CN102174518A

CN102174518A - 虾白斑综合征病毒iel启动子主要顺式作用元件及与其结合的转录因子和应用

Info

Publication number: CN102174518A
Application number: CN 201110032519
Authority: CN
Inventors: 于力; 马国达
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2011-01-30
Filing date: 2011-01-30
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2031-01-30
Also published as: CN102174518B

Abstract

本发明公开了一种虾白斑综合征病毒(WSSV)ie1启动子主要顺式作用元件及与其结合的转录因子和应用。本发明从WSSV ie1的转录调控入手，通过缺失和突变对其启动子进行结构与功能分析，发现一个12-bp DNA序列是其主要顺式作用元件，它决定着ie1的高表达。本发明采用DNA亲和层析方法从Sf9细胞核蛋白中提纯了与该段DNA相结合的蛋白，生物质谱鉴定该蛋白为PHB2，凝胶阻滞实验证明两者的相互作用是特异的。实验结果表明：PHB2作为转录因子通过特异结合ie1启动子12-bp DNA序列来启动WSSV立即早期基因转录，进而调控WSSV的复制，可作为药物有效作用靶点筛选抗虾白斑综合征病毒药物。

Description

虾白斑综合征病毒iel启动子主要顺式作用元件及与其结合的转录因子和应用

技术领域

本发明涉及一种病毒基因启动子主要顺式作用元件及与其结合的转录因子，尤其涉及虾白斑综合征病毒(WSSV)ie1启动子主要顺式作用元件及与其结合的转录因子，本发明还涉及它们的应用，本发明属于虾白斑综合征病毒基因的表达、调控领域。

背景技术

虾白斑综合征(White spot syndrome，WSS)是对养虾业危害最严重的传染病，病原是虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)。该病于20世纪90年代最先在中国台湾地区暴发，此后迅速传播至整个亚洲及欧美的主要对虾养殖地区。该病毒侵染性和复制能力很强，宿主死亡率可达100％，可侵染对虾的多种组织，且宿主范围很广，对虾、螯虾、蟹类、淡水甲壳类动物均可感染。该病毒给对虾养殖业造成了极大损失，并且威胁整个海洋生态系统的平衡。

WSSV是一种大型的双链DNA病毒，具有双层囊膜，不能形成包涵体，隶属于线头病毒科(Nimaviridae)，是该科的唯一成员。为了寻求防治对虾白斑综合征的方法，研究人员对WSSV展开了逐步深入的研究。早期的工作主要集中在病原学、病理学、流行病学等方面，研究人员还建立了一些实用的病原体检测方法，用于该病的检测。2001-2002年三株WSSV病毒基因组的全序列测定，拉开了WSSV分子病毒学研究的序幕，但分析发现其大部分开放阅读框与GenBank中已有的基因序列无同源性，这样就很难借鉴其它病毒的基因表达及复制模式对其进行研究。在基因组测序的基础上，各国学者对该病毒的分子致病机理作了大量研究。迄今为止，已确认的与WSSV致病有关的基因主要有：编码囊膜蛋白基因、编码核衣壳蛋白基因、编码病毒复制过程关键酶基因、与病毒潜伏相关的基因和阻止宿主细胞凋亡的基因等。

虽然目前针对WSSV的分子生物学研究取得了一定的进展，但是最主要还是集中于病毒结构蛋白方面；目前还没有建立适合该病毒生长的细胞系，对病毒侵染以及复制的分子机制还没有系统的研究；对WSSV感染机制特别是病毒复制的调控机制，病毒与宿主的相互作用等仍缺乏了解；另外，由于虾属于无脊椎动物没有特异性免疫系统，不能产生抗体，因此不能用疫苗免疫的方法来预防该疾病。所以到目前为止，对该病毒病的防治尚缺乏有效的方法。

病毒的复制是病毒致病的前提，而病毒基因的表达与调控又是病毒复制的核心环节。研究病毒基因的转录调控，不仅可以揭示宿主细胞某些基因表达的调节机制，而且有助于阐明病毒的致病机理，这对于疾病防治具有重要的理论和实用价值。

