CN114438083A - 识别猪PERV基因的sgRNA及其编码DNA和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种识别猪PERV基因的sgRNA及其编码DNA和应用。该sgRNA的靶序列为A1‑A8中任意一种。本发明提供的sgRNA特异性识别猪PERV基因，将其用于CRISPR/Cas9系统，在不引起DNA双链断裂的情况下实现DNA碱基序列改变，可以解决利用CRISPR/Cas9系统介导PERV基因敲除时，双链断裂累积导致细胞大量死亡的问题。本发明的sgRNA敲除效率高，能够高效地对猪PERV基因进行编辑，实现在猪器官异种移植、猪细胞或个体的基因功能研究以及抗病育种等方面的应用。

Description

识别猪PERV基因的sgRNA及其编码DNA和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种识别猪PERV基因的sgRNA及其编码DNA和应用。
背景技术
在利用猪器官进行异种移植临床应用前，必须解决猪内源性反转录病毒(porcineendogenous retroviruses,PERVs)向人类传播猪源病毒风险的问题。PERVs是一种整合在猪基因组中的病毒，可以作为感染性颗粒从正常细胞中释放出来，这种病毒无法通过SPF级培养净化去除，而且已有实验证明该病毒在体外可以感染人类细胞。
PERV属于高拷贝基因，在不同猪个体及猪细胞系内均具有较高的拷贝数。科学家们尝试了多种方法降低PERV向人类细胞传播的风险。2015年，Joachim Denner课题组和Ashley O'Brien课题组分别采用ZFN和TALEN技术尝试敲除猪PK15细胞系内PERV，但均未取得理想的效果。同一年，杨璐菡团队在Science发文称，该课题组采用CRISPR/Cas9技术成功获得了PERV完全失活的猪PK15细胞系，而且2017年，该团队再次Science发文称采用CRISPR技术和体细胞核移植技术成功获得了PERV完全失活的转基因克隆猪。但杨璐菡团队的文章指出，可能是由于PERV属于高拷贝基因，采用CRISPR/Cas9技术进行编辑时会产生大量双链断裂，对细胞产生毒性，导致细胞大量死亡，成功获得PERV失活细胞系的难度加大。JoachimDenner课题组采用ZFN未能获得PERV敲除的PK15细胞系，也是由于ZFN产生大量双链断裂导致细胞毒性增大，很难存活。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种识别猪PERV基因的sgRNA及其编码DNA和应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种识别猪PERV基因的sgRNA，其靶序列为A1-A8中任意一种：
A1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
A2.核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
A3.核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
A4.核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
A5.核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
A6.核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
A7.核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
A8.A1-A7中任一核苷酸经过一个或多个核苷酸的取代和/或缺失和/或插入仍具有相同功能的核苷酸序列。
优选地，所述识别猪PERV基因的sgRNA为A1-A8中任意两种或两种以上成的sgRNA；最优选地，所述识别猪PERV基因的sgRNA为A1-A8组成的sgRNA。
编码上述识别猪PERV基因的sgRNA的DNA、含有所述DNA的表达盒或表达载体。
一种识别猪PERV基因的CRISPR/Cas9系统，其sgRNA为上述识别猪PERV基因的sgRNA。
上述识别猪PERV基因的sgRNA或编码所述sgRNA的DNA、表达盒、表达载体或所述CRISPR/Cas9系统在制备B1-B2中一种产品中的应用：
B1.编辑猪PERV基因；
B2.构建猪PERV基因敲除细胞或动物模型。
所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。
一种试剂盒，包括上述识别猪PERV基因的sgRNA或编码所述sgRNA的DNA、表达盒、表达载体或CRISPR/Cas9系统。
一种猪PERV基因编辑的方法，包括以下步骤：将上述CRISPR/Cas9系统导入出发细胞，实现猪PERV基因的编辑。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的sgRNA特异性识别猪PERV基因，将其用于CRISPR/Cas9系统，在不引起DNA双链断裂的情况下实现DNA碱基序列改变，可以解决利用CRISPR/Cas9系统介导PERV基因敲除时，双链断裂累积导致细胞大量死亡的问题。本发明敲除效率高，能够高效地对猪PERV基因进行编辑，实现在猪器官异种移植、猪细胞或个体的基因功能研究以及抗病育种等方面的应用。
附图说明
图1是猪PERV基因sgRNA序列及位置示意图。
图2是猪PERV基因episomal-胞嘧啶碱基编辑载体构建流程图。
图3是pU6-gRNA的质粒图谱。
图4是pCMV-BE4max-P2A-Puro的质粒图谱。
图5是pCEP4-Middle的质粒图谱。
图6是猪ST克隆细胞7条sgRNA测序结果图。
图7是Hi-TOM测序工作流程示意图。
图8是ST克隆细胞株Gag区、Pol区测序结果统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1载体构建
一、猪PERV基因sgRNA序列的确定
在NCBI数据库中检索，获得猪PERV基因序列(GenBank：HM159246.1)，查找PERV基因的的pol和gag区中三联体密码子可以被转换成终止密码子的区域，针对gag区确定3个拟突变位点，针对pol区确定4个拟突变位点(图1)，sgRNA1-sgRNA7的序列SEQ ID NO.1-SEQID NO.7如表1所示。
表1 sgRNA序列(5’-3’)
Figure BDA0003494934660000021
二、构建猪PERV基因episomal-胞嘧啶碱基编辑载体
针对突变位点设计并构建sgRNA表达载体，将7个sgRNA、BE4-max及puro筛选标记等表达元件全部克隆至episomal表达载体pCEP4中，获得针对猪PERV基因的episomal-胞嘧啶碱基编辑载体。猪PERV基因episomal-胞嘧啶碱基编辑载体构建流程如图2所示。
(1)获得线性化载体pU6-gRNA。
将质粒pU6-gRNA用BbsI酶切，在37℃水浴锅中酶切4小时，进行DNA琼脂糖凝胶电泳，跑胶回收3950bp片段，得到的线性化载体pU6-gRNA作为pU6-gtRNA-gag、pU6-gtRNA-pol1和pU6-gtRNA-pol2的骨架载体。酶切体系如表2所示。
表2酶切体系
Figure BDA0003494934660000022
Figure BDA0003494934660000031
(2)构建质粒pU6-gtRNA-gag、pU6-gtRNA-pol1和pU6-gtRNA-pol2
①以pU6-gRNA为模板，以PERV-Primer1+PERV-Primer2为引物进行PCR扩增，进行DNA琼脂糖凝胶电泳，切胶回收得到180bp的片段P1。
表3 PCR扩增体系
2×Primer Star Max Premix(Takara) 25μl
pU6-gRNA 100ng
PERV-Primer1 2μl
PERV-Primer2 2μl
水 xμl
总计 50μl
表4 PCR扩增条件
Figure BDA0003494934660000032
②以pU6-gRNA(图3)为模板，PERV-Primer3+PERV-Primer5为引物，进行第一轮PCR扩增，产物不回收纯化。
表5 PCR扩增体系
2×Primer Star Max Premix(Takara) 10μl
pU6-gRNA 100ng
PERV-Primer3 1μl
PERV-Primer5 1μl
水 xμl
总计 20μl
表6 PCR扩增条件
Figure BDA0003494934660000033
③将②的PCR产物稀释20倍，取1μl为模板进行第二轮PCR扩增，PCR扩增引物为PERV-Primer3+PERV-Primer4，PCR扩增体系及条件如①，扩增完成后进行DNA琼脂糖凝胶电泳，切胶回收256bp的片段P2。
④将片段P1、P2用同源重组试剂盒(
Figure BDA0003494934660000034
MultiS One Step Cloning Kit,Vazyme)重组到线性化载体pU6-gRNA上，重组体系如表7所示。
