 더 바람직하게는 70% 더 낮다는 것을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"병원체"라는 용어는 당업계의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 그러나, "병원체"라는 용어는 박테리아와 바이러스를 포함한다.
"식용 동물"이라는 용어는, 돼지, 소, 가금류, 어류 등과 같은 사람의 소비를 위해 사용되는 동물을 의미하며, 바람직하게는 돼지이다. "식용 동물"이라는 용어는 말과(Equidae)의 동물, 예컨대 말은 제외한다.
"오래 지속되는 보호"는 적어도 3주, 보다 바람직하게는 적어도 3개월, 보다 더 바람직하게는 적어도 6개월 동안 지속되는 "개선된 효능"을 지칭한다. 가축의 경우에서, 오래 지속되는 보호는 동물이 고기를 위해 판매되는 평균 연령까지 지속되는 것이 가장 바람직하다.
"쉐딩(shedding)"이라는 용어는 콧물과 같은 분비물 및 추가로 기침 또는 재채기에 의해 생성된 에어로졸을 지칭한다. 따라서, 쉐딩은 비강 면봉법으로 바이러스 역가를 검사하거나 폐에서 바이러스 역가를 검사함으로써 결정될 수 있다. "쉐딩"이라는 용어는 추가로 민감한 동물 (즉, 센티넬(sentinel))로의 바이러스의 전달을 포함한다. 바이러스 쉐딩을 측정하는 방법은 당업계의 숙련자의 일반적인 상식 범위 내에 있다.
"항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체"라는 용어는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 특이적인 항체를 가리킨다. 이러한 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체의 예로는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 백신을 이용한 백신접종에 의한 암퇘지의 모계 유래 항체 또는 암퇘지의 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 의한 모계 유래 항체를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 추가로, 새끼 돼지에서의 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체는 새끼 돼지의 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 반응하여 발생된 것일 수 있다. "항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체"라는 용어는 추가로, 바람직하게는 적어도 1:10, 보다 바람직하게는 1:20 이상, 더욱 더 바람직하게는 1:40 이상, 보다 더 바람직하게는 1:80 이상, 더욱 더 바람직하게는 1:160, 더욱 더 바람직하게는 1:320 이상, 가장 바람직하게는 1:640 이상의 검출가능한 항-SIAV 항체 역가를 갖거나 이에 노출된(모계 항체의 수동 전달) 새끼돼지를 의미할 것이지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체 역가는 검출가능하고, 특이적 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 면역 분석법, 예컨대 헤마글루티닌 억제 분석법, ELISA 또는 혈청 중화 시험에서 정량가능하다.
"안전성"은, 다음을 포함하지만 이들에 제한되지 않는, 백신 접종 후 백신 접종된 동물에서 부정적인 결과가 없는 것을 지칭한다: 박테리아 기반 백신의 병독성으로의 잠재적 복귀, 임상적으로 유의한 부작용, 예를 들어, 백신 투여의 부위에서의 지속적인 전신 질환 또는 용납불가능한 염증.
본 명세서에서 사용되는 "백신 접종" 또는 "백신 접종하는"라는 용어 또는 이의 변형태는, 동물에게 투여 될 때, 상기 동물에서 면역 반응을 - 직접적으로 또는 간접적으로 - 유도하거나 유도할 수 있는 본 발명의 면역원성 조성물의 투여를 포함하는 방법을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 맥락에서, "사망률"은 감염에 의해 일어난 사망을 지칭하며, 감염이 너무 심각하여 동물을 안락사시켜 고통을 방지하고 생명에 인도적 결말을 제공하는 상황을 포함한다.
제제
본 발명의 제제는 유효 면역량의 1종 이상의 면역원성 조성물 및 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함한다. 백신은 유효 면역량의 1종 이상의 면역원성 조성물 및 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함한다. 상기 제제는 투여 모드에 적합해야 한다.
면역원성 조성물은 필요에 따라 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다. 면역원성 조성물은 액체 용액, 현탁액, 유화액, 정제, 환제, 캡슐, 서방형 제형 또는 분말일 수 있다. 경구용 제형은 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다.
바람직한 투여 경로는 비강내, 경구, 피부내 및 근육내를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 단일 용량으로의 음용수 중의 투여가 바람직하다. 통상의 기술자는, 본 발명의 조성물이 또한 다른 투여 경로에 의해서 뿐만 아니라, 1개, 2개 또는 그 이상의 용량으로 투여될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 이러한 다른 경로는 피하, 피부내, 복강내, 피내를 포함하고, 치료의 목적하는 지속 기간 및 유효성에 따라, 본 발명에 따른 조성물은, 예를 들어, 수일, 수주 또는 수개월 동안 매일 1회 또는 수회, 또한 간헐적으로, 약 1x104 내지 1x109 TCID50과 같은 상이한 투여량으로 투여될 수 있다 (상기 바이러스 역가 참조). 본 발명의 특정 양태에서, 용량은 약 1x104 내지 1x107 TCID50이다.
항원 정의
"돼지 인플루엔자 바이러스"라는 용어는 당업계의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 돼지 인플루엔자 바이러스라는 용어는 돼지 인플루엔자를 야기하는 오르토믹소바이러스 계열의 A형 또는 C형 인플루엔자 바이러스를 가리킨다. 오르토믹소바이러스는 세 그룹: A형, B형 및 C형이 있으나, 오직 A형과 C형 인플루엔자 바이러스만이 돼지를 감염시킨다. 바람직하게는, 돼지 인플루엔자 바이러스는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스이다. 돼지 인플루엔자 바이러스의 아형은 H1N1, H1N2, H3N2 및 H3N1을 포함한다. H9N2 및 H5N1도 돼지에서 발견될 수 있다. 바람직하게는, 돼지 인플루엔자 바이러스는 돼지로부터 분리된 인플루엔자 바이러스이다.
"HA" 또는 "H", "NA" 또는 "N" 및 "NP"라는 용어는 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 그러나, 일반적으로, A형 인플루엔자 바이러스는 여러가지 가능한 조합(H1N1, H1N2….H2N1, H2N2….H5N1, H5N2…. 등으로 지정됨)을 제공할 수 있는 17 H (헤마글루티닌) 및 10 N (뉴라미니다제) 아형으로 나뉜다. H (헤마글루티닌)와 N (뉴라미니다제)은 인플루엔자 A형 바이러스, 예컨대 SIAV 내의 표면 당단백질이다. 추가로, N은 중화 항체의 주요 항원성 표적이다. 또한, NP (핵단백질)은 뉴클레오캡시드를 형성한다.
DIVA 정의
"DIVA (감염된 동물과 백신접종된 동물 간의 구별)"라는 용어는 백신접종된 동물을 자연적으로 감염된 동물과 구별하는데 사용될 수 있는 백신을 지칭한다.
"샘플"이라는 용어는 체액의 샘플, 분리된 세포의 샘플 또는 조직 또는 장기의 샘플을 가리킨다. 체액의 샘플은 널리 공지된 기법들에 의해 수득될 수 있으며, 바람직하게는, 혈액, 혈장, 혈청 또는 뇨 샘플, 보다 바람직하게는, 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플을 포함한다. 조직 또는 장기 샘플은 예컨대 생검에 의해 임의의 조직 또는 장기로부터 수득될 수 있다. 분리된 세포는 분리 기법, 예컨대 원심분리법 또는 세포 분류법에 의해 체액 또는 조직 또는 장기로부터 수득될 수 있다.
"수득된"이라는 용어는 바람직하게는 침전, 컬럼 등을 사용하여 당업계의 숙련자에게 공지된 분리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다.
"면역 시험" 및 "유전체 분석 시험"이라는 용어는 본 발명에 따른 면역원성 조성물로 백신접종된 동물과 (질병과 연관된) 자연 발생적인 돼지 인플루엔자 바이러스로 감염된 동물을 구별하기 위한 토대이다. 면역 시험의 예로는 임의의 효소 면역학적 또는 면역화학적 검출 방법, 예컨대 ELISA (효소 결합 면역흡착 분석법), EIA (효소 면역분석법), RIA (방사능면역검정법), 샌드위치 효소 면역 시험, 형광성 항체 시험 (FAT), 전기화학발광 샌드위치 면역분석법 (ECLIA), 해리증진된 란탄계열 플루오로 면역 분석법(dissociation-enhanced lanthanide fluoro immuno assay, DELFIA) 또는 고체상 면역 시험, 면역형광 시험 (IFT), 면역조직 염색, 웨스턴 블롯 분석 또는 당업계의 숙련된 기술자가 이용할 수 있는 임의의 다른 적절한 방법을 포함한다. 사용된 분석법에 따라, 상기 항원 또는 항체는 효소, 형광단 또는 방사성동위원소로 표지될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc., New York, N.Y. (1994)]; 및 [Frye et al., Oncogen 4: 1153-1157, 1987]을 참조한다.
"유전체 분석 시험"이라는 용어는 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR), 실시간 PCR (r-PCR) 또는 실시간 역전사 PCR (rRT-PCR), 템플렉스-PCR, 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA) 및 폴리머라아제와 프라이머로서 특이적 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 등온성 증폭법에 기반한 유전체 분석 방법을 지칭한다. 상기 언급한 증폭 방법들은 당업계에 널리 공지되어 있다.
항목
하기의 항목들이 본원에 기술된다:
본 발명은 하기의 항목들을 제공한다:
화합물
1. 하기를 포함하는 EHV 벡터:
(i) 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 적어도 하나의 외인성 항원 인코딩 서열,
(ii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 삽입되는 ORF70,
(iii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 작동가능하게 연결되는 프로모터 서열.
2. 항목 1에 따른 EHV 벡터 및 임의로 약학적 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
3. 하기를 포함하는 EHV 벡터를 포함하는 면역원성 조성물:
(i) 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 적어도 하나의 외인성 항원 인코딩 서열,
(ii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 삽입되는 ORF70,
(iii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 작동가능하게 연결되는 프로모터 서열.
4. 하기를 포함하는 EHV 벡터:
(i) 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 적어도 하나의 외인성 항원 인코딩 서열,
(ii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 삽입되는 삽입 부위,
(iii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 작동가능하게 연결되는, 4pgG600 (서열번호 1) 또는 4pMCP600 (서열번호 2)을 포함하는 프로모터 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열.
5. 항목 4에 따른 EHV 벡터 및 임의로 약학적 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
6. 하기를 포함하는 EHV 벡터를 포함하는 면역원성 조성물:
(i) 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 적어도 하나의 외인성 항원 인코딩 서열,
(ii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 삽입되는 삽입 부위,
(iii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 작동가능하게 연결되는, 4pgG600 (서열번호 1) 또는 4pMCP600 (서열번호 2)을 포함하는 프로모터 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열.
7. 하기를 포함하는 EHV 벡터:
(i) 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 적어도 2개의 외인성 항원 인코딩 서열,
(ii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 삽입되는 삽입 부위,
(iii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 작동가능하게 연결되는 프로모터 서열.
8. 항목 7에 따른 EHV 벡터 및 임의로 약학적 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
9. 하기를 포함하는 EHV 벡터를 포함하는 면역원성 조성물:
(i) 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 적어도 2개의 외인성 항원 인코딩 서열,
(ii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 삽입되는 삽입 부위,
(iii) 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 작동가능하게 연결되는 프로모터 서열.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 따른 2종 이상의 EHV 벡터를 포함하는 면역원성 조성물.
11. 항목 10에 있어서, 2개의 EHV 벡터를 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
12. 항목 10에 있어서, 상기 2개 이상의 EHV 벡터가 상이한 외인성 항원 인코딩 서열을 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
13. 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 따른 하나 이상의 EHV 벡터를 포함하는 DIVA 백신.
14. 항목 1 내지 13 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 EHV 벡터가 재조합체인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
15. 항목 1 내지 14 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 EHV 벡터가 RacH 또는 RacH SE인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
16. 항목 1 내지 14 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 EHV 벡터가 EHV-1, EHV-3, EHV-4, EHV-8 및 EHV-9로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
17. 항목 1 내지 16 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 EHV 벡터가 EHV-1인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
18. 항목 1 내지 17 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 식용 동물이 돼지인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
19. 항목 1 내지 18 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 식용 동물을 감염시키는 병원체가 인플루엔자 바이러스, 바람직하게는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
20. 항목 1 내지 19 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
21. 항목 1 내지 20 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이고, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자 아형이 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 및 H18로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
22. 항목 1 내지 21 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이고, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자 아형이 H1 및/또는 H3인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
23. 항목 1 내지 22 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이고, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자 A형 항원이 돼지로부터 유래하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
24. 항목 1 내지 23 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 EHV 벡터가 적어도 2개의 헤마글루티닌 인플루엔자 항원 인코딩 서열을 포함하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
25. 항목 1 내지 24 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 EHV 벡터가 적어도 4개의 헤마글루티닌 인플루엔자 항원 인코딩 서열을 포함하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
26. 항목 1 내지 25 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 EHV 벡터가 4개의 헤마글루티닌 인플루엔자 항원 인코딩 서열을 포함하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
27. 항목 1 내지 26 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이고, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자 항원 인코딩 서열이 A/돼지/이탈리아/116114/2010(H1N2), A/돼지/이탈리아/7680/2001(H3N2), A/돼지/겐트/132/2005(H1N1), A/돼지/이탈리아/4675/2003(H1N2), A/돼지/이탈리아/259543/2003(H1N2), A/돼지/덴마크/13772-1/2003(H1N1), A/돼지/잉글랜드/MD0040352R/2009(H1N1), A/돼지/헝가리/13509/2007(H3N2), A/돼지/이탈리아/13962/95(H3N2), A/돼지/코트다르모르/1121/00(H1N1), A/돼지/콜로라도/1/77, A/돼지/콜로라도/23619/99, A/돼지/코트다르모르/3633/84, A/돼지/잉글랜드/195852/92, A/돼지/피니스테르/2899/82, A/돼지/홍콩/10/98, A/돼지/홍콩/9/98, A/돼지/홍콩/81/78, A/돼지/일리노이/100084/01, A/돼지/일리노이/100085A/01, A/돼지/일리노이/21587/99, A/돼지/인디애나/1726/88, A/돼지/인디애나/9K035/99, A/돼지/인디애나/P12439/00, A/돼지/아이오와/30, A/돼지/아이오와/15/30, A/돼지/아이오와/533/99, A/돼지/아이오와/569/99, A/돼지/아이오와/3421/90, A/돼지/아이오와/8548-1/98, A/돼지/아이오와/930/01, A/돼지/아이오와/17672/88, A/돼지/이탈리아/1513-1/98, A/돼지/이탈리아/1523/98, A/돼지/대한민국/CY02/02, A/돼지/미네소타/55551/00, A/돼지/미네소타/593/99, A/돼지/미네소타/9088-2/98, A/돼지/네브래스카/1/92, A/돼지/네브래스카/209/98, A/돼지/네덜란드/12/85, A/돼지/노스캐롤라이나/16497/99, A/돼지/노스캐롤라이나/35922/98, A/돼지/노스캐롤라이나/93523/01, A/돼지/노스캐롤라이나/98225/01, A/돼지/외덴로드/7C/96, A/돼지/오하이오/891/01, A/돼지/오클라호마/18717/99, A/돼지/오클라호마/18089/99, A/돼지/온타리오/01911-1/99, A/돼지/온타리오/01911-2/99, A/돼지/온타리오/41848/97, A/돼지/온타리오/97, A/돼지/퀘벡/192/81, A/돼지/퀘벡/192/91, A/돼지/퀘벡/5393/91, A/돼지/타이완/7310/70, A/돼지/테네시/24/77, A/돼지/텍사스/4199-2/98, A/돼지/위스콘신/125/97, A/돼지/위스콘신/136/97, A/돼지/위스콘신/163/97, A/돼지/위스콘신/164/97, A/돼지/위스콘신/166/97, A/돼지/위스콘신/168/97, A/돼지/위스콘신/235/97, A/돼지/위스콘신/238/97, A/돼지/위스콘신/457/985 A/돼지/위스콘신/458/98, A/돼지/위스콘신/464/98 및 A/돼지/위스콘신/14094/99로 이루어진 균주의 군으로부터 선택되는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
28. 항목 1 내지 27 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이고, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자 항원 인코딩 서열이 A/돼지/이탈리아/116114/2010(H1N2), A/돼지/이탈리아/7680/2001(H3N2), A/돼지/겐트/132/2005(H1N1) 및 A/돼지/이탈리아/4675/2003(H1N2)으로 이루어진 균주의 군으로부터 선택되는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
29. 항목 1 내지 28 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이고, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자 항원 인코딩 서열이 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 인코딩하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
30. 항목 1 내지 29 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이고, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자 항원 인코딩 서열이 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
31. 항목 1 내지 30 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 헤마글루티닌을 인코딩하는 서열이고, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자 항원 인코딩 서열이 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
32. 항목 1 내지 31 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 N (뉴라미니다제)를 인코딩하는 서열이고, 상기 N 아형이 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9 및 N10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
33. 항목 1 내지 32 중 어느 한 항목에 있어서, N (뉴라미니다제) 인플루엔자 항원 인코딩 서열을 포함하지 않는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
34. 항목 1 내지 33 중 어느 한 항목에 있어서, NP (핵단백질) 인플루엔자 항원 인코딩 서열을 포함하지 않는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
35. 항목 1 내지 34 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 EHV 벡터가 종결 신호 또는 폴리아데닐화 서열과 같은 추가의 조절 서열을 포함하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
삽입 부위:
36. 항목 4 내지 34 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 삽입 부위가 ORF1/3인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
37. 항목 4 내지 34 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 삽입 부위가 ORF70인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
38. 항목 1 내지 37 중 어느 한 항목에 있어서, 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 제1 외인성 항원 인코딩 서열을 ORF70에 삽입하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
39. 항목 1 내지 38 중 어느 한 항목에 있어서, 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 제2 외인성 항원 인코딩 서열을 ORF1/3에 삽입하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
40. 항목 1 내지 39 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 ORF70으로의 삽입이 ORF70에서의 부분 결실, 절단, 치환, 변형 등을 특징으로 하여, ORF71이 기능을 발휘할 수 있도록 하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
41. 항목 1 내지 40 중 어느 한 항목에 있어서, 하기를 특징으로 하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신:
i) ORF70으로의 삽입이 RacH에 있어서 ORF70 내에 약 801bp 부분 (서열번호 20) 또는 이와 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%의 상동성인 서열 및/또는 동일한 서열의 결실을 특징으로 하거나,
ii) ORF70으로의 삽입이 RacH에 있어서 ORF70 내에 약 801bp 부분 (서열번호 20) 또는 임의의 다른 균주에서의 이와 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성인 서열 및/또는 동일한 서열의 결실을 특징으로 하거나,
iii) ORF70으로의 삽입이 야생형 EHV-1 균주 ab4 (Genbank 등록번호 AY665713.1)에 있어서 ORF70 내의 약 801bp 부분 (서열번호 19) 또는 이와 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성인 서열 및/또는 동일한 서열의 결실을 특징으로 하거나[상기 야생형 ab4 유전체 서열 중의 결실된 부분은 뉴클레오타이드 127681과 128482 사이에 위치함], 또는
iv) ORF70으로의 삽입이 야생형 EHV-1 균주 ab4 (Genbank 등록번호 AY665713.1)에 있어서 ORF70 내의 약 801bp 부분 (서열번호 19) 또는 임의의 다른 균주에서의 이와 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성인 서열 및/또는 동일한 서열의 결실을 특징으로 함[상기 야생형 ab4 유전체 서열 중의 결실된 부분은 뉴클레오타이드 127681과 128482 사이에 위치함].