发明内容

本发明的目的之一是鉴定一种WSSV ie1启动子主要顺式作用元件；

本发明目的之二是筛选到与上述WSSV ie1启动子主要顺式作用元件相结合调控WSSV ie1基因表达的转录因子及其编码基因。

本发明目的之三是将筛选到的转录因子及其编码基因应用于制备成调控WSSV基因表达或复制的药物或作为药物有效作用靶点筛选抗虾白斑综合征病毒药物。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种WSSV ie1启动子主要顺式作用元件，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

一种与所述WSSV ie1启动子主要顺式作用元件相结合调控WSSV ie1基因表达的转录因子(prohibitin 2，PHB2)，其氨基酸序列为SEQ ID No.3所示，编码该转录因子的基因(sf-phb2)，其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

本发明从WSSV启动子入手探讨WSSV复制的分子机制，通过实验筛选到了一个泛活性的强启动子，它驱动WSSV一个立即早期基因ie1的表达。对该启动子结构与功能的进一步研究发现，位于转录起始位点上游-78～-67bp区间的12-bp DNA序列(SEQ ID No.1)决定其启动子的强活性；由于在此12-bp序列之内没有可以预测的转录因子结合位点，说明该12-bp序列包含一个全新的上游调控元件，一个新的转录因子与该调控元件结合，启动该病毒ie1基因的表达和病毒的复制。

本发明通过DNA亲和层析的方法从Sf9细胞核蛋白中提纯与ie1启动子12-bp DNA序列结合的蛋白，进而用生物质谱分析方法确定该蛋白为抑制素2(prohibitin 2，PHB2)。本发明从无脊椎动物细胞(Sf9)中克隆了PHB2基因，并命名为sf-phb2。在有脊椎动物细胞中，PHB2是一个具有广泛功能的蛋白质，它既存在于线粒体内膜上，发挥分子伴侣作用；也存在于细胞核内，作为转录调节因子发挥负性转录调控作用，因而对细胞代谢、生长、分化、衰老以及凋亡等诸多方面发挥着重要的调控作用，已经被确认为诸如糖尿病、肿瘤、肥胖等多种疾病的治疗靶点；此外，最近的报道证明PHB2可以作为细胞膜上病毒的主要受体蛋白，在介导病毒内吞中起重要作用。目前关于PHB2 的功能研究主要在有脊椎动物中进行，还没有PHB2作为转录因子直接结合DNA的报道。

本发明的研究表明，在Sf9细胞中，Sf-PHB2作为转录因子通过结合12-bpDNA序列调控WSSV ie1基因表达。Sf-PHB2作为转录因子是基于以下实验：首先，DNA亲和层析是研究DNA结合蛋白的经典方法，许多转录因子，诸如，Sp1和C/EBP等都是通过这种方法得到的。本发明也是通过这种方法从Sf9细胞中提纯12-bp DNA结合蛋白得到Sf-PHB2的；其次，本发明通过凝胶阻滞实验证明，Sf-PHB2能与12一bp DNA序列特异结合；第三，Sf-PHB2具有核定位信号(NLS)并部分在细胞核内表达；更重要的是通过SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)对蚊子、虾、蛾、蚕等无脊椎动物PHB2蛋白的结构进行结构分析发现，它们具有转录因子特征性结构域螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix，HTH)。在无脊椎动物中，PHB2蛋白具有转录因子DNA结合结构域的典型特征(HTH)，这提示它可能作为转录因子发挥作用，而这种结构域在有脊椎动物的PHB2蛋白并不存在。最近的研究表明，该基因在WSSV侵染与非侵染的对虾组织中存在差异表达，这也表明，PHB2可能作为主要转录因子启动WSSV在体内的复制以及虾白斑综合征的发生与发展过程。

