CN114350623A - 一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法，将羊传染性脓疱病毒毒力基因突变失活，所述毒力基因突变为ORFs 120/121双基因突变。缺失ORFs 120/121基因后ORFV的致病性显著降低。本发明通过敲除ORFV‑SY17毒株ORFs 120/121基因获得双基因缺失的羊传染性脓疱病毒减毒株，具备作为制备羊传染性脓疱病基因缺失减毒活疫苗生产毒株的潜在应用价值。缺失的ORFs 120/121基因也可作为标志基因，建立用于ORFV疫苗毒和野毒检测的鉴别诊断方法。

Description

一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及兽医领域，具体涉及一种荧光标记的羊传染性脓疱病毒双基因缺失毒株的制备方法及其应用。

背景技术

羊传染性脓疱病俗称“羊口疮(Orf)”，是由羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)感染引起绵羊、山羊等的一种急性、高度接触性的人兽共患传染病。该病是羊群常发疫病，主要危害3～6月龄羔羊，造成其生长/繁殖性能的下降甚至死亡，给我国乃至世界养羊业造成严重的经济损失。由于ORFV体外生存能力强，羊群一旦发生感染很难进行清除，可持续多年对羊群造成危害。因此，该病不仅对养羊业的危害较为突出，从事饲养、屠宰、兽医等职业的从业人员也常发生感染，对全球公共卫生安全也带来了严峻挑战。

目前尚无有效的特异性药物用于羊传染性脓疱病的治疗，疫苗接种仍然是预防和控制该病的重要措施，尽管针对ORFV疫苗研究也取得了积极的进展，但常规的灭活疫苗和弱毒疫苗存在的缺陷，使得疫苗的安全性和免疫保护效果尚待提高。因此急需开展安全有效的羊传染性脓疱病疫苗的创新，这对于羊传染性脓疱病的防治至关重要。

天然免疫是宿主抵御病原微生物入侵的第一道防线，在宿主抗病毒反应中发挥重要作用。ORFV是痘病毒科、副痘病毒属的代表种，基因组庞大，编码蛋白种类众多，研究发现，ORFV在长期进化过程中可通过末端基因组编码的多种免疫调节蛋白来拮抗宿主的天然免疫以利于自身的存活。此外，ORFV末端区的这些免疫调节基因也多为毒力相关基因，这些毒力基因的存在导致当前常规灭活疫苗的毒性作用大于预防效果，存在一定的安全隐患。当前，毒力基因缺失减毒疫苗是新型疫苗研究的一个热点，而构建、筛选及鉴定ORFV免疫调节/毒力基因缺失毒株将为后期羊传染性脓疱病毒基因缺失减毒活疫苗的研发提供重要的物质基础。

减毒活疫苗不仅具有有效诱导机体产生细胞免疫、体液免疫及黏膜免疫等优点，同时越来越多毒力基因的成功挖掘使得减毒疫苗的安全性能够获得保障，因此，安全有效的ORFV基因缺失减毒疫苗是未来开展新型、高效疫苗研发的一个重要方向，有望在羊传染性脓疱病防控中发挥重要作用。本发明选择ORFV基因组右末端的ORFs 120/121基因作为毒力基因敲除靶标，利用经典的同源重组技术成功构建ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株，其不仅具有作为制备羊传染性脓疱病基因缺失减毒活疫苗生产毒株的潜在应用价值，而且临床上可用于鉴别和诊断人工免疫羊和自然感染羊，有利于建立ORFV疫苗毒和野毒检测的鉴别诊断方法。

发明内容

本发明针对羊传染性脓疱病疫苗缺乏和已知疫苗的有效性不理想的现状，提供了一种荧光标记的羊传染性脓疱病毒(ORFV)ORFs 120/121双基因缺失毒株的构建方法，所述缺失ORFs120/121基因的毒株(ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP)是利用同源重组技术，从ORFV-SY17野毒株中敲除ORFs 120/121基因，并以绿色荧光蛋白(eGFP)基因作为筛选标记，以达到进一步减毒、降低生物安全风险的目的。该毒株减毒效果明显，与单独缺失ORF120基因相比，ORF120与ORF121基因序列进行联合缺失，进一步降低毒力。本发明提供的减毒株制备方法得到的减毒株，其安全性能良好，可潜在作为制备羊传染性脓疱病基因缺失减毒活疫苗的生产毒株，为新型疫苗研发提供候选毒株。将制备的ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP缺失毒株免疫本源动物羔羊，可提供对羊传染性脓疱病毒流行毒株100％免疫保护，有望作为安全、有效防控羊传染性脓疱病的疫苗，是一种具有良好发展应用前景的疫苗候选株。