表7 pU6-gtRNA-gag重组体系
Exnase MultiS 1μl
5×CE MultiS Buffer 2μl
pU6-gRNA 5μl
P1 0.3μl
P2 0.4μl
水 1.3μl
总计 10μl
使用振荡器震荡混匀，在37℃放置30min后，将重组产物加入到100μl感受态细胞(DH5α)中，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后立即置于冰上冷却3min，用无菌涂布棒在含有30μg/mL卡那霉素的平板上轻轻涂匀，37℃培养箱中倒置培养14h。挑取单菌落测序鉴定，得到质粒pU6-gtRNA-gag。
⑤选取鉴定正确的质粒pU6-gtRNA-gag为模板，分别以PERV-Primer6、PERV-Primer7和PERV-Primer8、PERV-Primer9为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系及条件如①，扩增完成后进行DNA琼脂糖凝胶电泳，切胶回收片段P3、P4。
⑥分别将片段P3、P4用同源重组试剂盒(
Figure BDA0003494934660000041
MultiS One Step CloningKit,Vazyme)重组到线性化载体pU6-gRNA上，重组体系如表8和9所示。
表8 pU6-gtRNA-pol1重组体系
Exnase MultiS 1μl
5×CE MultiS Buffer 2μl
pU6-gRNA 5μl
P3 0.5μl
水 1.5μl
总计 10μl
表9 pU6-gtRNA-pol2重组体系
Exnase MultiS 1μl
5×CE MultiS Buffer 2μl
pU6-gRNA 5μl
P4 0.3μl
水 1.7μl
总计 10μl
重组产物经转化(方法如④)后，测序鉴定，得到质粒pU6-gtRNA-pol1和pU6-gtRNA-pol2。以上所用引物的序列如表10所示。
表10引物序列(5’-3’)
Figure BDA0003494934660000042
Figure BDA0003494934660000051
(3)构建质粒pCMV-BE4max-P2A-Puro-tandem sgRNA
①将质粒pCMV-BE4max-P2A-Puro(图4)用MluI酶切，在37℃水浴锅酶切4小时，进行DNA琼脂糖凝胶电泳，跑胶回收9654bp片段，得到的线性化载体作为骨架载体。酶切体系如表11所示。
表11酶切体系
MluI(NEB) 3μl
10×Buffer 10μl
质粒 5μg
水 xμl
总计 100μl
②分别以pU6-gtRNA-gag为模板，CBE4-Puro-gag1F、CBE4-Puro-gag1R为引物，扩增片段gtRNA-gag；以pU6-gtRNA-pol1为模板，CBE4-Puro-pol1F、CBE4-Puro-pol1R为引物，扩增片段gtRNA-pol1；以pU6-gtRNA-pol2为模板，CBE4-Puro-pol2F、CBE4-Puro-pol2R为引物，扩增片段gtRNA-pol2。PCR扩增体系及方法如①。以上引物的序列如表12所示。
表12引物序列(5’-3’)
Figure BDA0003494934660000052
③将片段gtRNA-gag、gtRNA-pol1、gtRNA-pol2用同源重组试剂盒(
Figure BDA0003494934660000053
MultiS One Step Cloning Kit,Vazyme)重组到线性化载体pCMV-BE4max-P2A-Puro，重组体系如表13所示。
表13重组体系
Figure BDA0003494934660000054
Figure BDA0003494934660000061
重组产物经转化(方法如(2)中步骤④)后，测序鉴定，得到质粒pCMV-BE4max-P2A-Puro-tandem sgRNA。
(4)构建质粒pCEP4-Middle
①将质粒pCEP4(淼灵，P0183)用NruI、NotI酶切，在37℃水浴锅酶切4小时，进行DNA琼脂糖凝胶电泳，跑胶回收7661bp片段，得到片段P5。酶切体系如表14所示。
表14酶切体系
NruI(NEB) 3μl
NotI(NEB) 3μl
10×Buffer 10μl
质粒 5μg
水 xμl
总计 100μl
②用引物pCEP4-F1、pCEP4-R1进行引物退火反应。按照表15加入相应成分，混合均匀后，放入PCR仪中，95℃、10min，马上取出室温冷却。
表15引物退火体系
pCEP4-F1 10μl
pCEP4-R1 10μl
10×Buffer 5μl
水 25μl
总计 50μl
表16引物序列(5’-3’)
pCEP4-F1 GGCCGCGTTTAAACAGCTGGCATGAAGCTTTCG
pCEP4-R1 CGAAAGCTTCATGCCAGCTGTTTAAACGC
③取片段P5回收产物50ng、引物退火反应产物0.5uL、5uL solution I，16℃连接30min，连接产物转化(方法如(2)中步骤④)，得到质粒pCEP4-Middle(图5)。
(5)构建质粒pCEP4-BE4max-Puro-tandem sgRNA
①分别将质粒pCMV-BE4max-P2A-Puro-tandem sgRNA、pCEP4-Middle用PmeI和HindIII酶切，在37℃水浴锅酶切4小时，进行DNA琼脂糖凝胶电泳，分别回收酶切产物P5、P6。酶切体系如表17所示。
表17酶切体系
Figure BDA0003494934660000062
②将回收产物P5、P6用Solution I 16℃连接2h，连接体系如表18所示。
表18连接体系
Solution I(Takala) 5μl
P5 2μl
P6 1μl
水 2μl
总计 10μl
连接产物经转化(方法如(2)中步骤④)后，测序鉴定，得到质粒pCEP4-BE4max-P2A-Puro-tandem sgRNA，即episomal-胞嘧啶碱基编辑载体。
实施例2、PERV基因功能性敲除猪细胞系克隆的获得
一、细胞培养
复苏猪ST细胞(CL-0219，Procell)至10cm皿培养板中，在添加10％胎牛血清(FBS,Gibco)、1％非必需氨基酸(NEAA,Gibco)、2mm谷氨酰胺(Gibco)和1mm丙酮酸钠(Gibco)的DMEM高糖培养基(HyClone)中培养，所有细胞培养在37℃、5％CO2的培养箱中。
二、细胞转染及筛选
当细胞密度达到培养皿的70％左右时，采用Neon Transfection System电转，电转参数为：脉冲电压(Pulse Voltage)：1230V；脉冲宽度(Pulse Width)：10ms；脉冲次数(Pulse Number)：3；细胞密度(Cell Density)：4×106cells/mL。1个10cm皿转染约30μg的pCEP4-BE4max-P2A-Puro-tandem sgRNA质粒。电转染24h后用0.05％的胰酶(Gibco)消化细胞，接着按照每个孔1个细胞的比例将消化的细胞放入96孔板中，电转染48h后加入500ng/μl的嘌呤霉素进行筛选，分板10天，挑选单克隆至48孔板，待挑选单克隆长满48孔板即可进行克隆鉴定。
三、单克隆细胞的检测
收取单克隆细胞，加10μl NP40细胞裂解液(0.45％NP40原液+60μg/ml蛋白酶K)裂解细胞(56℃、1h，96℃、10min)，以细胞裂解液为模板，以引物Gag-jianding F1、Gag-jianding R1、Pol-jianding F1、Pol-jianding R1进行PCR扩增，测序鉴定，得到157株单克隆细胞，其中，Clone 3#7条sgRNA的测序结果如图6所示。从测序结果可知，episomal-胞嘧啶碱基编辑载体可以同时对猪PERV基因的7个位点进行编辑。上述引物的序列如表19所示。
表19引物序列(5’-3’)
Gag-jianding F1 GGCAGACTTTCTGTGCCTCTGA
Gag-jianding R1 GCAGCGGTAATATCGCGATCT
Pol-jianding F1 GGTAGAGACTTACTGACCAAGA
Pol-jianding R1 CGCTCAAGAGGTTATAAGGGT
四、Hi-TOM测序
为了能够以精确的百分比跟踪多个样本和多个目标位点的突变，对157株单克隆细胞做Hi-TOM测序，对目标位点进行精确的编辑效率检测。Hi-TOM测序工作流程示意图如图7。Hi-TOM的靶向位点设计要求正向或反向靶向扩增100bp范围左右，在PERV gag区、pol区的7条sgRNAs设计位点特异性引物，并在特异性引物5’端添加桥接序列F：5’-GGAGTGAGTACGGT GTGC-3’和R：5’-GAGTTGGATGCTGGATGG-3’。进行第一轮PCR扩增：引物M-gag-F1、M-gag-R1扩增gag区的sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3；引物M-pol-F1、M-pol-R1扩增pol区的sg RNA4、sgRNA6、sgRNA7。特异性引物序列如表20所示。
