KR20230115479A - 재조합 구제역 바이러스 a형 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물 - Google Patents
재조합 구제역 바이러스 a형 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 재조합 구제역 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 아시아 지역 또는 세계적으로 유행하는 A 혈청형에 광범위로 방어하는 구제역 재조합 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 재조합 구제역 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 구제역 A형에 대한 방어항원 (VP1)부위를 인위적으로 삽입 대체하여 제작된 바이러스를 이용하여 아시아 지역 또는 세계적으로 유행하는 A 혈청형에 광범위로 방어하는 구제역 재조합 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물에 관한 것이다.
구제역(Foot and mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스성 수포질병으로 빠른 복제와 빠른 전파력이 특징이다. 이 질병은 그 경제적 중요성으로 인하여 세계동물보건기구(OIE)에 의하여 매우 중요한 동물 질병으로 분류되어 있으며, 발생시 국가간 교역이 불가능하여 축산물의 교역에 있어 가장 중요한 요소로 작용하고 있다.
상기 구제역 병원체는 단일 가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데(Piconaviridae)과 아프소바이러스(Aphthovirus)속에 속하며, 7개의 다른 혈청형(A, O, C, Asia1, SAT 1, SAT2, SAT3)으로 분류되고 있다. 그러나, 모든 백신주 개발을 위해서는 야외주를 지속적으로 세포에 배양하여 적절한 증식력을 지녀야 하고, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되는 단점이 있다.
한편 구제역 바이러스 A형은 가장 항원적인 변화가 심한 바이러스이다. 세계적으로는 A22 Iraq이 주요 방어 백신주로 사용되고 있으나 세계적으로 일부 지역에서 사용하기에는 야외주와의 매칭률이 낮아 사용이 어려울 수도 있다. A 형의 경우 아시아 뿐 아니라 전 세계적으로 유행하는 바이러스로 보다 변이가 심한 다양한 지역형의 바이러스가 유행하기 때문에 A 혈청형에 대한 바이러스는 광범위 방어가 가능한 백신주를 사용되는 것이 중요하므로 보다 광범위한 방어능을 지니는 백신을 개발하고자 하였다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명은 소와 돼지에서의 매칭률이 높고 다양한 지역형 방어가 가능한 재조합 구제역 바이러스 및 상기 바이러스로부터 유래된 항원을 포함하는 구제역 백신 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 상기 구제역 백신 조성물을 이용한 구제역의 예방, 치료방법을 제공하고자 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 구제역 바이러스 A 혈청형에 기초한 재조합 바이러스 및 이를 유효성분으로 포함하는 구제역 백신 조성물을 제공한다.
또한, 상기 재조합 바이러스를 생산할 수 있는 재조합 플라스미드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스 또는 상기 재조합 구제역 바이러스로부터 분리·정제된 항원을 포함하며, 여러 지역형에 대한 방어가 가능한 구제역 백신 조성물을 제공한다.
또한, 상기 재조합 구제역 바이러스 또는 상기 재조합 구제역 바이러스로부터 분리·정제된 항원을 포함하는 백신 조성물을 이용하여 구제역을 예방 및 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 구제역 재조합 바이러스 또는 상기 구제역 바이러스 항원을 포함하는 구제역 진단 키트를 제공한다.
또한, 상기 구제역 진단 키트를 이용한 구제역 진단 방법을 제공한다.
상기 구제역의 예방 또는 치료 방법, 구제역 진단 방법은 인간을 제외한 돼지, 소, 염소, 사슴, 낙타와 같은 우제류 동물에 적용되는 것을 의미한다.
본 발명의 재조합 구제역 바이러스들은 O 혈청형을 기초로 하며, O 형 Manisa의 VP1을 A22iraq70 iso92 VP1 (Genbank. AY593764.1)로 치환한 것일 수 있다.
구체적으로 본 발명에 따른 재조합 구제역 바이러스는 구제역 A형 바이러스일 수 있고, 이들은 각각 G1-A22VP1-G7E, G1-A22VP1-G2E로 명칭될 수 있다.
더욱 구체적으로 상기 G1-A22VP1-G7E와 G1-A22VP1-G2E은 각각 서열번호 6 및 서열번호 7에서 각각 정제된 바이러스이며, 이들의 염기서열은 각각 서열번호 6의 646 번째 내지 8864번째 서열 부위, 서열번호 7의 646번째 내지 8861번째 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 구제역 바이러스는 면역 증가를 유도하는 아쥬반트와 함께 투여될 수 있다.
본 발명에서 용어 "플라스미드(plasmid)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 플라스미드는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다.
본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 선별 표지 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker) 등을 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터 및 재조합 구제역 바이러스는 통상의 유전자조작법, 형질전환법에 의해 제조될 수 있으며, 적은 양으로 형성된 바이러스를 세포배양을 통한 연속 계대로 적절한 양의 바이러스를 수득할 수 있다.
상기 세포 배양에 사용되는 세포는 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과 동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과, 토끼과, 설치류 및 영장류의 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포에서 유래된 것일 수 있고, 바람직하게는 염소 혀 세포(ZZ-R) 및 햄스터 신장 세포 (BHK-21), 흑염소 신장세포(BGK), 돼지 신장세포 (IBRS-2) 및 소 신장세포 (LFBK)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 구제역 백신 조성물은 본 발명의 구제역 재조합 바이러스 또는 상기 재조합 바이러스로부터 분리, 정제된 항원을 유효성분으로 포함한다.
상기 백신 조성물을 포함하는 백신은 생백신, 약독화된 백신, 또는 사백신일 수 있다.
상기 구제역 재조합 바이러스 또는 상기 재조합 바이러스로부터 분리·정제된 항원을 포함하는 백신 조성물은 1/2560 내지 1/10 dose의 용량으로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 1/640 내지 1/10 dose의 용량으로 투여될 수 있다.
또한, 상기 백신조성물은 당 업계에서 통상적으로 허용 가능한 담체, 충진제，증량제，결합제，습윤제，붕해제，계면활성제 등의 희석제 또는 부형제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 다양한 형태로 개체에 투여(또는 주입)될 수 있다. 투여는 피하주사，근육내 주사，피하내 주사，복막내 주사，비강투여，구강투여，경피투여 및 경구투여로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스의 제조방법을 제공할 수 있으며, 제조방법은 다음의 단계를 포함한다;
(a) 구제역 O 혈청형 Manisa의 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계;
(b) 상기 구제역 O 혈청형 Manisa 유전자 중 VP1 내지 VP4 부위를 A 형의 VP1 내지 VP4 부위로 교체시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 치환된 VP1의 140번째부터 160번째까지의 아미노산을 삽입하는 단계;
(d) 상기 (c)단계를 거쳐 얻은 재조합 플라스미드를 분리, 정제하는 단계.
상기 (b) 단계에서 치환되는 VP 1 내지 4의 부위는 제한되는 것은 아니지만 바람직하게는 VP2 내지 VP4는 구제역 A 형 중 A/Pocheon으로부터 유래된 것이며, VP1은 A22/Iraq 형으로부터 유래된 것으로 치환될 수 있다.
상기 (c) 단계에서 치환되는 아미노산은 SGRVRGDLGQLAARVAAQLPA 또는 QNRRGDSGPLVVKPATQLPAS 일 수 있다.
본 발명은 재조합 구제역 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 구제역 A형에 대한 방어항원 부위를 인위적으로 삽입 대체하여 제작된 바이러스를 이용하여 아시아 지역 또는 세계적으로 유행하는 A 혈청형에 광범위로 방어하는 구제역 재조합 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물을 제공할 수 있다.
도 1a는 본 발명에 따른 구제역 재조합 바이러스의 유전자 모식도를 나타낸 것이다.
도 1b는 본 발명 백신주의 항원 키트에서의 농도별 반응성을 나타낸 것이다.
도 1c는 본 발명에 따른 재조합 구제역 바이러스의 투과 전자 현미경 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명에 따른 구제역 백신 2 종류를 각각 마우스에 접종하여 구제역 바이러스에 대한 방어능 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 백신을 돼지에서 면역시킨 후 구제역 A형 대표 바이러스들에 대한 항체 수준의 변화를 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명에 따른 구제역 백신 2 종류를 각각 돼지에 면역시킨 후 구제역 바이러스 A형 대표 3종 바이러스들에 대한 방어능 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 바이러스 제작을 위해 사용된 pOManisa-3B333 벡터의 백본 개략도를 도시한 것이다.
도 6은 A-G1-A22 VP1(pO Manisa-3B333클론에서 A Poc VP4, VP2, VP3으로 교체되고 VP1만 A22 VP1으로 교체된 클론)의 플라스미드의 개략도를 도시한 것이다.
도 7은 A G1-A22VP1-G7E 재조합 바이러스를 생산하는 플라스미드의 개략도를 도시한 것이다.
도 8은 A G1-A22VP1-G2E 재조합 바이러스를 생산하는 플라스미드의 개략도를 도시한 것이다.
도 1b는 본 발명 백신주의 항원 키트에서의 농도별 반응성을 나타낸 것이다.
도 1c는 본 발명에 따른 재조합 구제역 바이러스의 투과 전자 현미경 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명에 따른 구제역 백신 2 종류를 각각 마우스에 접종하여 구제역 바이러스에 대한 방어능 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 백신을 돼지에서 면역시킨 후 구제역 A형 대표 바이러스들에 대한 항체 수준의 변화를 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명에 따른 구제역 백신 2 종류를 각각 돼지에 면역시킨 후 구제역 바이러스 A형 대표 3종 바이러스들에 대한 방어능 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 바이러스 제작을 위해 사용된 pOManisa-3B333 벡터의 백본 개략도를 도시한 것이다.
도 6은 A-G1-A22 VP1(pO Manisa-3B333클론에서 A Poc VP4, VP2, VP3으로 교체되고 VP1만 A22 VP1으로 교체된 클론)의 플라스미드의 개략도를 도시한 것이다.
도 7은 A G1-A22VP1-G7E 재조합 바이러스를 생산하는 플라스미드의 개략도를 도시한 것이다.
