CN108753813B

CN108753813B - 获得无标记转基因植物的方法

Info

Publication number: CN108753813B
Application number: CN201810590142.6A
Authority: CN
Inventors: 王克剑; 王俊杰
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2018-06-08
Filing date: 2018-06-08
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2038-06-08
Also published as: CN108753813A

Abstract

本发明公开了一种获得无标记转基因植物的方法。该方法通过CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统实现，CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统的载体中包含基因编辑蛋白基因、靶向载体自身的sgRNA和特异时空表达基因启动子，特异时空表达基因启动子在愈伤组织时期不表达，待完成遗传转化后表达基因编辑蛋白基因。应用本发明的技术方案，操作简单，主要针对农作物或经济植物，尤其是多年生，无性繁殖的植物，通过剪切载体本身，产生大片段转基因成分的丢失，意义重大。

Description

获得无标记转基因植物的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种获得无标记转基因植物的方法。

背景技术

目前，转基因技术广泛的用于基因功能的研究，随着商业化转基因植物新品种的不断出现,人们对转基因植物安全性问题的争论和担忧日益增加。CRISPR/Cas9技术是新兴的基因编辑工具，可以在特定位点产生DSB，借由生物体对DNA的修复过程中，可能产生插入、缺失、替换等现象，从而定点获得突变体，随着基因编辑技术的不断优化，CRISPR/Cas9技术用于基因敲除已经相当完善，但是Cas9系统产生靶向敲除之后对于植物本身的生长发育并没有改善，反而是Cas9的存在增加了脱靶的概率，对于商品生产来说是不稳定因素。对于一年生植物来说在生殖过程中存在一定的几率自然分离掉marker基因/Cas9编码基因，但是自然发生的概率相当小不能应用于生产中，且对于多年生经济作物来说，很难得到无转基因成分植株。目前人们通过转座途径、染色体内同源重组、目标基因与标记基因共转化、位点专一性重组等措施来剔除外源基因。

本发明基于目前广泛应用的CRISPR/Cas9技术，以特异表达启动子(愈伤组织不表达)驱动Cas9表达，并且除原有敲除位点之外，在T-DNA插入序列两端额外设计两个靶位点，经农杆菌介导转化后，在特异时期表达的Cas9蛋白通过靶向敲除靶点在植物基因组产生突变，同时T-DNA出去边界靶点，经过Cas9剪切也产生DSB，使得T-DNA插入序列从基因组上去除，产生非转基因突变体植株。随着基因敲除技术的广泛应用，构建突变体库用于基因研究，但是由于基因敲除得到的突变体存在一定的安全问题，国家对于转基因的界定还不明朗，对于基因敲除构建的转基因突变库的应用在生产育种中显得不太方便，并且通过转基因植物自体繁殖分离转基因成分效率低下，且对于多年生植物，以及无性繁殖的植物来说不能分离转基因成分。本发明可以经过一代获得不含Cas9蛋白，标记基因等外源序列的突变体，方便快捷。

发明内容

本发明旨在提供一种获得无标记转基因植物的方法，以解决现有技术中，以解决现有技术中获得无标记转基因植物操作繁琐的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种获得无标记转基因植物的方法。该方法通过CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统实现，CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统的载体中包含基因编辑蛋白基因、靶向载体自身的sgRNA和特异时空表达基因启动子，特异时空表达基因启动子在愈伤组织时期不表达，待完成遗传转化后表达基因编辑蛋白基因。

进一步地，启动子具有如LOC_Os07g01820所示的核苷酸序列。

进一步地，基因编辑蛋白基因为Cas9基因或Cpf1基因。

进一步地，载体还包含配套的Cas9基因或Cpf1基因的元件。

进一步地，载体为双元表达载体。

进一步地，双元表达载体为Pcambia 1300。

进一步地，植物包括水稻、小麦、马铃薯、红薯、杨树和柑橘。

应用本发明的技术方案，操作简单，主要针对农作物或经济植物，尤其是多年生，无性繁殖的植物，通过剪切载体本身，产生大片段转基因成分的丢失，意义重大。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了本发明的实验原理及流程示意图；

图2示出了本发明一种典型的实施方式中的载体基本元件。

图3示出了实施例1中T1代小苗根尖荧光显微镜下观察图；

图4示出了实施例1中PCR检测结果电泳图；以及

图5示出了实施例1中测序结果示意图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本发明基于目前广泛应用的CRISPR/Cas9技术，构建一个含有目的基因以及特异时期表达基因启动子驱动Cas9系统元件的表达载体，经农杆菌介导转化后，在特异时期表达的Cas9蛋白通过靶向标记基因以及通过设计靶向载体自身的sgRNA，指引Cas9在靶向位点产生切割Cas9系统元件边界，产生双重切割，使得包括标记基因以及Cas9元件在内的大片段缺失，产生无标记转基因植株。

