CN110004131A - 一种提高赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的分子改造方法 - Google Patents

一种提高赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的分子改造方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110004131A
CN110004131A CN201910158461.4A CN201910158461A CN110004131A CN 110004131 A CN110004131 A CN 110004131A CN 201910158461 A CN201910158461 A CN 201910158461A CN 110004131 A CN110004131 A CN 110004131A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
lysine decarboxylase
polypeptide
gene
lysine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910158461.4A
Other languages
English (en)
Inventor
张雷
齐海山
杜岩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University
Original Assignee
Tianjin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University filed Critical Tianjin University
Priority to CN201910158461.4A priority Critical patent/CN110004131A/zh
Publication of CN110004131A publication Critical patent/CN110004131A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01018—Lysine decarboxylase (4.1.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种提高赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的分子改造方法；是在赖氨酸脱羧酶分子LDC的一端连接一段多肽片段EK。包括(1)获得赖氨酸脱羧酶分子的基因片段；(2)将编码EK多肽的基因片段连接到赖氨酸脱羧酶基因的一端；(3)将连接有EK多肽基因的赖氨酸脱羧酶基因连接到表达载体上，转入到宿主中，表达改造后的赖氨酸脱羧酶LDC‑EK。本发明通过对酶分子进行理性的改造，避免了随机突变的不确定性和繁琐的筛选过程；改造后的赖氨酸脱羧酶具有良好的稳定性和催化活性。LDC‑EK催化活性提高2倍，能够在较宽的温度范围内保持较高的活性，并且能够耐多种有机溶剂。方法更易操作，改造后蛋白更易制备。

Description

一种提高赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的分子改造方法
技术领域
本发明涉及一种对赖氨酸脱羧酶(LDC)蛋白分子的改造方法。更具体的说，本发明涉及一种通过在赖氨酸脱羧酶的C端和(或)N端，连接赖氨酸(K)和谷氨酸(E)交替排列的多肽片段EK片段，来对赖氨酸脱羧酶修饰以提高其活性和稳定性的方法。
背景技术
1，5-戊二胺又名尸胺，是一种线性五碳二胺。可以广泛应用于多种商业用途，如合成聚酰胺、杀真菌剂、石油和燃料添加剂、树脂、螯合剂、沥青等，是一种重要的石油化工产品。化学法合成戊二胺依赖石油等不可再生资源，且污染较为严重，弊端很多。相比之下，生物合成法可利用环境友好型可再生资源生产戊二胺，越来越多的受到人们的关注。在生物法合成戊二胺中，赖氨酸脱羧酶是反应代谢的关键核心酶，它能够催化赖氨酸脱羧产生戊二胺。但是，野生型赖氨酸脱羧酶的稳定性较差，不耐高温，不耐碱。在发酵过程中，发酵液中不断积累戊二胺，使得发酵液pH逐步升高，此时赖氨酸脱羧酶的活性会受到很大抑制。蒋承建等生物酶法合成1，5-戊二胺的研究进展(广西科学，2017)。
为了提高赖氨酸脱羧酶的稳定性，研究者做出了多种尝试：酶的随机突变、固定化、定向进化等。Park等通过共价结合的方法，将赖氨酸脱羧酶制备成交联酶聚集体(CLEA)，提高了该酶的热稳定性，但是没有对酶的其他耐受性进行深入的探究；Chen Wang等对赖氨酸脱羧酶进行了定向进化研究，提高了其催化效率和活性；Fengyu Kou等对赖氨酸脱羧酶进行了定点突变研究，突变T88位置的氨基酸，突变体展现出了较高的温度、pH稳定性和催化活性。
除上述方法之外，通过在酶蛋白分子上连接聚合物或者多肽来对蛋白质分子进行改造也是一种重要的蛋白稳定方法，但是这种方法目前还没有应用于赖氨酸脱羧酶分子。目前，研究最为广泛的是PEG(聚乙二醇)修饰法，即在酶蛋白分子上连接PEG聚合物片段，以此来提高酶蛋白分子的稳定性。但是，这种方法改造的蛋白质不易生产，且会降低酶蛋白的生物活性和生物可降解性。为了克服PEG修饰所带来的缺陷，近年来又有多种对蛋白质修饰的聚合物被研究者提出，其中最具有应用前景的就是两性离子聚合物。Park S H等Cadaverine production by using cross-linked enzyme aggregate of Escherichiacoli lysine decarboxylase(Journal of Microbiology&Biotechnology.2017,27(2)289-296)。在前期研究中，两性离子聚合物(如聚羧基甜菜碱pCB，聚磺基甜菜碱pSB等展现出了优异的特性——超亲水、超低的生物黏附、超低的免疫原性、对蛋白质具有良好的稳定性，是PEG的优良替代物。研究者发现，将pCB连接到蛋白质的表面，能够在不影响功能的基础上，增加其稳定性。将pCB连接到模式酶——胰凝乳蛋白酶表面，大大提高了酶分子的温度稳定性和化学稳定性，并且增加了该酶对于底物的亲和力。
生物信息学研究表明，在蛋白质表面氨基酸中，带正电的赖氨酸(E)以及带负电的谷氨酸(K)具有绝对的数量优势，也就意味着，这两种带电氨基酸在蛋白质稳定中发挥着重要作用。重复的EK序列(交替或者混合)具有稳定生物化学性质、良好的生物相容性及酶降解能力，具有应用于蛋白稳定领域的潜力。Jiang等EKylation:Addition of anAlternating-Charge Peptide Stabilizes Proteins(Biomacromolecules,2015,16(10)3357-3361)；S.Jiang等Zwitterionic gel encapsulation promotes proteinstability,enhances pharmacokinetics,and reduces immunogenicity(P.Natl.Acad.Sci.USA.112(2015)12046-12051)；S.Jiang等Poly(zwitterionic)proteinconjugates offer increased stability without sacrificing binding affinity orbioactivity(Nat.Chem.4(2012)60-64)；考虑到蛋白质连接多肽比连接聚合物更加方便，作为两性离子聚合物天然类似物的聚(赖氨酸-谷氨酸)功能多肽，也具有稳定蛋白质的潜在用途。
针对赖氨酸脱羧酶不耐高温、不耐碱、容易失活的特性，急需一种提高赖氨酸脱羧酶稳定性的方法，而目前为止，还没有对赖氨酸脱羧酶进行EK化修饰的研究。通过对赖氨酸脱羧酶分子的结构进行计算机模拟和分析，我们发现使用EK多肽对赖氨酸脱羧酶进行修饰具有很大的潜在优势。通过X-射线晶体衍射晶型构象分析表明，来自大肠杆菌的诱导型赖氨酸脱羧酶分子是一个由五个二聚体所形成的十聚体结构，十聚体具有明显的五重对称性双环结构(见说明书附图1所示)。其单体主要有三个部分构成，N末端区域、主区域和C末端区域，其中C末端区域向分子外围突出，而N末端翅膀区域向环状结构中心突出。如果在C端进行EK多肽连接，相当于给赖氨酸脱羧酶分子外围添加了一层“两性离子聚合物”的保护外壳，形成类似于nanogel的结构(见说明书附图2)。因此，我们决定采用EK修饰的方式，来对赖氨酸脱羧酶分子进行改造。
发明内容
本发明针对赖氨酸脱羧酶不耐碱、稳定性差的问题，首先提出了对赖氨酸脱羧酶(LDC)分子进行EK化修饰的方法。本方法的特征在于，在赖氨酸脱羧酶分子LDC的一端连接一段功能多肽EK，制备改造后的赖氨酸脱羧酶(LDC-EK)。经过修饰之后，LDC-EK的活性和稳定性都得到了很大程度的提升：其中，催化活性比LDC提高2.0614倍；温度和有机溶剂稳定性是LDC的2-5倍；21天储藏稳定性测试中，LDC-EK保留有最初活性的50％，而LDC则全部失活。
本发明的技术方案如下：
一种提高赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的分子改造方法；其特征是在赖氨酸脱羧酶分子LDC的一端连接一段多肽片段EK。
本发明的方法包括如下步骤：
(1)获得赖氨酸脱羧酶分子的基因片段；
(2)将编码EK多肽的基因片段连接到赖氨酸脱羧酶基因的一端；
(3)将连接有EK多肽基因的赖氨酸脱羧酶基因连接到表达载体上，转入到宿主中，表达改造后的赖氨酸脱羧酶LDC-EK。
所述的多肽片段由赖氨酸和谷氨酸交替排列而成；
所述的多肽片段长度为20-200个氨基酸；
所述步骤(2)中将编码多肽的基因片段连接到赖氨酸脱羧酶基因的5’端。
所述步骤(2)中将编码多肽的基因片段连接到赖氨酸脱羧酶基因的3’端。
所述步骤(2)中将编码多肽的基因片段同时连接到赖氨酸脱羧酶基因的5’端和3’端。
所述步骤(1)获得编码赖氨酸脱羧酶分子的基因序列SEQ ID NO.1。
步骤(2)方法是:将编码EK多肽的基因片段为SEQ ID NO.2、长度为60bp连接到编码赖氨酸脱羧酶分子基因片段SEQ ID NO.1的5’端，3’端，以及同时连接到5’和3‘端，分别得到序列为SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5的基因序列；其中，EK多肽的基因序列不仅仅限于SEQ ID NO.2，其长度范围是以SEQ ID NO.2为基本单元，1-10个重复(60bp-600bp)，对应的EK多肽长度即为20-200个氨基酸。
所述步骤(3)的方法是：将步骤2所得到的基因片段SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5连接到适用于大肠杆菌E.coli BL21表达系统的表达型载体上，转入宿主E.coli BL21中进行表达，得到在C端和或/N端连接有EK多肽段的赖氨酸脱羧酶分子LDC-EK。
本发明相对于现有技术，具有如下优点：
(1)本发明通过对酶分子进行理性的改造，避免了随机突变的不确定性和繁琐的筛选过程；
(2)本发明通过连接超亲水EK多肽片段的方法，制备了改造后的赖氨酸脱羧酶(LDC-EK)。该酶具有良好的稳定性和催化活性。LDC-EK催化活性提高2倍，能够在较宽的温度范围内保持较高的活性，并且能够耐多种有机溶剂。
(3)相比于连接PEG片段的修饰方法，这种方法更易操作，改造后蛋白更易制备，并且不会降低活性；
(4)在转化L-赖氨酸产戊二胺方面，使用等量和LDC和LDC-EK，在30min之内以等量L-赖氨酸为底物，LDC-EK的戊二胺产量约为LDC的2倍。
(5)在不同有机溶剂中储存两小时后，活性是野生型赖氨酸脱羧酶的2-5倍；储藏21天之后，酶活性仍保留初始值的50％，而野生型赖氨酸脱羧酶全部失活。
附图说明
图1赖氨酸脱羧酶分子LDC；
图2 C端连接EK的赖氨酸脱羧酶分子LDC-EK；
图3 SEQ ID NO.3和pET-32a(+)的连接；
图4 pET-32a(+)-CadA-5’EK质粒图谱；
图5 pET-32a(+)-CadA-3’EK质粒图谱；
图6 pET-32a(+)-CadA-5’-3’EK质粒图谱。
具体实施方式
下面给出实施例，以对本发明作进一步的详细说明，但它们不对本发明作任何限制。
具体步骤如下：
(1)获得编码赖氨酸脱羧酶分子的基因片段，基因序列(SEQ ID NO.1，GenBankAccession number：NC_000913)。
(2)将编码EK多肽的基因片段(SEQ ID NO.2，长度为60bp)连接到编码赖氨酸脱羧酶分子基因片段(SEQ ID NO.1，GenBank Accession number：NC_000913)的5’端，3’端，以及同时连接到5’和3‘端，分别得到序列为SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5的基因序列；其中，EK多肽的基因序列不仅仅限于SEQ ID NO.2，其长度范围是以SEQ ID NO.2为基本单元，1-10个重复(60bp-600bp)，对应的EK多肽长度即为20-200个氨基酸，本发明以SEQID NO.2(EK长度为20个氨基酸)为例进行说明；
(3)将步骤2所得到的基因片段(SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5)连接到适用于大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统的表达型载体上(比如pET-28a-c(+)，pET-32a-c(+)等)，转入宿主E.coli BL21(DE3)中进行表达，就可以得到在C端和(或)N端连接有EK多肽段的赖氨酸脱羧酶分子LDC-EK。
实施例1
1.获得编码赖氨酸脱羧酶分子的基因片段，基因序列(SEQ ID NO.1，GenBankAccession number：NC_000913)。
2.将编码EK多肽的基因片段(SEQ ID NO.2)连接到编码赖氨酸脱羧酶分子基因片段(SEQ ID NO.1，GenBank Accession number：NC_000913)的5’端，此实施例采用PCR法，具体操作方法如下：
(1)引物设计：CadA-F-EK：SEQ ID NO.6；CadA-R：SEQ ID NO.7
(2)以SEQ ID NO.1为模板，以SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7为引物进行PCR反应，得到SEQ ID NO.3；
PCR循环过程(Taq酶)：
Step1：94℃3min
Step2：94℃30s
Step3：55℃30s
Step4：72℃128s(至step2，30个循环)
Step5：72℃5min
PCR产物的检测：取5μL PCR产物，琼脂糖凝胶电泳检测。
3.将步骤2中得到的SEQ ID NO.3连接到pET-32a(+)载体上，并转化到宿主大肠杆菌BL21(ED3)中，具体操作方法如下：
