KR101629282B1 - 구제역 아시아1 혈청형 유전형 v 바이러스의 방어항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

Description

구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법{Foot and mouth disease virus expressing P1-protective antigen of Asia1 type, V genotype and the manufacturing method}

본 발명은 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

구제역(Foot-and-mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스 수포성 질병으로 빠른 복제와 빠른 전파력이 특징이다. 이 질병은 그 경제적 중요성으로 인하여 세계동물보건기구(OIE)에 의하여 국가간 전파가 가능한 매우 중요한 동물질병으로 분류되어 있으며, 이러한 특성 때문에 축산물의 국가간 교역에 있어 발생유무는 가장 중요한 점검요소로 작용하고 있다.

상기 구제역 병원체는 단일가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데(Piconaviridae)과, 아프소바이러스(Aphthovirus)속에 속하며 7개의 다른 혈청형(A, O, C, Asia1, SAT 1, SAT2, SAT3)으로 분류되고 있다 (한국공개특허 제10-2011-0038380).

구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus) O형 중에서도 약 8가지 이상의 여러 지역형이 있다 (대한수의사학회지 제48권제12호, pp. 702-724, 2012). 엄격하게 개발한다면 이러한 지역형에 대한 백신을 모두 개발하여 백신주로 사용하여야 하지만, 모든 백신주 개발을 위해서는 야외주를 지속적으로 세포에 배양하여 적절한 증식력을 지녀야 한다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되고 결과가 좋으리라는 보장도 없다.

또한, 구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus)는 대부분 동물에 병원성을 나타내는 병원체이다. 여러번의 계대 등 여러 연구자들의 시도에서도 병원성이 유지되기 때문에 현재까지 구제역바이러스에 대한 병원성이 줄어든 약독화 백신으로 사용되는 것은 국제적으로는 금기시된 일이다.

구제역에 대해 약독화 바이러스를 사용하는 것은 병원성의 회복에 대한 문제점을 안고 있으며 또한 생독백신을 사용하면 야외 감염된 구제역 바이러스와 구분이 어려운 단점이 있어 구제역 발생시 효과적으로 접종하여 방역하는 체계를 구축하기 어렵다.

따라서, 기존의 백신 바이러스를 이용하여 필요로 하는 백신주를 신속하게 개발하여 사용할 수 있도록 적절한 시기에 제작 가능한 형태로 만들어져야 할 것이다.

구제역 바이러스 O형 Manisa 주는 O형 백신에서 가장 널리 쓰이는 백신 바이러스로 알려져 있고, ME-SA(중동-남아시아 지역형, PanAsia 지역형을 포함)에 대한 바이러스에 대한 방어가 가능하다.

그러나, 우리나라 주변에는 O형 이외에도 아시아1 형 및 A형의 발생이 있는데, 상기 아시아1 혈청형은 유전형은 group I-VI로 구분되어 분류할 수 있다. 상기 아시아1 혈청형은 아시아 지역에만 국한되어 발생한다고 하나, 2000년에 터키 및 그리스에 상기 바이러스가 전파되었을 뿐만 아니라, 최근 아시아1 혈청형의 발생 증가가 보고되고 있다 (Korean J. Vet. Serv. 32(4) : 315~323 (2009)).

최근 동아시아 지역에 발생되어 복잡하게 진행 중으로서, 아프가니스탄, 인도, 이란, 말레이시아, 네팔, 파키스탄 및 태국 등의 동남아시아에서 발생하였는데 2004년 말에서 2006년을 통하여 아시아1 혈청형 바이러스는 중국의 자치구, 미얀마, 몽골, 동러시아, 타지키스탄, 베트남 등지에서 발생하였다 (Korean J. Vet. Serv. 32(4) : 315~323 (2009)).