本发明的无标记转基因系统，除产生目的敲除之外，还可以通过靶向Cas9元件达到自体删除的目的。

本发明基于Cas9系统改造的无标记/非转基因系统，载体构建方便快捷，无需杂交，二次转化，依靠T0代植株自交就可以得到无标记/非转基因植株。

本发明通过特异启动子驱动Cas9蛋白的表达，使得Cas9不在转染过程中的愈伤组织表达，使得标记基因发挥筛选功能，富集阳性细胞，得到转基因植株。根据需要设计载体结构，在想要缺失的大片段两侧设计靶位点(靶位点选择在要删除的序列两侧)，在生殖发育时期表达的Cas9蛋白靶向大片段两侧，产生DSB(双链断裂)，两缺口之间的大段序列丢失。通过DNA自我复制，黏连缺口，从而把非靶标序列从植物基因组中剔除。得到想要的无标记(主要针对基因过表达)、非转基因(针对基因编辑，突变等)植株。如图1所示，载体转入愈伤组织，经潮霉素筛选后获得阳性转化子，后期经过特异启动子驱动的Cas9产生切割，缺失大片段从而获得无标记转基因植株，无标记转基因植株的子代仍为无标记转基因植株。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种获得无标记转基因植物的方法。该方法通过CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统实现，CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统的载体中包含基因编辑蛋白基因、靶向载体自身的sgRNA和特异时空表达基因启动子，特异时空表达基因启动子在愈伤组织时期不表达，待完成遗传转化后表达基因编辑蛋白基因。

优选的，启动子具有如LOC_Os07g01820(SEQ ID NO：1)所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO：1:

