PT698106E - Marcador genetico - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

MARCADOR GENÉTICO

Esta invenção está relacionada com um marcador genético quimérico seleccionável que compreende: um promotor que pode ser expresso em plantas, ADN que codifica uma aminoglicosido-6’-N-acetiltransferase (a “AAC(6’)”) e uma formação 3’-terminal e região de políadenilação activa em células vegetais.

Esta invenção está ainda relacionada com um processo para seleccionar ou identificar· células vegetais transformadas, através da expressão do marcador genético quimérico que codifica a AAC(6’), nas células vegetais. O marcador genético quimérico confere às células vegetais resistência a concentrações normalmente letais ou supressoras do crescimento de um antibiótico que é eficientemente desintoxicado pela AAC(6’) nas células.

Esta invenção está também relacionada com uma célula vegetal transformada, de uma forma estável, com o marcador genético quimérico que codifica a AAC(6’) e com uma planta regenerada a partir desta célula vegetal.

Antecedentes da invenção A tecnologia da engenharia genética de plantas tem feito progressos significativos durante a última década. Tornou-se possível introduzir, de uma forma estável, genes estranhos em plantas. Isto tem proporcionado oportunidades emocionantes para a agricultura moderna. A utilização de marcadores genéticos quiméricos seleccionáveis na transformação de células vegetais tem simplificado consideravelmente a selecção de células vegetais transformadas. Por exemplo, através da expressão de um marcador genético deste tipo, células vegetais transformadas podem tornar-se resistentes a antibióticos que são citotóxicos ou supressores do crescimento para células não transformadas. Um marcador genético quimérico habitualmente usado contém a região que codifica a neomicina-fosfotransferase-ll ou nptll (Bevan et al. (1983) Nature 304.184-187; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80,4803-4807). O gene nptll confere resistência a canamicina, 1 neomicina e antibióticos G-418 em células vegetais que expressam o gene (Reynaerts et al. (1987) Plant Mol. Bioi. Manual, Gelvin, S.B. & Schiiperoort, R.A. (eds), Kluwer, Dordrecht, sec. A9, pp. 1-16).

Os marcadores genéticos quiméricos contêm normalmente: um promotor que pode ser expresso em plantas (com uma região 5’ não traduzida); ADN (tal como o gene nfitll) que codifica um marcador seleccionável; e uma formação 3’-terminal e região de poliadenilação activa em plantas. Embora a versatilidade do gene nptll tenha sido confirmada em marcadores genéticos quiméricos utilizados em vários sistemas vegetais ao longo dos anos, têm surgido limitações à sua utilização que-'têm obrigado ao desenvolvimento de genes alternativos de resistência a antibióticos para uso nestes marcadores genéticos quiméricos seleccionáveis (Hayford et al. (1988) Plant Physiol. 86, 1216). Além disso, em muitas situações, tem sido necessário um segundo gene de resistência a antibióticos complementar para introdução em plantas que já haviam sido transformadas com um gene de resistência a antibióticos. Estes genes de resistência a antibióticos alternativos já existem, mas exigem frequentemente o uso de substratos muito tóxicos e/ou não permitem uma selecção eficiente em todas as espécies de plantas. Claro que para espécies que são rotineiramente reproduzíveis de uma forma vegetativa, como seja a batata, são necessários genes de resistência a antibióticos que codificam diferentes marcadores seleccionáveis, com diferentes substratos específicos, quando é necessário alterar genes distintos, em diferentes momentos, numa planta.

Entre os genes de resistência a antibióticos conhecidos encontram-se aqueles que codificam enzimas que acetilam antibióticos aminoglicosidos (AAC), entre as quais foram caracterizados quatro tipos (com base na posição do grupo amino modificado dos aminoglicosidos derivados de 2-desoxiestreptamina): AAC(1), AAC(2’), AAC(3) e AAC(6’). Consultar Shaw et al. (1989) Antimicrob. Agents & Chemotherapy 33, 2052-2062. A análise por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) demonstrou as diferenças entre os produtos acetilados destes quatro tipos de enzimas, e os perfis de resistência a aminoglicosidos podem ser usados para identificar a presença de cada um destes tipos de enzimas numa estirpe hospedeira (Shaw et al. (1989) supra). A Publicação de Patente Europeia (“EP”) 0 289 478 (Rogers et al. (1988)), Hayford et al. (1988) supra e Carrer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17, 301-303 descrevem a selecção em gentamicina de plantas transformadas com um gene que codifica uma aminoglicosido-3- 2 N-acetiltransferase (o “gene aaç(3)”). Constatou-se que o gene aaç(3)-IV conferia resistência a canamicina (em Petúnia), mas o nível de resistência era, no máximo, apenas suficiente para uma selecção marginal (Hayford et al. (1988) supra). Estas publicações também descrevem a supertransformação do tabaco, previamente transformado com o gene ηρίΙΙ, com o gene aac(3). através de selecção em meio contendo gentamicina. A EP 0 289 478 também descreve a utilização de gentamicina como substrato na transformação de petúnia, rebentos de soja, sementes de colza e alfafa com o gene aaç(3). Carrer et al. (1991) supra também descrevem a transformação de plantas de tabaco com um gene aaç(3)-l, que apenas confere resistência a gentamicina, na qual as plantas resistentes a gentamicina retêm a sua sensibilidade acanamicina. De acordo com Carrer et al. (1991) suora. nalguns casos poderá ser mais vantajoso utilizar um marcador genético seleccionável com uma especificidade restrita de substratos.

Os genes que codificam a AAC(6’) (os “genes aac(6T) constituem uma classe de genes diferentes, mas relacionados que acetilam o grupo 6’-amino de vários antibióticos aminoglicosidos. Vários genes aaç(6’) bacterianos foram clonados e sequenciados. De acordo com Davis (1986) in Antibiotics in Laboratorv Medicine, pp. 474-489, (ed.) Lorian V., Williams & Wilkins, Baltimore, Maryland; e Phillips & Shannon (1984) British Med. Buli. 40, 28-35, a AAC(6’) acetila a tobramicina, a canamicina, a amicacina, a neomicina, a gentamicina C1A e C2, a sissomicina e a netilmicina, embora com eficiências variáveis dependendo do tipo de AAC(6’). Foram caracterizados dois subtipos de genes aaç(6’) através dos seus perfis de resistência a aminoglicosidos: os genes aac(6’)-l e os genes aac-(6’)-ll; a primeira subclasse compreende os genes aac(6')-IV e -4, e a última subclasse compreende o gene aac(6’)-lll (Shaw et al. (1989) supra). Contudo, também foram efectuadas outras classificações destes genes.

Também se constatou que outra acetiltransferase, a fosfinotricina-acetiltransferase, é capaz de conferir um fenótipo seleccionável (isto é, resistência a um herbicida) em células vegetais (De Block et al. (1987) EMBO J. 6, 2513-2518). A EP 0 248 207 (Wohlleben et al., 1987) descreve um gene de resistência a gentamicina que ó activo em Streptomvces e que pode ser obtido a partir de uma estirpe de S. ohanaensis por digestão total com Bglll. 3 A Publicação de Patente Francesa 2 601 965 (Courvalin, 1988) descreve um gene bifuncional que codifica actividades de AAC(6') e APH(2”), a clonagem e sequenciação deste gene e o uso de partes do gene como uma sonda de ADN para detectar o desenvolvimento de resistência a antibióticos em culturas bacterianas.

Sumário da invenção

De acordo com esta invenção, é disponibilizado um marcador genético quimérico seieccionável (o “gene aacfô’) quimérico”) que compreende os seguintes elementos, ligados de JormaOperacional, no mesmo locus genético: um promoton-que^pode^ser expresso em plantas; uma sequência de ADN que codifica uma AAC(6’) (o “ADN aaç(6’)”), particularmente um ADN aaç(6’) com a sequência da SEQ ID N.a 1, sob o controlo do promotor; e uma formação 3’-terminal e região de poliadenilação activa em células vegetais.

