KR101891602B1

KR101891602B1 - 구제역 o형 한국발생주 sea 지역형 및 me-sa 지역형의 방어항원이 동시에 발현되는 재조합 바이러스

Info

Publication number: KR101891602B1
Application number: KR1020170037868A
Authority: KR
Inventors: 박종현; 이광녕; 고영준; 고미경; 이서용; 김병한
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2017-03-24
Publication date: 2018-09-28

Abstract

본 발명은 구제역 O형 Manisa 및 동남아 지역형 SEA의 방어항원을 발현하는 재조합 구제역 바이러스 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 구제역 O형 혈청형에 대해 보다넓은 범위에서 방어효과를 극대화할 수 있다.

Description

구제역 O형 한국발생주 SEA 지역형 및 ME-SA 지역형의 방어항원이 동시에 발현되는 재조합 바이러스 {Recombinant foot-and-mouth disease virus expressing protective antigen of type O, SEA and ME-SA topotype}

본 발명은 구제역 O형 한국발생주 SEA 지역형 및 ME-SA 지역형의 방어항원이 동시에 발현되는 재조합 바이러스, 그 제조방법 및 백신으로서의 용도에 관한 것이다.

구제역(Foot and mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스성 수포질병으로 빠른 복제와 빠른 전파력이 특징이다. 이 질병은 그 경제적 중요성으로 인하여 세계동물보건기구(OIE)에 의하여 매우 중요한 동물 질병으로 분류되어 있으며, 발생시 국가간 교역이 불가능하여 축산물의 교역에 있어 가장 중요한 요소로 작용하고 있다.

상기 구제역 병원체는 단일가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데(Piconaviridae)과, 아프소바이러스(Aphthovirus)속에 속하며 7개의 다른 혈청형(A, O, C, Asia1, SAT 1, SAT2, SAT3)으로 분류되고 있다.

구제역 바이러스(Foot and mouth disease virus) O형 중에서도 약 8가지 이상의 지역형이 있다. 엄격하게 개발한다면 이러한 지역형에 대한 백신을 모두 개발하여 백신주로 사용하여야 한다. 그러나 모든 백신주 개발을 위해서는 야외주를 지속적으로 세포에 배양하여 적절한 증식력을 지녀야 하고, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되며 결과가 좋으리라는 보장도 없다. 따라서 기존의 정보가 많고 이미 증명된 백신 바이러스를 이용하여 필요로 하는 백신주를 새로 신속하게 개발하여 사용할 수 있도록 적절한 시기에 제작 가능한 형태로 만들어져야 할 것이다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 이미 구제역 백신주로 알려져 있는, 병원성이 약화된 바이러스를 기초로 바이러스 유전자로 구성된 기본 벡터를 이용하여 O형 중 중동-남아시아 주변지역 및 동남아지역에서 유행하는 바이러스에 대한 방어가 가능한 백신을 생산할 수 있는 새로운 재조합 바이러스를 제작하였다.

한국등록특허 제10-1535555호

따라서, 본 발명의 목적은 구제역의 O형 바이러스 중 ME-SA 및 SEA 지역형에 대한 방어능을 동시에 구비하여 백신 종독주로 유용하게 사용될 수 있는 재조합 구제역 바이러스를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 바이러스의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 예방용 백신 조성물을 제공함에 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 이용하여 구제역을 예방하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명자들은 구제역 바이러스 O형에 대하여 보다 넓은 범위의 방어능을 가지는 백신주를 개발하기 위해 연구한 결과, 구제역 01manisa 바이러스의 일부 유전자가 SEA 바이러스 지역형의 유전자로 치환된, 새로운 구제역 재조합 바이러스가 환경저항성을 가지면서 방어효과가 극대화됨을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명에 의하면 이하의 발명이 제공된다.

1) 구제역 O형 Manisa 유전체의 P1 유전자 중 VP1 부위가 구제역 O-SEA의 VP1 유전자로 치환되고, 상기 구제역 O형 Manisa 유전체의 3B 부위 중, 3B12 부위가 치환된 것인, 구제역 O형 Manisa 유전체 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드.

2) 상기 구제역 O형 Mnisa 유전체의 P1 유전자 중 VP2 부위의 145번째 아미노산 히스티딘이 타이로신으로 치환(H145Y)되고, 상기 치환된 O-SEA의 VP1 부위 중 17번째 아미노산 아스파라긴이 아스파트산으로 치환(N17D)된 것인, 구제역 O형 Manisa 유전체 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드.

3) 상기 재조합 플라스미드를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스.

4) 상기 재조합 바이러스는 구제역 O형 Manisa 및 SEA 지역형 주의 방어항원이 동시에 발현되는 것인, 재조합 구제역 바이러스.