2005년 이후 중국을 비롯한 동아시아에서 발생한 아시아1 혈청형 유전형 V는 인도에서 25년 전에 분리된 바이러스와 밀접하게 유전적으로 관련성이 있는 바이러스로 확인되었고, 또한 2009년 바레인에서 발생된 아시아1형 바이러스는 인도에서 온 것으로 추정되고 있는 유전형으로서, 우리나라 주변에 유전형 V가 발생하고 있으므로 (Korean J. Vet. Serv. 32(4) : 315~323 (2009)), 이들 바이러스에 대한 백신의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명자들은 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스에 대해 적절하게 방어하기 위하여, 구제역 바이러스 O manisa 백신주의 유전자 전체 게놈을 플라스미드에 클로닝한 바이러스 벡터를 기초로, O manisa 백신주의 전체 유전자가 삽입된 벡터 내의 구조 단백질을 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스(Asia1/MOG/2005)의 구조 단백질 유전자로 치환시켜 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스에 대해 방어할 수 있는 방어 단백질을 발현하는 새로운 재조합 구제역 바이러스를 제공할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 한국 주변지역에서 유행하는 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스(Asia1/MOG/2005)의 P1 유전자가 삽입됨으로써, 상기 Asia1/MOG/2005에 대한 방어능을 구비하여 백신 종독주로 유용하게 사용될 수 있는 재조합 구제역 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 한국 주변지역에서 유행하는 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스에 대한 방어능을 구비하여 백신 종독주로 유용하게 사용될 수 있는 상기 재조합 구제역 바이러스의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서, 적어도 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 진뱅크 억세션 넘버 EF614458.1의 염기서열을 갖는 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된, 서열번호 1의 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계, (2) 상기 (1) 단계에서 얻은 플라스미드에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자를, 진뱅크 억세션 넘버 EF614458.1의 염기서열을 갖는 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환시켜, 서열번호 1의 재조합 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 구축하는 단계, 및 (3) 상기 (2) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 구제역 바이러스 O Manisa의 유전자 일부를 조작하여 동물에 병원성을 약화시킴으로써, 소독제 실험 또는 항바이러스 실험 등 실험실 내에서 다루기에 병원성 바이러스보다 더욱 안전하게 사용할 수 있는 장점을 지니고 있다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 바이러스 역가가 원래의 바이러스와 크게 차이를 보이지 않으면서, 한국, 동아시아, 중국 또는 대만 등에서 발생하는 바이러스 지역형을 효과적으로 방어할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.

도 1은 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드(pO-Manisa)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스의 게놈 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 단백질 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드(pOm-AsMOG-P1)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 간이 항원 킷트를 이용하여 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스에서 발현된 단백질이 구제역 항원 양성 반응을 보임을 나타낸 것이다.
도 5는 구제역 바이러스가 감염된 세포에서의 바이러스 감염세포(형광항체법 검출) 및 세포변성효과를 보여주는 사진이다.
도 6은 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스가 염소 태아 혀 세포주(ZZ-R) 및 햄스터 세포주(BHK-21)에서 자라서 바이러스 역가를 형성함을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서, 적어도 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 진뱅크 억세션 넘버(GenBank Accession No.) EF614458.1의 염기서열을 갖는 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스에서, 상기 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스에서, 상기 재조합 바이러스는 상기 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스에서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 (1) 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계, (2) 상기 (1) 단계에서 얻은 플라스미드에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자를, 진뱅크 억세션 넘버 EF614458.1의 염기서열을 갖는 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환시켜, 서열번호 1의 재조합 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 구축하는 단계, 및 (3) 상기 (2) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에 관한 것이다.

상기에서 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계는 통상적으로 유전자를 플라스미드에 삽입하는 방법을 이용할 수 있으면 족하므로, 이에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에서, 상기 (2) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하는 상기 (3) 단계에서의 세포는 염소 태아 혀 세포(ZZ-R) 및 어린 햄스터 신장 세포(BHK-21) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에서, 상기 재조합 바이러스는 상기 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스를 포함하는 구제역 예방용 백신에 관한 것이다.

본 발명의 상기 백신은 약독 생백신이거나 불활화된 백신일 수 있고, 상기 백신을 제조하는 방법은 통상적인 백신의 제조방법을 이용할 수 있으면 족하므로, 이에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.