表20特异性引物序列(5’-3’)
Figure BDA0003494934660000071
Figure BDA0003494934660000081
将所得PCR产物送往公司作为模板进行第二轮barcoding PCR扩增进行二代测序，Clone 3#测序结果如表21、表22。表21中Clone 3#Gag区3条sgRNA共读出10中不同序列结果及reads number；表22是Clone 3#Pol区3条sgRNA的测序结果(因为Hi TOM靶向位点引物设计范围的原因，Gag区可以测到3条sgRNAs，而Pol区只能测到sgRNA 4、6、7)，其中小写并加下划线处为编辑目标位点，小写处为SNP。
表21 Gag区3条sgRNA的测序结果(5’-3’)
Figure BDA0003494934660000082
表22 Pol区3条sgRNA的测序结果(5’-3’)
Figure BDA0003494934660000083
Figure BDA0003494934660000091
因为发明人选取了多个位点进行编辑，只要有一个位点发生编辑或者任意几个位点同时发生编辑，均可以实现PERV基因翻译的提前终止。发明人整理了Clone 3#每条sgRNA，以及Hi-TOM测序所得的Gag区3条sgRNAs和Pol区3条sgRNAs的编辑效率，得到表23。
表23编辑效率
Figure BDA0003494934660000092
同时，发明人对157株单克隆细胞Hi-TOM测序结果的Gag区3条sgRNAs和Pol区3条sgRNAs编辑效率汇总整理，结果如图8。结果表明，Gag区整体的基因编辑效率明显低于Pol区，约27％(43/157)的单克隆细胞Pol区的基因编辑在91％以上，其中约11％(17/157)的单克隆细胞可实现Pol区100％的PERV敲除。因此，根据Hi-TOM测序结果，episomal-胞嘧啶碱基编辑载体实现了对PERV的100％敲除。
由于发明人采用的episomal-胞嘧啶碱基编辑载体，筛选时间越长，基因编辑效率越高，可通过调整筛选时间来调节基因编辑效率。并且发明人选取了7个位点进行多位点编辑，只要有一个位点发生编辑或者任意几个位点同时发生编辑，均可以实现PERV基因翻译的提前终止。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 五邑大学
<120> 识别猪PERV基因的sgRNA及其编码DNA和应用
<160> 91
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<223> sgRNA1
tcttgccacg taaggatata 20
<210> 2
<223> sgRNA2
tttagccatg gtttaaccca 20
<210> 3
<223> sgRNA3
ggtccccgaa tcctggctct 20
<210> 4
<223> sgRNA4
ctgatcaaaa tatacagtcc 20
<210> 5
<223> sgRNA5
cccacaggtt attcagctga 20
<210> 6
<223> sgRNA6
tgttcaaaga ttaatccaac 20
<210> 7
<223> sgRNA7
gtattccaag gggatcggac 20
<210> 8
<223> PERV-Primer1
atcttgtgga aaggacgaaa caccggtccc cgaatcctgg ctctgtttta gagctagaaa 60
tagc 64
<210> 9
<223> PERV-Primer2
ctcggatcgc tggattcaaa gtccagagtg ctaaccatta caccatggga ccctgctgaa 60
gcaccgactc ggtgccac 78
<210> 10
<223> PERV-Primer3
ctttgaatcc agcgatccga gttcaaatct cggtgggacc ttcttgccac gtaaggatat 60
agttttagag ctagaaatag c 81
<210> 11
<223> PERV-Primer4
gctatttcta gctctaaaac tgggttaaac catggctaaa tgcaccagcc gggaatcgaa 60
cccgggtctg taccgtggc 79
<210> 12
<223> PERV-Primer5
ccgggtctgt accgtggcag ggtactattc taccactaga ccactggtgc tttgttaagc 60
accgactcgg tgccac 76
<210> 13
<223> PERV-Primer6
tatcttgtgg aaaggacgaa acaccgtatt ccaaggggat cggacgtttt agagctagaa 60
atagca 66
<210> 14
<223> PERV-Primer7
gctatttcta gctctaaaac ggactgtata ttttgatcag aggtcccacc gagatttgaa 60
c 61
<210> 15
<223> PERV-Primer8
tatcttgtgg aaaggacgaa acaccgtgtt caaagattaa tccaacgttt tagagctaga 60
aatagca 67
<210> 16
<223> PERV-Primer9
gctatttcta gctctaaaac tcagctgaat aacctgtggg aggtcccacc gagatttgaa 60
c 61
<210> 17
<223> CBE4-Puro-gag1F
gtacgggcca gatatacgcg taagcttgag ggcctatttc ccatgattcc t 51
<210> 18
<223> CBE4-Puro-gag1R
gccctcgggt ctagaaaaaa agcaccga 28
<210> 19
<223> CBE4-Puro-pol1F
ttttttctag acccgagggc ctatttccca tgattc 36
<210> 20
<223> CBE4-Puro-pol1R
gcccctcgag aaaaaaagca ccgactcggt g 31
<210> 21
<223> CBE4-Puro-pol2F
tgcttttttt ctcgaggggc aggaagaggg cctatttccc a 41
<210> 22
<223> CBE4-Puro-pol2R
caataatcaa tgtcaacgcg tagaaaaaaa gcaccgactc gg 42
<210> 23
<223> pCEP4-F1
ggccgcgttt aaacagctgg catgaagctt tcg 33
<210> 24
<223> pCEP4-R1
cgaaagcttc atgccagctg tttaaacgc 29
<210> 25
<223> Gag-jianding F1
ggcagacttt ctgtgcctct ga 22
<210> 26
<223> Gag-jianding R1
gcagcggtaa tatcgcgatc t 21
<210> 27
<223> Pol- jianding F1
ggtagagact tactgaccaa ga 22
<210> 28
<223> Pol- jianding R1
cgctcaagag gttataaggg t 21
<210> 29
<223> M-gag-F1
tcagactgga cccggctctc at 22
<210> 30
<223> M-gag-R1
ccgagtgttt gtttttctct cca 23
<210> 31
<223> M-pol-F1
ttctccccta gtaaagcctg 20
<210> 32
<223> M-pol-R1
cattggtccc aggcttccta 20
<210> 33
<223> 测序结果sgRNA1-1
ccctatatcc ttacgtggca aga 23
<210> 34
<223> 测序结果sgRNA1-2
ccctatatcc ttacgtggca aga 23
<210> 35
<223> 测序结果sgRNA1-3
ccctatatcc ttacgtggca aga 23
<210> 36
<223> 测序结果sgRNA1-4
ccctatatcc ttacgtggca aga 23
<210> 37
<223> 测序结果sgRNA1-5
ccctatatcc ttacgtaaca aga 23
<210> 38
<223> 测序结果sgRNA1-6
ccctatatcc ttacgtggca aga 23
<210> 39
<223> 测序结果sgRNA1-7
ccctatatcc ttacgtggca aga 23
<210> 40
<223> 测序结果sgRNA1-8
ccctatatcc ttacgtggca aga 23
<210> 41
<223> 测序结果sgRNA1-9
ccctatattc ttacgtggca aga 23
