CN110257403A - 一种表达传染性喉气管炎病毒gB基因、其重组鸡痘病毒及构建方法和应用 - Google Patents

一种表达传染性喉气管炎病毒gB基因、其重组鸡痘病毒及构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种表达传染性喉气管炎病毒gB基因、其重组鸡痘病毒及构建方法和应用。本发明所述传染性喉气管炎病毒gB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用本发明所述传染性喉气管炎病毒gB基因构建得到的重组鸡痘病毒与商品化的重组鸡痘基因工程疫苗相比，具有更为显著的免疫保护水平，且能克服传统弱毒活疫苗毒力返祖和潜伏感染等缺陷。

Description

一种表达传染性喉气管炎病毒gB基因、其重组鸡痘病毒及构 建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达传染性喉气管炎病毒gB 基因、其重组鸡痘病毒及构建方法和应用。
背景技术
传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitisvirus,ILTV)引起的一种急性呼吸道传染病，该病现已遍布各养禽国家和地区，我国有些地区呈地方性流行性。该病具有传播快，死亡率高，且能引起产蛋鸡的产蛋率迅速下降等特点，给养禽业造成了巨大的经济损失。目前国内外主要通过传代致弱的弱毒活疫苗来预防本病，但弱毒活疫苗存在毒力返强的风险，有的弱毒活疫苗还能使鸡发病，引起ILT的爆发和流行，野毒株和疫苗株难以区分等许多缺陷。因此，需要开发新一代高效安全的疫苗来用于ILT的防控。
发明内容
本发明的目的在于提供一种传染性喉气管炎病毒gB基因、其重组鸡痘病毒及构建方法和应用。利用本发明所述传染性喉气管炎病毒gB基因构建得到的重组鸡痘病毒与商品化的重组鸡痘基因工程疫苗相比，具有更为显著的免疫保护水平，且能克服传统弱毒活疫苗毒力返祖和潜伏感染等缺陷，有潜力替代现有的弱毒活疫苗和商品化的重组鸡痘基因工程疫苗，应用于传染性喉气管炎的防控，具有较大的市场潜力。
本发明提供了一种传染性喉气管炎病毒gB基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供了表达上述技术方案所述传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒。
本发明还提供了上述技术方案所述重组病毒的构建方法，包括以下步骤：
1)将上述技术方案所述传染性喉气管炎病毒gB基因构建到鸡痘病毒转移载体p12LS上，得到p12LS-gB；
2)得到p12LS-gB后，以鸡痘病毒282E4株为亲本毒株，共转染，得到表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒rFPV282E4-gB。
优选的是，步骤2)所述共转染包括脂质体共转染法。
优选的是，步骤2)所述共转染的对象包括无特定病原体的鸡胚成纤维细胞。
优选的是，步骤2)所述共转染后，还包括蓝白斑筛选、纯化。
本发明还提供了上述技术方案所述基因、上述技术方案所述病毒或上述技术方案所述构建方法得到的病毒作为传染性喉气管炎疫苗的应用。
本发明提供了一种表达传染性喉气管炎病毒gB基因。利用本发明所述传染性喉气管炎病毒gB基因构建得到的重组鸡痘病毒，能够正确表达鸡传染性喉气管炎病毒主要保护性抗原基因gB蛋白，诱导免疫鸡体产生良好的免疫应答反应，与ILTV传统弱毒疫苗和商品化重组鸡痘病毒基因工程疫苗相比，不仅克服了传统弱毒疫苗毒力返祖和潜伏感染等缺陷，而且免疫效力高于商品化重组鸡痘病毒基因工程疫苗，是一种更为安全、有效的基因工程疫苗候选株，具有广阔的开发前景，市场经济效益潜力大。试验结果表明，以105PFU/只的剂量颈部皮下免疫28日龄SPF鸡，结果显示，免疫后21d，使用105EID50/只的剂量ILTV野毒株Gallid herpesvirus 1strain I19喉头攻毒，疫苗候选株的免疫保护指数为100，显著高于商品化疫苗组的83.3，排毒率略低于商品化疫苗组，与商品化的重组鸡痘基因工程疫苗相比，具有更为显著的免疫保护水平，且能克服传统弱毒活疫苗毒力返祖和潜伏感染等缺陷。
附图说明
图1为本发明提供的T3-gB的BamH I+Xho I双酶切鉴定结果；
图2为本发明实施例1提供的p12LS-gB的BamH I+Sma I双酶切鉴定结果；
图3为本发明实施例1提供的rFPV282E4-gB的蓝色蚀斑(400×)结果；
图4为本发明实施例1提供的gB氨基酸序列的抗原性筛选结果；
图5为本发明实施例1提供的阳性质粒为原核表达重组质粒pET32a-gBa 的EcoRI+Xho I双酶切鉴定结果；