Também de acordo com esta invenção, é disponibilizado um método para seleccionar ou identificar células vegetais transformadas por: transformação das células com o gene aaç(6’) quimérico, seguida de contacto das células com concentrações de um antibiótico aminoglicosido que são letais ou supressoras do crescimento para células vegetais não transformadas.

Adicionalmente, de acordo com a invenção, é disponibilizada uma célula vegetal transformada, de forma estável, com o gene aaç(6’) quimérico, uma cultura de células vegetais e uma planta regenerada a partir desta célula vegetal, um vector de transformação para plantas, um plasmídeo e uma estirpe de Aarobacterium contendo o gene aaç(6’) quimérico.

Descricão detalhada da invenção O termo “ADN aac(6T. tal como aqui utilizado, designa uma sequência codificante de ADN codificando uma proteína (uma “AAC(6’)”) que catalisa a acetilação do grupo 6’-amino de antibióticos aminoglicosldos. Este termo Inclui uma sequência de ADN parcial ou totalmente sintética, assim como uma sequência de ADN natural que codifica uma AAC(6’.). Os ADNs aaç(6’) preferidos, de acordo com esta invenção, incluem o ADN da SEQ ID N.s 1 e ADNs substancialmente semelhantes, tais como os ADNs aaç(6’) 4 descritos por Nobuta et al. (1988) J. Bacteriol. 170. 3769; Tolmaski (1990) Plasmid 24. 218-226; e Tran van Nhieu e Collatz (1987) J. Bacteriol. 169. 5708. Outros ADNs aac(6’) desta Invenção Incluem aqueles descritos por Davles e Smlth (1978) Ann. Rev. Microbiol. 32. 469-518; Morohoshi et al. (1984) J. Antibiotics 37,1687-1691; Tenover et al. (1988) J. Bacteriol. 170. 471; Ferretti et al. (1986) J. Bacteriol. 167. 631; e Shaw et al. (1989) Antimicrob. Agents and Chemotherapv 33.2052. O termo “gene aac(6‘) quimérico”, tal como aqui utilizado, designa um marcador genético quimérico seleccionável que compreende o ADN aac(6’). ligado de forma operacional a um promotor que pode ser expresso em plantas (incluiridoiumâ'região 5’ não traduzida) e a uma formação 3’-terminal e região de poliadenilação activa em plantas. O ADN aac(6’) também pode ser expresso como uma proteína de fusão numa fusão genética quimérica com outro ADN transformante, de forma a realçar a selecção do genótipo desejado. A construção desta fusão genética quimérica pode ser efectuada de acordo com técnicas derivadas de métodos habitualmente utilizados para construir genes quiméricos que compreendem marcadores conhecidos. O termo “marcador genético seleccionável”, tal como aqui utilizado, designa uma sequência de ADN cuja expressão, numa célula vegetal, confere um fenótipo seleccionável (por exemplo, resistência a antibióticos) à célula vegetal. O termo “modificações neutras em termos da tradução”, tal como aqui utilizado, designa modificações de um gene ou de uma sequência de ADN que não afectam a sequência de aminoácidos codificada pelo gene ou sequência de ADN. Os exemplos preferidos destas modificações neutras em termos da tradução são alterações, por meio de substituições de nucleótidos, de codões noutros codões que codificam os mesmos aminoácidos. O termo “substrato adequado” ou “antibiótico substrato adequado”, tal como aqui utilizado, é um antibiótico aminoglicosido (por exemplo, a canamicina) que é eficientemente modificado por AAC(6’), de forma que a expressão do ADN aac(6’) numa célula vegetal confere resistência ao antibiótico na célula vegetal. Por este motivo, o termo “substrato de uma AAC(6’)”, tal como aqui utilizado, designa qualquer antibiótico aminoglicosido que pode ser modificado, isto é, acetilado, pelo produto do gene aac(6”). 5

Um ADN aaç(6’) desta invenção pode ser facilmente isolado de bactérias através de procedimentos de rotina, após crescimento num substrato adequado contendo normalmente níveis inibitórios de um antibiótico aminoglicosido, como seja a canamlclna; por exemplo, como descrito por Nobuta et al. (1988) J. Bacteriol. 170. 3769. A actividade de AAC(6’) pode ser analisada por métodos convencionais (Davies (1986) supra: Shaw et al. (1989) supra).

De preferência, um ADN aac(6*) desta invenção é inserido no genoma de uma planta a jusante (isto é, 3’) de, e sob o controlo de, um promotor que pode dirigir a expressão do gene em células vegetais^ -Qs^promotores preferidos incluem, mas não se limitam ao forte - ·«* promotor constitutivo 35S (Odell et al. (1985) Nature 313. 810) ou ao promotor duplicado 35S (Kay et al. (1987) Science 236. 1299) do vírus do mosaico da couve-flor; os promotores 35S têm sido obtidos a partir de diferentes isolados (Hull & Howell (1987) Virology 86, 482-493). Outros promotores preferidos incluem o promotor TR1’ e o promotor TR2’ (Velten et al. (1984) EMBO J. 3, 2723). Também preferidos são os promotores monocotiledóneos, como sejam os promotores descritos em EPO 0 342 926 ou EP 0 459 643. Em alternativa, pode utilizar-se um promotor que não é constitutivo, mas sim específico para um ou mais tecidos ou órgãos vegetais. Por exemplo, o ADN acc(6’) pode ser expresso de forma selectiva nos tecidos verdes de uma planta, colocando o ADN sob o controlo de um promotor ligeiramente induzível, como seja o promotor do gene da subunidade pequena da ribulose-1,5-bifosfato-carboxilase, tal como descrito em EP 0 193 259. Outra alternativa consiste em usar um promotor cuja expressão é induzível pela temperatura ou por factores químicos, ou um promotor que é expresso, preferencial ou selectivamente, no período de tempo ou na fase de desenvolvimento em que as células são seleccionadas, como seja um promotor específico para a formação de calos, os quais têm sido anteriormente utilizados com outros marcadores. Em qualquer caso, é evidente que um promotor a utilizar nesta invenção deve pelo menos permitir uma expressão suficiente do ADN aac(6’) em células vegetais para conferir resistência a antibióticos nas células vegetais. É preferido que o ADN aac(6’) seja inserido a montante (isto é, 5') de sinais de regulação da transcrição 3’ adequados (isto é, sinais de formação 3‘-termlnal e de poliadenílação do transcrito). Os sinais de regulação da transcrição 3’ preferidos incluem aqueles do gene da chalcona-sintase (Sommer & Saedler (1986) Mol. Gen. Genet. 202, 429), do vírus do mosaico da couve-flor (Mogen et al. (1990) The Plant Cell 2,1261), do gene da octopina- 6 sintase (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3, 835) ou do gene 7 do T-ADN (Velten & Schell (1985) Nucl. Acids Res. 13, 6981).