42. 항목 1 내지 41 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 EHV-1 벡터가 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17과 서열번호 18 및 상기 서열들 중 임의의 한 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성인 서열 및/또는 동일한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 인접 영역을 포함하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
43. 항목 1 내지 42 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 EHV-1 벡터가 (i) 서열번호 13, 서열번호 15 및 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 좌측 ORF70 인접 영역 및 (ii) 서열번호 14, 서열번호 16 및 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 우측 ORF70 인접 영역을 포함하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
프로모터:
44. 항목 1 내지 3 및 7 내지 43 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 프로모터 서열이 SV40 대형(large) T, HCMV 및 MCMV 전초기(immediate early) 유전자 1, 인간 신장인자 알파 프로모터, 바큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터, 4pgG600 (서열번호 1)의 기능적 단편 [바람직하게는, 상기 기능적 단편은 p430 (서열번호 3)], 4pgG600 (서열번호 1)의 상보적인 뉴클레오타이드 서열의 기능적 단편, 4pMCP600 (서열번호 2)의 기능적 단편 [바람직하게는, 상기 기능적 단편은 p455 (서열번호 4)] 및 4pMCP600 (서열번호 2)의 상보적인 뉴클레오타이드 서열의 기능적 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
45. 항목 1 내지 3 및 7 내지 44 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 프로모터 서열이 4pgG600 (서열번호 1) 또는 4pMCP600 (서열번호 2), 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
46. 항목 4 내지 6 및 45 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 프로모터 서열의 기능적 단편 또는 유도체가 80%, 85%, 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%의 상동성을 갖는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
47. 항목 4 내지 6, 45 및 46 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 프로모터 서열의 기능적 단편 또는 유도체가 550개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 500, 490, 480, 470, 460, 455, 450, 445, 440, 435, 434, 433, 432, 431, 430개의 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 455 또는 430개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
48. 항목 4 내지 6 및 45 내지 47 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 프로모터 서열의 기능적 단편이 4pgG600 (서열번호 1)의 절단부 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열이고, 바람직하게는 상기 서열 동일성이 전체 길이에 대하여 (적어도) 72% (또는 그 이상)인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
49. 항목 4 내지 6 및 45 내지 48 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 4pgG600 (서열번호 1)의 프로모터 서열의 기능적 단편이 p430 (서열번호 3)으로 지정된 단편 또는 서열번호 3과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%의 동일성을 갖는 서열인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
50. 항목 4 내지 6 및 45 내지 48 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 프로모터 서열의 기능적 단편이 4pMCP600 (서열번호 2)의 절단부 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열이고, 바람직하게는 상기 서열 동일성이 전체 길이에 대하여 (적어도) 78% (또는 그 이상)인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
51. 항목 4 내지 6 및 45 내지 48 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 4pMCP600 (서열번호 2)의 프로모터 서열의 기능적 단편이 p455 (서열번호 4)로 지정된 단편 또는 서열번호 4와 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%의 동일성을 갖는 서열인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
52. 항목 1 내지 51 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 EHV 벡터가 종결 신호, 폴리아데닐화 신호와 같은 추가의 조절 서열, 또는 IRES 및/또는 2a 펩타이드와 같은 추가의 조절요소를 포함하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
프로모터와 항원의 특이적 조합:
53. 항목 1 내지 52 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열이, 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
54. 항목 53에 있어서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1)의 기능적 단편이 p430 (서열번호 3)으로 지정된 단편인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
55. 항목 1 내지 54 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열이, 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
56. 항목 55에 있어서, 상기 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2)의 기능적 단편이 p455 (서열번호 4)으로 지정된 단편인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
57. 항목 1 내지 56 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열이, 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되고,
상기 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열이, 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
58. 항목 57에 있어서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1)의 기능적 단편이 p430 (서열번호 3)으로 지정된 단편이고, 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2)의 기능적 단편은 p455 (서열번호 4)로 지정된 단편인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
59. 항목 57 또는 58에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 2가인 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
60. 항목 1 내지 59 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열이, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
61. 항목 60에 있어서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1)의 기능적 단편이 p430 (서열번호 3)으로 지정된 단편인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
62. 항목 1 내지 61 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열이, 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
63. 항목 62에 있어서, 상기 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2)의 기능적 단편이 p455 (서열번호 4)로 지정된 단편인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
64. 항목 1 내지 63 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열이, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되고,
상기 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열이, 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
65. 항목 64에 있어서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1)의 기능적 단편이 p430 (서열번호 3)으로 지정된 단편이고, 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2)의 기능적 단편은 p455 (서열번호 4)로 지정된 단편인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
66. 항목 64 또는 65에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 2가인 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
67. 항목 1 내지 66 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물이, 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는, 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 및
서열번호 27에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는, 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 EHV 벡터를 포함하고,
상기 면역원성 조성물이, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는, 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 및
서열번호 26에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된, 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적 단편 또는 기능적 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 EHV 벡터를 포함하는 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
68. 항목 67에 있어서, 상기 프로모터 서열 4pgG600 (서열번호 1)의 기능적 단편이 p430 (서열번호 3)으로 지정된 단편이고, 프로모터 서열 4pMCP600 (서열번호 2)의 기능적 단편은 p455 (서열번호 4)로 지정된 단편인 것인, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
69. 항목 67 또는 68에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 4가인 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
70. 항목 1 내지 69 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 1회 용량 투여용으로 제제화되는 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
71. 항목 1 내지 70 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 근육내 또는 비강내로 투여되는 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
72. 항목 1 내지 71 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 생후 첫 6주 이내, 생후 첫 2주 이내, 생후 첫 1주 이내 또는 생후 첫 1일 이내의 돼지에게 안전한 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
73. 항목 1 내지 72 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
74. 항목 73에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체가 아쿠아 애드 인젝션엠(aqua ad injectionem, 주사용수), 세포 배양 배지 또는 재현탁 완충액인 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
75. 항목 74에 있어서, 상기 재현탁 완충액이 인산염 완충 식염수인 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
76. 항목 1 내지 75 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 1x104 내지 1x109의 TCID50, 바람직하게는 1x104 내지 1x108의 TCID50, 보다 더 바람직하게는 1x104 내지 1x107의 TCID50의 EHV 벡터를 포함하는 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
77. 항목 1 내지 76 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 백신인 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
78. 항목 1 내지 77 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 다가 백신인 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
79. 항목 1 내지 78 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 2가 백신, 4가 백신, 6가 백신 또는 7가 백신인 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
80. 항목 1 내지 79 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 2가 백신 또는 4가 백신인 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
81. 항목 1 내지 80 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 돼지 인플루엔자 A형 바이러스로 야기된 임상 증상의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 식용 동물에서 상기 임상 증상의 치료 및/또는 예방에 효과적인 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
82. 항목 1 내지 81 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 돼지 인플루엔자 A형 바이러스의 동종성 및/또는 이종성 시험감염에 대하여 보호하는 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
83. 항목 1 내지 82 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 혈청형 H1 및/또는 H3의 돼지 인플루엔자 A형 바이러스의 시험감염에 대하여 보호하는 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
키트
84. 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목의 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신을 포함하는 키트.
85. 항목 84에 있어서, 추가로 돼지 인플루엔자 A형 바이러스의 치료 및/또는 예방을 위한 지침서를 포함하는 것인, 키트.
치료 방법
86. 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목의 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신을 식용 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 식용 동물을 면역화시키는 방법.
87. 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목의 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신의 치료적 유효량을 식용 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스로 유발된 임상 증상의 치료 또는 예방을 필요로 하는 식용 동물에서 상기 임상 증상을 치료 또는 예방하는 방법.
88. 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목의 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신의 치료적 유효량을 식용 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동일한 종의 면역화시키지 않은 대조군 식용 동물에 비해 폐에서의 바이러스 역가를 감소시키는 것이 필요한 식용 동물에서 폐에서의 바이러스 역가를 감소시키는 방법.
89. 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목의 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신의 치료적 유효량을 식용 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체를 보유하는 것이 필요한 식용 동물을 백신접종하는 방법.
90. 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목의 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신의 치료적 유효량을 어린 식용 동물을 임신하고 있는 모체에게 투여하는 단계를 포함하는, 어린 식용 동물에서 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 모계 유래의 면역력을 제공하는 방법.
91. 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 대한 증진된 보호를 필요로 하는 어린 식용 동물에서 상기 바이러스 감염에 대한 증진된 보호를 제공하는 방법으로서,
a) 상기 어린 식용 동물을 임신하고 있는 모체를 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목의 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신의 치료적 유효량으로 백신접종시키고/시키거나,
b) 상기 어린 식용 동물을 생후 3주 이내에 치료적 유효량의 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신으로 백신접종시키는 것인, 방법.
92. 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목에 있어서, 치료적 유효량의 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신을 식용 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 식용 동물을 면역화시키는 방법에 사용하기 위한, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
93. 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목에 있어서, 치료적 유효량의 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신을 식용 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 A형 바이러스로 유발된 임상 증상의 치료 또는 예방을 필요로 하는 식용 동물에서 상기 임상 증상을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
94. 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목에 있어서, 치료적 유효량의 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신을 식용 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동일한 종의 면역화시키지 않은 대조군 식용 동물에 비해 폐에서의 바이러스 역가를 감소시키는 것이 필요한 식용 동물에서 폐에서의 바이러스 역가를 감소시키는 방법에 사용하기 위한, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
95. 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목에 있어서, 치료적 유효량의 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신을 식용 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체를 갖는 것이 필요한 식용 동물을 면역화시키는 방법에 사용하기 위한, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
96. 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목에 있어서, 치료적 유효량의 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신을 어린 식용 동물을 임신하고 있는 모체에게 투여하는 단계를 포함하는, 어린 식용 동물에서 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 모계 유래의 면역력을 제공하는 방법에 사용하기 위한, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
97. 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목에 있어서, 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 대한 증진된 보호를 필요로 하는 어린 식용 동물에서 상기 바이러스 감염에 대한 증진된 보호를 제공하는 방법에 사용하기 위한, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신으로서,
a) 상기 어린 식용 동물을 임신하고 있는 모체를 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목의 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신의 치료적 유효량으로 백신접종시키고/시키거나,
b) 상기 어린 식용 동물을 생후 3주 이내에 치료적 유효량의 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신으로 백신접종시키는 것인, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
98. 항목 86 내지 97 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 식용 동물이 돼지, 새끼 돼지 또는 암퇘지인 것인, 방법 또는 용도.
99. 항목 86 내지 98 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 인플루엔자 A형 바이러스가 돼지 인플루엔자 A형 바이러스인 것인, 방법 또는 용도.
100. 항목 86 내지 99 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신을 1회 투여하는 것인, 방법 또는 용도.
101. 항목 86 내지 100 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신을 생후 첫 6주 이내, 생후 첫 2주 이내, 생후 첫 1주 이내 또는 생후 첫 1일 이내의 식용 동물에게 투여하는 것인, 방법 또는 용도.
102. 항목 86 내지 101 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신을 2회 용량으로 투여하는 것인, 방법 또는 용도.
103. 항목 102에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신을 생후 첫 1주 이내에 식용 동물에게 투여하고, 생후 2주, 3주 또는 4주 이내에 2회차를 투여하는 것인, 방법 또는 용도.
104. 항목 86 내지 103 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신을 근육내 또는 비강내로 투여하는 것인, 방법 또는 용도.
105. 항목 86 내지 88, 92 내지 94 및 98 내지 104 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 식용 동물이 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체 음성인 것인, 방법 또는 용도.
106. 항목 86 내지 104 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 식용 동물이 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체 양성인 것인, 방법 또는 용도.
107. 항목 86 내지 106 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 1x104 내지 1x107 TCID50의 EHV 벡터를 포함하는 것인, 방법 또는 용도.
108. 항목 86 내지 107 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 방법이, 면역화시키지 않은 동일한 종의 대조군 식용 동물과 비교하여, 체중 손실의 감소, 폐에서의 더 낮은 바이러스 부하량, 폐 병변의 감소, 바이러스 쉐딩(shedding)의 감소 및/또는 단축, 감소된 직장 온도, 감소된 임상 증상 (특히, 호흡기 증상), (중화성) 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체의 유도 증가, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 T-세포의 자극 증가, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 B-세포의 자극 증가 및 폐에서의 염증 유발성 사이토카인, 예컨대, IL-1β의 감소, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 효능 파라미터에서의 개선을 유도하는 것인, 방법 또는 용도.
109. 항목 86 내지 108 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 치료 또는 예방이, 치료하지 않은 동일한 종의 대조군 식용 동물과 비교하여 바이러스 부하 단계의 단축을 유도하는 것인, 방법 또는 용도.
110. 항목 86 내지 109 중 어느 한 항목에 있어서, 치료 또는 예방은 상기 인플루엔자 A형 바이러스의 시험감염 (감염) 후 1일부터 상기 바이러스의 쉐딩을 감소시키는 것인, 방법 또는 용도.
111. 항목 86 내지 110 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 인플루엔자 A형 바이러스의 동종성 및/또는 이종성 시험감염에 대하여 보호하는 것인, 방법 또는 용도.
112. 항목 86 내지 111 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신이 혈청형 H1 및/또는 H3의 인플루엔자 A형 바이러스의 시험감염에 대하여 보호하는 것인, 방법 또는 용도.
스위스 타입 및 기타 어구 유형
113. 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목에 있어서, 치료적 사용을 위한, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
114. 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목에 있어서, 면역원 또는 백신으로 사용하기 위한, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
115. 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목에 있어서, 약제로 사용하기 위한, EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신.
116. 약제의 제조를 위한, 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목의 EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신의 용도.
117. 식용 동물에서 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방을 위한, 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목의 EHV 벡터, 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신의 용도.
DIVA
118. 하기 단계를 포함하는, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스로 감염된 식용 동물과 항목 2, 3, 5, 6 및 8 내지 83 중 어느 한 항목의 면역원성 조성물 또는 DIVA 백신으로 백신접종된 동물을 구별하는 방법:
a) 식용 동물로부터 샘플을 수득하는 단계, 및
b) 상기 샘플을 면역 시험 및/또는 유전체 분석 시험에서 분석하는 단계.
119. 항목 118에 있어서, 상기 면역 시험이, 해당 샘플이 돼지 인플루엔자의 N (뉴라미니다제) 단백질 또는 NP (핵단백질) 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는지의 여부를 시험하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
120. 항목 118 또는 119에 있어서, 상기 식용 동물은, 돼지 인플루엔자의 N (뉴라미니다제) 단백질 또는 NP (핵단백질) 단백질을 특이적으로 인식하는 항체가 검출되었다면, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 감염된 것인, 방법.
121. 항목 118에 있어서, 상기 유전체 분석 시험이, 해당 샘플이 N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질)를 인코딩하는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 특이적 서열을 포함하는지의 여부를 시험하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
122. 항목 118 또는 121에 있어서, 상기 식용 동물은, N (뉴라미니다제) 및/또는 NP (핵단백질)를 인코딩하는 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 특이적 서열이 검출되었다면, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 감염된 것인, 방법.
123. 항목 118 내지 122 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역 시험이 EIA (효소 면역분석법) 또는 ELISA (효소 결합 면역흡착 분석법)이거나, 또는, 상기 유전체 분석 시험은 PCR (중합효소 연쇄 반응), RT-PCR (역전사 중합효소 연쇄 반응) 또는 실시간 PCR (중합효소 연쇄 반응)인 것인, 방법.
124. 항목 118 내지 123 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 식용 동물이 돼지인 것인, 방법.
125. 항목 118 내지 124 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 샘플이 혈청 샘플인 것인, 방법.
126. 항목 118 내지 125 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 ELISA가 간접 ELISA, 샌드위치 ELISA, 경쟁적 ELISA 또는 블로킹 ELISA인 것인, 방법.
하기의 도면들은 본 명세서의 일부를 구성하며 본 발명의 특정 양태들을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 실시양태들에 대한 상세한 설명과 함께 이들 도면들 중 하나 이상을 참조하면 더 잘 이해될 수 있을 것이다.
도 1a. 야생형 (wt) EHV-1 균주 ab4 및 약독화된 백신 균주 EHV-1 RacH의 orf1/3 영역을 비교하는 개략도
도 1b. ORF70 삽입 부위의 개략도
UL = 고유의 긴 세그먼트(long unique segment)
US = 고유의 짧은 세그먼트(short unique segment)
IR = 내부 역위 반복
TR = 말단 역위 반복
gG = 당단백질 G
gpII = 당단백질 II
orf = 오픈 리딩 프레임
bp = 염기쌍
도 2. 전달 플라스미드 pU-mC70-BGH의 플라스미드 지도 및 뉴클레오타이드 서열
도 3. 프로모터 역학 실험의 qPCR 결과.
3a의 그래프는 필수 당단백질 D를 인코딩하는 orf72의 전사에 대한 역학을 나타내고 있다. 상기 데이터를 사용하여 mCherry의 전사 역학에 대한 데이터를 보정하였다 (3b의 그래프).
도 4. 독립적인 두 프로모터 역학 실험에 대한 qPCR 결과: 전사 활성과 나타낸 수치의 양의 상관관계. 감염 후 서로 다른 시간대에서의 mCherry qPCR 결과에 대하여 보정된 Ct 값을 t=0에서의 상응하는 평균 Ct 값에서 차감하였다. 2개의 서로 다른 세포주에서의 두 실험을 나타내었다.
도 5. 전달 벡터 pU70-p455-71K71의 플라스미드 지도 및 뉴클레오타이드 서열
도 6. EHV-1 RacH의 ORF70으로의 발현 카세트 p455-H3-71 삽입을 위한 전달 플라스미드 pU70-p455-H3-71K71의 플라스미드 지도 및 뉴클레오타이드 서열
H3 = 인플루엔자 A형 바이러스 헤마글루티닌 H3을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임
71pA = 본 발명에 기술된 신규한 폴리A 서열
I-SceI = 제한효소인 엔도뉴클레아제 I-SceI에 대한 절단 부위
프로모터 aph = 카나마이신 내성 유전자의 원핵성 프로모터
Kana = 카나마이신 내성 유전자
3' 말단 ORF70 = 삽입 부위의 재조합 영역 하향부
ORI = 플라스미드의 복제 원점
APr = 플라스미드의 암피실린 내성 유전자
상향부 ORF70 = 삽입 부위의 재조합 영역 상향부
p455 = 신규한 프로모터 p455
bp = 염기쌍
도 7. ORF70 삽입 영역을 확대한 rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 유전체의 개략도.
orf69: ORF70에서의 삽입 부위 중 오픈 리딩 프레임 69번 상향부; p455: 본원에 기술된 신규한 프로모터, 예컨대, 실시예 1 참조; H3: 이식유전자 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌; 71pA: 신규한 폴리아데닐화 서열; ΔORF70: 구조성 바이러스 당단백질 II (gpII)를 인코딩하는, ORF71에 대한 프로모터를 함유하는 ORF70의 잔여부
도 8. 간접 면역형광 분석법:
rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3으로 감염된 VERO-세포의 간접 면역형광 분석법. 감염후 (p.i.) 24시간된 세포들을 에탄올로 고정하고 통풍 건조시켰다. 1차 항체로서 시판중인 H3에 대한 단일클론 항체 및 2차 항체로서 FITC-컨쥬케이트된 래빗-항 마우스 IgG를 사용하여, 재조합 EHV-1 RacHSE-70-p455-H3으로 감염된 세포 중에서 H3을 형광 현미경 검사로 나타내었다.
도 9. 웨스턴 블롯:
서로 다른 계대수의 rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 또는 대조군 rEHV-1 RacH-SE 또는 허위 감염 (mock-infected) 대조군으로 감염된 세포들에 대한 웨스턴 블롯. 좌측의 블롯을 EHV-1의 gpII에 대한 단일클론 항체 Ai2G7과 함께 항온배양하였다. 우측의 레플리카(replica) 블롯을 인플루엔자 A형 헤마글루티닌 H3에 대한 시판중인 래빗 과다면역 혈청 (PA5-34930)과 함께 항온배양하였다. 1: rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 P5 감염된 세포, 2: rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 P10 감염된 세포, 3: rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 P15 감염된 세포, 4: rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 P20 감염된 세포, 5: rEHV-1 RacH-mC70 감염된 세포.
도 10.바이러스 역가:
개개의 동물 (a) 또는 그룹 평균 (b)에 있어서 시험감염 후 1일 및 3일째에 그룹의 평균 폐 역가. 역가는 각각 폐 균질액 1g당 돼지 IAV의 조직 배양 감염성 용량 50으로 나타낸다. 역가를 동물마다 각각 좌측 및 우측 폐에 대해 측정된 값들의 평균으로서 결정하고, 3개의 폐샘플의 풀(pool)에서 각각 유래한 폐에 대한 균질액을 조사하였다. 음성 대조군 (neg. ctrl.), 시험감염 대조군 (chall. ctrl.), RacH-SE-70-p455-H3으로 1회 백신접종된 동물 (1x EHV-1), RacH-SE-70-p455-H3으로 2회 백신접종된 동물 (2x EHV-1), 또는 시판중인 불활성화 돼지 IAV 백신으로 2회 백신접종된 동물 (2x Inact.).
도 11. 전달 벡터 pU-1-3-p430-BGHKBGH의 플라스미드 지도 및 뉴클레오타이드 서열
도 12. EHV-1 RacH의 orf1/3로의 발현 카세트 p430-H1av-BGH의 삽입을 위한 전달 플라스미드 pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH의 플라스미드 지도 및 뉴클레오타이드 서열
H1av = 인플루엔자 A형 바이러스 헤마글루티닌 H1을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임
BGHpA = 소 성장 호르몬 폴리A 서열
프로모터 aph = 카나마이신 내성 유전자의 원핵성 프로모터
Kana = 카나마이신 내성 유전자
Flank B = 삽입 부위의 재조합 영역 하향부
Flank A = 삽입 부위의 재조합 영역 상향부
p430 = 신규한 프로모터 p430
bp = 염기쌍
도 13. orf1/3 삽입 영역을 확대한 rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av 유전체의 개략도.
Δorf1: 삽입 부위의 오픈 리딩 프레임 1 상향부의 잔여 부분; p430: 본원에 기술된 신규한 프로모터, 예컨대, 실시예 1 참조; H1av: 이식유전자 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌; BGHpA: 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열; orf3: 삽입 부위의 오픈 리딩 프레임 3 하향부.
도 14. 이식유전자의 발현을 보여주는, rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av로 감염된 세포에 대한 웨스턴 블롯 및 면역형광.