이하 본 발명의 내용을 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기의 실험예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 재조합 플라스미드 pO-Manisa의 제작

구제역 O-Manisa 바이러스 전체 유전자(GenBank Accession No. AY593823.1)를 PCR에 의하여 증폭하고, 플라스미드(pBluescript SK II)에 O-Manisa 유전자를 삽입하여 재조합 플라스미드 pO-Manisa를 제작하였다.

상기에서, PCR 증폭은 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

일반적으로 cDNA 합성시 사용되는 랜덤 프라이머를 이용하여 O-Manisa 바이러스에 대한 cDNA 작성후 이것을 이용하여 O-Manisa 바이러스 유전자 정보를 기초로 증폭이 가능한 특이 프라이머들(GenBank Accession No. AY593823.1를 기초로 5' 및 3' 유전자의 각 20 mers씩에 해당)를 작성하여 PCR을 실시하였으며, PCR를 위한 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs (1㎕), Phusion enzyme (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균증류수 (35.5㎕)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25 싸이클, 최종 72℃ 10분으로 반응을 실시하였다.

또한, 전체 유전자중 (GenBank Accession No. AY593823.1)의 일반적으로 널리 사용되는 in vitro mutagenesis 법을 이용하여 일부 유전자 3B 부위가 치환(3B 부위중 22-36 bp 위치, gagcgtcagaaacct )과 결손(3B 부위중 37-105 bps부위, ctgagagtga aaaccaagtt gccacaacag gagggaccct acgctggccc gatggataga cagaaaccg을 삭제)시킨 재조합 플라스미드 pO-Manisa-3B2d를 제작하였다.

도 1은 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드(pO-Manisa)의 모식도를 나타낸 것이다.

<실시예 2> P1 부위가 치환된 재조합 구제역 바이러스의 제조

상기 실시예 1에서 제작한 재조합 플라스미드(pO-Manisa-3B2d) 중에서, 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자를 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스인 Asia1/MOG/2005 바이러스(GenBank Accession No. EF614458.1의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환하여, 재조합 유전자가 삽입된 서열번호 1의 플라스미드(pOm-AsMOG-P1)를 제작하였다.

상기 P1 단백질을 코딩하는 유전자는 다음과 같이 실시하여 치환시켰다.

서열번호 2의 정방향 프라이머(5'-GGAGCCGGGCAATCCAGTCCGGCGACC-3') 및 서열번호 3의 역방향 프라이머(5'-CTGTTTCTCAGGTGCAATGATCTCCTG-3')를 이용하여, Asia1/MOG/2005 바이러스(GenBank Accession No. EF614458.1의 P1 유전자를 PCR에 의하여 증폭시켰다.

이때, 상기 PCR 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs (1㎕), Phusion enzyme (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균증류수 (35.5㎕)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 60초간 25 싸이클, 최종 72℃ 10분으로 반응을 실시하였다.

서열번호 4의 정방향 프라이머(5'-CTTCTAAATTTTGACCTGCTCAAATTGGCGGG-3') 및 서열번호 5의 역방향 프라이머(5'-CTTGAGCCTTTTCTGGACCTTTGTTTTCCAC-3')를 이용하여, Omanisa 유전자에서 P1 유전자가 제거된 벡터를 PCR에 의하여 증폭시켰다.

이때, 상기 PCR 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs (1㎕), Phusion enzyme (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균증류수 (35.5㎕)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25 싸이클, 최종 72℃ 10분으로 반응시켰다.

그 후, 증폭된 P1 유전자와의 결찰반응 (TAKARA Long Ligation kit)을 수행하였으며, 최종적으로 전체 염기서열 분석을 통하여 적절히 클로닝(pOm-AsMOG-P1)된 것을 확인하였다.

재조합 구제역 바이러스의 회복은 확보된 상기 재조합 플라스미드(pOm-AsMOG-P1)를 제한효소로 반응시킨 뒤, BHKT7-9 세포(T7 RNA polymerase가 발현되는 세포주)에서 바이러스를 확보한 후, ZZ-R(염소 태아 혀) 세포 및 BHK-21(햄스터 세포주)에서 증식시키고, BHK-21 세포에서 세포 변성 효과를 확인하였다.

