KR101535555B1

KR101535555B1 - 구제역 바이러스 ＯＭａｎｉｓａ를 이용한 재조합 구제역 백신 바이러스

Info

Publication number: KR101535555B1
Application number: KR1020120152084A
Authority: KR
Inventors: 박종현; 이광녕; 김수미; 초가기; 김래형; 이여주; 박정남; 신연경; 고영준; 이향심; 서민구; 김병한
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2012-12-24
Filing date: 2012-12-24
Publication date: 2015-07-10
Also published as: KR20140083129A

Abstract

본 발명은 구제역 바이러스 O Manisa를 이용한 재조합 구제역 백신 바이러스에 관한 것으로서 보다 상세하게는 구제역 바이러스 O Manisa의 전체 유전자를 클로닝한 후 일부 유전자를 결실(deletion)시켜 얻은 구제역 바이러스 O Manisa를 이용한 재조합 구제역 백신 바이러스에 관한 것이다.

Description

구제역 바이러스 ＯＭａｎｉｓａ를 이용한 재조합 구제역 백신 바이러스{Recombinant foot and mouth disease viruses using the vaccine strain, O manisa strain for protection of ME-SA topotype of O serotyp}

구제역(Foot and mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스 수포성 질병으로 빠른 복제와 빠른 전파력이 특징이다. 이 질병은 그 경제적 중요성으로 인하여 세계동물보건기구(OIE)에 의하여 중요한 동물질병으로 분류되어 있으며, 축산물의 국가간 교역에 있어 가장 중요한 요소로 작용하고 있다.

구제역 병원체는 단일 가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데(Piconaviridae)과, 아프소바이러스(Aphthovirus)속에 속하며 7개의 다른 혈청형(A형, O형, C형, Asia1형, SAT1형, SAT2형, SAT3형)으로 분류되고 있다.

구제역 바이러스(Foot and mouth disease virus)는 대부분 병원성이 있는 원인체이다. 그러나 여러번의 계대 등 여러 연구자들의 시도에서도 병원성이 유지되기 때문에 현재까지 구제역바이러스에 대한 병원성이 줄어든 약독화 백신으로 사용되는 것은 국제적으로는 금기시된 일이다. 구제역에 대해 약독화 바이러스를 사용하는 것은 병원성의 회복에 대한 문제점을 안고 있으며 또한 생독백신을 사용하면 야외 감염된 구제역 바이러스와 구분이 안되는 단점이 있어 구제역 발생시 효과적으로 접종하여 방역하는 체계를 구축하기 어렵다.

본 발명의 발명자는 상기의 문제점을 해결하기 위하여 연구하던 중 이미 O형 구제역 바이러스의 여러 야외바이러스에 대한 광범위하게 면역이 가능한 백신주로 알려진 O manisa 구제역 바이러스 유전자 전체 게놈을 플라스미드에 클로닝한 후 상기 O manisa 구제역 바이러스의 유전자 중에서 3A 부위 일부 및 3B 부위 일부 중에서 선택된 어느 하나 이상의 부위를 결실시켜 병원성이 없는 새로운 바이러스 백신을 얻을 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

구제역 바이러스 O manisa 주는 세계적으로 널리 쓰이는 O형의 표준 백신주이다. 그러나 이 백신은 동물에 병원성이 있어 백신주로 사용할 경우 백신 청정국에서는 사용하기 어렵다. 따라서 청정국에서도 안심하고 사용이 가능한 백신주의 개발은 절실하므로 O Manisa 바이러스에 대한 전체 유전자를 클로닝하고 이 바이러스를 유전자 조작하여 일부 유전자(3A 부위 및 3B 부위 중에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자 부위)를 제거하여 돼지 및 반추수의 일종인 유산양에서 병원성이 없는 구제역 백신 바이러스를 얻고, 향후 이 백신 바이러스를 기초로 안전한 구제역 백신을 제작할 수 있다.

한편 본 발명과 관련된 선행기술로서 본 발명의 발명자가 발명자로 참여한 한국공개특허 제2011-0135532호에 구제역 방어를 위한 3개의 서로 다른 siRNA(small interference RNA)를 발현하는 바이러스 벡터 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 구제역의 유전자 중 가장 안정적인 부위인 2B와 3C 부분에서 효과가 입증된 3개의 siRNA 염기 서열을 선정하고, 이를 아데노바이러스에 삽입하여 발현되도록 제조한 바이러스 벡터 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신을 나타내고 있다.

그러나 본 발명과 상기 선행기술은 발명의 기술적 특징이 서로 달라 양 발명은 발명이 구성이 서로 다른 발명이다.

한 종류의 구제역 백신을 개발하는 일은 사독백신일지라도 적절한 조건과 바이러스의 선정 등 여러 과정을 거쳐야 하므로 수년간의 연구를 집약해야 이뤄질 수 있다. 백신이 개발된다 하더라도 이 바이러스의 병원성은 유지되고 있으며, 바이러스를 대량 배양할 경우 상당히 엄격한 시설 내에서 바이러스 유출이 되지 않도록 각별히 주의하여야 한다. 이러한 절차 등은 구제역 백신을 제시간에 생산을 어렵게 하고 있으며 필요한 시점에 동물에 공급하는 것은 어려울 수 있다.

본 발명은 구제역 바이러스일지라도 동물에 비병원성으로 위와 같은 엄격한 시설을 갖추지 않아도 되며, 구제역 예방용 백신을 제작하기 위한 기본 벡터로 이용하여 발현 항원부위를 교체할 수 있게 바이러스 백신을 제공하고자 한다.

