KR101891603B1

KR101891603B1 - 구제역 a형 한국발생주 및 백신표준주 a22형의 방어항원이 동시에 발현되는 재조합 바이러스

Info

Publication number: KR101891603B1
Application number: KR1020170037869A
Authority: KR
Inventors: 박종현; 이광녕; 고영준; 고미경; 이서용; 김병한
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2017-03-24
Publication date: 2018-08-24

Abstract

본 발명은 구제역 한국주(A Pocheon/SKR/2010) 및 중동 표준주 A22의 방어항원을 발현하는 재조합 구제역 바이러스 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 구제역 A형 혈청형에 대해 보다 넓은 범위에서 방어효과를 극대화할 수 있다.

Description

구제역 A형 한국발생주 및 백신표준주 A22형의 방어항원이 동시에 발현되는 재조합 바이러스 {Recombinant foot-and-mouth disease virus expressing protective antigen of type A, Korean and standard strains}

본 발명은 구제역 A형 한국발생주 및 백신표준주 A22형의 방어항원이 동시에 발현되는 재조합 바이러스 및 그 제조방법에 관한 것이다.

구제역(Foot and mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스성 수포질병으로 빠른 복제와 빠른 전파력이 특징이다. 이 질병은 그 경제적 중요성으로 인하여 세계동물보건기구(OIE)에 의하여 매우 중요한 동물 질병으로 분류되어 있으며, 발생시 국가간 교역이 불가능하여 축산물의 교역에 있어 가장 중요한 요소로 작용하고 있다.

상기 구제역 병원체는 단일가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데(Piconaviridae)과, 아프소바이러스(Aphthovirus)속에 속하며 7개의 다른 혈청형(A, O, C, Asia1, SAT 1, SAT2, SAT3)으로 분류되고 있다.

구제역 바이러스(Foot and mouth disease virus) A형 중에서도 ME-SA(중동-남아시아), AFRICA(아프리카), ASIA(아시아)의 3가지의 지역형이 있다. 이 지역형간에도 변이율이 높아 바이러스 공격에 대해 방어가 되지 않는 경우가 많아 A형 바이러스에 대한 여러 종류의 백신의 개발이 필요한 실정이다.

그러나 모든 백신주 개발을 위해서는 야외주를 지속적으로 세포에 배양하여 적절한 증식력을 지녀야 하고, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되며 결과가 좋으리라는 보장도 없다. 따라서 기존의 정보가 많고 이미 증명된 백신 바이러스를 이용하여 필요로 하는 백신주를 새로 신속하게 개발하여 사용할 수 있도록 적절한 시기에 제작 가능한 형태로 만들어져야 할 것이다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 이미 구제역 백신주로 알려져 있는, 병원성이 약화된 바이러스를 기초로 바이러스 유전자로 구성된 기본 벡터를 이용하여 A형 중 아시아 주변지역 및 중동지역에서 유행하는 바이러스에 대한 방어가 가능한 백신을 생산할 수 있는 새로운 재조합 바이러스를 제작하였다.

한국등록특허 제10-1578444호

따라서, 본 발명의 목적은 구제역의 7개의 혈청형 중 가장 변이가 심한 A형 바이러스 중 한국 발생주(A Pocheon/SKR/2010) 및 중동 백신표준주 (A22 Iraq)에 대한 방어능을 동시에 구비하여 백신 종독주로 유용하게 사용될 수 있는 재조합 구제역 바이러스를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 바이러스의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 예방용 백신 조성물을 제공함에 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 이용하여 구제역을 예방하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명자들은 구제역 바이러스 7종 중 가장 변이가 심한 A형에 대하여 보다 넓은 범위의 방어능을 가지는 백신주를 개발하기 위해 연구한 결과, 구제역 O형 바이러스의 일부 유전자가 한국 발생주(A Pocheon/SKR/2010) 및 중동 백신표준주 (A22 Iraq)의 유전자로 치환된, 새로운 구제역 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신이 환경저항성을 가지면서 방어효과가 극대화됨을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명에 의하면 이하의 발명이 제공된다.

1) 구제역 O형 바이러스의 P1 유전자가 A Pocheon/SKR/2010의 P1 유전자로 치환되고, 상기 치환된 P1 유전자 중 VP1 부위는 A22 Iraq의 VP1 유전자로 치환된 것이며, 상기 구제역 O형 바이러스는 3B 부위 중, 3B12부위가 치환된 것인, 구제역 O형 바이러스의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드.

2) 상기 치환된 A Pocheon/SKR/2010의 P1 유전자 중 VP2 부위의 145번째 아미노산 히스티딘이 타이로신으로 치환(H145Y)되고, 상기 치환된 A22 Iraq의 VP1 부위 중 17번째 아미노산 아스파라긴 (Asn, N)이 아스파트산(Asp, D)으로 치환(N17D)된 것인, 구제역 O형 바이러스의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드.

3) 상기 재조합 플라스미드를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스.

4) 상기 재조합 바이러스는 구제역 A형 한국주 및 중동 표준주의 방어항원이 동시에 발현되는 것인, 재조합 구제역 바이러스.

