KR102009268B1 - 구제역 C3 Resende 주의 방어 항원이 발현되는 재조합 바이러스 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구제역 C형 EURO-SA 지역형 Resende 주의 방어 항원이 발현되는 재조합 바이러스, 그 제조방법 및 백신으로서의 용도에 관한 것으로, 구제역 O형 혈청형에 대해 보다 넓은 범위에서 방어 효과를 극대화할 수 있다.

Description

구제역 C3 Resende 주의 방어 항원이 발현되는 재조합 바이러스{Recombinant foot-and-mouth disease virus expressing protective antigen of type C3 Resende}

본 발명은 구제역 C3 Resende주의 방어 항원이 발현되는 재조합 바이러스에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스로서, 구제역 C형 EURO-SA 지역형 Resende 주의 방어 항원이 발현되는 재조합 바이러스, 그 제조방법 및 백신으로서의 용도에 관한 것이다.

구제역(Foot and mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스성 수포질병으로 빠른 복제와 빠른 전파력이 특징이다. 이 질병은 그 경제적 중요성으로 인하여 세계동물보건기구(OIE)에 의하여 매우 중요한 동물 질병으로 분류되어 있으며, 발생시 국가간 교역이 불가능하여 축산물의 교역에 있어 가장 중요한 요소로 작용하고 있다.

상기 구제역 병원체는 단일 가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데(Piconaviridae)과 아프소바이러스(Aphthovirus)속에 속하며, 7개의 다른 혈청형(A, O, C, Asia1, SAT 1, SAT2, SAT3)으로 분류되고 있다.

또한, 구제역 바이러스(foot and mouth disease virus) C형 중에서도 EURO-SA, AFRICA, ASIA 3가지 지역형이 있기 때문에, 엄격하게 개발한다면 이러한 지역형에 대한 백신을 모두 개발하여 백신주로 사용하여야 한다. 그러나, 모든 백신주 개발을 위해서는 야외주를 지속적으로 세포에 배양하여 적절한 증식력을 지녀야 하고, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되며 결과가 좋으리라는 보장도 없다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자가 참여한 종래기술로서, 구제역 바이러스 O Manisa의 전체 유전자를 클로닝한 후, 일부 유전자를 결실(deletion)시켜 얻은 구제역 바이러스 O Manisa를 이용한 재조합 구제역 백신 바이러스가 개시되어 있다 (공개특허공보 제10-2014-0083129호).

또한, 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 구제역 C형 EURO-SA 지역형 바이러스의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스가 개시되어 있다 (공개특허공보 제10-2015-0014016호).

그러나, 상기 종래기술 만으로는 구제역 예방용 백신을 효율적으로 제공하는 것에 한계가 있기 때문에, 기존의 정보가 많고 이미 증명된 백신 바이러스를 이용하여 필요로 하는 백신주를 새로 신속하게 개발하여 사용할 수 있도록 적절한 시기에 제작 가능한 형태로 만들어져야 할 필요성이 절실히 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 이미 구제역 백신주로 알려져 있는, 병원성이 약화된 바이러스를 기초로 바이러스 유전자로 구성된 기본 벡터를 이용하여, C형 Resende (C3/Resende/Brazil/55)와 같은 유형의 구제역 발생시 방어가 가능한 백신을 생산할 수 있는 새로운 재조합 구제역 바이러스를 제조할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 구제역의 C형 바이러스 중 EURO-SA 지역형 등과 타 지역형 바이러스에 대한 광범위한 방어능을 동시에 구비함으로써, 이미 세계적으로 발생은 없지만 추후 다시 발생될 때 사용이 가능한 백신 종독주로 유용하게 사용될 수 있는 재조합 구제역 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 구제역 바이러스를 제조하기 위한 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 구제역 바이러스의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 이용하여 구제역을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 구제역 O형 Manisa 유전체의 P1 유전자 부위가 구제역 O형 C3 Resende 유전자로 치환되고, 상기 구제역 O형 Manisa 유전체의 3B 부위 중에서 3B12 부위가 치환되며, 상기 구제역 O형 Manisa 유전체의 P1 유전자 중에서 3C 유전자의 142번째 아미노산인 시스테인이 트레오닌으로 치환된 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 재조합 벡터를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 구제역 O형 Manisa의 유전자를 재조합 벡터에 삽입하는 단계, (b) 상기 (a)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 구제역 O형 Manisa의 3B12 부위를 치환하는 단계, (c) 상기 (b)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 상기 구제역 O형 Manisa의 3C 유전자 중 142번째 아미노산인 시스테인을 트레오닌으로 치환하는 단계, 및 (d) 상기 (c)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 상기 구제역 O형 Manisa의 P1 유전자 부위를 구제역 O형 C3 Resende 주의 P1 유전자로 치환하는 단계를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 제조된 재조합 벡터를 세포에 도입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 예방용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 구제역 O형 바이러스의 유전자 일부를 조작하여 동물에 병원성을 약화시킴으로써, 소독제 실험 또는 항바이러스 실험 등 실험실 내에서 다루기에 병원성 바이러스보다 더욱 안전하게 사용할 수 있는 장점을 지니고 있다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 하여 백신을 제작함으로써, C형 바이러스 중 EURO-SA 지역형 바이러스의 Resende와 유사한 유형의 바이러스에 방어할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 야외주와의 감별진단도 가능하여 백신 제작에 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 구제역 C형, C3 Resende 주(EURO-SA 지역형)의 방어 항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스의 게놈 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 구제역 O형 백신주 Manisa에서 VP2, VP3, VP4 및 VP1 방어 항원단백질을 C3 Resende(EURO-SA 지역형)로 교체하여, 유전자의 염기서열이 삽입된 재조합 벡터(플라스미드)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 상기 도 2의 재조합 벡터로부터 제작된 재조합 구제역 바이러스 C3 Resende를 전자현미경 사진을 통하여 확인한 바이러스 입자를 나타낸 것이다.
도 4는 마우스에서의 병원성이 감소됨을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 확인된 C3 Resende-R 구제역 바이러스가 감염된 세포에서의 항원이 발현됨을 나타내는 것이다.
도 6a 및 도 6b는 마우스에서의 항원 dose 별로 7일 면역 후(1.5~0.023 μg, 소 및 돼지 1/10~1/640 dose), 공격접종 실험(C3 Resende-wild type)을 통해서 마우스의 생존율(도 6a) 및 체중감소(도 6b)를 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 소(n=5)에서 면역시험(0주, 4주에 백신접종)을 통해 얻어진 혈청으로 면역된 항체에 대해 ELISA 항체 수준을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 돼지(n=20)에서의 면역실험 (0주, 4주에 백신접종)을 통해 얻어진 혈청으로 면역된 항체에 대해 ELISA 항체 수준을 조사한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명의 일 구현예는 구제역 O형 Manisa 유전체의 P1 유전자 부위가 구제역 O형 C3 Resende 유전자로 치환되고, 상기 구제역 O형 Manisa 유전체의 3B 부위 중에서 3B12 부위가 치환되며, 상기 구제역 O형 Manisa 유전체의 P1 유전자 중에서 3C 유전자의 142번째 아미노산인 시스테인이 트레오닌으로 치환된 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 "P1 유전자"는 P1 단백질을 코딩하는 염기서열로, VP1, VP2, VP3 및 VP4 부위를 포함할 수 있으며, 본 발명에서는 상기 부위는 단백질을 코딩하는 염기서열, 단백질을 코딩하지 않은 염기서열 및 유전자를 포함하는 개념으로 사용된다.