如说明书附图3所示，使用Bam HI和Hind III双酶切质粒pET-32a(+)和SEQ IDNO.3，使用T4 DNA连接酶将其进行连接，得到pET-32a(+)-CadA-5’EK(质粒图谱见说明书附图4，质粒序列SEQ ID NO.10)，取20μL酶连过程产物，加入到1mlL BL21(DE3)感受态细胞中，冰上30min，42℃热激1min30s，冰浴2min，加800μL LB培养基(无抗性)，复苏1h(37℃)，离心收集菌体，留200μL，和菌体混合后涂布平板(加氨苄青霉素，100μg/mL)，获得重组菌，用于发酵生产LDC-EK。
实施例2
1.获得编码赖氨酸脱羧酶分子的基因片段，基因序列(SEQ ID NO.1，GenBankAccession number：NC_000913)。
2.将编码EK多肽的基因片段(SEQ ID NO.2)连接到编码赖氨酸脱羧酶分子基因片段(SEQ ID NO.1，GenBank Accession number：NC_000913)的3’端，此实施例采用PCR法，具体操作方法如下：
(1)引物设计：CadA-F：SEQ ID NO.8；CadA-R-EK：SEQ ID NO.9
(2)以SEQ ID NO.1为模板，以SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9为引物进行PCR反应，得到SEQ ID NO.4；
PCR循环过程同实施例1。
3.将步骤2中得到的SEQ ID NO.4连接到pET-32a(+)载体上，并转化到宿主大肠杆菌BL21(ED3)中，具体操作方法如下：
使用Bam HI和Hind III双酶切质粒pET-32a(+)和SEQ ID NO.4，使用T4 DNA连接酶将其进行连接，得到pET-32a(+)-CadA-3’EK(质粒图谱见说明书附图5，质粒序列SEQ IDNO.11)，取20μL酶连过程产物，加入到1mL BL21(DE3)感受态细胞中，冰上30min，42℃热激1min30s，冰浴2min，加800μL LB培养基(无抗性)，复苏1h(37℃)，离心收集菌体，留200μL，和菌体混合后涂布平板(加氨苄青霉素，100μg/mL)，获得重组菌，用于发酵生产LDC-EK。
实施例3
1.获得编码赖氨酸脱羧酶分子的基因片段，基因序列(SEQ ID NO.1，GenBankAccession number：NC_000913)。
2.将编码EK多肽的基因片段(SEQ ID NO.2)同时连接到编码赖氨酸脱羧酶分子基因片段(SEQ ID NO.1，GenBank Accession number：NC_000913)的5‘端和3’端，此实施例采用PCR法，具体操作方法如下：
(1)引物设计：CadA-F-EK：SEQ ID NO.6；CadA-R-EK：SEQ ID NO.9
(2)以SEQ ID NO.1为模板，以SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.9为引物进行PCR反应，得到SEQ ID NO.5；
PCR循环过程同实施例1。
3.将步骤2中得到的SEQ ID NO.5连接到pET-32a(+)载体上，并转化到宿主大肠杆菌BL21(ED3)中，具体操作方法如下：
使用Bam HI和Hind III双酶切质粒pET-32a(+)和SEQ ID NO.5，使用T4 DNA连接酶将其进行连接，得到pET-32a(+)-CadA-5’-3’EK(质粒图谱见说明书附图6，质粒序列SEQID NO.12)，取20μL酶连过程产物，加入到1mL BL21(DE3)感受态细胞中，冰上30min，42℃热激1min30s，冰浴2min，加800μL LB培养基(无抗性)，复苏1h(37℃)，离心收集菌体，留200μL，和菌体混合后涂布平板(加氨苄青霉素，100μg/mL)，获得重组菌，用于发酵生产LDC-EK。
实施例4
赖氨酸脱羧酶活性测试
将等量的赖氨酸脱羧酶(LDC)和修饰之后的赖氨酸脱羧酶(LDC-EK，本发明实施例中制备所得，且包括本发明所保护的其他长度的EK基因序列所制备的LDC-EK)加入到3mLPBS缓冲液中(10mM L-赖氨酸，0.1mM的磷酸吡哆醛)，在一定温度下反应30min。
衍生化：取50μL上述反应产物，加入300μL硼酸-硼砂缓冲液，100μL甲醇，47μL双蒸水，3μL DEEMM，70℃反应2h。过0.22μM膜后，用高效液相色谱检测戊二胺的浓度，以此来推算酶活性。
实施例5
赖氨酸脱羧酶最适温度和最适pH测试
(1)最适温度：取一定质量且等量的野生赖氨酸脱羧酶(LDC)和改造后的赖氨酸脱羧酶(LDC-EK，本发明实施例中制备所得，且包括本发明所保护的其他长度的EK基因序列所制备的LDC-EK))在不同温度(25℃，35℃，45℃，55℃，65℃)下测定酶活力。经测定，两种酶的最适温度均为55℃，但是LDC-EK在每个温度下，活性均高于LDC。
(2)最适pH：取一定质量且等量的野生赖氨酸脱羧酶(LDC)和改造后的赖氨酸脱羧酶(LDC-EK，本发明实施例中制备所得，且包括本发明所保护的其他长度的EK基因序列所制备的LDC-EK)，在不同pH(4.0，5.0，6.0，7.0，8.0)下测定酶活力。经测定，两种酶的最适pH均为5，但是LDC-EK在每个pH下，活性均高于LDC。
实施例6
赖氨酸脱羧酶温度稳定性测试
取一定质量且等量的野生赖氨酸脱羧酶(LDC)和改造后的赖氨酸脱羧酶(LDC-EK，本发明实施例中制备所得，且包括本发明所保护的其他长度的EK基因序列所制备的LDC-EK)，在不同温度(25℃，35℃，45℃，55℃，65℃)存放2h，恢复室温后，用上述方法测定酶活性。结果显示，25℃-45℃区间存放2h后，LDC-EK活性是LDC活性的2-4倍，55℃-65℃范围内，两者相差不大。
实施例7
赖氨酸脱羧酶有机溶剂稳定性测试
取一定质量且等量的野生赖氨酸脱羧酶(LDC)和改造后的赖氨酸脱羧酶(LDC-EK，本发明实施例中制备所得，且包括本发明所保护的其他长度的EK基因序列所制备的LDC-EK)，在不同有机溶剂中(乙醇、甲醇、二甲基亚砜、N’,N’-二甲基甲酰胺)存放2h后，用上述方法测定酶活性。结果显示，在每种有机溶剂中存放后，LDC-EK活性均比LDC高，其活性为LDC活性的2-5倍。
实施例8
赖氨酸脱羧酶储藏稳定性测试
取一定质量且等量的野生赖氨酸脱羧酶(LDC)和改造后的赖氨酸脱羧酶(LDC-EK，本发明实施例中制备所得，且包括本发明所保护的其他长度的EK基因序列所制备的LDC-EK)，在4℃下存放一定时间，用上述方法测定酶活性。结果显示，21天之后，LDC-EK保留有最初活性的50％，LDC全部失活。
本发明提出了利用一种提高赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的分子改造方法；已通过现场较佳实施例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种提高赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的分子改造方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60
gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120
gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180
aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240
gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300
agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360
actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420
cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480
agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540
tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600
gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660
tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720
gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780
tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840
cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900
gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960
acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020
ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080
gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140
aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200
ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260
ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320
cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380
acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440
aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500
gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560
catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620
atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680
gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740
tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800
aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860
tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920
gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980
ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040
gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100
gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaagaaaagg aaaaagagaa ggagaaagag aaagaaaagg aaaaagagaa ggagaaggag 60
<210> 3
<211> 2227
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtcggatcc atgaaagaaa aggaaaaaga gaaggagaaa gagaaagaaa aggaaaaaga 60
gaaggagaag gagaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga 120
acccatccgt gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa 180
cgaccgtgac gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt 240
tgactgggat aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct 300
gccgttgtac gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg 360
tttacagatt agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat 420
caagcagacc actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt 480
taaatatgtt cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc 540
attccagaaa agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa 600
atctgatatt tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca 660
caaagaagca gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac 720
caacggtact tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac 780
cattctgatt gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt 840
tacgccaatc tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca 900
gagtgaattc cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg 960
gccggtacat gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt 1020
catcaagaaa acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac 1080
caacttctca ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa 1140
agtgatttac gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat 1200
gatccacgtt aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac 1260