5) (a) 구제역 O형 Manisa의 유전자를 재조합 벡터에 삽입하는 단계;

(b) 상기 (a)단계에서 얻은 제조합 벡터에서, 상기 구제역 O형 Manisa의 P1 유전자 중 VP1 부위를 구제역 O-SEA의 VP1 유전자로 치환하는 단계;

(c) 상기 (b)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 상기 구제역 O형 Manisa의 P1 유전자 중 VP2 부위의 145번째 아미노산 히스티딘을 타이로신으로 치환(H145Y)하고, 상기 치환된 구제역 O-SEA의 VP1 부위 중 17번째 아미노산 아스파라긴을 아스파트산으로 치환(N17D)하는 단계;

(d) 상기 (c)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 구제역 O형 Manisa의 3B12 부위를 치환하는 단계;를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법.

6) 상기에서 제조된 재조합 벡터를 세포에 도입하여 증식시키는 단계;를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.

7) 상기 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 예방용 백신 조성물.

8) 상기 재조합 구제역 바이러스를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 구제역의 예방 방법.

본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 구제역 O형 바이러스의 유전자 일부를 조작하여 동물에 병원성을 약화시킴으로써, 소독제 실험 또는 항바이러스 실험 등 실험실 내에서 다루기에 병원성 바이러스보다 더욱 안전하게 사용할 수 있는 장점을 지니고 있다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 하여 백신을 제작함으로써, 바이러스 역가가 원래의 바이러스와 크게 차이를 보이지 않으면서, 동남아시아를 비롯한 한국 주변 지역에서 발생하는 바이러스까지 넓은 범위에 걸쳐 방어할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 항원의 환경 저항성을 유도하도록 제작하여 저항성이 있으며 야외주와의 감별진단도 가능하여 백신 제작에 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1는 구제역 O 혈청형 백신 표준주의 방어 항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스의 게놈 모식도를 나타낸 것이다.
도 2은 구제역 O형 백신주 Manisa의 VP2, VP3, VP4 및 구제역 O형 백신주 SEA의 VP1 방어 항원단백질을 코딩하는 유전자 염기서열이 삽입된 재조합 플라스미드의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 도 2의 플라스미드에서 환경저항성 인자 2개 부위 (VP1과 VP2의 내부 유전자 1개씩)가 교체되고, 구제역 O Manisa의 3B1 과 3B2 부위가 A형의 3B3 및 SAT 형의 3B3로 교체된 플라스미드의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4은 확인된 O-AD-3B 구제역 바이러스가 감염된 세포에서의 항원이 발현됨을 간이항원 키트 (SP 밴드는 밴드형성, NSP는 미형성)에 의해 확인한 것으로 NSP가 밴드가 미형성된 것을 통해 항원 및 혈청학적으로도 야외주와의 감별이 가능한 것이다.
도 5은 마우스에서의 7일 면역 후 (1.5~0.5 μg, 1/10~1/30 dose) 공격접종 실험 (SEA 지역형, O/SKR/Jincheon/2014)을 통해서 마우스의 생존율 및 체중감소를 조사한 결과이다. 결과에 따르면 약 0.5 μg 정도면 SEA 지역형의 방어에 문제없는 정도의 항원으로 확인되었다.
도 6은 마우스에서의 항원 dose 별로 7일 면역 후 (1.5~0.046 μg, 1/10~1/320 dose)공격접종 실험 (ME-SA 지역형, O/VN/2013)을 통해서 마우스의 생존율을 조사한 결과이다. 이 결과에 따르면 0.046 μg (1/320 dose) 까지 희석된 백신을 접종하여도 ME-SA 지역형 바이러스에 대한 방어가 가능함을 확인하였다. SEA지역형 보다 약 10배 정도 더욱 방어능이 좋은 것으로 확인되었다.
도 7은 마우스에서 시제 백신을 2개월간 4℃에서 보관 후 보존성 (안정성)을 측정하기위해 면역 후 (1.5 μg, 1/10 dose) 를 접종하고 3주 후 공격접종 생존율 및 체중 변화를 측정한 결과로 모든 마우스가 생존하여 보존성이 인정되었다.
도 8은 기니픽에서 면역시험 (1차 후 2주 후 2차 접종 1주 후 채혈)을 통해 얻어진 혈청으로 면역된 항체에 대해 ELISA 항체수준 및 각 바이러스 별로 면역학적 상관성을 조사한 결과이다. SEA형 보다는 ME-SA 지역형이 좋은 중화항체 형성을 보였다.
도 9은 소에서의 면역실험 (1차 접종 후 3주 후 채혈)을 통해 면역학적 상관성 조사를 실시한 결과이다. 소의 경우도 기니픽의 경우와 비슷하게 SEA형 보다는 ME-SA 지역형이 좋은 중화항체형성 경향을 보였다.
도 10은 돼지에서의 면역실험을 통해 확인된 항체 수준을 ELISA 및 중화시험법에 의해 평가한 것이다. 대조군인 3가 백신(O Mansia, A22 Iraq, Asia1 Shamir형 trivalent vaccine, 6PD50 이상) 보다 백신 항체 및 2014 발생 진천주의 중화항체가 더 잘 형성되었다.