TCCGATCGAGCTAGTCCTGTGCCCGTACCATGACGGAGCCGATCCTCTCCATTCAAAGGGAATATGATGAGAGAGTAGTGGGGAATCGGTTTTTGCAATCAATTAGAGGAGGAAACGCATGGAGAGACAAATCGACGTGGCGGTGGCGCTAGGGTTCAGCCCGACGAAAAAACCACGAAAAAAATAGAGACAAAAGAAAGAAACCCGAAAACCGGTGAAAGAAAAAAAAGAGGGAACAGTGAAAAGAAAAGAAAAAAAAGGAAAACGGTGAAAAATAAAATAAAACGGAAAAAGATGGGAAAAAAGAAAAACAGGCGAAAATTATAGGTGGAAGCATATGTATTTTTTATTAGGTATAGATTTCTAGATTCTATAGCTTTTGATCCTTGTAATCTAGATGAAAAGCTTACGGGCCTCTTTGATTTAGAGGATAAACATAGGAATTTTGGAGAATTTTAATCCTATATAAAAAAATTATATAAATACATTTGAAACAAAAGATTGAATCCTATCATATCCTATCCTATTAAAGTCCTATGGAATGAACAATTCTACAGAGATTTTGGCGGAAATTTAGCAAGAGCTTCAACCTCTTGGAAATTTTCCTTTGAGTCTATCTCTCTTATCCGATTCGTACTTTTTCCTATGGTTTAATCAAATGGTTATTTCTAAGATTTCCTGTGTTTTACAATCCTCTGTTATGCACGAACTCCAAGAAGTTATGTGTTATAAGGTTCACATCCTCTGTTAGTAGTTGACTGTACTATTAAACTATACCATTAATAGCATAGCCAACTATTAACTTCACATCATCTATCAAAAACTCTCTAAAAGACAGGGCCACATACTCAGGGGGTGTTTAGATCCAGGGGTGTAAAGTTTTGGCGTGTCATATCGGATATTATATAGGGTGTCGCATGGGGTGTTTGACACTAATAAAAAAACTAATTACAGAATCCGTCAGTAAACCGCGAGACAAATTTATTAAGCCTAATTAATCAGTCATTAGCAAAGGTTTACTGTAGTACCACATTGTCAAATCATGTAGCAATTAGGCTTAAAAGATTTGTCTCGCAAATTAGTCGCAATCTGTGCAATTAGTTATTTTTTAGCCTATGTTTAATACCTCATGCATGTGTTCGATATGACGGGGTGTAAAATTTTGGGTGGGATCTAAACATGGCCTCATTAAAACCAACCATTGACAAGGTCTAGTGTGGATGTAAAGTGTGTAAACTAGAGTGCTCTGTATGTAAAGATGACTAATTTTATACTCCCTCCGTTCCAAAATAAGTGCAGTTTTAGCATTGTTCATGTCCAACGTTTGACTGTTTGTCTTATTTGAAATTTTTTTATAATTACTACTTTTATTGTTATTAGATGATAAAACATGAATAGTACTTTATGTGTGACTAATTTTTTTTAATATTTTTCATAATTTTTTCAAATAAGACGGGTGGTCAAAACAATGAACACGGATATCTATGGCTGAACTTATTTTGAGACGGAGGTAGTACAATTATTGTATTGGGTATATATATCATTTGTGCAACTACTAGTATACATACGTAGTACTCCCTCCGTCCCATAGTGTTGCAACCTAGGATGGGATGAGATACATCAAACCATCCTAGGACTACGAATTTGGACATGATTCGTAGTCCTAGGATGGGTCTCATCCCATCCTAGGTTGCAACATTATGGGACGGACGGAGTCCTATATATGTAGGCCATGCTCTCGGGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGGGCCAATTGGTGTTGCGATCGAGGCTAGGTCAGGTCATGACGCAATGCAAATGTTATATGGAATGGATCAGAGTGATAGAGGAGAGAGCTGTCGAGCTGGGATTGCAGCATCTCCAGCGCCAGGAGCACCAGTTGCCGTAAACAACACCACACAGTTTTTCCCACCAAATATAAAAGATCTTTCTTGGCACAGTGCGTTCAACAGTTGCAAGCAATAATATTATTGGCTAATTAGTACTGACTTTTATTAATATTCGCCTATTATACAATTGATACCACCTCCGATCCATTCCTAAATATACTGACCAATGTCATATGAAAAAAGAATAGAGAGAGTAGTAATTAATGAACTATATCAGTGAACATTGACAGACAAAAATAAAATCATACTAGCCATACTGTGCAAAAAGCACCATATATAATTTGAAAACGACCGGTATAGTTTACACTCATATATACTACTCCATCCGTTTCAGTTTATAATGCATTTTGACTTTAGTCAAAGTTAAACTGTTTTAAGTTTAACTAAGTTTGTAGACAAATATAATAATATTTATAATACTAAATTAATTAGAGTCATCAAATTAACAATTGAATATATTTTCATAATAAATTTATCTTGGATTGAAAAGTCAAAACGTAATTTGACTTTGACCAAAGTCAAAACGTCTTATTATAATGGAGTAACTTTGTAAATCACACTTGAGTGTATTGCGTGATTTCTTAGGATGCTACGCTATCTCACAAGCGACTTACGTACTATAAATTAATGCAGTGAACATACTTAGAGAGTTGAATTTTACCACGATTTAATTTCGATGGACTAATTAAAGAAAATCTCAAGGTTTCGAAAACGACATGGTACGTCGTGCGCGTATATGTAACTATTGACCATGTATTCATATGCACGAATTGGTACAAAAGGGTGCACAAATTCTGCAATAACTGTTGGAAATGTATATATATTCATACATATGTGTGTACACTGCTCTCTCCATCTCTAAAATACCTTATACTCCCTCCATTTCATATTGTAAGACTTTCTAGCATTGTTTATATTTATATAGATGTTAATGAATTTAGACACACACACACACACACACACATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATTCATTAACATATATATGAATGTGGCCAATGCTAAAAATTCTTACATTGTGAAACGGATGAAGTAGTATTTAGCTGGTCTCAGATATATTAGTATGGTTGTGAAAAGACGAATATGCACTTCATTAAGATTATATGCTTCTATTATACTACATGTTTAGCTAGACTTTTGGCATGCCCAAGCTCTAACAAATGATTTTTGCACCTAAATCGATTTCAATTAGGTGGGCGAGAGTGGGGTTTAACCAATAGAGATAAAATAAGGACAATAAAAACAGCTAGTGGACCACATATCTCCACACGTCTCTTAAAAAAAGATTTATTTTACAACTGAATTTGAAGATAAGGTATTTTGTAATTGAGAAAGTAAATACCAATATACTCCCTCCGGTTATTTATATTTATATTTAGCGTTAGAAAAGTTAAACTTAGTTTTCCCATCTTTAAATATATATAGTGAATGGATCGTATCGTAAAAAAAAAGACAACCGGATTATAGTTAAATAATTGGCCATGTATTGATATGGTGCAAATTAACAAAATTTCGCAGTAATGATTGGCCATGTATTCATGTGTACATTTATCAATATATCAATAAAAAAGACAAGAGGATAATAATAGTAATAATAAAGAAATGGAGAAAAGGAGTCGAGGGGTTGGGAGTTCGACCGTACGAGGAGGTAGCATAGCAGCAGAATCGACCCCAAGCTTTCCTTCTCACGTAACATGCCGTTATTATATTATATATATTAAAATAATTAATCCAATTATTTTTTACCAGATTAATATTAATGTAATCCGTGTGTCAGCAGGCTTGAGAGGCTGCAGGTGGGCCCCATGATTCCGGGACCAATCACAGCTCGACAGCATACTGACACCCGTCCCCAAAAGCAAAGAGGCCTCTCTCTCTCTCTCTCGCCGATCCCTCTCCTCCTCCTCTTCTTCTTCTTCCACTAGCTAGTTCGTCTTCCTCCTTCAGCTAGCTTGTAGCAGCTAAGGTTAGGTCGGATCGAGATCGGGATCGGCCGCCGGCGAGCGGCGAGCGGCGAGG

根据本发明一种典型的实施方式，基因编辑蛋白基因为Cas9基因或Cpf1基因，当然也可以是其他能够实现类似的基因编辑的蛋白基因。

优选的，载体还包含配套的Cas9基因或Cpf1基因的元件，方便后续操作。在本发明一种典型的实施方式中，如图2所示，载体基本元件包括潮霉素抗性元件，gRNA元件，MADS15驱动Cas9系统和GFP报告基因。

根据本发明一种典型的实施方式，载体为双元表达载体，优选为Pcambia 1300。

根据本发明一种典型的实施方式，用于获得无标记转基因植物的植物包括水稻、小麦、马铃薯、红薯、杨树和柑橘等。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例1

1.载体构建

以pC1300-Cas9为载体，BamHI/NcoI进行双酶切，线性化载体。以水稻DNA为模板，引物

M15-P-F(SEQ ID NO：2):