H1av = rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av
SE = rEHV-RacH-SE (대조군)
mock = 감염시키지 않은 세포 (대조군)
도 15. 두 삽입 영역을 확대한 rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3 (rEHV-1-RacH-SE B) 유전체의 개략도.
Δorf1: 삽입 부위의 오픈 리딩 프레임 1 상향부의 잔여 부분; p430: 신규한 프로모터; H1av: 이식유전자 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌; BGHpA: 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열; orf3: 삽입 부위의 오픈 리딩 프레임 3 하향부.
orf69: ORF70에서의 삽입 부위 중 오픈 리딩 프레임 69번 상향부; p455: 신규한 프로모터; H3: 이식유전자 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌; 71pA: 신규한 폴리아데닐화 서열; ΔORF70: 구조성 바이러스 당단백질 II (gpII)를 인코딩하는, ORF71에 대한 프로모터를 함유하는 ORF70의 잔여부
도 16. 웨스턴 블롯: rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3으로 감염시킨 세포 (B), 공벡터 rEHV-1 RacH-SE로 감염시킨 세포 (SE), 또는 허위 감염시킨 세포 (ctrl)에 대한 웨스턴 블롯. 레플리카 블롯을 시판중인 H3에 대한 래빗 과다면역 혈청 (H3), 시판중인 H1에 대한 래빗 과다면역 혈청 (PA 34929) (H1) 또는 EHV-1 gpII에 대한 단일클론 항체 Ai2G7 (gpII)과 함께 항온배양시켰다.
도 17. 시험감염 전과 시험감염 후 1, 2 및 3일째에 그룹의 평균 체온. 오차 막대, 표준 편차. 해당 연구일에 있어서 좌측에서 우측으로: 음성 대조군 (neg. ctrl.), 시험감염 대조군 (chall. ctrl.), RacH-SE-70-p455-H3으로 1회 백신접종된 동물 (1x EHV-1), RacH-SE-70-p455-H3으로 2회 백신접종된 동물 (2x EHV-1), 또는 불활성화 돼지 IAV 백신으로 2회 백신접종된 동물 (2x killed).
도 18. 시험감염 후 1일 및 3일째에 그룹의 평균 폐 스코어. 오차 막대, 표준 편차. 음성 대조군 (neg. ctrl.), 시험감염 대조군 (chall. ctrl.), RacH-SE-70-p455-H3으로 1회 백신접종된 동물 (1x EHV-1), RacH-SE-70-p455-H3으로 2회 백신접종된 동물 (2x EHV-1), 또는 불활성화 돼지 IAV 백신으로 2회 백신접종된 동물 (2x killed).
도 19. 시험감염 당일에 수집한 돼지 IAV H3 시험감염 균주 R452-14에 대하여 혈청 중화도 (SN) 역가의 역수. (20, 검출 한계). 음성 대조군 (neg. ctrl.), 시험감염 대조군 (chall. ctrl.), RacH-SE-70-p455-H3으로 1회 백신접종된 동물 (1x EHV-1), RacH-SE-70-p455-H3으로 2회 백신접종된 동물 (2x EHV-1), 또는 불활성화 돼지 IAV 백신으로 2회 백신접종된 동물 (2x killed).
도 20. 돼지 IAV 시험감염 적용 후 1일 또는 2일째에 수득한 BALF의 IL-1β 결과. 각 점들은 한 마리의 동물에 대해 측정된 값을 나타낸다. 음성 대조군 (Neg. Ctr.), 시험감염 대조군 (Chall. Ctr.), RacH-SE-70-p455-H3으로 1회 백신접종된 동물 (1x EHV-1), RacH-SE-70-p455-H3으로 2회 백신접종된 동물 (2x EHV-1), 또는 불활성화 돼지 IAV 백신으로 2회 백신접종된 동물 (2x killed).
도 21. 2차 백신접종 후 7일째에 재자극시킨 PBMC에 대한 IFNγ-ELISpot의 결과. (a), 백신접종을 하지 않은 대조군; (b), 불활성화 돼지 IAV 백신으로 2회 백신접종; (c), rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3으로 1회 백신접종; (d), rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3으로 2회 백신접종. rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3으로 단 한차례 백신접종한 동물에 있어서, 재자극은 1차 백신접종 후 7일째에 해당한다. 각 점들은 주어진 시점에서 특정 자극으로 재자극한 후에 한마리의 동물에 대해 측정된 값을 나타낸다. 재자극을 위해, rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3에서 H3 백신 항원에 상응하는 재조합적으로 발현된 돼지 IAV HA (HA_V), 시험감염 균주 R452-14의 H3에 상응하는 재조합적으로 발현된 돼지 IAV HA (HA_CH), 희석된 HA_V 및 HA_CH에 대한 배지 (RPMI), EHV-1 공벡터 RacH-SE (EHV-1 empty), 백신 RacH-SE-70-p455-H3 (EHV-1-H3), 돼지 IAV H3N2 시험감염 균주 R452-14 (H3N2), R452-14를 성장시키는데 사용된 감염시키지 않은 세포의 세포 상청액 (MDCK), 또는 재조합적으로 발현된 돼지 IAV 핵단백질 (NP)을 사용하였다.
도 22. 전달 플라스미드 pU1/3-p430-H1hu-BGHKBGH의 개략적인 지도
도 23: 전달 플라스미드 pU70-p455-H1pdm-71K71의 개략적인 지도
도 24: orf1/3 및 orf70 삽입 영역을 확대한 rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm (rEHV-1 RacH-SE_D)의 선형 이중 가닥 DNA 유전체
도 25: rEHV-1 RacH-SE_B, RacH-SE_D, RacH-SE로 감염된 세포 또는 감염시키지 않은 세포 (ctrl)에 대한 웨스턴 블롯. 레플리카 블롯을 H3에 대한 다중클론 래빗 과다면역 혈청 (PA5-34930), H1에 대한 다중클론 래빗 과다면역 혈청 (PA5-34929), 또는 EHV-1 당단백질 II (gpII)에 대한 단일클론 항체 (Ai2G7)와 함께 항온배양시켰다. 감염된 모든 세포 샘플 중에서 EHV-1 gpII의 매우 유사한 염색 패턴으로 판단된 바와 같이, 모든 항체들은 목적하는 항원 H3 및 H1의 발현을 확인시켜 주는 예상 패턴 및 서로 다른 바이러스에 대하여 유사한 복제 효율을 나타내었다.
도 26: 인플루엔자 A형 바이러스 (A/돼지/이탈리아/7680/2001(H3N2)) 또는 (A/돼지/겐트/132/2005(H1N1))에 대한 마우스 혈청의 평균 중화 능력에 대한 그래프. 중화 능력은 혈청의 희석률 역수와 그에 의해 중화된 개별 역가를 곱하여 계산하였다. 이후, 3번 시험의 평균을 100으로 나누어 100 TCID50의 중화도를 나타내었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 27: 시험감염 후 1일째에 사멸된 동물에 있어서 TCID50/폐 조직(g)으로 측정된 돼지 IAV 폐 역가. neg. ctrl., 음성 대조군; chall. ctrl., 시험감염 대조군; 2X IM, 근육내로 2회 백신접종된 그룹; IN+IM, 1차로 비강내 및 2차로 근육내로 백신접종된 그룹; 2X IN, 비강내로 2회 백신접종된 그룹. 데이터 포인트는 각 동물에 대하여 수득된 평균을 나타낸다. 중간의 수평선은 각각 그룹 평균을 나타낸다. 상부 및 하부 수평선은 각각 표준 편차를 나타낸다. 그룹들에 대한 통계적 쌍별 비교를 위한 p값을 아래에 나타내었는데, 이는 각각 맨-휘트니 시험(Mann-Whitney test)을 사용한 t-시험 및 표준 소프트웨어 설정을 사용한 윈도우 소프트웨어 7.02용 GraphPad Prism® [미국 캘리포니아주 92037 라호야 소재의 그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드(GraphPad Software,Inc.) 제조]으로 계산하였다.
도 28: 시험감염 후 3일째에 사멸된 동물에 있어서 TCID50/폐 조직(g)으로 측정된 돼지 IAV 폐 역가. neg. ctrl., 음성 대조군; chall. ctrl., 시험감염 대조군; 2X IM, 근육내로 2회 백신접종된 그룹; IN+IM, 1차로 비강내 및 2차로 근육내로 백신접종된 그룹; 2X IN, 비강내로 2회 백신접종된 그룹. 데이터 포인트는 각 동물에 대하여 수득된 평균을 나타낸다. 중간의 수평선은 각각 그룹 평균을 나타낸다. 상부 및 하부 수평선은 각각 표준 편차를 나타낸다. 그룹들에 대한 통계적 쌍별 비교를 위한 p값을 아래에 나타내었는데, 이는 각각 맨-휘트니 시험(Mann-Whitney test)을 사용한 t-시험 및 표준 소프트웨어 설정을 사용한 윈도우 소프트웨어 7.02용 GraphPad Prism® [미국 캘리포니아주 92037 라호야 소재의 그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드(GraphPad Software,Inc.) 제조]으로 계산하였다.
도 29: 시험감염 후 5일째에 사멸된 동물에 있어서 TCID50/폐 조직(g)으로 측정된 돼지 IAV 폐 역가. neg. ctrl., 음성 대조군; chall. ctrl., 시험감염 대조군; 2X IM, 근육내로 2회 백신접종된 그룹; IN+IM, 1차로 비강내 및 2차로 근육내로 백신접종된 그룹; 2X IN, 비강내로 2회 백신접종된 그룹. 데이터 포인트는 각 동물에 대하여 수득된 평균을 나타낸다. 중간의 수평선은 각각 그룹 평균을 나타낸다. 상부 및 하부 수평선은 각각 표준 편차를 나타낸다. 그룹들에 대한 통계적 쌍별 비교를 위한 p값을 아래에 나타내었는데, 이는 각각 맨-휘트니 시험을 사용한 t-시험 및 표준 소프트웨어 설정을 사용한 윈도우 소프트웨어 7.02용 GraphPad Prism® [미국 캘리포니아주 92037 라호야 소재의 그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드 제조]으로 계산하였다.
도 30: 백신 균주 rEHV-1 RacH-SE_B에 의해 발현된 H3과 동종성인 재조합적으로 발현된 돼지 IAV 헤마글루티닌 H3 항원에 대한 돼지 면역글로불린 G (IgG)에 특이적인 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA)의 결과. 상기 시험을 위해, 각 웰을 100 ng의 재조합적으로 발현된 H3으로 코팅하였다. 샘플을 쌍으로 측정하였고, 샘플 평균은 쌍별 측정으로부터 계산하였으며, 그룹의 값은 샘플 평균으로부터 계산하였다. chall. ctrl., 시험감염 대조군 (음성 대조군 대용); 2x IM, 근육내로 2회 백신접종된 그룹; IN+IM, 1차로 비강내 및 2차로 근육내로 백신접종된 그룹; 2X IN, 비강내로 2회 백신접종된 그룹. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 연구일 (SD)은 그래프 우측의 범례에 나타내었다.
도 31: 백신 균주 rEHV-1 RacH-SE_B에 의해 발현된 H3과 동종성인 재조합적으로 발현된 돼지 IAV 헤마글루티닌 H3 항원에 대한 돼지 면역글로불린 G (IgG)에 특이적인 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA)의 결과. 상기 시험을 위해, 각 웰을 100 ng의 재조합적으로 발현된 H3으로 코팅하였다. 샘플을 쌍으로 측정하였고, 샘플 평균은 쌍별 측정으로부터 계산하였으며, 그룹의 값은 샘플 평균으로부터 계산하였다. chall. ctrl., 시험감염 대조군 (음성 대조군 대용); 2x IM, 근육내로 2회 백신접종된 그룹; IN+IM, 1차로 비강내 및 2차로 근육내로 백신접종된 그룹; 2X IN, 비강내로 2회 백신접종된 그룹. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 연구일 (SD)은 그래프 우측의 범례에 나타내었다.
도 32: 인터페론 감마 특이적 효소 결합 면역흡착 스팟 분석법 (IFNγ ELISpot)의 결과. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 연구 28일째 (SD28)에 연구 동물에서 채취한 혈액으로부터 정제하였다. 이후, 1의 감염 다중도로 H3N2 돼지 IAV 시험감염 균주 R452-14 (H3N2 MOI 1)를 사용하거나 또는 1μg/ml의 농도로 백신 균주 rEHV-1 RacH-SE_B에 의해 발현된 H3에 대해 동종성인 재조합적으로 발현된 돼지 IAV H3 항원 (rH3 1μg/ml)을 사용하여 PBMC를 재자극시켰다. 상기 재자극된 PBMC를 사용하여, 인터페론 감마 특이적 효소 결합 면역흡착 스팟 분석법 (IFNγ ELISpot)을 수행하였고, 상기 수득된 값을 각각 106개의 세포에 대해 보정하여 그룹당 평균으로 계산하였다. chall. ctrl., 시험감염 대조군 (음성 대조군 대용); 2x IM, 근육내로 2회 백신접종된 그룹; IN+IM, 1차로 비강내 및 2차로 근육내로 백신접종된 그룹; 2X IN, 비강내로 2회 백신접종된 그룹. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 33: 인터페론 감마 특이적 효소 결합 면역흡착 스팟 분석법 (IFNγ ELISpot)의 결과. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 연구 28일째 (SD28)에 연구 동물에서 채취한 혈액으로부터 정제하였다. 이후, 1의 감염 다중도로 H3N2 돼지 IAV 시험감염 균주 R452-14 (H3N2 MOI 1)를 사용하거나 또는 1μg/ml의 농도로 백신 균주 rEHV-1 RacH-SE_B에 의해 발현된 H3에 대해 동종성인 재조합적으로 발현된 돼지 IAV H3 항원 (rH3 1μg/ml)을 사용하여 PBMC를 재자극시켰다. 상기 재자극된 PBMC를 사용하여, 인터페론 감마 특이적 효소 결합 면역흡착 스팟 분석법 (IFNγ ELISpot)을 수행하였고, 상기 수득된 값을 각각 106개의 세포에 대해 보정하여 그룹당 평균으로 계산하였다. chall. ctrl., 시험감염 대조군 (음성 대조군 대용); 2x IM, 근육내로 2회 백신접종된 그룹; IN+IM, 1차로 비강내 및 2차로 근육내로 백신접종된 그룹; 2X IN, 비강내로 2회 백신접종된 그룹. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 34: 재조합적으로 발현된 돼지 IAV 핵단백질 (NP)에 대한 돼지 면역글로불린 G (IgG)에 특이적인 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA)의 결과 상기 시험을 위해, 각 웰을 100 ng의 재조합적으로 발현된 NP로 코팅하였다. 샘플을 쌍으로 측정하였고, 샘플 평균은 쌍별 측정으로부터 계산하였으며, 그룹의 값은 샘플 평균으로부터 계산하였다. pos. ctrl., 양성 대조군; neg. ctrl., 음성 대조군; 2x IM, 근육내로 2회 백신접종된 그룹; IN+IM, 1차로 비강내 및 2차로 근육내로 백신접종된 그룹; 2X IN, 비강내로 2회 백신접종된 그룹. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 연구일 (SD)은 그래프 우측의 범례에 나타내었다.
서열 개관:
하기 서열들을 상세히 설명하며, 이로써 본 발명에 해당 서열들을 개시한다:
프로모터:
서열번호 1 EHV-4 600bp 데옥시리보핵산 서열 4pgG600
서열번호 2 EHV-4 600bp 데옥시리보핵산 서열 4pMCP600
서열번호 3 EHV-4 430bp 데옥시리보핵산 서열 p430
서열번호 4 EHV-4 449bp 데옥시리보핵산 서열 p455
서열번호 5 orf72에 특이적인 프라이머 1130번
서열번호 6 orf72에 특이적인 프라이머 1131번
서열번호 7 mCherry에 특이적인 프라이머 1079번
서열번호 8 mCherry에 특이적인 프라이머 1080번
삽입 부위:
서열번호 9 ORF70 삽입 영역을 위한 인공 서열 핵산 PCR 프라이머 1017
서열번호 10 ORF70 삽입 영역을 위한 인공 서열 핵산 PCR 프라이머 1018
서열번호 11 orf1/3 삽입 영역을 위한 인공 서열 핵산 PCR 프라이머 1007
서열번호 12 orf1/3 삽입 영역을 위한 인공 서열 핵산 PCR 프라이머 1008
서열번호 13 좌측 (Up70) 인접 영역 (417 bp)
서열번호 14 우측 (Up71) 인접 영역 (431 bp)
서열번호 15 뉴클레오타이드 127264 - 127680에 위치한, 야생형 EHV-1 균주 ab4 (Genbank 등록번호 AY665713.1) 내의 인접 영역 좌측부 (up ORF70)
서열번호 16 뉴클레오타이드 128484 - 128913에 위치한, 야생형 EHV-1 균주 ab4 (Genbank 등록번호 AY665713.1) 내의 인접 영역 우측부 (up ORF71)
서열번호 17 RED 시스템 내의 절단된 인접 영역: 좌측 (Up70) 인접 영역 (283 bp) = 417 bp의 "고전적인" 인접 영역의 3' 283 bp와 동일
서열번호 18 RED 시스템 내의 절단된 인접 영역: 우측 (Up71) 인접 영역 (144 bp) = 431 bp의 "고전적인" 인접 영역의 5' 144 bp와 동일
서열번호 19 야생형 ab4 (Genbank 등록번호 AY665713.1) 유전체 서열 내의 결실된 부분, nt 127681 - 128482
서열번호 20 RacH 유전체 서열 내의 결실된 부분 (완전한 유전체 서열이 공지되어 있지 않기 때문에 뉴클레오타이드 수는 알 수 없음)
플라스미드/벡터 서열:
서열번호 21 전달 플라스미드 pU-mC70-BGH의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 22 전달 벡터 pU70-p455-71K71의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 23 전달 플라스미드 pU70-p455-H3-71K71의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 24 전달 벡터 pU-1-3-p430-BGHKBGH의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 25 전달 플라스미드 pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH의 뉴클레오타이드 서열
헤마글루티닌 서열
서열번호 26 헤마글루티닌 [인플루엔자 A형 바이러스 (A/돼지/이탈리아/116114/2010(H1N2))]
GenBank: ADR01746.1 H1pdm
서열번호 27 헤마글루티닌 [인플루엔자 A형 바이러스 (A/돼지/이탈리아/7680/2001(H3N2))]
GenBank: ABS50302.2 H3:
서열번호 28 헤마글루티닌 [인플루엔자 A형 바이러스 (A/돼지/겐트/132/2005(H1N1))]
GenBank: AFR76623.1 H1av:
서열번호 29 헤마글루티닌 [인플루엔자 A형 바이러스 (A/돼지/이탈리아/4675/2003(H1N2))]
GenBank: ADK98476.1* H1hu
*아미노산 531 (정지 코돈 X가 I로 바뀜):
실시예
하기의 실시예를 들어 본 발명의 바람직한 실시양태를 설명한다. 당업계의 숙련자라면, 하기의 실시예에 기술된 기법들이 본 발명을 잘 수행하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기법들을 대표하는 것이기 때문에, 발명의 수행에 대한 바람직한 양태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 그러나, 당업계의 숙련자라면, 본 명세서의 내용을 고려하여, 개시된 구체적인 실시양태에 있어서 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 여러가지 변화를 주어도 그와 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다.
실시예 1:
신규한 삽입 부위 ORF70의 확립
EHV-1 벡터의 능력을 증강시키기 위해, 본 발명자들은 하나의 프로모터의 제어 하에 RNA-바이러스-유래된 작용기에 의해 두 이식유전자를 커플링하는 대신에, 하나의 벡터 백본에서 서로 다른 두 이식유전자를 발현시키는 방법을 찾고자 노력하였다. 본 발명자들은 헤르페스바이러스 유전체가 독립적인 두 이식유전자 삽입 부위의 동시적 사용을 견딜 수 있을 것이라 가정하였다. EHV-1 ORF70이 적절한 이식유전자 삽입 부위였는지의 여부를 판단하기 위해, ORF70 (1236 bp) 5' 말단의 801개의 염기쌍을 고전적인 동종성 재조합에 의해 자가형광성 mCherry 단백질을 코딩하는 발현 카세트(Shaner et al. 2004)로 대체하였다 (도 1b). 플라스미드 pU-mC70-BGH의 지도를 도 2에 나타낸다 (서열번호 21). 동종성 재조합에 사용된 DNA 단편은 XbaI를 사용하여 pU-mC70-BGH로부터 잘라냈다. 겔 정제된 단편을 EHV-1 RacH의 바이러스성 유전체 DNA와 함께 RK13 세포 내로 공동 형질감염시켰다. 재조합 벡터 바이러스의 효율적 구제(rescue) 및 배양된 세포에서의 효율적 복제를 라이브 형광 및 바이러스 적정으로 확인하였다 (나타내지는 않음). ORF70 중 3분의 2의 결실은, ORF70에 의해 인코딩되는 당단백질 G의 발현이 중지되는 추가의 이점이 있다. EHV-1의 당단백질 G는 숙주의 면역 반응에 역으로 작용하는 비구조성의 분비형 케모카인 결합 단백질인 것으로 밝혀졌다 (Drummer et al., 1998; Bryant et al., 2003). 벡터 백신으로 해당 백신의 면역 반응을 자극하려고 했기 때문에, 바이러스성 벡터의 이러한 특정 면역억제 기능의 제거로 바이러스성 벡터 플랫폼인 EHV-1 RacH-SE의 성능을 추가로 개선시킬 수 있다.