5) (a) 구제역 O형 바이러스의 유전자를 재조합 벡터에 삽입하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 재조합 벡터에서 구제역 O형 바이러스의 P1 유전자를 A Pocheon/SKR/2010의 P1 유전자로 치환하는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 A Pocheon/SKR/2010의 P1 유전자 중 VP1 부위를 A22 Iraq의 VP1 유전자로 치환하는 단계;

(d) 상기 (c)단계의 재조합 벡터에서 구제역 O형 바이러스의 3B12 부위를 치환하는 단계;를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법.

6) 상기 (d)단계의 재조합 벡터에서 상기 치환된 A Pocheon/SKR/2010의 P1 유전자 중 VP2 부위의 145번째 아미노산 히스티딘을 타이로신으로 치환(H145Y)하고, 상기 치환된 A22 Iraq의 VP1 부위 중 17번째 아미노산 아스파라긴을 아스파트산으로 치환(N17D)하는 단계를 더 포함하는 것인, 재조합 벡터의 제조방법.

7) 상기에서 제조된 재조합 벡터를 세포에 도입하여 증식시키는 단계;를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.

8) 상기 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 예방용 백신 조성물.

9) 상기 재조합 구제역 바이러스를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 구제역의 예방 방법.

본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 구제역 O형 바이러스의 유전자 일부를 조작하여 동물에 병원성을 약화시킴으로써, 소독제 실험 또는 항바이러스 실험 등 실험실 내에서 다루기에 병원성 바이러스보다 더욱 안전하게 사용할 수 있는 장점을 지니고 있다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 하여 백신을 제작함으로써, 바이러스 역가가 원래의 바이러스와 크게 차이를 보이지 않으면서, 한국 주변에서 발생되는 동아시아, 중국 또는 대만 등에서 발생하는 바이러스 지역형뿐 아니라 중동지역에서 유행하는 바이러스까지 넓은 범위에 걸쳐 방어할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 항원의 환경 저항성을 유도하도록 제작하여 저항성이 있으며 야외주와의 감별진단도 가능하여 백신 제작에 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1는 구제역 A 혈청형 한국주 및 중동백신 표준주의 방어 항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스의 게놈 모식도를 나타낸 것이다.
도 2은 한국주(A Pocheon/SKR/2010)의 VP2, VP3, VP4 및 중동백신 표준주(A22 Iraq)의 VP1 방어 항원단백질을 코딩하는 유전자 염기서열이 삽입된 재조합 플라스미드의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 도 2의 플라스미드에서 환경저항성 인자 2개 부위 (VP1과 VP2의 내부 아미노산 VP2 H145Y, VP1 N17D)가 교체되고, 구제역 O Manisa의 3B1 과 3B2 부위가 A형의 3B3 및 SAT 형의 3B3로 교체된 플라스미드의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4은 확인된 rA Po-A22-3B 구제역 바이러스가 감염된 세포에서의 항원이 발현됨을 간이항원 키트 (SP 밴드는 밴드형성, NSP는 미형성)에 의해 확인한 것으로 NSP가 밴드가 미형성됨으로 해서 항원 및 혈청학적으로도 야외주와의 감별이 가능한 것이다.
도 5은 마우스에서의 7일 면역 후 (2.0~1.0 μg, 1/7.5~1/15 dose) 공격접종 실험 (A May97)을 통해서 마우스의 생존율 및 체중감소를 조사한 결과이다. 결과에 따르면 약 1.0 μg 정도면 A May97 바이러스의 방어에 문제없는 정도의 항원으로 확인되었다.
도 6은 마우스에서의 항원 dose 별로 7일 면역 후 (1.5~0.046 μg, 1/10~1/320 dose)공격접종 실험 (미얀마 1997년 분리주 A May97)을 통해서 마우스의 생존율을 조사한 결과이다. 이 결과에 따르면 0.046 μg (1/320 dose) 까지 희석된 백신을 접종하여도 A May97 바이러스에 대한 방어가 가능함을 확인하였다.
도 7은 마우스에서 시제 백신을 2개월간 4℃에서 보관 후 보존성 (안정성)을 측정하기위해 면역 후 (1.5 μg, 1/10 dose) 를 접종하고 3주 후 공격접종 생존율 및 체중 변화를 측정한 결과이다. 모두 생존하여 보존성이 인정되었다.
도 8은 기니픽에서 면역시험 (1차 후 2주 후 2차 접종 1주 후 채혈)을 통해 얻어진 혈청으로 면역된 항체에 대해 ELISA 항체수준 및 각 바이러스 별로 면역학적 상관성을 조사한 결과이다. A22, A Pocheon, A May97에서 유사한 중화항체형성을 보였다.
도 9은 소에서의 면역실험 (1차접종 후 3주 후 채혈)을 통해 면역학적 상관성 조사를 실시한 결과이다. 소의 경우도 기니픽의 경우와 비슷하게 A22, A Pocheon, A May97에서 유사한 수준의 중화항체형성을 보였다.
도 10은 돼지에서의 면역실험을 통해 확인된 항체 수준을 ELISA 및 중화시험법에 의해 평가한 것이다. 대조군인 3가 백신(O Mansia, A22 Iraq, Asia1 Shamir형 trivalent vaccine, 6PD50 이상) 보다 백신 항체의 ELISA 및 중화 항체가 더 잘 형성되었다.