De acordo com esta invenção, pode inserir-se, de forma estável, todo ou parte de um ADN aaç(6’) desta invenção, de uma maneira convencional, no genoma nuclear de uma célula vegetal, e a célula vegetal assim transformada pode ser utilizada para produzir uma planta transgénica que apresenta resistência a antibióticos aminoglicosidos. A este respeito, pode usar-se um plasmídeo-Ti desactivado contendo o gene aaç(6’) quimérico em Aarobacterium (por exemplo, A. tumefaciens) para transformar uma célula vegetal, - usándò-ós procedimentos descritos, por exemplo, em EP 0 116 718-e»EP 0/2-70'822, na Publicação PCT WO 84/02913, em EP 0 242 246, em De Block (1988) Theor. Appl. Genet. 76, 767-774, e em Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95, 426 (que são aqui incorporadas por meio de referência). Os vectores plasmídicos-Ti preferidos contêm o gene aaç(6’) quimérico entre as sequências de fronteira, ou pelo menos localizado para a esquerda da sequência de fronteira direita, do T-ADN do plasmídeo-Ti. Obviamente, podem utilizar-se outros tipos de vectores para transformar a célula vegetal, usando procedimentos como a transferência directa de genes (como descrito, por exemplo, em EP 0 233 247), a transformação mediada por pólen (como descrito, por exemplo, em EP 0 270 356, Publicação PCT WO 85/01856 e Patente U.S. 4,684,611), a transformação mediada pelo ARN de vírus de plantas (como descrito, por exemplo, em EP 0 067 553 e Patente U.S. 4,407,956), a transformação mediada por liposomas (como descrito, por exemplo, na Patente U.S. 4,536,475) e outros métodos tal como os métodos para transformar monocotiledónias (por exemplo, os cereais principais que incluem o milho, o arroz, o trigo, a cevada e o centeio) como descritos na Publicação PCT WO 92/09696. No caso da planta a transformar ser o milho, também se podem utilizar outros métodos recentemente desenvolvidos como seja, por exemplo, o método descrito para certas linhas de milho por Fromm et al. (1990) Bio/Tech. 8, 833; Gordon-Kamm et al. (1990) The Plant Cell 2,603; e Gould et al. (19911 supra. No caso da planta a transformar ser o arroz, também se podem utilizar outros métodos recentemente desenvolvidos como sejam, por exemplo, os métodos descritos por Shimamoto et al. (1989) Nature 338,274; Datta et al. (1990) Bio/Tech. 8, 736; e Hayashimoto et al. (1990) Plant Physiol. 93,857.

De forma a melhorar a expressão numa planta do gene aac(6’1 quimérico desta invenção, pode modificar-se o ADN aaç(6’), por exemplo, alterando o emprego natural dos seus codões para formar um ADN aaç(6’) artificial equivalente. Estas modificações podem 7 incluir a introdução de intrões funcionais e/ou de modificações neutras em termos da tradução na sequência de ADN aaç(6’), de forma a eliminar sequências de ADN prejudiciais que estão presentes neste ADN bactehano, tal como descrito no Pedido de Patente PCT PCT/EP92/02547. Isto pode ser feito directamente, por modificação (de uma maneira neutra em termos da tradução) dessas sequências de ADN prejudiciais, inibindo a expressão nas células vegetais, ou indirectamente, por adaptação do emprego dos codões do ADN aacf6’t para aquele preferido pela planta; por exemplo, como descrito por Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 477. Adicionalmente, para conseguir uma expressão suficiente em plantas monocotiledónias como o milho, pode adicionar-se um intrão de monocotiledónia, por exemplo tnntrãò 1*dó gene adh do milho, ligado de forma eficiente ao gene aaç(6’) quimérico (Koziel et al. (1993) Bio/Tech. 11_, 194-200).

Uma planta transformada desta invenção, regenerada a partir de uma célula vegetal transformada com o gene aaç(6’) quimérico, apresenta resistência a antibióticos substratos adequados em virtude da produção de actividade de AAC(6’) nas suas células vegetais. Esta planta pode ser utilizada num esquema de reprodução convencional para produzir mais plantas transformadas com as mesmas características de resistência a antibióticos aminoglicosidos ou para introduzir o gene aaç(6’) quimérico noutras variedades da mesma espécie de planta ou noutras espécies de plantas relacionadas, por meio de técnicas de reprodução padrão. As sementes, que são obtidas a partir das plantas transformadas, contêm o gene aaç(6’) quimérico como uma inserção genómica estável.

Uma vez que o espectro de antibióticos que podem ser quimicamente modificados por expressão de um ADN aaç(6’) desta invenção é diferente daquele da região codificante nptll. o ADN aaç(6’) pode ser utilizado com a região codificante nptll em diferentes marcadores genéticos quiméricos seleccionáveis, quando se querem introduzir dois genes estranhos diferentes numa planta, estando cada gene estranho associado ao seu próprio marcador genético quimérico. Quando se introduzem múltiplos marcadores genéticos quiméricos numa planta, poderá ser vantajoso utilizar um gene aaç(6’) quimérico conferindo apenas resistência a um grupo limitado de antibióticos aminoglicosidos (Carrer et al. (1991) supra). Contudo, se se utilizar apenas um marcador genético quimérico, é preferido usar um gene aaç(6’) quimérico com canamicina como substrato adequado para as células vegetais. A este respeito, o ensaio enzimático para detectar actividade de 8 acetiltransferase é muitas vezes mais rápido e mais conveniente de utilizar que o ensaio de fosfotransferase usado para detectar actividade relacionada com nptll.

Para testar a transformação com êxito de plantas com um ADN aaç(6’) estão disponíveis diferentes métodos. Por exemplo, a resistência a antibióticos pode ser verificada num teste de indução de calos ou num ensaio de aplicação de “spots”; a presença e a actividade de AAC(6’) também pode ser analisada através de um ensaio enzimático: o “Western blotting” pode proporcionar um teste imunológico fácil, mas é menos sensível; e a resistência a canamicina pode ser seguida na descendência de plantas transgénicas através do crescimênto dé sementes em meios que contêm canamicina. ^ '·:

Os exemplos que se seguem ilustram a invenção. Excepto se referido de outra forma nos exemplos, todos os procedimentos para produzir e manipular o ADN recombinante são efectuados segundo os procedimentos normalizados descritos em Sambrook et al.. Molecular Clonina - A Laboratorv Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989) ou em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology vols. 1 and 2, Current Protocols, USA (1994).

Listagem das Seouências A SEQ ID N.9 1 mostra: i) a sequência de ADN de um ADN aaç(6’) proveniente de um plasmídeo de Shiaella e ii) a correspondente sequência de aminoácidos codificada pelo ADN aaç(6’). A SEQ ID N.9 2 mostra: a sequência de aminoácidos da proteína AAC(6’). A SEQ ID N.9 3 mostra: a sequência nucleotídica do iniciador de PCR “RVA61”. A SEQ ID N.9 4 mostra: a sequência nucleotídica do iniciador de PCR OFD15”. A SEQ ID N.9 5 mostra: o plasmídeo “pTRVA3” contendo um gene aaç(6’) quimérico com um promotor 35S-2, o ADN aaç(6’) da SEQ ID N.91 e a formação 3’-terminal e região de poliadenilação do gene 7 do T-ADN. 9 A SEQ ID N.B 6 mostra: a sequência de aminoácidos da proteína AAC(6’).

Exemplos

Exemplo 1. Cionagem de um ADN aaç(6’) e construção de um gene aaç(6’> quimérico O ADN aac(6’) foi obtido a partir do plasmídeo mini-Sa, pGV1106 (Leemans et al. (1982) Gene 19, 361-364). O fragmento Pvull/Hindlll de 1,5 Kb do pGV1106, contendo o ADN aac(6’). foi ligado ao plasmídeo pGSC1600 linearizado com Seal (Comelissen & Vandewiele (1989) Nucl. Acids Res. 17, 19-29), após tratamento com Klenow. O plasmídeo resultante, pFD1002A, foi utilizado como modelo para o PCR, utilizando os iniciadores RVA61 e OFD15 das SEQ ID N.°® 3 e 4, respectivamente. O RVA61 é complementar da cadeia não codificante do ADN aaç(6’) e das suas sequências não traduzidas em pFD1002A. O fragmento de PCR aaç(6’) Sall/BamHI de pFGD1002A foi ligado ao fragmento Sall/BamHI de 7,2 Kb do plasmídeo pGSJ290, que contém o gene quimérico, P35S-nptll-3’a7. para originar o plasmídeo pTRVA3 da SEQ ID N.s 5. O pGSJ290 foi derivado de pGV825 (Deblaere et al. (1985) Nucl. Acids Res. 13, 4777-4787), no qual se clonou uma construção genética P35S-nptll-3’o7 quimérica entre as repetições de fronteira do T-ADN. A extremidade 3’ não traduzida do gene 7 do T-ADN (isto é, 3’g7) foi como descrita por Velten & Schell (1985) supra, o gene nptll foi de pKM109/90 (Reiss et al. (1984) EMBO J. 3, 3317-3322) e o promotor 35S CaMV (isto é, P35S) foi um promotor 35S-2 do vírus do mosaico da couve-flor, como descrito em EP 0 193 259 e em Gardner et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9, 2871-2888. A construção genética P35S-nptll-3’q7 quimérica foi clonada entre os locais Hpal e Bglll do T-ADN, entre as repetições de fronteira direita e esquerda de pGV825.