본 발명은 새로운 병원성이 없고 감별이 가능한 마커바이러스 제작을 위하여 구제역 바이러스 O Manisa의 유전자 일부를 조작, 바람직하게는 구제역 바이러스 O Manisa의 유전자 중에서 3A 부위 일부 및 3B 부위 일부 중에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자 부위를 결실시켜 동물의 병원성 부위로 알려져 있는 3A에 대해 일부 삭제되어도 증식에 영향을 주지 않는 부위와 구제역바이러스의 복제를 위해 필요한 단백질 시발체로 작동되는 3B가 정상적으로는 3개로 반복하여 구성되어 있지만 2개만 나오도록 교체하여 병원성의 약화시킨 구제역 바이러스 O Manisa를 이용한 재조합 구제역 백신 바이러스를 제공하고자 한다.

본 발명에 의해 제공한 구제역 바이러스 O Manisa를 이용한 재조합 구제역 백신 바이러스는 구제역 바이러스 O Manisa의 유전자 일부를 조작하여 병원성이 없거나 또는 약화시킴으로써 소독제 실험 또는 항바이러스 실험 등 실험실내에서 다루기에 병원성 바이러스 보다 더욱 안전한 장점을 지니고 있다. 또한 이 백신 바이러스를 이용하여 O형(ME-SA 지역형) 구제역의 치료 및/또는 예방에 사용할 수 있는 구제역 백신 제작에 기여할 수 있다.

도 1은 구제역 바이러스 O형 Manisa에 대한 재조합 구제역바이러스의 게놈 모식도이다[O-Manisa(전체 유전자 모식도), O-Manisa-3Ad(전체 유전자에서 3A 부위 결실 모식도), O-Manisa-3B2d(전체 유전자에서 3B2 부위 조작 모식도), O-Manisa-3AB2d (전체 유전자에서 3A, 3B2 부위 조작 모식도)].
도 2는 O1 manisa 주의 전체유전자를 클로닝한 플라스미드(pO-Manisa)의 모식도이다.
도 3은 플라스미드(pO-Manisa)를 기초로 3A 부위 일부가 결실된 플라스미드(pO-Manisa-3Ad)의 모식도이다[파란색으로 표시된 유전자 부위가 변화된 서열이 포함된 부분이다.]
도 4는 플라스미드(pO-Manisa)를 기초로 3B2 부위 일부가 조작된 플라스미드(pO-Manisa-3B2d)의 모식도이다[파란색으로 표시된 유전자 부위가 변화된 서열이 포함된 부분이다.].
도 5는 플라스미드(pO-Manisa-3Ad)를 기초로 3A 및 3B2 부위 일부가 조작된 플라스미드(pO-Manisa-3AB2d)의 모식도이다[파란색으로 표시된 유전자 부위가 변화된 서열이 포함된 부분이다.].
도 6은 해당 플라스미드를 이용하여 세포에 유전자를 삽입하여 형질도입으로 제작된 구제역 바이러스가 회복되어 세포에서의 변성효과를 보이는 사진이다[(가)는 BHK21 정상 대조세포, (나)는 O-Manisa-3Ad, (다)는 O-Manisa-3B2d (라) 는 O-Manisa-3AB2d 바이러스가 세포에서 변성효과가 확인된 결과이다.].
도 7은 제작된 바이러스에서 발현된 단백질이 간이항원킷트로 양성반응이 확인된 사진이다[회복된 바이러스 배양 상층액 25㎕ 를 간이항원킷트 (PBM Co. Ltd.)로 구제역에 대한 구조단백질(SP)에 대한 양성반응을 확인할 수 있다. (가)는 O-Manisa-3Ad, (나)는 O-Manisa-3B2d (다) 는 O-Manisa-3AB2d이다.]
도 8은 구제역바이러스 유전자 3A 부위에서 삭제된 유전자 서열을 나타낸 것이다[이 유전자 서열을 기초로 O-manisa-3Ad, O-manisa-3AB2에서 3A부위를 이와 같이 결실하였다.]
도 9는 구제역바이러스 유전자 3B2 부위에서 조작된 유전자 서열을 나타낸 것이다[이 유전자서열을 기초로 O-manisa-3B2d, O-manisa-3AB2에서 3B2d 부위를 이와 같이 결실하였다.].
도 10은 전체 유전자가 삽입된 O manisa바이러스를 접종한 후의 체온의 변화를 관찰한 그림이다[구제역의 특이 증상인 체온 상승 효과는 보이지 않았다.].
도 11은 O-Mansia를 돼지에 접종하여 증상이 관찰되지 않음을 확인하였다[(가)는 O-manisa를 접종하였으며, (나)는 대조로 국내에서 2010년 발생된 구제역바이러스 O-AD-2010를 접종하여 병원성이 확인된 것이다.].

본 발명은 구제역 바이러스 O Manisa를 이용한 재조합 구제역 백신 바이러스.를 나타낸다.

본 발명은 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드에서 일부 유전자 부위를 결실(deletion) 또는 치환(substitution)시켜 얻은 플라스미드를 포함하는 구제역 바이러스 O Manisa를 이용한 재조합 구제역 백신 바이러스를 나타낸다.

상기에서 재조합 구제역 백신 바이러스는 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서 3A 부위 일부를 결실시켜 얻은 플라즈미드(pO-manisa-3Ad)를 포함할 수 있다.

상기의 유전자 3A 부위 중에서 결실 부위는 277∼306bp일 수 있다.

상기에서 재조합 구제역 백신 바이러스는 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서 3B1 부위, 3B2 부위 및 3B3 부위로 구성된 3B 부위를 치환 또는 결실시키되 이때 3B1 부위 일부를 치환시키고, 3B2 부위 일부를 결실시켜 얻은 플라즈미드(pO-manisa-3B2d)를 포함할 수 있다.

상기의 유전자 3B1 부위 중에서 치환 부위는 22∼36bp이고, 유전자 3B2 부위 중에서 결실 부위는 37∼105bp일 수 있다.

상기에서 재조합 구제역 백신 바이러스는 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서 3A 부위 일부의 결실과 3B2 부위 일부의 치환 또는 결실시켜 얻은 플라즈미드(pO-manisa-3AB2d)를 포함할 수 있다.

상기의 유전자 3A 부위 중에서 결실 부위는 277∼306bp이고, 유전자 3B2 부위 중에서 치환 부위는 22∼36bp, 결실 부위는 37∼105bp일 수 있다.