본 발명은 구제역 O형 바이러스의 유전자를 포함하는, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 재조합 플라스미드에 관한 것으로서, 구제역 O형 바이러스의 P1 유전자가 A Pocheon/SKR/2010의 P1 유전자로 치환되고, 상기 치환된 P1 유전자 중 VP1 부위는 A22 Iraq의 VP1 유전자로 치환된 것이며, 상기 구제역 O형 바이러스는 3B 부위 중, 3B12 부위가 서열번호 10의 염기서열로 치환된 것인, 구제역 O형 바이러스의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드에 관한 것이다.

본 발명에서 "P1 유전자"는 P1 단백질을 코딩하는 염기서열로, VP1, VP2, VP3 및 VP4 부위를 포함할 수 있으며, 본 발명에서는 상기 부위는 단백질을 코딩하는 염기서열, 단백질을 코딩하지 않은 염기서열 및 유전자를 포함하는 개념으로 사용된다.

상기 구제역 O형 바이러스의 유전자는 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자인 것을 특징으로 한다. 상기 전체 유전자 부위 중에서 3B1 부위 및 3B2 부위 일부를 치환시킬 수 있다. 상기 3B1 및 3B2의 치환부위는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 본 발명의 재조합 플라스미드 중 6486 내지 6629bp 부위가 바람직하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "구제역 바이러스 O형 Manisa 주"는 O형 백신에서 가장 널리 쓰이는 백신 바이러스로서, O형 중 ME-SA(중동-남아시아형, PanAsia 지역형을 포함)에 대한 바이러스에 대해 방어가 가능한 것으로 알려져있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 의하면, 상기 본 발명의 재조합 플라스미드는 상기 치환된 A Pocheon/SKR/2010의 P1 유전자 중 VP2 부위의 145번째 아미노산 히스티딘이 타이로신으로 치환(H145Y)되고, 상기 치환된 A22 Iraq의 VP1 부위 중 17번째 아미노산 아스파라긴이 아스파트산으로 치환(N17D)된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명은 상기 재조합 플라스미드를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 바이러스는 구제역 A 혈청형 중 A형 한국주(A pocheon주) 및 A 22 중동 표준주의 방어항원이 동시에 발현되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명은

(a) 구제역 O형 바이러스의 유전자를 재조합 벡터에 삽입하는 단계;

(d) 상기 (c)단계의 재조합 벡터에서 구제역 O형 바이러스의 3B12 부위를 치환하는 단계;를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 벡터의 제조방법에 있어서, 상기 (d)단계의 재조합 벡터에서 상기 치환된 A Pocheon/SKR/2010 P1의 유전자 중 VP2 부위의 145번째 아미노산 히스티딘을 타이로신으로 치환(H145Y)하고, 상기 치환된 A22 Iraq의 VP1 부위 중 17번째 아미노산 아스파라긴을 아스파트산으로 치환(N17D)하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 재조합 벡터를 세포에 도입하여 증식시키는 단계;를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 선별 표지 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터 및 재조합 구제역 바이러스는 통상의 유전자조작법, 형질전환법에 의해 제조될 수 있으며, 적은 양으로 형성된 바이러스를 세포배양을 통한 연속 계대로 적절한 양의 바이러스를 수득할 수 있다.

본 발명의 세포는 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과 동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과, 토끼과, 설치류 및 영장류의 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포에서 유래된 것일 수 있고, 바람직하게는 염소 혀 세포 (ZZR) 및 햄스터 신장 세포 (BHK-21), 흑염소 신장세포(BGK), 돼지 신장세포 (IBRS-2) 및 소 신장세포 (LF-BK)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

\본 발명의 구제역 예방용 백신 조성물에 있어서, 상기 백신은 생백신, 약독화된 백신, 또는 사백신일 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 재조합 구제역 바이러스와 함께 구제역 감염의 예방 효과가 우수한 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 수크로오스 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 개체의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 구제역의 예방 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명의 내용을 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실험예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재조합 플라스미드 rA-Po-A22 의 제작

1. 재조합 플라스미드 pO-Manisa의 제작

구제역 O-Manisa 바이러스 전체 유전자(GenBank Accession No. AY593823.1)를 PCR에 의하여 증폭하고, 플라스미드(pBluescript SK II)에 O-Manisa 유전자를 삽입하여 재조합 플라스미드 pO-Manisa를 제작하였다.

2. 재조합 플라스미드 rA-Po-A22의 제작

상기 실시예 1-1에서 제조된 재조합 플라스미드(pO-Manisa) 중에서, 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자를 한국 지역형 바이러스 A/pocheon/SKR/2010 (GenBank Accession No.EF614458.1)의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환하여 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드(pOm-Apocheon-P1, 특허등록 10-1578444, 2015.10.23.)를 제조하였다.