도 8은 A G1-A22VP1-G2E 재조합 바이러스를 생산하는 플라스미드의 개략도를 도시한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예> 본 발명에 따른 재조합 바이러스 제조
[실험 재료 및 방법]
세포 및 바이러스 준비
ZZ-R 세포는 Dulbecco의 Modified Eagle 's Medium (DMEM)/F12 (Corning, Union City, NJ, USA)에서 유지되었고, BHK 21 세포는 Dulbecco의 Modified Eagle's Medium (DMEM) (Corning)에서 10% 소태아혈청 (FBS) (Gibco BRL, Paisley, UK), 100 U/ml 페니실린, 및 5 % CO2대기에서 100 mg/ml 스트렙토마이신을 보충하였다. BHK 21 현탁 세포는 덱스트란 설페이트 나트륨 염 및 pluronic F-68이 보충된 ProVero-1 (Lonza, Belgium)와 Sodium bicarbonate가 보충된 CD-BHK21에서 유지되었다. 본 실험을 위해 선택된 표적 바이러스 서열은 o1manisa iso87 (Genbank No. AY593823.1), A/Pocheon/001/KOR/2010 (Genbank No. KC588943.1), A22iraq70 iso92 VP1 (Genbank. AY593764.1), BAN GA Sa-197 2013 (Genbank. KJ754939.1) 및 A/SKR/4/2018 (Genebank. MK463492.1)이 사용되었다.
2. 부위 지정 돌연변이 유발 및 서브 클로닝 및 재조합 플라스미드 제조
(1) 재조합 플라스미드 pO1Manisa-3B333의 제작
구제역 O1Manisa 바이러스 전체 유전자(GenBank Accession No. AY593823.1)를 PCR에 의하여 증폭하고, 플라스미드(pBluescript SK II)에 O1Manisa 유전자를 삽입하여 서열번호 1의 서열을 갖는 재조합 플라스미드 pO1Manisa-3B333를 제작하였다. 하기 실험을 위해 서열번호 1의 벡터를 준비하였고, O1manisa iso87 (Genbank No. AY593823.1)의 VP2부터 VP4 부위는 A/Pocheon/001/KOR/2010 (Genbank No. KC588943.1)의 P1 부위의 VP2부터 VP4 부위(서열번호 2에 해당)로 대체되었고 A22iraq70 iso92 VP1 (Genbank. AY593764.1)의 VP1 부위(서열번호 3에 해당)로 대체하여 서열번호 3의 플라스미드를 제조하였다.
이후, ASIA 지역형 중 유전자 아군 G2 (A/SKR/4/2018 (Genebank. MK463492.1))및 VII(BAN GA Sa-197 2013 (Genbank. KJ754939.1))의 VP1 아미노산 140부터 160까지 각각 SGRVRGDLGQLAARVAAQLPA(서열번호 9; 서열번호 5의 염기서열에 해당하는 아미노산 서열) 및 QNRRGDSGPLVVKPATQLPAS(서열번호 10; 서열번호 6의 염기서열에 해당하는 아미노산)을 각각 삽입하여 재조합 플라스미드를 제조하였다.
단, 제작의 pO1Manisa-3B333 작성시 그 과정에서 O1 Manisa의 일부 유전자는 교체되었으며 그 사항은 다음과 같다. 대체된 플라스미드는 3C C142T의 아미노산 치환을 위한 PCR 템플릿으로 사용되었다(5'-ACCATGGATGGAGACACCATG-3(서열번호 11) '및 5'-CACTACAATGTCTTTGTAGGTA-3'(서열번호 12)). 상기 3B1 및 3B2 부위에서 2개의 3B3으로 교체하기 위해 3B1과 3B2가 모두 결실된 full genome cDNA 벡터를 사용하고, 3B1 및 3B2 부위에 PCR 주형으로 합성 3B3 다이머(dimer) 유전자를 사용하여 특정 프라이머 (5’-AGGACCGACCACAAGCTGAAGGACCTTACGAGGGACCGGT-3’(서열번호 13) 및 5’-TCGGTCGGTGGGGCACCACTCTCAGTGACAATCAAGTTCT-3’(서열번호 14))로 증폭된 3B3 다이머 유전자를 삽입하였다.
(2) 재조합 플라스미드 A G1-A22VP1의 제작
제조된 재조합 플라스미드(pO1Manisa-3B333) 중에서, 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자를 한국 지역형 바이러스 A/Pocheon/001/KOR/2010 (Genbank No. KC588943.1)의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환하여 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드(pOm-Apocheon-P1, 특허등록 10-1578444, 2015.10.23.)를 제조하였다. 제조된 pOm-Apocheon-P1을 기초로 하여 중동 백신 표준주인 A22주의 VP1 증폭을 위한 프라이머는 정방향 프라이머(5'-ACCACTACCACCGGGGAG-3'; (서열번호 15)) 및 역방향 프라이머(5'-TTGTTTTGCAGGTGCAATGATC-3'; (서열번호 16))를 사용하였고, 벡터를 증폭시키기 위해 서열번호 4에서의 정방향 프라이머 (5'-CTTCTAAATTTTGACCTGCTCAAATTGGCGGG-3'; (서열번호 17)) 및 역방향 프라이머 (5'-TTGCGCACGGGGGTCAAT-3'; (서열번호 18))를 사용하여 증폭 후, A22 주의 VP1 유전자와 벡터로 사용을 위해 증폭된 pOm-Apocheon-P1을 결착하여, 본 발명의 A G1-A22VP1 플라스미드를 제조하였다(서열번호 4). 최종적으로 전체 염기서열 분석을 통하여 적절히 클로닝(A G1-A22VP1)된 것을 확인하였다.
(3) 재조합 플라스미드 A G1-A22VP1-G7E 및 A G1-A22VP1-G2E의 제작
제조된 재조합 플라스미드 (A G1-A22VP1)의 VP1의 140번째부터 160번째까지의 아미노산을 삽입하기 위해서 PCR 주형으로 합성한 A G1-A22VP1 full genome cDNA 벡터를 사용하고 VII(BAN GA Sa-197 2013 (Genbank. KJ754939.1)의 VP1의 140번째부터 160번째까지 특정 프라이머 5‘-TCGCGGCGCGAGTCGCTGCTCAACTCCCTGCCGCGAGGGTCGCCGCTCA-3’ (서열번호 19) 및 5‘-GCTGTCCCAGGTCACCCCGTACACGCCCACTCGCGAGAGGCCCTAGGTC-3’(서열번호 20)로 삽입하여 A G1-A22VP1-G7E를 제작하였다. 최종적으로 전체 염기서열 분석을 통하여 적절히 클로닝(A G1-A22VP1-G7E)된 것을 확인하였다.그리고 상기의 실험 방법과 동일하게 VP1의 140번째부터 160번째까지의 아미노산을 삽입하기 위해서 PCR 주형으로 합성한 A G1-A22VP1 full genome cDNA 벡터를 사용하고 A/SKR/4/2018 (Genebank. MK463492.1)의 VP1의 140번째부터 160번째까지 특정 프라이머 5‘-TGGTGAAACCCGCCACACAGCTCCCTGCCTCCGCGAGGGTCGCCGCTCAG-3’ (서열번호 21) 및 5‘-CGAGAGGACCCGAGTCACCTCGCCGGTTTTGCGCGAGAGGCCCTAGGTC-3’(서열번호 22)로 삽입하여 A G1-A22VP1-G2E를 제작하였다. 구축된 재조합 플라스미드를 서열 분석하여 아미노산 삽입을 확인하였다. 최종적으로 전체 염기서열 분석을 통하여
적절히 클로닝(A G1-A22VP1-G2E)된 것을 확인하였다. 최종적으로 제조된 플라스미드의 서열은 각각 서열번호 7, 서열번호 8로 확인되었다.
확보된 재조합 플라스미드를 분리 및 정제하기 위해서 CEOS competent cell(Yeastern Biotech, FYE609)를 이용하여 형질전환(Transformation)하였고 LB Broth Base (Invitrogen, 12780052)를 이용하여 플라스미드를 복제하였다. 복제한 플라스미드를 Plasmid DNA purification (MN, REF2101/005)를 이용하여 재조합 플라스미드를 분리 및 정제를 하였다.
이하에서는 SGRVRGDLGQLAARVAAQLPA를 삽입하여 제조된 재조합 바이러스(A-G1-A22VP1-G7E)를 실시예 1, QNRRGDSGPLVVKPATQLPAS를 삽입하여 제조된 재조합 바이러스(A-G1-A22VP1-G2E)를 실시예 2라 한다.
3. 바이러스 회수 및 세포 배양
재조합 cDNA 플라스미드는 제한 효소 SpeⅠ(NEB, Beverly, USA) 처리를 통해 선형화되었으며 감염성 cDNA는 BHK-T7-9 세포 (세포주 여기서 T7 RNA 중합 효소가 발현됨) 37℃에서 48 시간 동안 배양한 후, 바이러스를 3회의 동결-해동 주기로 수확하고 키메라 바이러스를 사용하여 신선한 ZZ-R 세포를 감염시켰다. 야생형 FMDV 및 재조합 바이러스와의 분화를 위해 구조 및 비구조 단백질을 FMDV 래피드 키트(Princeton Bio Meditech Corporation, USA)를 사용하여 확인하였다. 그 결과, 서열번호 7의 플라스미드에서 분리된 재조합 바이러스 G1-A22VP1-G7E는 서열번호 7의 646번째 내지 8926번째 서열을 갖는 것으로 확인되었고(이하 실시예 1), A G1-A22VP1-G2E의 재조합 바이러스는 서열번호 8의 642번째 내지 8926번째 서열을 갖는 것(이하 실시예 2)으로 확인되었다.