caccacttct ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa 1320
aggcaatgca ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa 1380
agagatcaaa cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga 1440
tcatatcgat acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa 1500
aaacatcgat aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg 1560
gatggaaaaa gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata 1620
cctcgacgaa catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt 1680
cagcatcggt atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa 1740
acgtgcgttc gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga 1800
tcctgaattc tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat 1860
tgttcaccac aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt 1920
aatgactccg tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct 1980
cgacgaaatg gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc 2040
tctggtaatg ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca 2100
gatgctgtgt gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata 2160
ccgtcaggct gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataaaa 2220
gcttccc 2227
<210> 4
<211> 2227
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtcggatcc atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga 60
acccatccgt gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa 120
cgaccgtgac gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt 180
tgactgggat aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct 240
gccgttgtac gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg 300
tttacagatt agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat 360
caagcagacc actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt 420
taaatatgtt cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc 480
attccagaaa agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa 540
atctgatatt tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca 600
caaagaagca gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac 660
caacggtact tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac 720
cattctgatt gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt 780
tacgccaatc tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca 840
gagtgaattc cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg 900
gccggtacat gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt 960
catcaagaaa acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac 1020
caacttctca ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa 1080
agtgatttac gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat 1140
gatccacgtt aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac 1200
caccacttct ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa 1260
aggcaatgca ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa 1320
agagatcaaa cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga 1380
tcatatcgat acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa 1440
aaacatcgat aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg 1500
gatggaaaaa gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata 1560
cctcgacgaa catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt 1620
cagcatcggt atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa 1680
acgtgcgttc gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga 1740
tcctgaattc tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat 1800
tgttcaccac aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt 1860
aatgactccg tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct 1920
cgacgaaatg gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc 1980
tctggtaatg ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca 2040
gatgctgtgt gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata 2100
ccgtcaggct gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaaaaaga 2160
aaaggaaaaa gagaaggaga aagagaaaga aaaggaaaaa gagaaggaga aggagtaaaa 2220
gcttccc 2227
<210> 5
<211> 2287
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctcggatcc atgaaagaaa aggaaaaaga gaaggagaaa gagaaagaaa aggaaaaaga 60
gaaggagaag gagaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga 120
acccatccgt gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa 180
cgaccgtgac gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt 240
tgactgggat aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct 300
gccgttgtac gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg 360
tttacagatt agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat 420
caagcagacc actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt 480
taaatatgtt cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc 540
attccagaaa agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa 600
atctgatatt tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca 660
caaagaagca gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac 720
caacggtact tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac 780
cattctgatt gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt 840
tacgccaatc tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca 900
gagtgaattc cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg 960
gccggtacat gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt 1020
catcaagaaa acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac 1080
caacttctca ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa 1140
agtgatttac gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat 1200
gatccacgtt aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac 1260
caccacttct ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa 1320
aggcaatgca ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa 1380
agagatcaaa cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga 1440
tcatatcgat acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa 1500
aaacatcgat aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg 1560
gatggaaaaa gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata 1620
cctcgacgaa catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt 1680
cagcatcggt atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa 1740
acgtgcgttc gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga 1800
tcctgaattc tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat 1860
tgttcaccac aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt 1920
aatgactccg tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct 1980
cgacgaaatg gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc 2040
tctggtaatg ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca 2100
gatgctgtgt gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata 2160
ccgtcaggct gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaaaaaga 2220