실시예 1-2에서 제조된 pOm-Apocheon-P1을 기초로 하여 중동 백신 표준주인 A22주의 VP1 증폭을 위한 프라이머는 서열번호 2의 정방향 프라이머(5'-ACCACTACCACCGGGGAG-3') 및 서열번호 3의 역방향 프라이머(5'-TTGTTTTGCAGGTGCAATGATC-3')를 사용하였고, 벡터를 증폭시키기 위해 서열번호 4의 정방향 프라이머 (5'-CTTCTAAATTTTGACCTGCTCAAATTGGCGGG-3') 및 서열번호 5의 역방향 프라이머 (5'-TTGCGCACGGGGGTCAAT-3') 를 사용하여 증폭 후, A22 주의 VP1 유전자와 pOm-Apocheon-P1을 결착하여, 본 발명의 rA-Po-A22 플라스미드를 제조하였다.

이때, 상기 PCR은 하기와 같이 수행하였다. 5X 완충액 (FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs (1㎕), Phusion enzyme (2 U/㎕, 0.5 ㎕), 멸균증류수 (35.5 ㎕)의 용량으로 98℃에서 30초 후, 98℃에서 10초, 65℃에서 30초, 72℃에서 60초를 한 주기로 25주기로 PCR을 수행한 후, 최종 72℃에서 10분 동안 반응을 실시하였다. 그 후, 증폭된 P1 유전자와의 결찰반응 (TAKARA Long Ligation kit)을 수행하였으며, 최종적으로 전체 염기서열 분석을 통하여 적절히 클로닝(rA-Po-A22)된 것을 확인하였다. rA-Po-A22 플라스미드의 모식도는 도 2에 나타내었으며, pOm-Apocheon-P1의 VP1 부위가 A22주의 VP1 부위로 치환됨을 확인하였다.

실시예 2. 환경 저항성 플라스미드 pA-Po-A22-3B의 제작

환경저항성 플라스미드를 만들기 위해 실시예 1-2에서 제조된 rA-Po-A22 플라스미드 중에서, Apocheon의 VP2 유전자 중 H145Y 부위와 A22의 VP1 유전자 중 N17D 부위를 치환하여 재조합 유전자가 삽입된 환경저항성 플라스미드(pA-Po-A22-3B)를 제조하였다. 상기 H145Y 부위와 N17D 부위를 치환하기 위하여 서열번호 6의 APOC VP2 H145Y F(5-TCCCCTACCAGTTCATTAGCCCCA-3) 와 서열번호 7의 A22 N17D R (5-ACAGTGGTGGTGACAGGGTCTGCA-3)를 사용하여 PCR을 수행하였고, 벡터를 증폭시키기 위해 서열번호 8의 정방향 프라이머 (5'-ACAAGTCCAACGACGTCAGCACACCGA-3') 및 서열번호 9의 역방향 프라이머 (5'-ACAGGGTGAGCTGGTACTTTTCAC-3') 를 사용하여 증폭 후, 교체된 재조합 플라스미드를 결찰하여 VP2 H145Y AD VP1 N17D 의 유전자가 교체된 rA-Po-A22 를 제조하였다.

상기 VP2 H145Y AD VP1 N17D 의 유전자가 교체된 플라스미드의 3B 부위 (3B333)는 합성된 서열(144 bps, 서열번호 1에서 6486~6629bp 위치에 해당)로 3B1 및 3B2 부위를 제거한 후 A형의 3B3 및 SAT 형의 3B3로 합성하여 삽입하는 작업을 실시하였다.

일반적으로 cDNA 합성시 사용되는 랜덤 프라이머를 이용하여 O-Manisa 바이러스에 대한 cDNA 작성 후 전체 유전자가 클로닝 된 것을 기초로 O-Manisa 바이러스 유전자 정보를 기초로 3A의 끝부분 유전자 및 3B3의 시작 부위 유전자 증폭이 가능한 특이 프라이머들(GenBank Accession No. AY593823.1를 기초로 5' 및 3' 유전자의 각 20 mers씩에 해당)을 작성하여 PCR을 실시하였으며, PCR를 위한 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs (1㎕), Phusion enzyme (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균증류수 (35.5㎕)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25 사이클, 최종 72℃ 10분으로 반응을 실시하였다. 위에서 작성된 벡터와 합성된 유전자와의 결찰반응 (TAKARA Long Ligation kit)을 수행하였으며, 전체 염기서열 분석을 통하여 적절히 클로닝(rA-Po-A22)된 것을 확인하였다.