PHB2所调控的ie1是WSSV一个重要的立即早期基因，现已证明它编码一个具有锌指结构的转录因子。根据转录的起始时间不同，WSSV基因可被分类为立即早期基因、迟早期基因、晚期基因和极晚期基因。在感染细胞内，病毒基因的表达以及DNA复制是一种有序的级联事件，病毒基因表达的级联是在转录水平上发生的调节，在这个级联模型中(cascade model)，病毒的一种时相的基因产物直接或间接地反式激活后一时相的基因转录。在无脊椎动物中，PHB2作为转录因子，通过结合WSSV ie1基因启动子的12-bp DNA，启动WSSV 立即早期基因的转录，在WSSV复制起始的过程中起主要作用，因此可以作为抗WSSV药物的有效作用靶点。同时，PHB2也可能作为对虾转基因抗病育种的重要候选基因。

附图说明

图1WSSV ie1启动子缺失和突变分析；A.WSSV ie1启动子位于翻译起始位点与其388-bp上游之间的DNA序列；数字以箭头所示的转录起始密码子(+1)为基准，下划线部分分别为12-bp DNA序列、阴Sp1结合序列和TATA盒序列，方框中部分表示翻译起始密码子ATG。B.启动子荧光素酶报告基因活性分析；

每一截短的末端用它们与转录起始位点之间的距离表示，推测的Sp1结合位点和TATA盒突变的报告基因质粒分别被命名为p(-55/+53)Δ和p(-35/+53)Δ。

图2DNA亲和层析提纯WSSV ie1启动子12-bp基序结合蛋白的SDS-PAGE分析；M：蛋白质分子量标准1.DNA亲和层析纯化蛋白的SDS-PAGE电泳银染(箭头所示为纯化的蛋白带)。

图3生物质谱分析结果；左、右图分别代表质谱分析得到的两段氨基酸序列VPWFQYPIIYDIR和FNASQLITQR。

图4Sf-phb2基因DNA序列以及推导的氨基酸序列；划线部分为质谱分析氨基酸片段对应的序列；方框中的序列为核定位信号(NuclearLocalization Signal，NLS)；阴影部分的氨基酸序列为推测的螺旋-转角-螺旋(Helix-Turn-Helix，HTH)结构域。

图5免疫荧光检测Sf-PHB2在Sf9细胞中的分布；A.正常的Sf9细胞；B.Sf-PHB2在Sf9细胞中的表达；C.DAPI染色用于指示细胞核；D.A.B.C重叠的结果。

图6凝胶阻滞试验验证Sf-PHB2与DNA的相互作用；箭头1表示supershift条带，箭头2迁移条带，箭头3表示游离探针；1.未加Sf9细胞核蛋白；2，3，4.加入Sf9细胞核蛋白并分别加入2、5、10倍的冷探针；5.加入Sf9细胞核蛋白；6.加入Sf9细胞核蛋白及EBNA探针；7，8.加入Sf9细胞核蛋白和分别加入1.0μl、0.5μl Sf-PHB2抗体。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例

1、材料与方法

1.1报告基因质粒构建及其缺失和突变分析

以WSSV病毒基因组DNA为模板，采用表1中的引物序列PCR方法对ie1基因启动子从5′和3′端进行一系列的缺失和突变分析，方法和策略见图1，突变体中基因调控元件的位置以ie1转录起始位点(+1)推算。通过一系列的5′和3′端缺失分析，利用不同引物序列组合，产生一系列5′、3′启动子缺失序列。为进行Sp1结合位点基序(TGTGGGCGGAGCA)和TATA盒 (GTGTATATAAGAGCC)的突变分析，用突变引物Mut1和Mut2进行PCR获得定点诱变的ie1启动子克隆，每个PCR产物用Kpn I和Hind III消化，克隆到phRG-B载体。

表1用于构建报告基因质粒的引物序列(酶切位点如下划线所示)