进一步的本发明提供了一种鉴别上述缺失ORFs 120/121基因的羊传染性脓疱病毒减毒株与野毒株鉴别的引物对，同时缺失的ORFs 120/121基因也可作为标志基因，建立用于ORFV疫苗毒和野毒检测的鉴别诊断方法。

本发明建立羊传染性脓疱病毒基因缺失减毒疫苗毒株的构建方法，用于筛选安全、有效的疫苗候选毒株。

本发明提供了一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法，将羊传染性脓疱病毒毒力基因突变失活，所述毒力基因突变为ORFs 120/121双基因突变。

优选的是，所述毒力基因突变ORFs 120/121双基因缺失突变。

上述任一项优选的是，所述羊传染性脓疱病毒为羊传染性脓疱病毒ORFV-SY17株，全长基因序列如GenBank：MG712417.1所述。

上述任一项优选的是，缺失的ORFs 120/121基因序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

上述任一项优选的是，所述ORFs 120/121双基因缺失突变为ORFV-SY17株全长序列的120779至122185位核苷酸缺失突变。

上述任一项优选的是，具体包括以下步骤：

步骤1：准备亲本毒株，所述亲本毒株为羊传染性脓疱病毒ORFV-SY17株，全长基因序列如GenBank：MG712417.1所述；

步骤2：同源重组穿梭质粒的构建：分别扩增ORFV-SY17株的ORFs 120/121基因两侧的序列作为重组同源臂，克隆至pUC57-vvp7.5-eGFP筛选表达盒上，获得携带标记基因eGFP的pUC57-LFΔORFs120/121-eGFP-RFΔORFs 120/121重组穿梭质粒；通过步骤2，在基因缺失的部位通过同源重组插入绿色荧光蛋白基因(eGFP)作为标记物，具有同等作用的荧光素DsRED,RFP,mCherry,tdTomato,YFP均可作为筛选标记。

步骤3：利用步骤2制备的pUC57-LFΔORFs 120/121-eGFP-RFΔORFs 120/121质粒DNA转染已感染ORFV-SY17野毒株的OFTu细胞，通过荧光斑法和有限稀释法获得表达绿色荧光蛋白的缺失病毒ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP；

步骤4：将ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP作为候选毒株，敲除GFP，制备得到羊传染性脓疱病毒ORFs120/121双基因缺失毒株。

上述任一项优选的是，ORFs 120/121基因两侧的左、右重组同源臂序列如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。

上述任一项优选的是，利用PCR扩增所述重组同源臂，PCR扩增的引物序列如SEQID NO.4～7所示。

本发明提供了上述任一项所述的制备方法在制备羊传染性脓疱病基因缺失减毒活疫苗中的应用。

本发明提供了上述任一项所述的制备方法在鉴别和诊断人工免疫羊和自然感染羊中的应用。

在本发明一项优选的实施方式中，ORFV ORFs120/121双基因缺失减毒株利用同源重组制备的具体包括：

(1)重组转移载体的构建：分别设计合成用于ORFs120/121基因上、下游序列扩增的特异性引物序列分别为：LFΔORFs 120/121-Fw：SEQ ID NO.4所示；LFΔORFs 120/121-Rv：SEQ ID NO.5所示；RFΔORFs 120/121-Fw：SEQ ID NO.6所示；RFΔORFs 120/121-Rv：SEQ ID NO.7所示。PCR扩增ORFV-SY17株的ORF120/121基因两侧的序列作为重组同源臂，克隆至pUC57-vvp7.5-eGFP筛选表达盒上，获得携带标记基因eGFP的pUC57-LFΔORFs 120/121-eGFP-RFΔORFs 120/121重组穿梭质粒。