본 발명은 구제역 바이러스 O Manisa를 이용한 재조합 구제역 백신 바이러스의 제조방법을 나타낸다.

본 발명은 (1)구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계; (2)상기의 플라스미드의 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 중에서 일부 유전자 부위를 결실(deletion) 또는 치환(substitution)시키는 단계; (3)상기 (2)단계에서 얻은 일부 유전전가 결실 또는 치환된 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 구제역 바이러스 O Manisa를 이용한 재조합 구제역 백신 바이러스의 제조방법을 나타낸다.

상기에서 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입은 통상적으로 유전자를 플라스미드에 삽입하는 방법을 이용할 수 있으면 족하므로 이에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.

상기의 유전자 3A 부위의 결실은 서열번호 2의 포워드 프라이머(Forwarf Primer) 및 서열번호 3의 리버스 프라이머(Reverse Primer)를 이용한 PCR에 의해 실시할 수 있다.

상기에서 재조합 구제역 백신 바이러스는 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서 3B1 부위, 3B2 부위 및 3B3 부위로 구성된 3B 부위 중 3B1 부위 일부를 치환시키고, 3B2 부위 일부를 결실시켜 얻은 플라즈미드(pO-manisa-3B2d)를 포함할 수 있다.

상기의 유전자 3B1 부위, 3B2 부위 및 3B3 부위로 구성된 3B 부위 중 3B1 부위 의 치환 부위는 22∼36bp이고, 유전자 3B2 부위의 결실 부위는 37∼105bp일 수 있다.

상기의 유전자 3B 부위의 치환 또는 결실은 서열번호 4의 포워드 프라이머(Forwarf Primer) 및 서열번호 5의 리버스 프라이머(Reverse Primer)를 이용한 PCR에 의해 실시할 수 있다.

상기에서 재조합 구제역 백신 바이러스는 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서 3A 부위 일부의 결실과 3B1 부위, 3B2 부위 및 3B3 부위로 구성된 3B 부위 중 3B1 부위 일부의 치환 또는 3B2 부위 일부를 결실시켜 얻은 플라즈미드(pO-manisa-3AB2d)를 포함할 수 있다.

상기의 유전자 3A 부위 중에서 결실 부위는 277∼306bp이고, 3B1 부위, 3B2 부위 및 3B3 부위로 구성된 3B 부위 중 유전자 3B1 부위의 치환 부위는 22∼36bp, 3B2 부위의 결실 부위는 37∼105bp일 수 있다.

상기의 3A 부위 일부의 결실과 3B 부위 일부의 치환 또는 결실은 서열번호 6의 포워드 프라이머(Forwarf Primer) 및 서열번호 7의 리버스 프라이머(Reverse Primer)를 이용한 PCR에 의해 실시할 수 있다.

상기 (2)단계에서 얻은 일부 유전전가 결실 또는 치환된 플라스미드를 세포에 주입하는 3단계에서의 세포는 염소 태아 혀 세포(ZZ-R) 및 어린 햄스터 신장 세포(BHK21) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기의 실험예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실험예>

1. 실험방법

구제역 O Manisa 바이러스 전체 유전자(Genbank AY593823.1)를 PCR에 의하여 증폭하고 플라스미드(pBluescript SK II)에 O_Manisa 유전자를 삽입하였다(pO-Manisa).

일반적으로 cDNA 합성시 사용되는 Random primers 를 이용하여 O Manisa 바이러스에 대한 cDNA 작성후 이것을 이용하여 O Manisa 바이러스 유전자정보를 기초로 증폭이 가능한 특이 프라이머들(Genbank AY593823.1를 기초로 5' 및 3' 유전자의 각 20 mers씩에 해당)를 작성하여 PCR을 실시하였으며, PCR를 위한 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs (1㎕), Phusion enzyme (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균증류수 (35.5㎕)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25cycle, 최종 72℃ 10분으로 반응을 실시하였다.

상기 O Manisa 유전자가 삽입된 플라스미드를 기초로 O Manisa 바이러스 전체 유전자 중에서 3A 부위 일부와, 3B 부위 일부와, 3A 부위 일부 및 3B 부위 일부를 치환 및/또는 결실이 되도록 조작하였고 그 방법은 다음과 같다.

플라스미드(pO-Manisa)를 기초로 하여 TOYOBO mutation kit를 이용하여 조작하였다.

유전자의 3A 부위 조작을 위한 PCR은 플라스미드(30ng/㎕, 1㎕), 서열번호 2의 포워드 프라이머(Forward Primer, GACAAGACTCTTGACGAGGCGGAAA, 10pmole/㎕, 1㎕) 및 서열번호 3의 리버스 프라이머(Reverse Primer, GTCATTCACTGCATCGTCCACCATC, 10pmole/㎕, 1㎕)를 이용하였다.

유전자의 3B 부위 조작을 위한 PCR은 플라스미드(30ng/㎕, 1㎕), 서열번호 4의 포워드 프라이머(TTGAAAGTGAGAGCAAGAGCCCCGG, 10pmole/㎕, 1㎕) 및 서열번호 5의 리버스 프라이머(TGCCACTGGTTTCTTAAGTGGTCCGGCGTAGGGCC, 10pmole/㎕, 1㎕)를 사용하였다.

유전자의 3A 부위 및 3B 부위 조작을 위한 PCR은 플라스미드 (O1m 3Ad)를 기초로 하여 TOYOBO mutation kit를 이용하여 조작하였다. 플라스미드(30ng/㎕, 1㎕), 서열번호 6의 포워드 프라이머(TTGAAAGTGAGAGCAAGAGCCCCGG, 10pmole/㎕, 1㎕) 및 서열번호 7의 리버스 프라이머(TGCCACTGGTTTCTTAAGTGGTCCGGCGTAGGGCC, 10pmole/㎕, 1㎕)를 합성하여 사용하였다.