<210> 42
<223> 测序结果sgRNA1-10
ccctatatcc ttacatggca aga 23
<210> 43
<223> 测序结果sgRNA2-1
ccatgggtta aaccatggct aaa 23
<210> 44
<223> 测序结果sgRNA2-2
ccatgggtta aaccataact aaa 23
<210> 45
<223> 测序结果sgRNA2-3
ccatgggtta aaccatggct aaa 23
<210> 46
<223> 测序结果sgRNA2-4
ccatgggtta aaccataact aaa 23
<210> 47
<223> 测序结果sgRNA2-5
ccatgggtta aaccataact aaa 23
<210> 48
<223> 测序结果sgRNA2-6
ccatgggtta aaccatggct aaa 23
<210> 49
<223> 测序结果sgRNA2-7
ccatgggtta aaccatggct gaa 23
<210> 50
<223> 测序结果sgRNA2-8
ccatgggtta aaccttggct aaa 23
<210> 51
<223> 测序结果sgRNA2-9
ccatgggtta aaccctggct aaa 23
<210> 52
<223> 测序结果sgRNA2-10
ccatggatta aaccatggct aaa 23
<210> 53
<223> 测序结果sgRNA3-1
ggtccccgaa tcctggctct tgg 23
<210> 54
<223> 测序结果sgRNA3-2
ggtccccgaa tcctggctct tgg 23
<210> 55
<223> 测序结果sgRNA3-3
ggtttttgaa tcctggctct tgg 23
<210> 56
<223> 测序结果sgRNA3-4
ggtttttgaa tcctggctct tgg 23
<210> 57
<223> 测序结果sgRNA3-5
ggtttttgaa tcctggctct tgg 23
<210> 58
<223> 测序结果sgRNA3-6
ggtccccgaa ttctggctct tgg 23
<210> 59
<223> 测序结果sgRNA3-7
ggtccccgaa ttctggctct tgg 23
<210> 60
<223> 测序结果sgRNA3-8
ggtccccgaa ttctggctct tgg 23
<210> 61
<223> 测序结果sgRNA3-9
ggtccccgaa ttctggctct tgg 23
<210> 62
<223> 测序结果sgRNA3-10
ggtccccgag ttctggctct tgg 23
<210> 63
<223> 测序结果sgRNA4-1
ctgattaaga tatacagtcc tgg 23
<210> 64
<223> 测序结果sgRNA4-2
ctgatcaaaa tatacaattc tgg 23
<210> 65
<223> 测序结果sgRNA4-3
tgttcaaaga ttaatccaac agg 23
<210> 66
<223> 测序结果sgRNA4-4
ctgattaaga tatacagtcc tgg 23
<210> 67
<223> 测序结果sgRNA4-5
ctgattaaga tatacagtcc tgg 23
<210> 68
<223> 测序结果sgRNA4-6
ctgatcaaga tatacagtcc tgg 23
<210> 69
<223> 测序结果sgRNA4-7
ctgattaaga tatacagtcc tgg 23
<210> 70
<223> 测序结果sgRNA4-8
ctgattaaga tatacagtcc tgg 23
<210> 71
<223> 测序结果sgRNA4-9
ctgattaaga tatacagtcc tgg 23
<210> 72
<223> 测序结果sgRNA6-1
tgttcaaaga ttaatccaac agg 23
<210> 73
<223> 测序结果sgRNA6-2
tgttcaaaga ttaatccaac agg 23
<210> 74
<223> 测序结果sgRNA6-3
tgttcaaaga ttaatccaac agg 23
<210> 75
<223> 测序结果sgRNA6-4
tgttcaaaga ttaatccaac agg 23
<210> 76
<223> 测序结果sgRNA6-5
tgttcaaaga ttaatccaac agg 23
<210> 77
<223> 测序结果sgRNA6-6
tgttcaaaga ttaatccaac agg 23
<210> 78
<223> 测序结果sgRNA6-7
tgtttaaaga ttaatccaac agg 23
<210> 79
<223> 测序结果sgRNA6-8
tgttcaaaga ttaatccaac agg 23
<210> 80
<223> 测序结果sgRNA6-9
tgttcaaaga ttaatccaac agg 23
<210> 81
<223> 测序结果sgRNA7-1
cctgtccaat ccccttggaa tac 23
<210> 82
<223> 测序结果sgRNA7-2
cctgtccaat ccccttaaaa tac 23
<210> 83
<223> 测序结果sgRNA7-3
cctgtccaat ccccttggaa tac 23
<210> 84
<223> 测序结果sgRNA7-4
cctgtccaat ccccttaaaa tac 23
<210> 85
<223> 测序结果sgRNA7-5
cctgtccaat ccccttaaaa tac 23
<210> 86
<223> 测序结果sgRNA7-6
cctgtccaat ccccttaaaa tac 23
<210> 87
<223> 测序结果sgRNA7-7
cctgtccaat ccccttaaaa tac 23
<210> 88
<223> 测序结果sgRNA7-8
cctgtccaat ccccttaaaa tac 23
<210> 89
<223> 测序结果sgRNA7-9
cctgtccaat ccccttaaaa tac 23
<210> 90
<223> pCMV-BE4max-P2A-Puro序列
atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 60
cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 120
ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 180
cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 240
atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 300
ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctggttt agtgaaccgt cagatccgct 360
agagatccgc ggccgctaat acgactcact atagggagag ccgccaccat gaaacggaca 420
gccgacggaa gcgagttcga gtcaccaaag aagaagcgga aagtctcctc agagactggg 480
cctgtcgccg tcgatccaac cctgcgccgc cggattgaac ctcacgagtt tgaagtgttc 540
tttgaccccc gggagctgag aaaggagaca tgcctgctgt acgagatcaa ctggggaggc 600
aggcactcca tctggaggca cacctctcag aacacaaata agcacgtgga ggtgaacttc 660
atcgagaagt ttaccacaga gcggtacttc tgccccaata ccagatgtag catcacatgg 720
tttctgagct ggtccccttg cggagagtgt agcagggcca tcaccgagtt cctgtccaga 780
tatccacacg tgacactgtt tatctacatc gccaggctgt atcaccacgc agacccaagg 840
aataggcagg gcctgcgcga tctgatcagc tccggcgtga ccatccagat catgacagag 900
caggagtccg gctactgctg gcggaacttc gtgaattatt ctcctagcaa cgaggcccac 960
tggcctaggt acccacacct gtgggtgcgc ctgtacgtgc tggagctgta ttgcatcatc 1020
ctgggcctgc ccccttgtct gaatatcctg cggagaaagc agccccagct gaccttcttt 1080