1.2细胞培养、转染和荧光素酶活性分析

昆虫细胞系Sf9(购自Invitrogen公司)用无血清培养基Sf-900IISFM(GIBCO)补加50μg/ml gentamycin于28℃培养。在96孔培养板中，当细胞长成80％单层时用于转染。转染使用0.1μg报告质粒DNA，采用Effectene转染试剂(Qiagen)进行，在转染后48h用Dual-Luciferase Reporter AssaySystem(Promega)检测荧光素酶活性，检测方法按试剂说明书进行，检测仪器为FB12 Luminometer(Berthold detection systems，USA)。检测数据来自3次独立试验结果，样品一式3孔，并进行统计学分析。

1.3.IE1启动子12-bp基序结合蛋白的提纯及生物质谱鉴定

Sf9细胞核蛋白提取参照PIERCR公司试剂盒说明书进行，蛋白浓度测定采用Lowry方法。

首先，设计两条含有WSSV ie1启动子12-bp片段的5′端磷酸化的引物，序列如下：

5′-ATTCCTAGAAATGGTGTAATCGCATTCCTAGAAATGGTGTAATCGC-3′和

5′-GCGATTACACCATTTCTAGGAATGCGATTACACCATTTCTAGGAAT-3′；

由于两条引物具有部分互补序列，可以建立self-primed PCR方法，并扩增含有多拷贝12-bp基序的DNA。然后，将该DNA分子连接于磁性颗粒表面，制备一种提纯12-bp结合蛋白的基质，继而通过亲和层析的方法从Sf9细胞核蛋白中提取该12-bp DNA结合蛋白。SDS-PAGE电泳进一步分离该DNA亲和层析纯化的蛋白，用质谱兼容的银染方法染色，切下相应蛋白条带进行生物质谱分析(mass spectrometric analysis)，利用NCBI蛋白质数据库检索数据。

1.4克隆Sf-PHB2基因

通过下载不同物种的同源序列，利用在线的CODE-HOP软件在蛋白质的保守区设计简并引物：5′-TGCACTTCCGGATGccntggttyca-3′和5′-GCCCTCGGCCTGCaydatyttytg-3′(y代表C或T；n代表A或C或G或T)利用RT-PCR的方法从Sf9细胞中扩增该基因部分片段，以该段DNA序列作为种子序列在草地夜蛾EST数据库中寻找同源序列，然后进行电子拼接，再以拼接的序列为种子序列，重复上述过程，直至拼接出最长片段，最后用NCBI的ORF Finder软件分析可能的读码框，通过SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)软件进行结构预测。

1.5Sf-PHB2的抗体制备及其细胞定位

根据基因克隆的结果设计引物扩增Sf-PHB2基因的编码区，并把该序列克隆到原核表达载体PET30a，IPTG诱导表达并纯化Sf-PHB2蛋白，通过免疫小鼠，制备了该蛋白的多克隆抗体，通过Western blot检测该抗体的特异性。Sf9细胞用PBS洗两次然后用冷乙醇在4℃固定15分钟。细胞用PBS稀释300倍的抗体在37℃下孵育1小时。之后用PBS洗3次，用200倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG(Sigma，USA)37℃下孵育1小时。用DAPI(Invitrogen，USA)染细胞核，用PBS洗3次后用激光共聚焦显微镜观察PHB2在Sf9细胞中的定位(Leica TCS SP2)。

1.6凝胶阻滞实验(EMSA)证明Sf-PHB2与12-bp的DNA的相互作用

用以下含有12-bp DNA片段作为EMSA的探针，探针的序列如下，12-bp序列如下划线所示：5′-TTACACCATTTCTAGGAATAAATG-3′。

通过PIERCE公司的3′末端生物素标记试剂盒标记该段DNA片段，采用该公司的凝胶阻滞实验(EMSA)试剂盒进一步验证Sf-PHB2与该12-bp DNA的相互作用。EMSA的实验方案如下：20fmol生物素标记的寡核苷酸与10μg Sf9细胞核蛋白在结合缓冲液(50mM Tris，pH 7.4，2.5mM EDTA，0.25mg/mlpoly(dI/dC)，250mM NaCl，2.5mM DTT，5mM MgCl₂和20％甘油)中室温抚育20分钟，为了验证Sf-PHB2结合DNA序列的特异性，本试验通过2、5或10倍过量非标记的寡核苷酸(冷探针)来竞争。为了supershift分析，在核蛋白与生物素标记的探针中加入1.0或0.5μl的Sf-PHB2抗体共孵育。结合复合物点样到5％非变性胶，然后在0.5×TBE(0.44M Tris base，0.44M boric acid和0.01M EDTA[pH 8.0])中电泳，电泳后把胶转移至尼龙膜并用紫外交联，通过Pierce公司化学发光核酸检测试剂盒显色。