(2)细胞转染及重组病毒筛选：将羊传染性脓疱病毒原始毒株(野生型毒ORFV-SY17株)以MOI＝0.1接种至OFTu细胞，之后将pUC57-LFΔORFs 120/121-eGFP-RFΔORFs120/121重组穿梭质粒DNA经脂质体转染至已接毒细胞中，经倒置荧光显微镜观察重组病毒的感染情况。消化细胞后，挑选单个荧光细胞经反复冻融释放病毒，随后再次接种OFTu细胞，观察出现荧光的细胞孔。

(3)重组病毒的纯化及鉴定：利用有限稀释法、蚀斑纯化、扩大培养、纯度检验、PCR鉴定等方法进行检测，以确保获得纯净的ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株。

本发明实施例中目的基因PCR测定结果显示，所述ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株相对于ORFV-SY17原始毒株全长序列缺失了第120779至122185位核苷酸。

进一步，本发明提供一种上述ORFV ORFs 120/121双基因缺失减毒株在羊传染性脓疱病新型疫苗研发中的潜在应用。所述ORFV ORFs 120/121双基因缺失减毒株优选的使用剂量为5×10^5.5～2×10^6.5TCID₅₀，进一步优选为5×10^5.5、8×10^5.5、1×10^6.0、3×10^6.0、7×10^6.0、1×10^6.5、2×10^6.5TCID₅₀。

本方面还提供了一种鉴别上述缺失ORFs 120/121基因的羊传染性脓疱病毒减毒株与野毒株鉴别的引物对：JD-Fw:SEQ ID NO.8所示；JD-Rv:SEQ ID NO.9所示。

本发明提供了上述任一项所述的制备方法在鉴别和诊断ORFV基因缺失减毒疫苗株和自然感染ORFV野毒株中的应用。

通过上述制备方法获得的缺失ORFs 120/121基因的羊传染性脓疱病毒减毒株，其缺失的ORFs 120/121基因也可作为标志基因，建立用于ORFV疫苗毒和野毒检测的鉴别诊断方法。

本发明提供了SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物序列在人工免疫羊自然感染羊的鉴别和诊断中的应用，所述人工免疫羊由上述任一项所述的制备方法获得的缺失ORFs 120/121基因的羊传染性脓疱病毒减毒株免疫获得。

本发明提供的羊传染性脓疱病毒ORFs 120/121双基因缺失毒株在后期应用上具有以下优势：在安全性方面，本发明构建的ORFs 120/121双基因缺失毒株在免疫羔羊后，即使是利用10^6.5TCID₅₀剂量的减毒株病毒免疫动物均无“口疮”等临床表现及病理变化，免疫动物存活率100％，无感染，相对于ORF 120单基因缺失毒株，ORFs 120/121双基因联合缺失毒株致弱更充分，作为潜在疫苗毒应用更为安全。在有效性方面，强毒攻击后，本发明构建的ORFs 120/121双基因缺失毒株免疫保护率为100％，表明具有极佳的免疫保护力，明显优于国内常规灭活和弱毒疫苗报道使用的保护效果。

本发明的研究成果益处在于：

(1)ORF120基因、ORF121基因是ORFV致病的重要毒力基因，同时，ORF120具有调节宿主细胞天然免疫应答的功能，缺失ORFs 120/121基因后ORFV的致病性显著降低。

(2)本发明通过敲除ORFV-SY17毒株ORFs 120/121基因获得双基因缺失的羊传染性脓疱病毒减毒株，具备作为制备羊传染性脓疱病基因缺失减毒活疫苗生产毒株的潜在应用价值，对于该病的防控具有重要的意义。

(3)本发明提供了一种鉴别上述缺失ORFs 120/121基因的羊传染性脓疱病毒减毒株与野毒株鉴别的引物对，此外，缺失的ORFs 120/121基因也可作为标志基因，建立用于ORFV疫苗毒和野毒检测的鉴别诊断方法。

附图说明

图1为本发明优选实施例1中ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株敲除策略示意图。

图2为本发明优选实施例1中ORFs 120/121基因左、右同源臂的PCR扩增结果。

图3为本发明优选实施例1中ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株的筛选结果。

图4为本发明优选实施例1中ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株的扩大培养。

图5为本发明优选实施例1中ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株的PCR鉴定结果。

图6为本发明优选实施例2中亲本毒株ORFV-SY17与ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株的生长曲线对比。

图7为本发明优选实施例3中ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失、ORFV-SY17ΔORF120-eGFP单基因缺失、ORFV-SY17野毒对本源动物致病性的比较。

