KR102009265B1 - 구제역 sat1형 bot의 방어항원이 발현되는 재조합 바이러스 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구제역 SAT 1형 III 지역형 BOT의 방어항원을 발현하는 재조합 구제역 바이러스 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 구제역 SAT1형 혈청형에 대해 보다 넓은 범위에서 방어효과를 극대화할 수 있다.

Description

구제역 SAT1형 BOT의 방어항원이 발현되는 재조합 바이러스 {Recombinant foot-and-mouth disease virus expressing protective antigen of type SAT1 BOT}

본 발명은 구제역 SAT1형 III 지역형 BOT의 방어항원이 발현되는 재조합 바이러스, 그 제조방법 및 백신으로서의 용도에 관한 것이다.

구제역(foot and mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스성 수포질병으로 빠른 복제와 빠른 전파력이 특징이다. 이 질병은 그 경제적 중요성으로 인하여 세계동물보건기구(OIE)에 의하여 매우 중요한 동물 질병으로 분류되어 있으며, 발생시 국가간 교역이 불가능하여 축산물의 교역에 있어 가장 중요한 요소로 작용하고 있다.

상기 구제역 병원체는 단일가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데(Piconaviridae)과 아프소바이러스(Aphthovirus)속에 속하며 7개의 다른 혈청형(A, O, C, Asia1, SAT1, SAT2, SAT3)으로 분류되고 있다.

구제역 바이러스(foot and mouth disease virus) SAT1형 중에서도 I, Ⅱ(SEZ), Ⅲ(WZ), Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ, Ⅷ, Ⅸ의 9가지의 지역형이 있다. 엄격하게 개발한다면 이러한 지역형 또는 그 아형에 대한 백신을 모두 개발하여 백신주로 사용하여야 한다. 그러나 모든 백신주 개발을 위해서는 야외주를 지속적으로 세포에 배양하여 적절한 증식력을 지녀야 하고, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되며 결과가 좋으리라는 보장도 없다. 따라서 기존의 정보가 많고 이미 증명된 백신 바이러스를 이용하여 필요로 하는 백신주를 새로 신속하게 개발하여 사용할 수 있도록 적절한 시기에 제작 가능한 형태로 만들어져야 할 것이다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 이미 구제역 백신주로 알려져 있는, 병원성이 약화된 바이러스를 기초로 바이러스 유전자로 구성된 기본 벡터를 이용하여 SAT1 형 구제역 발생시 방어가 가능한 백신을 생산할 수 있는 새로운 재조합 바이러스를 제작하고자 지속적으로 연구 노력하였다. 특허문헌 0001은 본 발명자들의 선행연구 중 하나로 구제역 SAT1형 WZ 지역형의 방어항원 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 개시하고 있지만, SAT1 SA 바이러스에서의 유전적인 차이는 9% (91% 상동성)의 큰 차이를 보이고 있으므로 이러한 백신 바이러스에 보강적인 역할을 수행할 수 있는 추가적인 백신주의 개발이 여전히 요구되고 있는 실정이다.

한국등록특허 제10-1578425호

본 발명의 목적은 구제역의 SAT1형 바이러스 중 III 지역형의 방어항원 단백질을 코딩하는 재조합 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 플라스미드를 이용하여 백신 종독주로 유용하게 사용될 수 있는 재조합 구제역 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 바이러스의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 이용하여 구제역을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 구제역 O형 Manisa 유전체의 P1 유전자 부위가 구제역 SAT1 BOT의 P1 유전자로 치환되고, 상기 구제역 O형 Manisa 유전체의 3B 부위 중 3B12 부위가 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 치환된 것이며, 상기 구제역 O형 Manisa 유전체의 3C 부위 중 142번째 아미노산 시스테인이 트레오닌으로 치환(C142T)된 재조합 플라스미드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 플라스미드를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 구제역 O형 Manisa의 유전자를 재조합 벡터에 삽입하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 구제역 O형 Manisa의 3B12 부위를 치환하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 상기 구제역 O형 Manisa의 P1 유전자 중 3C 142번째 아미노산 시스테인을 트레오닌(C142T)으로 치환하는 단계; (d) 상기 (c)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 상기 구제역 O형 Manisa의 P1 유전자를 SAT1 BOT 유전자로 치환하는 단계를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 예방용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 구제역의 예방 방법을 제공한다.