실시예 2:
신규한 프로모터의 동정 및 작제
적절한 프로모터 서열을 동정하기 위한 전략은 하기와 같았다: 먼저 EHV-1 유전체의 각 서열 단편들과 함께 공지된 두 orf의 EHV-4 서열 상향부의 600 bp의 단편을 정렬하여 이들에 대하여 분석하였다. 상기 선택된 유전자들은 주요 캡시드 단백질 (MCP)을 인코딩하는 orf42 및 당단백질 G (gG)를 인코딩하는 orf70이었다. 상기 주요 캡시드 단백질은 비리온의 가장 풍부한 성분들 중 하나로서, 새로 합성된 바이러스성 DNA가 패키징할 준비가 되자마자 곧바로 세포 핵 내 캡시드의 조립을 위해 필요하다. 따라서, 그의 프로모터는 바이러스 복제 주기 중 초기 및 후기 동안에 활성일 것으로 예상된다. 당단백질 G에 있어서, 그의 유전자 (ORF70)도 복제 주기 중 초기 및 후기 동안에 역시 활성임이 알려져 있다 (Colle et al. 1995, Drummer et al. 1998). 서열 동일성은 추정상의 MCP-프로모터에 대하여 82.2%, 추정상의 gG-프로모터에 대하여 82.3%였다. 이러한 차이점들은, 동종성 재조합을 방지하는데 충분히 큰 차이가 되는 한편, 다른 한편으로는 EHV-1 복제 동안 전사 활성화를 허용하는데 충분히 작은 차이인 것으로 생각되었다. 프로모터 활성도를 시험하기 위해, 600bp의 DNA 단편인 4pgG600
GCAGACTTTGGAGCAGCACAATTTCCGGTTGTGGACCCCATGGACCTTGGTTTGGCTGGTACCGTGGAAACTAACGCTCCGGAAGTTTTGGCCAGAGCAAAATACAATTCGAAGGTAGACATATGGAGCGCCGGAATAGTTCTGTTTGAAATGCTCGCATATCCATCAACTCTATTTGAGGACCCGCCGAGTACCCCACAAGAGTATGTAAAAAGCTGTCATTCTCAACTACTGAGAATAATATCAAAGCTAAAGATAAACCCTGAGGAGTTTCCACGGGAACCAGAGTCTAGGCTCGTGCGCGGATACATCGAATACGCCAGCCTAGAGCGTAAGCCACATACGCGCTATCCTTGCTTCCAGCGCGTGAACCTACACATTGACGGGGAATTTTTGATCCATAAAATGCTAGCGTTCAATGCTGCGATGCGCCCATCCGCAGAAGAGTTGTTGTCCTACCCAATGTTTATGAATCTGTAGGATGACTAACAGATTTGGGGTGGAGACGGCGTGGGCGATACTGTATAAAGTTGTACTACTTACCAGCCCAGTCAGTGTGCTGTAGTGCCACCACCTGTAAAGCTGTGATAAGCTGCAGTT (서열번호 1)
및 4pMCP600
AGCTGGGGGAGTTTGTACTATAGTGTATTACATGCGGCTTGCAATAACTGCCTGGTTTATGTTTCGCAACATTCAAGCAGACATGCTACCGCTAAACACTTTGCAACAATTTTTTATTGGGTGTTTGGCCTTTGGTAGAACTGTCGCGTTTTTGGTGGTAGCATATACTACCTTATTTATACGCTCCGAGCTGTTTTTCAGCATGCTAGCACCCAACGCCGAGCGAGAGTATATAACTCCCATCATTGCCCACAAGCTTATGCCACTTATTAGCGTCCGCTCTGCCGTTTGCTTAGTCATAATATCTACCGCCGTTTACGCAGCAGACGCTATCTGCGACACAATTGGATTTGCGATACCGCGCATGTGGATGTGTATTTTAATGAGATCAACCTCCATGAAGCGTAACTAGGGGGCCTCCCACTGAGGCACTACCGGCTTAGCAGCTGACTAACACAGTATAAAACGTGAGAAGAAATCAGTCTCATGCGCCATTAGCGCTAGGCTAGTTAGCGTGGAGGACCGGAGCGCTACCGCCAGCAGTTTCATCCGCCTGGTTACGGGTTTGTTAACACCTACCGGTGTTTTACCGCTACCATA (서열번호 2)
을 합성하고, 자가형광성 단백질 mCherry를 인코딩하는 리포터 유전자의 상향부를 클로닝하였다 (Shaner et al., 2004). 전사 종결 신호 및 mRNA 안정화 작용기로서, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGHpA; Goodwin & Rottman, 1992)을 리포터 유전자의 3' 말단에서 직접 하향부를 클로닝하였다.
양성 대조군으로 사용하기 위해, CMV 프로모터를 시판중인 플라스미드 pcDNA3.1 (인비트로겐, Invitrogen)로부터 증폭시키고, mCherry 리포터 유전자의 상향부를 클로닝시켰고, 여기서도 BGHpA를 리포터 유전자의 3' 말단에 부가하였다. 세포 배양물을 3개의 플라스미드 (pBlu-4pgGmCherry, pBlu-4pMCPmCherry 및 pBlu-CMVmCherry)로 형질감염시킨 후, 형광 현미경 검사를 이용하여 mCherry 형광도에 대하여 검사하였다. CMV 프로모터의 강한 활성은 형질감염 후 서로 다른 시간에서도 분명하였다. 4pgG600 프로모터도 형질감염 후 활성이었고, 4pMCP600 프로모터의 활성도 감지될 수는 있었으나 4pgG600 프로모터와 비교해보면 약했으며, 심지어 형질감염 후 3일째에 CMV-프로모터와 비교하는 경우 더욱 더 그러하였다.
바이러스성 유전자 산물의 프로모터 활성에 대한 효과를 조사하기 위해, pBlu-4pgG600-mCherry 또는 pBlu-4pMCP600-mCherry로 형질감염시킨 세포 배양물을 녹색 형광성 EHV-1 RacHI-EF로 형질감염시킨 후 1일째에 중복감염시켰다. 바이러스성 유전자 산물은 확실히 EHV-1 RacHI-EF 복제의 부재 하에서보다 현저히 더 높은 활성도로 4pMCP600 프로모터를 원격활성화(transactivate)시켰다. 상기 효과는 바이러스 복제의 부재 하의 초기 활성이 pBlu-4pMCP600-mCherry에 대해 관찰된 것보다 컸기 때문에, 비록 그렇게 강하지는 않더라도, pBlu-4pgG600-mCherry로 형질감염시키고 EHV-1 RacHI-EF로 중복감염시킨 세포 배양물 중에도 존재하였다. 계속해서, 두 600 bp 프로모터 모두에 대해서, 이들의 활성에 대한 바이러스 복제의 원격활성화 효과를 입증하였다.
상기 효과는 600bp의 서열이, 활성제 성분의 상향부에 통상적으로 위치하는 억제제 성분을 함유하는 경우에 설명될 수 있다. 결과적으로, 더 짧은 프로모터는 바이러스성 유전자 산물의 부재 하에 더 활성일 것이다. 이를 시험하기 위해, 두 EHV-4 프로모터 서열 모두를 처음 길이의 약 75%까지 절단하여 다시 시험하였다.
특히, 600 bp의 프로모터를 4pgG에 있어서 430 bp로 절단하여, 신규 명칭: p430: TCTATTTGAGGACCCGCCGAGTACCCCACAAGAGTATGTAAAAAGCTGTCATTCTCAACTACTGAGAATAATATCAAAGCTAAAGATAAACCCTGAGGAGTTTCCACGGGAACCAGAGTCTAGGCTCGTGCGCGGATACATCGAATACGCCAGCCTAGAGCGTAAGCCACATACGCGCTATCCTTGCTTCCAGCGCGTGAACCTACACATTGACGGGGAATTTTTGATCCATAAAATGCTAGCGTTCAATGCTGCGATGCGCCCATCCGCAGAAGAGTTGTTGTCCTACCCAATGTTTATGAATCTGTAGGATGACTAACAGATTTGGGGTGGAGACGGCGTGGGCGATACTGTATAAAGTTGTACTACTTACCAGCCCAGTCAGTGTGCTGTAGTGCCACCACCTGTAAAGCTGTGATAAGCTGCAGTT (서열번호 3)로 하고,
4pMCP에 있어서 449 bp로 절단하여, 신규 명칭: p455: TTGGTGGTAGCATATACTACCTTATTTATACGCTCCGAGCTGTTTTTCAGCATGCTAGCACCCAACGCCGAGCGAGAGTATATAACTCCCATCATTGCCCACAAGCTTATGCCACTTATTAGCGTCCGCTCTGCCGTTTGCTTAGTCATAATATCTACCGCCGTTTACGCAGCAGACGCTATCTGCGACACAATTGGATTTGCGATACCGCGCATGTGGATGTGTATTTTAATGAGATCAACCTCCATGAAGCGTAACTAGGGGGCCTCCCACTGAGGCACTACCGGCTTAGCAGCTGACTAACACAGTATAAAACGTGAGAAGAAATCAGTCTCATGCGCCATTAGCGCTAGGCTAGTTAGCGTGGAGGACCGGAGCGCTACCGCCAGCAGTTTCATCCGCCTGGTTACGGGTTTGTTAACACCTACCGGTGTTTTACCGCTACCATA (서열번호 4)로 하였다.
상기 단축된 프로모터를 함유하는 mCherry-리포터 플라스미드를 세포 배양물 중에 형질감염시킨 후 형광 현미경 검사로 검사하였다. p430 활성은 600 bp의 형태 (4pgG600)의 활성과 유사했던 반면, p455의 활성은 4pMCP600의 활성에 비해 현저히 증가하였다. 상기 결과는 두 프로모터의 600bp의 형태를 사용한 형질감염/중복감염의 결과, 즉, 동일한 세포 중에서 EHV-1 복제의 존재가 활성을 강하게 증가시키는 4pMCP600 프로모터의 원격활성의 기전을 제공한 한편, 4pgG600 프로모터의 원격활성은 가시적이었지만 그 현저함이 덜했던 상기 결과와 일치하였다.
상기 2개의 신규한 프로모터 이외에도, 신규한 폴리A 서열도 상기 신규한 ORF70 삽입 부위로부터의 발현에 필요하였다. 상기 성분을 71pA라 부른다. 이의 뉴클레오타이드 서열을 합성하고, pRacH-SE 내의 ORF70 삽입 부위를 표적으로 삼는 p455를 함유하는 전달 플라스미드의 mCherry 하향부를 클로닝하였다.
다음으로, rEHV-1 RacH-SE를 제조하여 바이러스 복제에 있어서 프로모터 활성을 분석하였다 (표 1). 상기 2개의 EHV-4 프로모터 (p430 및 p455), CMV 프로모터 및 마우스 시토메갈로바이러스 IE1 프로모터 (MCMV)를 사용하여, BGH 폴리A 신호와 함께 mCherry의 발현을 유도하여 mRNA 안정성을 증가시켰다. 도르쉬-해슬러(Dorsch-Haesler) 등 (1985)에 의해 기술된 MCMV IE1 프로모터 (인핸서)를 합성하고, 전달 플라스미드 내로 서브클로닝시킨 플라스미드 벡터 중에서 클로닝하였다. 또한, 상기 p455도 신규한 폴리A 신호 71pA와 함께 mCherry의 발현을 유도하는 orf70의 신규한 삽입 부위 내로 클로닝하였다. 또 다른 대조군으로서, rEHV-1 RacHmC70도 실험에 포함시켰다. 상기 재조합 바이러스로 감염시킨 세포들은 내인성 gG 프로모터 (egGp)의 제어 하에 mCherry를 발현한다 (표 1).
Figure 112019040794031-pct00001
VERO 또는 PK/WRL 세포를 1의 m.o.i. (감염 다중도)로 바이러스를 발현하는 6개 모두의 mCherry를 사용하여 감염시켰다. 감염된 세포들을 감염후(p.i.) 0, 4, 8 및 12시간째에 수집하고, 총 RNA를 추출하였다. RNA 추출물을 오염시키는 바이러스성 및 세포성 유전체 DNA를 DNAse I 분해(digestion)에 의해 파괴하였다. RNA의 온전성과 바이러스성 DNA의 제거는, 역전사효소를 첨가/무첨가한 역전사 이후, EHV-1의 필수 구조성 당단백질 D를 인코딩하는 orf72에 특이적인 프라이머 쌍 (프라이머 1130/1131번, (TGTCTACCTTCAAGCTTATG (서열번호 5)/CTAGCGCAGTCGCGTTG (서열번호 6))을 이용하는 PCR에 의해 밝혀내었다. 상기 예상한 196bp의 PCR 산물을, 역전사효소를 첨가하였던 역전사된 샘플 (cDNA), 구체적으로 t0= 감염 후 0시간째에 추출한 샘플이 아닌, t1= 감염 후 4시간, t2= 감염 후 8시간 및 t3= 감염 후 12시간에서 추출한 샘플로부터만 증폭시켰다. 해당 반응에 역전사효소를 첨가하지 않았던 모든 샘플들은 예상대로 어떠한 PCR 산물도 생성하지 않았다. 따라서, qPCR을 위한 주형으로 사용될 상기 샘플 (cDNA)은 바이러스성 유전체 DNA를 함유하지 않았던 것으로 나타났다.
다음으로, 효소를 첨가했던 역전사로부터 수득된 cDNA를 mCherry에 특이적인 프라이머 쌍 (프라이머 1079/1080번 (GCGAGGAGGATAACATGG (서열번호 7)/ ACCCTTGGTCACCTTCAG (서열번호 8)) 및 상기 orf72 프라이머 쌍 1130/1131번 (TGTCTACCTTCAAGCTTATG (서열번호 5)/ CTAGCGCAGTCGCGTTG (서열번호 6))을 사용하여 qPCR로 분석하였다. 상기 orf72 qPCR에 대한 Ct (역치 주기수) 값을 사용하여 동시에 실행한 서로 다른 바이러스 감염의 양립가능성을 평가하고, mCherry qPCR에 대한 Ct 값을 보정하였다. 따라서, mCherry의 전사는 감염 후 시간 및 상이한 바이러스들에 대하여 정량하였다 (도 3).
도 3a에 나타낸 바와 같이, orf72 전사 산물에 대한 Ct 값은 감염 후 상이한 네 시점에 있어서 서로 다른 6개의 바이러스가 거의 동일하였다. 이상적으로는 6개의 모든 바이러스가 조사 시점에서 동일한 값을 나타낼 것이고, 단 하나의 선만이 두드러질 것이다. 거의 동일한 선들은 본 실험의 품질이 충분함을 확인시켜주었으며, 또한 감염 후 12시간째의 결과도 유효한데, 그 이유는 감염 후 8시간째에 비해 줄어든 값이, 복제가 그의 최대치를 아직 초과하지 않은 경우에만 가능한 전사 산물의 수에서의 추가적인 증가를 나타내기 때문이다. 감염 후 각 시간에 대한 통계적 평균을 계산하였다. 특정 시점에서의 각 바이러스의 값을 해당 시점에 대하여 계산된 평균으로 나누고, 이를 mCherry qPCR의 Ct 값들을 보정하여 상기 값들을 직접 비교가능하도록 하는 인자로서 사용하였다. 보정된 mCherry qPCR의 Ct 값을 도 3b의 우측 그래프에 도시하였다. 선들에 있어서 차이는 서로 다른 바이러스로 감염된 세포에서 생성된 mCherry 전사 산물의 수의 차이를 나타낸다.
다른 형태의 그래프에서, VERO-EU 세포 (V)를 이용한 실험과 PK/WRL 세포 (P)를 이용한 실험의 두 실험을 조합시켰다 (도 4). RNA 추출물 및 시간의 경과에 따른 바이러스 복제의 품질은, 역전사효소를 첨가/무첨가한 역전사 이후 orf72 프라이머를 사용한 PCR에 의하여 상술한 바와 같이 확인하였다. mCherry에 대하여 수득된 qPCR Ct 값은 orf72에 대한 qPCR Ct 값을 바탕으로 상술한 바와 같이 보정하였다. t1= 감염 후 4시간; t2= 감염 후 8시간 및 t3= 감염 후 12시간의 보정된 Ct 값을 t0에서의 보정된 Ct 값에서 차감하여 (Δ 보정된 Ct), 전사 활성을 갖는 양의 상관관계를 유도하였다.
VERO (V) 또는 PK/WRL (P) 세포에서의 상기 두 실험은 직접적으로 비교될 수는 없었지만, PK/WRL 세포에서의 높은 발현 수준은 필시 EHV-1 복제에 대한 PK/WRL 세포의 월등한 감염허용성(permissivity)을 반영하는 것이며, 통상 10배 이상의 감염성 바이러스의 역가를 유도한다.
상기 EHV 유래된 프로모터인 p430, p455 및 egGp의 활성은, 이들의 삽입 부위 또는 사용된 폴리A (BGH 또는 71pA)와 관계없이, 사용된 세포주에 있어서 감염 후 각 시점에서는 거의 동일하였던 한편, CMV- 및 MCMV 프로모터의 활성은 PK/WRL 세포에서 더 높았다. VERO-EU 세포에서는, MCMV 프로모터만이 높은 활성을 지니는 것으로 나타났으며, CMV 프로모터는 상기 EHV-프로모터보다는 월등하지 않았다.
상기 실험들로부터, 결론적으로 orf1/3 및 orf70 삽입 부위 모두에 있어서 삽입된 이식유전자의 발현을 유도하는데에는 상기 EHV-4 프로모터 p430 및 p455가 EHV-1 RacH 백본에 사용하기에 적절하였다.
실시예 3:
재조합 EHV-1 벡터 백신 및 재조합 바이러스의 작제에서의 신규한 p455 프로모터의 사용
p455 프로모터:
첫번째 동물 실험에서, 돼지 유래의 인플루엔자 A형 바이러스의 인플루엔자 헤마글루티닌 아형 H3 (A/돼지/이탈리아/7680/2001(H3N2), GenBank 등록번호: ABS50302.2) (서열번호 27)을 사용하였다. 이의 코딩 서열을 합성해 전달 벡터 pU70-p455-71K71 내로 서브클로닝하여 (도 5), 전달 벡터 pU70-p455-H3-71K71을 생성하고, 신규한 p455 프로모터 및 신규한 71pA 폴리아데닐화 신호의 제어 하에 H3을 둔후, 해당 카세트를 ORF70으로의 삽입을 위한 재조합 영역을 갖도록 프레임화하였다 (도 6).
RED 재조합 시스템을 이용하는 앙파상(en-passant) 돌연변이 유발법을 이용하여 (Tischer et al. 2006), 발현 카세트 p455-H3-71을 pRacH-SE의 ORF70에 삽입하여 pRacH-SE70-p455-H3을 생성하였다 (도 7).
PK/WRL 세포를 pRacH-SE70-p455-H3으로 형질감염시키고, 재조합 바이러스 rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3을 구제하여 2회 플라크 정제(plaque-purified)하였다. 삽입 영역의 고충실도(high-fidelity) PCR 산물에 대한 시퀀싱으로 상기 발현 카세트의 정확한 삽입을 확인하였다. 감염된 세포에서의 이식유전자의 발현을 간접 면역형광 분석법으로 분석하였다 (IFA, 도 8).
EHV-1 gpII를 인코딩하는 ORF71의 복원을 단일클론 항체 Ai2G7 (BI 소유)을 사용한 IFA (나타내지는 않음) 및 웨스턴 블롯 (도 9)으로 확인하였다. 감염된 세포의 원형질막 상의 H3의 삼합체의 외관을 닭 적혈구를 사용한 혈구흡착 시험에 의해 분석하였다 (나타내지는 않음). PK/WRL 세포에서 TCID50/ml로 측정된 피크 역가는 모체 바이러스 rEHV-1 RacH-SE의 역가와 동일한 범위였는데, 이는 이식유전자 발현이 바이러스 복제에 해로운 영향을 미치지 않았음을 의미하는 것이다 (나타내지는 않음). 이것은 구제 후 PK/WRL 세포 중에서 rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3을 20회 계대 (P20)까지의 계대배양에 의해 확인하였다. P5, P10, P15 및 P20에서는 적정, 시퀀싱 및 웨스턴 블롯으로 (도 9), P10 및 P20에서는 추가로 IFA로 상기 바이러스에 대한 특성을 분석하였고, HA 발현, 및 프로모터와 폴리A 서열과 함께 HA 인코딩 삽입체의 유전적 안정성을 확인하였다.