Devido à introdução de um local de restrição BamHI a jusante do seu local de iniciação da tradução, a sequência de ADN aac(6’) em pTRVA3, como ilustrado na SEQ ID N.s 5, continha os aminoácidos Asp e Pro nas posições 2 e 3, respectivamente, e continha o gene aaç(6’) quimérico, P35S-aaç(6’)-3’g7, incluindo o ADN aaç(6’) com a sequência da SEQ ID N.8 1. 10

Exemplo 2. Selecção de células de tabaco transformadas com aaç(6’) em canamicina.

Os plasmídeos pTRVA3 e pGSJ290 foram mobilizados de E. çx>J[ para a estirpe de A. tumefaciens C58C1-RifR (pGV2260; Deblaere et al. (1985) suoral através de um cruzamento triparental, como descrito por Deblaere et al. (1985) supra e em EP 0 193 259. As Agrobactérias resultantes foram seleccionadas em meio mínimo A (Miller (1972) Experimente in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Células Petit Havana SR1 comerciais de tabaco foram co-crescidas com estas Agrobactérias, e as células de'tábacó'tfansformadas foram seleccionadas usando a resistência a antibióticos, de acordo com De Block et al. (1984) EMBO J. 3,1681-1689. As estirpes de Aarobacterium utilizadas para a infecção dos protoplastos de tabaco foram: C58Cl-Rifn (pGV2260) como controlo negativo; C58C1-RifR (pGV2260::pTRVA3) que contém o ADN aaç(6’); e C58Cl-RifR (pGV2260::pGSJ290) que contém o gene nptll. Uma semana após a infecção, os protoplastos foram transferidos para meios selectivos contendo uma das seguintes concentrações distintas de sulfato de canamicina (Cm): 0-25-50-100, 6200 ng/ml.

Sete semanas após a infecção, começaram a crescer calos a partir das células co-crescidas com C58Cl-RifR (pGV2260::pTRVA3) e C58C1-RifR (pGV2260::pGSJ290), para todas as concentrações de Cm. Os protoplastos infectados com pGV2260 (controlo negativo) só formaram calos em meio sem Cm. Após a transferência dos calos para meio de indução de rebentos contendo 200 pg/ml de Cm, formaram-se facilmente rebentos. A análise de Southern do ADN extraído de plantas de tabaco regeneradas e resistentes a canamicina confirmaram a integração estável do ADN aac(6’).

Exemplo 3. Selecção de células de batata transformadas com aac(6’) em canamicina.

Discos das folhas da variedade de batata Yesmina foram co-crescidos com as estirpes de Aarobacterium tumefaciens C58Cl-RifR (pGV2260::pTRVA3) e C58C1-RifR (pGV2260::pGSJ290) que transportam os genes quiméricos do exemplo 2 contendo ou o ADN aac(6’) ou o gene nptll, como descrito por De Block (1988) supra. Os discos das folhas foram transferidos para meio de indução de calos contendo 50 pg/ml de sulfato de canamicina. Cerca de 30% dos discos das folhas que foram co-crescidos com 11

Aarobacterium C58C1-RifR (pGV2260::pGSJ290) produziram calos em desenvolvimento na presença de canamícina, enquanto cerca de 70% dos discos das folhas que foram co-crescidos com Aarobacterium C58C1-RifR (pGV2260::pTRVA3) produziram calos em desenvolvimento após crescimento durante 6 semanas em meio com canamicina. Após transferência dos calos transformados com aaç(6’) para meio de regeneração de rebentos, formaram-se facilmente rebentos. As plantas de batata regeneradas retêm o fenótipo de resistência a canamicina. A análise de Southern do ADN extraído das plantas de batata resistentes a canamicina e da sua descendência confirma a integração do ADN aaç(6’).

Exemplo 4. Ensaio de actividade enzimática em plantas transformadas com aaç(6’). O calo e o tecido das folhas de tabaco do exemplo 2 contendo o gene aaç(6’) quimérico mostraram actividade de AAC(6’) quando foram testados num ensaio de acetiltransferase, em cromatografia de camada fina (CCF), para canamicina. Utilizou-se o ensaio de acetiltransferase para determinar actividade de fosfinotricina-acetiltransferase de acordo com De Block et al. (1987) EMBO J. 6, 2513-2518, com a excepção de se ter usado sulfato de canamicina em vez de fosfinotricina como substrato, numa concentração que foi o dobro da concentração de fosfinotricina utilizada por De Block et al. (conferir acima), e de se terem adicionado 2 μΙ de 14C-acetilcoenzima A em vez de uma mistura contendo a forma radioactiva e a forma não radioactivo da enzima. Após incubação durante 30 minutos a 37SC, a mistura reaccional foi colocada sob a forma de “spots” em placas de CCF, e os produtos de reacção foram separados por cromatografia em 1-propanol/NH4OH (3/2). Extractos dos calos contendo o gene aaç(6’) quimérico catalisaram a acetilação da canamicina, ao passo que não se observou qualquer reacção com os extractos de calos de plantas SR1 não transformadas e com os calos expressando nptll. Também se verificou que extractos do tecido das folhas de plantas de tabaco regeneradas transformadas com aaç(6’) acetilam de forma eficiente a canamicina.

Escusado será dizer, esta invenção não está limitada às plantas de tabaco e de batata transformadas com o ADN aaç(6’). Ela inclui qualquer planta, como seja o tomate, o algodão, as sementes de colza, a alfafa, o girassol, o milho, o arroz, os rebentos de soja, as Brássicas, a beterraba e outros vegetais, transformados com um ADN aaç(6’). 12

Nem está esta invenção limitada ao uso do gene aac(6’) quimérico da SEQID N.s 5 ou ao ADN aac(&) da SEQ ID N.s 1 para transformar células vegetais de forma a estas expressarem uma AAC(6’). Podem utilizar-se outros genes e ADNs quiméricos naturais e artificiais. A este respeito, as sequências de ADN aaç(6’) das SEQ ID N.0*5 1 e 5 podem ser modificadas por: 1) substituição de alguns codões por outros que codificam os mesmos ou diferentes, de preferência os mesmos, aminoácidos; e/ou 2) eliminação ou adição de alguns codões; desde que estas modificações não alterem substancialmente as propriedades, especialmente a capacidade de desintoxicação de antibióticos aminoglicosidos, da AAC(6’) codificada.

