CN103864887A

CN103864887A - 一种链霉菌生物合成调控蛋白的体外筛选方法

Info

Publication number: CN103864887A
Application number: CN201410006385.2A
Authority: CN
Inventors: 李永泉; 毛旭明; 罗帅; 周日成
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-01-07
Filing date: 2014-01-07
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2034-01-07
Also published as: CN103864887B

Abstract

本发明提供一种链霉菌生物合成调控蛋白的体外筛选方法，将培养的链霉菌细胞破碎，得到链霉菌全蛋白质组溶液，将有生物素标记的dptE基因启动子DNA片段与链亲和素耦合的琼脂糖相结合后，再与蛋白质组溶液相互混合，经亲和结合与洗脱后，得到链霉菌中与目的DNA片段相互结合的蛋白质溶液。最后，经胰酶消化后，再使用高效液相色谱以及串联质谱（HPLC-MS/MS）的方法对结合蛋白的氨基酸残基进行分析，获得部分肽段序列，通过比对从而精确确定与目的DNA片段相结合的调控因子。本发明筛选未知调控蛋白，该方法高效，准确，操作方便，为链霉菌体内调控因子的筛选提供了一种新的研究手段。

Description

一种链霉菌生物合成调控蛋白的体外筛选方法

技术领域

本发明涉及生物化学与分子生物学领域，特别涉及一种链霉菌体内调控蛋白对特定DNA片段结合的体外筛选方法。

背景技术

许多蛋白质在生物体内具有调控作用，其中一类为激素，如动物体内的胰岛素，其可以调控动物体内的血糖浓度等。还有一类调控蛋白可以参与基因的表达的调控，它们可以激活或者抑制特定基因的转录水平。

链霉菌属于放线菌属，是革兰氏阳性细菌。链霉菌具有复杂的生命周期，包括从基质菌丝、气生菌丝到孢子的形态分化。目前使用的大部分抗生素是由链霉菌生产的。在链霉菌生命周期的不同阶段，其体内的调控蛋白通过激活或者抑制相关基因的转录水平，调控这些生命周期平稳有序地进行。同时调控基因还能调节链霉菌体内各种代谢相关基因和抗逆基因的表达水平，以调控多种次级代谢产物的产生和对多种环境胁迫的适应等。因此对于链霉菌体内生长与代谢调控蛋白的研究不论是从基础科研还是从工业生产上来说，都具有极其重要的意义。

以链霉菌中的模式生物天蓝色链霉菌为例，全基因组测序表明，其基因大小为8.6Mbp，共7825个基因，其中包含了数量庞大的调控基因。由此可知，各种调控基因在天蓝色链霉菌的生长代谢过程中形成了一个复杂的调控网络，精密调节着链霉菌的生长发育。其调控网络的复杂性也大大增加了研究人员对其调控机制研究的难度。因此我们急需各种高效的调控基因筛选、定位等研究方法。

发明内容

本发明的目的是针对链霉菌体内调控蛋白研究，提供一种链霉菌生物合成调控蛋白的体外筛选方法，是一种调控蛋白体外筛选的新技术。

本发明将链霉菌生物体破胞，得到链霉菌蛋白质组溶液。同时将有生物素标记的目的DNA片段与链亲和素琼脂糖相结合后，再与蛋白质组溶液相互混合，筛选得到链霉菌中与目的DNA片段相互结合的蛋白质溶液。最后，使用高效液相色谱以及串联质谱的方法对结合蛋白进行部分氨基酸残基测序，精确确定与目的DNA片段相结合的每一种蛋白分子。具体步骤如下：

（1）将链霉菌液体培养基培养24～48小时后，以5000rpm速度离心5分钟，用蛋白结合液重悬成悬液，将悬液超声破碎后，于4℃条件下12000rpm速度离心10分钟，取上清，并用直径0.45um的微孔滤膜过滤上清，得到蛋白质组溶液备用；