도 9에 나타낸 두 블롯은 EHV-1 당단백질 II (gpII)를 특이적으로 검출하는 단일클론 항체 Ai2G7과 함께 항온배양시킨 레플리카 (좌측) 또는 인플루엔자 헤마글루티닌 아형 H3에 대해 형성된 시판중인 래빗 유래의 다중클론 항체 (PA5-34930)와 함께 배양시킨 레플리카 (우측)이다. 예상대로, 재조합 EHV-1로 감염된 모든 세포 배양물에서 gpII가 검출되었다. 예상대로, 서로 다른 계대수의 rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3으로 감염시킨 모든 세포에서 전장 H3이 검출되었다. H3-항혈청의 특이성을 동일한 웨스턴 블롯에 나타냈으며, gG430mC 레인을 참조한다. 여기서는 예상한 대로 gpII mab만이 반응을 나타냈던 반면, 상기 항-H3 항체는 각 레플리카 레인에서 결합하지 않았다.
단일클론 항-H3 항체 및 말 항-EHV 항혈청을 사용하여 P20으로 감염시킨 세포 중에서 바이러스 플라크에 대한 이중 면역형광 분석법 (dIFA)에 의해, 사실상 모든 EHV-1 유도된 플라크들도 H3을 발현함을 확인하였다 (나타내지는 않음). 모든 시험들은 재조합 EHV-1 RacH-SE-70-p455-H3의 안정성을 확인시켜 주었다.
실시예 4:
p455 프로모터를 이용한 개념 증명 동물 연구 (POC-I) 및 혈청학적 반응의 평가:
시험 동물: 선정 기준 및 실험 계획:
하기 표 2에 개괄한 바와 같이, 인플루엔자 A-미감작된(naive) 암퇘지에서 출생한 10마리의 새끼 돼지으로 구성된 5개의 그룹을 POC-I 연구에 포함시켰다.
Figure 112019040794031-pct00002
rEHV-1 RacH-70-p455-H3 (EHV-1)의 1x107 TCID50의 감염용량을 생후 5주에 1회 또는 생후 2주 및 5주에 2회로 사용하였다. 비교를 위해, 시판중인 불활성화 백신 (Inact)을 생후 2주 및 5주에 2회로 사용하였다. 모든 새끼 돼지들은 불활성화 백신 (Inact)의 효과를 상쇄하지 않기 위해 모계 유래의 항체를 포함하지 않았다. 두 그룹은 백신접종을 하지 않고 생리 염화나트륨 용액 (NaCl)을 주입하여 시험감염 대조군 또는 순(strict) 음성 대조군으로 각각 사용하였다. 제2 백신접종 후 21일째에, 순음성 대조군을 제외한 모든 그룹들을 1x107 TCID50의 이종성 인플루엔자 A (IAV) 균주 (돼지의 H3N2 인플루엔자 A형 바이러스 R452-14, BI 소유의 시험감염용 분리주(challenge isolate))로 시험감염하였다. 백신접종을 하지 않은 시험감염 대조군 (Chall. ctrl)에서는 시험감염 후 1일 및 3일째에 모든 돼지들이 이들의 폐에서 인플루엔자 바이러스 역가가 높았던 반면, 순음성 대조군 (neg ctrl)과 rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3으로 2회 백신접종시킨 그룹 (EHV 2x)에서의 모든 돼지들은 양 일에 있어서 IAV에 대하여 음성이었다. 불활성화 대조군 백신으로 2회 백신접종한 그룹 (Inact 2x)에서, 5마리의 동물 중 1마리는 시험감염 후 3일째에 낮은 IAV 역가를 가졌다. rEHV-1 RacH-SE-70-455-H3으로 시험감염하기 21일 전에 1회 백신접종시킨 그룹 (EHV 1x)에서, 5마리의 동물 중 2마리는 시험감염 후 1일째에, 5마리 중 1마리는 시험감염 후 3일째에 낮은 IAV 역가를 가졌다 (도 10).
1x 107 TCID50의 rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3을 사용한 2번의 백신접종은 이종성 IAV인 아형 H3N2의 시험감염으로부터 돼지를 완전히 보호하였다. 상기 EHV-1 벡터 RacH-SE가 돼지의 백신접종에 적절하며, 신규한 프로모터 455가 백신접종된 돼지에서 IAV 헤마글루티닌의 면역원성 발현을 유도하는데 있어서 기능을 한다는 사실이 입증되었다.
실시예 5:
재조합 EHV-1 벡터 백신 및 재조합 바이러스의 작제에서의 신규한 p430 프로모터의 사용
p430 프로모터:
상기 새롭게 동정된 p430 프로모터를 사용하여 H1N1 바이러스의 또 다른 인플루엔자 헤마글루티닌 ((A/돼지/겐트/132/2005(H1N1), GenBank 등록번호: AFR76623.1) (서열번호 28)의 발현을 유도하였다. 상기 바이러스 분리주 내의 헤마글루티닌 유전자가 "조류" 유형의 IAV 중 돼지 IAV로부터 유래하기 때문에, H1av로 지칭할 것이다. H1av를 합성하고 orf1/3 삽입 영역을 위한 전달 벡터인 pU1/3-p430-BGH_K_BGH (도 11)에 서브클로닝시켜 pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH를 생성하였다. H1av의 발현을 p430 프로모터 및 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리A 신호의 제어 하에 두었다 (도 12).
RED 재조합 시스템을 이용하는 앙파상 돌연변이 유발법을 이용하여 (Tischer et al. 2006), 발현 카세트 p430-H1av-BGH를 pRacH-SE의 orf1/3에 삽입하여 pRacH-SE1/3-p430-H1av를 생성하였다 (도 13).
PK/WRL 세포를 pRacH-SE1/3-p430-H1av로 형질감염시키고, 재조합 바이러스 rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av를 구제하여 2회 플라크 정제하였다. 삽입 영역의 고충실도 PCR 산물에 대한 시퀀싱으로 상기 발현 카세트의 정확한 삽입을 확인하였다. 감염된 세포에서 이식유전자의 발현을 시판중인 단일클론 및 다중클론 항체를 사용하여 간접 면역형광 분석법 (IFA) 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다 (도 14).
EHV-1 gpII를 인코딩하는 ORF71의 복원을 단일클론 항체 Ai2G7 (BI 소유)을 사용한 IFA 및 웨스턴 블롯으로 확인하였다 (나타내지는 않음). 감염된 세포의 원형질막에서의 H1av의 정확한 처리와 운송 및 위치(localization)를, 닭 적혈구를 사용한 혈구흡착 시험에 의해 분석하였다 (나타내지는 않음). PK/WRL 세포에서 TCID50/ml로 측정된 피크 역가는 모체 바이러스 RacH-SE의 역가와 동일한 범위였는데, 이는 이식유전자 발현이 바이러스 복제에 해로운 영향을 미치지 않았음을 의미하는 것이다 (나타내지는 않음).
항체 PA-34929에 의해 75 kDa에서 이동하는 광범위 밴드의 특이적 검출은 그의 서열로부터 예측한 대로 재조합 HA 당단백질의 예상된 외관과 일치하였다. 단일클론 항체 C102를 이용한 세포막의 뚜렷한 염색은 예상한대로의 세포내 위치와 일치하였다 (도 14).
상기 발현된 재조합 헤마글루티닌이 예상대로 처리되어 운송되었는지의 여부를 시험하기 위해, VERO-세포를 rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av, rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3, rEHV-1 RacH-SE (모체)를 사용하여 0.01의 m.o.i.로 감염시키거나, 또는 비감염 상태로 놔두었다. 생독백신으로 감염 후 24시간된 세포 및 감염되지 않은 세포를 PBS 중의 닭 적혈구의 현탁액과 함께 항온배양하고, PBS로 세척한 후, 형광성 Hoechst 33342 핵염색으로 염색하였다. 조류의 적혈구가 세포핵을 포함하고 있기 때문에, 이들은 Hoechst 33342로 염색할 수 있고 형광 현미경 검사로 작은 푸른 반점으로 보인다. 헤마글루티닌을 발현하지 않는 rEHV-1 RacH-SE로 감염시킨 세포와 비교했을 때, 닭 적혈구의 흡착은 rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av 또는 rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3으로 감염시킨 세포에 대해서 현저히 증가하였다 (나타내지는 않음). 이로부터, 실제 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 생성되는 것과 같은 방식으로 헤마글루티닌이 번역되고, 처리된 후, 벡터 바이러스로 감염된 세포의 원형질막으로 운송되었다는 결론을 내릴 수 있다.
감염된 세포의 혈구흡착에 대한 분명한 표현형은, 유전자이식 단백질의 효율적인 발현을 보여주며 EHV-1 벡터 감염된 세포의 세포 표면 상에서의 기능성 HA 삼합체의 형성을 시사하는 웨스턴 블롯 및 면역형광 분석법의 결과를 뒷받침한다.
실시예 6:
재조합 EHV-1 벡터 백신 내의 두 삽입 부위에서 2개의 신규한 프로모터 p455 및 p430의 동시적 사용
상기 2개의 신규한 프로모터가 동시에 사용될 수 있음을 보여주기 위해, 2개의 서로 다른 인플루엔자 A형 바이러스 아형의 상이한 두 헤마글루티닌을 발현하는 재조합 EHV-1 RacH를 제조하였다.
시판중인 H3 (PA5-34930) 및 H1 (PA5-34929)에 대한 다중클론 항체의 특이성, 및 교차반응성의 결여를 단일 삽입물 바이러스 rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 및 rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av로 감염시킨 감염된 세포에 대한 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다 (나타내지는 않음).
재조합체 BAC pRacH-SE-70-p455-H3에서 출발하여, 전달 벡터 pU1/3-p430-H1av-BGHKBGH (도 12) 내에 조립된 발현 카세트 p430-H1av-BGH를 2단계의 RED 재조합에 의해 orf1/3 삽입 부위에 삽입하여 pRacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3을 제조하였다. PK/WRL 세포를 pRacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3으로 형질감염시키고, 재조합 바이러스 rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3을 구제하여 2회 플라크 정제하였다 (도 15).
상기 재조합 바이러스에 대한 약칭은 rEHV-1 RacH-SE_B이다. 인접 서열과 함께 삽입 영역의 고충실도 PCR 산물에 대한 시퀀싱으로 상기 발현 카세트의 정확한 삽입을 확인하였다. 감염된 세포에서 이식유전자의 발현을 시판중인 단일클론 및 다중클론 항체를 사용하여 간접 면역형광 분석법 (IFA, 나타내지 않음) 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다 (도 16). EHV-1 gpII를 인코딩하는 ORF71의 복원을 단일클론 항체 Ai2G7 (BI 소유)을 사용한 IFA (나타내지는 않음) 및 웨스턴 블롯으로 확인하였다 (도 16).
도 16에 나타낸 바와 같이, 이식유전자 H3과 H1av 모두 이중 삽입물 재조합체인 rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3으로 감염된 세포 배양물에서 동시에 발현되었다. 이식유전자 발현은 안정적이었으며, PK/WRL 세포 중에서 11번째의 계대배양까지 시험된 바이러스 역가를 손상시키지 않았다 (나타내지는 않음).
상기 신규한 두 프로모터 p430 및 p455는 세포 배양물 중의 rEHV1-RacH 복제에 있어서 기능성인 것으로 밝혀졌다. 바이러스 복제 주기 동안의 활성 수준은 시험관내 프로모터 동역학적 실험으로부터 추론할 수 있는 것과 매우 유사해 보인다. 이러한 특성들은 2개의 서로 다른 항원을 유사한 효율로 동시에 발현하는 EHV-1 RacH 또는 다른 벡터 플랫폼을 기반으로 하는 재조합 벡터 백신의 제조를 가능하게 한다. 백신 표적이 2개의 서로 다른 병원체로 구성되는 경우, 두 폴리아데닐화 서열과 조합된 2개의 삽입 부위 내의 2개의 신규한 프로모터의 적용을 통해 제품의 비용을 크게 줄일 수 있고, 단 하나의 항원 성분만을 발현하는 벡터에 비해 명백한 이점을 나타낼 수 있다.
실시예 7:
1가의 EHV-1 벡터를 이용한 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 백신 (H3 백신)의 제조, 시험관내 특성분석 및 생체내 시험
돼지에서의 백신접종 연구를 위해 실험할 항원으로서 혈청형 H3의 돼지 IAV 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (서열번호 27) (A/돼지/이탈리아/7680/2001(H3N2), GenBank 등록번호: ABS50302.2)을 선택하였다. 돼지 IAV에 대한 상기 신규한 백신은, 예컨대, 본원에 기술된 백신으로만 백신접종된 동물이 아닌(그 이유는 단 하나의 돼지 IAV HA 단백질만을 발현하기 때문임) 돼지 IAV 야생형 균주에 의해 감염된 동물에 있어서 돼지 IAV 단백질 NP 또는 NA에 대한 항체의 검출을 통해, DIVA 특징을 제공한다. 이의 코딩 서열을 합성 및 서브클로닝하여, 전달 벡터 pU70-p455-H3-71K71을 생성하고, 신규한 p455 프로모터 및 신규한 71pA 폴리아데닐화 신호의 제어 하에 H3을 둔후, 해당 카세트를 ORF70으로의 삽입을 위한 재조합 영역을 갖도록 프레임화하였다 (도 1B).
RED 재조합 시스템을 이용하는 앙파상 돌연변이 유발법을 이용하여, 발현 카세트 p455-H3-71을 pRacH-SE의 ORF70에 삽입하여 pRacH-SE70-p455-H3을 생성하였다.
PK/WRL 세포를 pRacH-SE70-p455-H3으로 형질감염시키고, 재조합 바이러스 rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3을 구제하여 2회 플라크 정제하였다 (도 7).
삽입 영역의 고충실도 PCR 산물에 대한 시퀀싱으로 상기 발현 카세트의 정확한 삽입을 확인하였다. 감염된 세포에서 이식유전자의 발현을 시판중인 단일클론 및 다중클론 항체를 사용하여 간접 면역형광 분석법 (IFA, 도 8) 및 웨스턴 블롯 (도 9)으로 분석하였다.
EHV-1 gpII를 인코딩하는 ORF71의 복원을 단일클론 항체 Ai2G7 (BI 소유)을 사용한 IFA (나타내지는 않음) 및 웨스턴 블롯 (도 9)으로 확인하였다. 감염된 세포의 원형질막 상의 H3의 삼합체의 외관을 닭 적혈구를 사용한 혈구흡착 시험에 의해 분석하였다 (나타내지는 않음). PK/WRL 세포에서 TCID50/ml로 측정된 피크 역가는 모체 바이러스 RacH-SE의 역가와 동일한 범위였는데, 이는 이식유전자 발현이 바이러스 복제에 해로운 영향을 미치지 않았음을 의미하는 것이다 (나타내지는 않음). 이것은 구제 후 PK/WRL 세포 중에서 rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3을 20회 계대 (P20)까지의 계대배양에 의해 확인하였다. P5, P10, P15 및 P20에서는 적정, 시퀀싱 및 웨스턴 블롯으로 (도 9), P10 및 P20에서는 추가로 IFA로 상기 바이러스에 대한 특성을 분석하였고, HA 발현, 및 프로모터와 폴리A 서열과 함께 HA 인코딩 삽입체의 유전적 안정성을 확인하였다.
도 9에 나타낸 두 블롯은, EHV-1 당단백질 II (gpII)를 특이적으로 검출하는 단일클론 항체 Ai2G7과 함께 항온배양시킨 레플리카 (좌측) 또는 인플루엔자 헤마글루티닌 아형 H3에 대해 형성된 시판중인 래빗 유래의 다중클론 항체 (PA5-34930)와 함께 배양시킨 레플리카 (우측)이다. 예상대로, 재조합 EHV-1로 감염된 모든 세포 배양물에서 gpII가 검출되었다. 예상대로, 서로 다른 계대수의 rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3으로 감염시킨 모든 세포에서 전장 H3이 검출되었다. 또한, 상기 H3-항혈청의 특이성도 H1 아형 바이러스의 인플루엔자 헤마글루티닌을 발현하는 다른 재조합체 EHV-1 RacH-SE로 감염시킨 세포에 대한 웨스턴 블롯을 통해 밝혀냈다 (하기 도 16 참조).
단일클론 항-H3 항체 및 말 항-EHV 항혈청을 사용하여 P20으로 감염시킨 세포 중에서 바이러스 플라크에 대한 이중 면역형광 분석법 (dIFA)에 의해, 사실상 모든 EHV-1 유도된 플라크들도 H3을 발현함을 확인하였다 (나타내지는 않음). 모든 시험들은 재조합 EHV-1 RacH-SE-70-p455-H3의 안정성을 확인시켜 주었다.
어린 새끼 돼지에서 벡터 백신으로서의 그 특성을 연구하기 위해, rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3을 백신접종-시험감염 연구에서 시험하였다. 상세히 설명하면, 돼지 IAV에 대한 모계 유래의 면역력이 없는 새끼 돼지 (모계 항체 없음)을 생후 2주 및 5주에 (2회 백신접종, 2x EHV-1) 또는 오직 생후 5주에만 (1회 백신접종, 1x EHV-1) RacH-SE-70-p455-H3을 함유하는 세포 배양 상청액을 사용하여 1x107의 TCID50의 용량으로 근육내 2회 백신접종하였다. 백신접종을 하지 않은 그룹은 음성 대조군으로 이용하였고, 제조업자의 지시(백신접종의 시점에 대해서만)에 따라 시판중인 불활성화 돼지 IAV 백신으로 생후 2주 및 5주에 백신접종한 동물의 그룹은 양성 대조군 (사멸)으로 이용하였다. 생후 8주에, 음성 대조군을 제외한 모든 동물을 1x107의 TCID50의 용량의 H3N2 돼지 IAV 시험감염 균주 (H3이 RacH-SE-70-p455-H3에 사용된 H3 백신 항원에 이종성인 유럽 야생형 바이러스 분리주 R452-14)의 기관내 적용에 의해 시험감염하였다. 백신접종을 하지 않고 시험감염하지 않은 동물을 음성 대조군으로 이용하였던 한편, 백신접종을 하지 않고 시험감염한 동물은 시험감염 대조군으로 이용하였다. 백신접종시와 백신접종 후, 그리고 시험감염 전과 후에, 체온을 측정하고 서로 다른 시점에 혈액 샘플을 채취하였다. 시험감염 후 1일째에, 그룹당 동물의 절반을 사멸시키고, 돼지 IAV 감염에 전형적인 병변에 대하여 폐를 스코어링한 후, 좌측 및 우측 폐당 3개의 폐 샘플을 각각 채취하여, 폐 균질액 중의 감염성 돼지 IAV 역가를 측정하고, 기관지폐포 세척액 (BALF)을 샘플링하였다. 시험감염 후 3일째에 그룹당 잔류하는 동물의 절반에 대하여 동일한 절차를 수행하였다.
돼지 IAV 시험감염 바이러스 적용 후 체온 상승을 조사했을 때, 백신접종을 하지 않은 동물은 시험감염 후 1일째에 약 1℃의 체온 증가를 나타내었다. 시험감염 후 1일째의 이러한 체온 상승은 RacH-SE-70-p455-H3 백신으로 2회 백신접종된 그룹에 있어서는 방지되었다 (도 17).
돼지 IAV 시험감염 바이러스 적용 후 1일 또는 3일째에 사멸된 동물의 폐 스코어 평가를 통해, 음성 대조군은 돼지 IAV 감염에 전형적인 폐 병변을 나타내지 않았고, 시험감염 대조군은 평균 6-7% 범위로 폐 병변을 나타내었음과; 그룹 평균 값에 있어서 폐 병변 스코어는 RacH-SE-70-p455-H3 백신으로 2회 백신접종된 그룹에서 1 내지 4% 미만으로 크게 감소되었음을 알 수 있었다 (도 18).
돼지 IAV 시험감염 바이러스 적용 후 1일 또는 3일째에 사멸된 동물의 평균 돼지 IAV 폐 역가는, 음성 대조군은 폐 샘플에서 돼지 IAV를 나타내지 않았던 반면, 시험감염 대조군은 폐 조직(g)당 5 로그 이상 (3일째) 내지 7 로그 이상 (1일째)의 범위의 바이러스 역가를 나타내었음을 보여주었다. 이와는 아주 대조적으로, 그룹 평균 값은 RacH-SE-70-p455-H3 백신으로 1회 백신접종된 그룹에서 약 2 로그 이하로 크게 감소되었고, RacH-SE-70-p455-H3 백신으로 2회 백신접종된 그룹에서는 검출될 수 없는 수준까지 감소하였다 (도 10).
백신접종 후 돼지 IAV 중화 항체의 유도를 시험했을 때, RacH-SE-70-p455-H3 백신으로 1회 백신접종된 동물의 혈청은 1차 백신접종 후 3주째에 약 160 범위 내의 중화 역가의 역수를 나타내었고, RacH-SE-70-p455-H3 백신으로 2회 백신접종된 동물의 혈청은 2차 백신접종 후 3주째에 약 2560 범위 내의 중화 역가를 나타내었던 한편, 백신접종을 하지 않은 그룹의 혈청은 검출가능한 돼지 IAV 중화 항체 수준을 갖지 않았다 (도 19).