aaaggaaaaa gagaaggaga aagagaaaga aaaggaaaaa gagaaggaga aggagtaaaa 2280
gcttccc 2287
<210> 6
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgtcggatcc atgaaagaaa aggaaaaaga gaaggagaaa gagaaagaaa aggaaaaaga 60
gaaggagaag gagaacgtta ttgcaatatt gaatcacat 99
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccaagcttt tattttttgc tttcttct 28
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctcggatcc atgaacgtta ttgcaatat 29
<210> 9
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccaagcttt tactccttct ccttctcttt ttccttttct ttctctttct ccttctcttt 60
ttccttttct ttttttttgc tttcttcttt caatac 96
<210> 10
<211> 8089
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagctttt 180
attttttgct ttcttctttc aataccttaa cggtatagcg gccatcagcc tgacggtatg 240
caccgtgaat atcggtttca aagcccggat agtgagcgcc gatttcacac agcatctgca 300
ggaactccag aaccggacgg ctttcttcgg tgatcatttc acccggcatt accagaggaa 360
ctcccggcgg gtacggaagg atcatattgg cgttaatacg acctaccatt tcgtcgaggt 420
aaacttcttc ggtcataccg tgcagctctt tctggaatgc agcatacgga gtcattacca 480
tcgtcggcag cacttcaaat gcgcgataca tcagatccgg cagattgtgg tgaacaatca 540
gtttgtggat attctgagcc agttcctgaa tacgcatgtt ttcatagaat tcaggatctt 600
cacgatacag agacggcagc atgtttttca cacgcaggtt caggtcgaac gcacgtttaa 660
agtcagtcag agcacgcagc aggctcagtg ctttggtctt atcgataccg atgctgaaca 720
ggaacagcag gttatacgga ccggttttct caacaacgat gccatgttcg tcgaggtatt 780
tcgccacgat gctggccgga ataccaaagt cgctcatggt gccgtctttt tccatccccg 840
gagtcagcag ggtgactttg atcgggtcaa gatacatgtg ctcgttatcg atgtttttga 900
agccgtgcca ggtgctgtca gaacgcagcg gccagcattc agtcgtatcg atatgatccg 960
gctgccatac atcaaagaac cagccatcag attccgttct cagacgtttg atctctttac 1020
ggaatttgat cgcacgttca atagaaccgt tgatcagacg cttacctgca ttgcctttca 1080
tcatcgccgc agcggtttca gtggacgcca cgataccgta gtgcggagaa gtggtggtgt 1140
gcatcatgta ggcttcgtta aaggtttctt cgtttacgtc acctttaacg tggatcatgg 1200
aagcctgaga gaacgccgcc agcagtttgt gagtggactg ggtttcgtaa atcactttcc 1260
cttctacacg gccaccgctc ataccgcatt taccttcgta aatcggtgag aagttggtgt 1320
aaggcaccca cgcggagtca aagtggatgg atttcacatc cagtgttttc ttgatgaagt 1380
cggtgttgta cagcagacca tcataggtag agttggtaat tacagcatgt accggccagg 1440
ttgcgtttgg tgtttctttc acgcgcttag caatggtagc gtgctggaat tcactctgtg 1500
ggataccacc aagaataccg taagcgttac gggtcgggcg gaaatagatt ggcgtaacat 1560
cgctcatcat catcaggtgg gtcagcgatt tgtggcagtt acggtcaatc agaatggtgc 1620
tgcctgctgg agcagagtac ataccaacaa ttttgttcgc agtggaagta ccgttggtca 1680
ccatgtagct gcggtctgcg ttaaagacgc gagcgatata ctgttctgct tctttgtgtg 1740
gaccactgtg atccagcaga gaacccagtt cagatactga aatggaaata tcagatttca 1800
tggtattcgg accaaagaaa tcatagaaca ggctacctac cgggcttttc tggaatgcag 1860
taccgcccat gtgaccagga gtacagaaag tatatttacc ttcacgaaca tatttaaaca 1920
gtgctttagt cagcggaggc agaatagtgt tgatatattc gtcagtggtc tgcttgatct 1980
tattagcaat atcttcagca gcacccagcg catattcaaa gaagctaatc tgtaaacgca 2040
ggtcattcag gcttacatcg agagtggaat acgtattagc gaacgcgtac aacggcaggt 2100
tctcgttcat tttgctaatt tcttcgcaca gctcgagatt atatttatcc cagtcaaaaa 2160
taacgccgca cagacgcgca ttgttttcga tcagttttaa taagtcgtca cggtcgttcg 2220
ggtaaacaat ctggaagttc agacgttcaa gcgcgcgatg aagttcacgg atgggttctt 2280
ctttaaaata aacccccatg tgattcaata ttgcaataac gttctccttc tccttctctt 2340
tttccttttc tttctctttc tccttctctt tttccttttc tttcatggat ccgatatcag 2400
ccatggcctt gtcgtcgtcg tcggtaccca gatctgggct gtccatgtgc tggcgttcga 2460
atttagcagc agcggtttct ttcataccag aaccgcgtgg caccagacca gaagaatgat 2520
gatgatgatg gtgcatatgg ccagaaccag aaccggccag gttagcgtcg aggaactctt 2580
tcaactgacc tttagacagt gcacccactt tggttgccgc cacttcaccg tttttgaaca 2640
gcagcagagt cgggatacca cggatgccat atttcggcgc agtgccaggg ttttgatcga 2700
tgttcagttt tgcaacggtc agtttgccct gatattcgtc agcgatttca tccagaatcg 2760
gggcgatcat tttgcacgga ccgcaccact ctgcccagaa atcgacgagg atcgccccgt 2820
ccgctttgag tacatccgtg tcaaaactgt cgtcagtcag gtgaataatt ttatcgctca 2880
tatgtatatc tccttcttaa agttaaacaa aattatttct agaggggaat tgttatccgc 2940
tcacaattcc cctatagtga gtcgtattaa tttcgcggga tcgagatcga tctcgatcct 3000
ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg ctggcgccta 3060
tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca tgagcgcttg 3120
tttcggcgtg ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg ccatctcctt 3180
gcatgcacca ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc aacctactac tgggctgctt 3240
cctaatgcag gagtcgcata agggagagcg tcgagatccc ggacaccatc gaatggcgca 3300
aaacctttcg cggtatggca tgatagcgcc cggaagagag tcaattcagg gtggtgaatg 3360
tgaaaccagt aacgttatac gatgtcgcag agtatgccgg tgtctcttat cagaccgttt 3420
cccgcgtggt gaaccaggcc agccacgttt ctgcgaaaac gcgggaaaaa gtggaagcgg 3480
cgatggcgga gctgaattac attcccaacc gcgtggcaca acaactggcg ggcaaacagt 3540
cgttgctgat tggcgttgcc acctccagtc tggccctgca cgcgccgtcg caaattgtcg 3600
cggcgattaa atctcgcgcc gatcaactgg gtgccagcgt ggtggtgtcg atggtagaac 3660
gaagcggcgt cgaagcctgt aaagcggcgg tgcacaatct tctcgcgcaa cgcgtcagtg 3720
ggctgatcat taactatccg ctggatgacc aggatgccat tgctgtggaa gctgcctgca 3780
ctaatgttcc ggcgttattt cttgatgtct ctgaccagac acccatcaac agtattattt 3840
tctcccatga agacggtacg cgactgggcg tggagcatct ggtcgcattg ggtcaccagc 3900
aaatcgcgct gttagcgggc ccattaagtt ctgtctcggc gcgtctgcgt ctggctggct 3960
ggcataaata tctcactcgc aatcaaattc agccgatagc ggaacgggaa ggcgactgga 4020
gtgccatgtc cggttttcaa caaaccatgc aaatgctgaa tgagggcatc gttcccactg 4080
cgatgctggt tgccaacgat cagatggcgc tgggcgcaat gcgcgccatt accgagtccg 4140
ggctgcgcgt tggtgcggac atctcggtag tgggatacga cgataccgaa gacagctcat 4200
gttatatccc gccgttaacc accatcaaac aggattttcg cctgctgggg caaaccagcg 4260
tggaccgctt gctgcaactc tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag ctgttgcccg 4320
tctcactggt gaaaagaaaa accaccctgg cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg 4380
cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt 4440
gagcgcaacg caattaatgt aagttagctc actcattagg caccgggatc tcgaccgatg 4500
cccttgagag ccttcaaccc agtcagctcc ttccggtggg cgcggggcat gactatcgtc 4560
gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc ggcagcgctc 4620
tgggtcattt tcggcgagga ccgctttcgc tggagcgcga cgatgatcgg cctgtcgctt 4680
gcggtattcg gaatcttgca cgccctcgct caagccttcg tcactggtcc cgccaccaaa 4740
cgtttcggcg agaagcaggc cattatcgcc ggcatggcgg ccccacgggt gcgcatgatc 4800
gtgctcctgt cgttgaggac ccggctaggc tggcggggtt gccttactgg ttagcagaat 4860
gaatcaccga tacgcgagcg aacgtgaagc gactgctgct gcaaaacgtc tgcgacctga 4920
gcaacaacat gaatggtctt cggtttccgt gtttcgtaaa gtctggaaac gcggaagtca 4980
gcgccctgca ccattatgtt ccggatctgc atcgcaggat gctgctggct accctgtgga 5040
acacctacat ctgtattaac gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt tctctggtcc 5100
cgccgcatcc ataccgccag ttgtttaccc tcacaacgtt ccagtaaccg ggcatgttca 5160