도 2는 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스의 게놈 모식도로서, pOm-AsMOG-P1은 구제역 바이러스 O형 Manisa 전체 유전자에서 3B 부위의 일부가 결실되고, 방어 항원 P1 부위가 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스(Asia1/MOG/2005)의 P1 부위로 치환된 모식도를 나타낸 것이다.

도 3은 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 단백질 유전자가 삽입된 플라스미드의 모식도를 나타낸 것이다.

도 3은 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 단백질 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드(pOm-AsMOG-P1)의 모식도를 나타낸 것이다.

도 4는 간이 항원 킷트를 이용하여 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스에서 발현된 단백질이 구제역 항원 양성 반응을 보임을 나타낸 것이다. 회복된 바이러스 배양 상층액 25㎕를 간이항원키트(PBM Co. Ltd.)로 구제역에 대한 구조 단백질(SP)에 대한 양성반응을 확인할 수 있다.

도 5는 구제역 바이러스가 감염된 세포에서의 바이러스 감염세포(형광항체법 검출) 및 세포변성효과를 보여주는 사진이다. 실험실에서 회복되어 재형성된 바이러스가 세포에 감염되어 형광항체법으로 바이러스의 감염을 검출가능하였고, 세포를 변성시키는 효과도 보였다.

도 6은 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스가 염소 태아 혀 세포주(ZZ-R) 및 햄스터 세포주(BHK-21)에서 자라서 바이러스 역가를 형성함을 보여주는 그래프이다. 도 6을 참조하면, 본 발명의 재조합 구제역 바이러스는 야외 바이러스와 유사한 바이러스 역가를 나타냄을 알 수 있다.

상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예 및 시험예를 참조하여 설명하였지만 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원 발현능을 보유하는 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스를 이용한 구제역 백신을 제공함으로써, 구제역의 치료 및/또는 예방에 기여할 수 있다.