5’-CGAGCTCGGTACCAAGGATCCGAAAAGCTTACGGGCCTCTTTGA-3’

M15-P-R(SEQ ID NO：3):

5’-TCTTCTTCTTAGGGGCCATGGTCTCTATCCGCTTCAGCTGCACC-3’

扩增LOC_Os07g01820基因启动子区域3614bp序列，Gibson连接构建pC1300-MADS15P-Cas9。

PmeI酶切pC1300-MADS15P-Cas9载体，引物

cas-Hgfp-F(SEQ ID NO：4)：

CGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTGCCACCTGACGTGAGCTCGGTA

cas-Hgfp-R(SEQ ID NO：5)：

TGTCAAACACTGATAGTTTAAACCGGTGTGAGGGAACTAGTTTTGAT

扩增2X35S驱动的GFP元件序列，T4连接，构成pC1300-MADS15P-Cas9-GFP载体。按照CRISPR-Cas9系统对靶序列的要求(PAM(Protospacer Adjacent Motif)为NGG，序列长度为22bp)，在pC1300-MADS15P-Cas9-GFP序列上选择特异4个靶序列，并根据gRNA引物设计原则，在F向引物和R向引物两端加上酶切连接碱基，设计好的引物命名为G1-F/R，G2-F/R，G3-F/R，G4-F/R。序列如下：

G1-F(SEQ ID NO：6)：GGCAACATGAGCGAAACCCTAT

G1-R(SEQ ID NO：7)：AAACATAGGGTTTCGCTCATGT

G2-F(SEQ ID NO：8)：GGCAGGCGTCGGTTTCCACTAT

G2-R(SEQ ID NO：9)：AAACATAGTGGAAACCGACGCC

G3-F(SEQ ID NO：10)：GGCAGCTGGCGTAATAGCGAAG

G3-R(SEQ ID NO：11)：AAACCTTCGCTATTACGCCAGC

G4-F(SEQ ID NO：12)：GGCAACAGTTGCGCAGCCTGAA

G4-R(SEQ ID NO：13)：AAACTTCAGGCTGCGCAACTGT

将设计好的G1-F/R,G2-F/R,G3-F/R,G4-F/R引物分别在100℃条件下退火5分钟，自然冷却，将退火产物与经过AarI酶切的中间载体sk-gRNA连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，经测序证明正确，得到4个中间载体命名为sk-g1，sk-g2，sk-g3，sk-g4。以KpnI/BamHI酶切sk-g1作为载体，以KpnI/SalI酶切sk-g2；XhoI/NheI酶切sk-g3；XbaI/BglII酶切sk-g4；分别回收3个542bp目的片段，T4酶连接得到sk-g1g2g3g4-gRNA载体。用KpnI和BglII双酶切sk-g1g2g3g4-gRNA，回收含gRNA的大小为2072bp目的片段，与经过KpnI和BamHI双酶切的载体pC1300-MADS15P-Cas9-GFP连接，得到最终载体pC1300-G1-G2-G3-G4-MADS15P-Cas9-GFP。

2X35S序列SEQ ID NO:14

CCCTACTCCAAAAATGTCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACCCCTACTCCAAAAATGTCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACAGCCCAAGCTTGTCGACGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGTGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCACGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACCCG

sk-g1g2g3g4-gRNA序列SEQ ID NO:15

ctgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccgaggatcctctagactcgaggattatgtggaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaacttcaggctgcgcaactgttgccacggatcatctgcacaactcttttaaatcagctttgatctatgtggatagccgaggtggtactaatactagtctttgttgtcgtccaattgcgtaatgggccggcccatactgcaatacatgtcctgaaaggcttcatggcccactacgaaatgcttttctcctacagtttatcttacttcttcacatcacgtggtttccgacgtacccagtgttcccggcttccagcatttgctggtagcaccagtagaagacgcctgtcttgtgctatggtccctgactgcacatctgattcctccaagatccatgcatgcctgataactttaagttgcttcagaagaactttaagtgatctgttcgtatgtttaaagattccttaatcgtcgacgctagcagatcctctagactcgaggattatgtggaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaaccttcgctattacgccagctgccacggatcatctgcacaactcttttaaatcagctttgatctatgtggatagccgaggtggtactaatactagtctttgttgtcgtccaattgcgtaatgggccggcccatactgcaatacatgtcctgaaaggcttcatggcccactacgaaatgcttttctcctacagtttatcttacttcttcacatcacgtggtttccgacgtacccagtgttcccggcttccagcatttgctggtagcaccagtagaagacgcctgtcttgtgctatggtccctgactgcacatctgattcctccaagatccatgcatgcctgataactttaagttgcttcagaagaactttaagtgatctgttcgtatgtttaaagattccttaatcgtcgacgctagactcgaggattatgtggaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaacatagtggaaaccgacgcctgccacggatcatctgcacaactcttttaaatcagctttgatctatgtggatagccgaggtggtactaatactagtctttgttgtcgtccaattgcgtaatgggccggcccatactgcaatacatgtcctgaaaggcttcatggcccactacgaaatgcttttctcctacagtttatcttacttcttcacatcacgtggtttccgacgtacccagtgttcccggcttccagcatttgctggtagcaccagtagaagacgcctgtcttgtgctatggtccctgactgcacatctgattcctccaagatccatgcatgcctgataactttaagttgcttcagaagaactttaagtgatctgttcgtatgtttaaagattccttaatcgtcgaggattatgtggaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaacatagggtttcgctcatgttgccacggatcatctgcacaactcttttaaatcagctttgatctatgtggatagccgaggtggtactaatactagtctttgttgtcgtccaattgcgtaatgggccggcccatactgcaatacatgtcctgaaaggcttcatggcccactacgaaatgcttttctcctacagtttatcttacttcttcacatcacgtggtttccgacgtacccagtgttcccggcttccagcatttgctggtagcaccagtagaagacgcctgtcttgtgctatggtccctgactgcacatctgattcctccaagatccatgcatgcctgataactttaagttgcttcagaagaactttaagtgatctgttcgtatgtttaaagattccttaatcgtcgacgctagcagatctgcggccgccaccgcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccac

靶位点：

2、植株转化：转基因植株的获得

将上述获得的pC1300-G1-G2-G3-G4-MADS15P-Cas9-GFP双元载体转入根癌农杆菌EHA105中，得到重组菌1。提取重组菌1的质粒送去测序，结果该质粒为pC1300-G1-G2-G3-G4-MADS15P-Cas9-GFP，将含有该质粒的重组菌1命名为EHA105/pC1300-G1-G2-G3-G4-MADS15P-Cas9-GFP。

将成熟胚脱壳灭菌，接种到诱导愈伤组织的培养基中。培养3周后，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。

将上述重组菌EHA105/pC1300-G1-G2-G3-G4-MADS15P-Cas9-GFP转入到受体植株日本晴的愈伤组织中，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性转基因植株。筛选抗性愈伤在含有50mg/L预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。大田种植T0代植株，成熟后收获种子，发苗得到T1代水稻。

3.GFP信号检测

取T1代小苗根尖在荧光显微镜下观察，结果发现转基因植株根尖绿色信号明显(图3)，表明GFP在转基因植株中成功表达。

4.无标记转基因植株检测

提取T1代植株(20棵)DNA，以下述引物进行检测，如图4所示1-5，12-16样品DNA通过PCR扩增未发现Cas9，潮霉素抗性标记等序列，而GFP序列未受影响。测序结果如图5所示，所有T1代植株序列切除的方式一致，虚线部分表示缺失部分，被删除掉。

F1(SEQ ID NO：20)ATGTACTGAATTAACGCCGAA

F2(SEQ ID NO：21)AAGACCAATGCGGAGCATATAC

F3(SEQ ID NO：22)CCTAAGAAGAAGAGAAAGGTCG

F4(SEQ ID NO：23)GCCCATCTCTTCGATGACAAGGTTATG

F5(SEQ ID NO：24)GGGTTTCGCTCATGTGTTGAGC

F6(SEQ ID NO：25)ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

R1(SEQ ID NO：26)TCACGTCAGGTGGCAGTTTA

R2(SEQ ID NO：27)GACGTCTGTCGAGAAGTTTC

R3(SEQ ID NO：28)GCAGATGATAGATTGTGGGGTA

R4(SEQ ID NO：29)CTTCGCAGTGGCCTTGCCAATTTC

R5(SEQ ID NO：30)CGGGTTACTTGTACAGCTCG

Actin-F(SEQ ID NO：31)TGCTATGTACGTCGCCATCCA

Actin-R(SEQ ID NO：32)AATGAGTAACCACGCTCCGTC

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

用于商品化生产的农作物多是杂合的，自交繁种后会产生分离，后代性状可能不稳定，不能用于大规模生产以及形状保持，而普通产生无标记植株的方法多需要进行杂交以达到标记分离的目的，本发明不需要通过杂交，特异启动子的选择可以达到在转基因当代(T0)就得到转基因无标记植株，值得推广应用。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 获得无标记转基因植物的方法