4. 백신 항원을 위한 바이러스 정제
백신 제조용 항원을 생산하기 위해 FMDV 생산을 위한 세포인 BHK21 또는 BHK21-현탁 세포를 사용하여 상기 재조합 바이러스를 복제하였다. 감염 16 시간 후, BHK 21 현탁 세포에서 성장한 바이러스는 완전한 CPE가 관찰되었을 때 동결 및 해동에 의해 수확되었다. 이원 에틸렌 이민 (BEI)으로 바이러스를 비활성화한 후 세포 파편을 제거하였다. 정제된 배양물에서 비활성화된 바이러스는 7.5% PEG 6000 (81260; Sigma Aldrich, WI, USA) 및 2.3% NaCl로 4℃에서 밤새 침전되었고, 펠릿은 Tris-KCl (TK) 버퍼에 재현탁되었다. 재현탁된 펠렛은 4℃에서 SW41 로터에서 4 시간 동안 30,000rpm에서 TN 버퍼에서 15-45 % 수크로스 구배를 통해 원심 분리하여 정제되었으며, 항원 양은 259nm에서 분광 광도계 분석에 의해 결정되었다. 정제된 항원은 탄소 코팅된 구리 그리드에 별도로 흡착되고 투과 전자 현미경 (Hitachi H7100FA, Tokyo, Japan)으로 시각화되었다.
5. 실험 백신의 준비
백신은 이전 연구에서 사용한 방법을 사용하여 제조되었다. 즉, 상기 3.에서 수득한 재조합 바이러스인 실시예 1과 실시예 2로부터 정제된 146S 항원 15μg (1 회분)을 ISA206VG (Seppic, Paris, France)와 혼합하였다. 1 : 1 (v/v) 및 10% 수산화 알루미늄 겔 (Rehyragel® HPA; General Chemical, NJ, USA)과 사포닌 0.5μg을 이 혼합물에 혼합하여 수-중유수(water-in-oil-in-water) 백신을 제조하였다.
6. 성숙 C57BL/6 마우스에서 백신 접종 후 바이러스 공격
본 실험에는 KOSA-BIO (대한민국)에서 공급한 7 주령 C57BL/6 암컷 마우스를 사용하였다. 동물은 APQA에 보관되었고 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아 사용되었다. ISA 206 (Seppic, France)과 혼합된 항원 (1.5, 0.375, 0.093, 및 0.023) 용량 그룹 (돼지 또는 소에 대한 백신 접종의 용량 (15 μg/용량)) 및 10 % 수산화 알루미늄 겔 보조제를 투여하였다. 백신 접종 후 7 일(dpv) 후, APOC 바이러스 접종할 마우스에서 바이러스 접종 1일 전에 IFN-aR 1mg/0.1mL 복강내 투여한 후 1x10^4 TCID50 바이러스를 공격접종하였다. A NEP 바이러스를 마우스에서 바이러스 접종 1시간 전에 IFN-aR 항체 0.125mg/0.1mL 복강내 투여한 후 1x10^4 TCID50 바이러스를 공격접종하였다. 구제역 A-GP 바이러스를 마우스에서 접종 1 시간 전에 IFN-aR 항체를 0.125mg/0.1mL 로 복강내 투여한 후 1x10^5 TCID50 바이러스를 공격접종하였다. 그리고 7 일 동안 생존 유무를 관찰하였다.
7. 구조 단백질 항체 검출을 위한 ELISA
혈청 내 FMDV의 구조 단백질은 VDProRⓡ FMDV Type A AB ELISA (MEDIAN Diagnostics, Republic of Korea)을 사용하여 검출되었다. MEDIAN 키트 경우 샘플이 0.6의 이하 값을 반영하면 동물은 면역 반응을 보이는 것으로 간주했다.
8. 돼지를 대상으로 한 실험 백신의 면역원성 시험
돼지(n=5)에 ISA 206, 사포닌 및 수산화 알루미늄 겔 보조제와 혼합된 15μg/ml 항원을 접종하였다. 1차 백신 접종 후 4주 후 추가 백신 접종하여 총 12 주 (0, 7, 14, 21, 28, 42, 68, 84 dpv)까지 혈청을 수집하였다.
9. 돼지를 대상으로 한 실험 백신의 공격실험 시험
돼지(n=13)에 ISA 206, 사포닌 및 수산화 알루미늄 겔 보조제와 혼합된 15μg/ml 항원을 접종하였다. 백신 접종 후 APOC, A GP, A NEP 바이러스를 1x10^5 TCID50 공격접종하여 (0, 2, 4, 6, 8 dpc)까지 혈청을 수집하였고 타액은 8일까지 매일 수집하였다. 동물은 APQA에 보관되었고 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아 사용되었다.
10. 돼지의 바이러스 중화 테스트
백신 접종 후 돼지에서 혈청 샘플을 채취하여 56℃에서 30분 동안 열(heat)-불활성화시켰다. 시험 혈청을 FMDV 100 TCID50과 함께 1시간 동안 배양한 후, LFBK 세포를 플레이트에 첨가하고 3일 동안 배양하였다. 역가를 결정하기 위해 CPE를 확인하였으며, 이는 바이러스의 100 TCID50을 중화시키기 위해 상호 혈청 희석액의 log10으로 계산되었다. FMDV A G1-A22VP1-G7E, A G1-A22VP1-G2E, A POC, A22, A GP, A NEP이 돼지 혈청에서 VNT에 사용되었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시되었다. 차이는 P <0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
11. 통계분석
접종 군과 음성 대조군 간의 통계적 관계를 확인하였다. T-테스트는 GraphPad Prism (ver. 5.0; GraphPad Software, USA) 및 GraphPad Instant (ver. 3.05; GraphPad Software)를 사용하여 수행되었다.
[실험예1] 재조합 FMDV의 특성 평가
O1manisa 바이러스의 전체 게놈 cDNA는 T7 RNA 중합 효소의 결합 부위 하에서 클로닝되었다. O1manisa에 대한 A/SKR/Pocheon/2010 P1의 VP4, VP2, VP3과 A22 P1의 VP1 대체되었고 A/Ban/2013(GⅦ)과 A/SKR/GP/2018(G2)의 에피토프(140-160번째 아미노산)는 새로운 백신 제조를 위해 추가되었다. 바이러스는 cDNA로 형질감염된 세포에서 회수되었다(도 1a). 바이러스 게놈의 3B1B2는 3B3B3로 대체되었는데, 이는 대체 부위에 의한 반응없이 NSP 검출이 가능한 간단한 항원 진단 키트(측방 유동 장치; LFD)를 사용하여 백신 바이러스 및 구제역 야생형 균주와 구별할 수 있었다(도 1b). 또한 본 실험의 백신 바이러스는 전자 현미경을 통해 25nm에서 예상되는 FMDV 크기를 확인하였다(도 1c).
[실험예2] 백신 접종 후 마우스에서 3종 바이러스 백신 접종 테스트 평가
실시예 1에 대한 백신을 제작하고 마우스에 면역 후 (도 2a), 각종 바이러스에 대한 방어능 결정 시험을 실시하였다. 공격 바이러스는 A Pocheon, A GP 2018, A Nep 17바이러스를 접종하여 백신을 희석하여 방어능 PD50을 결정하였다. 방어역가는 A Pocheon, A GP 2018 에 대해서는 >128 mPD50, A Nep 17dp 대해서는 97 mPD50에 해당하는 결과를 확인하였다.
실시예 2에 대한 백신을 제작하고 마우스에 면역 후(도 2b), 각종 바이러스에 대한 방어능 결정 시험을 실시하였다. 공격 바이러스는 A Pocheon, A GP 2018, A Nep 17바이러스를 접종하여 백신을 희석하여 방어능 PD50을 결정하였다. 방어역가는 A Pocheon, 에 대해서는 >128 mPD50, A GP 2018 의 경우는 >128 mPD50, A Nep 17dp 대해서는 32 mPD50에 해당하는 결과를 확인하였다.
[실험예3] 돼지에서 면역화 후 여러 바이러스 균주에 대한 항체 비교
실험 백신으로 면역화된 돼지에서 3종 바이러스에 대한 항체의 역가를 비교하기 위해 바이러스 중화 테스트를 수행하였다. 돼지는 1차 백신 접종 후 3주 만에 상당히 높은 수준의 항체 역가 (> 1 : 100)를 유도하였다. 2차 접종 후 면역원성은 점진적으로 증가하는 경향을 보였다. Sea97/G1, G2, GⅦ 대한 중화 항체의 역가는 높은 것으로 결정되었다(도 3).
[실험예4] 백신 접종 후 돼지에서 3종 바이러스 공격접종 테스트
실시예 1에 대한 백신을 제작하고 돼지에 면역 후(도 4a), 각종 바이러스에 대한 공격접종을 실시하였다. 공격 바이러스는 A Pocheon, A GP 2018, A Nep 17바이러스를 접종하였다. 방어 역가는 A Pocheon, A GP 2018 및 A Nep 17에 대해서는 모두 방어하였다.
실시예 2에 대한 백신을 제작하고 돼지에 면역 후(도 4b), 각종 바이러스에 대한 공격접종을 실시하였다. 공격 바이러스는 A Pocheon, A GP 2018, A Nep 17바이러스를 접종하였다. 방어역가는 A Pocheon 및 A GP 2018에 대해서 모두 방어하였다. 반면에 A Nep 17에 대해서 4두 중 1두는 임상증상이 6점으로 심하였고 1두는 임상증상이 1점으로 미약하게 있었고 나머지 2두에 대해서는 모두 방어하였다.
결론적으로, 본 발명에 따른 재조합 바이러스를 포함한 A 실시예 1 및 실시예 2에 따른 백신주들은 돼지에서 FMDV A형 3종 계열의 바이러스에 대해서 목적동물 실험에서 방어하였으므로 넓은 광범위 영역의 백신으로 사용 가능할 것으로 판단된다.