图6为本发明实施例1提供的PET32a-gBa蛋白电泳图；
图7为本发明实施例1提供的间接免疫荧光鉴定gBa多克隆抗体血清结果；
图8为本发明实施例1提供的Western-blot鉴定gBa多克隆抗体血清结果；
图9为本发明实施例1提供的rFPV282E4-gB的PCR鉴定结果；
图10为本发明实施例1提供的间接免疫荧光鉴定rFPV282E4-gB中gB的表达(400×)结果；
图11为本发明实施例1提供的Western-blot鉴定rFPV282E4-gB中gB的表达结果；
图12为本发明实施例2提供的感染ILTV的鸡胚和健康对照结果。
具体实施方式
本发明提供了一种传染性喉气管炎病毒gB基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。本发明所述传染性喉气管炎病毒gB基因优选人工合成，或由核苷酸序列为SEQID NO.2所示的gB基因突变而来，本发明对如SEQ ID NO.2所示的gB基因的来源没有特殊限定，采用含如SEQ ID NO.2 所示的gB基因的载体或毒株进行扩增均可。具体地，当扩增如SEQ ID NO.2 所示的gB基因时，本发明优选采用如SEQ ID NO.3所示的上游引物(gB-1：5’-AAAGGATCCGCCACCATGGCTAGCTTGAAAAT-3’)和如SEQ ID NO.4 所示的下游引物(gB-2：5’-GCCCTCGAGATAAAAATTATTCGTCTTCGCTTTCT-3’)。本发明在各上下游引物两端分别添加限制性酶切位点BamH I和Xho I，在上游引物中的起始密码子ATG附件设置Kozak序列，在下游引物中引入FPV早期转录终止信号TTTTTNT的反向互补序列。本发明对所述引物的来源没有特殊限定，优选由北京擎科新业生物技术有限公司合成。当扩增如SEQ ID NO.2所示的 gB基因上，所述扩增体系(25μL)优选如表1所示：
表1 gB基因扩增体系
2×PhantaMaxBuffer(withMg<sup>2+</sup>) 12.5μL
dNTPMix(10mM) 0.5μL
上游引物(25μM) 0.5μL
下游引物(25μM) 0.5μL
DNA 2μL
PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase(1U/μL) 1μL
ddH<sub>2</sub>O 8μL
将上述体系混匀，瞬离后，本发明优选按以下步骤进行PCR扩增：95℃预变性30s；95℃变性15s，61℃退火15s，72℃延伸1min 20s，35个循环； 72℃延伸5min，4℃保存。反应结束，本发明优选用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收约2.7kb大小的目的条带。本发明优选将回收的目的片段与 pEASY-Blunt3进行连接，提取质粒。用BamH I和Xho I进行双酶切鉴定，取鉴定条带约为2700bp的重组gB基因质粒送南京金斯瑞公司测序，阳性重组质粒命名为T3-gB，T3-gB的BamH I+Xho I双酶切鉴定结果如图1所示，其中，M：1kb plusDNAladder；1：经BamH I+Xho I消化处理的T3-gB。
得到含如SEQ ID NO.2所示的gB基因的载体T3-gB后，本发明优选进行同义突变，即将如SEQ ID NO.2所示的gB基因中存在的痘病毒早期转录终止信号(TTTTTNT)序列进行了同义突变。如SEQ ID NO.2所示的gB基因ORF中第741-747位核苷酸序列为TTTTTAT，第2106-2112位核苷酸序列为TTTTTTT，与终止信号序列吻合。故以T3-gB质粒为DNA模板，用多点突变试剂盒对其gB基因进行同义突变。突变后，第741-747位核苷酸序列改变为TTTCTAT，第2106-2112位核苷酸序列改变为TTTCTTT，编码苯丙氨酸的密码子均由UUU变为UUC(对于部分如下划线所示)。突变用引物如SEQ ID NO.5～8所示：
PM1-1：
5’-GCGACAGGTGATACAGTAGAAATTTCTCCTTTCTATACC-3’(SEQ ID NO.5)；
PM1-2：
5’-TGGTCCGGTCGTGTTTTTGGTATAGAAAGGAGAAATT-3’(SEQ ID NO.6)；
PM2-1：
5’-GCAATCTTTAGAGCAATAGCAGATTTCTTTGGCAAC-3’(SEQ ID NO.7)；
PM2-2：
5’-TACTTCTTCAAGAGTGTTGCCAAAGAAATCTGCTATTG-3’(SEQ ID NO.8)。
本发明优选通过测序证明所得的基因序列突变的正确性。
本发明还提供了表达上述技术方案所述传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒。