본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 구제역 O형 바이러스의 유전자 일부를 조작하여 병원성을 약화시킴으로써, 소독제 실험 또는 항바이러스 실험 등 실험실 내에서 다루기에 병원성 바이러스보다 더욱 안전하게 사용할 수 있는 장점을 지니고 있다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 하여 백신을 제작함으로써, SAT1 형 III 지역형 바이러스까지 방어할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 야외주와의 감별진단도 가능하여 백신 제작에 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1는 구제역 SAT1 형 구제역 바이러스 III 지역형 BOT 1/68 백신주의 방어 항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스의 게놈 모식도를 나타낸 것이다.
도 2은 구제역 O형 백신주 Manisa에 SAT1 BOT (III 지역형)의 방어항원 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열이 삽입된 본 발명의 재조합 플라스미드(pO-SAT1 BOT)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 도 2의 재조합 플라스미드를 세포에 도입하여 새로 제작된 재조합 구제역 바이러스 SAT1 BOT의 바이러스 입자를 전자현미경 사진을 통하여 확인한 것이다.
도 4는 야외 주(SAT1 BOT-wild type)와 본 발명의 재조합 구제역 바이러스(SAT1 BOT-R)를 포유 마우스에 접종한 후 폐사율을 측정하여 재조합 구제역 바이러스의 병원성이 감소된 것을 확인한 것이다.
도 5는 본 발명의 재조합 구제역 바이러스(SAT1 BOT-R)가 감염된 세포에서 항원 단백질이 발현됨을 간이항원 키트로 확인한 것이다(Svanova 키트, UK; SP 밴드는 밴드형성, C는 실험대조, 375 ng[1/40 dose]까지 검출 가능하다).
도 6은 마우스에서의 항원 dose 별로 7일 면역 후 (1.5~0.023 μg, 소 및 돼지 1/10~1/640 dose) 공격접종 실험 (SAT1 BOT wild type)을 통해서 마우스의 생존율 및 체중감소를 조사한 결과이다. 이 결과에 따르면 0.023 μg (1/640 dose) 백신을 접종하여도 III 지역형 바이러스에 대해 완벽한 방어가 가능함을 확인하였다.
도 7은 소(n=5)에서 면역시험 (0주, 4주에 백신접종)을 통해 얻어진 혈청으로 면역된 항체에 대해 중화항체 형성 능을 조사한 결과이다.
도 8은 돼지(n=20)에서 면역시험 (0주, 4주에 백신접종)을 통해 얻어진 혈청으로 면역된 항체에 대해 중화항체 형성 능을 조사한 결과이다.

본 발명은 구제역 O형 바이러스의 유전자를 포함하는, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 재조합 플라스미드에 관한 것으로서, 구제역 O형 Manisa 유전체의 P1 유전자가 구제역 III 지역형 SAT1 BOT의 P1 유전자로 치환되고, 상기 구제역 O형 Manisa 유전체의 3B 부위 중, 3B12 부위가 치환되며, 3C 부위 중 142번째 아미노산인 시스테인이 트레오닌으로 치환된 것인, 구제역 O형 Manisa 유전체 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 플라스미드에 의하면 구제역 O1 manisa의 유전체를 기본으로 하여 외피 단백질로 구성되어 있는 P1(VP1+VP2+VP3+VP4)을 교체하여 바이러스의 외피를 완전히 바꿀 수 있으므로 SAT1 III 지역형의 외피를 암호하는 유전자로 완벽하게 치환함으로써 SAT1형 중 가장 많이 발생되고 문제시 되는 지역형 III형뿐 아니라 SAT1형 중 다른 지역형도 방어될 수 있고 같은 혈청형 내에서는 광범위하게 방어할 수 있는 우수한 효과가 있다.

본 발명에서 "P1 유전자"는 P1 단백질을 코딩하는 염기서열로, VP1, VP2, VP3 및 VP4 부위를 포함할 수 있으며, 본 발명에서는 상기 부위는 단백질을 코딩하는 염기서열, 단백질을 코딩하지 않은 염기서열 및 유전자를 포함하는 개념으로 사용된다.

상기 구제역 O형 바이러스의 유전자는 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자인 것을 특징으로 한다. 상기 전체 유전자 부위 중에서 야외주와의 감별진단 목적으로 3B1 부위 및 3B2 부위 중 일부를 치환시킬 수 있다. 상기 3B1 및 3B2 의 치환부위는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 본 발명의 재조합 플라스미드 중 6,513 내지 6,656 bp 부위로서 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 144 bp의 서열인 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "구제역 바이러스 SAT1형 III 지역형 SAT1 BOT 주"는 SAT1 형 백신에서 널리 쓰이는 백신 바이러스로, SAT1 형 중 III 지역형에 대한 바이러스에 대한 방어가 가능한 것으로 알려져 있다.

본 발명의 실시예에 의하면, 상기 본 발명의 재조합 플라스미드는 상기 구제역 O형 Manisa 유전체 중 3C 부위의 142번째 아미노산인 시스테인이 트레오닌으로 치환(C142T)된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 본 발명은 상기 재조합 플라스미드를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 바이러스는 구제역 SAT1 형 BOT 주의 방어항원이 발현되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명은

(a) 구제역 O형 Manisa의 유전자를 재조합 벡터에 삽입하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 구제역 O형 Manisa의 3B12 부위를 치환하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 상기 구제역 O형 Manisa의 3C 부위 중 142번째 아미노산 시스테인을 트레오닌으로 치환(C142T)하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 상기 구제역 O형 Manisa의 P1 유전자를 구제역 SAT1-BOT의 P1 유전자로 치환하는 단계를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 재조합 벡터를 세포에 도입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포 당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환 된 숙주세포가 선발될 수 있도록 선별 표지 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터 및 재조합 구제역 바이러스는 통상의 유전자조작법, 형질전환법에 의해 제조될 수 있으며, 적은 양으로 형성된 바이러스를 세포배양을 통한 연속 계대로 적절한 양의 바이러스를 수득할 수 있다.