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ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc atatgtaata cgactcacta tagggttgaa agggggcgct 660
agggtctcac ccctagcatg ccaacgacag ctcctacgtc gcactccaca ctaacgtttg 720
tgtgcgcgcg ggaaccgatg gacttttgtt cacccaccta cagttggact cacggcaccg 780
cgtggccatt ttagctgggt tgtgcggacg aacactgctt gcgcatctcg cgtgaccggt 840
tagtactctt accactatcc gcctacttgg tcgttagcgc tgtcctgggc actcttgttg 900
ggggctgttc aacgctctac ggtctcccct gcgtaacaga ctacggtgtt ggggccgctt 960
cgtgcgagcc gatcgcttgg tgtgcctcgg ctgtcgcccg aagcccgcct ttcacccccc 1020
ccccccccct aggttttacc gtcgttcccg acgttaatgg ggaaacaacc acaagcttaa 1080
caccgtcttg cccgacgtaa aagggctgca accaaaaagc ttgtgccgcc tttcccggcg 1140
ttaatgggag gtaaccacaa gacaaacctt cacccggaag taaaacggca acttcacaca 1200
gttttgcccg ttttcgtgag aaatgggccg tcaacgcacg aaacgcgccg tcgcttgagg 1260
aggacttgta caaacacgat ctatgcaggt ttccacaact gacacaaacc gtgcaacttg 1320
aaaccccgcc tggtctttcc aggtctagag gggcgacatt ttgtactgtg cttgactcca 1380
cgctcggtcc actagcgagt gttagtagta gcactgttgc ttcgtagcgg agcatgatgg 1440
ccgtgggagc ttccccttgg taacaaggac ccacggggcc aaaagccacg tcctaccgga 1500
cccatcatgt gtgcaaaccc agcacggcaa ctttactgcg aaaaccactt taaggtgaca 1560
ctgatactgg tactcaatca ctggtgacag gctaaggatg cccttcaggt accccgaggt 1620
aacacgcgac actcgggatc tgagaagggg actggggctt ctttaaaagt gcccagttta 1680
aaaagcttct atgcctgaat aggcgaccgg aggccggcgc cttttcactg ttttactact 1740
gttttcatga atacaactga ctgtttcacc gccctgttac acgctctcag agagatcaaa 1800
acactgtttc ttttacggac acaaggaaag atggaattca cactttacaa cggtgagaag 1860
aaaaccttct actccagacc caacaaccac gacaactgct ggcttaacac cattctccag 1920
ttgttcaggt atgttgatga gcctttcttt gactgggtct acgactcgcc tgaaaacctc 1980
actcttgagg caatcaaaca gttggaagag acaaccggtc ttgagctgca cgagggtgga 2040
ccacccgctc tcgtcatctg gaacatcaaa cacttgcttc acaccggaat cggcactgcc 2100
tcacgcccta gcgaggtgtg tatggtggac ggaacggaca tgtgtttagc tgattttcat 2160
gctggcattt tcctgaaagg acaggaacat gctgtgttcg cctgtgtcac ctccaacggg 2220
tggtacgcga ttgatgacga ggacttttac ccttggacac cggacccgtc cgacgttctg 2280
gtgtttgtcc cgtacgatca agaaccgctt aacggagagt ggaaaacaaa ggtccagaaa 2340
aggctcaagg gagccgggca atccagcccg gcaaccgggt cacagaacca atcaggcaac 2400
actgggagca tcatcaacaa ttactacatg cagcagtacc aaaactccat ggacacacaa 2460
cttggtgaca acgctacaag cggaggctca aacgaggggt ccacggacac aacctccacc 2520
cacacaacca acactcagaa caacgactgg ttctcgaagc tggccagttc cgctttcagc 2580
ggtcttttcg gcgctcttct cgccgacaag aaaaccgagg agaccactct tctcgaggac 2640
cgcatcctca ctactcgtaa cggacacacc acctcgacaa cccagtcgag cgttggagtc 2700
acgtacgggt atgcaacagc tgaggatttc gtgagcgggc caaacacctc tggtctcgag 2760
accagggttg cccaggcaga gcggttcttt aaaacccacc tgttcgactg ggtcaccagt 2820
gacccattcg gacggtgcca cctgctggaa cttccaactg accacaaagg tgtctacggc 2880
agcctgaccg actcgtatgc ttatatgagg aacggctggg atgttgaagt cactgcagtg 2940
ggaaaccagt tcaatggagg atgcctgttg gtggccatgg tgccagaact ttgctccata 3000
cagaagaggg agctgtacca gctcacgctc tttcctcacc agttcatcaa ccctcggacg 3060
aacatgacag cacacatcac tgtgcccttt gttggcgtca accgttatga ccagtacaag 3120
gtacacaaac cttggaccct cgtggttatg gttgtagccc ccctgactgt caacagtgaa 3180
ggtgccccgc aaatcaaggt gtatgccaac atcgcaccta ccaacgtaca cgtcgcgggt 3240
gagttccctt ccaaagaggg gatcttccct gtggcttgca gcgatggtta tggcggtctg 3300
gtgaccactg acccgaaaac ggctgacccc gcttacggga aagtgtttaa ccccccccgc 3360
aacatgttgc cggggcggtt caccaatttt cttgacgtgg ctgaggcgtg ccccacgttt 3420
ctccacttcg agggtgacgt gccatacgtg accacgaaga cggattcaga cagggtgctc 3480
gctcagttcg acttgtcttt ggcagcaaag cacatgtcga acaccttcct tgcaggtctc 3540
gcccagtact acacacagta cagcggcacc atcaacctgc acttcatgtt cacagggcct 3600
actgacgcga aggcgcgtta catgattgcg tatgctcctc ctggcatgga accacctaaa 3660
acgccagagg cggctgccca ctgcattcat gctgaatggg acacagggtt gaactcaaaa 3720
ttcacatttt caatccctta cctttcggcg gctgattacg cttacacagc gtctgacact 3780
gctgagacca caaatgtaca gggatgggtt tgcctgtttc aaataacaca cgggaaagct 3840
gacggcgacg cactggtcgt tttggctagc gccggaaagg actttgagct gcgcctgccg 3900
gtggatgctc gcacacagac tacctccgcg ggcgagtcag ctgaccccgt gaccgccacc 3960
gttgagaatt acggtggcga gacacaggtc cagaggcgcc aacacacgga cgtctcattt 4020
atattagaca gatttgtgac agtgacacca aaagaccaaa ttaatgtatt ggacctgatg 4080
caaacccctg ctcacacttt ggtgggagca ctccttcgta ctgccactta ctatttcgct 4140
gacttagagg tggcagtgaa gcacaaggga aacctcacct gggtcccgaa cggggcgcct 4200
gaagcggcgt tggacaacac caccaaccca acagcttacc acaaggcacc actcacccga 4260
cttgcactgc cttacacggc gccacaccgc gtgttggcta ctgtttacaa cgggaactgc 4320
aagtatggtg acggcacggt ggccaatgtg agaggtgacc tgcaagtgtt ggcccagaag 4380
gcggcgagag cgctgcctac ctccttcaac tacggtgcca ttaaagctac tcgggtgact 4440
gaactgcttt accgcatgaa gagggctgag acatactgcc cccggcctct tttggccatt 4500
cacccggacc aggctagaca caagcagaag attgtggcac cggtggaaca gcttctaaat 4560
tttgacctgc tcaaattggc gggagatgtg gagtccaacc ctgggccctt cttcttctcc 4620
gacgtcaggt caaatttctc aaaactggta gaaaccatca atcagatgca ggaggacatg 4680
tcaacaaaac acgggcctga ctttaaccgg ttggtgtccg catttgagga attggccact 4740
ggagtgaagg ctatcagggc cggtctcgac gaggccaaac cctggtacaa actcatcaag 4800
ctcctgagcc gcttgtcgtg catggccgct gtagcagcac ggtcaaagga cccagtcctt 4860
gtggccatca tgctggctga caccggtctt gagattctgg acagcacctt tgtcgtgaag 4920
aagatctccg actcgctctc cagtctcttt cacgtgccgg cccccgtctt cagtttcgga 4980
gccccgattc tgttggccgg gttggtcaaa gtcgcctcga gtttcttccg gtccacaccc 5040
gaagaccttg agagagcaga aaaacagctc aaagcacgtg acattaacga catattcgcc 5100
attctcaaga acggcgagtg gctggtcaag ctgatccttg ccatccgcga ctggatcaaa 5160
gcgtggatcg cctcagaaga aaagtttgtc accatgacgg acttggtgcc tggtatcctt 5220
gaaaagcagc gggatctcaa cgacccgagt aagtacaagg aagccaagga gtggctcgac 5280
aacgcgcgcc aggcgtgttt gaagagcggg aacgttcaca ttgccaattt gtgcaaagtg 5340
gtcgccccgg cacccagcaa gtcgagaccc gaacccgtgg tcgtttgcct ccgcggcaaa 5400
tccggccagg ggaagagttt ccttgcgaac gtgctcgcgc aagcaatctc cacccacttc 5460
accggcagaa ctgattcggt ttggtactgc ccgcctgacc ctgaccactt cgacggttac 5520
aaccagcaga ccgttgtcgt gatggacgat ttgggccaga accccgatgg caaggacttc 5580
aagtacttcg cccagatggt ttcgaccacg gggttcatcc cgcccatggc ctcgcttgag 5640
gacaaaggca agcctttcaa cagcaaagtc atcattgcta ccaccaacct gtactcgggt 5700
ttcaccccga gaacaatggt gtgtcctgac gcgctgaacc ggaggttcca ctttgacatc 5760
gacgtgagtg ccaaggacgg gtacaaagtt aacaacaaat tggacataat caaagctctt 5820
gaagacaccc acaccaaccc agtggcgatg ttccaatacg actgtgccct tctaaacggt 5880
atggcagttg aaatgaagag aatgcaacag gatatgttca agcctcaacc acccctccag 5940
aacgtgtacc aactcgttca cgaggtgatt gaacgggtcg agctccacga gaaggtgtcg 6000
agccacccga ttttcaaaca gatatcaatt ccttcccaaa agtctgtgtt gtacttcctc 6060
attgagaaag gccaacacga agcagcaatt gaattctttg agggaatggt gcatgactcc 6120
atcaaggaag agctccggcc cctcatccaa cagacctcat ttgtgaaacg cgcttttaag 6180
cgcctgaagg aaaactttga gactgttgcc ctgtgtttga ctcttttggc aaacatagtg 6240
atcatgatcc gcgagactcg caagagacaa cagatggtgg acgatgcagt gaatgactac 6300
attgagaagg caaacatcac cacagatgac aagactcttg acgaggcgga aaagaaccct 6360
ctagagacca gcggtgccag cactattggt ttcagagaga gaactctccc ggggcacaag 6420
gcgagcgatg acgtgagctc cgagcccgcc aaacccgtgg aggaccgacc acaagctgaa 6480
ggaccttacg agggaccggt gaagaagcct gtcgctttga aagtgaaagc taagaacttg 6540
attgtcactg aggggccata tgaaggacca gtgaagaaac ctgtcgcttt gaaagtgaaa 6600
gcaaaagccc cgattgtcac tgaaggaccc tacgagggac cggtgaagaa gcctgtcgct 6660
ttgaaagtga aagccaagaa cttgattgtc actgagagtg gtgccccacc gaccgacttg 6720
cagaagatgg tcatgggcaa cactaagcct gttgagctca tcctcgacgg gaagacggta 6780
gccatctgct gtgctaccgg agtgtttggc actgcctacc tcgtacctcg tcacctcttc 6840
gcggagaagt acgacaagat aatgttggac ggtagagcca tgacagacag tgactacaga 6900
gtgtttgagt ttgagattaa agtaaaagga caggacatgc tctcagacgc tgcactcatg 6960
gtgcttcacc gtgggaaccg cgtgagagac atcacgaaac attttcgtga cacagcaaga 7020
atgaagaaag gcacccccgt tgtcggtgtg atcaacaacg ccgacgttgg gagactgatt 7080
ttctctggag aggcccttac ctacaaagac attgtagtga ccatggatgg agacaccatg 7140
ccgggcctgt ttgcctacag agccgccacc aaggctggtt actgcggggg agccgttctc 7200