Todas as publicações referidas neste pedido são desta forma aqui incorporadas por meio de referência. 13

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: PLANT GENETIC SYSTEMS N.V. (B) RUA: Plateaustraat 22

(C) CIDADE: GENT

(E) PAÍS: BÉLGICA (F) CÓDIGO POSTAL: B-9000

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MARCADOR GENÉTICO (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 6 (iv) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE SUPORTE: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (EPO)

(v) DADOS DO PEDIDO ACTUAL NÚMERO DO PEDIDO: EP 93401237.8 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 612 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) 14 48 (ix) FUNÇÃO: (A) NOME/KEY: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1. .612 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /codon_start-1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: ATG GAT CCG AGT ATT CAA CAT TTC CAA ACA AAG TTA GGC ATC ACA AAG Met Asp Pro Ser lie Gin His Phe Gin Thr Lys Leu Gly lie Thr Lys 1 5 10 15 TAC AGC ATC GTG ACC AAC AGC ACC GAT TCC GTC ACA CTG CGC CTC ATG Tyr Ser lie Vai Thr Asn Ser Thr Asp Ser Vai Thr Leu Arg Leu Met 20 25 30 96 ACT GAG CAT GAC CTT GCG ATG CTC TAT GAG TGG CTA AAT CGA TCT CAT Thr Glu His Asp Leu Ala Met Leu Tyr Glu Trp Leu Asn Arg Ser His 35 40 45 ATC GTC GAG TGG TGG GGC GGA GAA GAA GCA CGC CCG ACA CTT GCT GAC lie Vai Glu Trp Trp Gly Gly Glu Glu Ala Arg Pro Thr Leu Ala Asp 50 55 60 GTA CAG GAA CAG TAC TTG CCA AGC GTT TTA GCG CAA GAG TCC GTC ACT Vai Gin Glu Gin Tyr Leu Pro Ser Vai Leu Ala Gin Glu Ser Vai Thr 65 70 75 80 CCA TAC ATT GCA ATG CTG AAT GGA GAG CCG ATT GGG TAT GCC CAG TCG Pro Tyr lie Ala Met Leu Asn Gly Glu Pro lie Gly Tyr Ala Gin Ser 85 90 95 TAC GTT GCT CTT GGA AGC GGG GAC GGA TGG TGG GAA GAA GAA ACC GAT Tyr Vai Ala Leu Gly Ser Gly Asp Gly Trp Trp Glu Glu Glu Thr Asp 100 105 110 CCA GGA GTA CGC GGA ATA GAC CAG TCA CTG GCG AAT GCA TCA CAA CTG Pro Gly Vai Arg Gly lie Asp Gin Ser Leu Ala Asn Ala Ser Gin Leu 115 120 125 144 192 240 288 336 15 384 432

GGC AM GGC TTG GGA ACC MG CTG GTT CGA GCT CTG GTT GAG TTG CTG

Gly Lys Gly Leu Gly Thr Lys Leu Vai Arg Ala Leu Vai Glu Leu Leu 130 135 140 TTC MT GAT CCC GAG GTC ACC MG ATC CM ACG GAC CCG TCG CCG AGC Phe Asn Asp Pro Glu Vai Thr Lys lie Gin Thr Asp Pro Ser Pro Ser 145 150 155 160 MC TTG CGA GCG ATC CGA TGC TAC GAG AM GCG GGG TTT GAG AGG CM Asn Leu Arg Ala lie Arg Cys Tyr Glu Lys Ala Gly Phe Glu Arg Gin 165 170 175 GGT ACC GTA ACC ACC CCA GAT GGT CCA GCC GTG TAC ATG GTT CM ACA Gly Thr Vai Thr Thr Pro Asp Gly Pro Ala Vai Tyr Met Vai Gin Thr 180 185 190 CGC CAG GCA TTC GAG CGA ACA CGC AGT GAT GCC TA Arg Gin Ala Phe Glu Arg Thr Arg Ser Asp Ala 195 200 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 203 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Met Asp Pro Ser lie Gin His Phe Gin Thr Lys Leu Gly lie Thr Lys 15 10 15

Tyr Ser lie Vai Thr Asn Ser Thr Asp Ser Vai Thr Leu Arg Leu Met 20 25 30

Thr Glu His Asp Leu Ala Met Leu Tyr Glu Trp Leu Asn Arg Ser His 16 480 528 576 612 35 40 45 lie Vai Glu Trp Trp Gly Gly Glu Glu Ala Arg Pro TMr Leu Ala Asp 50 55 60

Vai Gin Glu Gin Tyr Leu Pro Ser Vai Leu Ala Gin Glu Ser Vai Thr 65 70 75 80

Pro Tyr lie Ala Met Leu Asn Gly Glu Pro lie Gly Tyr Ala Gin Ser 85 90 95

Tyr Vai Ala Leu Gly Ser Gly Asp Gly Trp Trp Glu Glu Glu Thr Asp 100 105 110

Pro Gly Vai Arg Gly lie Asp Gin Ser Leu Ala Asn Ala Ser Gin Leu 115 120 125

Gly Lys Gly Leu Gly Thr Lys Leu Vai Arg Ala Leu Vai Glu Leu Leu 130 135 140

Phe Asn Asp Pro Glu Vai Thr Lys lie Gin Thr Asp Pro Ser Pro Ser 145 150 155 160

Asn Leu Arg Ala lie Arg Cys Tyr Glu Lys Ala Gly Phe Glu Arg Gin 165 170 175

Gly Thr Vai Thr Thr Pro Asp Gly Pro Ala Vai Tyr Met Vai Gin Thr 180 185 190

Arg Gin Ala Phe Glu Arg Thr Arg Ser Asp Ala 195 200 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 54 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) TOPOLOGIA: linear 17 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) (ix) FUNÇÃO: (A) NOME/KEY: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1. .54 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /nota- "iniciador oligonucleotídico a montante, designado RVA61 ” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: GATGGATCCG AGTATTCAAC ATTTCCAAAC AAAGTTAGGC ATCACAAAGT ACAG 54 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) (ix) FUNÇÃO: (A) NOME/KEY: miscjeature (B) LOCALIZAÇÃO: 1..31 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /nota- “iniciador oligonucleotídico, designado OFD15“ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: AATAATGTCG ACGTCCCCCT CGATGGAAGG G 31 2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 7811 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 18 (C) NÚMERO DE CADEIAS: dupla (D) TOPOLOGIA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) (ix) FUNÇÃO: (A) NOME/KEY: misc_recomb (B) LOCALIZAÇÃO: 1. .7811 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /legenda- vector pTRVA3 (ix) FUNÇÃO: (A) NOME/KEY: miscjeature (B) LOCALIZAÇÃO: 194..218 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /nota- “fronteira direita do T-ADN" (ix) FUNÇÃO: (A) NOME/KEY: miscjeature (B) LOCALIZAÇÃO: 484. .684 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /nota- "a formação 3’-terminal e região de poliadenilação do gene 7 do T-ADN” (ix) FUNÇÃO:

(A) NOME/KEY: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (729. .1340) (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /nota- "a sequência codificante de aac(6')” (ix) FUNÇÃO: (A) NOME/KEY: promotor (B) LOCALIZAÇÃO: 1341. .1756