具体实施方式

本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。

实施例中所用材料来源：

细胞和病毒：原代胎羊鼻甲骨细胞(OFTu)分离自妊娠3～5月龄健康孕羊，麻醉孕羊，无菌取出胎羊，采集鼻甲骨组织剪碎，D-Hanks液体冲洗2～3次，加入0.25％胰蛋白酶消化处理30min，之后重复消化1～2次。收集细胞悬液，低速离心，弃去上清，将细胞重悬于含10％FBS的MEM培养基中，置37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。OFTu细胞用于质粒转染和病毒重组实验。

ORFV-SY17(GenBank：MG712417.1)毒株保存于吉林大学兽医病理学实验室，分装保存于－80℃备用。本发明所使用的ORFV-SY17为现有技术中已公开的毒株(Zhong J#,Guan J#,Zhou Y,Cui S,Wang Z,Zhou S,Xu M,Wei X,Gao Y,Zhai S,Song D,He W,Gao F,Zhao K*.Genomic characterization of two Orf virus isolates from Jilinprovince in China.Virus Genes,2019,55:490–501.)，公众可通过与作者共享的方式获得。

实施例1羊传染性脓疱病毒ORFs 120/121双基因缺失毒株的构建、筛选及鉴定

1.1重组穿梭质粒pUC57-LFΔORFs 120/121-eGFP-RFΔORFs 120/121的构建

根据同源臂基因片段最适原则，选择ORFV-SY17ORFs 120/121基因上、下游部分序列作为重组左右同源臂，左同源臂序列(LF)如SEQ ID NO.2所示，右同源臂序列(RF)如SEQID NO.3所示。进一步设计合成针对ORFV ORFs 120/121基因左右同源臂的特异性引物，引物序列如SEQ ID NO.4～7所示，分别为LFΔORFs 120/121-Fw：SEQ ID NO.4；LFΔORFs120/121-Rv：SEQ ID NO.5；和RFΔORFs 120/121-Fw：SEQ ID NO.6；RFΔORFs 120/121-Rv：SEQ ID NO.7。利用PCR扩增ORFV-SY17株的ORF120/121基因两侧的序列作为重组同源臂，PCR扩增条件为98℃15s,55℃15s,72℃20s,36个循环，分别对左、右同源臂的PCR扩增产物进行胶回收。图2为ORFs 120/121基因左、右同源臂的PCR扩增结果。(A)左同源臂扩增结果；M:DL2000DNA Marker；1-2:左同源臂的PCR扩增结果；(B)右同源臂扩增结果；M:DL2000DNAMarker；1-2:右同源臂的PCR扩增结果。

测序正确后通过无缝连接盒克隆入本实验室构建保存的pUC57-vvp7.5-eGFP筛选表达盒中，制备DH5α感受态细胞进行转化，将DH5α感受态细胞-连接产物转移至1mL无菌LB液体培养基中，37℃摇床孵育1h后，取出200μL菌液加入含Amp抗性的LB固体平板，37℃倒置过夜。挑取单个菌落，在含Amp抗性LB培养基内培养，37℃摇床160r/min过夜。经测序鉴定正确的菌液，利用Endo-free Plasmid Mini Kit П试剂盒提取质粒，获得携带标记基因eGFP的pUC57-LFΔORFs 120/121-eGFP-RFΔORFs 120/121重组穿梭质粒，浓度测定为1,555ng/μL，之后置于-20℃保存备用。重组策略如图1所示，缺失的ORFs120/121基因序列位于羊传染性脓疱病毒全基因组中第120779至122185位核苷酸，序列如SEQ ID NO.1所示。

pUC57-vvp7.5-eGFP筛选表达盒：利用分子克隆常规技术，用绿色荧光蛋白eGFP作为标记基因，以pUC57克隆质粒为载体骨架，插入痘苗病毒(Vaccinia virus,VV)早晚期p7.5启动子(VV p7.5)，构建得到，其具体构建方法为本领域常规技术再此不进行赘述，具体序列信息如SEQ ID NO.10所示。

1.2细胞转染及重组病毒筛选

将羊传染性脓疱病毒原始毒株(ORFV-SY17)以MOI＝0.1接种至长至约80％单层的OFTu细胞，加入含4％BI胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5％CO₂培养箱培养8h。参照