<130> PN78583SDYJS

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3976

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

tccgatcgag ctagtcctgt gcccgtacca tgacggagcc gatcctctcc attcaaaggg 60

aatatgatga gagagtagtg gggaatcggt ttttgcaatc aattagagga ggaaacgcat 120

ggagagacaa atcgacgtgg cggtggcgct agggttcagc ccgacgaaaa aaccacgaaa 180

aaaatagaga caaaagaaag aaacccgaaa accggtgaaa gaaaaaaaag agggaacagt 240

gaaaagaaaa gaaaaaaaag gaaaacggtg aaaaataaaa taaaacggaa aaagatggga 300

aaaaagaaaa acaggcgaaa attataggtg gaagcatatg tattttttat taggtataga 360

tttctagatt ctatagcttt tgatccttgt aatctagatg aaaagcttac gggcctcttt 420

gatttagagg ataaacatag gaattttgga gaattttaat cctatataaa aaaattatat 480

aaatacattt gaaacaaaag attgaatcct atcatatcct atcctattaa agtcctatgg 540

aatgaacaat tctacagaga ttttggcgga aatttagcaa gagcttcaac ctcttggaaa 600

ttttcctttg agtctatctc tcttatccga ttcgtacttt ttcctatggt ttaatcaaat 660

ggttatttct aagatttcct gtgttttaca atcctctgtt atgcacgaac tccaagaagt 720

tatgtgttat aaggttcaca tcctctgtta gtagttgact gtactattaa actataccat 780

taatagcata gccaactatt aacttcacat catctatcaa aaactctcta aaagacaggg 840

ccacatactc agggggtgtt tagatccagg ggtgtaaagt tttggcgtgt catatcggat 900

attatatagg gtgtcgcatg gggtgtttga cactaataaa aaaactaatt acagaatccg 960

tcagtaaacc gcgagacaaa tttattaagc ctaattaatc agtcattagc aaaggtttac 1020

tgtagtacca cattgtcaaa tcatgtagca attaggctta aaagatttgt ctcgcaaatt 1080

agtcgcaatc tgtgcaatta gttatttttt agcctatgtt taatacctca tgcatgtgtt 1140

cgatatgacg gggtgtaaaa ttttgggtgg gatctaaaca tggcctcatt aaaaccaacc 1200

attgacaagg tctagtgtgg atgtaaagtg tgtaaactag agtgctctgt atgtaaagat 1260

gactaatttt atactccctc cgttccaaaa taagtgcagt tttagcattg ttcatgtcca 1320

acgtttgact gtttgtctta tttgaaattt ttttataatt actactttta ttgttattag 1380

atgataaaac atgaatagta ctttatgtgt gactaatttt ttttaatatt tttcataatt 1440

ttttcaaata agacgggtgg tcaaaacaat gaacacggat atctatggct gaacttattt 1500

tgagacggag gtagtacaat tattgtattg ggtatatata tcatttgtgc aactactagt 1560

atacatacgt agtactccct ccgtcccata gtgttgcaac ctaggatggg atgagataca 1620

tcaaaccatc ctaggactac gaatttggac atgattcgta gtcctaggat gggtctcatc 1680

ccatcctagg ttgcaacatt atgggacgga cggagtccta tatatgtagg ccatgctctc 1740

ggggagagag agagagagag agagagagag agagagagag aggggccaat tggtgttgcg 1800

atcgaggcta ggtcaggtca tgacgcaatg caaatgttat atggaatgga tcagagtgat 1860

agaggagaga gctgtcgagc tgggattgca gcatctccag cgccaggagc accagttgcc 1920

gtaaacaaca ccacacagtt tttcccacca aatataaaag atctttcttg gcacagtgcg 1980

ttcaacagtt gcaagcaata atattattgg ctaattagta ctgactttta ttaatattcg 2040

cctattatac aattgatacc acctccgatc cattcctaaa tatactgacc aatgtcatat 2100

gaaaaaagaa tagagagagt agtaattaat gaactatatc agtgaacatt gacagacaaa 2160

aataaaatca tactagccat actgtgcaaa aagcaccata tataatttga aaacgaccgg 2220

tatagtttac actcatatat actactccat ccgtttcagt ttataatgca ttttgacttt 2280

agtcaaagtt aaactgtttt aagtttaact aagtttgtag acaaatataa taatatttat 2340

aatactaaat taattagagt catcaaatta acaattgaat atattttcat aataaattta 2400

tcttggattg aaaagtcaaa acgtaatttg actttgacca aagtcaaaac gtcttattat 2460

aatggagtaa ctttgtaaat cacacttgag tgtattgcgt gatttcttag gatgctacgc 2520

tatctcacaa gcgacttacg tactataaat taatgcagtg aacatactta gagagttgaa 2580

ttttaccacg atttaatttc gatggactaa ttaaagaaaa tctcaaggtt tcgaaaacga 2640

catggtacgt cgtgcgcgta tatgtaacta ttgaccatgt attcatatgc acgaattggt 2700

acaaaagggt gcacaaattc tgcaataact gttggaaatg tatatatatt catacatatg 2760

tgtgtacact gctctctcca tctctaaaat accttatact ccctccattt catattgtaa 2820

gactttctag cattgtttat atttatatag atgttaatga atttagacac acacacacac 2880

acacacacat atatatatat atatatatat atatatatat atatatattc attaacatat 2940

atatgaatgt ggccaatgct aaaaattctt acattgtgaa acggatgaag tagtatttag 3000

ctggtctcag atatattagt atggttgtga aaagacgaat atgcacttca ttaagattat 3060

atgcttctat tatactacat gtttagctag acttttggca tgcccaagct ctaacaaatg 3120

atttttgcac ctaaatcgat ttcaattagg tgggcgagag tggggtttaa ccaatagaga 3180

taaaataagg acaataaaaa cagctagtgg accacatatc tccacacgtc tcttaaaaaa 3240

agatttattt tacaactgaa tttgaagata aggtattttg taattgagaa agtaaatacc 3300

aatatactcc ctccggttat ttatatttat atttagcgtt agaaaagtta aacttagttt 3360

tcccatcttt aaatatatat agtgaatgga tcgtatcgta aaaaaaaaga caaccggatt 3420

atagttaaat aattggccat gtattgatat ggtgcaaatt aacaaaattt cgcagtaatg 3480

attggccatg tattcatgtg tacatttatc aatatatcaa taaaaaagac aagaggataa 3540

taatagtaat aataaagaaa tggagaaaag gagtcgaggg gttgggagtt cgaccgtacg 3600