gccaaggacg gagccgacac attcatcgtt ggcacccact ccgcaggtgg taacggagtt 7260
ggatactgct cgtgcgtgtc caggtccatg ctcctgaaaa tgaaggcaca cattgaccct 7320
gaaccacacc acgaggggtt gattgttgat accagagatg tggaagagcg cgtgcatgtc 7380
atgcgtaaaa ccaagcttgc acccaccgtg gcacacggtg tgtttaaccc tgaatttggt 7440
cccgctgcct tgtccaacaa ggacccgcgg ctgaacgaag gggttgtcct cgatgaagtc 7500
atcttctcca aacacaaggg agacacgaaa atgtctgagg aggacaaagc gctgttccgc 7560
cgctgcgctg ccgactacgc gtcgcacttg cacagcgtgc tggggacggc aaatgcccca 7620
ttgagcatct atgaggccat caaaggcgtc gacgggctcg atgccatgga gccggacacc 7680
gcgcccggcc tcccctgggc cctccagggg aaacgccgtg gtgcgttgat tgacttcgag 7740
aacggcacgg tcggacccga agtcgaggct gccctaaagc tcatggagaa aagagagtac 7800
aaatttgctt gccagacctt cctgaaagac gagattcgtc cgatggaaaa agtacgtgct 7860
ggcaagactc gcattgtcga cgttttgccc gtggaacaca ttctttacac caggatgatg 7920
attggcagat tctgtgctca aatgcacaca aacaatggac cgcagattgg ctcagcggtc 7980
ggttgcaatc ctgatgttga ttggcaaaga tttggcacac attttgctca gtacagaaac 8040
gtgtgggatg tggactattc ggcctttgat gctaaccact gcagtgacgc aatgaacatc 8100
atgtttgagg aggtatttcg cacagacttc ggtttccacc caaatgctga gtggattctg 8160
aagactcttg tgaacacgga gcacgcctat gagaacaaac gtatcactgt tgagggcggg 8220
atgccgtctg gctgttccgc gacaagcatc atcaacacaa ttttgaacaa catttatgtg 8280
ctctacgctc ttcgtagaca ctatgaggga gttgagctgg acacctacac catgatctcc 8340
tacggagatg acatcgtggt tgcaagtgac tacgatctgg attttgaggc tctcaaaccc 8400
cacttcaaat ctcttggtca aaccatcact ccagctgaca aaagcgacaa aggttttgtt 8460
cttggtcact ccattaccga tgtcactttc ctcaaaagac acttccacat ggactatgga 8520
actgggtttt acaaacctgt gatggcctca aagaccctcg aggccattct ctcctttgca 8580
cgccgtggga ccatacagga gaagttgatc tccgtggcag gactcgccgt ccactcagga 8640
cctgacgagt accggcgtct ctttgagccc ttccagggtc tcttcgagat tccaagctac 8700
agatcacttt acctgcgttg ggtgaacgcc gtgtgcggtg acgcataatc cctcagatgt 8760
cacaattggc agaaagactc tgaggcgagc gacgccgtag gagtgaaaag cccgaaaggg 8820
cttttcccgc ttcctattcc aaaaaaaaaa aaaaaaacta gttctagagc ggccgccacc 8880
gcggtggagc tccagctttt gttcccttta gtgagggtta attgcgcgct tggcgtaatc 8940
atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 9000
agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 9060
tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg 9120
aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 9180
cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 9240
ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 9300
ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 9360
cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 9420
actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 9480
cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 9540
tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 9600
gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 9660
caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 9720
agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 9780
tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 9840
tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 9900
gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 9960
gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 10020
aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 10080
atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 10140
gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 10200
acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 10260
ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 10320
tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 10380
ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 10440
ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 10500
atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 10560
taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 10620
catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 10680
atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 10740
acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 10800
aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 10860
ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 10920
cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 10980
atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 11040
ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cac 11093
<210> 2
<211> 1572
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP4, VP2, VP3 of A Pocheon
<400> 2
ggggcagggc aatctagccc tgccaccggg tcacagaacc agtcaggcaa taccggcagc 60
attattaaca actactacat gcagcagtac cagaactcca tggacacaca acttggtgac 120
aacgccatca gcggaggatc caacgagggg tccacggaca caacctctac ccacacaacc 180
aacacccaaa acaatgactg gttctcaaaa ctggcaagtt ccgcgttcac cggtcttttc 240
ggcgcactgc tcgccgacaa gaagaccgaa gagacaactc ttctggagga ccgtatcctc 300
accactcgta atggacacac cacttctaca actcagtcga gtgtgggggt cacctacggg 360
tattcaactg gtgaggacca cgtttctgga cctaacacat caggtttgga gacgcgggtg 420
gtacaagctg aaaggttctt caagaagcac ttgtttgatt ggacgacgga caaacccttt 480
ggtcacgttg aaaagctgga acttcccact gatcacaaag gtgtctacgg acagctggtg 540
gactcctttg catacatgag aaatggctgg gacgtggagg tgtctgctgt tggcaaccag 600
ttcaacggcg ggtgccttct cgtggccatg gtacctgagt ttaaggagtt caccacacgt 660
gaaaagtacc agctcaccct gttcccccac cagttcatta gccccagaac caacatgacc 720
gcgcacatca cggtcccgta ccttggtgtg aacaggtatg accagtacaa caaacacaaa 780
ccctggacgt tggtggtgat ggtggtttca ccacttacca ctagctccat tggtgcatca 840
cagattaagg tctacaccaa tatcgcccct acccacgttc acgtggctgg cgagctcccg 900
tcgaaagagg ggatcgtgcc ggtcgcctgc tcggacgggt acggtggcct ggtgacaaca 960
gaccctaaaa cagctgaccc tgcttacggt atggtgtaca acccacctag gaccaactac 1020
cccgggcggt ttacaaactt gttggacgtg gcagaggcgt gtcccacctt cctctgtttc 1080
gacgacggga aaccgtatgt tgtgacaaga gcggatgagc agcgcctctt ggccaagttt 1140
gacctttccc ttgctgcaaa gcacatgtca aacacctacc tttcagggat agcacagtac 1200
tacgcacagt actctggcac catcaatttg cacttcatgt ttactggttc cactgactca 1260
aaggcccgtt acatggtggc ttacgtcccg cctggcgtga caacgccacc ggacacgcct 1320
gagagagctg cgcactgcat ccacgcagaa tgggacacgg gcctaaactc caaattcact 1380
ttttcaatcc cgtacgtatc tgctgcagat tacgcgtaca cagcgtccga tgtggcagac 1440
acaacaaacg tacagggatg ggtttgcatc taccaaatca cccacgggaa ggccgaacaa 1500
gacactttgg tcgtgtcggt cagcgccggc aaagactttg agctgcgcct ccccattgac 1560
ccccgtgcgc aa 1572
<210> 3
<211> 633
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP1 of A22(A22iraq70 iso92)
<400> 3
accactacca ccggggagtc tgcagaccct gtcaccacca ctgttgaaaa ctacggcggt 60
gagacacaag tccaacgacg tcagcacacc gacgttactt tcataatgga cagatttgta 120
aagatacaaa acttgaaccc cacacatgtc attgacctca tgcaaaccca ccaacacggg 180
ttggtaggtg ccctgttacg tgctgctacg tactacttct ctgacctgga gattgtggta 240
cgccatgacg gtaacctaac ctgggtaccc aatggagcac ccgaggcagc tctgtctaac 300
acgggcaacc ccaccgccta cctcaaggca ccatttacga ggctcgcgct cccctacacc 360
gcgccacacc gcgtgttggc aacagtgtac aacgggacga gcaagtactc cgcaggtggt 420
acgggcagac ggggcgacct agggcctctc gcggcgaggg tcgccgctca gcttcctgct 480
tctttcaact ttggtgcaat tcaagccacg accatccacg agctcctcgt gcgcatgaag 540
cgtgccgaac tctactgccc cagaccactg ttggcagtgg aggtgtcgtc tcaagacaga 600
cacaaacaga agatcattgc acctgcaaaa caa 633
<210> 4
<211> 11099
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A-G1-A22 VP1 plasmid
<400> 4
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc atatgtaata cgactcacta tagggttgaa agggggcgct 660
agggtctcac ccctagcatg ccaacgacag ctcctacgtc gcactccaca ctaacgtttg 720
tgtgcgcgcg ggaaccgatg gacttttgtt cacccaccta cagttggact cacggcaccg 780
cgtggccatt ttagctgggt tgtgcggacg aacactgctt gcgcatctcg cgtgaccggt 840
tagtactctt accactatcc gcctacttgg tcgttagcgc tgtcctgggc actcttgttg 900
ggggctgttc aacgctctac ggtctcccct gcgtaacaga ctacggtgtt ggggccgctt 960
cgtgcgagcc gatcgcttgg tgtgcctcgg ctgtcgcccg aagcccgcct ttcacccccc 1020
cccccccccc ctaggtttta ccgtcgttcc cgacgttaat ggggaaacaa ccacaagctt 1080
aacaccgtct tgcccgacgt aaaagggctg caaccaaaaa gcttgtgccg cctttcccgg 1140