본 발명은 구제역 O형 바이러스의 유전자를 포함하는, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 재조합 플라스미드에 관한 것으로서, 구제역 O형 Manisa 유전체의 P1 유전자 중 VP1 부위가 구제역 O-SEA의 VP1 유전자로 치환되고, 상기 구제역 O형 Manisa 유전체의 3B 부위 중, 3B12 부위가 치환된 것인, 구제역 O형 Manisa 유전체 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드에 관한 것이다.

본 발명에서 "P1 유전자"는 P1 단백질을 코딩하는 염기서열로, VP1, VP2, VP3 및 VP4 부위를 포함할 수 있으며, 본 발명에서는 상기 부위는 단백질을 코딩하는 염기서열, 단백질을 코딩하지 않은 염기서열 및 유전자를 포함하는 개념으로 사용된다.

상기 구제역 O형 바이러스의 유전자는 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자인 것을 특징으로 한다. 상기 전체 유전자 부위 중에서 3B1 부위 및 3B2 부위 일부를 치환시킬 수 있다. 상기 3B1 및 3B2의 치환부위는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 본 발명의 재조합 플라스미드 중 6483 내지 6626bp 부위가 바람직하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "구제역 바이러스 O형 Manisa 주"는 O형 백신에서 가장 널리 쓰이는 백신 바이러스로서, O형 중 ME-SA(중동-남아시아형, PanAsia 지역형을 포함)에 대한 바이러스에 대한 방어가 가능한 것으로 알려져 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 의하면, 상기 본 발명의 재조합 플라스미드는 상기 구제역 O형 Mnisa 유전체의 P1 유전자 중 VP2 부위의 145번째 아미노산 히스티딘이 타이로신으로 치환(H145Y)되고, 상기 치환된 O-SEA의 VP1 부위 중 17번째 아미노산 아스파라긴이 아스파트산으로 치환(N17D)된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명은 상기 재조합 플라스미드를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 바이러스는 구제역 O형 Manisa 및 SEA 지역형 주의 방어항원이 동시에 발현되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명은

(a) 구제역 O형 Manisa의 유전자를 재조합 벡터에 삽입하는 단계;

(d) 상기 (c)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 구제역 O형 Manisa의 3B12 부위를 치환하는 단계;를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 재조합 벡터를 세포에 도입하여 증식시키는 단계;를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 선별 표지 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터 및 재조합 구제역 바이러스는 통상의 유전자조작법, 형질전환법에 의해 제조될 수 있으며, 적은 양으로 형성된 바이러스를 세포배양을 통한 연속 계대로 적절한 양의 바이러스를 수득할 수 있다.

본 발명의 세포는 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과 동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과, 토끼과, 설치류 및 영장류의 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포에서 유래된 것일 수 있고, 바람직하게는 염소 혀 세포 (ZZR) 및 햄스터 신장 세포 (BHK-21), 흑염소 신장세포 (BGK), 돼지 신장세포 (IBRS-2) 및 소 신장세포 (LF-BK)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 구제역 예방용 백신 조성물에 있어서, 상기 백신은 생백신, 약독화된 백신, 또는 사백신일 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 재조합 구제역 바이러스과 함께 구제역 감염의 예방 효과가 우수한 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 수크로오스 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 개체의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 구제역의 예방 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명의 내용을 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실험예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재조합 플라스미드 pO-AD 의 제작

1. 재조합 플라스미드 pO-AD의 제작

구제역 O-Manisa 바이러스 전체 유전자(GenBank Accession No. AY593823.1)를 PCR에 의하여 증폭하고, 플라스미드(pBluescript SK II)에 O-Manisa 유전자를 삽입하여 재조합 플라스미드 pO-Manisa를 제작하였다 (특허등록 10-1535555호, 2015.7.3.).

상기의 방법으로 제조한 pO-Manisa 이용하여 pO-Manisa P1의 VP1을 (정방향 프라이머 Andong VP1 F: 5’-ACCACTTCGACAGGCGAGT-3’;서열번호 2, 역방향 프라이머 Andong VP1 R: 5’-CTGCTTTACAGATGCCACT-3’서열번호 3)를 이용하여 O/Andong/SKR/2010 바이러스(GenBank Accession No. KF112887.1)의 VP1 유전자를 PCR을 이용해 증폭시켰다.

벡터의 증폭은, 서열번호 4의 정방향 프라이머(5'-CTTCTAAATTTTGACCTGCTCAAATTGGCGGG -3') 및 서열번호 5의 역방향 프라이머(5'-CTGTGTGCGAGCATCCACC-3')를 사용하여 증폭 후, O/Andong/2010 주의 VP1 유전자 와 증폭된 선형화된 PCR 산물인 pO-manisa-vector 에 결찰하여, pO-AD 플라스미드를 제조하였다 (도1).