본 발명의 세포는 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과 동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과, 토끼과, 설치류 및 영장류의 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포에서 유래된 것일 수 있고, 바람직하게는 염소 혀 세포 (ZZR) 및 햄스터 신장 세포 (BHK-21), 흑염소 신장세포 (BGK), 돼지 신장세포 (IBRS-2) 및 소 신장세포 (LF-BK)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 구제역 예방용 백신 조성물에 있어서, 상기 백신은 생백신, 약독화된 백신, 또는 사백신일 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 재조합 구제역 바이러스과 함께 구제역 감염의 예방 효과가 우수한 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 수크로오스 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 개체의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 구제역의 예방 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명의 내용을 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실험예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 구제역 야외주와 감별 진단을 위한 유전자 조작

구제역 O형 Manisa 바이러스 전체 유전자(Genbank AY593823.1)를 PCR에 의해 증폭하고 플라스미드(pBluescript SK II)에 O-Manisa 유전자를 삽입하여 재조합 플라스미드 pO-Manisa를 제조하였다. 그 후 제조된 pO-Manisa의 3B1 및 3B2 부위를 제거한 후 A형의 3B3 및 SAT형의 3B3 서열을 합성(144 bps, 서열번호 2)하여 삽입하는 작업을 통해 야외주와의 감별 진단을 위한 pO-Mansia-3B 플라스미드를 제작하였다.

구체적으로 cDNA 합성 시 일반적으로 사용되는 랜덤 프라이머를 이용하여 O-Manisa 바이러스에 대한 cDNA 작성 후 전체 유전자가 클로닝된 것을 기초로 3A의 끝부분 유전자 및 3B3의 시작 부위 유전자 증폭이 가능한 특이 프라이머들(GenBank Accession No. AY593823.1을 기초로 5' 및 3' 유전자의 각 20 mers씩에 해당)을 작성하여 PCR을 실시하였다. PCR은 5X buffer (FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs (1㎕), Phusion enzyme (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균증류수 (35.5㎕)의 용량으로 98℃에서 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25 사이클, 최종 72℃ 10분으로 반응을 수행하였다.

상기에서 작성된 pO-Mansia와 PCR 반응에 의해 합성된 유전자와의 결찰반응(TAKARA Long Ligation kit)을 수행하였으며, 전체 염기서열 분석을 통하여 적절히 클로닝된 것을 확인하였다. 하기 표 1은 O-Manisa의 3B1 및 3B2를 제거하고, A형 3B3 및 SAT형의 3B3이 삽입된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

NSP 부위 조작	아미노산 서열	아미노산 크기	참고
3B12 deletion	GPYAGPLERQKPLRVKTKLPQQEGPYAGPMDRQKPLKVRARAPVVKE(서열번호 3)	47 aa	-
3B33 addition	GPYEGPVKKPVALKVKAKNLIVTEGPYEGPVKKPVALKVKAKAPIVTE(서열번호 4)	48 aa	A type and SAT type

실시예 2. 병원성 감소 유전자 조작

병원성이 감소된 구제역바이러스를 제작하기 위해 우선 감염성 플라스미드를 만들기 위한 시도가 수행되었다. 실시예 1에서 제조된 pO-Mansia-3B 플라스미드에서, 그 벡터를 NEW ENGLAND BIOLABS^ⓡ Inc.의 Gibson Assembly^ⓡ Master Mix 를 이용하여 pO-Manisa-3B 유전자 중 3C 부위의 142번째 아미노산인 시스테인을 트레오닌으로 치환(C142T)되도록 조작하였다(서열번호 1의 염기서열에서 7140-7141 bp 위치의 tg를 ac로 치환). PCR을 이용하여 증폭한 뒤 자가결찰(Self ligation)하는 방법을 이용하여 유전자가 교체된 플라스미드(pO-Manisa 3B333 3Cmut)를 확보하였다.

실시예 3. 재조합 플라스미드 pO-SAT1 BOT의 제작(도 1 및 도 2)

상기 실시예 2에서 제조된 재조합 플라스미드(pO-Manisa 3B333 3Cmut) 중에서 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자를 구제역 SAT1 바이러스 BOT 지역형의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환하여 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드(pO-SAT1 BOT)를 제조하였다. 상기 P1 단백질을 코딩하는 유전자는 하기와 같이 치환시켰다.

