KR101578445B1 - 구제역 a형 중동 유래 아시아 지역형의 방어항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구제역 A형 한국 분리 바이러스(A/KOR/Pocheon/2010)의 전체 유전자 부위 중에서, 상기 A형 한국 분리 바이러스의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스(A/Iran/05)의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

Description

구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형의 방어항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법{Recombinant foot-and-mouth disease virus expressing P1-protective antigen of middle-east-derived Asia type and the manufacturing method}

본 발명은 구제역 A형 중동유래 아시아 지역형의 방어항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 구제역 A형 한국 분리 바이러스 전체 유전자 부위 중에서, 적어도 상기 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 진뱅크 억세션 넘버 EF494486의 염기서열을 갖는 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스(A/Iran/05)의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

구제역(Foot-and-mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스 수포성 질병으로 빠른 복제와 빠른 전파력이 특징이다. 이 질병은 그 경제적 중요성으로 인하여 세계동물보건기구(OIE)에 의하여 국가간 전파가 가능한 매우 중요한 동물질병으로 분류되어 있으며, 이러한 특성 때문에 축산물의 국가간 교역에 있어 발생유무는 가장 중요한 점검요소로 작용하고 있다.

상기 구제역 병원체는 단일가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데(Piconaviridae)과, 아프소바이러스(Aphthovirus)속에 속하며 7개의 다른 혈청형(A, O, C, Asia1, SAT 1, SAT2, SAT3)으로 분류되고 있다.

구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus) A형 중에서도 ME-SA(중동-남아시아), AFRICA(아프리카), ASIA(아시아)의 3가지의 지역형이 있다. 이 지역형간에도 변이율이 높아 바이러스 공격에 대한 방어가 되지 않는 경우가 많아 A형 바이러스에 대한 여러 종류의 백신의 개발이 필요한 실정이다.

2010년 1월 한국에서 분리된 바이러스는 아시아 지역형으로 유전적으로는 sea-97 계통에 속하는 바이러스이며, 상기 아시아 지역형에 속한 바이러스들 간에서도 변이가 많이 형성되어 있다.

A형 중동 유래 아시아 지역형(A/Iran/05)은 새로운 바이러스로서, 2005년 이란에서 발생하였고 이란지역에서 사우디아라비아, 터키로 전파되었다. 2005년 8월에 발생이 시작되어 2006년 봄까지 문제를 일으켰으며, 2007년에는 요르단까지 발생하였다. 중동지역에서 A/Iran/05는 비발생지역으로 전파되고 있다. 이라크, 쿠웨이트, 레바논, 리비아가 처음 발생되었고, 바레인, 이란, 파키스탄, 터키는 지속적으로 발생되었다.

과거 2년 동안 4개의 아형 계통형이 나타났고 그들은 A/Iran/05^{ARD -07}, A/Iran/05^EZM-07, A/Iran/05^{AFG - 07}와 A/Iran/05^{BAR -08}이다. A/Iran/05^{AFG -07}은 아프가니스탄 (2007), 이란(2008~2009), 파키스탄(2008~2009), 바레인(2009)로 전파되었다.

A/Iran/05 ^{BAR -08}은 바레인(2008), 이란(2009), 파키스탄(2009), 레바논(2009), 이라크(2009), 쿠웨이트(2009), 리비아(2009) 및 팔레스타인 자치구(2009)에 발생하였다. 이 바이러스는 백신주인 A22Iraq와 비교적 낮은 항원 동질성을 가지므로 더욱 적절한 바이러스주를 선정하는 것도 필요하다. 최근에 A/Iran/05도 세계 구제역 표준연구소에서는 높은 유용성(high priority)이 있는 항원형으로 인정하였다.