상기에서 PCR를 위한 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs (1㎕), Phusion enzyme (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균증류수 (35.5㎕)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25cycle, 최종 72℃ 10분으로 반응을 실시하였다. 그 후 자가 결찰반응(Self ligation, TOYOBO mutation kit)을 수행하였다. 그 방법은 PCR 산물을 제한효소 DpnI(10unit/㎕, 2㎕)로 37℃, 1시간 처리 후 Ligation high 5㎕, T4 polynucleotide kinase 1㎕, 멸균증류수 7㎕로 조합하여 16℃, 3시간 반응하였다. 그후 플라스미드를 추출한 뒤 FspI 제한효소로 처리하면 Ligation이 잘 된 플라스미드는 3개의 band로 확인할 수 있다.

최종적으로 염기서열 분석을 실시하여 3A 부위의 서열이 결실(deletion)된 플라스미드(pO-Manisa-3Ad), 3B 부위의 서열이 결실(deletion) 및 치환(substitution)된 플라스미드(pO-Manisa-3B2d) 및 3A 부위의 서열이 결실되고, 3B 부위의 서열이 결실 및 치환된 플라스미드(pO-Manisa-3AB2d)를 확인하였다.

그리고 바이러스 회복은 확보된 플라스미드(O1m 3Ad, 3B2d, 3AB2d)를 제한효소로 반응시킨 뒤 BHKT7-9 세포(T7 RNA polymerase가 발현되는 세포주)에서 바이러스를 확보한 후 ZZ-R(염소 태아 혀) 세포 및 BHK21(어린 햄스터 신장) 세포에서 증식시키고, BHK21 세포 및 IBRS-2(돼지 신장) 세포에서 세포 변성 효과를 확인하였다.

제작된 구제역 바이러스는 foot-pad 및 목 근육에 2ml (> 5.0 logTCID50/ml) 으로 접종하고 10일 이상 관찰하였다.

2. 결과

도 1은 구제역 바이러스 O형 Manisa에 대한 재조합 구제역바이러스의 게놈 모식도를 표현하고 있다. 도 1에서 O-Manisa은 구제역 바이러스 O형 Manisa 전체 유전자 모식도를 나타내고 있으며, O-Manisa-3Ad는 구제역 바이러스 O형 Manisa 전체 유전자에서 3A 부위 결실 모식도이고, O-Manisa-3B2d는 구제역 바이러스 O형 Manisa 전체 유전자에서 3B2 부위 조작 모식도이고, O-Manisa-3AB2d는 구제역 바이러스 O형 Manisa 전체 유전자에서 3A, 3B2 부위 조작 모식도이다.

도 2는 구제역 바이러스 O manisa 주의 전체 유전자를 클로닝한 플라스미드(pO-Manisa)의 모식도이다.

도 3은 구제역 바이러스 O manisa 주의 전체 유전자를 클로닝한 플라스미드(pO-Manisa)를 기초로 3A 부위 일부가 결실된 플라스미드(pO-Manisa-3Ad)의 모식도이고, 파란색으로 표시된 유전자 부위가 변화된 서열이 포함된 부분이다.

도 4는 구제역 바이러스 O manisa 주의 전체 유전자를 클로닝한 플라스미드(pO-Manisa)를 기초로 3B2 부위 일부가 조작된 플라스미드(pO-Manisa-3B2d)의 모식도이고 파란색으로 표시된 유전자 부위가 변화된 서열이 포함된 부분이다.

도 5는 구제역 바이러스 O manisa 주의 전체 유전자를 클로닝한 플라스미드(pO-Manisa-3Ad)를 기초로 3A 및 3B2 부위 일부가 조작된 플라스미드(pO-Manisa-3AB2d)의 모식도이고 파란색으로 표시된 유전자 부위가 변화된 서열이 포함된 부분이다.

도 6은 해당 플라스미드를 이용하여 BHK21 세포에 유전자를 삽입하여 형질도입으로 제작된 구제역 바이러스가 회복되어 BHK21 세포에서의 변성효과를 나타낸 것이다. 도 6에서 (가)는 BHK21 정상 대조 세포를 나타낸 것이고, (나)는 BHK21 세포에 3A 부위 일부가 결실된 플라스미드(pO-Manisa-3Ad)를 포함하는 백신 바이러스 주입 후 변성을 나타낸 것이고, (다)는 BHK21 세포에 3B 부위 일부가 치환 또는 결실된 플라스미드(pO-Manisa-3B2d)를 포함하는 백신 바이러스 주입 후 변성을 나타낸 것이고, (라) 는 BHK21 세포에 3A 부위 일부가 결실되고, 3B 부위 일부가 치환 또는 결실된 플라스미드(pO-Manisa-3AB2d)를 포함하는 백신 바이러스 주입 후 변성을 나타낸 것이다.

도 7은 상기에서 제조한 3종의 백신 바이러스에서 발현된 단백질이 간이항원키트로 구제역 양성반응이 확인된 사진이다. 회복된 바이러스 배양 상층액 25㎕를 간이항원키트(PBM Co. Ltd.)로 구제역에 대한 구조 단백질(SP)에 대한 양성반응을 확인할 수 있다. (가)는 3A 부위 일부가 결실된 플라스미드(pO-Manisa-3Ad)를 포함하는 백신 바이러스에 대한 구제역 양성반응을 나타낸 간이항원키트이고, (나)는 3B 부위 일부가 치환 또는 결실된 플라스미드(pO-Manisa-3B2d)를 포함하는 백신 바이러스에 대한 구제역 양성반응을 나타낸 간이항원키트이고, (다)는 3A 부위 일부가 결실되고, 3B 부위 일부가 치환 또는 결실된 플라스미드(pO-Manisa-3AB2d)를 포함하는 백신 바이러스 에 대한 구제역 양성반응을 나타낸 간이항원키트를 나타낸 것이다.