(D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /legenda- promotor 35S (ix) FUNÇÃO: (A) NOME/KEY: miscjeature (B) LOCALIZAÇÃO: 3001...3023 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /nota- "sequências da fronteira esquerda do T-ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: CGAAGCTCGG TCCCGTGGGT GTTCTGTCGT CTCGTTGTAC AACGAAATCC ATTCCCATTC 60 CGCGCTCAAG ATGGCTTCCC CTCGGCAGTT CATCAGGGCT AAATCAATCT AGCCGACTTG 120 TCCGGTGAAA TGGGCTGCAC TCCAACAGAA ACAATCAAAC AAACATACAC AGCGACTTAT 180 TCACACGAGG TCAAATTACA ACGGTATATA TCCTGCCAGT CAGCATCATC ACACCAAAAG 240 TTAGGCCCGA ATAGTTTGAA ATTAGAAAGC TCGCAATTGA GGTCTACAGG CCAAATTCGC 300 TCTTAGCCGT ACAATATTAC TCACCGGTGC GATGCCCCCC ATCGTAGGTG AAGGTGGAAA 360 TTAATGATCG ATCTTGAGAC CACAGGCCCA CAACAGCTAC CAGTTTCCTC AAGGGTCCAC 420 CAAAAACGTA AGCGCTTACG TACATGGTCG ATAAGAAAAG GCAATTTGTA GATGTTAATT 480 CCCATCTTGA AAGAAATATA GTTTAAATAT TTATTGATAA AATAACAAGT CAGGTATTAT 540 AGTCCAAGCA AAAACATAAA TTTATTGATG CAAGTTTAAA TTCAGAAATA TTTCAATAAC 600 TGATTATATG AGCTGGTACA TTGCCGTAGA TGAAAGACTG AGTGCGATAT TATGTGTAAT 660 ACATAAATTG ATGATATAGC TAGCTTAGCT CATCGGGGGA TCTGTCGACG TCCCCCTCGA 720 TGGAAGGGTT AGGCATCACT GCGTGTTCGC TCGAATGCCT GGCGTGTTTG AACCATGTAC 780 ACGGCTGGAG CATCTGGGGT GGTTACGGTA CCTTGCCTCT CAAACCCCGC TTTCTCGTAG 840 CATCGGATCG CTCGCAAGTT GCTCGGCGAC GGGTCCGTTT GGATCTTGGT GACCTCGGGA 900 TCATTGAACA GCAACTCAAC CAGAGCTCGA ACCAGCTTGG TTCCCAAGCC TTTGCCCAGT 960 TGTGATGCAT TCGCCAGTGA CTGGTCTATT CCGCGTACTC CTGGATCGGT TTCTTCTTCC 1020 CACCATCCGT CCCCGCTTCC AAGAGCAACG TACGACTGGG CATACCCAAT CGGCTCTCCA 1080 TTCAGCATTG CAATGTATGG AGTGACGGAC TCTTGCGCTA AAACGCTTGG CAAGTACTGT 1140 TCCTGTACGT CAGCAAGTGT CGGGCGTGCT TCTTCTCCGC CCCACCACTC GACGATATGA 1200 gatcgattta GCCACTCATA GAGCATCGCA AGGTCATGCT CAGTCATGAG GCGCAGTGTG 1260 ACGGAATCGG TGCTGTTGGT CACGATGCTG TACTTTGTGA TGCCTAACTT TGTTTGGAAA 1320 TGTTGAATAC TCGGATCCAT CGATTTGTAG AGAGAGACTG GTGATTTCAG CGTGTCCTCT 1380 CCAAATGAAA TGAACTTCCT TATATAGAGG AAGGGTCTTG CGAAGGATAG TGGGATTGTG 1440 CGTCATCCCT TACGTCAGTG GAGATATCAC ATCAATCCAC TTGCTTTGAA GACGTGGTTG 1500 GAACGTCTTC TTTTTCCACG ATGCTCCTCG TGGGTGGGGG TCCATCTTTG GGACCACTGT 1560 CGGCAGAGGC ATCTTGAACG ATAGCCTTTC CTTTATCGCA ATGATGGCAT TTGTAGGTGC 1620 20 CACCTTCCTT TTCTACTGTC CTTTTGATGA AGTGACAGAT AGCTGGGCAA TGGAATCCGA 1680 GGAGGTTTCC CGATATTACC CTTTGTTGAA AAGTCTCAAT AGCCCTTTGG TCTTCTGAGA 1740 CTGTATCTTT GATATTCTTG GAGTAGACGA GAGTGTCGTG CTCCACCATG TTGACGAAGA 1800 TTTTCTTCTT GTCATTGAGT CGTAAAAGAC TCTGTATGAA CTGTTCGCCA GTCTTCACGG 1860 CGAGTTCTGT TAGATCCTCG ATCTGAATTT TTGACTCCAT GGCCTTTGAT TCAGTAGGAA 1920 CTACTTTCTT AGAGACTCCA ATCTCTATTA CTTGCCTTGG TTTATGAAGC AAGCCTTGAA 1980 TCGTCCATAC TGGAATAGTA CTTCTGATCT TGAGAAATAT ATCTTTCTCT GTGTTCTTGA 2040 TGCAGTTAGT CCTGAATCTT TTGACTGCAT CTTTAACCTT CTTGGGAAGG TATTTGATCT 2100 CCTGGAGATT ATTACTCGGG TAGATCGTCT TGATGAGACC TGCCGCGTAG GCCTCTCTAA 2160 CCATCTGTGG GTCAGCATTC TTTCTGAAAT TGAAGAGGCT AATCTTCTCA TTATCGGTGG 2220 TGAACATGGT ATCGTCACCT TCTCCGTCGA ACTTTCTTCC TAGATCGTAG AGATAGAGAA 2280 AGTCGTCCAT GGTGATCTCC GGGGCAAAGG AGATCTTATA ATTAAATGGC CTTCGCTGCC 2340 CATATTATTG GTAACTCAAC AGCATCAATC ACGGGATTTT TCTCGAATTA ATTGCGTCGA 2400 ATCTCAGCAT CGAAATATTC GCCTTTTTCG TCCATTAGAC TATCTATTGT GATGGTGGAT 2460 TTATCACAAA TGGGACCCGC CGCCGACAGA GGTGTGATGT TAGGCCAGGA CTTTGAAAAT 2520 TTGCGCAACT ATCGTATAGT GGCCGACAAA TTGACGCCGA GTTGACAGAC TGCCTAGCAT 2580 TTGAGTGAAT TATGTGAGGT AATGGGCTAC ACTGAATTGG TAGCTCAAAC TGTCAGTATT 2640 TATGTATATG AGTGTATATT TTCGCATAAT CTCAGACCAA TCTGAAGATG AAATGGGTAT 2700 CTGGGAATGG CGAAATCAAG GCATCGATCG TGAAGTTTCT CATCTAAGCC CCCATTTGGA 2760 CGTGAATGTA GACACGTCGA AATAAAGATT TCCGAATTAG AATAATTTGT TTATTGCTTT 2820 CGCCTATAAA TACGACGGAT CGTAATTTGT CGTTTTATCA AAATGTACTT TCATTTTATA 2880 ATAACGCTGC GGACATCTAC ATTTTTGAAT TGAAAAAAAA TTGGTAATTA CTCTTTCTTT 2940 TTCTCCATAT TGACCATCAT ACTCATTGCT GATCCATGTA GATTTCCCGG ACATGAAGCC 3000 ATTTACAATT GAATATATCC TGCCGCCGCT GCCGCTTTGC ACCCGGTGGA GCTTGCATGT 3060 TGGTTTCTAC GCAGAACTGA GCCGGTTAGG CAGATAATTT CCATTGAGAA CTGAGCCATG 3120 TGCACCTTCC CCCCAACACG GTGAGCGACG GGGCAACGGA GTGATCCACA TGGGACTTTT 3180 AAACATCATC CGTCGGATGG CGTTGCGAGA GAAGCAGTCG ATCCGTGAGA TCAGCCGACG 3240 CACCGGGCAG GCGCGCAACA CGATCGCAAA GTATTTGAAC GCAGGTACAA TCGAGCCGAC 3300 GTTCACGGTA CCGGAACGAC CAAGCAAGCT AGCTTAGTAA AGCCCTCGCT AGATTTTAAT 3360 GCGGATGTTG CGATTACTTC GCCAACTATT GCGATAACAA GAAAAAGCCA GCCTTTCATG 3420 ATATATCTCC CAATTTGTGT AGGGCTTATT ATGCACGCTT AAAAATAATA AAAGCAGACT 3480 TGACCTGATA GTTTGGCTGT GAGCAATTAT GTGCTTAGTG CATCTAACGC TTGAGTTAAG 3540 21 CCGCGCCGCG AAGCGGCGTC GGCTTGAACG AATTGTTAGA CATTATTTGC CGACTACCTT 3600 GGTGATCTCG CCTTTCACGT AGTGGACAAA TTCTTCCAAC TGATCTGCGC GCGAGGCCAA 3660 GCGATCTTCT TCTTGTCCAA GATAAGCCTG TCTAGCTTCA AGTATGACGG GCTGATACTG 3720 GGCCGGCAGG CGCTCCATTG CCCAGTCGGC AGCGACATCC TTCGGCGCGA TTTTGCCGGT 3780 TACTGCGCTG TACCAAATGC GGGACAACGT AAGCACTACA TTTCGCTCAT CGCCAGCCCA 