(1) 먼저 Gibson Assembly®Cloning Kit(NEB)을 이용하여 SAT1 BOT1/68의 wild type virus에서 RNA를 추출 하여 cDNA를 합성한 후 플라스미드(100ng/μl, 1μl), 서열번호 5의 정방향 프라이머 (5‘-AAGGTCCAGAAAAGGCTCAAGGGAGCAGGCCAGTCGTCACCA-3’, 42mer) 및 서열번호 6의 역방향 프라이머(5‘-GAGCAGGTCAAAATTTAGAAGCTGTTTGGCAGGTTTAACAAG-3’, 42mer)를 이용하여 SAT1 BOT1/68 바이러스의 P1 유전자를 PCR에 의하여 증폭시켰다. 이때, 상기 PCR은 5X buffer (FINNZYMES, 10μl), 10mM dNTPs (1μl), Phusion enzyme (2U/μl, 1μl), 멸균증류수 (35μl)의 용량으로 98℃에서 30초 후, 98℃에서 10초, 72℃ 30초, 72℃ 2분 30초를 한 주기로 25주기로 PCR을 수행한 후, 최종 72℃에서 10분 동안 반응을 실시하였다.

(2) 3B 및 3C 부위가 조작된 플라스미드(pO-Manisa 3B333 3Cmut)에서 P1을 제거하기 위한 PCR은 플라스미드(100ng/μl, 1μl), 서열번호 7의 정방향 프라이머인 V_Fwd(5'-ACTTCTAAATTTTGACCTGC-3', 20mer), 서열번호 8의 역방향 프라이머인 V_Rev(5‘-CTTGAGCCTTTTCTGGAC-3’, 18mer)를 사용하였다. 이때, 상기 PCR 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10μl), 10mM dNTPs (1μl), Phusion enzyme (2U/μl, 1μl), 멸균증류수 (35μl)의 용량으로 98℃에서 30초 후 98℃에서 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초를 한 주기로 25주기로 PCR을 수행한 후, 최종 72℃에서 10분 동안 반응을 실시하였다.

(3) 상기 SAT1 BOT1/68의 P1 증폭산물(200ng/μl, 1μl)과 pO-Manisa 3B333 3Cmut에서 P1 부위가 제거된 증폭산물(200ng/μl, 1μl), Gibson Assembly Master Mix (2X, 10μl), 멸균 증류수(8μl)용량으로 56℃에서 30분간 반응시켰다. 그 이후에 Gibson Assembly®Cloning Kit에 포함된 competent cell에 transformation하여 본 발명의 pO-SAT1 BOT 플라스미드(전체서열을 서열번호 1에 나타냄)를 제조하였으며 최종적으로 염기서열 분석을 실시하여 pO-Manisa 3B333 3C mut 플라스미드의 P1 부위가 SAT1의 P1 부위로 교체됨을 확인하였다. 제작된 재조합 플라스미드 pO-SAT1-BOT의 구조 및 모식도를 각각 도 1 및 도 2에 나타내었다.

실시예 4. 본 발명의 플라스미드를 이용한 재조합 구제역 바이러스의 제조(도 3)

재조합 구제역 바이러스의 회복은 확보된 상기 재조합 플라스미드(pO-SAT1 BOT)를 제한효소로 반응시켜 유전자를 단일 조각편으로 작성하고, BHKT7-9 세포(T7 RNA polymerase가 발현되는 세포주)에 리포펙타민 형질전환 시약 (라이프 테크놀로지)을 이용하여 정제된 DNA를 형질도입 하여 2~3일 동안 배양한 후, 형성된 재조합 바이러스를 확보하였다. 이후, 확보된 바이러스를 ZZ-R(염소 태아 혀)세포 또는 BHK-21(어린 햄스터 신장) 세포에서 연속계대를 통해 접종하여 바이러스를 증식시켰다. 이후 구제역 바이러스가 감염된 세포에서 재조합 바이러스가 재형성되는 것을 도 3의 전자현미경 사진을 통해 확인하였다.

실시예 5. 제작 백신의 동물에서의 면역원성(도 4 내지 도 8)

상술한 바와 같이 제작된 바이러스를 이용하여 동물실험을 위해서 정제한 구제역바이러스 항원(15 μg/dose) 0.5ml을 오일 아쥬반트 ISA206이 포함된 아쥬반트 0.5ml를 이용하여 혼합하여 이중오일로 작성하였다. 이렇게 제작된 백신을 구제역 항체가 없는 마우스(C57BL/6)에 0.1mL, 2-3개월령 돼지 및 6개월령 이상의 소에는 1mL 접종하였고, 마우스에서는 각각 7 일간 면역 후 공격접종하여 체중변화, 생존율을 관찰하였으며(도 6), 돼지와 소에서는 0주, 4주에 백신접종하고 각 시기별 항체 측정을 위해 채혈하고, 그 SAT1형 항체 측정을 위해 백신주에 대한 중화시험(OIE 메뉴얼 표준시험법 기준)을 실시하여 항체 수준을 결정하였다(도 7 및 도 8).

상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예 및 시험예를 참조하여 설명하였지만 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

구제역 SAT1 혈청형의 광범위 방어항원 발현능을 보유하는 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스를 이용한 구제역 백신을 제공함으로써, 구제역의 치료 및/또는 예방에 기여할 수 있다.