도 8은 구제역 바이러스 유전자 3A 부위에서 삭제된 유전자 서열을 보고주고 있다. 이 유전자 서열을 기초로 O-manisa-3Ad, O-manisa-3AB2에서 3A부위를 이와 같이 결실하였다.

도 9는 구제역바이러스 유전자 3B2 부위에서 조작된 유전자 서열을 보고주고 있다. 이 유전자서열을 기초로 O-manisa-3B2d, O-manisa-3AB2에서 3B2d 부위를 이와 같이 결실하였다.

표 1은 백신주의 표준으로 삼고 있는 O manisa 바이러스(소 유래주)를 조작한 여러 O manisa 바이러스 유래주를 소와 같은 반추수인 유산양에서 바이러스의 병원성 및 공격접종을 실시하여 병원성이 보이지 않는 것을 확인한 것이다.

Viruses	Goat No.	Passage history	Clinical signs	Foot lesion in injected site	Clinical samples
Viruses	Goat No.	Passage history	Clinical signs	Foot lesion in injected site	virus isolation	RT-PCR
O-Manisa (wild type)	132	B6	-	-	-	-
O-Manisa (wild type)	141	B6	-	-	-	-
O-Manisa 3B2D	145	Z4B9	-	-	-	-
O-Manisa 3B2D	146	Z4B9	-	-	-	-
O-Manisa 3AD	147	Z4B9	-	-	-	-
O-Manisa 3AD	148	Z4B9	-	-	-	-
O-Manisa 3AB2D	152	Z6B7	-	-	-	-
O-Manisa 3AB2D	157	Z6B7	-	-	-	-

*상기 표 1에서 Z는 ZZ-R(염소 태아 혀) 세포를 나타내고, B는 BHK21(어린 햄스터 신장) 세포를 나타내며, 이때 숫자는 계대수를 나타낸다.

도 10은 구제역 O manisa 바이러스 전체 유전자를 포함하는 플라스미드(O-Manisa)를 포함하는 백신 바이러스, 구제역 O manisa 바이러스 전체 유전자 중에서 3A 부위 일부가 결실된 플라스미드(pO-Manisa-3Ad)를 포함하는 백신 바이러스, 구제역 O manisa 바이러스 전체 유전자 중에서 3B 부위 일부가 치환 또는 결실된 플라스미드(pO-Manisa-3B2d)를 포함하는 백신 바이러스, 구제역 O manisa 바이러스 전체 유전자 중에서 3A 부위 일부가 결실되고, 3B 부위 일부가 치환 또는 결실된 플라스미드(pO-Manisa-3AB2d)를 포함하는 백신 바이러스를 각각 발굽부위(foot pad)에 피내로 0.1ml을 접종한 후 체온의 변화를 관찰 것으로서, 모든 실험군에서 구제역의 특이 증상인 체온 상승은 보이지 않았다.

도 11은 돼지에 구제역 O manisa 바이러스 전체 유전자를 갖는 백신 바이러스 및 국내에서 2010년 발생된 구제역바이러스 O-AD-2010를 대조군으로 접종한 것을 나타낸 사진으로, 도 11에서 (가)는 돼지에 구제역 O manisa 바이러스 전체 유전자를 포함하는 백신 바이러스를 접종한 것으로 병원성을 나타내지 않았으며, (나)는 돼지에 국내에서 2010년 발생된 구제역바이러스 O-AD-2010를 접종한 것으로 병원성을 나타내었다.

한편, 구제역 바이러스 O manisa 주를 전체 클로닝한 플라스미드(pO-Manisa)에 대한 유전자 염기서열을 서열번호 1에 나타내었다.