플라스미드	primer name	프라이머 염기서열	서열번호
rA-Po-Α22	O1m APOC A22 VP1 F	5- ACCACTACCACCGGGGAG -3	서열번호 2
	O1m APOC A22 VP1 R	5- TTGTTTTGCAGGTGCAATGATC -3	서열번호 3
	vector F	5- CTTCTAAATTTTGACCTGCTCAAATTGGCGGG -3	서열번호 4
	vector R	5- TTGCGCACGGGGGTCAAT -3	서열번호 5
rA-Po-Α22-3Β	O1m APOC VP2 H145Y F	5- TCCCCTACCAGTTCATTAGCCCCA-3	서열번호 6
	O1m A22 N17D R	5- ACAGTGGTGGTGACAGGGTCTGCA-3	서열번호 7
	vector F	5-ACAAGTCCAACGACGTCAGCACACCGA-3	서열번호 8
	vector R	5- ACAGGGTGAGCTGGTACTTTTCAC -3	서열번호 9

NSP 부위 조작	아미노산 서열	아미노산 크기	참고
3B12 deletion	GPYAGPLERQKPLRVKTKLPQQEGPYAGPMDRQKPLKVRARAPVVKE	47 aa	-
3B33 addition	GPYEGPVKKPVALKVKAKNLIVTEGPYEGPVKKPVALKVKAKAPIVTE	48 aa	A type and SAT type

실시예 3. 본 발명의 플라스미드를 이용한 재조합 구제역 바이러스의 제조

재조합 구제역 바이러스의 회복은 확보된 상기 재조합 플라스미드(pA-Po-A22-3B)를 제한효소로 반응시켜 유전자를 단일 조각편으로 작성하고, BHKT7-9 세포(T7 RNA polymerase가 발현되는 세포주)에 리포펙타민 형질전환 시약 (라이프 테크놀로지)을 이용하여 정제된 DNA를 형질도입하여 2 내지 3일 동안 배양 후, 형성된 재조합 바이러스를 확보하였다. 이후, 확보된 바이러스를 ZZ-R (염소 태아 혀)세포 또는 BHK-21 (어린 햄스터 신장) 세포에서 연속 계대를 통해 접종하여 바이러스를 증식시켰다. 이후, 세포변성 효과를 도 5에 나타내었다. 또한, 본 발명의 재조합 구제역 바이러스를 햄스터 세포주(BHK-21)에서 증식시킨 후, 염소 태아 혀 세포주(ZZ-R)에 감염시킨 후 바이러스 역가를 도 6에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 구제역 바이러스가 감염된 세포에서 재조합 바이러스가 재형성되어 형광 항체법으로 바이러스 감염의 검출이 가능함을 확인하였고, 세포를 변성시키는 효과가 있다는 것을 확인하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 구제역 바이러스가 염소 태아 혀 세포주(ZZ-R)에 감염된 경우, 바이러스 역가가 높음을 확인하였다.

실시예 4. 제작 백신의 동물에서의 면역원성

상술한 바와 같이 제작된 바이러스를 이용하여 동물실험을 위해서 정제한 구제역 바이러스 항원 (15 μg/dose) 0.5ml을 오일 아쥬반트 ISA206이 포함된 아쥬반트 0.5ml를 이용하여 혼합하여 이중오일로 작성하였다. 이렇게 제작된 백신을 마우스 (C57/BL6), 기니픽 (Hartley), 10-12주령 돼지, 6개월령 이상의 소 등 구제역 항체가 없는 동물을 이용하여 마우스는 0.1ml, 기니픽은 0.2ml, 돼지 및 소는 1ml를 접종하였다. 그 후 마우스에서는 각각 7~21일간 면역 후 공격접종하여 체중변화, 생존율 관찰하였으며, 기니픽, 돼지 및 소에서는 각 시기별 항체 측정을 위해 채혈하였고, A형 항체 측정을 위해서는 A형 SP-ELISA (Prionic 키트 자체 메뉴얼) 및 백신주를 이용하여 중화시험(OIE 메뉴얼 표준시험법 기준)을 실시하여 항체 수준을 결정하였다.

구제역 A형 혈청형의 광범위 방어항원 발현능을 보유하는 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스를 이용한 구제역 백신을 제공함으로써, 구제역의 치료 및/또는 예방에 기여할 수 있다.