상기 A/Iran/05 바이러스는 중동지역을 비롯한 아시아 지역에서 유행하고 있기 때문에, 상기 바이러스에 대한 백신의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명자들은 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스에 대해 적절하게 방어하기 위하여, 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 유전자 전체 게놈을 플라스미드에 클로닝한 바이러스 벡터를 기초로, 상기 A형 한국 분리 바이러스의 전체 유전자가 삽입된 벡터 내의 구조 단백질을 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스(A/Iran/05)의 구조 단백질 유전자로 치환시켜 형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스에 대해 방어할 수 있는 방어 단백질을 발현하는 새로운 재조합 구제역 바이러스를 제공할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 중동지역에서 유행하고 있는 상기 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스(A/Iran/05)의 P1 유전자가 삽입됨으로써, 상기 A/Iran/05에 대한 방어능을 구비하여 백신 종독주로 유용하게 사용될 수 있는 재조합 구제역 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 중동지역에서 유행하고 있는 상기 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스(A/Iran/05)에 대한 방어능을 구비하여 백신 종독주로 유용하게 사용될 수 있는 상기 재조합 구제역 바이러스의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 진뱅크 억세션 넘버 KC588943의 염기서열을 갖는 구제역 A형 한국 분리 바이러스 전체 유전자 부위 중에서, 적어도 상기 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 진뱅크 억세션 넘버 EF494486의 염기서열을 갖는 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스(A/Iran/05)의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된, 서열번호 2의 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 진뱅크 억세션 넘버 KC588943의 염기서열을 갖는 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계, (2) 상기 (1) 단계에서 얻은 플라스미드에서, 상기 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자를, 진뱅크 억세션 넘버 EF494486의 염기서열을 갖는 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환시켜, 서열번호 2의 재조합 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 구축하는 단계, 및 (3) 상기 (2) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 구제역 A형 한국 분리주의 유전자 일부를 조작하여 동물에 병원성을 약화시킴으로써, 소독제 실험 또는 항바이러스 실험 등 실험실 내에서 다루기에 병원성 바이러스보다 더욱 안전하게 사용할 수 있는 장점을 지니고 있다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 바이러스 역가가 원래의 바이러스와 크게 차이를 보이지 않으면서, 중동에서 유행하는 아시아 지역형을 효과적으로 방어할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.

도 1은 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드(pA-Kor-Poc)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스의 게놈 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스의 방어 단백질 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드(pA-Iran05-P1)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 간이 항원 킷트를 이용하여 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스에서 발현된 단백질이 구제역 항원 양성 반응을 보임을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스가 염소 태아 혀 세포주(ZZ-R) 및 햄스터 세포주(BHK-21)에서 자라서 바이러스 역가를 형성함을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 진뱅크 억세션 넘버 KC588943의 염기서열을 갖는 구제역 A형 한국 분리 바이러스 전체 유전자 부위 중에서, 적어도 상기 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 진뱅크 억세션 넘버 EF494486의 염기서열을 갖는 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스(A/Iran/05)의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스에서, 상기 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스에서, 상기 재조합 바이러스는 상기 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스에서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 (1) 진뱅크 억세션 넘버 KC588943의 염기서열을 갖는 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계, (2) 상기 (1) 단계에서 얻은 플라스미드에서, 상기 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자를, 진뱅크 억세션 넘버 EF494486의 염기서열을 갖는 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환시켜, 서열번호 2의 재조합 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 구축하는 단계, 및 (3) 상기 (2) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에 관한 것이다.

상기에서 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계는 통상적으로 유전자를 플라스미드에 삽입하는 방법을 이용할 수 있으면 족하므로, 이에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에서, 상기 (2) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하는 상기 (3) 단계에서의 세포는 염소 태아 혀 세포(ZZ-R) 및 햄스터 세포주(BHK-21) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에서, 상기 재조합 바이러스는 상기 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스를 포함하는 구제역 예방용 백신에 관한 것이다.

본 발명의 상기 백신은 약독 생백신이거나 불활화된 백신일 수 있고, 상기 백신을 제조하는 방법은 통상적인 백신의 제조방법을 이용할 수 있으면 족하므로, 이에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.