cgttaatggg aggtaaccac aagacaaacc ttcacccgga agtaaaacgg caacttcaca 1200
cagttttgcc cgttttcgtg agaaatgggc cgtcaacgca cgaaacgcgc cgtcgcttga 1260
ggaggacttg tacaaacacg atctatgcag gtttccacaa ctgacacaaa ccgtgcaact 1320
tgaaaccccg cctggtcttt ccaggtctag aggggcgaca ttttgtactg tgcttgactc 1380
cacgctcggt ccactagcga gtgttagtag tagcactgtt gcttcgtagc ggagcatgat 1440
ggccgtggga gcttcccctt ggtaacaagg acccacgggg ccaaaagcca cgtcctaccg 1500
gacccatcat gtgtgcaaac ccagcacggc aactttactg cgaaaaccac tttaaggtga 1560
cactgatact ggtactcaat cactggtgac aggctaagga tgcccttcag gtaccccgag 1620
gtaacacgcg acactcggga tctgagaagg ggactggggc ttctttaaaa gtgcccagtt 1680
taaaaagctt ctatgcctga ataggcgacc ggaggccggc gccttttcac tgttttacta 1740
ctgttttcat gaatacaact gactgtttca ccgccctgtt acacgctctc agagagatca 1800
aaacactgtt tcttttacgg acacaaggaa agatggaatt cacactttac aacggtgaga 1860
agaaaacctt ctactccaga cccaacaacc acgacaactg ctggcttaac accattctcc 1920
agttgttcag gtatgttgat gagcctttct ttgactgggt ctacgactcg cctgaaaacc 1980
tcactcttga ggcaatcaaa cagttggaag agacaaccgg tcttgagctg cacgagggtg 2040
gaccacccgc tctcgtcatc tggaacatca aacacttgct tcacaccgga atcggcactg 2100
cctcacgccc tagcgaggtg tgtatggtgg acggaacgga catgtgttta gctgattttc 2160
atgctggcat tttcctgaaa ggacaggaac atgctgtgtt cgcctgtgtc acctccaacg 2220
ggtggtacgc gattgatgac gaggactttt acccttggac accggacccg tccgacgttc 2280
tggtgtttgt cccgtacgat caagaaccgc ttaacggaga gtggaaaaca aaggtccaga 2340
aaaggctcaa gggggcaggg caatctagcc ctgccaccgg gtcacagaac cagtcaggca 2400
ataccggcag cattattaac aactactaca tgcagcagta ccagaactcc atggacacac 2460
aacttggtga caacgccatc agcggaggat ccaacgaggg gtccacggac acaacctcta 2520
cccacacaac caacacccaa aacaatgact ggttctcaaa actggcaagt tccgcgttca 2580
ccggtctttt cggcgcactg ctcgccgaca agaagaccga agagacaact cttctggagg 2640
accgtatcct caccactcgt aatggacaca ccacttctac aactcagtcg agtgtggggg 2700
tcacctacgg gtattcaact ggtgaggacc acgtttctgg acctaacaca tcaggtttgg 2760
agacgcgggt ggtacaagct gaaaggttct tcaagaagca cttgtttgat tggacgacgg 2820
acaaaccctt tggtcacgtt gaaaagctgg aacttcccac tgatcacaaa ggtgtctacg 2880
gacagctggt ggactccttt gcatacatga gaaatggctg ggacgtggag gtgtctgctg 2940
ttggcaacca gttcaacggc gggtgccttc tcgtggccat ggtacctgag tttaaggagt 3000
tcaccacacg tgaaaagtac cagctcaccc tgttccccca ccagttcatt agccccagaa 3060
ccaacatgac cgcgcacatc acggtcccgt accttggtgt gaacaggtat gaccagtaca 3120
acaaacacaa accctggacg ttggtggtga tggtggtttc accacttacc actagctcca 3180
ttggtgcatc acagattaag gtctacacca atatcgcccc tacccacgtt cacgtggctg 3240
gcgagctccc gtcgaaagag gggatcgtgc cggtcgcctg ctcggacggg tacggtggcc 3300
tggtgacaac agaccctaaa acagctgacc ctgcttacgg tatggtgtac aacccaccta 3360
ggaccaacta ccccgggcgg tttacaaact tgttggacgt ggcagaggcg tgtcccacct 3420
tcctctgttt cgacgacggg aaaccgtatg ttgtgacaag agcggatgag cagcgcctct 3480
tggccaagtt tgacctttcc cttgctgcaa agcacatgtc aaacacctac ctttcaggga 3540
tagcacagta ctacgcacag tactctggca ccatcaattt gcacttcatg tttactggtt 3600
ccactgactc aaaggcccgt tacatggtgg cttacgtccc gcctggcgtg acaacgccac 3660
cggacacgcc tgagagagct gcgcactgca tccacgcaga atgggacacg ggcctaaact 3720
ccaaattcac tttttcaatc ccgtacgtat ctgctgcaga ttacgcgtac acagcgtccg 3780
atgtggcaga cacaacaaac gtacagggat gggtttgcat ctaccaaatc acccacggga 3840
aggccgaaca agacactttg gtcgtgtcgg tcagcgccgg caaagacttt gagctgcgcc 3900
tccccattga cccccgtgcg caaaccacta ccaccgggga gtctgcagac cctgtcacca 3960
ccactgttga aaactacggc ggtgagacac aagtccaacg acgtcagcac accgacgtta 4020
ctttcataat ggacagattt gtaaagatac aaaacttgaa ccccacacat gtcattgacc 4080
tcatgcaaac ccaccaacac gggttggtag gtgccctgtt acgtgctgct acgtactact 4140
tctctgacct ggagattgtg gtacgccatg acggtaacct aacctgggta cccaatggag 4200
cacccgaggc agctctgtct aacacgggca accccaccgc ctacctcaag gcaccattta 4260
cgaggctcgc gctcccctac accgcgccac accgcgtgtt ggcaacagtg tacaacggga 4320
cgagcaagta ctccgcaggt ggtacgggca gacggggcga cctagggcct ctcgcggcga 4380
gggtcgccgc tcagcttcct gcttctttca actttggtgc aattcaagcc acgaccatcc 4440
acgagctcct cgtgcgcatg aagcgtgccg aactctactg ccccagacca ctgttggcag 4500
tggaggtgtc gtctcaagac agacacaaac agaagatcat tgcacctgca aaacaacttc 4560
taaattttga cctgctcaaa ttggcgggag atgtggagtc caaccctggg cccttcttct 4620
tctccgacgt caggtcaaat ttctcaaaac tggtagaaac catcaatcag atgcaggagg 4680
acatgtcaac aaaacacggg cctgacttta accggttggt gtccgcattt gaggaattgg 4740
ccactggagt gaaggctatc agggccggtc tcgacgaggc caaaccctgg tacaaactca 4800
tcaagctcct gagccgcttg tcgtgcatgg ccgctgtagc agcacggtca aaggacccag 4860
tccttgtggc catcatgctg gctgacaccg gtcttgagat tctggacagc acctttgtcg 4920
tgaagaagat ctccgactcg ctctccagtc tctttcacgt gccggccccc gtcttcagtt 4980
tcggagcccc gattctgttg gccgggttgg tcaaagtcgc ctcgagtttc ttccggtcca 5040
cacccgaaga ccttgagaga gcagaaaaac agctcaaagc acgtgacatt aacgacatat 5100
tcgccattct caagaacggc gagtggctgg tcaagctgat ccttgccatc cgcgactgga 5160
tcaaagcgtg gatcgcctca gaagaaaagt ttgtcaccat gacggacttg gtgcctggta 5220
tccttgaaaa gcagcgggat ctcaacgacc cgagtaagta caaggaagcc aaggagtggc 5280
tcgacaacgc gcgccaggcg tgtttgaaga gcgggaacgt tcacattgcc aatttgtgca 5340
aagtggtcgc cccggcaccc agcaagtcga gacccgaacc cgtggtcgtt tgcctccgcg 5400
gcaaatccgg ccaggggaag agtttccttg cgaacgtgct cgcgcaagca atctccaccc 5460
acttcaccgg cagaactgat tcggtttggt actgcccgcc tgaccctgac cacttcgacg 5520
gttacaacca gcagaccgtt gtcgtgatgg acgatttggg ccagaacccc gatggcaagg 5580
acttcaagta cttcgcccag atggtttcga ccacggggtt catcccgccc atggcctcgc 5640
ttgaggacaa aggcaagcct ttcaacagca aagtcatcat tgctaccacc aacctgtact 5700
cgggtttcac cccgagaaca atggtgtgtc ctgacgcgct gaaccggagg ttccactttg 5760
acatcgacgt gagtgccaag gacgggtaca aagttaacaa caaattggac ataatcaaag 5820
ctcttgaaga cacccacacc aacccagtgg cgatgttcca atacgactgt gcccttctaa 5880
acggtatggc agttgaaatg aagagaatgc aacaggatat gttcaagcct caaccacccc 5940
tccagaacgt gtaccaactc gttcacgagg tgattgaacg ggtcgagctc cacgagaagg 6000
tgtcgagcca cccgattttc aaacagatat caattccttc ccaaaagtct gtgttgtact 6060
tcctcattga gaaaggccaa cacgaagcag caattgaatt ctttgaggga atggtgcatg 6120
actccatcaa ggaagagctc cggcccctca tccaacagac ctcatttgtg aaacgcgctt 6180
ttaagcgcct gaaggaaaac tttgagactg ttgccctgtg tttgactctt ttggcaaaca 6240
tagtgatcat gatccgcgag actcgcaaga gacaacagat ggtggacgat gcagtgaatg 6300
actacattga gaaggcaaac atcaccacag atgacaagac tcttgacgag gcggaaaaga 6360
accctctaga gaccagcggt gccagcacta ttggtttcag agagagaact ctcccggggc 6420
acaaggcgag cgatgacgtg agctccgagc ccgccaaacc cgtggaggac cgaccacaag 6480
ctgaaggacc ttacgaggga ccggtgaaga agcctgtcgc tttgaaagtg aaagctaaga 6540
acttgattgt cactgagggg ccatatgaag gaccagtgaa gaaacctgtc gctttgaaag 6600
tgaaagcaaa agccccgatt gtcactgaag gaccctacga gggaccggtg aagaagcctg 6660
tcgctttgaa agtgaaagcc aagaacttga ttgtcactga gagtggtgcc ccaccgaccg 6720
acttgcagaa gatggtcatg ggcaacacta agcctgttga gctcatcctc gacgggaaga 6780
cggtagccat ctgctgtgct accggagtgt ttggcactgc ctacctcgta cctcgtcacc 6840
tcttcgcgga gaagtacgac aagataatgt tggacggtag agccatgaca gacagtgact 6900
acagagtgtt tgagtttgag attaaagtaa aaggacagga catgctctca gacgctgcac 6960
tcatggtgct tcaccgtggg aaccgcgtga gagacatcac gaaacatttt cgtgacacag 7020
caagaatgaa gaaaggcacc cccgttgtcg gtgtgatcaa caacgccgac gttgggagac 7080
tgattttctc tggagaggcc cttacctaca aagacattgt agtgaccatg gatggagaca 7140
ccatgccggg cctgtttgcc tacagagccg ccaccaaggc tggttactgc gggggagccg 7200
ttctcgccaa ggacggagcc gacacattca tcgttggcac ccactccgca ggtggtaacg 7260
gagttggata ctgctcgtgc gtgtccaggt ccatgctcct gaaaatgaag gcacacattg 7320
accctgaacc acaccacgag gggttgattg ttgataccag agatgtggaa gagcgcgtgc 7380
atgtcatgcg taaaaccaag cttgcaccca ccgtggcaca cggtgtgttt aaccctgaat 7440
ttggtcccgc tgccttgtcc aacaaggacc cgcggctgaa cgaaggggtt gtcctcgatg 7500
aagtcatctt ctccaaacac aagggagaca cgaaaatgtc tgaggaggac aaagcgctgt 7560
tccgccgctg cgctgccgac tacgcgtcgc acttgcacag cgtgctgggg acggcaaatg 7620
ccccattgag catctatgag gccatcaaag gcgtcgacgg gctcgatgcc atggagccgg 7680
acaccgcgcc cggcctcccc tgggccctcc aggggaaacg ccgtggtgcg ttgattgact 7740
tcgagaacgg cacggtcgga cccgaagtcg aggctgccct aaagctcatg gagaaaagag 7800