<110> Animal and plant quaratine agency <120> Recombinant foot-and-mouth disease virus expressing protective antigen of type A, Korean and standard strains <130> 17-10708 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11099 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rA Po-A22-3B plasmid <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 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gcttcccctt ggtaacaagg acccacgggg ccaaaagcca cgtcctaccg 1500 gacccatcat gtgtgcaaac ccagcacggc aactttactg cgaaaaccac tttaaggtga 1560 cactgatact ggtactcaat cactggtgac aggctaagga tgcccttcag gtaccccgag 1620 gtaacacgcg acactcggga tctgagaagg ggactggggc ttctttaaaa gtgcccagtt 1680 taaaaagctt ctatgcctga ataggcgacc ggaggccggc gccttttcac tgttttacta 1740 ctgttttcat gaatacaact gactgtttca ccgccctgtt acacgctctc agagagatca 1800 aaacactgtt tcttttacgg acacaaggaa agatggaatt cacactttac aacggtgaga 1860 agaaaacctt ctactccaga cccaacaacc acgacaactg ctggcttaac accattctcc 1920 agttgttcag gtatgttgat gagcctttct ttgactgggt ctacgactcg cctgaaaacc 1980 tcactcttga ggcaatcaaa cagttggaag agacaaccgg tcttgagctg cacgagggtg 2040 gaccacccgc tctcgtcatc tggaacatca aacacttgct tcacaccgga atcggcactg 2100 cctcacgccc tagcgaggtg tgtatggtgg acggaacgga catgtgttta gctgattttc 2160 atgctggcat tttcctgaaa ggacaggaac atgctgtgtt cgcctgtgtc acctccaacg 2220 ggtggtacgc gattgatgac gaggactttt acccttggac accggacccg tccgacgttc 2280 tggtgtttgt cccgtacgat caagaaccgc ttaacggaga gtggaaaaca aaggtccaga 2340 aaaggctcaa gggggcaggg caatctagcc ctgccaccgg gtcacagaac cagtcaggca 2400 ataccggcag cattattaac aactactaca tgcagcagta ccagaactcc atggacacac 2460 aacttggtga caacgccatc agcggaggat ccaacgaggg gtccacggac acaacctcta 2520 cccacacaac caacacccaa aacaatgact ggttctcaaa actggcaagt tccgcgttca 2580 ccggtctttt cggcgcactg ctcgccgaca agaagaccga agagacaact cttctggagg 2640 accgtatcct caccactcgt aatggacaca ccacttctac aactcagtcg agtgtggggg 2700 tcacctacgg gtattcaact ggtgaggacc acgtttctgg acctaacaca tcaggtttgg 2760 agacgcgggt ggtacaagct gaaaggttct tcaagaagca cttgtttgat tggacgacgg 2820 acaaaccctt tggtcacgtt gaaaagctgg aacttcccac tgatcacaaa ggtgtctacg 2880 gacagctggt ggactccttt gcatacatga gaaatggctg ggacgtggag gtgtctgctg 2940 ttggcaacca gttcaacggc gggtgccttc tcgtggccat ggtacctgag tttaaggagt 3000 tcaccacacg tgaaaagtac cagctcaccc tgttccccta ccagttcatt agccccagaa 3060 ccaacatgac cgcgcacatc acggtcccgt accttggtgt gaacaggtat gaccagtaca 3120 acaaacacaa 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agactacggc ggtgagacac aagtccaacg acgtcagcac accgacgtta 4020 ctttcataat ggacagattt gtaaagatac aaaacttgaa ccccacacat gtcattgacc 4080 tcatgcaaac ccaccaacac gggttggtag gtgccctgtt acgtgctgct acgtactact 4140 tctctgacct ggagattgtg gtacgccatg acggtaacct aacctgggta cccaatggag 4200 cacccgaggc agctctgtct aacacgggca accccaccgc ctacctcaag gcaccattta 4260 cgaggctcgc gctcccctac accgcgccac accgcgtgtt ggcaacagtg tacaacggga 4320 cgagcaagta ctccgcaggt ggtacgggca gacggggcga cctagggcct ctcgcggcga 4380 gggtcgccgc tcagcttcct gcttctttca actttggtgc aattcaagcc acgaccatcc 4440 acgagctcct cgtgcgcatg aagcgtgccg aactctactg ccccagacca ctgttggcag 4500 tggaggtgtc gtctcaagac agacacaaac agaagatcat tgcacctgca aaacaacttc 4560 taaattttga cctgctcaaa ttggcgggag atgtggagtc caaccctggg cccttcttct 4620 tctccgacgt caggtcaaat ttctcaaaac tggtagaaac catcaatcag atgcaggagg 4680 acatgtcaac aaaacacggg cctgacttta accggttggt gtccgcattt gaggaattgg 4740 ccactggagt gaaggctatc agggccggtc tcgacgaggc caaaccctgg tacaaactca 4800 tcaagctcct gagccgcttg tcgtgcatgg ccgctgtagc agcacggtca aaggacccag 4860 tccttgtggc catcatgctg gctgacaccg gtcttgagat tctggacagc acctttgtcg 4920 tgaagaagat ctccgactcg ctctccagtc tctttcacgt gccggccccc gtcttcagtt 4980 tcggagcccc gattctgttg gccgggttgg tcaaagtcgc ctcgagtttc ttccggtcca 5040 cacccgaaga ccttgagaga gcagaaaaac agctcaaagc acgtgacatt aacgacatat 5100 tcgccattct caagaacggc gagtggctgg tcaagctgat ccttgccatc cgcgactgga 5160 tcaaagcgtg gatcgcctca gaagaaaagt ttgtcaccat gacggacttg gtgcctggta 5220 tccttgaaaa gcagcgggat ctcaacgacc cgagtaagta caaggaagcc aaggagtggc 5280 tcgacaacgc gcgccaggcg tgtttgaaga gcgggaacgt tcacattgcc aatttgtgca 5340 aagtggtcgc cccggcaccc agcaagtcga gacccgaacc cgtggtcgtt tgcctccgcg 5400 gcaaatccgg ccaggggaag agtttccttg cgaacgtgct cgcgcaagca atctccaccc 5460 acttcaccgg cagaactgat tcggtttggt actgcccgcc tgaccctgac cacttcgacg 5520 gttacaacca gcagaccgtt gtcgtgatgg acgatttggg ccagaacccc gatggcaagg 5580 acttcaagta cttcgcccag atggtttcga ccacggggtt catcccgccc atggcctcgc 5640 ttgaggacaa aggcaagcct ttcaacagca aagtcatcat tgctaccacc aacctgtact 5700 cgggtttcac cccgagaaca atggtgtgtc ctgacgcgct gaaccggagg ttccactttg 5760 acatcgacgt gagtgccaag gacgggtaca aagttaacaa caaattggac ataatcaaag 5820 ctcttgaaga cacccacacc aacccagtgg cgatgttcca atacgactgt gcccttctaa 5880 acggtatggc agttgaaatg aagagaatgc aacaggatat gttcaagcct caaccacccc 5940 tccagaacgt gtaccaactc gttcacgagg tgattgaacg ggtcgagctc cacgagaagg 6000 tgtcgagcca cccgattttc aaacagatat caattccttc ccaaaagtct gtgttgtact 6060 tcctcattga gaaaggccaa cacgaagcag caattgaatt ctttgaggga atggtgcatg 6120 actccatcaa ggaagagctc cggcccctca tccaacagac ctcatttgtg aaacgcgctt 6180 ttaagcgcct gaaggaaaac tttgagactg ttgccctgtg tttgactctt ttggcaaaca 6240 tagtgatcat gatccgcgag actcgcaaga gacaacagat ggtggacgat gcagtgaatg 6300 actacattga gaaggcaaac atcaccacag atgacaagac tcttgacgag gcggaaaaga 6360 accctctaga gaccagcggt gccagcacta