본 발명에서 용어 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다.

상기 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다.

본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 선별 표지 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다.

적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

본 발명에서 "구제역 바이러스 O형 Cathay 지역형 C3 Resende 주"는 C형 백신에서 널리 쓰이는 백신 항원형으로, C형 중 EURO-SA 지역형에 대해 광범위한 방어가 가능한 항원이다.

본 발명의 상기 재조합 벡터에서, 상기 구제역 O형 바이러스의 유전자는 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자인 것을 특징으로 한다. 상기 전체 유전자 부위 중에서 야외주와의 감별진단 목적으로 3B1 부위 및 3B2 부위 일부를 치환시킬 수 있다. 상기 3B1 및 3B2의 치환부위는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 본 발명의 재조합 플라스미드 중 6,474 내지 6,617 bp 부위가 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 재조합 벡터는 상기 구제역 O형 Manisa 유전체 중 3C 부위의 142번째 아미노산 시스테인이 트레오닌으로 치환(C142T)된 것일 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 벡터는 도 2의 개열지도를 갖는 pO-C3 Resende일 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 벡터 pO-C3 Resende는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예는 상기 재조합 벡터를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스는 구제역 O형 C3 Resende 주의 방어항원이 발현되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예는 (a) 구제역 O형 Manisa의 유전자를 재조합 벡터에 삽입하는 단계, (b) 상기 (a)단계에서 얻은 제조합 벡터에서, 상기 구제역 O형 Manisa의 P1 유전자 중 P1 부위를 구제역 C3 Resende의 P1 유전자로 치환하는 단계, (c) 상기 (b)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 상기 구제역 구제역 O형 Manisa 유전체 중 3C 부위의 142번째 아미노산 시스테인이 트레오닌으로 치환(C142T)하는 단계, 및 (d) 상기 (c)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 구제역 O형 Manisa의 3B12 부위를 치환하는 단계를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예는 상기 제조방법에 의해 제조된 재조합 벡터를 세포에 도입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 벡터 및 재조합 구제역 바이러스는 통상의 유전자조작법, 형질전환법에 의해 제조될 수 있으며, 적은 양으로 형성된 바이러스를 세포배양을 통한 연속 계대로 적절한 양의 바이러스를 수득할 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에서, 상기 세포는 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과 동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과, 토끼과, 설치류 및 영장류의 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포에서 유래된 것일 수 있고, 바람직하게는 염소 혀 세포(ZZ-R) 및 햄스터 신장 세포(BHK-21), 흑염소 신장세포(BGK), 돼지 신장세포(IBRS-2) 및 소 신장세포(LF-BK)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에서, 상기 세포는 보다 바람직하게는 염소 태아 혀 세포(ZZ-R) 및 햄스터 신장 세포(BHK-21) 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예는 상기 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 상기 구제역 예방용 백신 조성물에 있어서, 상기 백신은 생백신, 약독화된 백신, 또는 사백신일 수 있다.