돼지 IAV 시험감염 후 1일 또는 3일째에 동물의 BALF에서의 염증 유발성 사이토카인 IL-1β의 양을 측정했을 때, 1일째에 시험된 4마리의 동물 중 3마리에서 100 pg/ml 이상 내지 900 pg/ml 이하의 IL-1β 수준이 검출될 수 있었던 한편, 상기 수준은 RacH-SE-70-p455-H3 백신으로 1회 백신접종된 동물의 BALF에서 100-300 pg/ml의 IL-1β로 감소되었고, 심지어는 RacH-SE-70-p455-H3 백신으로 2회 백신접종된 모든 동물에서 0 내지 100 pg/ml 미만의 IL-1β로 추가로 감소되었다 (도 20). 이러한 사실은 RacH-SE-70-p455-H3 백신을 이용한 백신접종이 돼지 IAV 감염 후 염증 유발성 사이토카인 IL-1β의 유도를 효과적으로 방지하였음을 보여주는 것이다.
연구 28일째에 샘플링한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 재자극을 서로 다른 자극을 이용하여 시험했을 때, 백신접종을 하지 않은 동물의 PBMC의 자극은 사용된 자극에 관계없이 IFNγ-ELISpot에서 75 미만/1x106개를 나타내었다 (도 21a). 불활성화 (사멸) 백신을 투여받은 동물의 PBMC는, 이들을 재조합 돼지 IAV 핵단백질 NP로 재자극시켰던 경우에는 약 150/1x106개를 나타내었고, 이들을 돼지 IAV H3N2 시험감염 균주 R452-14로 재자극시켰던 경우에는 IFNγ-ELISpot에서 약 3000/1x106개를 나타냈지만, 재조합 돼지 IAV HA 또는 EHV-1 바이러스를 사용했던 경우에는 PBMC의 재자극이 나타나지 않았다 (75/1x106개 이하의 수준) (도 21b). 이와는 대조적으로, RacH-SE-70-p455-H3 백신으로 1회 또는 2회 백신접종시킨 동물도 이들을 돼지 IAV H3N2 시험감염 균주 R452-14로 재자극시켰던 경우에는 IFNγ-ELISpot에서 약 200 (1x EHV-1) 내지 300 (2x EHV-1)/1x106개를 나타냈지만, 재조합 돼지 IAV NP를 사용했던 경우에는 PBMC의 재자극이 나타나지 않았다 (75/1x106개 이하의 수준) (도 21c 및 21d). 재자극을 위해 EHV-1 바이러스를 사용했던 경우, RacH-SE-70-p455-H3 백신으로 1회 또는 2회 백신접종한 동물은 이들을 EHV-1 공백신 RacH-SE로 재자극시켰던 경우에는 IFNγ-ELISpot에서 약 300/1x106개를 나타냈고, 이 값은 돼지 IAV H3을 발현하는 RacH-SE-70-p455-H3 백신을 사용하는 경우에는 400 이상/1x106개로 추가로 증가하였다 (도 21c 및 21d). 따라서, 재자극을 위해 재조합 돼지 IAV HA를 사용했던 경우, RacH-SE-70-p455-H3 백신으로 1회 또는 2회 백신접종한 동물만이 IFNγ-ELISpot에서 약 100-150 (1xEHV-1) 내지 150-200 (2x EHV-1)/1x106개를 나타냈다 (도 21c 및 21d).
실시예 8
4가의 EHV-1 벡터를 이용한 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 백신의 제조, 시험관내 특성분석 및 생체내 시험
하기 기술된 바와 같이, 본원 발명에서는 H1N2, H3N2, H1N1 조류 및 H1N1 범유행 돼지 IAV 아형/혈청형으로부터 유도된 4개의 상술한 돼지 IAV 헤마글루티닌 (HA) 항원이 2개의 재조합 EHV-1 벡터 바이러스에 의해 발현된다. 이러한 돼지 IAV에 대한 신규한 4가 백신은, 예컨대, 본원에 기술된 백신으로만 백신접종된 동물이 아닌(그 이유는 돼지 IAV HA 단백질만을 발현하기 때문임) 돼지 IAV 야생형 균주에 의해 감염된 동물에 있어서 돼지 IAV 단백질 NP 또는 NA에 대한 항체의 검출을 통해, DIVA 특징을 제공한다.
신규한 4가 돼지 IAV 백신에 대해 시험관내 특성을 분석하고, 돼지 IAV에 대한 그 효능에 대하여 생체내 시험하였다.
상기 새롭게 동정된 p430 프로모터를 사용하여 돼지 IAV H1N1 ((A/돼지/겐트/132/2005(H1N1), GenBank 등록번호: AFR76623.1)의 발현을 유도하였다. 상기 바이러스 분리주 내의 헤마글루티닌 유전자가 조류 IAV로부터 유래하기 때문에, H1av로 지칭할 것이다. H1av를 합성하고 orf1/3 삽입 영역을 위한 전달 벡터에 서브클로닝시켜 pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH를 생성하였다. H1av의 발현을 p430 프로모터 및 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리A 신호의 제어 하에 둔 후, orf1/3으로의 삽입을 위한 재조합 영역을 갖도록 프레임화하였다 (도 12).
RED 재조합 시스템을 이용하는 앙파상 돌연변이 유발법을 이용하여, 발현 카세트 p430-H1av-BGH를 pRacH-SE의 orf1/3에 삽입하여 pRacH-SE1/3-p430-H1av를 생성하였다. PK/WRL 세포를 pRacH-SE1/3-p430-H1av로 형질감염시키고, 재조합 바이러스 rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av (도 13)를 구제하여 2회 플라크 정제하였다. 삽입 영역의 고충실도 PCR 산물에 대한 시퀀싱으로 상기 발현 카세트의 정확한 삽입을 확인하였다. 감염된 세포에서 이식유전자의 발현을 시판중인 단일클론 및 다중클론 항체를 사용하여 간접 면역형광 분석법 (IFA) 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다 (도 14). EHV-1 gpII를 인코딩하는 ORF71의 복원을 단일클론 항체 Ai2G7 (BI 소유)을 사용한 IFA 및 웨스턴 블롯으로 확인하였다 (나타내지는 않음). 감염된 세포의 원형질막에서의 H1av의 정확한 처리와 운송 및 위치를, 닭 적혈구를 사용한 혈구흡착 시험에 의해 분석하였다 (나타내지는 않음). PK/WRL 세포에서 TCID50/ml로 측정된 피크 역가는 모체 바이러스 RacH-SE의 역가와 동일한 범위였는데, 이는 이식유전자 발현이 바이러스 복제에 해로운 영향을 미치지 않았음을 의미하는 것이다 (나타내지는 않음).
항체 PA-34929에 의해 75 kDa에서 이동하는 광범위 밴드의 특이적 검출은 그의 서열로부터 예측한 대로 재조합 HA 당단백질의 예상된 외관과 일치하였다. 단일클론 항체 C102를 이용한 세포막의 뚜렷한 염색은 예상한대로의 세포내 위치와 일치하였다.
상기 발현된 재조합 헤마글루티닌이 예상대로 처리되어 운송되었는지의 여부를 시험하기 위해, VERO-세포를 rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av, rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3, rEHV-1 RacH-SE (모체)를 사용하여 0.01의 m.o.i.로 감염시키거나, 또는 비감염 상태로 놔두었다. 생독백신으로 감염 후 24시간된 세포 및 감염되지 않은 세포를 PBS 중의 닭 적혈구의 현탁액과 함께 항온배양하고, PBS로 세척한 후, 형광성 Hoechst 33342 핵염색으로 염색하였다. 조류의 적혈구가 세포핵을 포함하고 있기 때문에, 이들은 Hoechst 33342로 염색할 수 있고 형광 현미경 검사로 작은 푸른 반점으로 보인다. 헤마글루티닌을 발현하지 않는 rEHV-1 RacH-SE로 감염시킨 세포와 비교했을 때, 닭 적혈구의 흡착은 rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av 또는 rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3으로 감염시킨 세포에 대해서 현저히 증가하였다 (나타내지는 않음). 이로부터, 실제 인플루엔자 바이러스 복제에 의해 생성되는 것과 같은 방식으로 헤마글루티닌이 번역되고, 처리된 후, 벡터 바이러스로 감염된 세포의 원형질막으로 운송되었다는 결론을 내릴 수 있다. 감염된 세포의 혈구흡착에 대한 표현형은, 유전자이식 단백질의 효율적인 발현을 보여주며 EHV-1 벡터 감염된 세포의 세포 표면 상에서의 기능성 HA 삼합체의 형성을 시사하는 웨스턴 블롯 및 면역형광 분석법의 결과(H1av, 도 14)를 뒷받침한다.
시판중인 H3 (PA5-34930) 및 H1 (PA5-34929)에 대한 다중클론 항체의 특이성, 및 교차반응성의 결여를 단일 삽입물 바이러스 rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 및 rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av로 감염시킨 감염된 세포에 대한 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다 (나타내지는 않음).
다음으로, 2개의 서로 다른 인플루엔자 A형 바이러스 아형/혈청형의 2개의 상이한 헤마글루티닌을 발현하는 재조합 EHV-1 RacH-SE를 제조하였다.
재조합체 BAC pRacH-SE-70-p455-H3에서 출발하여, 전달 벡터 pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH (도 12) 내에 조립된 발현 카세트 p430-H1av-BGH를 2단계의 RED 재조합에 의해 orf1/3 삽입 부위에 삽입하여 pRacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3을 제조하였다. PK/WRL 세포를 pRacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3으로 형질감염시키고, 재조합 바이러스 rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3을 구제하여 2회 플라크 정제하였다. 상기 재조합 바이러스에 대한 약칭은 rEHV-1 RacH-SE_B이다 (도 15). 인접 서열과 함께 삽입 영역의 고충실도 PCR 산물에 대한 시퀀싱으로 상기 발현 카세트의 정확한 삽입을 확인하였다.
감염된 세포에서 이식유전자의 발현을 시판중인 단일클론 및 다중클론 항체를 사용하여 간접 면역형광 분석법 (IFA, 나타내지 않음) 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다 (도 16). EHV-1 gpII를 인코딩하는 ORF71의 복원을 단일클론 항체 Ai2G7 (BI 소유)을 사용한 IFA (나타내지는 않음) 및 웨스턴 블롯으로 확인하였다 (도 16).
이식유전자 H3과 H1av 모두 이중 삽입물 재조합체인 rEHV-1 RacH-SE_B로 감염된 세포 배양물에서 동시에 발현되었다. 이식유전자 발현은 안정적이었으며, PK/WRL 세포 중에서 11번째의 계대배양까지 시험된 바이러스 역가를 손상시키지 않았다.
상기 두 삽입 부위와 2개의 신규한 프로모터로 강화된 EHV-1 벡터는 2개의 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌을 동시에 발현하는 것으로 밝혀졌다. IFA로 측정된 세포내 위치 및 웨스턴 블롯으로 측정된 SDS-PAGE는 문헌에 공지된 인플루엔자 A형 바이러스 감염된 세포에서 발현된 실제의 헤마글루티닌과 일치하였다.
다음으로, 헤마글루티닌 H1hu (서열번호 29) (A/돼지/이탈리아/4675/2003(H1N2); GenBank 등록번호 ADK98476.1) 및 H1pdm (서열번호 26) (A/돼지/이탈리아/116114/2010(H1N2); GenBank 등록번호 ADR01746.1)을 발현하는 제2 이중 삽입물 rEHV-1 RacH를 제조하였다.
H1hu의 코딩 서열을 합성하고 orf1/3 삽입 영역을 위한 전달 벡터에 서브클로닝시켜 pU1/3-p430-H1hu-BGHKBGH를 생성하였다. H1hu의 발현을 p430 프로모터 및 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리A 신호의 제어 하에 둔 후, orf1/3으로의 삽입을 위한 재조합 영역을 갖도록 프레임화하였다 (도 22).
H1pdm의 코딩 서열을 합성 및 서브클로닝하여, 전달 벡터 pU70-p455-H1pdm-71K71을 생성하고, 신규한 p455 프로모터 및 신규한 71pA 폴리아데닐화 신호의 제어 하에 H1pdm을 둔후, 해당 카세트를 orf70으로의 삽입을 위한 재조합 영역을 갖도록 프레임화하였다 (도 23).
이어서, RED 재조합 시스템을 이용하는 앙파상 돌연변이 유발법에 의해 상기 발현 카세트 p430-H1av-BGH 및 p455-H1pdm-71을 pRacH-SE 내로 삽입하여, 먼저 pRacH-SE-1/3-p430-H1hu를 생성하였다. 표적으로 상기 변형된 BAC를 사용하여, RED 재조합 시스템을 이용하는 앙파상 돌연변이 유발법에 의해 p455-H1pdm-71을 삽입하여, pRacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm을 생성하였다. PK/WRL 세포 중에서 pRacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm을 형질감염시키고, rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm을 구제하여 3회 플라크 정제하였다. 상기 신규한 재조합 벡터 바이러스에 대한 약칭은 rEHV-1 RacH-SE_D이다 (도 24).
감염된 세포에서 이식유전자의 발현을 시판중인 단일클론 및 다중클론 항체를 사용하여 간접 면역형광 분석법 (IFA, 나타내지 않음) 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다 (도 25). EHV-1 gpII를 인코딩하는 ORF71의 복원을 단일클론 항체 Ai2G7 (BI 소유)을 사용한 IFA (나타내지는 않음) 및 웨스턴 블롯으로 확인하였다 (도 25).
재조합 rEHV-1의 유전자형 및 표현형 안정성은 세포 배양물에서 계대배양하여 5번의 계대배양마다 바이러스 역가를 측정함으로써 나타내었다. 삽입 영역의 서열은 웨스턴 블롯에 의해 10번의 계대배양마다 이식유전자 발현으로 확인하였다 (나타내지는 않음). 발현 충실도는 메토셀 오버레이(methocel-overlay) 하에 플라크에 대한 이중 IFA로 항-EHV-항체 및 이식유전자 특이적 항체로 염색된 플라크를 계수함으로써 평가하였다 (나타내지는 않음).
어린 새끼 돼지에서 벡터 백신으로서의 그 특성을 연구하기 위해, rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신을 백신접종-시험감염 연구에서 시험하였다. 상세히 설명하면, 돼지 IAV에 대한 모계 유래의 면역력이 있는 새끼 돼지 (모계 항체에 대해 양성)을 생후 1주 및 4주에 (2회 백신접종, 2x EHV-1) 또는 오직 생후 4주에만 (1회 백신접종, 1x EHV-1) rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D를 사용하여 백신 균주당 1x107의 TCID50의 용량으로 근육내 2회 백신접종하였다. 백신접종을 하지 않은 그룹은 음성 대조군으로 이용하였다. 생후 11주에, 음성 대조군을 제외한 모든 동물을 1x106의 TCID50의 용량의 H3N2 돼지 IAV 시험감염 균주 (H3이 rEHV-1 RacH-SE_B에 사용된 H3 백신 항원에 이종성인 유럽 야생형 바이러스 분리주 R452-14)의 기관내 적용의 의해 시험감염하였다. 백신접종을 하지 않고 시험감염하지 않은 동물을 음성 대조군으로 이용하였던 한편, 백신접종을 하지 않고 시험감염한 동물은 시험감염 대조군으로 이용하였다. 백신접종시와 백신접종 후, 그리고 시험감염 전과 후에, 체온을 측정하고 서로 다른 시점에 혈액 샘플을 채취하였다. 시험감염 후 1일째에, 그룹당 동물의 절반을 사멸시키고, 돼지 IAV 감염에 전형적인 병변에 대하여 폐를 스코어링한 후, 좌측 및 우측 폐당 3개의 폐 샘플을 각각 채취하여, 폐 균질액 중의 감염성 돼지 IAV 역가를 측정하고, 기관지폐포 세척액 (BALF)을 샘플링하였다. 시험감염 후 3일째에 그룹당 잔류하는 동물의 절반에 대하여 동일한 절차를 수행하였다. 샘플 물질 및 수집된 데이터를 분석하여, 특히, 시험감염 후 체온 변화, 돼지 IAV 감염 후 임상 증상, 폐 스코어, 돼지 IAV 폐 역가, 폐 조직의 조직학적 변화, 돼지 IAV 혈청 중화 역가, BALF의 사이토카인 수준, IFNγ-ELISpot으로 측정한 PBMC의 재자극, 및 B-세포 활성화를 측정하였다.
실시예 9
2가의 rEHV-1 RacH 벡터 백신으로 백신접종된 마우스에서 두 항원에 대한 중화 항체 반응의 유도
상기 발현된 이식유전자가 돼지 이외의 다른 종에서 면역성이고, 비강내 적용에 의해 중화 항체가 두 항원 중 어느 하나에 대해 유도되었음을 입증하기 위해, Balb/c 마우스의 면역화에 rEHV-1 RacH SE B (rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-7-p455-H3, 도 15 참조)를 사용하였다.
상세히 설명하면, 그룹당 5마리의 Balb/c 마우스(3-5주령)로 구성된 세 그룹을, 연구일 0일째 및 21일째에 각각 40 μl의 rEHV-1 RacH SE B (rEHV-1 RacH-SE-1/3-430-H1av-7-455-H3, 그룹 1), 또는 40 μl의 공벡터 (rEHV-1 RacH-SE, 그룹 2, 벡터 대조군), 또는 40 μl의 조직 배양 배지 (그룹 3 음성 대조군)로 비강내 접종하였다. 그룹 1과 2에 있어서, 감염성 재조합 EHV-1 용량은 각각 1x105 TCID50/40 μl이었다. 마우스를 연구일 0일 (1차 접종전), 7일, 14일, 21일 (2차 접종전), 28일 및 35일에 채혈하였다. 혈청을 혈액 샘플로부터 추출하여 -80℃로 동결 보관하였다.
벡터 바이러스에 대한 항체 검출을 위한 면역형광 분석법
AI-ST 세포를, 공벡터 BAC pRacH-SE1.2로부터 구제된 바이러스인 rEHV-1 RacH-SE1212를 사용하여 0.001의 감염 다중도 (MOI)로 감염시켰다. 감염 후 24시간된 특징적인 플라크들을 관찰하고 세포를 간접 면역형광 분석법 (IFA)을 위해 처리하였다. PBS 중에서 1:50으로 희석된 최종 채혈물 중의 세 그룹 모두의 혈청(2차 백신접종 후 14일째에 수득됨)을 시험하였다. EHV-1 백신접종된 말의 양성 대조군 혈청을 1:500의 희석률로 사용하였다. 2차 항체는 마우스 혈청에 대해서는 시판중인 FITC-컨쥬케이트된 래빗 항-마우스 IgG 및 말 혈청에 대해서는 Cy5-컨쥬케이트된 염소-항-말 IgG였고, 1:200 희석률로 사용하였다. 항체 결합은 형광 현미경 검사에 의해 평가하였다. 백신접종된 모든 마우스들은 rEHV-1 RacH-SE-감염된 세포를 이용한 IFA에서 반응성인 항체를 발달시켰다. 감염되지 않은 세포들은 어떠한 시험 혈청에 의해서도 결합되지 않았다. 마우스의 음성 대조군의 혈청은 감염되거나 감염되지 않은 세포 그 어디에도 임의의 특정 결합을 나타내지 않았다. 데이터를 하기 표에 개괄하였다.
Figure 112019040794031-pct00003
상기로부터, 마우스의 콧구멍으로의 rEHV-1의 접종이 감염 및 바이러스 복제를 유도하였기 때문에, 마우스 면역 시스템이 자극을 받아 항-EHV-1 항체를 생성하였다고 결론지을 수 있다.
바이러스 중화 시험
인플루엔자 A형 바이러스 (IAV) (A/돼지/이탈리아/7680/2001(H3N2)) 또는 (A/돼지/겐트/132/2005(H1N1))에서 유래한 상기 발현된 이식유전자에 대한 보호 면역성의 유도를 보여주기 위해, 마우스 혈청을 각 바이러스에 대한 중화 활성에 대하여 시험하였다 (Allwinn et al. 2010; Trombetta et al. 2014). 중화 시험에 사용된 IAV는 2014년 독일산 돼지의 분리주, 구체적으로 A/돼지/독일/AR452/2014 (H3N2) 및 A/돼지/독일/AR1181/2014 (H1N1)였다. 이들은 백신 표적이 유래한 균주와는 이종성이기 때문에, 마우스 혈청에 의한 이러한 바이러스들의 중화는 rEHV-1 백신접종에 의한 보호 면역성의 광범위하고 효율적인 유도를 의미할 것이다.
음성 대조군 혈청으로서, 인플루엔자 바이러스 항체에 음성인 것으로 나타났던 돼지의 혈청을 사용하였다.