ttggtttcag agagagaact ctcccggggc 6420 acaaggcgag cgatgacgtg agctccgagc ccgccaaacc cgtggaggac cgaccacaag 6480 ctgaaggacc ttacgaggga ccggtgaaga agcctgtcgc tttgaaagtg aaagctaaga 6540 acttgattgt cactgagggg ccatatgaag gaccagtgaa gaaacctgtc gctttgaaag 6600 tgaaagcaaa agccccgatt gtcactgaag gaccctacga gggaccggtg aagaagcctg 6660 tcgctttgaa agtgaaagcc aagaacttga ttgtcactga gagtggtgcc ccaccgaccg 6720 acttgcagaa gatggtcatg ggcaacacta agcctgttga gctcatcctc gacgggaaga 6780 cggtagccat ctgctgtgct accggagtgt ttggcactgc ctacctcgta cctcgtcacc 6840 tcttcgcgga gaagtacgac aagataatgt tggacggtag agccatgaca gacagtgact 6900 acagagtgtt tgagtttgag attaaagtaa aaggacagga catgctctca gacgctgcac 6960 tcatggtgct tcaccgtggg aaccgcgtga gagacatcac gaaacatttt cgtgacacag 7020 caagaatgaa gaaaggcacc cccgttgtcg gtgtgatcaa caacgccgac gttgggagac 7080 tgattttctc tggagaggcc cttacctaca aagacattgt agtgtgcatg gatggagaca 7140 ccatgccggg cctgtttgcc tacagagccg ccaccaaggc tggttactgc gggggagccg 7200 ttctcgccaa ggacggagcc gacacattca tcgttggcac ccactccgca ggtggtaacg 7260 gagttggata ctgctcgtgc gtgtccaggt ccatgctcct gaaaatgaag gcacacattg 7320 accctgaacc acaccacgag gggttgattg ttgataccag agatgtggaa gagcgcgtgc 7380 atgtcatgcg taaaaccaag cttgcaccca ccgtggcaca cggtgtgttt aaccctgaat 7440 ttggtcccgc tgccttgtcc aacaaggacc cgcggctgaa cgaaggggtt gtcctcgatg 7500 aagtcatctt ctccaaacac aagggagaca cgaaaatgtc tgaggaggac aaagcgctgt 7560 tccgccgctg cgctgccgac tacgcgtcgc acttgcacag cgtgctgggg acggcaaatg 7620 ccccattgag catctatgag gccatcaaag gcgtcgacgg gctcgatgcc atggagccgg 7680 acaccgcgcc cggcctcccc tgggccctcc aggggaaacg ccgtggtgcg ttgattgact 7740 tcgagaacgg cacggtcgga cccgaagtcg aggctgccct aaagctcatg gagaaaagag 7800 agtacaaatt tgcttgccag accttcctga aagacgagat tcgtccgatg gaaaaagtac 7860 gtgctggcaa gactcgcatt gtcgacgttt tgcccgtgga acacattctt tacaccagga 7920 tgatgattgg cagattctgt gctcaaatgc acacaaacaa tggaccgcag attggctcag 7980 cggtcggttg caatcctgat gttgattggc aaagatttgg cacacatttt gctcagtaca 8040 gaaacgtgtg ggatgtggac tattcggcct ttgatgctaa ccactgcagt gacgcaatga 8100 acatcatgtt tgaggaggta tttcgcacag acttcggttt ccacccaaat gctgagtgga 8160 ttctgaagac tcttgtgaac acggagcacg cctatgagaa caaacgtatc actgttgagg 8220 gcgggatgcc gtctggctgt tccgcgacaa gcatcatcaa cacaattttg aacaacattt 8280 atgtgctcta cgctcttcgt agacactatg agggagttga gctggacacc tacaccatga 8340 tctcctacgg agatgacatc gtggttgcaa gtgactacga tctggatttt gaggctctca 8400 aaccccactt caaatctctt ggtcaaacca tcactccagc tgacaaaagc gacaaaggtt 8460 ttgttcttgg tcactccatt accgatgtca ctttcctcaa aagacacttc cacatggact 8520 atggaactgg gttttacaaa cctgtgatgg cctcaaagac cctcgaggcc attctctcct 8580 ttgcacgccg tgggaccata caggagaagt tgatctccgt ggcaggactc gccgtccact 8640 caggacctga cgagtaccgg cgtctctttg agcccttcca gggtctcttc gagattccaa 8700 gctacagatc actttacctg cgttgggtga acgccgtgtg cggtgacgca taatccctca 8760 gatgtcacaa ttggcagaaa gactctgagg cgagcgacgc cgtaggagtg aaaagcccga 8820 aagggctttt cccgcttcct attccaaaaa aaaaaaaaaa aaactagttc tagagcggcc 8880 gccaccgcgg tggagctcca gcttttgttc cctttagtga gggttaattg cgcgcttggc 8940 gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa 9000 catacgagcc 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agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 9900 ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 9960 tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 10020 atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 10080 aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 10140 ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 10200 tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 10260 ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 10320 tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 10380 aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt 10440 gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 10500 tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 10560 cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 10620 tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 10680 ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 10740 cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 10800 actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 10860 ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 10920 aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 10980 ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 11040 atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccac 11099 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of O1m APOC A22 VP1 <400> 2 accactacca ccggggag 18 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for O1m APOC A22 VP1 <400> 3 ttgttttgca ggtgcaatga tc 22 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for rA-Po-A22 vector <400> 4 cttctaaatt ttgacctgct caaattggcg gg 32 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for rA-Po-A22 vector <400> 5 ttgcgcacgg gggtcaat 18 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for O1m APOC VP2 H145Y <400> 6 tcccctacca gttcattagc ccca 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for O1m A22 N17D <400> 7 acagtggtgg tgacagggtc tgca 24 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for rA-Po-A22-3B vector <400> 8 acaagtccaa cgacgtcagc acaccga 27 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for rA-Po-A22-3B vector <400> 9 acagggtgag ctggtacttt tcac 24