acaatcgccc tgcagtcttg tcactatcag aggctgccac cccacatcct gtgggccaca 1140
ggcctgaagt ctggaggatc tagcggagga tcctctggca gcgagacacc aggaacaagc 1200
gagtcagcaa caccagagag cagtggcggc agcagcggcg gcagcgacaa gaagtacagc 1260
atcggcctgg ccatcggcac caactctgtg ggctgggccg tgatcaccga cgagtacaag 1320
gtgcccagca agaaattcaa ggtgctgggc aacaccgacc ggcacagcat caagaagaac 1380
ctgatcggag ccctgctgtt cgacagcggc gaaacagccg aggccacccg gctgaagaga 1440
accgccagaa gaagatacac cagacggaag aaccggatct gctatctgca agagatcttc 1500
agcaacgaga tggccaaggt ggacgacagc ttcttccaca gactggaaga gtccttcctg 1560
gtggaagagg ataagaagca cgagcggcac cccatcttcg gcaacatcgt ggacgaggtg 1620
gcctaccacg agaagtaccc caccatctac cacctgagaa agaaactggt ggacagcacc 1680
gacaaggccg acctgcggct gatctatctg gccctggccc acatgatcaa gttccggggc 1740
cacttcctga tcgagggcga cctgaacccc gacaacagcg acgtggacaa gctgttcatc 1800
cagctggtgc agacctacaa ccagctgttc gaggaaaacc ccatcaacgc cagcggcgtg 1860
gacgccaagg ccatcctgtc tgccagactg agcaagagca gacggctgga aaatctgatc 1920
gcccagctgc ccggcgagaa gaagaatggc ctgttcggaa acctgattgc cctgagcctg 1980
ggcctgaccc ccaacttcaa gagcaacttc gacctggccg aggatgccaa actgcagctg 2040
agcaaggaca cctacgacga cgacctggac aacctgctgg cccagatcgg cgaccagtac 2100
gccgacctgt ttctggccgc caagaacctg tccgacgcca tcctgctgag cgacatcctg 2160
agagtgaaca ccgagatcac caaggccccc ctgagcgcct ctatgatcaa gagatacgac 2220
gagcaccacc aggacctgac cctgctgaaa gctctcgtgc ggcagcagct gcctgagaag 2280
tacaaagaga ttttcttcga ccagagcaag aacggctacg ccggctacat tgacggcgga 2340
gccagccagg aagagttcta caagttcatc aagcccatcc tggaaaagat ggacggcacc 2400
gaggaactgc tcgtgaagct gaacagagag gacctgctgc ggaagcagcg gaccttcgac 2460
aacggcagca tcccccacca gatccacctg ggagagctgc acgccattct gcggcggcag 2520
gaagattttt acccattcct gaaggacaac cgggaaaaga tcgagaagat cctgaccttc 2580
cgcatcccct actacgtggg ccctctggcc aggggaaaca gcagattcgc ctggatgacc 2640
agaaagagcg aggaaaccat caccccctgg aacttcgagg aagtggtgga caagggcgct 2700
tccgcccaga gcttcatcga gcggatgacc aacttcgata agaacctgcc caacgagaag 2760
gtgctgccca agcacagcct gctgtacgag tacttcaccg tgtataacga gctgaccaaa 2820
gtgaaatacg tgaccgaggg aatgagaaag cccgccttcc tgagcggcga gcagaaaaag 2880
gccatcgtgg acctgctgtt caagaccaac cggaaagtga ccgtgaagca gctgaaagag 2940
gactacttca agaaaatcga gtgcttcgac tccgtggaaa tctccggcgt ggaagatcgg 3000
ttcaacgcct ccctgggcac ataccacgat ctgctgaaaa ttatcaagga caaggacttc 3060
ctggacaatg aggaaaacga ggacattctg gaagatatcg tgctgaccct gacactgttt 3120
gaggacagag agatgatcga ggaacggctg aaaacctatg cccacctgtt cgacgacaaa 3180
gtgatgaagc agctgaagcg gcggagatac accggctggg gcaggctgag ccggaagctg 3240
atcaacggca tccgggacaa gcagtccggc aagacaatcc tggatttcct gaagtccgac 3300
ggcttcgcca acagaaactt catgcagctg atccacgacg acagcctgac ctttaaagag 3360
gacatccaga aagcccaggt gtccggccag ggcgatagcc tgcacgagca cattgccaat 3420
ctggccggca gccccgccat taagaagggc atcctgcaga cagtgaaggt ggtggacgag 3480
ctcgtgaaag tgatgggccg gcacaagccc gagaacatcg tgatcgaaat ggccagagag 3540
aaccagacca cccagaaggg acagaagaac agccgcgaga gaatgaagcg gatcgaagag 3600
ggcatcaaag agctgggcag ccagatcctg aaagaacacc ccgtggaaaa cacccagctg 3660
cagaacgaga agctgtacct gtactacctg cagaatgggc gggatatgta cgtggaccag 3720
gaactggaca tcaaccggct gtccgactac gatgtggacc atatcgtgcc tcagagcttt 3780
ctgaaggacg actccatcga caacaaggtg ctgaccagaa gcgacaagaa ccggggcaag 3840
agcgacaacg tgccctccga agaggtcgtg aagaagatga agaactactg gcggcagctg 3900
ctgaacgcca agctgattac ccagagaaag ttcgacaatc tgaccaaggc cgagagaggc 3960
ggcctgagcg aactggataa ggccggcttc atcaagagac agctggtgga aacccggcag 4020
atcacaaagc acgtggcaca gatcctggac tcccggatga acactaagta cgacgagaat 4080
gacaagctga tccgggaagt gaaagtgatc accctgaagt ccaagctggt gtccgatttc 4140
cggaaggatt tccagtttta caaagtgcgc gagatcaaca actaccacca cgcccacgac 4200
gcctacctga acgccgtcgt gggaaccgcc ctgatcaaaa agtaccctaa gctggaaagc 4260
gagttcgtgt acggcgacta caaggtgtac gacgtgcgga agatgatcgc caagagcgag 4320
caggaaatcg gcaaggctac cgccaagtac ttcttctaca gcaacatcat gaactttttc 4380
aagaccgaga ttaccctggc caacggcgag atccggaagc ggcctctgat cgagacaaac 4440