본 발명의 상기 구제역 백신 조성물은 재조합 구제역 바이러스와 함께 구제역 감염의 예방 효과가 우수한 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.

상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 수크로오스 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 개체의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 또 다른 구현예는 상기 재조합 구제역 바이러스를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 구제역의 예방 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명의 내용을 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실험예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 구제역 야외주와 감별 진단을 위한 유전자 조작

구제역 바이러스 전체 유전자(Genbank Accession No. AY593823.1)를 PCR에 의하여 증폭하고, 플라스미드(pBluescript SK II)에 O_Manisa 유전자를 삽입하였다(pO-Manisa). 이를 기초로 P1 부위를 조작하였고, 그 방법은 다음과 같다.

이미 확보된 O1 Manisa 감염성 플라스미드의 3B 부위(3B333)는, 서열번호 1에서 6,474~6,617 위치에 해당하는 합성된 서열(GGACCTTACGAGGGACCGGTGAAGAAGCCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGCTAAGAACTTGATTGTCACTGAGGGGCCATATGAAGGACCAGTGAAGAAACCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGCAAAAGCCCCGATTGTCACTGAA, 144 bps; 서열번호 2)로 3B1 및 3B2 부위를 제거한 후, A형의 3B3 및 SAT 형의 3B3로 합성하여 삽입하는 작업을 실시하였다.

일반적으로 cDNA 합성시 사용되는 랜덤 프라이머를 이용하여 O-Manisa 바이러스에 대한 cDNA 작성후 전체 유전자가 클로닝된 것을 기초로, O-Manisa 바이러스 유전자 정보를 이용하여 3A의 끝부분 유전자 및 3B3의 시작 부위 유전자 증폭이 가능한 특이 프라이머들(GenBank Accession No. AY593823.1를 기초로 5' 및 3' 유전자의 각 20 mers씩에 해당)을 작성하여 PCR을 실시하였다.

상기 PCR를 위한 조건은 5X buffer(FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs(1㎕), Phusion enzyme(2U/㎕, 0.5㎕), 멸균 증류수(35.5㎕)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25 싸이클, 최종 72℃ 10분으로 반응을 실시하였다.

상기에서 작성된 벡터와 합성된 유전자와의 결찰반응(TAKARA Long Ligation kit)을 수행하였으며, 전체 염기서열 분석을 통하여 적절히 클로닝된 것을 확인하였다.

하기 표 1은 3B1 및 3B2를 제거하고, A형 3B3 및 SAT형의 3B3이 교체되어 삽입된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

<실시예 2> 병원성 감소 유전자 조작

병원성 감소된 구제역 바이러스를 제작하기 위해 우선 감염성 플라스미드를 만들기 위한 시도가 수행되었다. 실시예 1에서 제조된 pO-Mansia-3B 플라스미드에서, 그 벡터를 NEW ENGLAND BIOLABS^® Inc.의 Gibson Assembly^® Master Mix를 이용하여 pO-Manisa-3B 유전자 중 3C C142T(7113-7114 bp 위치, tg→ac) 되도록 조작하였다.

PCR을 이용하여 증폭한 뒤 자가결찰(self ligation)하는 방법을 이용하여 유전자가 교체 플라스미드를 확보하였다.

<실시예 3> 재조합 플라스미드 pO-C3 Resende의 제작

구제역 바이러스 전체 유전자(Genbank Accession No. AY593823.1)를 PCR에 의하여 증폭하고, 플라스미드(pBluescript SK II)에 O_Manisa 유전자를 삽입하였다(pO-Manisa). 이를 기초로 P1 부위를 조작하였고 그 방법은 다음과 같다.

플라스미드(pO-Manisa)를 기초로 하여 Gibson Assembly^® Cloning Kit에 조건에 맞게 P1을 증폭하기 위한 PCR은 플라스미드(100ng/μl, 1μl), 서열번호 5의 Primer F(AACAAAGGTCCAGAAAAGGCTCAAGGGAGCGGGACAGTCATCA, 42mer), 서열번호 6의 Primer R(TTTGAGCAGGTCAAAATTTAGAAGTGCACAGTTGTTTCTCGACG, 42mer)를 사용하였다.

PCR 조건은 5X buffer(FINNZYMES, 10μl), 10mM dNTPs(1μl), Phusion enzyme(2U/μl, 1μl), 멸균 증류수(35μl)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 72℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25 싸이클, 최종 72℃ 10분으로 반응을 실시하였다.

P1이 증폭된 PCR산물을 Gibson Assembly^® Cloning Kit의 라이게이션 조건에 따라 반응시켰다.