인플루엔자 A형 바이러스 중화 시험 (VNT):
96-웰 플레이트에서의 바이러스 중화 및 역적정을 위한 MDCK 세포를 사용 전에 37℃/5% CO2로 2일간 항온배양하였다. 각 IAV 스톡 H3N2 및 H1avN1을 얼음에서 해동시키고, 젠타마이신 및 2배 농도의 트립신을 함유하는 MEM (MEM/젠타마이신/2x 트립신) 중에서 희석하였다.
시험된 혈청은 그룹 1 (rEHV-1 RacH SE B), 그룹 2 (공벡터), 양성 대조군 (불활성화 다가 IAV 백신으로 백신접종된 돼지의 혈청) 및 음성 대조군의 최종 채혈물에서 유래하였다.
혈청을 가열해 불활성화시키고, 2개 및 3개의 독립적인 시험에서 각각 1:16에서 출발하여 1:4096까지 1:2 연속 희석하였다. IAV를 약 100 TCID50/중화 반응으로 희석하였다. 중화 반응을 37°C, 5% CO2로 2시간 동안 항온배양하였다. 사용된 바이러스의 역적정을 4회 반복하였다. 성장 배지를 제거하고, MDCK-세포를 중화 반응의 부가 또는 역적정의 바이러스 희석을 부가하기 전에 젠타마이신과 트립신을 함유하는 배지로 세척하였다. VNT 및 적정 플레이트를 중화 반응의 부가 또는 MDCK-세포에 대한 바이러스 희석 부가 후에 37°C, 5% CO2로 2시간 동안 항온배양하였다. 이후, 접종물을 제거하고, 세포들을 젠타마이신과 트립신을 함유하는 신선한 배지로 오버레이하였다. 감염후 5일째에 CPE를 모니터링하여 기록하였다. 시험에서 실제로 사용된 바이러스 역가를 리드와 무네흐(Reed and Muench)에 따라 TCID50/ml로 계산하고, 시험된 혈청이 인플루엔자 바이러스에 전형적인 CPE의 유도를 방지하였던 희석률을 기록하였다 (하기 표 참조).
Figure 112019040794031-pct00004
Figure 112019040794031-pct00005
독립적인 시험들의 결과를 비교하기 위해, 혈청의 희석률 역수와 그에 의해 중화된 개별 역가를 곱하여 중화 능력을 계산하였다. 이후, 3번 시험의 평균을 100으로 나누어 100 TCID50의 중화도를 나타내었다 (표 3, 4 및 5). 데이터를 개괄하고, 도 26에 도시하여 나타냈다.
rEHV-1 RacH SE B로 백신접종된 모든 마우스는 아형 H3N2 및 H1avN1의 이종성 균주인 개별 IAV에 대해 중화 항체를 발달시켰다. 따라서, p455 프로모터의 제어 하에 ORF70 삽입 부위의 IAV (H3) 및 동시에 p430 프로모터의 제어 하에 orf1/3 삽입 부위의 IAV (H1av)의 헤마글루티닌을 발현하는 rEHV-1 RacH-SE의 비강내 이중적 적용은, BALB/c 마우스에서 보호 면역 반응을 성공적으로 자극하였다.
결론적으로, 벡터 rEHV-1 RacH-SE를 2개의 서로 다른 이식유전자의 동시적 발현에 사용하여 비강내 백신접종 후 면역 반응을 자극할 수 있다.
실시예 10
새끼 돼지에서 돼지 IAV H3N2 시험감염에 대한 rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신의 효능
어린 새끼 돼지에서 벡터 백신으로서의 그 특성을 연구하기 위해, rEHV-1 RacH-SE_B (rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3, 도 15 참조) 및 rEHV-1 RacH-SE_D (rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm, 도 24 참조)으로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신을 제2 백신접종-시험감염 연구에서 시험하였다.
상기 제2 연구에서, 백신접종을 하지 않은 암퇘지로서 1차 백신접종 시에 H3 특이적 ELISA (도 30) 및 바이러스 중화 시험 (데이터는 나타내지 않음)에 의해 돼지 IAV 특이적 항체에 대하여 혈청학적으로 음성으로 시험된 암퇘지의 새끼 돼지를 rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 백신으로 2회 백신접종하였다. 동물들을 각각 생후 1주에 1차 (연구일 0일, SD0), 생후 4주에 2차 (연구일 21일, SD21)로 백신 균주, 동물 및 백신접종 당 각각 2 ml의 용량 중 1x107 TCID50의 용량으로 각각 근육내로 백신접종한 후 근육내로 백신접종하거나 (2X IM), 먼저 비강내로 백신접종한 후 근육내로 백신접종하거나 (IN+IM), 또는 비강내로 2회 백신접종 (2X IN)하였다. 백신접종을 하지 않은 그룹을 음성 대조군으로 이용하고, 백신접종을 하지 않은 또 다른 그룹을 시험감염 대조군으로 이용하였다. 생후 7주 (연구일 69일 또는 70일, SD42/43)에, 음성 대조군을 제외한 모든 동물을 2x107의 TCID50의 용량의 H3N2 돼지 IAV 시험감염 균주 (H3이 rEHV-1 RacH-SE_B에 사용된 H3 백신 항원에 이종성인 유럽 야생형 바이러스 분리주 R452-14)의 기관내 적용의 의해 시험감염하였다. 백신접종을 하지 않고 시험감염하지 않은 동물을 음성 대조군(neg. ctrl.)으로 이용하였던 한편, 백신접종을 하지 않고 시험감염한 동물은 시험감염 대조군(chall. ctrl.)으로 이용하였다. 백신접종시와 백신접종 후, 그리고 시험감염 전, 서로 다른 시점에 혈액 샘플을 채취하였다.
시험감염 후 1일째에, 그룹당 동물의 절반을 사멸시키고, 동물마다 좌측 및 우측 폐당 3개의 폐 샘플을 각각 채취하였다. 다음으로, 1g의 폐 균질액당 감염성 돼지 IAV 역가를 각 동물에 대해 동물마다 좌측 및 우측 폐의 평균으로 측정하였는데, 그 값은 각각 좌측 또는 우측 폐당 3개의 샘플 풀의 균질액으로부터 수득하고 상기 좌측 또는 우측 폐의 세 샘플의 전체 중량에 대하여 각각 보정하였다. 시험감염 후 3일째에 그룹당 잔류하는 동물의 절반에 대하여 동일한 절차를 수행하였다. 백신접종된 모든 그룹에서, 그룹 내의 각 동물로부터 수득된 감염성 돼지 IAV 역가의 중앙값은, 시험감염 대조군과 비교했을 때 시험감염 후 1일째에 (CH+1) 채취한 샘플에 있어서 통계적으로 현저하게 감소되었던 반면, 음성 대조군의 모든 동물들은 이들의 폐 균질액에서 감염성 돼지 IAV 바이러스 역가를 나타내지 않았다 (도 27). 또한, 백신접종된 모든 그룹에서, 그룹 내의 각 동물로부터 수득된 감염성 돼지 IAV 역가의 중앙값은, 시험감염 대조군과 비교했을 때 시험감염 후 +3일째에 (CH+3) 채취한 샘플에 있어서 통계적으로 현저하게 감소되었던 반면, 음성 대조군의 모든 동물들은 이들의 폐 균질액에서 감염성 돼지 IAV 바이러스 역가를 나타내지 않았다 (도 28). 따라서, rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신을 이용한 백신접종은, 새끼 돼지에서 이종성 돼지 IAV H3N2 균주로 시험감염 후 1일 및 3일째에 돼지 IAV 폐 부하량을 통계적으로 현저히 감소시켰다. 결과적으로, 본원에 기술한 백신은 돼지에서 돼지 IAV에 대하여 효과적이다.
또한, 연구일 0일 (SD0, 1차 백신접종 전), 연구일 21일 (SD21, 2차 백신접종 전) 및 연구일 42일 또는 43일 (SD42/43, 시험감염 물질의 적용 전)에 연구 동물로부터 채취한 혈청을, 백신 균주 rEHV-1 RacH-SE_B에 의해 발현된 H3에 동종성인 재조합적으로 발현된 돼지 IAV H3 항원에 대한 돼지 면역글로불린 G (IgG)에 특이적인 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA)으로 분석하였다. 음성 대조군의 혈청의 평균 OD 값이 측정된 모든 시점에서 매우 낮은 값들만 제공하였던 반면, 백신접종된 그룹의 혈청은 2회의 근육내 적용 후 (2X IM; SD21 및 SD42/43), 1차 비강내 이후 근육내 적용 후 (IN+IM; SD42/43) 및 2회의 비강내 적용 후 (2X IN; SD42/43)에 OD 값이 크게 증가한 것으로 나타났다; 도 30. 따라서, rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신을 사용한 백신접종은, 백신 균주 rEHV-1 RacH-SE_B에 의해 발현된 돼지 IAV 헤마글루티닌 H3에 대하여 새끼 돼지에서의 혈청학적 면역 반응을 각각 유도하였다.
또한, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 연구 28일째 (SD28)에 연구 동물에서 채취한 혈액으로부터 정제하였다. 이후, 1의 감염 다중도로 H3N2 돼지 IAV 시험감염 균주 R452-14 (H3N2 MOI 1)를 사용하거나 또는 1μg/ml의 농도로 백신 균주 rEHV-1 RacH-SE_B에 의해 발현된 H3에 대해 동종성인 재조합적으로 발현된 돼지 IAV H3 항원 (rH3 1μg/ml)을 사용하여 PBMC를 재자극시켰다. 상기 재자극된 PBMC를 사용하여, 인터페론 감마 특이적 효소 결합 면역흡착 스팟 분석법 (IFNγ ELISpot)을 수행하였고, 상기 수득된 값을 각각 106개의 세포에 대해 보정하여 각각 그룹당 평균으로 계산하였다 (도 32). 시험감염 대조군 (본 시험에서는 음성 대조군으로 이용되고, 동물은 백신접종하지 않음)의 재자극된 PBMC는, 2번의 근육내 적용, 1차 비강내 이후 근육내 적용 (IN+IM) 및 2번의 비강내 적용 (2X IN) 중의 어느 하나의 재자극 후에 45 미만의 그룹당 평균 스폿을 나타내었던 반면, 백신접종된 동물의 재자극된 PBMC는 각각 2번의 근육내 적용 후 85 스폿 초과, 1차 비강내 이후 근육내 적용 후 (IN+IM) 100 스폿 이상, 및 2번의 비강내 적용 후 (2X IN) 150 스폿 이상의 그룹당 평균 스폿을 나타내었다 (도 32). 따라서, rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신을 사용한 백신접종은, 백신 균주 rEHV-1 RacH-SE_B에 의해 발현된 돼지 IAV 헤마글루티닌 H3 및 이종성 시험감염 바이러스 감염에 사용된 돼지 IAV H3N2 R452-14 모두에 대하여 새끼 돼지에서의 세포성 면역 반응을 각각 유도하였다.
따라서, rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신을 사용한 새끼 돼지의 백신접종은, 새끼 돼지에 있어서 검출가능한 혈청학적 및 세포성 면역 반응을 유도하였고, 이종성 돼지 IAV 시험감염 후 1일 및 3일재에 폐 균질액에서 돼지 IAV 부하량을 통계학적으로 현저히 감소시킴으로써 백신 효능을 입증하였다.
실시예 11
모계 유래의 항체를 갖는 새끼 돼지에서 돼지 IAV H3N2 시험감염에 대한 rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신의 효능
어린 새끼 돼지에서 벡터 백신으로서의 그 특성을 연구하기 위해, rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신을 제3 백신접종-시험감염 연구에서 시험하였다.
본 제3 연구에서는, 임신 중에 돼지 IAV에 대한 시판중인 불활성화 백신으로 2회 백신접종한 암퇘지가 낳아서 초유 및 우유를 먹인 새끼 돼지를 사용하였다. 제조업자의 시험 권고(데이터는 나타내지 않음)에 따라 H3 특이적 ELISA (도 31) 및 시판중인 돼지 IAV-특이적 항체 ELISA (IDEXX 인플루엔자 A (바이러스 항체 시험) ®; 미국 메인주 04092 웨스트브룩 소재의 IDEXX)를 사용하여 돼지 IAV 특이적 항체에 대해 혈청학적으로 양성으로 시험된 새끼 돼지들을 1차 백신접종시에 rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 백신으로 2회 백신접종하였다. 동물들을 각각 생후 1주에 1차 (연구일 0일, SD0), 생후 4주에 2차 (연구일 21일, SD21)로 백신 균주, 동물 및 백신접종 당 각각 2 ml의 용량 중 1x107 TCID50의 용량으로 각각 근육내로 백신접종한 후 근육내로 백신접종하거나 (2X IM), 먼저 비강내로 백신접종한 후 근육내로 백신접종하거나 (IN+IM), 또는 비강내로 2회 백신접종 (2X IN)하였다. 백신접종을 하지 않은 그룹을 음성 대조군으로 이용하고, 백신접종을 하지 않은 또 다른 그룹을 시험감염 대조군으로 이용하였다. 생후 11주 (연구일 69일 또는 70일, SD69/70)에, 음성 대조군을 제외한 모든 동물을 2x107의 TCID50의 용량의 H3N2 돼지 IAV 시험감염 균주 (H3이 rEHV-1 RacH-SE_B에 사용된 H3 백신 항원에 이종성인 유럽 야생형 바이러스 분리주 R452-14)의 기관내 적용의 의해 시험감염하였다. 백신접종을 하지 않고 시험감염하지 않은 동물을 음성 대조군(neg. ctrl.)으로 이용하였던 한편, 백신접종을 하지 않고 시험감염한 동물은 시험감염 대조군(chall. ctrl.)으로 이용하였다. 백신접종시와 백신접종 후, 그리고 시험감염 전, 서로 다른 시점에 혈액 샘플을 채취하였다.
시험감염 후 5일째에, 동물들을 사멸시키고, 동물마다 좌측 및 우측 폐당 3개의 폐 샘플을 각각 채취하였다. 다음으로, 1g의 폐 균질액당 감염성 돼지 IAV 역가를 각 동물에 대해 동물마다 좌측 및 우측 폐의 평균으로 측정하였는데, 그 값은 각각 좌측 또는 우측 폐당 3개의 샘플 풀의 균질액으로부터 수득하고 상기 좌측 또는 우측 폐의 세 샘플의 전체 중량에 대하여 각각 보정하였다. 백신접종된 모든 그룹에서, 그룹 내의 각 동물로부터 수득된 감염성 돼지 IAV 역가의 중앙값은, 시험감염 대조군과 비교했을 때 시험감염 후 +5일째에 (CH+5) 채취한 샘플에 있어서 통계적으로 현저하게 감소되었던 반면, 음성 대조군의 모든 동물들은 이들의 폐 균질액에서 감염성 돼지 IAV 바이러스 역가를 나타내지 않았다 (도 29). 따라서, rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신을 이용한 백신접종은, 새끼 돼지에서 이종성 돼지 IAV H3N2 균주로 시험감염 후 5일째에 돼지 IAV 폐 부하량을 통계적으로 현저히 감소시켰다. 결과적으로, 본원에 기술한 백신은 돼지에서 돼지 IAV에 대하여 효과적이다.
또한, 연구일 0일 (SD0, 1차 백신접종 전), 연구일 21일 (SD21, 2차 백신접종 전) 및 연구일 35일 (SD35, 2차 백신접종 전)에 연구 동물로부터 채취한 혈청을, 백신 균주 rEHV-1 RacH-SE_B에 의해 발현된 H3에 동종성인 재조합적으로 발현된 돼지 IAV H3 항원에 대한 돼지 면역글로불린 G (IgG)에 특이적인 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA)으로 분석하였다. 음성 대조군의 혈청의 평균 OD 값이 SD21 및 SD35에서 매우 낮은 값들만 제공하였던 반면, 백신접종된 그룹의 혈청은 2회의 근육내 적용 후 (2X IM; SD35), 1차 비강내 이후 근육내 적용 후 (IN+IM; SD35) 및 2회의 비강내 적용 후 (2X IN; SD35)에 OD 값이 크게 증가한 것으로 나타났다; 도 31. 따라서, rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신을 사용한 백신접종은, 백신 균주 rEHV-1 RacH-SE_B에 의해 발현된 돼지 IAV 헤마글루티닌 H3에 대하여 새끼 돼지에서의 혈청학적 면역 반응을 각각 유도하였다.
또한, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 연구 28일째 (SD28)에 연구 동물에서 채취한 혈액으로부터 정제하였다. 이후, 1의 감염 다중도로 H3N2 돼지 IAV 시험감염 균주 R452-14 (H3N2 MOI 1)를 사용하거나 또는 1μg/ml의 농도로 백신 균주 rEHV-1 RacH-SE_B에 의해 발현된 H3에 대해 동종성인 재조합적으로 발현된 돼지 IAV H3 항원 (rH3 1μg/ml)을 사용하여 PBMC를 재자극시켰다. 상기 재자극된 PBMC를 사용하여, 인터페론 감마 특이적 효소 결합 면역흡착 스팟 분석법 (IFNγ ELISpot)을 수행하였고, 상기 수득된 값을 각각 106개의 세포에 대해 보정하여 각각 그룹당 평균으로 계산하였다 (도 33). 시험감염 대조군 (본 시험에서는 음성 대조군으로 이용되고, 동물은 백신접종하지 않음)의 재자극된 PBMC는, 2번의 근육내 적용, 1차 비강내 이후 근육내 적용 (IN+IM) 및 2번의 비강내 적용 (2X IN) 중의 어느 하나의 재자극 후에 15 미만의 그룹당 평균 스폿을 나타내었던 반면, 백신접종된 동물의 재자극된 PBMC는 각각 2번의 근육내 적용 후 30 스폿 초과, 1차 비강내 이후 근육내 적용 후 (IN+IM) 55 스폿 이상, 및 2번의 비강내 적용 후 (2X IN) 65 스폿 이상의 그룹당 평균 스폿을 나타내었다 (도 33). 따라서, rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신을 사용한 백신접종은, 백신 균주 rEHV-1 RacH-SE_B에 의해 발현된 돼지 IAV 헤마글루티닌 H3 및 이종성 시험감염 바이러스 감염에 사용된 돼지 IAV H3N2 R452-14 모두에 대하여 새끼 돼지에서의 세포성 면역 반응을 각각 유도하였다.
따라서, rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신을 사용한 새끼 돼지의 백신접종은, 새끼 돼지에 있어서 검출가능한 혈청학적 및 세포성 면역 반응을 유도하였고, 이종성 돼지 IAV 시험감염 후 5일째에 폐 균질액에서 돼지 IAV 부하량을 통계학적으로 현저히 감소시킴으로써 백신 효능을 입증하였다.
실시예 12
rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신은 IAV 핵단백질 (NP) 특이적 항체를 기반으로 하여 백신접종된 동물에서 감염축을 진단하여 구별하는 (DIVA) 특징을 제공한다
rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신의 혈청학적 DIVA 특성을 평가하기 위해, 임신 중에 돼지 IAV에 대한 시판중인 불활성화 백신으로 2회 백신접종한 암퇘지가 낳아서 초유 및 우유를 먹인 새끼 돼지를, rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 백신으로 2회 백신접종하였다. 동물들을 각각 생후 1주에 1차, 그리고 생후 4주에 2차로 백신 균주, 동물 및 백신접종 당 각각 2 ml의 용량 중 1x107 TCID50의 용량으로 각각 근육내로 백신접종한 후 근육내로 백신접종하거나 (2X IM), 먼저 비강내로 백신접종한 후 근육내로 백신접종하거나 (IN+IM), 또는 비강내로 2회 백신접종 (2X IN)하였다. 백신접종을 하지 않은 그룹은 음성 대조군(neg. ctrl.)으로 이용하였다. 상기 2X IM, IN+IM, 2X IN 및 음성 대조군에 있어서, 그룹당 5마리의 동물을 사용하고, 혈청 샘플을 1차 백신접종 전 (도 34, 백신접종 전)과 2차 백신접종 후 14일째 (도 34, 백신접종 후)에 각각 채취하였다. 양성 대조군으로서, 1차 백신접종 시점 이전에 IAV 특이적 항체에 대해 음성인 것으로 시험된 (데이터는 나타내지 않음, 도 34, 백신접종 전), 백신접종을 하지 않은 암퇘지의 새끼 돼지 2마리를 돼지 IAV에 대한 백신을 함유하고 있는 시판중인 불활성화 IAV로 2회 백신접종하였다 (양성 대조군). 양성 대조군의 새끼 돼지를 생후 2주에 1차로, 그리고 생후 5주에 2차로 각각 백신접종하고, 혈청 샘플을 1차 백신접종 전 (도 34, 백신접종 전)과 2차 백신접종 후 22일째 (도 34, 백신접종 후)에 각각 채취하였다.