aggaggtagc atagcagcag aatcgacccc aagctttcct tctcacgtaa catgccgtta 3660

ttatattata tatattaaaa taattaatcc aattattttt taccagatta atattaatgt 3720

aatccgtgtg tcagcaggct tgagaggctg caggtgggcc ccatgattcc gggaccaatc 3780

acagctcgac agcatactga cacccgtccc caaaagcaaa gaggcctctc tctctctctc 3840

tcgccgatcc ctctcctcct cctcttcttc ttcttccact agctagttcg tcttcctcct 3900

tcagctagct tgtagcagct aaggttaggt cggatcgaga tcgggatcgg ccgccggcga 3960

gcggcgagcg gcgagg 3976

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(44)

<223> 引物M15-P-F

<400> 2

cgagctcggt accaaggatc cgaaaagctt acgggcctct ttga 44

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(44)

<223> 引物M15-P-R

<400> 3

tcttcttctt aggggccatg gtctctatcc gcttcagctg cacc 44

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(46)

<223> 引物cas-Hgfp-F

<400> 4

cgtttcccgc cttcagttta aactgccacc tgacgtgagc tcggta 46

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(47)

<223> 引物cas-Hgfp-R

<400> 5

tgtcaaacac tgatagttta aaccggtgtg agggaactag ttttgat 47

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(22)

<223> 引物G1-F

<400> 6

ggcaacatga gcgaaaccct at 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(22)

<223> 引物G1-R

<400> 7

aaacataggg tttcgctcat gt 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(22)

<223> 引物G2-F

<400> 8

ggcaggcgtc ggtttccact at 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(22)

<223> 引物G2-R

<400> 9

aaacatagtg gaaaccgacg cc 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(22)

<223> 引物G3-F

<400> 10

ggcagctggc gtaatagcga ag 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(22)

<223> 引物G3-R

<400> 11

aaaccttcgc tattacgcca gc 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(22)

<223> 引物G4-F

<400> 12

ggcaacagtt gcgcagcctg aa 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(22)

<223> 引物G4-R

<400> 13

aaacttcagg ctgcgcaact gt 22

<210> 14

<211> 1481

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(1481)

<223> 2X35S序列

<400> 14

ccctactcca aaaatgtcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggctat tgagactttt 60

caacaaaggg taatttcggg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttc 120

atcgaaagga cagtagaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg cgataaagga 180

aaggctatca ttcaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg 240

aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt 300

gacatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccacc cctactccaa aaatgtcaaa 360

gatacagtct cagaagacca aagggctatt gagacttttc aacaaagggt aatttcggga 420

aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttca tcgaaaggac agtagaaaag 480

gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggctatcat tcaagatgcc 540

tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa 600

gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg acatctccac tgacgtaagg 660

gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt 720

catttggaga ggacagccca agcttgtcga cggatccatg gtgagcaagg gcgaggagct 780

gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt 840

cagcgtgtcc ggcgagggtg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat 900

ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccacct tcacctacgg 960

cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc 1020

catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa 1080

gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg 1140

catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag 1200

ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat 1260

ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc 1320

catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct 1380

gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc 1440

cgggatcact cacggcatgg acgagctgta caagtaaccc g 1481

<210> 15

<211> 4959

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_RNA

<222> (1)..(4959)

<223> sk-g1g2g3g4-gRNA序列

<400> 15

ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 60

ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 120

ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 180

ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 240

ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 300

gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 360

tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 420

ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaatttc cattcgccat tcaggctgcg 480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccga 660