（2）制备生物素标记的载体片段DNA和生物素标记的载体片段与目的片段融合DNA；

（3）将链亲和素琼脂糖与生物素标记的载体片段DNA在蛋白结合液中混合，置于亲和层析柱中，于25℃摇动结合30分钟后，弃去上清；

（4）将蛋白质组溶液加入（3）中的亲和层析柱中，25℃摇动结合30分钟后，过滤取上清；

（5）将链亲和素琼脂糖和生物素标记的载体片段与目的片段融合DNA在蛋白结合液中混合，置于亲和层析柱中，于25℃摇动结合30分钟后，弃去上清；

（6）将（4）中得到蛋白质组溶液加入（5）中的亲和层析柱中，25℃摇动，与有生物素标记的载体片段与目的片段融合DNA的链亲和素磁珠结合30分钟后，过滤弃上清；

（7）使用蛋白结合液将（6）中的亲和层析柱过滤洗涤两遍后，加入蛋白洗脱液。将亲和层析柱于25℃摇动洗脱30分钟，过滤收集上清溶液；

（8）使用10kD超滤离心管将7）中得到的上清溶液替换成NH₄HCO₃溶液；

（9）将（8）中得到的溶液加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇，于56℃保温30分钟后冷却到室温。接着加入终浓度为20mM的碘乙酰胺，于黑暗下25℃保温30分钟。接着加入胰蛋白酶，37℃保温5个小时，60℃烘干；

（10）将得到的干粉样品在串联质谱中进行氨基酸残基测序分析；

（11）将得到的氨基酸残基序列在链霉菌的全基因组数据库中进行序列比对，精确确定和目的DNA序列相结合的蛋白，及其对应的基因，并筛选出其中可能的调控基因；

（12）体外表达并纯化筛选出的可能的调控蛋白，使用EMSA（凝胶电泳迁移率实验）实验进一步验证该蛋白与目的DNA相互结合的实验事实。

蛋白结合液配方为：终浓度为10%甘油、20mM Tris·Cl，50mM NaCl、1mM EDTA，溶液最终pH值为8.0。

蛋白洗脱液配方为：终浓度为10%甘油，20mM Tris·Cl、1M NaCl、1mM EDTA，溶液最终pH值为6.8。

制备生物素标记的载体片段DNA和生物素标记的载体片段与目的片段融合DNA的方法为使用PCR反应（聚合酶链式反应）制备。其PCR反应所需的引物中，一条引物于5’端进行生物素标记修饰，另一条引物则无修饰。

所有操作中的摇动均在侧摆摇床上以30次/分钟的速度进行。

本发明的另一个目的是提供所述方法在体外筛选链霉菌中任何与生物合成相关的基因启动子DNA结合的调控蛋白中的应用。

调控蛋白和其调控的目的基因启动子序列相互结合是调控蛋白发挥调控功能的第一步。本发明在这DNA和蛋白相互结合的基础上开发了一种新的针对目的基因DNA序列，筛选未知调控蛋白的体外筛选方法。该方法高效，准确，操作方便，为链霉菌体内调控因子的筛选提供了一种新的研究手段。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：（1）本发明将目的DNA序列和链霉菌蛋白质组进行结合筛选，可以筛选出与目的DNA序列特异性结合的调控蛋白可靠性高，串联质谱氨基酸测序技术定位精确，并且可以使用EMSA等实验方便地验证。（2）本发明将目的DNA序列和链霉菌蛋白质组进行结合筛选在体外进行，筛选效率提高，时间缩短。（3）本发明筛选所使用的DNA序列灵活性高，可以使用任意想要的DNA序列合成探针进行筛选，适用性广泛，更可推广应用到其他生物的分子调控机制研究中。

附图说明

图1是ORF2870和ORF4603调控因子与dptE基因启动子结合分析的EMSA实验图。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步的详细描述。

实施例1

以使用本方法筛选达托霉素生产菌小链霉菌SW0702中dptE基因的调控蛋白为例（小链霉菌由杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司提供，分类命名为小链霉菌SW0702 Streptomyces parvus SW0702，其在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC M 2010136, 保藏日期为：2010年6月4日，保藏单位地址：中国武汉武汉大学）。具体实施步骤如下：

（1）将小链霉菌于TSB液体培养基30℃，250rpm培养24～48小时后，以5000rpm速度离心5分钟，用蛋白结合液重悬成悬液。将悬液超声破碎后，于4℃条件下12000rpm速度离心10分钟，取上清。并用直径0.45um的微孔滤膜过滤上清，得到5ml蛋白质组溶液备用；