상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예 및 시험예를 참조하여 설명하였지만 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 의해 제공한 구제역 바이러스 O Manisa를 이용한 재조합 구제역 백신 바이러스는 구제역 바이러스 O Manisa의 유전자 일부를 조작하여 병원성이 없거나 또는 약화시킴으로써 소독제 실험 또는 항바이러스 실험 등 실험실내에서 다루기에 병원성 바이러스 보다 더욱 안전한 장점을 지니고 있다. 또한 이 백신 바이러스를 이용하여 O형(ME-SA 지역형) 구제역의 치료 및/또는 예방에 사용할 수 있는 구제역 백신 제작에 사용될 수 있어 구제역에 예민한 돼지, 소, 염소, 양 등의 축산 농가 및 축산 관련 산업발전에 기여할 수 있으므로 산업상 이용가능성이 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA (Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries.Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency (QIA) ) <120> Recombinant foot and mouth disease viruses using the vaccine strain, O manisa strain for protection of ME-SA topotype of O serotyp <130> 9039 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 11097 <212> DNA <213> gene for O manisa of pO-Manisa <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg gccagtgagc atatgtaata cgactcacta tagggttgaa agggggcgct 660 agggtctcac ccctagcatg ccaacgacag ctcctacgtc gcactccaca ctaacgtttg 720 tgtgcgcgcg ggaaccgatg gacttttgtt cacccaccta cagttggact cacggcaccg 780 cgtggccatt ttagctgggt tgtgcggacg aacactgctt gcgcatctcg cgtgaccggt 840 tagtactctt accactatcc gcctacttgg tcgttagcgc tgtcctgggc actcttgttg 900 ggggctgttc aacgctctac ggtctcccct gcgtaacaga ctacggtgtt ggggccgctt 960 cgtgcgagcc gatcgcttgg tgtgcctcgg ctgtcgcccg aagcccgcct ttcacccccc 1020 cccccccccc ccccctaggt tttaccgtcg ttcccgacgt taatggggaa acaaccacaa 1080 gcttaacacc gtcttgcccg acgtaaaagg gctgcaacca aaaagcttgt gccgcctttc 1140 ccggcgttaa tgggaggtaa ccacaagaca aaccttcacc cggaagtaaa acggcaactt 1200 cacacagttt tgcccgtttt cgtgagaaat gggccgtcaa cgcacgaaac gcgccgtcgc 1260 ttgaggagga cttgtacaaa cacgatctat gcaggtttcc acaactgaca caaaccgtgc 1320 aacttgaaac cccgcctggt ctttccaggt ctagaggggc gacattttgt actgtgcttg 1380 actccacgct cggtccacta gcgagtgtta gtagtagcac tgttgcttcg tagcggagca 1440 tgatggccgt gggagcttcc ccttggtaac aaggacccac ggggccaaaa gccacgtcct 1500 accggaccca tcatgtgtgc aaacccagca cggcaacttt actgcgaaaa ccactttaag 1560 gtgacactga tactggtact caatcactgg tgacaggcta aggatgccct tcaggtaccc 1620 cgaggtaaca cgcgacactc gggatctgag aaggggactg gggcttcttt aaaagtgccc 1680 agtttaaaaa gcttctatgc ctgaataggc gaccggaggc cggcgccttt tcactgtttt 1740 actactgttt tcatgaatac aactgactgt ttcaccgccc tgttacacgc tctcagagag 1800 atcaaaacac tgtttctttt acggacacaa ggaaagatgg aattcacact ttacaacggt 1860 gagaagaaaa ccttctactc cagacccaac aaccacgaca actgctggct taacaccatt 1920 ctccagttgt tcaggtatgt tgatgagcct ttctttgact gggtctacga ctcgcctgaa 1980 aacctcactc ttgaggcaat caaacagttg gaagagacaa ccggtcttga gctgcacgag 2040 ggtggaccac ccgctctcgt catctggaac atcaaacact tgcttcacac cggaatcggc 2100 actgcctcac gccctagcga ggtgtgtatg gtggacggaa cggacatgtg tttagctgat 2160 tttcatgctg gcattttcct gaaaggacag gaacatgctg tgttcgcctg tgtcacctcc 2220 aacgggtggt acgcgattga tgacgaggac ttttaccctt ggacaccgga cccgtccgac 2280 gttctggtgt ttgtcccgta cgatcaagaa ccgcttaacg gagagtggaa aacaaaggtc 2340 cagaaaaggc tcaagggagc cgggcaatcc agcccggcaa ccgggtcaca gaaccaatca 2400 ggcaacactg ggagcatcat caacaattac tacatgcagc agtaccaaaa ctccatggac 2460 acacaacttg gtgacaacgc tacaagcgga ggctcaaacg aggggtccac ggacacaacc 2520 tccacccaca caaccaacac tcagaacaac gactggttct cgaagctggc cagttccgct 2580 ttcagcggtc ttttcggcgc tcttctcgcc gacaagaaaa ccgaggagac cactcttctc 2640 gaggaccgca tcctcactac tcgtaacgga cacaccacct cgacaaccca gtcgagcgtt 2700 ggagtcacgt acgggtatgc aacagctgag gatttcgtga gcgggccaaa cacctctggt 2760 ctcgagacca gggttgccca ggcagagcgg ttctttaaaa cccacctgtt cgactgggtc 2820 accagtgacc cattcggacg gtgccacctg ctggaacttc caactgacca caaaggtgtc 2880 tacggcagcc tgaccgactc gtatgcttat atgaggaacg gctgggatgt tgaagtcact 2940 gcagtgggaa accagttcaa tggaggatgc ctgttggtgg ccatggtgcc agaactttgc 3000 tccatacaga agagggagct gtaccagctc acgctctttc ctcaccagtt catcaaccct 3060 cggacgaaca tgacagcaca catcactgtg ccctttgttg gcgtcaaccg ttatgaccag 3120 tacaaggtac acaaaccttg gaccctcgtg gttatggttg tagcccccct gactgtcaac 3180 agtgaaggtg ccccgcaaat caaggtgtat gccaacatcg cacctaccaa cgtacacgtc 3240 gcgggtgagt tcccttccaa agaggggatc ttccctgtgg cttgcagcga tggttatggc 3300 ggtctggtga ccactgaccc gaaaacggct gaccccgctt acgggaaagt gtttaacccc 3360 ccccgcaaca tgttgccggg gcggttcacc aattttcttg acgtggctga ggcgtgcccc 3420 acgtttctcc acttcgaggg tgacgtgcca tacgtgacca cgaagacgga ttcagacagg 3480 gtgctcgctc agttcgactt gtctttggca gcaaagcaca tgtcgaacac cttccttgca 3540 ggtctcgccc agtactacac acagtacagc ggcaccatca acctgcactt catgttcaca 3600 gggcctactg acgcgaaggc gcgttacatg attgcgtatg ctcctcctgg catggaacca 3660 cctaaaacgc cagaggcggc tgcccactgc attcatgctg aatgggacac agggttgaac 3720 tcaaaattca cattttcaat cccttacctt tcggcggctg attacgctta cacagcgtct 3780 gacactgctg agaccacaaa tgtacaggga tgggtttgcc tgtttcaaat aacacacggg 3840 aaagctgacg gcgacgcact ggtcgttttg gctagcgccg gaaaggactt tgagctgcgc 3900 ctgccggtgg atgctcgcac acagactacc tccgcgggcg agtcagctga ccccgtgacc 3960 gccaccgttg agaattacgg tggcgagaca caggtccaga ggcgccaaca cacggacgtc 4020 tcatttatat tagacagatt tgtgacagtg acaccaaaag accaaattaa tgtattggac 4080 ctgatgcaaa cccctgctca cactttggtg ggagcactcc ttcgtactgc cacttactat 4140 ttcgctgact tagaggtggc agtgaagcac aagggaaacc tcacctgggt cccgaacggg 4200 gcgcctgaag cggcgttgga caacaccacc aacccaacag cttaccacaa ggcaccactc 4260 acccgacttg cactgcctta cacggcgcca caccgcgtgt tggctactgt ttacaacggg 4320 aactgcaagt atggtgacgg cacggtggcc aatgtgagag gtgacctgca agtgttggcc 4380 cagaaggcgg cgagagcgct gcctacctcc ttcaactacg gtgccattaa agctactcgg 4440 gtgactgaac tgctttaccg catgaagagg gctgagacat actgcccccg gcctcttttg 4500 gccattcacc cggaccaggc tagacacaag cagaagattg tggcaccggt ggaacagctt 4560 ctaaattttg acctgctcaa attggcggga gatgtggagt ccaaccctgg gcccttcttc 4620 ttctccgacg tcaggtcaaa tttctcaaaa ctggtagaaa ccatcaatca gatgcaggag 4680 gacatgtcaa caaaacacgg gcctgacttt aaccggttgg tgtccgcatt tgaggaattg 4740 gccactggag tgaaggctat cagggccggt ctcgacgagg ccaaaccctg gtacaaactc 4800 atcaagctcc tgagccgctt gtcgtgcatg gccgctgtag cagcacggtc aaaggaccca 4860 gtccttgtgg ccatcatgct ggctgacacc ggtcttgaga ttctggacag cacctttgtc 4920 gtgaagaaga tctccgactc gctctccagt ctctttcacg tgccggcccc cgtcttcagt 4980 ttcggagccc cgattctgtt ggccgggttg gtcaaagtcg cctcgagttt cttccggtcc 5040 acacccgaag accttgagag agcagaaaaa cagctcaaag cacgtgacat taacgacata 5100 ttcgccattc tcaagaacgg cgagtggctg gtcaagctga tccttgccat ccgcgactgg 5160 atcaaagcgt ggatcgcctc agaagaaaag tttgtcacca tgacggactt ggtgcctggt 5220 atccttgaaa agcagcggga tctcaacgac ccgagtaagt acaaggaagc caaggagtgg 5280 ctcgacaacg cgcgccaggc gtgtttgaag agcgggaacg ttcacattgc caatttgtgc 5340 aaagtggtcg ccccggcacc cagcaagtcg agacccgaac ccgtggtcgt ttgcctccgc 5400 ggcaaatccg gccaggggaa gagtttcctt gcgaacgtgc tcgcgcaagc aatctccacc 5460 cacttcaccg gcagaactga ttcggtttgg tactgcccgc ctgaccctga ccacttcgac 5520 ggttacaacc agcagaccgt tgtcgtgatg gacgatttgg gccagaaccc cgatggcaag 5580 gacttcaagt acttcgccca