플라스미드(pO-Manisa 3B333 3Cmut)에서 P1을 제거하기 위한 PCR은 플라스미드(100ng/μl, 1μl), 서열번호 7의 Primer F(V_Fwd ACTTCTAAATTTTGACCTGC 20mer), 서열번호 8의 Primer R(V_Rev CTTGAGCCTTTTCTGGAC 18mer)를 사용하였다.

이때, PCR 조건은 5X buffer(FINNZYMES, 10μl), 10mM dNTPs(1μl), Phusion enzyme(2U/μl, 1μl), 멸균 증류수(35μl)의 용량으로 98℃ 30초 후, 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25 싸이클, 최종 72℃ 10분으로 반응을 실시하였다.

그 방법은 P1 PCR산물(200ng/μl, 1μl)과 pO-Manisa 3B333 3Cmut에서 P1이 제거된 PCR 산물(200ng/μl, 1μl), Gibson Assembly Master Mix(2X, 10μl), 멸균 증류수(8μl)용량으로 56℃ 30분 반응하였다. 그 이후에 Gibson Assembly^® Cloning Kit에 포함된 수용성 세포(competent cell)에 형질전환하였다.

최종적으로 염기서열 분석을 실시하여 pO-Manisa 3B333 3Cmut의 플라스미드의 P1이 C3 Ressende의 P1으로 교체 되었는지를 확인하였다.

<실시예 4> 재조합 구제역 바이러스의 제작>

재조합 구제역 바이러스의 회복은 확보된 상기 재조합 플라스미드(pO-C3 Resende)를 제한효소로 반응시켜 유전자를 단일 조각편으로 작성하고, BHKT7-9 세포(T7 RNA polymerase가 발현되는 세포주)에 리포펙타민 형질전환 시약(라이프 테크놀로지)을 이용하여 정제된 DNA를 형질도입하여 2일 내지 3일 동안 배양한 후, 형성된 재조합 바이러스를 확보하였다.

이 후, 상기 확보된 바이러스를 ZZ-R(염소 태아 혀)세포 또는 BHK-21(어린 햄스터 신장) 세포에서 연속 계대를 통해 접종하여 바이러스를 증식시켰다.

도 3은 상기 재조합 플라스미드 pO-C3 Resende로부터 새로 제작된 재조합 구제역 바이러스 O-Thi-R을 전자현미경 사진을 통하여 확인한 바이러스 입자를 나타낸 것이다.

<실시예 5> 제작 백신의 동물에서의 면역원성

재조합 구제역 바이러스를 이용한 동물 실험을 위하여, 상기 실시예 3에서 제작한 재조합 구제역 바이러스를 정제한 구제역 바이러스 항원(15μg/dose) 0.5ml 오일 아쥬반트 ISA206이 포함된 아쥬반트 0.5ml를 이용하여 혼합하여 이중 오일로 작성하였다.

이렇게 제작된 백신을 마우스(C57BL/6), 6개월령 이상 소 등 구제역 항체가 없는 동물을 이용하여 마우스는 0.1ml 및 2-3개월령 돼지, 소는 1ml 을 접종하여 마우스에서는 각각 7 일간 면역후 공격접종하여 체중변화, 생존률을 관찰하였으며, 돼지 및 소에서는 각 시기별 항체 측정을 위해 채혈하였고, 그 C형 항체 측정을 위해서 백신주에 대한 중화시험(OIE 메뉴얼 표준시험법 기준)을 실시하여 항체 수준을 결정하였다.

도 4는 마우스에서의 병원성이 감소된 결과를 확인한 것이다. 포유 마우스에서 야외주(C3 Resende-wild type)와 제작된 백신주(C3 Resende-R)의 접종 후 폐사율을 시험한 것이다.

도 5는 확인된 C3 Resende-R 구제역 바이러스가 감염된 세포에서의 항원이 발현됨을 간이항원 킷트 (PBM 킷트, USA; SP 밴드는 밴드형성, NSP는 미형성)에 의해 확인한 것으로서, NSP가 밴드가 미형성된 것을 통해 항원 및 혈청학적으로도 야외주와의 감별이 가능한 것이다. 15 ng(1/1000 dose) 까지 검출이 가능하다.

도 6은 마우스에서의 항원 dose 별로 7일 면역 후(1.5~0.023 μg, 소 및 돼지 1/10~1/640 dose) 공격접종 실험(C3 Resende-wild type)을 통해서 마우스의 생존율 및 체중감소를 조사한 결과이다. 이 결과에 따르면 0.023 μg(1/640 dose) 백신을 접종하여도 ME-SA 지역형 바이러스에 대해 완벽한 방어가 가능함을 확인하였다.

도 7은 소(n=5)에서 면역시험(0주 및 4주 접종)을 통해 얻어진 혈청으로 면역된 항체에 대해 ELISA 항체수준을 조사한 결과이다.

도 8은 돼지(n=20)에서의 면역실험(0주 및 4주 접종)을 통해 얻어진 혈청으로 면역된 항체에 대해 ELISA 항체 수준을 조사한 결과를 나타낸 것이다.