（2）使用p29和5’端生物素标记的p155为引物，质粒pUC18为模板制备生物素标记的载体片段DNA。使用p29和5’端生物素标记的p155为引物，插入dptE基因启动子片段的pUC18质粒为模板制备生物素标记的载体片段与目的片段融合DNA（引物序列见序列表，dptE基因启动子序列以及质粒pUC18序列见序列表）；

（3）将100ul体积的链亲和素琼脂糖与500ng生物素标记的载体片段DNA（同时加入500

鱼精DNA）在蛋白结合液中混合，置于6ml亲和层析柱中，于25℃摇动结合30分钟后，弃去上清；

（4）将（1）中的蛋白质组溶液加入（3）中的亲和层析柱中，25℃摇动结合30分钟后，过滤取上清；

（5）将100ul链亲和素琼脂糖和生物素标记的载体片段与500ng目的片段融合DNA（同时加入500

（6）将（4）中得到蛋白质组溶液加入（5）中的亲和层析柱中，25℃摇动，与有生物素标记的载体片段与目的片段融合DNA的链亲和素琼脂糖结合30分钟后，过滤弃上清；

（7）分别使用3ml蛋白结合液将（6）中的亲和层析柱过滤洗涤两遍后，加入2ml蛋白洗脱液。将亲和层析柱于25℃摇动洗脱30分钟，过滤收集上清溶液；

（8）用10KD截留超滤离心管将（7）中得到的上清溶液替换成100mM pH8.0的NH₄HCO₃溶液；

（9）将（8）中得到的溶液加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇，于56℃保温30分钟后冷却到室温。接着加入终浓度为20mM的碘乙酰胺，于黑暗下25℃保温30分钟。接着加入胰蛋白酶，37℃保温5个小时后，于60℃旋转烘干；

（10）将得到的干粉样品进行串联质谱实验，进行氨基酸残基测序分析；

（11）将得到的部分氨基酸残基序列在小链霉菌SW0702的蛋白质组数据库中进行序列比对，比对结果筛选出其中可能的两个调控蛋白ORF2870和ORF4603；

（12）体外表达并纯化筛选出调控蛋白ORF2870和ORF4603，并将ORF2870和ORF4603两个蛋白与dptE基因的启动子进行EMSA实验（见图1：1、5泳道为载体DNA泳道，2、6泳道为载体DNA分别与蛋白ORF2870和ORF4603混合泳道，3、7泳道为dptE基因启动子和载体序列融合DNA泳道，4、8泳道为dptE基因启动子和载体序列融合DNA分别与蛋白ORF2870和ORF4603混合泳道）。实验结果表明，ORF2870和ORF4603两个调控蛋白都和dptE基因的启动子有特异性的结合。

TSB培养基配方为：TSB 2%, PEG6000 5%。

蛋白结合液配方为：终浓度为10%甘油、20mM Tris·Cl、50mM NaCl、1mM EDTA，溶液最终pH值为8.0。

蛋白洗脱液配方为：终浓度为10%甘油、20mM Tris·Cl、1M NaCl、1mM EDTA，溶液最终pH值为6.8。

所有操作中的摇动都在侧摆摇床上以30次/分钟的速度进行。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种链霉菌生物合成调控蛋白的体外筛选方法

<160> 4

<210> 1

<211> 408

<212> DNA

<213> Streptomyces roseosporus

<400> 1

cnatnattnn catntanncc cctccccacc acctgcccag tgtgacgttt gcgcagatga 60

gaacgtgcgt aaacgccgca tacgcaaaga tcgtccctgc cgggacccat tgacgttcgc 120

aggggcgtgg aacatactgg cgatcaagtc gcacaggaac caacaggcac accaaccaca 180

ggcgttacag ggggggttgg tgtttcgtcc atatcaagtg gtttggtccg ccgaagcggt 240

tggacctcac atgacggcaa cagggcattc gcacatgcct gatgacggga cggcacacct 300

cacgcagcgg cgaccggtcg caagccggac gcggaatgac tccctgcctt acaggtatgc 360

gagcgcggat gcgtcgttcg accggagtca ggagggggag tgcctgcc 408

<210> 2

<211> 2691

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cnatntcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 60

ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 120

gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag 180

agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag 240

gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc 300

gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc 360

agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gccaagcttg catgcctgca 420

ggtcgactct agaggatccc cgggtaccga gctcgaattc gtaatcatgg tcatagctgt 480

ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 540

agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 600

tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 660

cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 720

gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 780

ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 840

ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 900

atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 960

aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 1020

gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaaagc tcacgctgta 1080

ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 1140

ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 1200

acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 1260

gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat 1320

ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 1380

ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 1440

gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 1500

ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 1560

agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 1620

ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 1680

gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 1740

catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 1800

cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 1860

cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 1920

gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 1980

tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 2040

gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 2100

tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 2160

gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 2220

gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 2280

taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 2340

tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 2400

ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 2460

taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 2520

tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 2580

aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta 2640

ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt c 2691

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gccagggttt tcccagtcac ga 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gagcggataa caatttcaca cagg 24

Claims

1. 一种链霉菌生物合成调控蛋白的体外筛选方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）将链霉菌在TSB液体培养基中培养24～48小时后，以5000rpm速度离心5分钟收集细胞，用蛋白结合液重悬成悬液，将悬液超声破碎后，于4℃条件下12000rpm速度离心10分钟，取上清，并用直径0.45um的微孔滤膜过滤上清，得到蛋白质组溶液备用；

（2）制备生物素标记的载体DNA片段和生物素标记的载体片段与目的片段融合DNA；

（3）将链亲和素耦合的琼脂糖与生物素标记的载体片段DNA在蛋白结合液中混合，置于亲和层析柱中，于25℃摇动结合30分钟后，弃去上清；

（5）将链亲和素琼脂糖和生物素标记的载体片段与目的片段融合的DNA在蛋白结合液中混合，置于亲和层析柱中，于25℃摇动结合30分钟后，弃去上清；

（6）将（4）中得到蛋白质组溶液加入（5）中的亲和层析柱中，25℃摇动，与载有生物素标记的载体片段与目的片段融合DNA的链亲和素琼脂糖结合30分钟后，过滤并弃上清；

（7）使用蛋白结合液将（6）中的亲和层析柱过滤洗涤两遍后，加入蛋白洗脱液，将亲和层析柱于25℃摇动洗脱30分钟，过滤收集上清溶液；

（8）使用超滤离心管将（7）中得到的上清溶液替换成NH₄HCO₃溶液；

（9）将（8）中得到的溶液加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇，于56℃保温30分钟后冷却到室温，接着加入终浓度为20mM的碘乙酰胺，于黑暗下25℃保温30分钟，接着加入胰蛋白酶，37℃保温5个小时，60℃烘干；

（10）将得到的干粉样品在高效液相层析-串联质谱中进行部分氨基酸残基测序分析；

（12）体外表达并纯化筛选出的可能的调控蛋白，使用凝胶电泳进一步验证该蛋白与目的DNA相互结合的实验事实。

2.根据权利要求1所述的一种链霉菌生物合成调控蛋白的体外筛选方法，其特征在于，所用到的蛋白结合液组成为：终浓度为10%甘油、20mM Tris·Cl、50mM NaCl、1mM EDTA、溶液最终pH值为8.0。

3.根据权利要求1所述的一种链霉菌生物合成调控蛋白的体外筛选方法，其特征在于，其所用到的蛋白洗脱液组成为：终浓度为10%甘油、20mM Tris·Cl、1M NaCl、1mM EDTA、溶液最终pH值为6.8。

4.根据权利要求1所述的一种链霉菌生物合成调控蛋白的体外筛选方法，其特征在于，其制备生物素标记的载体片段DNA和生物素标记的载体片段与目的片段融合的DNA的方法为使用聚合酶链式反应制备，反应所需的引物中，一条引物于5’端进行生物素标记修饰，另一条引物则无修饰。

5.根据权利要求1所述的一种链霉菌生物合成调控蛋白的体外筛选方法，其特征在于，操作中的摇动都在侧摆摇床上以30次/分钟的速度进行。