2、实验结果

2.1ie1启动子上游调控元件的鉴定

WSSV ie1启动子序列分析表明，存在几个推测的转录因子结合位点可能对启动子活性起重要的作用(图1)。为了检测WSSV ie1在Sf9细胞中的启动子活性，用PCR方法扩增了ie1基因5′端388-bp序列(从-335至+53bp)并且克隆到荧光素酶报告基因表达载体phRG-B中。为了确定ie1启动子基础活性所必需的最小序列，本实验从其5′端产生一系列的缺失和突变(图1)。结果表明，包含推测的转录起始序列CAGT元件的最小表达载体p(-25/+53)能够保持最小的启动子活性(13倍)，另外加上TATA盒(p(-35/+53))导致启动子活性增加17.8倍。同时，突变TATA盒(p(-35/+53)Δ)，导致活性减少10.5倍。缺失ie1启动子的3′端同样证明(-25至+53)是维持启动子基本活性的最小序列。这表明CAGT元件是转录起始位点，它和TATA盒共同组成了ie1启动子的核心序列。从5′远端进行的截短突变产生两个突变体，一个是暂定AP-1/CRE位点的缺失突变产生突变体p(-235/+53)，另一个是缺失Myc位点的缺失突变产生突变体p(-135/+53)。用这两个质粒转染Sf9细胞后，其荧光素酶活性与野生型启动子比较无明显变化，表明ie1启动子5′端-335～-135bp序列不存在任何上游调控元件，与该启动子的活性无关。可是，接下来缺失80bp产生的突变体p(-55/+53)，其启动子活性却明显下降至原来的1/11；随后构建的Sp1结合位点定点诱变突变体p(-55/+53)Δ和缺失突变体p(-35/53)，其启动子活性分别下降至原来的1/2.6和1/2.8。上述结果表明，在ie1启动子上游存在的Sp1结合位点，是一个重要的上游调控元件；而位于-135～-55bp之间的80bp序列，存在一个目前尚不能预测的转录因子结合位点，主要负责激活该启动子的转录活性，是主要的上游调控元件。为精确分析上述主要的上游调控元件，在p(-55/+53)和p(-135/+53)之间又构建了另外5个5′端缺失突变体，分别为p(-120/+53)、p(-105/+53)、p(-85/+53)、p(-78+53)和p(-66/+53)，结果见图1。对转染细胞的检测结果表明，突变体从p(-120/+53)到p(-78/+53)的逐步截短缺失，并不影响启动子活性，而从p(-78/+53)到p(-66/+53)的12bp截短，使启动子活性骤降至原来的1/14。这表明，ie1启动子的主要上游调控元件就存在于这12-bp序列之中，该元件是一个未知转录因子的结合位点。

2.2IE-1启动子主要顺式作用元件(12-bp基序)结合蛋白的提纯

首先合成含有12-bp基序的DNA引物，建立self-primed PCR方法，并扩增含有多拷贝12-bp基序的DNA。将该DNA分子连接于磁性颗粒表面，制备一种提纯12-bp结合蛋白的基质，继而通过亲和层析的方法从Sf9细胞核蛋白中纯化该12-bp DNA结合蛋白，SDS-PAGE分析的结果表明该蛋白大小约为32KDa(图2)。