상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 의하면, 구제역 C형 바이러스 중 EURO-SA 지역형 바이러스의 Resende와 유사한 유형의 바이러스의 광범위 방어항원 발현능을 보유하는 재조합 구제역 바이러스를 이용한 구제역 백신을 제공함으로써, 구제역의 치료 및/또는 예방에 기여할 수 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 적용될 수 있다.

<110> Republic of Korea(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Recombinant foot-and-mouth disease virus expressing protective antigen of type C3 Resende <130> 10919 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11087 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> full DNA gene of pO-C3 Resende <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg gccagtgagc atatgtaata cgactcacta tagggttgaa agggggcgct 660 agggtctcac ccctagcatg ccaacgacag ctcctacgtc gcactccaca ctaacgtttg 720 tgtgcgcgcg ggaaccgatg gacttttgtt cacccaccta cagttggact cacggcaccg 780 cgtggccatt ttagctgggt tgtgcggacg aacactgctt gcgcatctcg cgtgaccggt 840 tagtactctt accactatcc gcctacttgg tcgttagcgc tgtcctgggc actcttgttg 900 ggggctgttc aacgctctac ggtctcccct gcgtaacaga ctacggtgtt ggggccgctt 960 cgtgcgagcc gatcgcttgg tgtgcctcgg ctgtcgcccg aagcccgcct ttcacccccc 1020 cccccccccc ctaggtttta ccgtcgttcc cgacgttaat ggggaaacaa ccacaagctt 1080 aacaccgtct tgcccgacgt aaaagggctg caaccaaaaa gcttgtgccg cctttcccgg 1140 cgttaatggg aggtaaccac aagacaaacc ttcacccgga agtaaaacgg caacttcaca 1200 cagttttgcc cgttttcgtg agaaatgggc cgtcaacgca cgaaacgcgc cgtcgcttga 1260 ggaggacttg tacaaacacg atctatgcag gtttccacaa ctgacacaaa ccgtgcaact 1320 tgaaaccccg cctggtcttt ccaggtctag aggggcgaca ttttgtactg tgcttgactc 1380 cacgctcggt ccactagcga gtgttagtag tagcactgtt gcttcgtagc ggagcatgat 1440 ggccgtggga gcttcccctt ggtaacaagg acccacgggg ccaaaagcca cgtcctaccg 1500 gacccatcat gtgtgcaaac ccagcacggc aactttactg cgaaaaccac tttaaggtga 1560 cactgatact ggtactcaat cactggtgac aggctaagga tgcccttcag gtaccccgag 1620 gtaacacgcg acactcggga tctgagaagg ggactggggc ttctttaaaa gtgcccagtt 1680 taaaaagctt ctatgcctga ataggcgacc ggaggccggc gccttttcac tgttttacta 1740 ctgttttcat gaatacaact gactgtttca ccgccctgtt acacgctctc agagagatca 1800 aaacactgtt tcttttacgg acacaaggaa agatggaatt cacactttac aacggtgaga 1860 agaaaacctt ctactccaga cccaacaacc acgacaactg ctggcttaac accattctcc 1920 agttgttcag gtatgttgat gagcctttct ttgactgggt ctacgactcg cctgaaaacc 1980 tcactcttga ggcaatcaaa cagttggaag agacaaccgg tcttgagctg cacgagggtg 2040 gaccacccgc tctcgtcatc tggaacatca aacacttgct tcacaccgga atcggcactg 2100 cctcacgccc tagcgaggtg tgtatggtgg acggaacgga catgtgttta gctgattttc 2160 atgctggcat tttcctgaaa ggacaggaac atgctgtgtt cgcctgtgtc acctccaacg 2220 ggtggtacgc gattgatgac gaggactttt acccttggac accggacccg tccgacgttc 2280 tggtgtttgt cccgtacgat caagaaccgc ttaacggaga gtggaaaaca aaggtccaga 2340 aaaggctcaa gggagccggg caatccagcc cggcgaccgg atcgcagaac caatctggca 2400 acactggcag cataatcaac aactattaca tgcagcagta ccaaaattcc atggacacac 2460 agcttggtga caacgccatt agcggaggct ccaacgaagg ctccacggac acaacttcca 2520 cccacacaac caacactcag aacaacgact ggttttccaa actcgccagc tctgccttca 2580 gcggtctttt cggcgccctg ctcgccgaca agaagacgga agagaccact cttctcgagg 2640 accgcatcct cactacccgt aacggacaca cgacgtcgac aacccagtcg agtgtcggag 2700 ttacatacgg gtatgcaaca gctgaggaca gctcgtcagg gcctaacacg tctggccttg 2760 agacgcgtgt ccatcaggca gagcggtttt tcaaaatgac gctttttgat tgggttccct 2820 cgcaaaattt tggacacatg cacaaggttg ttctgcccac agacccgaaa ggtgtctatg 2880 ggggtctcgt caagtcatat gcgtacatgc gcaatggctg ggacgttgag gtgactgccg 2940 tcggaaacca gttcaacggc ggttgtctct tggtggcgct cgtccccgag atgggcgaca 3000 tcagtgacag ggaaaagtac caactgaccc tttaccccca ccagttcatc aacccacgta 3060 ctaacatgac ggcacacatc accgtgccct acgtgggtgt caacagatac gaccagtaca 3120 agcaacacaa gccctggacc ctcgtggtta tggtcgttgc tccactcact gtgaacacat 3180 caggcgccca gcagattaaa gtgtatgcca acatagcccc aaccaacgtc cacgttgcag 3240 gtgagctccc ctccaaggag gggatctttc ccgttgcgtg tgccgacggt tatggcaaca 3300 tggtgacaac tgacccgaaa acggctgatc ctgcctacgg gaaagtgtac aacccccccc 3360 ggactgcttt gccggggcgg ttcacaaact acctggatgt tgctgaggct tgtcccactt 3420 tcctggtgtt cgagaacgtg ccctacgtct caacacggac tgatggacaa aggttactgg 3480 ccaagttcga cgtgtcgctg gcagcgagac acatgtcaaa cacctacttg gctggtctgg 3540 cccagtacta cacacagtac gctgggacaa tcaacctaca ctttatgttc actgggccga 3600 ccgacgcgaa agctcggtac atggtagcat acgtgccccc cggcatggaa gcaccagaaa 3660 acccagaaga ggctgcccac tgcatacacg cagagtggga cactggtctg aactccaagt 3720 tcacattttc aatcccgtac atttcggccg ctgactacgc gtacaccgcg tccaacgagg 3780 ctgaaacaac atgtgtacag ggatgggttt gtgtgtacca aatcacccac ggcaaggcag 3840 atgccgacgc gctcgtcatc tccgcatctg cggggaaaga ctttgagctc cggctgcctg 3900 tggacgctag gcaacaaact acgaccactg gtgaatctgc cgaccctgtt accactaccg 3960 ttgagaacta cggaggagag acgcaagtcc aacgtcgtca ccacactgac gttgccttcg 4020 ttcttgaccg gtttgtgaag