<110> Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency <120> Foot and mouth disease virus expressing P1-protective antigen of Asia1 type, V genotype and the manufacturing method <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11019 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pOm-AsMOG-P1 <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg gccagtgagc atatgtaata cgactcacta tagggttgaa agggggcgct 660 agggtctcac ccctagcatg ccaacgacag ctcctacgtc gcactccaca ctaacgtttg 720 tgtgcgcgcg ggaaccgatg gacttttgtt cacccaccta cagttggact cacggcaccg 780 cgtggccatt ttagctgggt tgtgcggacg aacactgctt gcgcatctcg cgtgaccggt 840 tagtactctt accactatcc gcctacttgg tcgttagcgc tgtcctgggc actcttgttg 900 ggggctgttc aacgctctac ggtctcccct gcgtaacaga ctacggtgtt ggggccgctt 960 cgtgcgagcc gatcgcttgg tgtgcctcgg ctgtcgcccg aagcccgcct ttcacccccc 1020 cccccccccc ccccctaggt tttaccgtcg ttcccgacgt taatggggaa acaaccacaa 1080 gcttaacacc gtcttgcccg acgtaaaagg gctgcaacca aaaagcttgt gccgcctttc 1140 ccggcgttaa tgggaggtaa ccacaagaca aaccttcacc cggaagtaaa acggcaactt 1200 cacacagttt tgcccgtttt cgtgagaaat gggccgtcaa cgcacgaaac gcgccgtcgc 1260 ttgaggagga cttgtacaaa cacgatctat gcaggtttcc acaactgaca caaaccgtgc 1320 aacttgaaac cccgcctggt ctttccaggt ctagaggggc gacattttgt actgtgcttg 1380 actccacgct cggtccacta gcgagtgtta gtagtagcac tgttgcttcg tagcggagca 1440 tgatggccgt gggagcttcc ccttggtaac aaggacccac ggggccaaaa gccacgtcct 1500 accggaccca tcatgtgtgc aaacccagca cggcaacttt actgcgaaaa ccactttaag 1560 gtgacactga tactggtact caatcactgg tgacaggcta aggatgccct tcaggtaccc 1620 cgaggtaaca cgcgacactc gggatctgag aaggggactg gggcttcttt aaaagtgccc 1680 agtttaaaaa gcttctatgc ctgaataggc gaccggaggc cggcgccttt tcactgtttt 1740 actactgttt tcatgaatac aactgactgt ttcaccgccc tgttacacgc tctcagagag 1800 atcaaaacac tgtttctttt acggacacaa ggaaagatgg aattcacact ttacaacggt 1860 gagaagaaaa ccttctactc cagacccaac aaccacgaca actgctggct taacaccatt 1920 ctccagttgt tcaggtatgt tgatgagcct ttctttgact gggtctacga ctcgcctgaa 1980 aacctcactc ttgaggcaat caaacagttg gaagagacaa ccggtcttga gctgcacgag 2040 ggtggaccac ccgctctcgt catctggaac atcaaacact tgcttcacac cggaatcggc 2100 actgcctcac gccctagcga ggtgtgtatg gtggacggaa cggacatgtg tttagctgat 2160 tttcatgctg gcattttcct gaaaggacag gaacatgctg tgttcgcctg tgtcacctcc 2220 aacgggtggt acgcgattga tgacgaggac ttttaccctt ggacaccgga cccgtccgac 2280 gttctggtgt ttgtcccgta cgatcaagaa ccgcttaacg gagagtggaa aacaaaggtc 2340 cagaaaaggc tcaagggagc cgggcaatcc agtccggcga ccgggtcgca gaaccagtca 2400 ggcaacactg gaagcatcat taacaactac tacatgcagc agtaccagaa ctccatggac 2460 acgcaacttg gagataacgc tatcagcgga ggctccaacg agggttccac ggacaccaca 2520 tccacacaca caaacaacac ccaaaacaat gattggttct cacgcttggc cagttcggcc 2580 tttagcggac tgtttggtgc tcttttggct gacaagaaaa cggaggagac aactctgctt 2640 gaagaccgca tactcaccac cagaaatggc cacacgacgt cgacgacaca gtcgagtgtt 2700 ggcgtaacat atggttacgc tgtggctgag gacgcggtat ctgggcctaa cacctcaggc 2760 ctggagaccc gcgtgacaca ggctgaacgg ttcttcaaga aacacctgtt tgactggacg 2820 ccggatttgt catttggaca ctgtcactac ttggaactcc cctctgaaca caagggcgtg 2880 tttggcagcc tcatgagctc ttatgcttac atgaggaacg ggtgggacat tgaggtgacc 2940 gctgttggaa atcagttcaa tggtggttgt ctcctcgtcg cactcgtgcc ggagctgaaa 3000 gagctcgaca cgcggcagaa gtatcagtta accctcttcc cacaccagtt cattaacccg 3060 cgcactaaca tgacggctca cattaacgtg ccgtacgtgg gtgtcaacag gtacgaccag 3120 tacgagctcc acaaaccgtg gacgcttgtg gtgatggtgg tggccccgct taccgtcaaa 3180 actggtggtt ctgaacagat caaggtttac atgaatgcag