agtacaaatt tgcttgccag accttcctga aagacgagat tcgtccgatg gaaaaagtac 7860
gtgctggcaa gactcgcatt gtcgacgttt tgcccgtgga acacattctt tacaccagga 7920
tgatgattgg cagattctgt gctcaaatgc acacaaacaa tggaccgcag attggctcag 7980
cggtcggttg caatcctgat gttgattggc aaagatttgg cacacatttt gctcagtaca 8040
gaaacgtgtg ggatgtggac tattcggcct ttgatgctaa ccactgcagt gacgcaatga 8100
acatcatgtt tgaggaggta tttcgcacag acttcggttt ccacccaaat gctgagtgga 8160
ttctgaagac tcttgtgaac acggagcacg cctatgagaa caaacgtatc actgttgagg 8220
gcgggatgcc gtctggctgt tccgcgacaa gcatcatcaa cacaattttg aacaacattt 8280
atgtgctcta cgctcttcgt agacactatg agggagttga gctggacacc tacaccatga 8340
tctcctacgg agatgacatc gtggttgcaa gtgactacga tctggatttt gaggctctca 8400
aaccccactt caaatctctt ggtcaaacca tcactccagc tgacaaaagc gacaaaggtt 8460
ttgttcttgg tcactccatt accgatgtca ctttcctcaa aagacacttc cacatggact 8520
atggaactgg gttttacaaa cctgtgatgg cctcaaagac cctcgaggcc attctctcct 8580
ttgcacgccg tgggaccata caggagaagt tgatctccgt ggcaggactc gccgtccact 8640
caggacctga cgagtaccgg cgtctctttg agcccttcca gggtctcttc gagattccaa 8700
gctacagatc actttacctg cgttgggtga acgccgtgtg cggtgacgca taatccctca 8760
gatgtcacaa ttggcagaaa gactctgagg cgagcgacgc cgtaggagtg aaaagcccga 8820
aagggctttt cccgcttcct attccaaaaa aaaaaaaaaa aaactagttc tagagcggcc 8880
gccaccgcgg tggagctcca gcttttgttc cctttagtga gggttaattg cgcgcttggc 8940
gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa 9000
catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac 9060
attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca 9120
ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc 9180
ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 9240
aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 9300
aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 9360
gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 9420
gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 9480
tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 9540
ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 9600
ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 9660
tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 9720
tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 9780
ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 9840
aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 9900
ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 9960
tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 10020
atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 10080
aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 10140
ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 10200
tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 10260
ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 10320
tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 10380
aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt 10440
gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 10500
tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 10560
cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 10620
tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 10680
ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 10740
cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 10800
actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 10860
ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 10920
aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 10980
ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 11040
atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccac 11099
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G7E epitope
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agtgggcgtg tacggggtga cctgggacag ctcgcggcgc gagtcgctgc tcaactccct 60
gcc 63
<210> 6
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2E epitope
<400> 6
caaaaccggc gaggtgactc gggtcctctc gtggtgaaac ccgccacaca gctccctgcc 60
tcc 63
<210> 7
<211> 11162
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A G1-A22VP1-G7E plasmid
<400> 7
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc atatgtaata cgactcacta tagggttgaa agggggcgct 660
agggtctcac ccctagcatg ccaacgacag ctcctacgtc gcactccaca ctaacgtttg 720
tgtgcgcgcg ggaaccgatg gacttttgtt cacccaccta cagttggact cacggcaccg 780
cgtggccatt ttagctgggt tgtgcggacg aacactgctt gcgcatctcg cgtgaccggt 840
tagtactctt accactatcc gcctacttgg tcgttagcgc tgtcctgggc actcttgttg 900
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cgtgcgagcc gatcgcttgg tgtgcctcgg ctgtcgcccg aagcccgcct ttcacccccc 1020
cccccccccc ctaggtttta ccgtcgttcc cgacgttaat ggggaaacaa ccacaagctt 1080
aacaccgtct tgcccgacgt aaaagggctg caaccaaaaa gcttgtgccg cctttcccgg 1140
cgttaatggg aggtaaccac aagacaaacc ttcacccgga agtaaaacgg caacttcaca 1200
cagttttgcc cgttttcgtg agaaatgggc cgtcaacgca cgaaacgcgc cgtcgcttga 1260
ggaggacttg tacaaacacg atctatgcag gtttccacaa ctgacacaaa ccgtgcaact 1320
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cacgctcggt ccactagcga gtgttagtag tagcactgtt gcttcgtagc ggagcatgat 1440
ggccgtggga gcttcccctt ggtaacaagg acccacgggg ccaaaagcca cgtcctaccg 1500
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cactgatact ggtactcaat cactggtgac aggctaagga tgcccttcag gtaccccgag 1620
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ctgttttcat gaatacaact gactgtttca ccgccctgtt acacgctctc agagagatca 1800
aaacactgtt tcttttacgg acacaaggaa agatggaatt cacactttac aacggtgaga 1860
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tcactcttga ggcaatcaaa cagttggaag agacaaccgg tcttgagctg cacgagggtg 2040
gaccacccgc tctcgtcatc tggaacatca aacacttgct tcacaccgga atcggcactg 2100
cctcacgccc tagcgaggtg tgtatggtgg acggaacgga catgtgttta gctgattttc 2160
atgctggcat tttcctgaaa ggacaggaac atgctgtgtt cgcctgtgtc acctccaacg 2220
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tggtgtttgt cccgtacgat caagaaccgc ttaacggaga gtggaaaaca aaggtccaga 2340
aaaggctcaa gggggcaggg caatctagcc ctgccaccgg gtcacagaac cagtcaggca 2400
ataccggcag cattattaac aactactaca tgcagcagta ccagaactcc atggacacac 2460
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cccacacaac caacacccaa aacaatgact ggttctcaaa actggcaagt tccgcgttca 2580
ccggtctttt cggcgcactg ctcgccgaca agaagaccga agagacaact cttctggagg 2640
accgtatcct caccactcgt aatggacaca ccacttctac aactcagtcg agtgtggggg 2700
tcacctacgg gtattcaact ggtgaggacc acgtttctgg acctaacaca tcaggtttgg 2760
agacgcgggt ggtacaagct gaaaggttct tcaagaagca cttgtttgat tggacgacgg 2820
acaaaccctt tggtcacgtt gaaaagctgg aacttcccac tgatcacaaa ggtgtctacg 2880
gacagctggt ggactccttt gcatacatga gaaatggctg ggacgtggag gtgtctgctg 2940
ttggcaacca gttcaacggc gggtgccttc tcgtggccat ggtacctgag tttaaggagt 3000
tcaccacacg tgaaaagtac cagctcaccc tgttccccca ccagttcatt agccccagaa 3060
ccaacatgac cgcgcacatc acggtcccgt accttggtgt gaacaggtat gaccagtaca 3120
acaaacacaa accctggacg ttggtggtga tggtggtttc accacttacc actagctcca 3180
ttggtgcatc acagattaag gtctacacca atatcgcccc tacccacgtt cacgtggctg 3240
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tggtgacaac agaccctaaa acagctgacc ctgcttacgg tatggtgtac aacccaccta 3360
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tcctctgttt cgacgacggg aaaccgtatg ttgtgacaag agcggatgag cagcgcctct 3480
tggccaagtt tgacctttcc cttgctgcaa agcacatgtc aaacacctac ctttcaggga 3540
tagcacagta ctacgcacag tactctggca ccatcaattt gcacttcatg tttactggtt 3600
ccactgactc aaaggcccgt tacatggtgg cttacgtccc gcctggcgtg acaacgccac 3660
cggacacgcc tgagagagct gcgcactgca tccacgcaga atgggacacg ggcctaaact 3720
ccaaattcac tttttcaatc ccgtacgtat ctgctgcaga ttacgcgtac acagcgtccg 3780
atgtggcaga cacaacaaac gtacagggat gggtttgcat ctaccaaatc acccacggga 3840
aggccgaaca agacactttg gtcgtgtcgg tcagcgccgg caaagacttt gagctgcgcc 3900
tccccattga cccccgtgcg caaaccacta ccaccgggga gtctgcagac cctgtcacca 3960
ccactgttga aaactacggc ggtgagacac aagtccaacg acgtcagcac accgacgtta 4020
ctttcataat ggacagattt gtaaagatac aaaacttgaa ccccacacat gtcattgacc 4080