3000转染试剂使用说明书，将5μg pUC57-LFΔORFs 120/121-eGFP-RFΔORFs 120/121重组质粒经250μL Opti-

培养基稀释制成预混液，然后按1:1比例添加稀释的

3000试剂(125μL Opti-

培养基稀释3.75μL

3000转染试剂)，孵育15min后，每孔加入250μL质粒-脂质体复合物至上述接毒的细胞中。在37℃，5％CO₂培养箱继续孵育细胞72h后，经倒置荧光显微镜观察重组病毒的感染情况。对于荧光倒置显微镜下观察到绿色荧光区域(疑似携带eGFP荧光标志的双基因缺失病毒)，进行标记圈出，用移液器枪头刮取，反复冻融三次，收集备用以进行下一步的筛选。收集上述细胞病变液反复冻融3次，经4℃、1000r/min离心10min后，利用有限稀释法将其接种至预先铺设好OFTu细胞的96孔板进行筛选(图3a-f)，有限稀释法筛选7轮；之后将有限稀释后的荧光毒接种至12孔板，利用低熔点琼脂糖进行蚀斑筛选，筛选3次，结果如图3g-i所示。(图3为ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株的筛选结果。A/D/G：倒置显微镜明视野下细胞病变(CPE)观察结果(20×)；B/E/H：是与A/D/G相同区域的GFP荧光观察结果(20×)；C/F/I：分别是A与B，D与E，G与H的合成图。)

1.3重组病毒的扩大培养及纯化

挑选经蚀斑纯化后的单个蚀斑，反复冻融后接种至35mm细胞培养皿培养的OFTu细胞进行扩大培养。收集病变液，4℃、2000r/min离心10min，去除细胞碎片后，取上清液，将其加入预先制备的蔗糖梯度(依次从底部缓慢加入浓度为35％、45％、55％的蔗糖溶液)，之后4℃、20000r/min离心2h。离心完成后，使用长针头小心吸出乳白色的病毒带，加入适量DMEM进行重悬。将获得的重组病毒，命名为ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株。相对于羊传染性脓疱病毒ORFV-SY17毒株全长序列，ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株缺失了第120779至122185位核苷酸。

如图4所示为ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株的扩大培养，其中A：倒置显微镜明视野下细胞病变(CPE)观察(10×)；B：是与A相同区域的GFP荧光观察结果(10×)；C：A与B的合成图。

ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株的鉴定

利用病毒基因组DNA提取试剂盒提取ORFV-SY17原始毒株及ORFV ORFs120/121双基因缺失减毒株基因组，使用由库美生物有限公司合成鉴定引物(JD-Fw:SEQ ID NO.8所示；JD-Rv:SEQ ID NO.9所示)对其纯度进行鉴定，以确定是否成功缺失。PCR反应体系如下：基因组DNA模板1μL，PrimeSTAR Max Premix(2×)12.5μL，JD-Fw引物1μL，JD-Rv引物1μL，ddH₂O 9.5μL，共计25μL；PCR反应条件：98℃15s，62℃20s，72℃35s。取PCR扩增产物，经1％琼脂糖进行凝胶电泳观察，结果如图5所示，图5中M:DL15000 DNA Marker；1-4:分别为第3,6,9,12代次的PCR扩增结果；5:空白对照；6:阳性对照(ORFV-SY17野毒)。

实施例2 ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株的毒力及生长曲线测定

将经反复冻融ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株使用DMEM进行10倍倍比稀释后(10^-1-10^-10)，接种于细胞长至80％单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种1纵排(8孔)，每孔100μL；同时设正常细胞对照，逐日观察并记录各稀释度的病变孔数，按照Karber法测定ORFV-SY17ΔORFs120/121-eGFP双基因缺失减毒株的病毒滴度，TCID₅₀为10^5.5/0.1mL，表明ORFs 120-121基因的缺失对其在OFTu细胞上的复制影响不大。之后利用一步法(MOI＝10)和多步法(MOI＝0.1)对单基因缺失毒株ORFV-SY17ΔORF 120-eGFP、双基因缺失株ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP、野毒株ORFV-SY17的增殖特性进行评价，各毒株生长曲线对比结果见图6(其中A为一步生长曲线；B为多步生长曲线)，ORFV-SY17ΔORFs120/121-eGFP双基因缺失毒株与ORFV-SY17ΔORF 120-eGFP单基因缺失毒株、ORFV-SY17野毒株的生长规律基本一致，其生长速度较野生毒株、单基因缺失毒株没有明显差异。