gatggtttcg accacggggt tcatcccgcc catggcctcg 5640 cttgaggaca aaggcaagcc tttcaacagc aaagtcatca ttgctaccac caacctgtac 5700 tcgggtttca ccccgagaac aatggtgtgt cctgacgcgc tgaaccggag gttccacttt 5760 gacatcgacg tgagtgccaa ggacgggtac aaagttaaca acaaattgga cataatcaaa 5820 gctcttgaag acacccacac caacccagtg gcgatgttcc aatacgactg tgcccttcta 5880 aacggtatgg cagttgaaat gaagagaatg caacaggata tgttcaagcc tcaaccaccc 5940 ctccagaacg tgtaccaact cgttcacgag gtgattgaac gggtcgagct ccacgagaag 6000 gtgtcgagcc acccgatttt caaacagata tcaattcctt cccaaaagtc tgtgttgtac 6060 ttcctcattg agaaaggcca acacgaagca gcaattgaat tctttgaggg aatggtgcat 6120 gactccatca aggaagagct ccggcccctc atccaacaga cctcatttgt gaaacgcgct 6180 tttaagcgcc tgaaggaaaa ctttgagact gttgccctgt gtttgactct tttggcaaac 6240 atagtgatca tgatccgcga gactcgcaag agacaacaga tggtggacga tgcagtgaat 6300 gactacattg agaaggcaaa catcaccaca gatgacaaga ctcttgacga ggcggaaaag 6360 aaccctctag agaccagcgg tgccagcact attggtttca gagagagaac tctcccgggg 6420 cacaaggcga gcgatgacgt gagctccgag cccgccaaac ccgtggagga ccgaccacaa 6480 gctgaagggc cctacgccgg accacttgag cgtcagaaac ctctgagagt gaaaaccaag 6540 ttgccacaac aggagggacc ctacgctggc ccgatggata gacagaaacc gttgaaagtg 6600 agagcaagag ccccggtcgt gaaggaggga ccctacgagg gaccggtgaa gaagcctgtc 6660 gctttgaaag tgaaagccaa gaacttgatt gtcactgaga gtggtgcccc accgaccgac 6720 ttgcagaaga tggtcatggg caacactaag cctgttgagc tcatcctcga cgggaagacg 6780 gtagccatct gctgtgctac cggagtgttt ggcactgcct acctcgtacc tcgtcacctc 6840 ttcgcggaga agtacgacaa gataatgttg gacggtagag ccatgacaga cagtgactac 6900 agagtgtttg agtttgagat taaagtaaaa ggacaggaca tgctctcaga cgctgcactc 6960 atggtgcttc accgtgggaa ccgcgtgaga gacatcacga aacattttcg tgacacagca 7020 agaatgaaga aaggcacccc cgttgtcggt gtgatcaaca acgccgacgt tgggagactg 7080 attttctctg gagaggccct tacctacaaa gacattgtag tgtgcatgga tggagacacc 7140 atgccgggcc tgtttgccta cagagccgcc accaaggctg gttactgcgg gggagccgtt 7200 ctcgccaagg acggagccga cacattcatc gttggcaccc actccgcagg tggtaacgga 7260 gttggatact gctcgtgcgt gtccaggtcc atgctcctga aaatgaaggc acacattgac 7320 cctgaaccac accacgaggg gttgattgtt gataccagag atgtggaaga gcgcgtgcat 7380 gtcatgcgta aaaccaagct tgcacccacc gtggcacacg gtgtgtttaa ccctgaattt 7440 ggtcccgctg ccttgtccaa caaggacccg cggctgaacg aaggggttgt cctcgatgaa 7500 gtcatcttct ccaaacacaa gggagacacg aaaatgtctg aggaggacaa agcgctgttc 7560 cgccgctgcg ctgccgacta cgcgtcgcac ttgcacagcg tgctggggac ggcaaatgcc 7620 ccattgagca tctatgaggc catcaaaggc gtcgacgggc tcgatgccat ggagccggac 7680 accgcgcccg gcctcccctg ggccctccag gggaaacgcc gtggtgcgtt gattgacttc 7740 gagaacggca cggtcggacc cgaagtcgag gctgccctaa agctcatgga gaaaagagag 7800 tacaaatttg cttgccagac cttcctgaaa gacgagattc gtccgatgga aaaagtacgt 7860 gctggcaaga ctcgcattgt cgacgttttg cccgtggaac acattcttta caccaggatg 7920 atgattggca gattctgtgc tcaaatgcac acaaacaatg gaccgcagat tggctcagcg 7980 gtcggttgca atcctgatgt tgattggcaa agatttggca cacattttgc tcagtacaga 8040 aacgtgtggg atgtggacta ttcggccttt gatgctaacc actgcagtga cgcaatgaac 8100 atcatgtttg aggaggtatt tcgcacagac ttcggtttcc acccaaatgc tgagtggatt 8160 ctgaagactc ttgtgaacac ggagcacgcc tatgagaaca aacgtatcac tgttgagggc 8220 gggatgccgt ctggctgttc cgcgacaagc atcatcaaca caattttgaa caacatttat 8280 gtgctctacg ctcttcgtag acactatgag ggagttgagc tggacaccta caccatgatc 8340 tcctacggag atgacatcgt ggttgcaagt gactacgatc tggattttga ggctctcaaa 8400 ccccacttca aatctcttgg tcaaaccatc actccagctg acaaaagcga caaaggtttt 8460 gttcttggtc actccattac cgatgtcact ttcctcaaaa gacacttcca catggactat 8520 ggaactgggt tttacaaacc tgtgatggcc tcaaagaccc tcgaggccat tctctccttt 8580 gcacgccgtg ggaccataca ggagaagttg atctccgtgg caggactcgc cgtccactca 8640 ggacctgacg agtaccggcg tctctttgag cccttccagg gtctcttcga gattccaagc 8700 tacagatcac tttacctgcg ttgggtgaac gccgtgtgcg gtgacgcata atccctcaga 8760 tgtcacaatt ggcagaaaga ctctgaggcg agcgacgccg taggagtgaa aagcccgaaa 8820 gggcttttcc cgcttcctat tccaaaaaaa aaaaaaaaaa actagttcta gagcggccgc 8880 caccgcggtg gagctccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattgcg cgcttggcgt 8940 aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 9000 tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 9060 taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 9120 aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 9180 cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 9240 aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 9300 aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 9360 tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 9420 caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 9480 cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 9540 ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 9600 gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 9660 agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 9720 gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 9780 acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 9840 gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 9900 gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 9960 cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 10020 caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 10080 gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 10140 cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 10200 cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 10260 caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 10320 gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 10380 gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 10440 cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 10500 catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 10560 gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 10620 ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 10680 gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 10740 cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 10800 tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 10860 gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 10920 atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 10980 ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 11040 gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccac 11097 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Forward Primer <400> 2 gacaagactc ttgacgaggc ggaaa 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Reverse Primer <400> 3 gtcattcact gcatcgtcca ccatc 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Forward Primer <400> 4 ttgaaagtga gagcaagagc cccgg 25 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Reverse Primer <400> 5 tgccactggt ttcttaagtg gtccggcgta gggcc 35 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Forward Primer <400> 6 ttgaaagtga gagcaagagc cccgg 25 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Reverse Primer <400> 7 tgccactggt ttcttaagtg gtccggcgta gggcc 35