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 구제역 O형 바이러스의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드.
제1항에 있어서, 상기 구제역 O형 바이러스의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드는 구제역 O형 바이러스의 P1 유전자가 A Pocheon/SKR/2010의 P1 유전자로 치환되고,
상기 치환된 P1 유전자 중 VP1 부위는 A22 Iraq의 VP1 유전자로 치환된 것이며,
상기 구제역 O형 바이러스는 3B 부위 중, 3B12 부위가 치환된 것인, 구제역 O형 바이러스의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드.
제2항에 있어서, 상기 치환된 A Pocheon/SKR/2010 P1 유전자 중 VP2 부위의 145번째 아미노산 히스티딘이 타이로신으로 치환(H145Y)되고, 상기 치환된 A22 Iraq의 VP1 부위 중 17번째 아미노산 아스파라긴이 아스파트산으로 치환(N17D)된 것인, 구제역 O형 바이러스의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드.
제1항의 재조합 플라스미드를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스.
제4항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 A형 한국주 및 중동 표준주의 방어항원이 동시에 발현되는 것인, 재조합 구제역 바이러스.
(a) 구제역 O형 바이러스의 유전자를 재조합 벡터에 삽입하는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 재조합 벡터에서 구제역 O형 바이러스의 P1 유전자를 A Pocheon/SKR/2010의 P1 유전자로 치환하는 단계;
(c) 상기 (b)단계의 A Pocheon/SKR/2010의 P1 유전자 중 VP1 부위를 A22 Iraq의 VP1 유전자로 치환하는 단계;(d) 상기 (c)단계의 재조합 벡터에서 구제역 O형 바이러스의 3B12 부위를 3B33 부위로 치환하는 단계;를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 (d)단계의 재조합 벡터에서 상기 치환된 A Pocheon/SKR/2010 P1 유전자 중 VP2 부위의 145번째 아미노산 히스티딘을 타이로신으로 치환(H145Y)하고, 상기 치환된 A22 Iraq의 VP1 부위 중 17번째 아미노산 아스파라긴을 아스파트산으로 치환(N17D)하는 단계를 더 포함하는 것인, 재조합 벡터의 제조방법.
제6항 또는 제7항에서 제조된 재조합 벡터를 세포에 도입하여 증식시키는 단계;를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 세포는 염소 태아 혀 세포(ZZ-R) 및 햄스터 신장 세포(BHK-21) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
제4항 또는 제5항의 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 예방용 백신 조성물.
제10항에 있어서, 상기 백신은 생백신, 약독화된 백신, 또는 사백신인 것인, 구제역 예방용 백신 조성물.
제4항 또는 제5항의 재조합 구제역 바이러스를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 구제역의 예방 방법.