ggatcctcta gactcgagga ttatgtggaa aaaaagcacc gactcggtgc cactttttca 720

agttgataac ggactagcct tattttaact tgctatttct agctctaaaa cttcaggctg 780

cgcaactgtt gccacggatc atctgcacaa ctcttttaaa tcagctttga tctatgtgga 840

tagccgaggt ggtactaata ctagtctttg ttgtcgtcca attgcgtaat gggccggccc 900

atactgcaat acatgtcctg aaaggcttca tggcccacta cgaaatgctt ttctcctaca 960

gtttatctta cttcttcaca tcacgtggtt tccgacgtac ccagtgttcc cggcttccag 1020

catttgctgg tagcaccagt agaagacgcc tgtcttgtgc tatggtccct gactgcacat 1080

ctgattcctc caagatccat gcatgcctga taactttaag ttgcttcaga agaactttaa 1140

gtgatctgtt cgtatgttta aagattcctt aatcgtcgac gctagcagat cctctagact 1200

cgaggattat gtggaaaaaa agcaccgact cggtgccact ttttcaagtt gataacggac 1260

tagccttatt ttaacttgct atttctagct ctaaaacctt cgctattacg ccagctgcca 1320

cggatcatct gcacaactct tttaaatcag ctttgatcta tgtggatagc cgaggtggta 1380

ctaatactag tctttgttgt cgtccaattg cgtaatgggc cggcccatac tgcaatacat 1440

gtcctgaaag gcttcatggc ccactacgaa atgcttttct cctacagttt atcttacttc 1500

ttcacatcac gtggtttccg acgtacccag tgttcccggc ttccagcatt tgctggtagc 1560

accagtagaa gacgcctgtc ttgtgctatg gtccctgact gcacatctga ttcctccaag 1620

atccatgcat gcctgataac tttaagttgc ttcagaagaa ctttaagtga tctgttcgta 1680

tgtttaaaga ttccttaatc gtcgacgcta gactcgagga ttatgtggaa aaaaagcacc 1740

gactcggtgc cactttttca agttgataac ggactagcct tattttaact tgctatttct 1800

agctctaaaa catagtggaa accgacgcct gccacggatc atctgcacaa ctcttttaaa 1860

tcagctttga tctatgtgga tagccgaggt ggtactaata ctagtctttg ttgtcgtcca 1920

attgcgtaat gggccggccc atactgcaat acatgtcctg aaaggcttca tggcccacta 1980

cgaaatgctt ttctcctaca gtttatctta cttcttcaca tcacgtggtt tccgacgtac 2040

ccagtgttcc cggcttccag catttgctgg tagcaccagt agaagacgcc tgtcttgtgc 2100

tatggtccct gactgcacat ctgattcctc caagatccat gcatgcctga taactttaag 2160

ttgcttcaga agaactttaa gtgatctgtt cgtatgttta aagattcctt aatcgtcgag 2220

gattatgtgg aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc 2280

cttattttaa cttgctattt ctagctctaa aacatagggt ttcgctcatg ttgccacgga 2340

tcatctgcac aactctttta aatcagcttt gatctatgtg gatagccgag gtggtactaa 2400

tactagtctt tgttgtcgtc caattgcgta atgggccggc ccatactgca atacatgtcc 2460

tgaaaggctt catggcccac tacgaaatgc ttttctccta cagtttatct tacttcttca 2520

catcacgtgg tttccgacgt acccagtgtt cccggcttcc agcatttgct ggtagcacca 2580

gtagaagacg cctgtcttgt gctatggtcc ctgactgcac atctgattcc tccaagatcc 2640

atgcatgcct gataacttta agttgcttca gaagaacttt aagtgatctg ttcgtatgtt 2700

taaagattcc ttaatcgtcg acgctagcag atctgcggcc gccaccgcgg tggagctcca 2760

gcttttgttc cctttagtga gggttaattg cgcgcttggc gtaatcatgg tcatagctgt 2820

ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 2880

agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 2940

tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 3000

cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 3060

gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 3120

ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 3180

ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 3240

atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 3300

aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 3360

gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 3420

ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 3480

ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 3540

acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 3600

gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 3660

ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 3720

ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 3780

gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 3840

ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 3900

agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 3960

ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 4020

gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 4080

catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 4140

cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 4200

cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 4260

gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 4320

tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 4380

gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 4440

tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 4500

gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 4560

gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 4620

taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 4680

tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 4740

ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 4800

taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 4860

tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 4920

aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccac 4959

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(21)

<223> 靶位点G1

<400> 16

acatgagcga aaccctatag g 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(21)

<223> 靶位点G2

<400> 17

ggcgtcggtt tccactatcg g 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(21)

<223> 靶位点G3

<400> 18

gctggcgtaa tagcgaagag g 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(21)

<223> 靶位点G4

<400> 19

acagttgcgc agcctgaatg g 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(21)

<223> 引物F1

<400> 20

atgtactgaa ttaacgccga a 21

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(22)

<223> 引物F2

<400> 21

aagaccaatg cggagcatat ac 22

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(22)

<223> 引物F3

<400> 22

cctaagaaga agagaaaggt cg 22

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(27)

<223> 引物F4

<400> 23

gcccatctct tcgatgacaa ggttatg 27

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(22)

<223> 引物F5

<400> 24

gggtttcgct catgtgttga gc 22

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223> 引物F6

<400> 25

atggtgagca agggcgagga 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223> 引物R1

<400> 26

tcacgtcagg tggcagttta 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223> 引物R2

<400> 27

gacgtctgtc gagaagtttc 20

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(22)

<223> 引物R3

<400> 28

gcagatgata gattgtgggg ta 22

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(24)

<223> 引物R4

<400> 29

cttcgcagtg gccttgccaa tttc 24

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223> 引物R5

<400> 30

cgggttactt gtacagctcg 20

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(21)

<223> 引物Actin-F

<400> 31

tgctatgtac gtcgccatcc a 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(21)

<223> 引物Actin-R

<400> 32

aatgagtaac cacgctccgt c 21

Claims

1.一种获得无标记转基因植物的方法，通过CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统实现，其特征在于，所述CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统的载体中包含基因编辑蛋白基因、靶向载体自身的sgRNA和特异时空表达基因启动子，所述特异时空表达基因启动子在愈伤组织时期不表达，待完成遗传转化后表达所述基因编辑蛋白基因；所述启动子具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述基因编辑蛋白基因为Cas9基因或Cpf1基因；所述载体还包含配套的Cas9基因或Cpf1基因的元件；所述载体为双元表达载体，所述双元表达载体为Pcambia1300；所述植物为水稻。