Claims

구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드에서 일부 유전자 부위를 결실(deletion) 및 치환(substitution)시켜 얻은 플라스미드를 포함하는 구제역 바이러스 O Manisa를 이용한 재조합 구제역 백신 바이러스에 있어서,
상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서 3B1 부위, 3B2 부위 및 3B3 부위로 구성된 3B 부위에서 3B1 부위의 일부를 치환시키고, 3B2 부위의 일부를 결실시켜 얻은 플라즈미드(pO-manisa-3B2d)를 포함하되,
상기 유전자 3B1 부위 중에서 치환 부위는 22∼36bp 부위이고, 유전자 3B2 부위 중에서 결실 부위는 37∼105bp인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 백신 바이러스.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
(1) 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계;
(2) 상기의 플라스미드의 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 중에서 일부 유전자 부위를 결실(deletion) 및 치환(substitution)시키는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계에서 얻은 일부 유전자가 결실 및 치환된 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 구제역 바이러스 O Manisa를 이용한 재조합 구제역 백신 바이러스의 제조방법에 있어서,
상기 플라스미드에 삽입된 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서 3B1 부위, 3B2 부위 및 3B3 부위로 구성된 3B 부위에서 3B1 부위의 일부를 치환시키고, 3B2 부위의 일부를 결실시키되,
상기 유전자 3B1 부위 중에서 치환 부위는 22∼36bp 부위이고, 유전자 3B2 부위 중에서 결실 부위는 37∼105bp인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 백신 바이러스의 제조방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제8항에 있어서,
상기 유전자 3B 부위의 치환 또는 결실은 서열번호 4의 포워드 프라이머(forward primer) 및 서열번호 5의 리버스 프라이머(reverse primer)를 이용한 PCR에 의해 실시하는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 백신 바이러스의 제조방법.
제8항에 있어서,
구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서 3A 부위 일부와 3B1 부위, 3B2 부위 및 3B3 부위로 구성된 3B 부위 중 3B1 부위의 일부를 치환시키고, 3B2 부위의 일부를 결실시키는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 백신 바이러스의 제조방법.
삭제
삭제
제8항에 있어서,
상기 세포는 염소 태아 혀 세포(ZZ-R) 및 어린 햄스터 신장 세포(BHK21) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 백신 바이러스의 제조방법.