2.3用生物质谱分析方法对该蛋白进行分子定性

从胶上切下蛋白条带并用胰酶消化，对消化的肽段进行质谱分析，获得了两段氨基酸序列(VPWFQYPIIYDIR和FNASQLITQR)，蛋白数据库搜索表明它与蚊子的Prohibitin 2(PHB2)蛋白(GenBank登录号：XM_001842599)是同源物，由此证明本亲和层析纯化获得的12-bp DNA序列结合蛋白是PHB2同源蛋白。目前关于PHB2的功能研究主要在哺乳动物中进行，还没有PHB2作为转录因子直接结合DNA的报道。

通过软件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)对蚊子、家蚕、虾等无脊椎动物PHB2蛋白的结构分析发现，它具有螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix，HTH)结构域，但这种HTH结构域在有脊椎动物的PHB2蛋白并不存在。HTH是转录因子DNA结合结构域的典型特征，这提示在无脊椎动物中，它可能作为转录因子发挥作用。根据质谱分析搜索得到的是蚊子的PHB2氨基酸序列(图3)，GenBank中至今尚没有昆虫Sf9细胞PHB2蛋白的基因序列，这就需要从Sf9细胞克隆该基因序列。

2.4从Sf9细胞中克隆PHB2基因

通过CODEHOP软件设计了一对引物，通过RT-PCR的方法从Sf9细胞中扩增到了一段490bp的DNA序列。为了获得全长的cDNA，本试验用这490bp序列为模板，搜索草地夜蛾EST数据库，获得了几段EST序列(DY897934，DY793476，DV076437和DY784502)。根据这些序列拼接出了一条完整序列，通过软件预测读码框，对其编码的氨基酸进行BLAST分析，证明所得到的基因为PHB2同源物，被命名为sf-phb2。该基因编码299个氨基酸，分子量约为32KDa，通过结构预测同样发现Sf-PHB2蛋白也具有HTH结构域。质谱分析所得到的两段序列存在于所克隆基因编码的氨基酸序列之中(图5)。

2.5Sf-PHB2的抗体制备及其在Sf9细胞中的分布

本发明对Sf-PHB2进行结构预测分析发现它含有核定位信号。为证实该蛋白在细胞核中的存在，本实验通过原核表达Sf-PHB2蛋白，提纯后免疫小鼠，制备该蛋白的多克隆抗体，通过免疫荧光检测该蛋白在Sf9细胞中的表达情况。如图5所示，Sf-PHB2在Sf9细胞中主要表达在细胞质，少部分表达在细胞核。而用免疫前血清没有检测出免疫荧光信号。

2.6凝胶阻滞试验验证Sf-PHB2与WSSV ie1启动子12-bp DNA序列的结合

Sf-PHB2与12-bp序列结合的特异性通过EMSA来验证(图6)。当只加入Sf9细胞核蛋白时可检测到一条蛋白-DNA复合物条带(泳道5)；当加入不同剂量过量的非标记的冷探针时，该复合物条带变弱(泳道2，3和4)；而加入非标记的EBNA探针，条带强弱几乎没有改变(泳道6)；当加入1.0μl或0.5μl Sf-PHB2抗体进行Supershift分析，发现蛋白质-DNA复合物条带在加入抗体后出现了迁移(泳道7和8)，而加入同量免疫前血清几乎没有影响，表明抗体影响迁移是因为Sf-PHB与12-bp DNA形成复合物的缘故。这些结果表明，Sf-PHB2特异结合到WSSV ie1启动子的78到67核苷酸处(图6)。

Claims

1.一种虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus)ie1启动子主要顺式作用元件，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.与权利要求1所述的虾白斑综合征病毒ie1启动子主要顺式作用元件相结合的转录因子，特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID No.3所示。

3.编码权利要求2所述转录因子的基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

4.权利要求1所述的虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus)ie1启动子主要顺式作用元件在制备调控虾白斑综合征病毒ie1表达或复制的药物中的用途。

5.权利要求2所述的转录因子作为药物有效作用靶点筛选抗虾白斑综合征病毒药物中的用途。

6.权利要求2所述的转录因子在作为药物有效作用靶点筛选杀虫剂中的用途。