3840 GTCGGGCGGC GAGTTCCATA GCGTTAAGGT TTCATTTAGC GCCTCAAATA GATCCTGTTC 3900 TGCTTTTGTC AGCAAGATAG CCAGATCAAT GTCGATCGTG GCTGGCTCGA AGATACCTQC 4020 AAGAATGTCA TTGCGCTGCC ATTCTCCAAA TTGCAGTTCG CGCTTAGCTG GATAACGCCA 4080 TCCAGGGGAA GCCGAAGTTT CCAAAAGGTC GTTGATCAAA GCTCGCCGCG TTGTTTCATC 42Ç0 AAGCCTTACG GTCACCGTAA CCAGCAAATC AATATCACTG TGTGGCTTCA GGCCGCCATC 4260 CACTGCGGAG CCGTACAAAT GTACGGCCAG CAACGTCGGT TCGAGATGGC GCTCGATGAC 4320 GCCAACTACC TCTGATAGTT GAGTCGATAC TTCGGCGATC ACCGCTTCCC TCATGATGTT 4380 TAACTTTGTT TTAGGGCGAC TGCCCTGCTG CGTAACATCG TTGCTGCTCC ATAACATCAA 4440 ACATCGACCC ACGGCGTAAC GCGCTTGCTG CTTGGATGCC CGAGGCATAG ACTGTACCCC 4500 AAAAAAACAG TCATAACAAG CCATGAAAAC CGCCACTGCG CCGTTACCAC CGCTGCGTTC 4560 GGTCAAGGTT CTGGACCAGT TGCGTGAGCG CATACGCTAC TTGCATTACA GCTTACGAAC 4620 CGAACAGGCT TATGTCCACT GGGTTCGTGC CTTCATCCGT TTCCACGGTG TGCGTCACCC 4680 GGCAACCTTG GGCAGCAGCG AAGTCGAGGC ATTTCTGTCC TGGCTGGCGA ACGAGCGCAA 4740 GGTTTCGGTC TCCACGCATC GTCAGGCATT GGCGGCCTTG CTGTTCTTCT ACGGCAAGTG 4800 CTGTGCACGG ATCTGCCCTG GCTTCAGGAG ATCGGAAGAC CTCGGCCGTC CGGGCGCTTG 4860 CCGGTGGTGC TGACCCCGGA TGAAGTGGTT CGCATCCTCG GTTTTCTGGA AGGCGAGCAT 4920 CGTTTGTTCG CCCAGCTTCT GTATGGAACG GGCATGCGGA TCAGTGAGGG TTTGCAACTG 4980 CGGGTCAAGG ATCTGGATTT CGATCACGGC ACGATCATCG TGCGGGAGGG CAAGGGCTCC 5040 AAGGATCGGG CCTTGATGTT ACCCGAGAGC TTGGCACCCA GCCTGCGCGA GCAGCTGCCT 5100 CGCGCGTTTC GGTGATGACG GTGAAAACCT CTGACACATG CAGCTCCCGG AGACGGTCAC 5160 AGCTTGTCTG TAAGCGGATG CCGGGAGCAG ACAAGCCCGT CAGGGCGCGT CAGCGGGTGT 5220 TGGCGGGTGT CGGGGCGCAG CCATGACCCA GTCACGTAGC GATAGCGGAG TGTATACTGG 5280 CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC ACCATATGCG GTGTGAAATA 5340 CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCT CTTCCGCTTC CTCGCTCACT 5400 GACTCGCTGC GCTCGGTCGT TCGGCTGCGG CGAGCGGTAT CAGCTCACTC AAAGGCGGTA 5460 ATACGGTTAT CCACAGAATC AGGGGATAAC GCAGGAAAGA ACATGTGAGC AAAAGGCCAG 5520 CAAAAGGCCA GGAACCGTAA AAAGGCCGCG TTGCTGGCGT TTTTCCATAG GCTCCGCCCC 5580 22 CCTGACGAGC ATCACAAAAA TCGACGCTCA AGTCAGAGGT GGCGAAACCC GACAGGACTA 5640 TAAAGATACC AGGCGTTTCC CCCTGGAAGC TCCCTCGTGC GCTCTCCTGT TCCGACCCTG 5700 CCGCTTACCG GATACCTGTC CGCCTTTCTC CCTTCGGGAA GCGTGGCGCT TTCTCAATGC 5760 TCACGCTGTA GGTATCTCAG TTCGGTGTAG GTCGTTCGCT CCAAGCTGGG CTGTGTGCAC 5820 GAACCCCCCG TTCAGCCCGA CCGCTGCGCC TTATCCGGTA ACTATCGTCT TGAGTCCAAC 5880 CCGGTAAGAC ACGACTTATC GCCACTGGCA GCAGCCACTG GTAACAGGAT TAGCAGAGCG 5940 AGGTATGTAG GCGGTGCTAC AGAGTTCTTG AAGTGGTGGC CTAACTACGG CTACACTAGA 6000 AGGACAGTAT TTGGTATCTG CGCTCTGCTG AAGCCAGTTA CCTTCGGAAA AAGAGTTGGT 6060 AGCTCTtiSÁf'·' CCGGCAAACA AACCACCGCT GGTAGCGGTG G1 ITT 1 U^T;, TTGCA^GCAG 6120 CAGATTACGC GCAGAAAAAA AGGATCTCAA GAAGÁTCCTT TGATCTTTTC TACGGGGTCT 6180 GACGCTCAGT GGAACGAAAA CTCACGTTAA GGGATTTTGG TCATGAGATT ATCAAAAAGG 6240 ATCTTCACCT AGATCCTTTT AAATTAAAAA TGAAGTTTTA AATCAATCTA AAGTATATAT 6300 GAGTAAACTT GGTCTGACAG TTACCAATGC TTAATCAGTG AGGCACCTAT CTCAGCGATC 6360 TGTCTATTTC GTTCATCCAT AGTTGCCTGA CTCCCCGTCG TGTAGATAAC TACGATACGG 6420 GAGGGCTTAC CATCTGGCCC CAGTGCTGCA ATGATACCGC GAGACCCACG CTCACCGGCT 6480 CCAGATTTAT CAGCAATAAA CCAGCCAGCC GGAAGGGCCG AGCGCAGAAG TGGTCCTGCA 6540 ACTTTATCCG CCTCCATCCA GTCTATTAAT TGTTGCCGGG AAGCTAGAGT AAGTAGTTCG 6600 CCAGTTAATA GTTTGCGCAA CGTTGTTGCC ATTGCTGCAG GCATCGTGGT GTCACGCTCG 6660 TCGTTTGGTA TGGCTTCATT CAGCTCCGGT TCCCAACGAT CAAGGCGAGT TACATGATCC 6720 CCCATGTTGT GCAAAAAAGC GGTTAGCTCC TTCGGTCCTC CGATCGTTGT GAGAAGTAAG 6780 TTGGCCGCAG TGTTATCACT CATGGTTATG GCAGCACTGC ATAATTCTCT TACTGTCATG 6840 CCATCCGTAA GATGCTTTTC TGTGACTGGT GAGTACTCAA CCAAGTCATT CTGAGAATAG 6900 TGTATGCGGC GACCGAGTTG CTCTTGCCCG GCGTCAACAC GGGATAATAC CGCGCCACAT 6960 AGCAGAACTT TAAAAGTGCT CATCATTGGA AAACGTTCTT CGGGGCGAAA ACTCTCAAGG 7020 ATCTTACCGC TGTTGAGATC CAGTTCGATG TAACCCACTC GTGCACCCAA CTGATCTTCA 7080 GCATCTTTTA CTTTCACCAG CGTTTCTGGG TGAGCAAAAA CAGGAAGGCA AAATGCCGCA 7140 AAAAAGGGAA TAAGGGCGAC ACGGAAATGT TGAATACTCA TACTCTTCCT TTTTCAATAT 7200 TATTGAAGCA TTTATCAGGG TTATTGTCTC ATGAGCGGAT ACATATTTGA ATGTATTTAG 7260 AAAAATAAAC AAATAGGGGT TCCGCGCACA TTTCCCCGAA AAGTGCCACC TGACGTCTAA 7320 GAAACCATTA TTATCATGAC ATTAACCTAT AAAAATAGGC GTATCACGAG GCCCTTTCGT 7380 CTTCGAATAA ATACCTGTGA CGGAAGATCA CTTCGCAGAA TAAATAAATC CTGGTGTCCC 7440 TGTTGATACC GGGAAGCCCT GGGCCAACTT TTGGCGAAAA TGAGACGTTG ATCGGCACGT 7500 23 AAGAGGTTCC AACTTTCACC ATAATGAAAT AAGATCACTA CCGGGCGTAT TTTTTGAGTT 7560 ATCGAGATTT TCAGGAGCTA AGGAAGCTAA AATGGAGAAA AAAATCACTG GATATACCAC 7620 CGTTGATATA TCCCAATGGC ATCGTAAAGA ACATTTTGAG GCATTTCAGT CAGTTGCTCA 7680 ATGTACCTAT AACCAGACCG TTCCTGGATA TTACGGCCTT TTTAAAGACC GTAAAGAAAA 7740 ATAAGCACAA GTTTTATCCG GCCTTTATTC ACATTCTTGC CCGCCTGATG AATGCTCATC 7800 CGGAATTAAT T 7811 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA, SEQUÊNCIA; (A) COMPRIMENTO: 203 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Met Asp Pro Ser lie Gin His Phe Gin Thr Lys Leu Gly lie Thr Lys 15 10 15