tcatgcaaac ccaccaacac gggttggtag gtgccctgtt acgtgctgct acgtactact 4140
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cacccgaggc agctctgtct aacacgggca accccaccgc ctacctcaag gcaccattta 4260
cgaggctcgc gctcccctac accgcgccac accgcgtgtt ggcaacagtg tacaacggga 4320
cgagcaagta ctccgcaggt ggtacgggca gacggggcga cctagggcct ctcgcgagtg 4380
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tcatcaagct cctgagccgc ttgtcgtgca tggccgctgt agcagcacgg tcaaaggacc 4920
cagtccttgt ggccatcatg ctggctgaca ccggtcttga gattctggac agcacctttg 4980
tcgtgaagaa gatctccgac tcgctctcca gtctctttca cgtgccggcc cccgtcttca 5040
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ggatcaaagc gtggatcgcc tcagaagaaa agtttgtcac catgacggac ttggtgcctg 5280
gtatccttga aaagcagcgg gatctcaacg acccgagtaa gtacaaggaa gccaaggagt 5340
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gcggcaaatc cggccagggg aagagtttcc ttgcgaacgt gctcgcgcaa gcaatctcca 5520
cccacttcac cggcagaact gattcggttt ggtactgccc gcctgaccct gaccacttcg 5580
acggttacaa ccagcagacc gttgtcgtga tggacgattt gggccagaac cccgatggca 5640
aggacttcaa gtacttcgcc cagatggttt cgaccacggg gttcatcccg cccatggcct 5700
cgcttgagga caaaggcaag cctttcaaca gcaaagtcat cattgctacc accaacctgt 5760
actcgggttt caccccgaga acaatggtgt gtcctgacgc gctgaaccgg aggttccact 5820
ttgacatcga cgtgagtgcc aaggacgggt acaaagttaa caacaaattg gacataatca 5880
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taaacggtat ggcagttgaa atgaagagaa tgcaacagga tatgttcaag cctcaaccac 6000
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agaacttgat tgtcactgag gggccatatg aaggaccagt gaagaaacct gtcgctttga 6660
aagtgaaagc aaaagccccg attgtcactg aaggacccta cgagggaccg gtgaagaagc 6720
ctgtcgcttt gaaagtgaaa gccaagaact tgattgtcac tgagagtggt gccccaccga 6780
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agacggtagc catctgctgt gctaccggag tgtttggcac tgcctacctc gtacctcgtc 6900
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cctttgcacg ccgtgggacc atacaggaga agttgatctc cgtggcagga ctcgccgtcc 8700
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cgaaagggct tttcccgctt cctattccaa aaaaaaaaaa aaaaaactag ttctagagcg 8940
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tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 9600
gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 9660
gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 9720
tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 9780
gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 9840
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agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 10620
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 10680
tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 10740
attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 10800
taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 10860
aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 10920
caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 10980
gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 11040
cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 11100
tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 11160
ac 11162
<210> 8
<211> 11162
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A G1-A22VP1-G2E plasmid
<400> 8
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc atatgtaata cgactcacta tagggttgaa agggggcgct 660
agggtctcac ccctagcatg ccaacgacag ctcctacgtc gcactccaca ctaacgtttg 720
tgtgcgcgcg ggaaccgatg gacttttgtt cacccaccta cagttggact cacggcaccg 780
cgtggccatt ttagctgggt tgtgcggacg aacactgctt gcgcatctcg cgtgaccggt 840
tagtactctt accactatcc gcctacttgg tcgttagcgc tgtcctgggc actcttgttg 900
ggggctgttc aacgctctac ggtctcccct gcgtaacaga ctacggtgtt ggggccgctt 960
cgtgcgagcc gatcgcttgg tgtgcctcgg ctgtcgcccg aagcccgcct ttcacccccc 1020
cccccccccc ctaggtttta ccgtcgttcc cgacgttaat ggggaaacaa ccacaagctt 1080
aacaccgtct tgcccgacgt aaaagggctg caaccaaaaa gcttgtgccg cctttcccgg 1140
cgttaatggg aggtaaccac aagacaaacc ttcacccgga agtaaaacgg caacttcaca 1200
cagttttgcc cgttttcgtg agaaatgggc cgtcaacgca cgaaacgcgc cgtcgcttga 1260
ggaggacttg tacaaacacg atctatgcag gtttccacaa ctgacacaaa ccgtgcaact 1320
tgaaaccccg cctggtcttt ccaggtctag aggggcgaca ttttgtactg tgcttgactc 1380
cacgctcggt ccactagcga gtgttagtag tagcactgtt gcttcgtagc ggagcatgat 1440
ggccgtggga gcttcccctt ggtaacaagg acccacgggg ccaaaagcca cgtcctaccg 1500
gacccatcat gtgtgcaaac ccagcacggc aactttactg cgaaaaccac tttaaggtga 1560
cactgatact ggtactcaat cactggtgac aggctaagga tgcccttcag gtaccccgag 1620
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cctcacgccc tagcgaggtg tgtatggtgg acggaacgga catgtgttta gctgattttc 2160
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ataccggcag cattattaac aactactaca tgcagcagta ccagaactcc atggacacac 2460
aacttggtga caacgccatc agcggaggat ccaacgaggg gtccacggac acaacctcta 2520
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tcacctacgg gtattcaact ggtgaggacc acgtttctgg acctaacaca tcaggtttgg 2760
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gacagctggt ggactccttt gcatacatga gaaatggctg ggacgtggag gtgtctgctg 2940
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ctttcataat ggacagattt gtaaagatac aaaacttgaa ccccacacat gtcattgacc 4080
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cacccgaggc agctctgtct aacacgggca accccaccgc ctacctcaag gcaccattta 4260
cgaggctcgc gctcccctac accgcgccac accgcgtgtt ggcaacagtg tacaacggga 4320
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cagtccttgt ggccatcatg ctggctgaca ccggtcttga gattctggac agcacctttg 4980
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gtatccttga aaagcagcgg gatctcaacg acccgagtaa gtacaaggaa gccaaggagt 5340
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attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 10800
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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1 5 10 15
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<220>
<223> primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> primer
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<212> DNA
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<223> primer
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<212> DNA
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<223> primer
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 22
cgagaggacc cgagtcacct cgccggtttt gcgcgagagg ccctaggtc 49
Claims (7)
- 서열번호 7의 646번째 내지 8926번째 서열 또는 서열번호 8의 642번째 내지 8926번째 서열을 갖는 재조합 구제역 바이러스.
- 제1항의 재조합 구제역 바이러스를 생산하는 서열번호7 또는 서열번호 8의 재조합 플라스미드.
- 제1항의 재조합 구제역 바이러스를 정제, 분리하여 수득한 구제역 A 혈청형 바이러스 항원.
- 제1항의 재조합 구제역 바이러스 또는 제3항의 구제역 A 혈청형 바이러스 항원을 포함하는 백신 조성물.
- 제1항의 재조합 구제역 바이러스 또는 제3항의 구제역 바이러스 항원을 포함하는 구제역 진단 키트.
- 제6항의 구제역 진단 키트를 이용하여 인간을 제외한 우제류 동물에서의 구제역 진단 방법.
- 제1항의 구제역 재조합 바이러스 또는 제3항의 재조합 구제역 바이러스 항원을 포함하는 백신 조성물을 이용하여 인간을 제외한 우제류 동물에서의 구제역 예방 또는 치료 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220012021A KR20230115479A (ko) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 재조합 구제역 바이러스 a형 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220012021A KR20230115479A (ko) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 재조합 구제역 바이러스 a형 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230115479A true KR20230115479A (ko) | 2023-08-03 |
Family
ID=87567954
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220012021A KR20230115479A (ko) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 재조합 구제역 바이러스 a형 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230115479A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102009270B1 (ko) | 2017-11-17 | 2019-10-23 | 대한민국 | 구제역 O-Thi60 주의 방어 항원이 발현되는 재조합 바이러스 |
-
2022
- 2022-01-27 KR KR1020220012021A patent/KR20230115479A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102009270B1 (ko) | 2017-11-17 | 2019-10-23 | 대한민국 | 구제역 O-Thi60 주의 방어 항원이 발현되는 재조합 바이러스 |
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| E902 | Notification of reason for refusal |