cgccgaccta cgtgcacgtg 3240 gcaggagaac tgccctcgaa agaggggata gttcctgtgg cgtgtgtgga cggttacggc 3300 aacatggtaa ccacggaccc gaagacggct gaccccgtct acgggaaagt gtctaacccc 3360 cccagaacaa gcttccctgg gcgcttcaca aacttccttg atgtagcgga ggcgtgtcca 3420 accttcctcc gcttcggaga agtaccattt gtgaagacgg tgaactctgg tgaccgcttg 3480 cttgccaagt ttgacgtgtc cctcgctgcg gggcacatgt ccaacaccta cttggcaggt 3540 ttggcacagt actacacaca gtacagcggc actatgaata tccacttcat gttcactgga 3600 cccacggatg ccaaagcccg ctacatggtg gcttacatac ctcctggtat gacaccgcca 3660 acggacccgg agcgggctgc acactgcatt cattctgagt gggacactgg actcaattct 3720 aaatttacct tttctatccc ttacctttct gctgcagact atgcttacac tgcttctgac 3780 gtggctgaga ccacgagtgt gcagggatgg gtgtgtattt accagatcac ccacggtaaa 3840 gctgaaggtg acgcgctggt cgtgtccgtc agcgctggca aggactttga gtttcgactg 3900 ccggtggatg cccgccaaca gactaccacc actggcgagt ccgcggaccc agtcaccacc 3960 acggttgaga actacggagg agagacccag acggcccgac ggcttcacac tgatgtcgcc 4020 ttcgttctcg acaggttcgt gaaactcacc cagcccaaga gcacccaaac ccttgatctc 4080 atgcagatcc cctcacacac actggtcggg gcgcttctcc ggtctgcgac gtactacttc 4140 tcagacctgg aggttgcgct cgtccacaca ggaccggtca cgtgggtgcc caatggtgcg 4200 cccaagaccg ccttgaacaa ccacaccaac ccgactgcct accagaagca gcctatcacc 4260 cgcttggcac tcccctacac cgctccccac cgtgtgctgt caacagtgta caacgggaag 4320 acaacgtacg gagaagaatc ctcgcggcgt ggtgatcttg ccgccctcgc acgcagagtg 4380 aacaaccggc tgcccacttc cttcaactac ggcgctgtga aggccgacac catcacggag 4440 ctgttgatcc gcatgaagcg tgcggaaaca tactgcccca gacccttgct ggctcttgac 4500 accacacaag accgccgtaa acaggagatc attgcacctg agaaacagct tctaaatttt 4560 gacctgctca aattggcggg agatgtggag tccaaccctg ggcccttctt cttctccgac 4620 gtcaggtcaa atttctcaaa actggtagaa accatcaatc agatgcagga ggacatgtca 4680 acaaaacacg ggcctgactt taaccggttg gtgtccgcat ttgaggaatt ggccactgga 4740 gtgaaggcta tcagggccgg tctcgacgag gccaaaccct ggtacaaact catcaagctc 4800 ctgagccgct tgtcgtgcat ggccgctgta gcagcacggt caaaggaccc agtccttgtg 4860 gccatcatgc tggctgacac cggtcttgag attctggaca gcacctttgt cgtgaagaag 4920 atctccgact cgctctccag tctctttcac gtgccggccc ccgtcttcag tttcggagcc 4980 ccgattctgt tggccgggtt ggtcaaagtc gcctcgagtt tcttccggtc cacacccgaa 5040 gaccttgaga gagcagaaaa acagctcaaa gcacgtgaca ttaacgacat attcgccatt 5100 ctcaagaacg gcgagtggct ggtcaagctg atccttgcca tccgcgactg gatcaaagcg 5160 tggatcgcct cagaagaaaa gtttgtcacc atgacggact tggtgcctgg tatccttgaa 5220 aagcagcggg atctcaacga cccgagtaag tacaaggaag ccaaggagtg gctcgacaac 5280 gcgcgccagg cgtgtttgaa gagcgggaac gttcacattg ccaatttgtg caaagtggtc 5340 gccccggcac ccagcaagtc gagacccgaa cccgtggtcg tttgcctccg cggcaaatcc 5400 ggccagggga agagtttcct tgcgaacgtg ctcgcgcaag caatctccac ccacttcacc 5460 ggcagaactg attcggtttg gtactgcccg cctgaccctg accacttcga cggttacaac 5520 cagcagaccg ttgtcgtgat ggacgatttg ggccagaacc ccgatggcaa ggacttcaag 5580 tacttcgccc agatggtttc gaccacgggg ttcatcccgc ccatggcctc gcttgaggac 5640 aaaggcaagc ctttcaacag caaagtcatc attgctacca ccaacctgta ctcgggtttc 5700 accccgagaa caatggtgtg tcctgacgcg ctgaaccgga ggttccactt tgacatcgac 5760 gtgagtgcca aggacgggta caaagttaac aacaaattgg acataatcaa agctcttgaa 5820 gacacccaca ccaacccagt ggcgatgttc caatacgact gtgcccttct aaacggtatg 5880 gcagttgaaa tgaagagaat gcaacaggat atgttcaagc ctcaaccacc cctccagaac 5940 gtgtaccaac tcgttcacga ggtgattgaa cgggtcgagc tccacgagaa ggtgtcgagc 6000 cacccgattt tcaaacagat atcaattcct tcccaaaagt ctgtgttgta cttcctcatt 6060 gagaaaggcc aacacgaagc agcaattgaa ttctttgagg gaatggtgca tgactccatc 6120 aaggaagagc