gtccctgtgt cggacagaca acaacacaca ctggacgtga 4080 tgcaggtaca caaggacagt attgtgggag cgcttctccg cgcagccacg tactacttct 4140 ctgatctgga aatagcggtg acccacaccg ggaagctcac ctgggtgccc aacggtgcac 4200 cggtttctgc acttgacaac acaaccaacc ccactgcata ccacaaggga ccgctgactc 4260 gactggctct cccatacacc gcgccacacc gcgtgttggc cacgacgtac actggtacaa 4320 caacctacac taccagtgca cgtagaggag attcggccca tttggcggca gcacacgctc 4380 ggcatttgcc gacgtcgttc aactttggtg cagttaaagc agaaacagtc actgagctgc 4440 tggtgcgcat gaagcgtgca gaactctatt gccccaggcc gattcttccg attcagccaa 4500 cgggcgacag acacaagcaa ccgctcatcg cgccggcgaa acagcttcta aattttgacc 4560 tgctcaaatt ggcgggagat gtggagtcca accctgggcc cttcttcttc tccgacgtca 4620 ggtcaaattt ctcaaaactg gtagaaacca tcaatcagat gcaggaggac atgtcaacaa 4680 aacacgggcc tgactttaac cggttggtgt ccgcatttga ggaattggcc actggagtga 4740 aggctatcag ggccggtctc gacgaggcca aaccctggta caaactcatc aagctcctga 4800 gccgcttgtc gtgcatggcc gctgtagcag cacggtcaaa ggacccagtc cttgtggcca 4860 tcatgctggc tgacaccggt cttgagattc tggacagcac ctttgtcgtg aagaagatct 4920 ccgactcgct ctccagtctc tttcacgtgc cggcccccgt cttcagtttc ggagccccga 4980 ttctgttggc cgggttggtc aaagtcgcct cgagtttctt ccggtccaca cccgaagacc 5040 ttgagagagc agaaaaacag ctcaaagcac gtgacattaa cgacatattc gccattctca 5100 agaacggcga gtggctggtc aagctgatcc ttgccatccg cgactggatc aaagcgtgga 5160 tcgcctcaga agaaaagttt gtcaccatga cggacttggt gcctggtatc cttgaaaagc 5220 agcgggatct caacgacccg agtaagtaca aggaagccaa ggagtggctc gacaacgcgc 5280 gccaggcgtg tttgaagagc gggaacgttc acattgccaa tttgtgcaaa gtggtcgccc 5340 cggcacccag caagtcgaga cccgaacccg tggtcgtttg cctccgcggc aaatccggcc 5400 aggggaagag tttccttgcg aacgtgctcg cgcaagcaat ctccacccac ttcaccggca 5460 gaactgattc ggtttggtac tgcccgcctg accctgacca cttcgacggt tacaaccagc 5520 agaccgttgt cgtgatggac gatttgggcc agaaccccga tggcaaggac ttcaagtact 5580 tcgcccagat ggtttcgacc acggggttca tcccgcccat ggcctcgctt gaggacaaag 5640 gcaagccttt caacagcaaa gtcatcattg ctaccaccaa cctgtactcg ggtttcaccc 5700 cgagaacaat ggtgtgtcct gacgcgctga accggaggtt ccactttgac atcgacgtga 5760 gtgccaagga cgggtacaaa gttaacaaca aattggacat aatcaaagct cttgaagaca 5820 cccacaccaa cccagtggcg atgttccaat acgactgtgc ccttctaaac ggtatggcag 5880 ttgaaatgaa gagaatgcaa caggatatgt tcaagcctca accacccctc cagaacgtgt 5940 accaactcgt tcacgaggtg attgaacggg tcgagctcca cgagaaggtg tcgagccacc 6000 cgattttcaa acagatatca attccttccc aaaagtctgt gttgtacttc ctcattgaga 6060 aaggccaaca cgaagcagca attgaattct ttgagggaat ggtgcatgac tccatcaagg 6120 aagagctccg gcccctcatc caacagacct catttgtgaa acgcgctttt aagcgcctga 6180 aggaaaactt tgagactgtt gccctgtgtt tgactctttt ggcaaacata gtgatcatga 6240 tccgcgagac tcgcaagaga caacagatgg tggacgatgc agtgaatgac tacattgaga 6300 aggcaaacat caccacagat gacaagactc ttgacgaggc ggaaaagaac cctctagaga 6360 ccagcggtgc cagcactatt ggtttcagag agagaactct cccggggcac aaggcgagcg 6420 atgacgtgag ctccgagccc gccaaacccg tggaggaccg accacaagct gaaggacctt 6480 acgagggacc ggtgaagaag cctgtcgctt tgaaagtgaa agctaagaac ttgattgtca 6540 ctgaggggcc atatgaagga ccagtgaaga aacctgtcgc tttgaaagtg aaagcaaaag 6600 ccccgattgt cactgaagga ccctacgagg gaccggtgaa gaagcctgtc gctttgaaag 6660 tgaaagccaa gaacttgatt gtcactgaga gtggtgcccc accgaccgac ttgcagaaga 6720 tggtcatggg caacactaag cctgttgagc tcatcctcga cgggaagacg gtagccatct 6780 gctgtgctac cggagtgttt ggcactgcct acctcgtacc tcgtcacctc ttcgcggaga 6840 agtacgacaa gataatgttg gacggtagag ccatgacaga cagtgactac agagtgtttg 6900 agtttgagat taaagtaaaa ggacaggaca tgctctcaga cgctgcactc atggtgcttc 6960 accgtgggaa ccgcgtgaga gacatcacga aacattttcg tgacacagca agaatgaaga 7020 aaggcacccc cgttgtcggt gtgatcaaca acgccgacgt tgggagactg attttctctg 7080 gagaggccct tacctacaaa gacattgtag tgaccatgga tggagacacc atgccgggcc 7140 tgtttgccta cagagccgcc accaaggctg gttactgcgg gggagccgtt ctcgccaagg 7200 acggagccga cacattcatc gttggcaccc actccgcagg tggtaacgga gttggatact 7260 gctcgtgcgt gtccaggtcc atgctcctga aaatgaaggc acacattgac cctgaaccac 7320 accacgaggg gttgattgtt gataccagag atgtggaaga gcgcgtgcat gtcatgcgta 7380 aaaccaagct tgcacccacc gtggcacacg gtgtgtttaa ccctgaattt ggtcccgctg 7440 ccttgtccaa caaggacccg cggctgaacg aaggggttgt cctcgatgaa gtcatcttct 7500 ccaaacacaa gggagacacg aaaatgtctg aggaggacaa agcgctgttc cgccgctgcg 7560 ctgccgacta cgcgtcgcac ttgcacagcg tgctggggac ggcaaatgcc ccattgagca 7620 tctatgaggc catcaaaggc gtcgacgggc tcgatgccat ggagccggac accgcgcccg 7680 gcctcccctg ggccctccag gggaaacgcc gtggtgcgtt gattgacttc gagaacggca 7740 cggtcggacc cgaagtcgag gctgccctaa agctcatgga gaaaagagag tacaaatttg 7800 cttgccagac cttcctgaaa gacgagattc gtccgatgga aaaagtacgt gctggcaaga 7860 ctcgcattgt cgacgttttg cccgtggaac acattcttta caccaggatg atgattggca 7920 gattctgtgc tcaaatgcac acaaacaatg gaccgcagat tggctcagcg gtcggttgca 7980 atcctgatgt