이하 본 발명의 내용을 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기의 실험예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 재조합 플라스미드 pA-Kor-Poc의 제작

구제역 A형 한국 분리 바이러스(A/KOR/Pocheon/2010)의 전체 유전자(진뱅크 억세션 넘버 KC588943를 PCR에 의하여 증폭하고, 플라스미드(pBluescript SK II)에 상기 A/KOR/Pocheon/2010의 유전자를 삽입하여 재조합 플라스미드 pA-Kor-Poc를 제작하였다.

상기에서, PCR 증폭은 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

일반적으로 cDNA 합성시 사용되는 랜덤 프라이머를 이용하여 상기 한국 분리 바이러스에 대한 cDNA 작성후 이것을 이용하여 한국 분리 바이러스 유전자 정보를 기초로 증폭이 가능한 특이 프라이머들(GenBank Accession No. KC588943을 기초로 5' 및 3' 유전자의 각 20 mers씩에 해당)를 작성하여 PCR을 실시하였으며, PCR를 위한 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs (1㎕), Phusion enzyme (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균증류수 (35.5㎕)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25 싸이클, 최종 72℃ 10분으로 반응을 실시하였다.

도 1은 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드(pA-Kor-Poc)의 모식도를 나타낸 것이다. 상기 재조합 플라스미드 pA-Kor-Poc는 서열번호 1의 염기서열을 갖는다.

<실시예 2> P1 부위가 치환된 재조합 구제역 바이러스의 제조

상기 실시예 1에서 제작한 재조합 플라스미드(pA-Kor-Poc) 중에서, 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자를 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스인 A/Iran/05 바이러스(GenBank Accession No. EF494486)의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환하여 재조합 유전자가 삽입되고, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 재조합 플라스미드(pA-Iran05-P1)를 제작하였다.

상기 P1 단백질을 코딩하는 유전자는 다음과 같이 실시하여 치환시켰다.

서열번호 3의 정방향 프라이머(5'-GGAGCCGGGCAATCCAGTCCGGCAAC-3') 및 서열번호 4의 역방향 프라이머(5'-TTGCTTTGTAGGTGCAATGATCTTTTG-3')를 이용하여, A/Iran/05 바이러스(GenBank Accession No. EF494486의 P1 유전자를 PCR에 의하여 증폭시켰다.

이때, 상기 PCR 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs (1㎕), Phusion enzyme (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균증류수 (35.5㎕)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 60초간 25 싸이클, 최종 72℃ 10분으로 반응을 실시하였다.

서열번호 5의 정방향 프라이머(5'-CTCCTGAACCTTGATCTGCTCAAGTTG-3') 및 서열번호 6의 역방향 프라이머(5'-TTTAAGTCGCCTCTGAACCTTTGT-3')를 이용하여, A/KOR/Poch eon/2010의 전체 유전자에서 P1 유전자가 제거된 벡터를 PCR에 의하여 증폭시켰다.

이때, 상기 PCR 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs (1㎕), Phusion enzyme (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균증류수 (35.5㎕)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25 싸이클, 최종 72℃ 10분으로 반응시켰다.

그 후, 증폭된 P1 유전자와의 결찰반응 (TAKARA Long Ligation kit)을 수행하였으며, 최종적으로 전체 염기서열 분석을 통하여 적절히 클로닝(pA-Iran05-P1)된 것을 확인하였다.

재조합 구제역 바이러스의 회복은 확보된 상기 재조합 플라스미드(pA-Iran05-P1)를 제한효소로 반응시킨 뒤, BHKT7-9 세포(T7 RNA polymerase가 발현되는 세포주)에서 바이러스를 확보한 후, ZZ-R(염소 태아 혀) 세포 및 BHK-21(햄스터 세포주)에서 증식시키고, BHK-21 세포에서 세포변성 효과를 확인하였다.