实施例3 ORFV ORFs120/121双基因缺失减毒株的安全性及免疫保护效果评价

将9只ORFV抗体检测阴性的3-6月龄羔羊随机分为3组，接种方式采用下唇部划痕接种ORFV-SY17(n＝3)，ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株(n＝3)，DMEM液体(n＝3)，接种剂量为10^6.5TCID₅₀，逐日观察并记录接种羔羊唇部是否出现特征性的“口疮”病变。结果显示，ORFV-SY17野毒株在感染后第3d即可观察到病变，5-7d脓疱及结痂极为明显如图7h-k；随着时间延长5-7d时，无论ORFV-SY17ΔORFs 120-eGFP单基因缺失减毒株组还是ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株组，较ORFV-SY17野毒株组均出现好转。但在3到5d，ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株较ORFV-SY17ΔORFs120-eGFP单基因缺失接种羔羊的口疮病变较为轻微，仅出现局部微红，如图7a-g。(图7为ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失、ORFV-SY17ΔORF 120-eGFP单基因缺失、ORFV-SY17野毒对本源动物致病性的比较。a-d:ORFV-SY17ΔORF120-eGFP单基因缺失0-7d的变化图；e-h:ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失0-7d的变化图，ORFV-SY17野毒0-7d的变化图。)并进行攻毒保护试验，结果证明ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP减毒株动物试验具有完全免疫保护及非常好的安全性效果，如表1。

表1 ORFV-SY17ΔORFs120/121-eGFP安全性效果

注：“/”代表未进行攻毒保护试验。

实施例4 ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒疫苗株和自然感染ORFV野毒的鉴定和诊断

采集感染羊组织样品，液氮充分研磨后加入TRansZol UP试剂1ml，冰上裂解5min，按照TransZol Up Plus RNA Kit试剂盒说明书提取病料RNA，反转录42℃1h，72℃15min获得cDNA，利用合成的如JD-Fw:SEQ ID NO.8以及JD-Rv:SEQ ID NO.9所示的鉴定引物进行PCR扩增，用于缺失ORFs 120/121基因的羊传染性脓疱病毒减毒株与野毒株感染的鉴别。PCR反应体系：基因组cDNA模板1μL，PrimeSTAR Max Premix(2×)12.5μL，JD-Fw引物1μL，JD-Rv引物1μL，ddH₂O 9.5μL，共计25μL；PCR反应条件：98℃15s，62℃20s，72℃35s。取PCR扩增产物，1％琼脂糖凝胶电泳观察，如图5第1-4泳道所示，ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株免疫羊的样本扩增片段为1656bp，而图5第6泳道结果显示，采集自ORFV-SY17野生毒株感染羊扩增片段为2050bp，故可根据扩增片段长度的差异进行鉴定。

实施例4所述ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株免疫羊的免疫方法与实施例3相同，接种方式采用下唇部划痕接种ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP双基因缺失减毒株，接种剂量优选为5×10^5.5、8×10^5.5、1×10^6.0、3×10^6.0、7×10^6.0、1×10^6.5或10^6.5TCID50。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccccctccgt actcggctcg acgagttcgg aaccaagctc ggaagacgct gtggcttcga 60