<110> Animal and plant quaratine agency <120> Recombinant foot-and-mouth disease virus expressing protective antigen of type SAT1 BOT <130> 17-10920 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Full DNA sequence of pO-SAT1 BOT <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg gccagtgagc atatgtaata cgactcacta tagggttgaa agggggcgct 660 agggtctcac ccctagcatg ccaacgacag ctcctacgtc gcactccaca ctaacgtttg 720 tgtgcgcgcg ggaaccgatg gacttttgtt cacccaccta cagttggact cacggcaccg 780 cgtggccatt ttagctgggt tgtgcggacg aacactgctt gcgcatctcg cgtgaccggt 840 tagtactctt accactatcc gcctacttgg tcgttagcgc tgtcctgggc actcttgttg 900 ggggctgttc aacgctctac ggtctcccct gcgtaacaga ctacggtgtt ggggccgctt 960 cgtgcgagcc gatcgcttgg tgtgcctcgg ctgtcgcccg aagcccgcct ttcacccccc 1020 cccccccccc ctaggtttta ccgtcgttcc cgacgttaat ggggaaacaa ccacaagctt 1080 aacaccgtct tgcccgacgt aaaagggctg caaccaaaaa gcttgtgccg cctttcccgg 1140 cgttaatggg aggtaaccac aagacaaacc ttcacccgga agtaaaacgg caacttcaca 1200 cagttttgcc cgttttcgtg agaaatgggc cgtcaacgca cgaaacgcgc cgtcgcttga 1260 ggaggacttg tacaaacacg atctatgcag gtttccacaa ctgacacaaa ccgtgcaact 1320 tgaaaccccg cctggtcttt ccaggtctag aggggcgaca ttttgtactg tgcttgactc 1380 cacgctcggt ccactagcga gtgttagtag tagcactgtt gcttcgtagc ggagcatgat 1440 ggccgtggga gcttcccctt ggtaacaagg acccacgggg ccaaaagcca cgtcctaccg 1500 gacccatcat gtgtgcaaac ccagcacggc aactttactg cgaaaaccac tttaaggtga 1560 cactgatact ggtactcaat cactggtgac aggctaagga tgcccttcag gtaccccgag 1620 gtaacacgcg acactcggga tctgagaagg ggactggggc ttctttaaaa gtgcccagtt 1680 taaaaagctt ctatgcctga ataggcgacc ggaggccggc gccttttcac tgttttacta 1740 ctgttttcat gaatacaact gactgtttca ccgccctgtt acacgctctc agagagatca 1800 aaacactgtt tcttttacgg acacaaggaa agatggaatt cacactttac aacggtgaga 1860 agaaaacctt ctactccaga cccaacaacc acgacaactg ctggcttaac accattctcc 1920 agttgttcag gtatgttgat gagcctttct ttgactgggt ctacgactcg cctgaaaacc 1980 tcactcttga ggcaatcaaa cagttggaag agacaaccgg tcttgagctg cacgagggtg 2040 gaccacccgc tctcgtcatc tggaacatca aacacttgct tcacaccgga atcggcactg 2100 cctcacgccc tagcgaggtg tgtatggtgg acggaacgga catgtgttta gctgattttc 2160 atgctggcat tttcctgaaa ggacaggaac atgctgtgtt cgcctgtgtc acctccaacg 2220 ggtggtacgc gattgatgac gaggactttt acccttggac accggacccg tccgacgttc 2280 tggtgtttgt cccgtacgat caagaaccgc ttaacggaga gtggaaaaca aaggtccaga 2340 aaaggctcaa gggagcaggc cagtcgtcac cagccacagg gtcacaaaat caatctggta 2400 acactggaag catcatcaac aactactaca tgcaacagta ccagaactcg atggacaccc 2460 agcttggcga caacgccatt tcgggtggtt ccaacgaggg gtcgactgac accacatcga 2520 cccataccaa caacactcag aacaatgact ggttttccaa attggcacaa tcggctttct 2580 ccgggcttgt tggcgcgctt ctagccgaca agaagaccga ggagaccact ctgcttgagg 2640 accgtatcgt gaccaccagt catggtacca ccacatcaac cacacagagc tcggtgggcg 2700 ttacctacgg gtacgccttg actgacaagt tcctccccgg cccaaacacc aacgggctgg 2760 agacaagagt ggaacaggca gagaggttct tcaagcacaa actttttgat tggacgcttg 2820 accaacagtt cggcacaacc tacgtgctgg agctccctac agatcacaag ggtatctacg 2880 ggcagctggt tgattcacac gcgtacatcc gcaacggatg ggacgtccaa gtctcagcca 2940 ccgccaccca gttcaacgga ggctgcctgc tggtggccat ggtacccgag ctgtgcaaat 3000 tggacgacag ggagaaatac cagctcaccc ttttcccaca ccagttcttg aacccacgca 3060 ccaacaccac agcacacatc caggtaccct acttgggtgt tgacaggcac gaccagggga 3120 ctcgccacaa ggcgtggacc ctcgttgtga tggtgctggc accatacacc aacgaccaga 3180 ccattggatc aacaaaagcc gaagtctacg taaacattgc accaaccaac gtttacgtgg 3240 ccggtgagaa acccgtcaaa caagggattc tccctgtggc cgtttccgac ggctacggtg 3300 gcttccaaaa tactgaccct aagacctcgg accccgttta cggacacgtg tacaatccgg 3360 cacgcacgct ctaccccggc aggttcacca acttgctgga cgtagcagaa gcttgcccca 3420 cgctgctcga tttcaacggg gtaccgtatg tccaaaccca gagcaactct ggttcaaaag 3480 ttctcgcatg ttttgatttg gcattcggac acaaaaacat gaaaaacaca tacatgtctg 3540 gtctggccca gtactttgca cagtacagtg gcactctcaa ccttcatttc atgtacactg 3600 gccccaccaa caacaaggcc aagtacatgg tggcatacat cccacccggc acacaccctc 3660 tccctgaaac accggagatg gcgtcacact gctaccacgc cgagtgggac actggactga 3720 actcgacttt caccttcacc gtgccgtaca tttcggcggc ggattacgcc tacacctacg 3780 ctgacgagcc cgaacaggcc tcagtacaag gttgggtcgg tgtgtaccag atcactgaca 3840 cacatgagaa agacggggcc gtcatcgtca ccgtgagcgc cggtcccgac tttgagttca 3900 ggatgcccat cagtccatcg cgccagacaa cctctgcagg cgaaggcgcg gacccagtca 3960 ccacagacgc atccgcacac ggaggtgaca ccagaaccac ccgtcgggcc cacaccgacg 4020 tgacgttcct tcttgaccgg ttcactctgg ttgggaagac caacgacaac aaactggttt 4080 tggacctcct gagcaccaaa gagaaatcac tggtcggcgc actcctgcgc gcggccacgt 4140 attacttctc tgacctggag gtggcgtgtg ttgggaccaa cgcatgggtg ggttggactc 4200 ctaacggtag tccagtgctg acggaagtgg gcgacaaccc agtcgtcttc tcacgtagag 4260 