ggcgaaaccg gggagatcgt gtgggataag ggccgggatt ttgccaccgt gcggaaagtg 4500
ctgagcatgc cccaagtgaa tatcgtgaaa aagaccgagg tgcagacagg cggcttcagc 4560
aaagagtcta tcctgcccaa gaggaacagc gataagctga tcgccagaaa gaaggactgg 4620
gaccctaaga agtacggcgg cttcgacagc cccaccgtgg cctattctgt gctggtggtg 4680
gccaaagtgg aaaagggcaa gtccaagaaa ctgaagagtg tgaaagagct gctggggatc 4740
accatcatgg aaagaagcag cttcgagaag aatcccatcg actttctgga agccaagggc 4800
tacaaagaag tgaaaaagga cctgatcatc aagctgccta agtactccct gttcgagctg 4860
gaaaacggcc ggaagagaat gctggcctct gccggcgaac tgcagaaggg aaacgaactg 4920
gccctgccct ccaaatatgt gaacttcctg tacctggcca gccactatga gaagctgaag 4980
ggctcccccg aggataatga gcagaaacag ctgtttgtgg aacagcacaa gcactacctg 5040
gacgagatca tcgagcagat cagcgagttc tccaagagag tgatcctggc cgacgctaat 5100
ctggacaaag tgctgtccgc ctacaacaag caccgggata agcccatcag agagcaggcc 5160
gagaatatca tccacctgtt taccctgacc aatctgggag cccctgccgc cttcaagtac 5220
tttgacacca ccatcgaccg gaagaggtac accagcacca aagaggtgct ggacgccacc 5280
ctgatccacc agagcatcac cggcctgtac gagacacgga tcgacctgtc tcagctggga 5340
ggtgacagcg gcgggagcgg cgggagcggg gggagcacta atctgagcga catcattgag 5400
aaggagactg ggaaacagct ggtcattcag gagtccatcc tgatgctgcc tgaggaggtg 5460
gaggaagtga tcggcaacaa gccagagtct gacatcctgg tgcacaccgc ctacgacgag 5520
tccacagatg agaatgtgat gctgctgacc tctgacgccc ccgagtataa gccttgggcc 5580
ctggtcatcc aggattctaa cggcgagaat aagatcaaga tgctgagcgg aggatccgga 5640
ggatctggag gcagcaccaa cctgtctgac atcatcgaga aggagacagg caagcagctg 5700
gtcatccagg agagcatcct gatgctgccc gaagaagtcg aagaagtgat cggaaacaag 5760
cctgagagcg atatcctggt ccataccgcc tacgacgaga gtaccgacga aaatgtgatg 5820
ctgctgacat ccgacgcccc agagtataag ccctgggctc tggtcatcca ggattccaac 5880
ggagagaaca aaatcaaaat gctgtctggc ggctcaaaaa gaaccgccga cggcagcgaa 5940
ttcgagccca agaagaagag gaaagtcggc agtggagagg gcagaggaag tctgctaaca 6000
tgcggtgacg tcgaggagaa tcctggccca atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc 6060
gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac 6120
cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa 6180
gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc 6240
gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag 6300
atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa 6360
ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag cccgcgtggt tcctggccac cgtcggagtc 6420
tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg 6480
gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc 6540
tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc 6600
tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctct ggtggttctc ccaagaagaa gaggaaagtc 6660
taaccggtca tcatcaccat caccattgag tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc 6720
cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag 6780
gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta 6840
ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag 6900
acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca 6960
gctggggctc gataccgtcg acctctagct agagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt 7020
ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 7080
agtgtaaagc ctagggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 7140
tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 7200
cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 7260
gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 7320
ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 7380
ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 7440
atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 7500
aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 7560
gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 7620
ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 7680
ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 7740
acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 7800
gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat 7860
ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 7920
ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 7980
gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacactcagt 8040
ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 8100
agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 8160
ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 8220
gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 8280
catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 8340
cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 8400
cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 8460
gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 8520
tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 8580
gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 8640
tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 8700
gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 8760
gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 8820
taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 8880
tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 8940
ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 9000
taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 9060
tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 9120
aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtcgac ggatcgggag 9180
atcgatctcc cgatccccta gggtcgactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt 9240
taagccagta tctgctccct gcttgtgtgt tggaggtcgc tgagtagtgc gcgagcaaaa 9300
tttaagctac aacaaggcaa ggcttgaccg acaattgcat gaagaatctg cttagggtta 9360
ggcgttttgc gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga 9420
ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 9480
gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 9540
tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 9600
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatc 9654
<210> 91
<223> pU6-gRNA序列
cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 60
cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 120
acatgtgagc aaaaggccag caaaagccca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 180
ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 240
ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 300
gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 360
gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 420
ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 480
actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 540
gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 600
ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 660
ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 720
gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 780
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 840
tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 900
gcacgtgtca gtcctgctcc tcggccacga agtgcacgca gttgccggcc gggtcgcgca 960
gggcgaactc ccgcccccac ggctgctcgc cgatctcggt catggccggc ccggaggcgt 1020
cccggaagtt cgtggacacg acctccgacc actcggcgta cagctcgtcc aggccgcgca 1080
cccacaccca ggccagggtg ttgtccggca ccacctggtc ctggaccgcg ctgatgaaca 1140
gggtcacgtc gtcccggacc acaccggcga agtcgtcctc cacgaagtcc cgggagaacc 1200
cgagccggtc ggtccagaac tcgaccgctc cggcgacgtc gcgcgcggtg agcaccggaa 1260
cggcactggt caacttggcc atggtggccc tcctcacgtg ctattattga agcatttatc 1320
agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 1380
gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgtatg cggtgtgaaa taccgcacag 1440
atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggaa attgtaagcg ttaataattc agaagaactc 1500
gtcaagaagg cgatagaagg cgatgcgctg cgaatcggga gcggcgatac cgtaaagcac 1560
gaggaagcgg tcagcccatt cgccgccaag ctcttcagca atatcacggg tagccaacgc 1620
tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag ccggccacag tcgatgaatc cagaaaagcg 1680
gccattttcc accatgatat tcggcaagca ggcatcgcca tgggtcacga cgagatcctc 1740
gccgtcgggc atgctcgcct tgagcctggc gaacagttcg gctggcgcga gcccctgatg 1800
ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag accggcttcc atccgagtac gtgctcgctc 1860
gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg gcaggtagcc ggatcaagcg tatgcagccg 1920
ccgcattgca tcagccatga tggatacttt ctcggcagga gcaaggtgag atgacaggag 1980
atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag ccagtccctt cccgcttcag tgacaacgtc 2040
gagcacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt ggccagccac gatagccgcg ctgcctcgtc 2100
ttgcagttca ttcagggcac cggacaggtc ggtcttgaca aaaagaaccg ggcgcccctg 2160
cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga gcagccgatt gtctgttgtg cccagtcata 2220
gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg agaacctgcg tgcaatccat cttgttcaat 2280
catgcgaaac gatcctcatc ctgtctcttg atcagagctt gatcccctgc gccatcagat 2340
ccttggcggc gagaaagcca tccagtttac tttgcagggc ttcccaacct taccagaggg 2400
cgccccagct ggcaattccg gttcgcttgc tgtccataaa accgcccagt ctagctatcg 2460
ccatgtaagc ccactgcaag ctacctgctt tctctttgcg cttgcgtttt cccttgtcca 2520
gatagcccag tagctgacat tcatccgggg tcagcaccgt ttctgcggac tggctttcta 2580
cgtgaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgcctgaca tttatattcc 2640
ccagaacatc aggttaatgg cgtttttgat gtcattttcg cggtggctga gatcagccac 2700
ttcttccccg ataacggaga ccggcacact ggccatatcg gtggtcatca tgcgccagct 2760
ttcatccccg atatgcacca ccgggtaaag ttcacgggag actttatctg acagcagacg 2820
tgcactggcc agggggatca ccatccgtcg ccccggcgtg tcaataatat cactctgtac 2880
atccacaaac agacgataac ggctctctct tttataggtg taaaccttaa actgccgtac 2940
gtataggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca 3000
gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca 3060
gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attgtaatac gactcactat agggcgaatt 3120
gggccctcta gatgcatgct cgagcggccg ccagtgtgat ggatatctgc agaattcgcc 3180
ctttgtacaa aaaagcaggc tttaaaggaa ccaattcagt cgactggatc cggtaccaag 3240
gtcgggcagg aagagggcct atttcccatg attccttcat atttgcatat acgatacaag 3300
gctgttagag agataattag aattaatttg actgtaaaca caaagatatt agtacaaaat 3360
acgtgacgta gaaagtaata atttcttggg tagtttgcag ttttaaaatt atgttttaaa 3420
atggactatc atatgcttac cgtaacttga aagtatttcg atttcttggc tttatatatc 3480
ttgtggaaag gacgaaacac cgggtcttcg agaagacctg ttttagagct agaaatagca 3540
agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt 3600
ttctagaccc agctttcttg tacaaagttg gcattaaagg gcgaattcca gcacactggc 3660
ggccgttact agtggatccg agctcggtac caagcttgat gcatagcttg agtattctat 3720
agtgtcacct aaatagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 3780
atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 3840
cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 3900
gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 3960
gtattgggcg ct 3972

Claims (8)

1.一种识别猪PERV基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶序列为A1-A8中任意一种：
A1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
A2.核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
A3.核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
A4.核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
A5.核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
A6.核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
A7.核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
A8.A1-A7中任一核苷酸经过一个或多个核苷酸的取代和/或缺失和/或插入仍具有相同功能的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述识别猪PERV基因的sgRNA，其特征在于，所述识别猪PERV基因的sgRNA为A1-A8中任意两种或两种以上成的sgRNA。
3.根据权利要求2所述识别猪PERV基因的sgRNA，其特征在于，所述识别猪PERV基因的sgRNA为A1-A8组成的sgRNA。
4.编码权利要求1-3任一项所述sgRNA的DNA、含有所述DNA的表达盒或表达载体。
5.一种识别猪PERV基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，其sgRNA为权利要求1-3任一项所述识别猪PERV基因的sgRNA。
6.权利要求1-3任一项所述识别猪PERV基因的sgRNA或权利要求4所述DNA、表达盒、表达载体或权利要求5所述CRISPR/Cas9系统在制备B1-B2中一种产品中的应用：
B1.编辑猪PERV基因；
B2.构建猪PERV基因敲除细胞或动物模型；
所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。
7.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述识别猪PERV基因的sgRNA或权利要求4所述DNA、表达盒、表达载体或权利要求5所述CRISPR/Cas9系统。
8.一种猪PERV基因编辑的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求5所述CRISPR/Cas9系统导入出发细胞，实现猪PERV基因的编辑。
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