이때, 상기 PCR은 하기와 같이 수행하였다. 5X 완충액 (FINNZYMES, 10 ㎕), 10mM dNTPs (1 ㎕), Phusion enzyme (2 U/㎕, 0.5 ㎕), 멸균증류수 (35.5 ㎕)의 용량으로 98℃에서 30초 후, 98℃에서 10초, 65℃에서 30초, 72℃에서 60초를 한 주기로 25 주기로 PCR을 수행한 후, 최종 72℃에서 10분 동안 반응을 실시하였다. 그 후, 증폭된 VP1 유전자와의 결찰반응 (TAKARA Long Ligation kit)을 수행하였으며, 전체 염기서열 분석을 통하여 적절히 클로닝(pO-AD)된 것을 확인하였다.

실시예 2. 환경 저항성 플라스미드 pO-AD-3B의 제작

환경저항성 플라스미드를 만들기 위해 실시예 1에서 제조된 pO-AD 플라스미드 중에서, pO-Manisa VP2 유전자 중 H145Y 부위와 Andong VP1 유전자 중 N17D 부위를 치환하여 재조합 유전자가 삽입된 환경저항성 플라스미드(pO-AD-3B)를 제조하였다. 상기 H145Y 부위와 N17D 부위를 치환하기 위한 프라이머로 서열번호 6의 O1m VP2 H145Y F ((5’-TCCTTACCAGTTCATCAACCCTC-3) 와 서열번호 7의 O1m AD VP1 N17D R (5’-TGTGTCTCGCCGCCGTAATCCTCA-3)를 사용하여 PCR을 수행하였고, 벡터를 증폭시키기 위해 서열번호 8의 정방향 프라이머 (5'-GGTCCAGAGGCGCCACCACACAGA-3') 및 서열번호 9의 역방향 프라이머 (5'-GTGTCTCGCCACCGTAATCCTCA-3') 를 사용하여 증폭 후, 교체된 재조합 플라스미드를 결찰하여 VP2 H145Y, VP1 N17D 의 유전자가 교체된 pO-AD-3B를 제조하였다.

플라스미드	primer name	프라이머 염기서열	서열번호
O-AD	O1m AD VP1 F	5’- ACCACTTCGACAGGCGAGT -3’	서열번호 2
	O1m AD VP1 R	5’- CTGCTTTACAGATGCCACT -3’	서열번호 3
	vector F	5’-CTTCTAAATTTTGACCTGCTCAAATTGGCGGG-3’	서열번호 4
	vector R	5’- CTGTGTGCGAGCATCCACC -3’	서열번호 5
O-AD-3B	O1m VP2 H145Y F	5’- TCCTTACCAGTTCATCAACCCTC -3’	서열번호 6
	O1m AD VP1 N17D R	5’- TGTGTCTCGCCGCCGTAATCCTCA -3’	서열번호 7
	vector F	5’- GGTCCAGAGGCGCCACCACACAGA -3’	서열번호 8
	vector R	5’- AAGAGCGTGAGCTGGTACAGCTC -3	서열번호 9

실시예 3. 구제역 야외주와 감별 진단을 위한 pO-AD-3B 의 제작

실시예 2에서 VP2 H145Y, VP1 N17D 의 유전자가 교체된 플라스미드의 3B 부위 (3B333)는 합성된 서열(GGACCTTACGAGGGACCGGTGAAGAAGCCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGCTAAGAACTTGATTGTCACTGAGGGGCCATATGAAGGACCAGTGAAGAAACCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGCAAAAGCCCCGATTGTCACTGAA, 144 bps, 서열번호 1에서 6483~6626 위치에 해당)로 3B1 및 3B2 부위를 제거한 후 A형의 3B3 및 SAT 형의 3B3로 합성하여 삽입하는 작업을 실시하였다.

일반적으로 cDNA 합성시 사용되는 랜덤 프라이머를 이용하여 O-Manisa 바이러스에 대한 cDNA 작성후 전체 유전자가 클로닝된 것을 기초로 O-Manisa 바이러스 유전자 정보를 기초로 3A의 끝부분 유전자 및 3B3의 시작 부위 유전자 증폭이 가능한 특이 프라이머들(GenBank Accession No. AY593823.1를 기초로 5' 및 3' 유전자의 각 20 mers씩에 해당)를 작성하여 PCR을 실시하였으며, PCR를 위한 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs (1㎕), Phusion enzyme (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균증류수 (35.5㎕)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25 싸이클, 최종 72℃ 10분으로 반응을 실시하였다. 상기에서 작성된 벡터와 합성된 유전자와의 결찰반응 (TAKARA Long Ligation kit)을 수행하였으며, 전체 염기서열 분석을 통하여 적절히 클로닝(pO-AD-3B)것을 확인하였다. 하기 표 2는 3B1 및 3B2를 제거하고, A형 3B3 및 SAT형의 3B3 이 삽입된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