gcaccactcg tttcgcgctc ccttacaccg caccccaccg ggtgctcgcc acagtctaca 4320 acggtgactg taagtacaaa cccactggca ccgcgccccg cgaaaacatc cgcggcgacc 4380 tcgcaaccct ggcagcgcgg attgctagtg agacccacat cccaacaaca ttcaactacg 4440 ggatgattta cacacaggca gaagtggacg tgtacctgag gatgaagaga gcagaactct 4500 actgccctcg acccgttctc acgcactacg accataacgg cagggatcgt tacaagacga 4560 cccttgttaa acctgccaaa cagcttctaa attttgacct gctcaaattg gcgggagatg 4620 tggagtccaa ccctgggccc ttcttcttct ccgacgtcag gtcaaatttc tcaaaactgg 4680 tagaaaccat caatcagatg caggaggaca tgtcaacaaa acacgggcct gactttaacc 4740 ggttggtgtc cgcatttgag gaattggcca ctggagtgaa ggctatcagg gccggtctcg 4800 acgaggccaa accctggtac aaactcatca agctcctgag ccgcttgtcg tgcatggccg 4860 ctgtagcagc acggtcaaag gacccagtcc ttgtggccat catgctggct gacaccggtc 4920 ttgagattct ggacagcacc tttgtcgtga agaagatctc cgactcgctc tccagtctct 4980 ttcacgtgcc ggcccccgtc ttcagtttcg gagccccgat tctgttggcc gggttggtca 5040 aagtcgcctc gagtttcttc cggtccacac ccgaagacct tgagagagca gaaaaacagc 5100 tcaaagcacg tgacattaac gacatattcg ccattctcaa gaacggcgag tggctggtca 5160 agctgatcct tgccatccgc gactggatca aagcgtggat cgcctcagaa gaaaagtttg 5220 tcaccatgac ggacttggtg cctggtatcc ttgaaaagca gcgggatctc aacgacccga 5280 gtaagtacaa ggaagccaag gagtggctcg acaacgcgcg ccaggcgtgt ttgaagagcg 5340 ggaacgttca cattgccaat ttgtgcaaag tggtcgcccc ggcacccagc aagtcgagac 5400 ccgaacccgt ggtcgtttgc ctccgcggca aatccggcca ggggaagagt ttccttgcga 5460 acgtgctcgc gcaagcaatc tccacccact tcaccggcag aactgattcg gtttggtact 5520 gcccgcctga ccctgaccac ttcgacggtt acaaccagca gaccgttgtc gtgatggacg 5580 atttgggcca gaaccccgat ggcaaggact tcaagtactt cgcccagatg gtttcgacca 5640 cggggttcat cccgcccatg gcctcgcttg aggacaaagg caagcctttc aacagcaaag 5700 tcatcattgc taccaccaac ctgtactcgg gtttcacccc gagaacaatg gtgtgtcctg 5760 acgcgctgaa ccggaggttc cactttgaca tcgacgtgag tgccaaggac gggtacaaag 5820 ttaacaacaa attggacata atcaaagctc ttgaagacac ccacaccaac ccagtggcga 5880 tgttccaata cgactgtgcc cttctaaacg gtatggcagt tgaaatgaag agaatgcaac 5940 aggatatgtt caagcctcaa ccacccctcc agaacgtgta ccaactcgtt cacgaggtga 6000 ttgaacgggt cgagctccac gagaaggtgt cgagccaccc gattttcaaa cagatatcaa 6060 ttccttccca aaagtctgtg ttgtacttcc tcattgagaa aggccaacac gaagcagcaa 6120 ttgaattctt tgagggaatg gtgcatgact ccatcaagga agagctccgg cccctcatcc 6180 aacagacctc atttgtgaaa cgcgctttta agcgcctgaa ggaaaacttt gagactgttg 6240 ccctgtgttt gactcttttg gcaaacatag tgatcatgat ccgcgagact cgcaagagac 6300 aacagatggt ggacgatgca gtgaatgact acattgagaa ggcaaacatc accacagatg 6360 acaagactct tgacgaggcg gaaaagaacc ctctagagac cagcggtgcc agcactattg 6420 gtttcagaga gagaactctc ccggggcaca aggcgagcga tgacgtgagc tccgagcccg 6480 ccaaacccgt ggaggaccga ccacaagctg aaggacctta cgagggaccg gtgaagaagc 6540 ctgtcgcttt gaaagtgaaa gctaagaact tgattgtcac tgaggggcca tatgaaggac 6600 cagtgaagaa acctgtcgct ttgaaagtga aagcaaaagc cccgattgtc actgaaggac 6660 cctacgaggg accggtgaag aagcctgtcg ctttgaaagt gaaagccaag aacttgattg 6720 tcactgagag tggtgcccca ccgaccgact tgcagaagat ggtcatgggc aacactaagc 6780 ctgttgagct catcctcgac gggaagacgg tagccatctg ctgtgctacc ggagtgtttg 6840 gcactgccta cctcgtacct cgtcacctct tcgcggagaa gtacgacaag ataatgttgg 6900 acggtagagc catgacagac agtgactaca gagtgtttga gtttgagatt aaagtaaaag 6960 gacaggacat gctctcagac gctgcactca tggtgcttca ccgtgggaac cgcgtgagag 7020 acatcacgaa acattttcgt gacacagcaa gaatgaagaa aggcaccccc gttgtcggtg 7080 tgatcaacaa cgccgacgtt gggagactga ttttctctgg agaggccctt acctacaaag 7140 acattgtagt gaccatggat ggagacacca tgccgggcct gtttgcctac agagccgcca 7200 ccaaggctgg ttactgcggg ggagccgttc tcgccaagga cggagccgac acattcatcg 7260 ttggcaccca ctccgcaggt ggtaacggag ttggatactg ctcgtgcgtg tccaggtcca 7320 tgctcctgaa aatgaaggca cacattgacc ctgaaccaca ccacgagggg ttgattgttg 7380 ataccagaga tgtggaagag cgcgtgcatg tcatgcgtaa aaccaagctt gcacccaccg 7440 tggcacacgg tgtgtttaac cctgaatttg gtcccgctgc cttgtccaac aaggacccgc 7500 ggctgaacga aggggttgtc ctcgatgaag tcatcttctc caaacacaag ggagacacga 7560 aaatgtctga ggaggacaaa gcgctgttcc gccgctgcgc tgccgactac gcgtcgcact 7620 tgcacagcgt gctggggacg gcaaatgccc cattgagcat ctatgaggcc atcaaaggcg 7680 tcgacgggct cgatgccatg gagccggaca ccgcgcccgg cctcccctgg gccctccagg 7740 ggaaacgccg tggtgcgttg attgacttcg agaacggcac ggtcggaccc gaagtcgagg 7800 ctgccctaaa gctcatggag aaaagagagt acaaatttgc ttgccagacc ttcctgaaag 7860 acgagattcg tccgatggaa aaagtacgtg ctggcaagac tcgcattgtc gacgttttgc 7920 ccgtggaaca cattctttac accaggatga tgattggcag attctgtgct caaatgcaca 7980 caaacaatgg accgcagatt ggctcagcgg tcggttgcaa tcctgatgtt gattggcaaa 8040 gatttggcac acattttgct cagtacagaa acgtgtggga tgtggactat tcggcctttg 8100 atgctaacca ctgcagtgac gcaatgaaca tcatgtttga ggaggtattt cgcacagact 