tcatcagtaa cccgtatcgt gagcatcctc tctcgtttca tcggtatcat tacccccatg 5220
aacagaaatc ccccttacac ggaggcatca gtgaccaaac aggaaaaaac cgcccttaac 5280
atggcccgct ttatcagaag ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa cgagctggac 5340
gcggatgaac aggcagacat ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga gctttaccgc 5400
agctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 5460
acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 5520
gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg 5580
tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatatgcg 5640
gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc 5700
ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 5760
aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 5820
aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 5880
gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 5940
gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 6000
tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 6060
ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 6120
ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 6180
tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 6240
tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 6300
ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 6360
aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 6420
ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 6480
tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 6540
atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 6600
aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 6660
ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 6720
tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 6780
ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 6840
tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 6900
aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctgcag gcatcgtggt 6960
gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 7020
tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 7080
cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 7140
tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 7200
ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 7260
cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 7320
actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 7380
ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 7440
aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 7500
ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 7560
atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 7620
tgaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 7680
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 7740
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 7800
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 7860
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 7920
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 7980
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 8040
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgcca 8089
<210> 11
<211> 8089
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagctttt 180
actccttctc cttctctttt tccttttctt tctctttctc cttctctttt tccttttctt 240
tttttttgct ttcttctttc aataccttaa cggtatagcg gccatcagcc tgacggtatg 300
caccgtgaat atcggtttca aagcccggat agtgagcgcc gatttcacac agcatctgca 360
ggaactccag aaccggacgg ctttcttcgg tgatcatttc acccggcatt accagaggaa 420
ctcccggcgg gtacggaagg atcatattgg cgttaatacg acctaccatt tcgtcgaggt 480
aaacttcttc ggtcataccg tgcagctctt tctggaatgc agcatacgga gtcattacca 540
tcgtcggcag cacttcaaat gcgcgataca tcagatccgg cagattgtgg tgaacaatca 600
gtttgtggat attctgagcc agttcctgaa tacgcatgtt ttcatagaat tcaggatctt 660
cacgatacag agacggcagc atgtttttca cacgcaggtt caggtcgaac gcacgtttaa 720
agtcagtcag agcacgcagc aggctcagtg ctttggtctt atcgataccg atgctgaaca 780
ggaacagcag gttatacgga ccggttttct caacaacgat gccatgttcg tcgaggtatt 840
tcgccacgat gctggccgga ataccaaagt cgctcatggt gccgtctttt tccatccccg 900
gagtcagcag ggtgactttg atcgggtcaa gatacatgtg ctcgttatcg atgtttttga 960
agccgtgcca ggtgctgtca gaacgcagcg gccagcattc agtcgtatcg atatgatccg 1020
gctgccatac atcaaagaac cagccatcag attccgttct cagacgtttg atctctttac 1080
ggaatttgat cgcacgttca atagaaccgt tgatcagacg cttacctgca ttgcctttca 1140
tcatcgccgc agcggtttca gtggacgcca cgataccgta gtgcggagaa gtggtggtgt 1200
gcatcatgta ggcttcgtta aaggtttctt cgtttacgtc acctttaacg tggatcatgg 1260
aagcctgaga gaacgccgcc agcagtttgt gagtggactg ggtttcgtaa atcactttcc 1320
cttctacacg gccaccgctc ataccgcatt taccttcgta aatcggtgag aagttggtgt 1380
aaggcaccca cgcggagtca aagtggatgg atttcacatc cagtgttttc ttgatgaagt 1440
cggtgttgta cagcagacca tcataggtag agttggtaat tacagcatgt accggccagg 1500
ttgcgtttgg tgtttctttc acgcgcttag caatggtagc gtgctggaat tcactctgtg 1560
ggataccacc aagaataccg taagcgttac gggtcgggcg gaaatagatt ggcgtaacat 1620
cgctcatcat catcaggtgg gtcagcgatt tgtggcagtt acggtcaatc agaatggtgc 1680
tgcctgctgg agcagagtac ataccaacaa ttttgttcgc agtggaagta ccgttggtca 1740
ccatgtagct gcggtctgcg ttaaagacgc gagcgatata ctgttctgct tctttgtgtg 1800
gaccactgtg atccagcaga gaacccagtt cagatactga aatggaaata tcagatttca 1860
tggtattcgg accaaagaaa tcatagaaca ggctacctac cgggcttttc tggaatgcag 1920
taccgcccat gtgaccagga gtacagaaag tatatttacc ttcacgaaca tatttaaaca 1980
gtgctttagt cagcggaggc agaatagtgt tgatatattc gtcagtggtc tgcttgatct 2040
tattagcaat atcttcagca gcacccagcg catattcaaa gaagctaatc tgtaaacgca 2100
ggtcattcag gcttacatcg agagtggaat acgtattagc gaacgcgtac aacggcaggt 2160
tctcgttcat tttgctaatt tcttcgcaca gctcgagatt atatttatcc cagtcaaaaa 2220
taacgccgca cagacgcgca ttgttttcga tcagttttaa taagtcgtca cggtcgttcg 2280
ggtaaacaat ctggaagttc agacgttcaa gcgcgcgatg aagttcacgg atgggttctt 2340
ctttaaaata aacccccatg tgattcaata ttgcaataac gttcatggat ccgatatcag 2400
ccatggcctt gtcgtcgtcg tcggtaccca gatctgggct gtccatgtgc tggcgttcga 2460
atttagcagc agcggtttct ttcataccag aaccgcgtgg caccagacca gaagaatgat 2520
gatgatgatg gtgcatatgg ccagaaccag aaccggccag gttagcgtcg aggaactctt 2580
tcaactgacc tttagacagt gcacccactt tggttgccgc cacttcaccg tttttgaaca 2640
gcagcagagt cgggatacca cggatgccat atttcggcgc agtgccaggg ttttgatcga 2700
tgttcagttt tgcaacggtc agtttgccct gatattcgtc agcgatttca tccagaatcg 2760
gggcgatcat tttgcacgga ccgcaccact ctgcccagaa atcgacgagg atcgccccgt 2820
ccgctttgag tacatccgtg tcaaaactgt cgtcagtcag gtgaataatt ttatcgctca 2880
tatgtatatc tccttcttaa agttaaacaa aattatttct agaggggaat tgttatccgc 2940
tcacaattcc cctatagtga gtcgtattaa tttcgcggga tcgagatcga tctcgatcct 3000
ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg ctggcgccta 3060
tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca tgagcgcttg 3120
tttcggcgtg ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg ccatctcctt 3180