NSP 부위 조작	아미노산 서열	아미노산 크기	참고
3B12 deletion	GPYAGPLERQKPLRVKTKLPQQEGPYAGPMDRQKPLKVRARAPV	47 aa	-
3B33 addition	GPYEGPVKKPVALKVKAKNLIVTEGPYEGPVKKPVALKVKAKAPIVTE	48 aa	A type and SAT type

실시예 3. 본 발명의 플라스미드를 이용한 재조합 구제역 바이러스의 제조

재조합 구제역 바이러스의 회복은 확보된 상기 재조합 플라스미드(rAsiaM-Sham-3B)를 제한효소로 반응시켜 유전자를 단일 조각편으로 작성하고, BHKT7-9 세포(T7 RNA polymerase가 발현되는 세포주)에 리포펙타민 형질전환 시약 (라이프 테크놀로지)을 이용하여 정제된 DNA를 형질도입하여 2 내지 3일 동안 배양 후, 형성된 재조합 바이러스를 확보하였다. 이후, 확보된 바이러스를 ZZ-R (염소 태아 혀)세포 또는 BHK-21 (어린 햄스터 신장) 세포에서 연속계대를 통해 접종하여 바이러스를 증식시켰다.

실시예 4. 제작 백신의 동물에서의 면역원성

상술한 바와 같이 제작된 바이러스를 이용하여 동물실험을 위해서 정제한 구제역바이러스 항원 (15 μg/dose) 0.5ml을 오일 아쥬반트 ISA206이 포함된 아쥬반트 0.5ml를 이용하여 혼합하여 이중오일로 작성하였다. 이렇게 제작된 백신을 마우스 (C57/BL6), 기니픽(Hartley), 10-12주령 돼지, 6개월령 이상 소 등 구제역 항체가 없는 동물을 이용하여 마우스는 0.1ml, 기니픽은 0.2ml, 돼지 및 소는 1ml 를 접종하여 마우스에서는 각각 7~21일간 면역 후 공격접종하여 체중변화, 생존율을 관찰하였으며, 기니픽, 돼지 및 소에서는 각 시기별 항체 측정을 위해 채혈하였고, O형 항체 측정을 위해서 O형 SP-ELISA (Prionic 킷트 자체 메뉴얼) 및 백신주를 이용하여 중화시험(OIE 메뉴얼 표준시험법 기준)을 실시하여 항체 수준을 결정하였다.

상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예 및 시험예를 참조하여 설명하였지만 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

구제역 O형 혈청형의 광범위 방어항원 발현능을 보유하는 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스를 이용한 구제역 백신을 제공함으로써, 구제역의 치료 및/또는 예방에 기여할 수 있다.