8160 tcggtttcca cccaaatgct gagtggattc tgaagactct tgtgaacacg gagcacgcct 8220 atgagaacaa acgtatcact gttgagggcg ggatgccgtc tggctgttcc gcgacaagca 8280 tcatcaacac aattttgaac aacatttatg tgctctacgc tcttcgtaga cactatgagg 8340 gagttgagct ggacacctac accatgatct cctacggaga tgacatcgtg gttgcaagtg 8400 actacgatct ggattttgag gctctcaaac cccacttcaa atctcttggt caaaccatca 8460 ctccagctga caaaagcgac aaaggttttg ttcttggtca ctccattacc gatgtcactt 8520 tcctcaaaag acacttccac atggactatg gaactgggtt ttacaaacct gtgatggcct 8580 caaagaccct cgaggccatt ctctcctttg cacgccgtgg gaccatacag gagaagttga 8640 tctccgtggc aggactcgcc gtccactcag gacctgacga gtaccggcgt ctctttgagc 8700 ccttccaggg tctcttcgag attccaagct acagatcact ttacctgcgt tgggtgaacg 8760 ccgtgtgcgg tgacgcataa tccctcagat gtcacaattg gcagaaagac tctgaggcga 8820 gcgacgccgt aggagtgaaa agcccgaaag ggcttttccc gcttcctatt ccaaaaaaaa 8880 aaaaaaaaaa ctagttctag agcggccgcc accgcggtgg agctccagct tttgttccct 8940 ttagtgaggg ttaattgcgc gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 9000 ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 9060 gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 9120 gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 9180 tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 9240 gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 9300 ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 9360 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 9420 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 9480 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 9540 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 9600 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 9660 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 9720 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 9780 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 9840 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 9900 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 9960 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 10020 acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 10080 ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 10140 ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 10200 tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 10260 tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 10320 gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 10380 tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 10440 tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 10500 ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 10560 tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 10620 ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 10680 gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 10740 ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 10800 cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 10860 ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 10920 ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 10980 gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 11040 ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 11100 gcgcacattt ccccgaaaag tgccac 11126 <210> 2 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of substitution region in 3B1 and 3B2 of O-Manisa <400> 2 ggaccttacg agggaccggt gaagaagcct gtcgctttga aagtgaaagc taagaacttg 60 attgtcactg aggggccata tgaaggacca gtgaagaaac ctgtcgcttt gaaagtgaaa 120 gcaaaagccc cgattgtcac tgaa 144 <210> 3 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of deletion region in 3B1 and 3B2 of O-Manisa <400> 3 Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Arg Val Lys 1 5 10 15 Thr Lys Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met Asp Arg 20 25 30 Gln Lys Pro Leu Lys Val Arg Ala Arg Ala Pro Val Val Lys Glu 35 40 45 <210> 4 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of substitution region in 3B1 and 3B2 of O-Manisa <400> 4 Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys 1 5 10 15 Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys 20 25 30 Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Ile Val Thr Glu 35 40 45 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for P1 of SAT1 BOT1/68 virus <400> 5 aaggtccaga aaaggctcaa gggagcaggc cagtcgtcac ca 42 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for P1 of SAT1 BOT1/68 virus <400> 6 gagcaggtca aaatttagaa gctgtttggc aggtttaaca ag 42 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for P1-deleted-O-manisa virus <400> 7 acttctaaat tttgacctgc 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for P1-deleted-O-manisa virus <400> 8 cttgagcctt ttctggac 18