gcatgcacca ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc aacctactac tgggctgctt 3240
cctaatgcag gagtcgcata agggagagcg tcgagatccc ggacaccatc gaatggcgca 3300
aaacctttcg cggtatggca tgatagcgcc cggaagagag tcaattcagg gtggtgaatg 3360
tgaaaccagt aacgttatac gatgtcgcag agtatgccgg tgtctcttat cagaccgttt 3420
cccgcgtggt gaaccaggcc agccacgttt ctgcgaaaac gcgggaaaaa gtggaagcgg 3480
cgatggcgga gctgaattac attcccaacc gcgtggcaca acaactggcg ggcaaacagt 3540
cgttgctgat tggcgttgcc acctccagtc tggccctgca cgcgccgtcg caaattgtcg 3600
cggcgattaa atctcgcgcc gatcaactgg gtgccagcgt ggtggtgtcg atggtagaac 3660
gaagcggcgt cgaagcctgt aaagcggcgg tgcacaatct tctcgcgcaa cgcgtcagtg 3720
ggctgatcat taactatccg ctggatgacc aggatgccat tgctgtggaa gctgcctgca 3780
ctaatgttcc ggcgttattt cttgatgtct ctgaccagac acccatcaac agtattattt 3840
tctcccatga agacggtacg cgactgggcg tggagcatct ggtcgcattg ggtcaccagc 3900
aaatcgcgct gttagcgggc ccattaagtt ctgtctcggc gcgtctgcgt ctggctggct 3960
ggcataaata tctcactcgc aatcaaattc agccgatagc ggaacgggaa ggcgactgga 4020
gtgccatgtc cggttttcaa caaaccatgc aaatgctgaa tgagggcatc gttcccactg 4080
cgatgctggt tgccaacgat cagatggcgc tgggcgcaat gcgcgccatt accgagtccg 4140
ggctgcgcgt tggtgcggac atctcggtag tgggatacga cgataccgaa gacagctcat 4200
gttatatccc gccgttaacc accatcaaac aggattttcg cctgctgggg caaaccagcg 4260
tggaccgctt gctgcaactc tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag ctgttgcccg 4320
tctcactggt gaaaagaaaa accaccctgg cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg 4380
cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt 4440
gagcgcaacg caattaatgt aagttagctc actcattagg caccgggatc tcgaccgatg 4500
cccttgagag ccttcaaccc agtcagctcc ttccggtggg cgcggggcat gactatcgtc 4560
gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc ggcagcgctc 4620
tgggtcattt tcggcgagga ccgctttcgc tggagcgcga cgatgatcgg cctgtcgctt 4680
gcggtattcg gaatcttgca cgccctcgct caagccttcg tcactggtcc cgccaccaaa 4740
cgtttcggcg agaagcaggc cattatcgcc ggcatggcgg ccccacgggt gcgcatgatc 4800
gtgctcctgt cgttgaggac ccggctaggc tggcggggtt gccttactgg ttagcagaat 4860
gaatcaccga tacgcgagcg aacgtgaagc gactgctgct gcaaaacgtc tgcgacctga 4920
gcaacaacat gaatggtctt cggtttccgt gtttcgtaaa gtctggaaac gcggaagtca 4980
gcgccctgca ccattatgtt ccggatctgc atcgcaggat gctgctggct accctgtgga 5040
acacctacat ctgtattaac gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt tctctggtcc 5100
cgccgcatcc ataccgccag ttgtttaccc tcacaacgtt ccagtaaccg ggcatgttca 5160
tcatcagtaa cccgtatcgt gagcatcctc tctcgtttca tcggtatcat tacccccatg 5220
aacagaaatc ccccttacac ggaggcatca gtgaccaaac aggaaaaaac cgcccttaac 5280
atggcccgct ttatcagaag ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa cgagctggac 5340
gcggatgaac aggcagacat ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga gctttaccgc 5400
agctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 5460
acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 5520
gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg 5580
tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatatgcg 5640
gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc 5700
ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 5760
aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 5820
aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 5880
gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 5940
gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 6000
tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 6060
ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 6120
ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 6180
tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 6240
tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 6300
ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 6360
aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 6420
ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 6480
tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 6540
atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 6600
aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 6660
ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 6720
tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 6780
ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 6840
tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 6900
aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctgcag gcatcgtggt 6960
gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 7020
tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 7080
cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 7140
tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 7200
ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 7260
cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 7320
actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 7380
ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 7440
aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 7500
ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 7560
atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 7620
tgaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 7680
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 7740
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 7800
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 7860
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 7920
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 7980
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 8040
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgcca 8089
<210> 12
<211> 8149
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagctttt 180
actccttctc cttctctttt tccttttctt tctctttctc cttctctttt tccttttctt 240
tttttttgct ttcttctttc aataccttaa cggtatagcg gccatcagcc tgacggtatg 300
caccgtgaat atcggtttca aagcccggat agtgagcgcc gatttcacac agcatctgca 360
ggaactccag aaccggacgg ctttcttcgg tgatcatttc acccggcatt accagaggaa 420
ctcccggcgg gtacggaagg atcatattgg cgttaatacg acctaccatt tcgtcgaggt 480
aaacttcttc ggtcataccg tgcagctctt tctggaatgc agcatacgga gtcattacca 540
tcgtcggcag cacttcaaat gcgcgataca tcagatccgg cagattgtgg tgaacaatca 600
gtttgtggat attctgagcc agttcctgaa tacgcatgtt ttcatagaat tcaggatctt 660
cacgatacag agacggcagc atgtttttca cacgcaggtt caggtcgaac gcacgtttaa 720
agtcagtcag agcacgcagc aggctcagtg ctttggtctt atcgataccg atgctgaaca 780
ggaacagcag gttatacgga ccggttttct caacaacgat gccatgttcg tcgaggtatt 840
tcgccacgat gctggccgga ataccaaagt cgctcatggt gccgtctttt tccatccccg 900
gagtcagcag ggtgactttg atcgggtcaa gatacatgtg ctcgttatcg atgtttttga 960
agccgtgcca ggtgctgtca gaacgcagcg gccagcattc agtcgtatcg atatgatccg 1020
gctgccatac atcaaagaac cagccatcag attccgttct cagacgtttg atctctttac 1080
ggaatttgat cgcacgttca atagaaccgt tgatcagacg cttacctgca ttgcctttca 1140