<110> Animal and plant quaratine agency <120> Recombinant foot-and-mouth disease virus expressing protective antigen of type O, SEA and ME-SA topotype <130> 17-10708 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11096 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pO-AD-3B plasmid <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg 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ggtaacaagg acccacgggg ccaaaagcca cgtcctaccg 1500 gacccatcat gtgtgcaaac ccagcacggc aactttactg cgaaaaccac tttaaggtga 1560 cactgatact ggtactcaat cactggtgac aggctaagga tgcccttcag gtaccccgag 1620 gtaacacgcg acactcggga tctgagaagg ggactggggc ttctttaaaa gtgcccagtt 1680 taaaaagctt ctatgcctga ataggcgacc ggaggccggc gccttttcac tgttttacta 1740 ctgttttcat gaatacaact gactgtttca ccgccctgtt acacgctctc agagagatca 1800 aaacactgtt tcttttacgg acacaaggaa agatggaatt cacactttac aacggtgaga 1860 agaaaacctt ctactccaga cccaacaacc acgacaactg ctggcttaac accattctcc 1920 agttgttcag gtatgttgat gagcctttct ttgactgggt ctacgactcg cctgaaaacc 1980 tcactcttga ggcaatcaaa cagttggaag agacaaccgg tcttgagctg cacgagggtg 2040 gaccacccgc tctcgtcatc tggaacatca aacacttgct tcacaccgga atcggcactg 2100 cctcacgccc tagcgaggtg tgtatggtgg acggaacgga catgtgttta gctgattttc 2160 atgctggcat tttcctgaaa ggacaggaac atgctgtgtt cgcctgtgtc acctccaacg 2220 ggtggtacgc gattgatgac gaggactttt acccttggac accggacccg tccgacgttc 2280 tggtgtttgt cccgtacgat caagaaccgc ttaacggaga gtggaaaaca aaggtccaga 2340 aaaggctcaa gggagccggg caatccagcc cggcaaccgg gtcacagaac caatcaggca 2400 acactgggag catcatcaac aattactaca tgcagcagta ccaaaactcc atggacacac 2460 aacttggtga caacgctaca agcggaggct caaacgaggg gtccacggac acaacctcca 2520 cccacacaac caacactcag aacaacgact ggttctcgaa gctggccagt tccgctttca 2580 gcggtctttt cggcgctctt ctcgccgaca agaaaaccga ggagaccact cttctcgagg 2640 accgcatcct cactactcgt aacggacaca ccacctcgac aacccagtcg agcgttggag 2700 tcacgtacgg gtatgcaaca gctgaggatt tcgtgagcgg gccaaacacc tctggtctcg 2760 agaccagggt tgcccaggca gagcggttct ttaaaaccca cctgttcgac tgggtcacca 2820 gtgacccatt cggacggtgc cacctgctgg aacttccaac tgaccacaaa ggtgtctacg 2880 gcagcctgac cgactcgtat gcttatatga ggaacggctg ggatgttgaa gtcactgcag 2940 tgggaaacca gttcaatgga ggatgcctgt tggtggccat ggtgccagaa ctttgctcca 3000 tacagaagag ggagctgtac cagctcacgc tctttcctta ccagttcatc aaccctcgga 3060 cgaacatgac agcacacatc actgtgccct ttgttggcgt caaccgttat gaccagtaca 3120 aggtacacaa accttggacc ctcgtggtta tggttgtagc ccccctgact gtcaacagtg 3180 aaggtgcccc gcaaatcaag gtgtatgcca acatcgcacc taccaacgta cacgtcgcgg 3240 gtgagttccc ttccaaagag gggatcttcc ctgtggcttg cagcgatggt tatggcggtc 3300 tggtgaccac tgacccgaaa acggctgacc ccgcttacgg gaaagtgttt aacccccccc 3360 gcaacatgtt gccggggcgg ttcaccaatt ttcttgacgt ggctgaggcg tgccccacgt 3420 ttctccactt cgagggtgac gtgccatacg tgaccacgaa gacggattca gacagggtgc 3480 tcgctcagtt cgacttgtct ttggcagcaa agcacatgtc gaacaccttc cttgcaggtc 3540 tcgcccagta ctacacacag tacagcggca ccatcaacct gcacttcatg ttcacagggc 3600 ctactgacgc gaaggcgcgt tacatgattg cgtatgctcc tcctggcatg gaaccaccta 3660 aaacgccaga ggcggctgcc cactgcattc atgctgaatg ggacacaggg ttgaactcaa 3720 aattcacatt ttcaatccct tacctttcgg cggctgatta cgcttacaca gcgtctgaca 3780 ctgctgagac cacaaatgta cagggatggg tttgcctgtt tcaaataaca cacgggaaag 3840 ctgacggcga cgcactggtc gttttggcta gcgccggaaa ggactttgag ctgcgcctgc 3900 cggtggatgc tcgcacacag accacttcga caggcgagtc ggctgacccc gtgactgcca 3960 ccgttgagga ttacggcggc gagacacagg tccagaggcg ccaccacaca gacgtctcat 4020 tcatattgga cagatttgtg aaagtcacac caaaagactc aataaatgta ttggacctga 4080 tgcagacccc ctcccacacc ctagtagggg cgctcctccg cactgctact tactatttcg 4140 ctgatttaga ggtggcagtg aaacacaagg gggaccttac ctgggtgcca aatggagcac 4200 ctgaagcagc cttggacaac accaccaacc caacggcgta ccataaggcg ccgcttaccc 4260 ggctcgcatt gccctacacg gcaccacacc gtgttttggc caccgtttac aacgggaact 4320 gcaaatacgc cgggggctca ctgcccaacg tgagaggcga tctccaagtg ctggctcaga 4380 aggcagcgag gccgctgcct acttctttca actacggtgc catcaaagcc actcgggtga 4440 cagaactgct gtaccgcatg aagagggccg agacgtactg tcctcggccc ctcttggctg 4500 ttcacccgag tgcggccaga cacaaacaga aaatagtggc atctgtaaag cagcttctaa 4560 attttgacct gctcaaattg gcgggagatg tggagtccaa ccctgggccc ttcttcttct 4620 ccgacgtcag gtcaaatttc tcaaaactgg tagaaaccat caatcagatg caggaggaca 4680 tgtcaacaaa acacgggcct gactttaacc ggttggtgtc cgcatttgag gaattggcca 4740 ctggagtgaa ggctatcagg gccggtctcg acgaggccaa accctggtac aaactcatca 4800 agctcctgag ccgcttgtcg tgcatggccg ctgtagcagc acggtcaaag gacccagtcc 4860 ttgtggccat catgctggct gacaccggtc ttgagattct ggacagcacc tttgtcgtga 4920 agaagatctc cgactcgctc tccagtctct ttcacgtgcc ggcccccgtc ttcagtttcg 4980 gagccccgat tctgttggcc gggttggtca aagtcgcctc gagtttcttc cggtccacac 5040 ccgaagacct tgagagagca gaaaaacagc tcaaagcacg tgacattaac gacatattcg 5100 ccattctcaa gaacggcgag tggctggtca agctgatcct tgccatccgc gactggatca 5160 aagcgtggat cgcctcagaa gaaaagtttg tcaccatgac ggacttggtg cctggtatcc 5220 ttgaaaagca gcgggatctc aacgacccga gtaagtacaa ggaagccaag gagtggctcg 5280 acaacgcgcg ccaggcgtgt ttgaagagcg ggaacgttca cattgccaat ttgtgcaaag 5340 tggtcgcccc ggcacccagc aagtcgagac ccgaacccgt ggtcgtttgc ctccgcggca 5400 aatccggcca ggggaagagt ttccttgcga acgtgctcgc gcaagcaatc tccacccact 5460 tcaccggcag aactgattcg gtttggtact gcccgcctga ccctgaccac ttcgacggtt 5520 acaaccagca gaccgttgtc gtgatggacg atttgggcca gaaccccgat ggcaaggact 5580 tcaagtactt cgcccagatg gtttcgacca cggggttcat cccgcccatg gcctcgcttg 5640 aggacaaagg caagcctttc aacagcaaag tcatcattgc taccaccaac ctgtactcgg 5700 gtttcacccc gagaacaatg gtgtgtcctg acgcgctgaa ccggaggttc cactttgaca 5760 tcgacgtgag tgccaaggac gggtacaaag ttaacaacaa attggacata atcaaagctc 5820 ttgaagacac ccacaccaac ccagtggcga tgttccaata cgactgtgcc cttctaaacg 5880 gtatggcagt tgaaatgaag agaatgcaac aggatatgtt caagcctcaa