tccggcccct catccaacag acctcatttg tgaaacgcgc ttttaagcgc 6180 ctgaaggaaa actttgagac tgttgccctg tgtttgactc ttttggcaaa catagtgatc 6240 atgatccgcg agactcgcaa gagacaacag atggtggacg atgcagtgaa tgactacatt 6300 gagaaggcaa acatcaccac agatgacaag actcttgacg aggcggaaaa gaaccctcta 6360 gagaccagcg gtgccagcac tattggtttc agagagagaa ctctcccggg gcacaaggcg 6420 agcgatgacg tgagctccga gcccgccaaa cccgtggagg accgaccaca agctgaaggg 6480 ccctacgccg gaccacttaa gaaaccagtg gcattgaaag tgagagcaag agccccggtc 6540 gtgaaggagg gaccctacga gggaccggtg aagaagcctg tcgctttgaa agtgaaagcc 6600 aagaacttga ttgtcactga gagtggtgcc ccaccgaccg acttgcagaa gatggtcatg 6660 ggcaacacta agcctgttga gctcatcctc gacgggaaga cggtagccat ctgctgtgct 6720 accggagtgt ttggcactgc ctacctcgta cctcgtcacc tcttcgcgga gaagtacgac 6780 aagataatgt tggacggtag agccatgaca gacagtgact acagagtgtt tgagtttgag 6840 attaaagtaa aaggacagga catgctctca gacgctgcac tcatggtgct tcaccgtggg 6900 aaccgcgtga gagacatcac gaaacatttt cgtgacacag caagaatgaa gaaaggcacc 6960 cccgttgtcg gtgtgatcaa caacgccgac gttgggagac tgattttctc tggagaggcc 7020 cttacctaca aagacattgt agtgtgcatg gatggagaca ccatgccggg cctgtttgcc 7080 tacagagccg ccaccaaggc tggttactgc gggggagccg ttctcgccaa ggacggagcc 7140 gacacattca tcgttggcac ccactccgca ggtggtaacg gagttggata ctgctcgtgc 7200 gtgtccaggt ccatgctcct gaaaatgaag gcacacattg accctgaacc acaccacgag 7260 gggttgattg ttgataccag agatgtggaa gagcgcgtgc atgtcatgcg taaaaccaag 7320 cttgcaccca ccgtggcaca cggtgtgttt aaccctgaat ttggtcccgc tgccttgtcc 7380 aacaaggacc cgcggctgaa cgaaggggtt gtcctcgatg aagtcatctt ctccaaacac 7440 aagggagaca cgaaaatgtc tgaggaggac aaagcgctgt tccgccgctg cgctgccgac 7500 tacgcgtcgc acttgcacag cgtgctgggg acggcaaatg ccccattgag catctatgag 7560 gccatcaaag gcgtcgacgg gctcgatgcc atggagccgg acaccgcgcc cggcctcccc 7620 tgggccctcc aggggaaacg ccgtggtgcg ttgattgact tcgagaacgg cacggtcgga 7680 cccgaagtcg aggctgccct aaagctcatg gagaaaagag agtacaaatt tgcttgccag 7740 accttcctga aagacgagat tcgtccgatg gaaaaagtac gtgctggcaa gactcgcatt 7800 gtcgacgttt tgcccgtgga acacattctt tacaccagga tgatgattgg cagattctgt 7860 gctcaaatgc acacaaacaa tggaccgcag attggctcag cggtcggttg caatcctgat 7920 gttgattggc aaagatttgg cacacatttt gctcagtaca gaaacgtgtg ggatgtggac 7980 tattcggcct ttgatgctaa ccactgcagt gacgcaatga acatcatgtt tgaggaggta 8040 tttcgcacag acttcggttt ccacccaaat gctgagtgga ttctgaagac tcttgtgaac 8100 acggagcacg cctatgagaa caaacgtatc actgttgagg gcgggatgcc gtctggctgt 8160 tccgcgacaa gcatcatcaa cacaattttg aacaacattt atgtgctcta cgctcttcgt 8220 agacactatg agggagttga gctggacacc tacaccatga tctcctacgg agatgacatc 8280 gtggttgcaa gtgactacga tctggatttt gaggctctca aaccccactt caaatctctt 8340 ggtcaaacca tcactccagc tgacaaaagc gacaaaggtt ttgttcttgg tcactccatt 8400 accgatgtca ctttcctcaa aagacacttc cacatggact atggaactgg gttttacaaa 8460 cctgtgatgg cctcaaagac cctcgaggcc attctctcct ttgcacgccg tgggaccata 8520 caggagaagt tgatctccgt ggcaggactc gccgtccact caggacctga cgagtaccgg 8580 cgtctctttg agcccttcca gggtctcttc gagattccaa gctacagatc actttacctg 8640 cgttgggtga acgccgtgtg cggtgacgca taatccctca gatgtcacaa ttggcagaaa 8700 gactctgagg cgagcgacgc cgtaggagtg aaaagcccga aagggctttt cccgcttcct 8760 attccaaaaa aaaaaaaaaa aaactagttc tagagcggcc gccaccgcgg tggagctcca 8820 gcttttgttc cctttagtga gggttaattg cgcgcttggc gtaatcatgg tcatagctgt 8880 ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 8940 agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 9000 tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 9060 cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 9120 gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 9180 ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 9240 ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 9300 atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 9360 aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 9420 gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 9480 ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 9540 ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 9600 acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 9660 gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 9720 ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 9780 ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 9840 gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 9900 ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 9960 agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 10020 ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 10080 gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 10140 catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 10200 cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 10260 cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 10320 gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 10380 tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 10440 gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 10500 tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 10560 gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 10620 gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 10680 taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 10740 tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 10800 ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 10860 taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 10920 tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 10980 aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccac 11019 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 ggagccgggc aatccagtcc ggcgacc 27 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 ctgtttctca ggtgcaatga tctcctg 27 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 4 cttctaaatt ttgacctgct caaattggcg gg 32 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 5 cttgagcctt ttctggacct ttgttttcca c 31

Claims (9)

1. 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 진뱅크 억세션 넘버 EF614458.1의 염기서열을 갖는 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환되고, 도 3의 개열지도를 갖는 재조합 플라스미드 pOm-AsMOG-P1로부터 생산된 재조합 구제역 바이러스로서,
   상기 재조합 플라스미드 pOm-AsMOG-P1이 서열번호 1의 염기서열을 갖고,
   상기 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 2356 번째 염기 내지 4548 번째 염기의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 상기 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스.
5. (1). 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계;
   (2). 상기 (1) 단계에서 얻은 플라스미드에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자를, 진뱅크 억세션 넘버 EF614458.1의 염기서열을 갖는 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환시켜, 재조합 유전자가 삽입된 서열번호 1의 재조합 플라스미드를 구축하는 단계로서, 상기 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 2356 번째 염기 내지 4548 번째 염기의 염기서열을 갖는 단계; 및
   (3). 상기 (2) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 세포는 염소 태아 혀 세포(ZZ-R) 및 어린 햄스터 신장 세포(BHK-21) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 상기 구제역 아시아1 혈청형 유전형 V 바이러스의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
9. 삭제

Images