Tyr Ser lie Vai Thr Asn Ser Thr Asp Ser Vai Thr Leu Arg Leu Met 20 25 30

Thr Glu His Asp Leu Ala Met Leu Tyr Glu Trp Leu Asn Arg Ser His 35 40 45

He Vai Glu Trp Trp Gly Gly Glu Glu Ala Arg Pro Thr Leu Ala Asp 50 55 60

Vai Gin Glu Gin Tyr Leu Pro Ser Vai Leu Ala Gin Glu Ser Vai Thr 65 70 75 80

Pro Tyr lie Ala Met Leu Asn Gly Glu Pro lie Gly Tyr Ala Gin Ser 85 90 95

Tyr Vai Ala Leu Gly Ser Gly Asp Gly Trp Trp Glu Glu Glu Thr Asp 100 105 110 24

Pro Gly Vai Arg Gly lie Asp Gin Ser Leu Ala Asn Ala Ser Gin Leu 115 120 125

Gly Lys Gly Leu Gly Thr Lys Leu Vai Arg Ala Leu Vai Glu Leu Leu 130 135 140

Phe Asn Asp Pro Glu Vai Thr Lys lie Gin Thr Asp Pro Ser Pro Ser 145 150 155 160

Asn Leu Arg Ala lie Arg Cys Tyr Glu Lys Ala Gly Phe Glu Arg Gin 165 170 175

Gly Thr Vai Thr Thr Pro Asp Gly Pro Ala Vai Tyr Met Vai Gin Thr 180 185 190

Arg Gin Ala Phe Glu Arg Thr Arg Ser Asp Ala * 195 200

Lisboa, ‘3 1 OUI. 2001

Aventis CropScience N.V.

25

Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Marcador genético quimérico seleccionável para transformar uma célula vegetal ou planta de forma a torná-la resistente a um antibiótico aminoglicosido, compreendendo o referido marcador genético os seguintes fragmentos de ADN ligados de forma operacional: a) um promotor que pode ser expresso em plantas; b) um ADN que codifica uma aminoglicosido-6’-N-acetiltransferase capaz de modificar o referido antibiótico aminoglicosido; e c) uma formação 3’-terminal e região de poliadenilação activa em células vegetais; e sendo a referida aminog!icosido-6’-N-acetiltransferase capaz de acetilar pelo menos a canamicina.
2. 2. Marcador genético quimérico seleccionável da reivindicação 1, no qual o referido ADN que codifica uma aminoglicosido-6’-N-acetiltransferase pode ser obtido por amplificação por PCR utilizando iniciadores, onde pelo menos um dos iniciadores tem a sequência de ADN da SEQ ID N.9 3 ou da SEQ ID N.Q 4.
3. 3. Marcador genético quimérico seleccionável da reivindicação 2, no qual o referido ADN que codifica uma aminoglicosido-6’-N-acetiltransferase tem a sequência de ADN da SEQ ID N.s 1.
4. 4. Marcador genético quimérico seleccionável de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, no qual a referida aminoglicosido-6’-N-acetiltransferase codificada tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N.9 2.
5. 5. Marcador genético quimérico seleccionável de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, que é integrado no ADN nuclear de uma célula vegetal.
6. 6. Vector de transformação de plantas que contém o marcador genético quimérico seleccionável de qualquer uma das reivindicações 1 a 4. 1
7. 7. Vector de transformação de plantas da reivindicação 6, que é um plasmídeo-Ti.
8. 8. Aarobacterium tumefaciens que contém o vector da reivindicação 7.
9. 9. Célula vegetal cujo ADN nuclear contém o marcador genético quimérico seleccionável de qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
10. 10. Cultura de células vegetais que compreende uma pluralidade de células vegetais da reivindicação 9. • l,,- -roi.-, ·
11. 11. Semente que compreende o marcador genético quimérico seleccionável de qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
12. 12. Planta que compreende o marcador genético quimérico seleccionável de qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
13. 13. Método para seleccionar ou identificar células vegetais transformadas usando um antibiótico aminoglicosido, compreendendo o referido método os passos de: transformação das células vegetais com um ADN estranho que compreende o marcador genético quimérico seleccionável de qualquer uma das reivindicações 1 a 4; seguida de crescimento das referidas células transformadas com concentrações do referido antibiótico aminoglicosido que são letais ou supressoras do crescimento para células não transformadas.
14. 14. Método da reivindicação 13, no qual o referido antibiótico aminoglicosido é a canamicina.
15. 15. Método para tornar uma célula vegetal resistente a um antibiótico aminoglicosido, compreendendo o referido método o passo de transformação do ADN nuclear da referida célula com o marcador genético seleccionável quimérico de qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
16. 16. Método da reivindicação 15, no qual o referido antibiótico aminoglicosido é a canamicina. 2
17. 17. Método para desintoxicar um antibiótico aminoglicosido numa célula vegetal, compreendendo o método o passo de disponibilização do marcador genético quimérico seleccionável de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 no ADN nuclear da célula.
18. 18. Utilização do marcador genético quimérico seleccionável de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para produzir uma aminoglicosido-6’-N-acetiltransferase nas células de uma planta.
19. 19. Utilização do marcador genético quimérico seleccionável de qualquer uma das reivindicações 1 á' 4 para tornar uma célula vegetal ou uma planta resistentes.a um: antibiótico aminoglicosido. Lisboa, 31 OUT. 2001 Por Aventis CropScience N.V.

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