tcatcgccgc agcggtttca gtggacgcca cgataccgta gtgcggagaa gtggtggtgt 1200
gcatcatgta ggcttcgtta aaggtttctt cgtttacgtc acctttaacg tggatcatgg 1260
aagcctgaga gaacgccgcc agcagtttgt gagtggactg ggtttcgtaa atcactttcc 1320
cttctacacg gccaccgctc ataccgcatt taccttcgta aatcggtgag aagttggtgt 1380
aaggcaccca cgcggagtca aagtggatgg atttcacatc cagtgttttc ttgatgaagt 1440
cggtgttgta cagcagacca tcataggtag agttggtaat tacagcatgt accggccagg 1500
ttgcgtttgg tgtttctttc acgcgcttag caatggtagc gtgctggaat tcactctgtg 1560
ggataccacc aagaataccg taagcgttac gggtcgggcg gaaatagatt ggcgtaacat 1620
cgctcatcat catcaggtgg gtcagcgatt tgtggcagtt acggtcaatc agaatggtgc 1680
tgcctgctgg agcagagtac ataccaacaa ttttgttcgc agtggaagta ccgttggtca 1740
ccatgtagct gcggtctgcg ttaaagacgc gagcgatata ctgttctgct tctttgtgtg 1800
gaccactgtg atccagcaga gaacccagtt cagatactga aatggaaata tcagatttca 1860
tggtattcgg accaaagaaa tcatagaaca ggctacctac cgggcttttc tggaatgcag 1920
taccgcccat gtgaccagga gtacagaaag tatatttacc ttcacgaaca tatttaaaca 1980
gtgctttagt cagcggaggc agaatagtgt tgatatattc gtcagtggtc tgcttgatct 2040
tattagcaat atcttcagca gcacccagcg catattcaaa gaagctaatc tgtaaacgca 2100
ggtcattcag gcttacatcg agagtggaat acgtattagc gaacgcgtac aacggcaggt 2160
tctcgttcat tttgctaatt tcttcgcaca gctcgagatt atatttatcc cagtcaaaaa 2220
taacgccgca cagacgcgca ttgttttcga tcagttttaa taagtcgtca cggtcgttcg 2280
ggtaaacaat ctggaagttc agacgttcaa gcgcgcgatg aagttcacgg atgggttctt 2340
ctttaaaata aacccccatg tgattcaata ttgcaataac gttctccttc tccttctctt 2400
tttccttttc tttctctttc tccttctctt tttccttttc tttcatggat ccgatatcag 2460
ccatggcctt gtcgtcgtcg tcggtaccca gatctgggct gtccatgtgc tggcgttcga 2520
atttagcagc agcggtttct ttcataccag aaccgcgtgg caccagacca gaagaatgat 2580
gatgatgatg gtgcatatgg ccagaaccag aaccggccag gttagcgtcg aggaactctt 2640
tcaactgacc tttagacagt gcacccactt tggttgccgc cacttcaccg tttttgaaca 2700
gcagcagagt cgggatacca cggatgccat atttcggcgc agtgccaggg ttttgatcga 2760
tgttcagttt tgcaacggtc agtttgccct gatattcgtc agcgatttca tccagaatcg 2820
gggcgatcat tttgcacgga ccgcaccact ctgcccagaa atcgacgagg atcgccccgt 2880
ccgctttgag tacatccgtg tcaaaactgt cgtcagtcag gtgaataatt ttatcgctca 2940
tatgtatatc tccttcttaa agttaaacaa aattatttct agaggggaat tgttatccgc 3000
tcacaattcc cctatagtga gtcgtattaa tttcgcggga tcgagatcga tctcgatcct 3060
ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg ctggcgccta 3120
tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca tgagcgcttg 3180
tttcggcgtg ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg ccatctcctt 3240
gcatgcacca ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc aacctactac tgggctgctt 3300
cctaatgcag gagtcgcata agggagagcg tcgagatccc ggacaccatc gaatggcgca 3360
aaacctttcg cggtatggca tgatagcgcc cggaagagag tcaattcagg gtggtgaatg 3420
tgaaaccagt aacgttatac gatgtcgcag agtatgccgg tgtctcttat cagaccgttt 3480
cccgcgtggt gaaccaggcc agccacgttt ctgcgaaaac gcgggaaaaa gtggaagcgg 3540
cgatggcgga gctgaattac attcccaacc gcgtggcaca acaactggcg ggcaaacagt 3600
cgttgctgat tggcgttgcc acctccagtc tggccctgca cgcgccgtcg caaattgtcg 3660
cggcgattaa atctcgcgcc gatcaactgg gtgccagcgt ggtggtgtcg atggtagaac 3720
gaagcggcgt cgaagcctgt aaagcggcgg tgcacaatct tctcgcgcaa cgcgtcagtg 3780
ggctgatcat taactatccg ctggatgacc aggatgccat tgctgtggaa gctgcctgca 3840
ctaatgttcc ggcgttattt cttgatgtct ctgaccagac acccatcaac agtattattt 3900
tctcccatga agacggtacg cgactgggcg tggagcatct ggtcgcattg ggtcaccagc 3960
aaatcgcgct gttagcgggc ccattaagtt ctgtctcggc gcgtctgcgt ctggctggct 4020
ggcataaata tctcactcgc aatcaaattc agccgatagc ggaacgggaa ggcgactgga 4080
gtgccatgtc cggttttcaa caaaccatgc aaatgctgaa tgagggcatc gttcccactg 4140
cgatgctggt tgccaacgat cagatggcgc tgggcgcaat gcgcgccatt accgagtccg 4200
ggctgcgcgt tggtgcggac atctcggtag tgggatacga cgataccgaa gacagctcat 4260
gttatatccc gccgttaacc accatcaaac aggattttcg cctgctgggg caaaccagcg 4320
tggaccgctt gctgcaactc tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag ctgttgcccg 4380
tctcactggt gaaaagaaaa accaccctgg cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg 4440
cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt 4500
gagcgcaacg caattaatgt aagttagctc actcattagg caccgggatc tcgaccgatg 4560
cccttgagag ccttcaaccc agtcagctcc ttccggtggg cgcggggcat gactatcgtc 4620
gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc ggcagcgctc 4680
tgggtcattt tcggcgagga ccgctttcgc tggagcgcga cgatgatcgg cctgtcgctt 4740
gcggtattcg gaatcttgca cgccctcgct caagccttcg tcactggtcc cgccaccaaa 4800
cgtttcggcg agaagcaggc cattatcgcc ggcatggcgg ccccacgggt gcgcatgatc 4860
gtgctcctgt cgttgaggac ccggctaggc tggcggggtt gccttactgg ttagcagaat 4920
gaatcaccga tacgcgagcg aacgtgaagc gactgctgct gcaaaacgtc tgcgacctga 4980
gcaacaacat gaatggtctt cggtttccgt gtttcgtaaa gtctggaaac gcggaagtca 5040
gcgccctgca ccattatgtt ccggatctgc atcgcaggat gctgctggct accctgtgga 5100
acacctacat ctgtattaac gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt tctctggtcc 5160
cgccgcatcc ataccgccag ttgtttaccc tcacaacgtt ccagtaaccg ggcatgttca 5220
tcatcagtaa cccgtatcgt gagcatcctc tctcgtttca tcggtatcat tacccccatg 5280
aacagaaatc ccccttacac ggaggcatca gtgaccaaac aggaaaaaac cgcccttaac 5340
atggcccgct ttatcagaag ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa cgagctggac 5400
gcggatgaac aggcagacat ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga gctttaccgc 5460
agctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 5520
acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 5580
gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg 5640
tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatatgcg 5700
gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc 5760
ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 5820
aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 5880
aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 5940
gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 6000
gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 6060
tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 6120
ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 6180
ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 6240
tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 6300
tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 6360
ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 6420
aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 6480
ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 6540
tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 6600
atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 6660
aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 6720
ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 6780
tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 6840
ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 6900
tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 6960
aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctgcag gcatcgtggt 7020
gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 7080
tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 7140
cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 7200
tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 7260
ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 7320
cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 7380
actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 7440
ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 7500
aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 7560
ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 7620
atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 7680
tgaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 7740
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 7800
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 7860
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 7920
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 7980
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 8040
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 8100
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgcca 8149

Claims (10)

1.一种提高赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的分子改造方法；其特征是在赖氨酸脱羧酶分子LDC的一端连接一段多肽片段EK。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)获得赖氨酸脱羧酶分子的基因片段；
(2)将编码EK多肽的基因片段连接到赖氨酸脱羧酶基因的一端；
(3)将连接有EK多肽基因的赖氨酸脱羧酶基因连接到表达载体上，转入到宿主中，表达改造后的赖氨酸脱羧酶LDC-EK。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的多肽片段由赖氨酸和谷氨酸交替排列而成。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的多肽片段长度为20-200个氨基酸。
5.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤(2)中将编码多肽的基因片段连接到赖氨酸脱羧酶基因的5’端。
6.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤(2)中将编码多肽的基因片段连接到赖氨酸脱羧酶基因的3’端。
7.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤(2)中将编码多肽的基因片段同时连接到赖氨酸脱羧酶基因的5’端和3’端。
8.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤(1)获得编码赖氨酸脱羧酶分子的基因序列SEQ ID NO.1。
9.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤(2)方法是:将编码EK多肽的基因片段为SEQID NO.2、长度为60bp连接到编码赖氨酸脱羧酶分子基因片段SEQ ID NO.1的5’端，3’端，以及同时连接到5’和3‘端，分别得到序列为SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5的基因序列；其中，EK多肽的基因序列不仅仅限于SEQ ID NO.2，其长度范围是以SEQ ID NO.2为基本单元，1-10个重复(60bp-600bp)，对应的EK多肽长度即为20-200个氨基酸。
10.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤(3)的方法是：将步骤2所得到的基因片段SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5连接到适用于大肠杆菌E.coli BL21表达系统的表达型载体上，转入宿主E.coli BL21中进行表达，得到在C端和或N端连接有EK多肽段的赖氨酸脱羧酶分子LDC-EK。
CN201910158461.4A 2019-03-04 2019-03-04 一种提高赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的分子改造方法 Pending CN110004131A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910158461.4A CN110004131A (zh) 2019-03-04 2019-03-04 一种提高赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的分子改造方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910158461.4A CN110004131A (zh) 2019-03-04 2019-03-04 一种提高赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的分子改造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110004131A true CN110004131A (zh) 2019-07-12

Family

ID=67166339

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910158461.4A Pending CN110004131A (zh) 2019-03-04 2019-03-04 一种提高赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的分子改造方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110004131A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111141856A (zh) * 2020-01-19 2020-05-12 浙江工业大学 同时检测发酵液中l-高丝氨酸和游离氨基酸的hplc方法
CN111172184A (zh) * 2020-03-10 2020-05-19 大连理工大学 一种基于基因修饰得到人重组干扰素的融合基因、融合蛋白及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104099308A (zh) * 2013-04-03 2014-10-15 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种具有天冬氨酸激酶活性的多肽及其应用
CN107164352A (zh) * 2017-05-16 2017-09-15 中国科学院天津工业生物技术研究所 新的赖氨酸脱羧酶突变体及其应用
WO2018140532A1 (en) * 2017-01-24 2018-08-02 Fred Hutchinson Cancer Research Center Systems and methods for hematopoietic cell expansion utilizing hydrogels
CN110291101A (zh) * 2016-12-30 2019-09-27 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 修饰的赖氨酸脱羧酶

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104099308A (zh) * 2013-04-03 2014-10-15 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种具有天冬氨酸激酶活性的多肽及其应用
CN110291101A (zh) * 2016-12-30 2019-09-27 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 修饰的赖氨酸脱羧酶
WO2018140532A1 (en) * 2017-01-24 2018-08-02 Fred Hutchinson Cancer Research Center Systems and methods for hematopoietic cell expansion utilizing hydrogels
CN107164352A (zh) * 2017-05-16 2017-09-15 中国科学院天津工业生物技术研究所 新的赖氨酸脱羧酶突变体及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ERIK J. LIU等: ""EKylation: Addition of an Alternating-Charge Peptide Stabilizes Proteins"", 《BIOMACROMOLECULES》 *
杨庆华: ""抗非特异性蛋白质吸附多肽的合成、表征及体外酶降解性能研究"", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技Ⅰ辑》 *
梅晔等: ""EK多肽折叠以及离子浓度和pH值依赖性的计算研究"", 《中国科学：化学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111141856A (zh) * 2020-01-19 2020-05-12 浙江工业大学 同时检测发酵液中l-高丝氨酸和游离氨基酸的hplc方法
CN111172184A (zh) * 2020-03-10 2020-05-19 大连理工大学 一种基于基因修饰得到人重组干扰素的融合基因、融合蛋白及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2718431T3 (en) dsRNA endoribonucleases.
CN107475267B (zh) 4-羟基异亮氨酸生产质粒与菌株以及4-羟基异亮氨酸的合成方法
CN108486105B (zh) 一种马克斯克鲁维酵母启动子及其制备方法与应用
CN111592990B (zh) 阿魏酸酯酶的重组表达菌株、制备方法及其应用
CN110540989A (zh) 基于pcr技术克隆已知区域旁邻的未知dna序列的引物及方法
CN111304252B (zh) 基于pink1及park7的非治疗目的的将病毒注入动物特定脑区进行基因编辑的方法
CN110004131A (zh) 一种提高赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的分子改造方法
CN111171132B (zh) 乌鳢抗菌肽
CN110734480B (zh) 大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的应用
KR101891603B1 (ko) 구제역 a형 한국발생주 및 백신표준주 a22형의 방어항원이 동시에 발현되는 재조합 바이러스
CN111304257B (zh) 基于psen1基因的非治疗目的的将病毒注入动物特定脑区进行基因编辑的方法
CN114438083A (zh) 识别猪PERV基因的sgRNA及其编码DNA和应用
CN108410870B (zh) 马克斯克鲁维酵母启动子、分泌信号肽及其制备与应用
CN102241763A (zh) 一种鱼类持续激活生长激素受体基因及制备方法和用途
CN113373163B (zh) 一种密码子优化的沙眼衣原体ctl0286基因及其应用
US20100304461A1 (en) Portable, Temperature and Chemically Inducible Expression Vector for High Cell Density Expression of Heterologous Genes in Escherichia Coli
CN115369099B (zh) 一种米黑根毛霉脂肪酶突变体及提高米黑根毛霉脂肪酶活性和/或甲醇耐受性的方法
CN114773449B (zh) 一种β-酪蛋白的人工优化与合成方法及其应用
CN114773448B (zh) 重组κ-酪蛋白及其制备方法和人造乳
CN115109791B (zh) 一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体、构建方法和应用
CN110157721A (zh) 一种痘苗病毒天坛株的示踪打靶质粒及其制备方法
KR101629345B1 (ko) 구제역 아시아1 혈청형 유전형 iv 바이러스의 방어항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법
KR101526818B1 (ko) 인간 혈청 알부민을 이용한 인터루킨-2 발현 컨스트럭트
KR101490661B1 (ko) 메탄올 자화 효모를 이용한 인터루킨-2 단백질 생산 방법
CN103864887A (zh) 一种链霉菌生物合成调控蛋白的体外筛选方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190712

RJ01 Rejection of invention patent application after publication