gcacaactac aagcacattc acaagcacac tcactctgtc cacaagtgtg gacaccacta 120

ctacctcggg cgctacaacg tccgcaaaca gcactcctgc agcgagtgtg agctcctcca 180

cacccgcaac caccgaggca tcgacggcac caacgacgcc gtcgacgccg acgacagtga 240

agggcaagga agacgcgaag gcgtctgcct acctcgcttt actaatcacg ttcatggtca 300

tgaccacgct agtgatggtc gtggtcgtgg tcgtggtcgt gtacaaacag ggactctgtg 360

actgctgctg taggatgttt ccctgctgca gagagctcaa ggactacctc gacgaggagg 420

agagcgccgg tctgtacgac gccttgacgt ggagccactc gaaccccggc ttccggctcg 480

tcatgcgcgc ggaccccaga tgatgaggat cagattggcg tgtttttccc gcccgtcgcg 540

aacattatgc ctctaaatgc cgagaattaa ctgaaattca aacacgcttt gggactcaac 600

tctgtggccc acacaaccat ggctggcttc ctaggcgcgt tcagaggcgt gtgctccgac 660

ttatggcagt cgctccgtgg acacggcaac cactcttcca actgcccgcg acgacgcgcc 720

aacagcatgg acgaccgcga ccggcgccga caccgccacc gcgagatccc caacagctcg 780

gcgtcgctga acagcgaccc gatgccgcaa cacagtgcgg gtgcgcgccg gcactacgac 840

caccgcccct cggaaaagag caaacactcc tccaggcacc actctgcgga ccgacaccaa 900

tcggcggaca gggacagaca ccgtcgcggt cgcaagaact acgactcgca cccgtcgcgc 960

aggaaccgcg actacgagcg ggcggactac cagagacacc cctctcaaac ccacccagac 1020

gcccccgcgc agacctcgac gctcaaggtg acctccctca gcaccggctg cagcaccctg 1080

tcccaacatc actacgagac ccccgaccac atctacgacg tcccggaaga cagtcgcggg 1140

gcgtcggctc cccctcgcgc ggacctcgcg cttcccccgc tcgccatgcc aaaatccaag 1200

cacccgcgcc gcatgcgccc ggcgtccatg aacgactgcc tgatgaagca ctgcggcgcc 1260

ggcagaccca acctccaaga cgacatatgc acactatgca ctgatataga gacacagctg 1320

agcgcactag agaagtctct ggagtcagag atcaacttct atcgtcgcta catacaagac 1380

actaagacat tgctcgccac tcgagca 1407

<210> 2

<211> 819

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccgcacccc cgcagcccca gcctgctccc ctcgtgatca cgccgcagaa cgcgttcatg 60

ttcgtgccgc aaggcagcca cgtgcacgtg gacgagagcg tggacccgtt cttcggcatg 120

agcccctcca tcttcgggcg cgacctcccc cctcagccgc ccgaggagct gctgagcgac 180

tacgacccgc tcatgagcca ggccggcgag ccgccgagcc cgcggtcgcc ctgcgaggcc 240

gacctctggt gcttcgagac gctcggcgac agcgacagcg attgagcccg caccccaccc 300

accccacact ccactcctta ccccacaccc caacacccca accggacaat gaaggagtcc 360

cacatttcac tgaaggacgc ggatgaagcc gcgcatcccc acatgaagga ttggcaacgg 420

tcaaacattt cacctgcaat gaaggacgat gcgcggtcgc gattagcctg cgaccgacat 480

cgcacacaaa tgaaggacac aattggtttg taatccggac aatgaagtac aaattgtttt 540

tgttaatcag gacaattgga acacaatcaa attaattttt tgtacgatca taaaatcgat 600

atttgatgca catatattag taagtatatt aaactaattc tccggggagg caagcagttg 660

gatacggcgg ggcggggcac gacgtgcacg gagaattcgg gcgggtcccc cttcccccac 720

ccccacgcac cacgatgcgt ctaatcttag cgctcgtggc ttgcttgttg gcggcgccga 780

tgccgttatc gggtcgttcg acaagcactc caaacacgt 819

<210> 3

<211> 614

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcaaacatcg gcagcaaagc tctgatctac accgacgact acagcgacag tggcaacgtc 60

ggcgaaaagg agcactgctc ggaggagtgc tgcaaagtgg aggaagttct gtgagaaagt 120

gcgtttttct gtaatgtgaa ataagatagc cttatgtgtg cacagacatg gcgaacaggc 180

ttgtgtttct cgaccccgag accctagccg aggccgacgg catccccggc cagggggtgt 240

tcgagcccgg caagaagaaa tgcaacttca cgaagattcg caccagcgtc gcgctcgcgt 300

gccggtacgc cgtctcggac ggcggcctca tcgacgagtt cgtcatggcg acatacggga 360

ccagacgcgc gtgccggctc gtccggcacc tgacgataag cgcggagggc gtgatgaccc 420

ggcccgccaa caactgcgcg ccgcacatgg tgctcatctg cctcagaggc gtggccgccg 480

tgtccagcga gggcatgggc ttcggtcgct gcatcatgga gcgcggcacc atgttcatgg 540

tcaagtccgc gcacagcgcc gtcgtctgcg gcaaccccgc ctgcgagctg ctcgtcctct 600

tctacgacta cttc 614

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacgacggcc agtgaattcg ccgcaccccc gcagccccag 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tatagtatat agatagatct acgtgtttgg agtgcttgtc 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagctgtaca agtaactcga ggcaaacatc ggcagcaaag 40