도 2는 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스의 방어 항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스의 게놈 모식도로서, pA-Iran05-P1은 구제역 A형 한국 분리 바이러스(A/KOR/Poch eon/2010)의 전체 유전자에서, 방어 항원 P1 부위가 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스(A/Iran/05)의 P1 부위로 치환된 모식도를 나타낸 것이다.

도 3은 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스의 방어 단백질 유전자가 삽입된 플라스미드의 모식도를 나타낸 것이다.

도 3은 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스의 방어 단백질 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드(pA-Iran05-P1)의 모식도를 나타낸 것이다.

도 4는 간이 항원 킷트를 이용하여 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스에서 발현된 단백질이 구제역 항원 양성 반응을 보임을 나타낸 것이다. 회복된 바이러스 배양 상층액 25㎕를 간이항원 키트(PBM Co. Ltd.)로 구제역에 대한 구조 단백질(SP)에 대한 양성반응을 확인할 수 있다.

도 5는 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스가 염소 태아 혀 세포주(ZZ-R) 및 햄스터 세포주(BHK-21)에서 자라서 바이러스 역가를 형성함을 보여주는 그래프이다. 도 6을 참조하면, 본 발명의 재조합 구제역 바이러스는 야외 바이러스와 유사한 바이러스 역가를 나타냄을 알 수 있다.

상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예 및 시험예를 참조하여 설명하였지만 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스의 방어 항원 발현능을 보유하는 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스를 이용한 구제역 백신을 제공함으로써, 구제역의 치료 및/또는 예방에 기여할 수 있다.