tgattggcaa agatttggca cacattttgc tcagtacaga aacgtgtggg 8040 atgtggacta ttcggccttt gatgctaacc actgcagtga cgcaatgaac atcatgtttg 8100 aggaggtatt tcgcacagac ttcggtttcc acccaaatgc tgagtggatt ctgaagactc 8160 ttgtgaacac ggagcacgcc tatgagaaca aacgtatcac tgttgagggc gggatgccgt 8220 ctggctgttc cgcgacaagc atcatcaaca caattttgaa caacatttat gtgctctacg 8280 ctcttcgtag acactatgag ggagttgagc tggacaccta caccatgatc tcctacggag 8340 atgacatcgt ggttgcaagt gactacgatc tggattttga ggctctcaaa ccccacttca 8400 aatctcttgg tcaaaccatc actccagctg acaaaagcga caaaggtttt gttcttggtc 8460 actccattac cgatgtcact ttcctcaaaa gacacttcca catggactat ggaactgggt 8520 tttacaaacc tgtgatggcc tcaaagaccc tcgaggccat tctctccttt gcacgccgtg 8580 ggaccataca ggagaagttg atctccgtgg caggactcgc cgtccactca ggacctgacg 8640 agtaccggcg tctctttgag cccttccagg gtctcttcga gattccaagc tacagatcac 8700 tttacctgcg ttgggtgaac gccgtgtgcg gtgacgcata atccctcaga tgtcacaatt 8760 ggcagaaaga ctctgaggcg agcgacgccg taggagtgaa aagcccgaaa gggcttttcc 8820 cgcttcctat tccaaaaaaa aaaaaaaaaa actagttcta gagcggccgc caccgcggtg 8880 gagctccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattgcg cgcttggcgt aatcatggtc 8940 atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 9000 aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 9060 gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 9120 ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 9180 ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 9240 acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 9300 aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 9360 tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 9420 aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 9480 gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 9540 acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 9600 accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 9660 ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 9720 gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 9780 gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 9840 ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 9900 gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 9960 cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 10020 cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 10080 gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 10140 tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 10200 gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 10260 agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 10320 tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 10380 agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 10440 gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 10500 catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 10560 ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 10620 atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 10680 tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 10740 cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 10800 cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 10860 atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 10920 aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 10980 ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 11040 aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccac 11087 <210> 2 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3B gene of pO-C3 Resende sequence <400> 2 ggaccttacg agggaccggt gaagaagcct gtcgctttga aagtgaaagc taagaacttg 60 attgtcactg aggggccata tgaaggacca gtgaagaaac ctgtcgcttt gaaagtgaaa 120 gcaaaagccc cgattgtcac tgaa 144 <210> 3 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acids of 3B12 deletion <400> 3 Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Arg Val Lys 1 5 10 15 Thr Lys Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met Asp Arg 20 25 30 Gln Lys Pro Leu Lys Val Arg Ala Arg Ala Pro Val Val Lys Glu 35 40 45 <210> 4 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acids of 3B33 addition <400> 4 Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys 1 5 10 15 Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys 20 25 30 Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Ile Val Thr Glu 35 40 45 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of P1 amplication <400> 5 aacaaaggtc cagaaaaggc tcaagggagc gggacagtca tca 43 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of P1 amplication <400> 6 tttgagcagg tcaaaattta gaagtgcaca gttgtttctc gacg 44 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of P1 deletion <400> 7 acttctaaat tttgacctgc 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of P1 deletion <400> 8 cttgagcctt ttctggac 18