ccacccctcc 5940 agaacgtgta ccaactcgtt cacgaggtga ttgaacgggt cgagctccac gagaaggtgt 6000 cgagccaccc gattttcaaa cagatatcaa ttccttccca aaagtctgtg ttgtacttcc 6060 tcattgagaa aggccaacac gaagcagcaa ttgaattctt tgagggaatg gtgcatgact 6120 ccatcaagga agagctccgg cccctcatcc aacagacctc atttgtgaaa cgcgctttta 6180 agcgcctgaa ggaaaacttt gagactgttg ccctgtgttt gactcttttg gcaaacatag 6240 tgatcatgat ccgcgagact cgcaagagac aacagatggt ggacgatgca gtgaatgact 6300 acattgagaa ggcaaacatc accacagatg acaagactct tgacgaggcg gaaaagaacc 6360 ctctagagac cagcggtgcc agcactattg gtttcagaga gagaactctc ccggggcaca 6420 aggcgagcga tgacgtgagc tccgagcccg ccaaacccgt ggaggaccga ccacaagctg 6480 aaggacctta cgagggaccg 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ttgattgttg ataccagaga tgtggaagag cgcgtgcatg 7380 tcatgcgtaa aaccaagctt gcacccaccg tggcacacgg tgtgtttaac cctgaatttg 7440 gtcccgctgc cttgtccaac aaggacccgc ggctgaacga aggggttgtc ctcgatgaag 7500 tcatcttctc caaacacaag ggagacacga aaatgtctga ggaggacaaa gcgctgttcc 7560 gccgctgcgc tgccgactac gcgtcgcact tgcacagcgt gctggggacg gcaaatgccc 7620 cattgagcat ctatgaggcc atcaaaggcg tcgacgggct cgatgccatg gagccggaca 7680 ccgcgcccgg cctcccctgg gccctccagg ggaaacgccg tggtgcgttg attgacttcg 7740 agaacggcac ggtcggaccc gaagtcgagg ctgccctaaa gctcatggag aaaagagagt 7800 acaaatttgc ttgccagacc ttcctgaaag acgagattcg tccgatggaa aaagtacgtg 7860 ctggcaagac tcgcattgtc gacgttttgc ccgtggaaca cattctttac accaggatga 7920 tgattggcag attctgtgct caaatgcaca caaacaatgg accgcagatt ggctcagcgg 7980 tcggttgcaa tcctgatgtt gattggcaaa gatttggcac acattttgct cagtacagaa 8040 acgtgtggga tgtggactat tcggcctttg atgctaacca ctgcagtgac gcaatgaaca 8100 tcatgtttga ggaggtattt cgcacagact tcggtttcca cccaaatgct gagtggattc 8160 tgaagactct tgtgaacacg gagcacgcct atgagaacaa acgtatcact gttgagggcg 8220 ggatgccgtc tggctgttcc gcgacaagca tcatcaacac aattttgaac aacatttatg 8280 tgctctacgc tcttcgtaga cactatgagg gagttgagct ggacacctac accatgatct 8340 cctacggaga tgacatcgtg gttgcaagtg actacgatct ggattttgag gctctcaaac 8400 cccacttcaa atctcttggt caaaccatca ctccagctga caaaagcgac aaaggttttg 8460 ttcttggtca ctccattacc gatgtcactt tcctcaaaag acacttccac atggactatg 8520 gaactgggtt ttacaaacct gtgatggcct caaagaccct cgaggccatt ctctcctttg 8580 cacgccgtgg gaccatacag gagaagttga tctccgtggc aggactcgcc gtccactcag 8640 gacctgacga gtaccggcgt ctctttgagc ccttccaggg tctcttcgag attccaagct 8700 acagatcact ttacctgcgt tgggtgaacg ccgtgtgcgg tgacgcataa tccctcagat 8760 gtcacaattg gcagaaagac tctgaggcga gcgacgccgt aggagtgaaa agcccgaaag 8820 ggcttttccc gcttcctatt ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa ctagttctag agcggccgcc 8880 accgcggtgg agctccagct tttgttccct ttagtgaggg ttaattgcgc gcttggcgta 8940 atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat 9000 acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt 9060 aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta 9120 atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc 9180 gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 9240 ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 9300 aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 9360 ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 9420 aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 9480 gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 9540 tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 9600 tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 9660 gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 9720 cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 9780 cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 9840 agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 9900 caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 9960 ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 10020 aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 10080 tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 10140 agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 10200 gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 10260 accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 10320 tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 10380 tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc 10440 acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 10500 atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 10560 aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 10620 tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 10680 agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc 10740 gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 10800 ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg 10860 atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa 10920 tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt 10980 tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 11040 tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccac 11096 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for O1m AD VP1 <400> 2 accacttcga caggcgagt 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for O1m AD VP1 <400> 3 ctgctttaca gatgccact 19 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for O-AD vector <400> 4 cttctaaatt ttgacctgct caaattggcg gg 32 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for O-AD vector <400> 5 ctgtgtgcga gcatccacc 19 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for pO-Manisa VP2 <400> 6 tccttaccag ttcatcaacc ctc 23 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Andong VP1 <400> 7 tgtgtctcgc cgccgtaatc ctca 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for O-AD-3B vector <400> 8 ggtccagagg cgccaccaca caga 24 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for O-AD-3B vector <400> 9 aagagcgtga gctggtacag ctc 23