<110> Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency <120> Recombinant foot-and-mouth disease virus expressing P1-protective antigen of middle-east-derived Asia type and the manufacturing method <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11040 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant plasmid pA-Kor-Poc <400> 1 tatgtaatac gactcactat agggttgaaa gggggcgtta gggtcccacc cctagcatgc 60 caacgactgc tcctgcgttg cactccacac ttacgttcgt gtacgcggga accgatagac 120 taccgttcac ccacctgcag ctggactcat gacaccgcgt ggtcatttag ctggattgtg 180 cggacgaaca ccgcttgcgc acctcgcgtg accgattagt actctcacca ccttccgcct 240 acttggtcgt cagcgctgtc ctgggcaccc ctgttggggg ccgctcgatg ctctacggtt 300 tcccccgcag cgggctacgg tgatggggcc gcctcgtgcg ggttgatcgt ttggtgtgcc 360 tcggttgtga tccgaagctc acctttcatc cccccccccc cccctaagca ctaccgtcgt 420 tcccgacgtt aaagggatga aactacaagc ttagcgcctt cgtgtccgaa gtcaaaggac 480 tacaaccgca agtttgagcc gccttttccg gtgttaatgg aatgtaacca caagatggac 540 cttcttccgg aagtaaaacg 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gtcaccatga cagacttggt gcctggtatc cttgaaaagc agcgggatct caacgacccg 4620 agcaagtaca aggcagccaa ggagtggctt gacaacgcgc gtcaagcgtg cctgaagagc 4680 gggaatgtcc acattgccaa cctttgcaaa gtggtcgccc cagcgccaag caagtcgaga 4740 cccgaacccg tggtcgtttg cctccgtggc aaatccggcc agggcaaaag tttccttgcg 4800 aacgtgctcg cacaagcaat ttcaacccac ttcactggca gaatcgattc agtttggtac 4860 tgcccacctg accctgacca cttcgacggt tataaccaac aaaccgttgt tgtgatggac 4920 gatttgggcc agaaccccga cggcaaggac tttaagtact tcgcccagat ggtttcaacc 4980 acggggttca tcccgcccat ggcctcactt gaggacaagg ggaaaccctt caacagcaaa 5040 gtcatcatta ccaccaccaa cctctatgcg ggctttaccc cgagaaccat ggtgtgtcct 5100 gacgcgctga accggaggtt ccactttgac attgatgtga gtgccaagga cgggtacaaa 5160 attaacaaca aattggacat aatcaaagca cttgaagaca cacacaccaa cccggtagca 5220 atgttccagt acgactgcgc cctcctcaac ggcatggcag tcgagatgaa gagattgcaa 5280 caggatttgt tcactcccca accacccata cagaatgttt accaacttgt tcaagaagtg 5340 attgatcggg tggagctcca cgagaaagtg tcgagccacc cgattttcaa acagatctca 5400 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ggtagagcca tgacagacag tgactacaga gtgtttgagt ttgaaattaa ggtaaaagga 6300 caggacatgc tttcagacgc tgcgctcatg gtgttgcacc gtgggaatcg cgtgagagat 6360 atcacgaaac actttcgtga cacagcaaga atgaagaaag gcacctccgt cgtcggcgta 6420 ataaacaacg ctgatgttgg tagactgatt ttctctggtg aggcccttac ctacaaagac 6480 attgtagtgt gcatggatgg agacaccatg ccgggcttgt ttgcctacag agccgccacc 6540 aaggctggtt actgtggagg agctgttctt gccaaagacg gagctgacac attcatcgtt 6600 ggcactcact ccgcaggtgg taatggggtt gggtactgct cgtgcgtatc cagatccatg 6660 cttttgaaga tgaaggcaca cattgaccct gagccacacc atgaagggtt gattgttgac 6720 accagggatg tggaagagcg cgtgcacgtc atgcgtaaaa ccaagcttgc gcccaccgtg 6780 gctcacggtg tgttcaaccc cgagtacggc cccgctgcct tgtccaacaa ggatccgcgg 6840 ctgaatgagg gagttgtcct cgacgaggtc atcttctcca aacataaggg agacacaagg 6900 atgtcaccgg aggataaagc gctgttccgc cgctgtgctg ccgactacgc gtcgcgtttg 6960 cacggtgtgc tgggtacggc aaatgcccca ttgagcgtct atgaggccat caagggtgtc 7020 gacggacttg acgccatgga acctgacaca gcacctggcc ttccctgggc cctccagggg 7080 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tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 9660 ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 9720 atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 9780 gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 9840 tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 9900 cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 9960 taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 10020 ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 10080 ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 10140 cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 10200 ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 10260 gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 10320 gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 10380 aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctaaattg taagcgttaa 10440 tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc 10500 cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt 10560 tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa 10620 aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa gttttttggg 10680 gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg 10740 acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc 10800 tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa 10860 tgcgccgcta cagggcgcgt cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg 10920 atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg 10980 attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga 11040 gca 11043 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 ggagccgggc aatccagtcc ggcaac 26 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 ttgctttgta ggtgcaatga tcttttg 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 ctcctgaacc ttgatctgct caagttg 27 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 tttaagtcgc ctctgaacct ttgt 24

Claims (9)

1. 진뱅크 억세션 넘버 KC588943의 염기서열을 갖는 구제역 A형 한국 분리 바이러스 전체 유전자 부위 중에서, 상기 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 진뱅크 억세션 넘버 EF494486의 염기서열을 갖는 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스(A/Iran/05)의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 플라스미드로서, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 상기 구제역 A형 중동지역 유행 아시아 지역형 바이러스의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스.
5. (1). 진뱅크 억세션 넘버 KC588943의 염기서열을 갖는 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계;
   (2). 상기 (1) 단계에서 얻은 플라스미드에서, 상기 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자를, 진뱅크 억세션 넘버 EF494486의 염기서열을 갖는 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환시켜, 재조합 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 구축하되, 상기 재조합 플라스미드는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 단계; 및
   (3). 상기 (2) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 세포는 염소 태아 혀세포(ZZR) 및 햄스터 세포주(BHK-21) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 상기 구제역 A형 중동 유래 아시아 지역형 바이러스의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
9. 제1항 또는 제3항의 재조합 구제역 바이러스를 포함하는 구제역 예방용 백신.

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