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accatgatta cgccaagctt gaagtagtcg tagaagagg 39

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggaggcaagc agttggatac gg 22

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctctgaggc agatgagcac cat 23

<210> 10

<211> 3708

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt accagatcta 420

tctatatact atatagtaat accaatactc aagactacga aactgataca atctcttatc 480

atgtgggtaa tgttctcgat gtcgatagcc atatgcccgg tagttgcgat atacataaac 540

tgatcactaa ttccaaaccc acccgctttt tatagtaagt ttttcaccca taaataataa 600

atacaataat taatttctcg taaaagtaga aaatatattc taatttattg cacggtaagg 660

aagtagaatc ataaagaaca gtgacggcgg ccgctctaga atggtgagca agggcgagga 720

gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa 780

gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt 840

catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta 900

cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc 960

cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta 1020

caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa 1080

gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa 1140

cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa 1200

gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac 1260

ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc 1320

cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc 1380

cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa ctcgaggata tcggatcccg 1440

ggcccgtcga ctgcagaggc ctgcatgcaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 1500

ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 1560

gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 1620

ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 1680

ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1740

cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1800

cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1860

accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1920

acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1980

cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 2040

acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 2100

atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 2160

agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 2220

acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 2280

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 2340

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2400

gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2460

gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 2520

acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 2580

tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 2640

ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 2700

catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 2760

ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag 2820

caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 2880

ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 2940

tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 3000

cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 3060

aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 3120

tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 3180

gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 3240

cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 3300

aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 3360

tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 3420

tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 3480

gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt 3540

atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa 3600

taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta 3660

tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtc 3708

Claims (10)

1.一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法，将羊传染性脓疱病毒毒力基因突变失活，其特征在于，所述毒力基因突变为ORFs 120/121双基因突变。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述毒力基因突变ORFs 120/121双基因缺失突变。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述羊传染性脓疱病毒为羊传染性脓疱病毒ORFV-SY17株。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，缺失的ORFs 120/121基因序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述ORFs 120/121双基因缺失突变为ORFV-SY17株全长序列的120779至122185位核苷酸缺失突变。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤1：准备亲本毒株，所述亲本毒株为羊传染性脓疱病毒ORFV-SY17株，全长基因序列如GenBank：MG712417.1所述；

步骤2：同源重组穿梭质粒的构建：分别扩增ORFV-SY17株的ORFs 120/121基因两侧的序列作为重组同源臂，克隆至pUC57-vv7.5-eGFP筛选表达盒上，获得携带标记基因eGFP的pUC57-LFΔORFs120/121-eGFP-RFΔORFs 120/121重组穿梭质粒；

步骤3：利用步骤2制备的pUC57-LFΔORFs 120/121-eGFP-RFΔORFs 120/121质粒DNA转染已感染ORFV-SY17野毒株的OFTu细胞，通过荧光斑法和有限稀释法获得表达绿色荧光蛋白的缺失病毒ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP；

步骤4：将ORFV-SY17ΔORFs 120/121-eGFP作为候选毒株，敲除GFP，制备得到羊传染性脓疱病毒ORFs120/121双基因缺失毒株。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，ORFs 120/121基因两侧的左、右重组同源臂序列如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，利用PCR扩增所述重组同源臂，PCR扩增的引物序列如SEQ ID NO.4～7所示。

9.权利要求1至8任一项所述的制备方法在制备羊传染性脓疱病基因缺失减毒活疫苗中的应用。

10.一种利用SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物序列对ORFV基因缺失减毒疫苗株免疫羊和自然感染ORFV野毒株病羊的鉴别和诊断方法，其特征在于，所述疫苗毒株免疫羊由权利要求1至9任一项所述的制备方法制备获得的缺失ORFs 120/121基因的羊传染性脓疱病毒减毒株进行免疫获得。

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