Claims (11)

1. 구제역 O형 Manisa 유전체의 P1 유전자 부위가 구제역 O형 C3 Resende 유전자의 P1 유전자로 치환되고, 상기 구제역 O형 Manisa 유전체의 3B 부위 중에서 3B1 및 3B2 부위가 구제역 A형의 3B3 및 구제역 SAT형의 3B3 서열을 합성한 서열번호 2의 서열로 치환되며, 상기 구제역 O형 Manisa 유전체의 P1 유전자 중에서 3C 유전자의 142번째 아미노산인 시스테인이 트레오닌으로 치환된 재조합 벡터로서,
   상기 재조합 벡터가 하기 도 2의 개열지도를 갖는 pO-C3 Resende이고,
   상기 재조합 벡터 pO-C3 Resende는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 재조합 벡터.
   [도 2]
   

   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항의 재조합 벡터를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스.
5. 제4항에 있어서, 상기 바이러스는 구제역 Cathay 지역형인 C3 Resende 주의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스.
6. (a) 구제역 O형 Manisa의 유전자를 재조합 벡터에 삽입하는 단계;
   (b) 상기 (a)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 구제역 O형 Manisa의 3B1 및 3B2 부위를 구제역 A형의 3B3 및 구제역 SAT형의 3B3 서열을 합성한 서열번호 2의 서열로 치환하는 단계;
   (c) 상기 (b)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 상기 구제역 O형 Manisa의 3C 유전자 중 142번째 아미노산인 시스테인을 트레오닌으로 치환하는 단계; 및
   (d) 상기 (c)단계에서 얻은 재조합 벡터에서, 상기 구제역 O형 Manisa의 P1 유전자 부위를 구제역 C3 Resende 주의 P1 유전자로 치환하는 단계를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법으로서,
   상기 재조합 벡터가 하기 도 2의 개열지도를 갖는 pO-C3 Resende이고,
   상기 재조합 벡터 pO-C3 Resende는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 재조합 벡터의 제조방법.
   [도 2]
   

   
7. 제6항의 방법에 의해 제조된 재조합 벡터를 세포에 도입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 세포는 염소 태아 혀 세포 및 햄스터 신장 세포 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
9. 제4항의 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 예방용 백신 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 백신은 생백신, 약독화된 백신 또는 사백신인 것을 특징으로 하는 구제역 예방용 백신 조성물.
11. 제4항의 재조합 구제역 바이러스를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 구제역의 예방 방법.

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