Claims

구제역 O형 Manisa 유전체의 P1 유전자 중 VP1 부위가 구제역 O-SEA의 VP1 유전자로 치환되고,
상기 구제역 O형 Manisa 유전체의 3B 부위 중, 3B12 부위가 3B33 부위로 치환된 것인, 구제역 O형 Manisa 유전체 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드에 있어서,
상기 구제역 O형 Manisa 유전체의 P1 유전자 중 VP2 부위의 145번째 아미노산 히스티딘이 타이로신으로 치환(H145Y)되고, 상기 치환된 O-SEA의 VP1 부위 중 17번째 아미노산 아스파라긴이 아스파트산으로 치환(N17D)되며,
상기 재조합 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 구제역 O형 Manisa 유전체 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드.
삭제
제1항의 재조합 플라스미드를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스.
제3항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 O형 Manisa 및 SEA 지역형 주의 방어항원이 동시에 발현되는 것인, 재조합 구제역 바이러스.
(a) 구제역 O형 Manisa의 유전자를 재조합 벡터에 삽입하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 얻은 제조합 벡터에서, 상기 구제역 O형 Manisa의 P1 유전자 중 VP1 부위를 구제역 O-SEA의 VP1 유전자로 치환하는 단계;
(c) 상기 (b)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 상기 구제역 O형 Manisa의 P1 유전자 중 VP2 부위의 145번째 아미노산 히스티딘을 타이로신으로 치환(H145Y)하고, 상기 치환된 구제역 O-SEA의 VP1 부위 중 17번째 아미노산 아스파라긴을 아스파트산으로 치환(N17D)하는 단계; 및
(d) 상기 (c)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 구제역 O형 Manisa의 3B12 부위를 3B33 부위로 치환하는 단계;를 포함하되
상기 재조합 벡터는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터의 제조방법.
제5항에서 제조된 재조합 벡터를 세포에 도입하여 증식시키는 단계;를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 세포는 염소 태아 혀 세포(ZZ-R) 및 햄스터 신장 세포(BHK-21) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
제3항의 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 예방용 백신 조성물.
제8항에 있어서, 상기 백신은 생백신, 약독화된 백신, 또는 사백신인 것인, 구제역 예방용 백신 조성물.
제3항의 재조합 구제역 바이러스를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 구제역의 예방 방법.