상술한 혈청을 돼지 IAV 핵단백질 (NP) 특이적 IgG를 검출하는 ELISA에서 시험하였다 (도 34). 백신접종된 암퇘지의 새끼 돼지의 혈청 샘플들 (음성 대조군, 2X IM, IN+IM, 2X IN 그룹)은 모두 백신접종 전에 0.7 이상의 그룹당 평균 OD 값을 나타내었으므로, 이는 모계 유래 기원의 상기 백신접종을 하지 않은 동물들에서 IAV NP 특이적 항체의 존재를 입증하는 것이다 (도 34). 이와는 대조적으로, 양성 대조군의 새끼 돼지 혈청의 평균 그룹 값은 백신접종 전 0.15 미만이었는데, 이는 IAV NP 특이적 항체의 부재/매우 낮은 수준을 입증하는 것이다. 시판중인 불활성화 NP 함유 돼지 IAV 백신으로 2차 백신접종 후 22일째에 (도 34, 백신접종 후), 양성 대조군의 혈청의 평균 그룹 값이 1.9 이상으로 증가하였으므로, 이는 새끼 돼지에서 검출가능한 돼지 IAV NP 특이적 IgG가 강력하게 유도되었음을 입증하는 것이다. 이와는 대조적으로, 돼지 IAV NP를 함유하지 않거나 발현하지 않는 rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신으로 백신접종 후 14일째에, 상기 2X IM, IN+IM, 2X IN 그룹 및 또한 백신접종을 하지 않은 음성 대조군의 새끼 돼지의 혈청 샘플은 각각 0.15 미만의 그룹당 평균 OD 값을 나타내었으므로, 이는 백신접종 전에 존재했던 IAV NP-특이적 항체 수준이 매우 낮은 수준으로 감소하였음과 백신접종이 새끼 돼지에서 검출가능한 돼지 IAV NP 특이적 IgG를 강력하게 유도하지 못했음을 입증하는 것이다. 이를 종합해 보면, 종래의 NP 함유 불활성화 돼지 IAV 백신이 백신접종된 새끼 돼지에서 검출가능한 NP 특이적 항체를 강력하게 유도하였던 반면에, rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신을 사용한 백신접종은 백신접종된 새끼 돼지에서 검출가능한 NP 특이적 항체를 강력하게 유도하지 못하였다.
rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신이 백신접종된 새끼 돼지에서 검출가능한 NP 특이적 항체를 강력하게 유도하지 못하였다는 사실은, 백신접종된 동물에서 감염축을 구별 (DIVA)하고 종래의 NP 함유 불활성화 돼지 IAV 백신으로 백신접종된 동물에서 백신접종된 동물을 구별할 수 있도록 해주는 혈청학적 진단 마커를 입증한 것이었다.
상기 DIVA 특징은 rEHV-1 RacH-SE_B 및 rEHV-1 RacH-SE_D로 이루어진 4가 돼지 IAV 백신의 사용을 수반하는 상업적인 시험 개발을 위해서 그리고 돼지 IAV에 대한 근절 방안을 뒷받침하는데 이용된다.
본원에 개시되고 청구된 모든 조성물과 방법들은 본 명세서의 내용을 고려하여 과도한 실험없이도 고안하여 수행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시양태의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 당업계의 개념, 의미 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본원에 기술된 조성물과 방법들, 상기 방법의 단계들 또는 상기 방법 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 사실은 당업계의 숙련자들에게는 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되어 있는 특정 제제의 경우 이들을 사용하여도 동일하거나 유사한 결과가 달성된다면 본원에 기술된 제제를 대체할 수 있음도 명백할 것이다. 당업계의 숙련자들에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 하기의 특허청구범위에 정의된 본 발명의 의미, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참조문헌
하기의 참고문헌들은, 본원에 기술된 내용에 대하여 예시적인 절차이거나 이를 보충하는 기타 상세한 설명을 제공하는 정도로, 본원에 참고로서 상세하게 포함된다.
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<110> Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH <120> NEW SWINE INFLUENZA VACCINE <130> P01-3203 <160> 29 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 600 <212> DNA <213> Equine herpesvirus 4 <400> 1 gcagactttg gagcagcaca atttccggtt gtggacccca tggaccttgg tttggctggt 60 accgtggaaa ctaacgctcc ggaagttttg gccagagcaa aatacaattc gaaggtagac 120 atatggagcg ccggaatagt tctgtttgaa atgctcgcat atccatcaac tctatttgag 180 gacccgccga gtaccccaca agagtatgta aaaagctgtc attctcaact actgagaata 240 atatcaaagc taaagataaa ccctgaggag tttccacggg aaccagagtc taggctcgtg 300 cgcggataca tcgaatacgc cagcctagag cgtaagccac atacgcgcta tccttgcttc 360 cagcgcgtga acctacacat tgacggggaa tttttgatcc ataaaatgct agcgttcaat 420 gctgcgatgc gcccatccgc agaagagttg ttgtcctacc caatgtttat gaatctgtag 480 gatgactaac agatttgggg tggagacggc gtgggcgata ctgtataaag ttgtactact 540 taccagccca gtcagtgtgc tgtagtgcca ccacctgtaa agctgtgata agctgcagtt 600 <210> 2 <211> 600 <212> DNA <213> Equine herpesvirus 4 <400> 2 agctggggga gtttgtacta tagtgtatta catgcggctt gcaataactg 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primer no 1131 specific for orf72 <400> 6 ctagcgcagt cgcgttg 17 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer no. 1079 specific for mCherry <400> 7 gcgaggagga taacatgg 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer no. 1080 specific for mCherry <400> 8 acccttggtc accttcag 18 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence nucleic acid PCR primer 1017 for the orf70 insertion region <400> 9 aggctcgtgc gcggatacat cg 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence nucleic acid PCR primer 1018 for the orf70 insertion region <400> 10 ttcggggctg ttagactcct cc 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence nucleic acid PCR primer 1007 for the orf1/3 insertion region <400> 11 ccaactcgcc gccatgagac cc 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence nucleic acid PCR primer 1008 for the orf1/3 insertion region <400> 12 agcgcgcccc gtacccagtg gg 22 <210> 13 <211> 417 <212> DNA <213> Equine herpesvirus 1 <400> 13 ctccgagtac cccagaggag tatgtgaaaa gctgccactc gcaactactg aagataattt 60 caacgctcaa gataaatccg gaggagtttc ctcgagaccc cgggtcgagg ctcgtgcgcg 120 gatacatcga gtattctaga ctcgagcgca agccctacac gcgctacccc tgctttcaac 180 gcgtcaacct gcacattgac ggggagtttc tggttcacaa gatgctagcg ttcaatgccg 240 cgatgcgccc atcggccgag gagctgctgt catacccaat gtttgctcaa ctttaggatg 300 actaacctgt ttctgggagg agacagcgtg ggcgacggtg tataaagttg gtctgctttc 360 aagccctgcc actgcgctac agtgccacca actgtaaagc ggtagtaagc tgcagtg 417 <210> 14 <211> 431 <212> DNA <213> Equine herpesvirus 1 <400> 14 gaccctgttg gtgggtgcgg ttggactcag aatcttggcg caggcatgga agtttgtcgg 60 tgacgaaaca tacgacacca tccgcgcaga agcaaagaat ttagagaccc acgtaccctc 120 aagtgctgca gagtcgtctc tagaaaacca atcgacacag gaggagtcta acagccccga 180 agttgcccac ctgcgaagcg tcaacagcga tgacagtaca cacacggggg gtgcgtcgaa 240 cggcatccag gactgtgaca gtcagctcaa aactgtgtat 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1 <400> 20 atgttgactg tcttagcagc tctgagtctg ctcagcttgc ttacgagcgc aaccggacgg 60 ctcgccccag atgaactctg ttatgccgaa ccccgcagaa ctggcagccc accaaacacc 120 cagcccgaac gcccacccgt aatatttgag cccccaacaa ttgcgattaa agctgaatcc 180 aagggttgtg agctaatttt attagatcca cccatagatg taagctatcg cagagaagat 240 aaggtgaatg cgtccattgc ttggtttttt gactttggcg cttgccggat gcccatcgca 300 tacagagagt attacggttg tattggcaat gctgttccct ccccagagac ttgtgatgcg 360 tactcattta cccttattag gaccgagggt atcgtggagt ttaccatcgt aaacatgagc 420 ctcctgtttc agcctggaat atacgatagt ggcaatttta tctacagcgt tctcctggac 480 taccacatat ttacaggacg tgtaacgttg gaagtggaaa aggacacaaa ctatccctgt 540 ggcatgattc atggactcac tgcttacgga aacatcaacg tagatgaaac catggacaac 600 gccagcccac acccgcgtgc cgtggggtgc tttcccgagc ccatcgacaa cgaagcgtgg 660 gcaaacgtta catttactga attggggata ccagacccaa actcatttct cgatgacgag 720 ggtgattacc cgaatatatc agactgtcac tcgtgggagt catacaccta cccaaatacg 780 ctgaggcagg ccacaggacc c 801 <210> 21 <211> 4435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of transfer plasmid pU-mC70-BGH <400> 21 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cctccgagta ccccagagga 420 gtatgtgaaa agctgccact cgcaactact gaagataatt tcaacgctca agataaatcc 480 ggaggagttt cctcgagacc ccgggtcgag gctcgtgcgc ggatacatcg agtattctag 540 actcgagcgc aagccctaca cgcgctaccc ctgctttcaa cgcgtcaacc tgcacattga 600 cggggagttt ctggttcaca agatgctagc gttcaatgcc gcgatgcgcc catcggccga 660 ggagctgctg tcatacccaa tgtttgctca actttaggat gactaacctg tttctgggag 720 gagacagcgt gggcgacggt gtataaagtt ggtctgcttt caagccctgc cactgcgcta 780 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Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val 180 185 190 Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu 195 200 205 Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Thr Ser Arg Tyr Ser 210 215 220 Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln 225 230 235 240 Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys 245 250 255 Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe 260 265 270 Ala Met Glu Arg Lys Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro 275 280 285 Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn 290 295 300 Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His 405 410 415 Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430 Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460 Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr 515 520 525 Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ile 530 535 540 Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 27 <211> 566 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 27 Met Lys Thr Val Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Val Phe Gly 1 5 10 15 Gln Asp Leu Pro Gly Lys Gly Asn Asn Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly 20 25 30 His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr Asp Asp 35 40 45 Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Phe Ser Met 50 55 60 Gly Lys Ile Cys Asn Asn Pro His Arg Ile Leu Asp Gly Ala Asn Cys 65 70 75 80 Thr Leu Ile Asp Ser Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Gly Phe Gln 85 90 95 Asn Glu Lys Trp Asp Leu Phe Ile Glu Arg Ser Lys Ala Phe Ser Asn 100 105 110 Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Glu Tyr Thr Ser Leu Arg Ser Leu Ile 115 120 125 Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Thr Asn Glu Asn Phe Asn Trp Thr 130 135 140 Gly Val Thr Gln Asn Gly Gly Ser Ser Ala Cys Lys Arg Gly Pro Asn 145 150 155 160 Asn Ser Phe Phe Ser Lys Leu Asn Trp Leu Tyr Lys Ser Gly Asn Thr 165 170 175 Tyr Pro Met Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Ser Asp Asp Phe Asp Lys 180 185 190 Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp Arg Glu Gln Ile 195 200 205 Asn Leu Tyr Val Gln Ala Ser Gly Lys Ile Ile Val Ser Thr Lys Arg 210 215 220 Ser Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Trp Val Arg 225 230 235 240 Gly Leu Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly 245 250 255 Asp Ile Leu Ile Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly 260 265 270 Tyr Phe Lys Met Gln Thr Gly Lys Ser Ser Val Met Arg Ser Asp Ala 275 280 285 Pro Ile Asp Thr Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile 290 295 300 Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Ile Thr Tyr Gly Ala 305 310 315 320 Cys Pro Lys Tyr Ile Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met 325 330 335 Arg Asn Ile Pro Glu Arg Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala 340 345 350 Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asn Gly Trp Tyr Gly 355 360 365 Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Ile Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys 370 375 380 Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asn Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val 385 390 395 400 Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser 405 410 415 Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Arg Tyr Val Glu Asp Thr 420 425 430 Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu 435 440 445 Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe 450 455 460 Glu Lys Thr Arg Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn 465 470 475 480 Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ser Cys Met Glu Ser 485 490 495 Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asn Glu Tyr Arg Asp Glu Ala Val 500 505 510 Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Ser Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys 515 520 525 Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys 530 535 540 Ala Val Trp Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile 545 550 555 560 Arg Cys Asn Ile Cys Ile 565 <210> 28 <211> 566 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 28 Met Glu Ala Lys Leu Phe Val Leu Phe Cys Ala Phe Thr Ala Leu Lys 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Val Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Ile Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asn Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Asn Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Asn Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Asn Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Ile Glu Thr Ser Asn Ser Lys Asn Gly Ala Cys Tyr Pro Gly Glu Phe 100 105 110 Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Thr Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Ala Thr Ser Trp Pro Asn His Asp 130 135 140 Thr Thr Lys Gly Thr Thr Val Ser Cys Ser His Ser Gly Ala Asn Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Ile Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro 165 170 175 Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Val Leu Val 180 185 190 Ile Trp Gly Val His His Pro Pro Thr Asp Ser Asp Gln Gln Thr Leu 195 200 205 Tyr Gln Asn Asn His Thr Tyr Val Ser Val Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr 210 215 220 Gln Arg Phe Thr Pro Glu Ile Val Ala Arg Pro Lys Val Arg Gly Gln 225 230 235 240 Ala Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Asp Gln Gly Asp Thr 245 250 255 Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp His Ala Phe 260 265 270 Ala Leu Asn Lys Gly Ser Asn Ser Gly Ile Met Met Ser Asp Ala His 275 280 285 Val His Asn Cys Thr Thr Lys Cys Gln Thr Pro His Gly Ala Leu Lys 290 295 300 Ser Asn Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Ile Thr Ile Gly Glu Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Gln Leu Arg Met Ala Thr Gly Leu Arg 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Ile Ala Ile Asp Gly Ile Ser Asn Lys Val Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Ile Gln Phe Thr Ser Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn 405 410 415 Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430 Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Ile Leu Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Phe Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460 Lys Val Lys Ser Gln Leu Arg Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Arg Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Val Gly Val His 515 520 525 Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu 530 535 540 Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 29 <211> 564 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 29 Met Lys Ala Lys Leu Leu Ile Leu Trp Cys Ala Leu Ser Ala Thr Asp 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Asn His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Lys Gly Val 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Ser Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Phe Ser Lys Lys Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Ala Glu Thr Pro Asn Ala Glu Asn Gly Ile Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe 100 105 110 Ser Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Lys His Ser 130 135 140 Ile Gly Ala Thr Ala Ser Cys Ser Lys Gln Gly Arg Ser Ser Phe Tyr 145 150 155 160 Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys Asn Gly Ser Tyr Pro Asn Leu 165 170 175 Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asp Lys Glu Arg Glu Val Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Val His His Pro Ser Asn Ile Glu Asp Gln Arg Ala Ile Tyr Arg 195 200 205 Lys Glu Thr Ala Tyr Val Ser Val Met Ser Ser Leu Tyr Asn Arg Arg 210 215 220 Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Ile Arg Asn Gln Glu Gly 225 230 235 240 Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Lys Asp Thr Ile Ile 245 250 255 Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala Leu 260 265 270 Ser Arg Gly Phe Glu Ser Gly Ile Ile Val Ser Asn Ala Ser Met Asp 275 280 285 Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Lys Met Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ile 325 330 335 Pro Ser Ile Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 340 345 350 Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 355 360 365 Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln 370 375 380 Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Asp Lys 385 390 395 400 Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu 405 410 415 Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp 420 425 430 Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg 435 440 445 Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Ser Leu Tyr Glu Lys Val 450 455 460 Lys Gly Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe 465 470 475 480 Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Asp Ser Val Lys Asn 485 490 495 Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Arg Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg 500 505 510 Glu Lys Ile Asp Gly Val Glu Leu Lys Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile 515 520 525 Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser 530 535 540 Leu Gly Ala Thr Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys 545 550 555 560 Arg Ile Cys Ile

Claims (26)

  1. 돼지, 소, 가금류 및 어류로 이루어진 군으로부터 선택되는 식용 동물을 감염시키는 병원체와 관련된 제1 및 제2 외인성 항원 인코딩 서열을 포함하는 EHV-1 RacH 벡터로서,
    상기 제1 외인성 항원 인코딩 서열은 ORF70으로 삽입되고, 상기 ORF70은 801bp 부분 (서열번호 20)을 결실시켜 변형시키고, 상기 결실은 서열번호 20과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열에 상응하고,
    상기 제2 외인성 항원 인코딩 서열은 ORF1/3 또는 ORF70으로 삽입되고,
    상기 외인성 항원 인코딩 서열들은 프로모터들에 작동가능하게 연결되는, EHV-1 RacH 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 외인성 항원 인코딩 서열이 인플루엔자 헤마글루티닌 인코딩 서열인 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 헤마글루티닌 인플루엔자의 아형은 H1 및/또는 H3인 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 외인성 항원 인코딩 서열이 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29 중 어느 하나를 갖는 헤마글루티닌 인플루엔자 항원을 인코딩하는 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제2 외인성 항원 인코딩 서열이 ORF1/3으로 삽입되는 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 ORF70은 부분 결실 또는 치환을 가지고, ORF71은 기능을 유지하고, ORF70 유전자 산물 당단백질 G의 발현이 제거되는 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  7. 제1항에 있어서, 상기 EHV-1 RacH 벡터가 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18, 및 상기 서열들 중 어느 하나의 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 인접 영역(flanking region)을 포함하는 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  8. 제1항에 있어서, 상기 프로모터들 중 하나 이상이 HCMV 및 MCMV 전초기(immediate early) 유전자 1, 또는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4 중 어느 하나의 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열인 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  9. 제1항에 있어서, 상기 프로모터들 중 하나 이상이 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  10. 제1항에 있어서, 상기 프로모터들 중 하나 이상이 서열번호 3의 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  11. 제1항에 있어서, 상기 프로모터들 중 하나 이상이 서열번호 4의 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 상기 프로모터들이 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열을 포함하는 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  13. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 외인성 항원 인코딩 서열이 인플루엔자 헤마글루티닌 인코딩 서열인 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  14. 제1항에 있어서, 상기 식용 동물이 돼지인 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  15. 제1항에 있어서, 상기 식용 동물을 감염시키는 병원체가 돼지 인플루엔자 A형 바이러스인 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  16. 제1항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 외인성 항원 인코딩 서열이 돼지 기원의 헤마글루티닌 인플루엔자 A형 항원 인코딩 서열인 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  17. 제1항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 외인성 항원 인코딩 서열이 돼지 기원의 헤마글루티닌 인플루엔자 A형 항원 인코딩 서열이고, 상기 돼지 기원의 적어도 하나의 헤마글루티닌 인플루엔자 A형 항원 인코딩 서열이 ORF70으로 삽입되는 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  18. 제1항에 있어서, 상기 제2 외인성 항원 인코딩 서열이 ORF1/3으로 삽입되고, 상기 제1 및/또는 제2 외인성 항원 인코딩 서열이 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29 중 어느 하나를 갖는 헤마글루티닌 인플루엔자 항원을 인코딩하고, 상기 프로모터들 중 하나 이상이 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, EHV-1 RacH 벡터.
  19. 제1항에 따른 EHV-1 RacH 벡터를 포함하는 면역원성 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 다가 백신인 것인, 면역원성 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 2가 백신, 4가 백신, 6가 백신 또는 7가 백신인 것인, 면역원성 조성물.
  22. 돼지, 소, 가금류 및 어류로 이루어진 군으로부터 선택되는 식용 동물을 면역화시키는 방법으로서, 제19항에 따른 면역원성 조성물의 2회 이상의 용량을 상기 식용 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 식용 동물을 면역화시키는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 식용 동물이 돼지인 것인, 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 방법이, 면역화시키지 않은 동일한 종의 대조군 식용 동물과 비교하여, 체중 손실의 감소, 폐에서의 더 낮은 바이러스 부하량, 폐 병변의 감소, 바이러스 쉐딩(shedding)의 감소 및/또는 단축, 감소된 직장 온도, 감소된 임상 증상, 항-돼지 인플루엔자 A형 바이러스 항체의 유도 증가, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 T-세포의 자극 증가, 돼지 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 B-세포의 자극 증가 및 염증 유발성 사이토카인의 감소, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효능 파라미터를 개선하고, 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29 중 어느 하나를 갖는 헤마글루티닌 인플루엔자 항원을 인코딩하는 것인, 방법.
  25. 돼지, 소, 가금류 및 어류로 이루어진 군으로부터 선택되는 식용 동물에서돼지 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 임상 증상을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 제19항
    의 면역원성 조성물의 치료적 유효량을 상기 식용 동물에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29 중 어느 하나를 갖는 헤마글루티닌 인플루엔자 항원을 인코딩하는 것인, 방법.
  26. 돼지, 소, 가금류 및 어류로 이루어진 군으로부터 선택되는 식용 동물에서, 동일한 종의 면역화시키지 않은 대조군 식용 동물과 비교하여 폐에서의 바이러스 역가를 감소시키는 방법으로서, 제19항의 면역원성 조성물의 치료적 유효량을 상기 식용 동물에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 외인성 항원 인코딩 서열이 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29 중 어느 하나를 갖는 헤마글루티닌 인플루엔자 항원을 인코딩하는 것인, 방법.
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