Claims (9)

1. 구제역 O형 Manisa 유전체의 P1 유전자 부위가 구제역 SAT1 BOT의 P1 유전자로 치환되고,
   상기 구제역 O형 Manisa 유전체의 3B 부위 중 3B1 및 3B2 부위가 서열번호 2로 표시되는 144bp에 해당하는 염기서열로 치환된 것이며,
   상기 구제역 O형 Manisa 유전체의 3C 부위 중 142번째 아미노산 시스테인이 트레오닌으로 치환(C142T)된 재조합 플라스미드에 있어서,
   상기 재조합 플라스미드는 구제역 O형 Manisa 유전체 염기서열을 포함하는 것으로 서열번호 1(pO-SAT1 BOT)의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드.
2. 제1항의 재조합 플라스미드를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스.
3. 제2항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 SAT1 III 지역형인 SAT1 BOT 주의 방어항원이 발현되는 것인 재조합 구제역 바이러스.
4. (a) 구제역 O형 Manisa의 유전자를 재조합 벡터에 삽입하는 단계;
   (b) 상기 (a)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 구제역 O형 Manisa의 3B1 및 3B2 부위를 서열번호 2로 표시되는 144bp에 해당하는 염기서열로 치환하는 단계;
   (c) 상기 (b)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 상기 구제역 O형 Manisa의 3C 부위 중 142번째 아미노산 시스테인을 트레오닌으로 치환(C142T)하는 단계; 및(d) 상기 (c)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 상기 구제역 O형 Manisa의 P1 유전자를 구제역 SAT1-BOT의 P1 유전자로 치환하는 단계를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법.
5. 제4항에서 제조된 재조합 벡터를 세포에 도입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 세포는 염소 태아 혀 세포 및 햄스터 신장 세포 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
7. 제3항의 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 예방용 백신 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 백신은 생백신, 약독화된 백신, 또는 사백신인 것인, 구제역 예방용 백신 조성물.
9. 제3항의 재조합 구제역 바이러스를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 구제역의 예방 방법.

Images