本发明还提供了上述技术方案所述重组病毒的构建方法，包括以下步骤：
1)将上述技术方案所述传染性喉气管炎病毒gB基因构建到鸡痘病毒转移载体p12LS上，得到p12LS-gB；
2)得到p12LS-gB后，以鸡痘病毒282E4株为亲本毒株，共转染，得到表达传染性喉气管炎gB基因的重组鸡痘病毒rFPV282E4-gB。
本发明将上述技术方案所述传染性喉气管炎病毒gB基因构建到鸡痘病毒转移载体p12LS上，得到p12LS-gB。本发明对所述p12LS载体的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规p12LS载体即可，p12LS质粒序列(10367bp)如SEQ ID NO.9所示。本发明对所述载体的构建方法没有特殊限定，采用常规表达载体构建方法即可。
得到p12LS-gB后，本发明以鸡痘病毒282E4株为亲本毒株，共转染，得到表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒rFPV282E4-gB。在本发明中，所述共转染包括脂质体共转染法。在本发明中，所述共转染的对象包括SPF鸡胚成纤维细胞。在本发明中，所述共转染后，还包括蓝白斑筛选、纯化。
本发明还提供了上述技术方案所述基因、上述技术方案所述病毒或上述技术方案所述构建方法得到的重组病毒作为传染性喉气管炎疫苗的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种表达传染性喉气管炎病毒gB 基因、其重组鸡痘病毒及构建方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
转移载体的构建
鸡痘病毒转移载体p12LS，其含有两段鸡痘病毒复制非必需区基因、 MCS和启动子Ps，可利用同源重组原理将转移载体中的目的基因插入到鸡痘病毒中。
将突变完成后的质粒T3-gB用BamH I和Xho I双酶切电泳回收2.7kb 的目的片段，与用BamH I和SalI双酶切的载体质粒p12LS进行连接，提取质粒，BamH I和Sma I双酶切鉴定，取条带大小正确的质粒送南京金斯瑞公司测序，阳性质粒为转移载体p12LS-gB，p12LS-gB的BamH I+Sma I双酶切鉴定结果如图2所示，其中，M：1kbplus DNAladder；1:经BamH I+Sma I消化的p12LS-gB。
表达ILTVgB基因的重组鸡痘病毒的转染与纯化
按PolyJetTM转染试剂说明书进行转染：用0.1MOI的亲本鸡痘病毒 282E4株预先感染60mm平皿培养的单层CEF，37℃、5％CO2培养3h；取两个1.5mL的离心管分别标记为管1和管2，然后两个离心管中都加入100 μL无抗无血清DMEM基础培养基。在管1中加入15μL转染试剂，在管2 中加5μg质粒p12LS-gB；接着将管1中的液体移到管2中，轻轻混匀，室温作用15min。用PBS洗涤三次上述细胞后加入无抗无血DMEM培养液1 mL，然后逐滴加入质粒转染试剂混合液；6h后将无抗无血DMEM更换为 1％M199维持液，继续培养至细胞完全病变后收获病毒。反复冻融3次，3000 rpm离心10min，吸取上清用于重组病毒的筛选。
将上述上清液稀释后，接种CEF次代，待出现单个典型蚀斑后，用含有X-gal(200μg/mL)的营养琼脂覆盖，37℃再次培养48-72h，待出现蓝色蚀斑后挑取蓝色蚀斑放入500uL的细胞维持液中，冻融3次后再进一步克隆纯化，直至在含有X-gal的营养琼脂覆盖条件下，重组鸡痘病毒 rFPV282E4-gB在CEF上形成的蚀斑全部为蓝色，rFPV282E4-gB的蓝色蚀斑 (400×)结果如图3。
gB多克隆抗体的制备
(1)gB氨基酸序列的抗原性筛选
通过DNAStar软件分析gB蛋白氨基酸序列的亲水性、抗原性和表面可及性，选择相对抗原性强的片段，即gBa(146-454aa)，结果如图4所示。用Primer5.0软件设计引物，在上下游分别添加EcoR I和Xho I酶切位点，扩增目的序列。引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成，具体如下：
gBa-1:5’-GGGAATTCCATGAAATTGTCAGGAT-3’(SEQ ID NO.10)；
gBa-2:5’-CTCGAGTGTTGCAGAACTGTGGGTA-3’(SEQ ID NO.11)。
(2)gBa基因的扩增和克隆
PCR扩增上述gBa目的片段，所述扩增体系(25μL)如表2所示：
表2 gBa基因扩增体系
2×PhantaMaxBuffer(withMg<sup>2+</sup>) 12.5μL
dNTPMix(10mM) 0.5μL
上游引物(25μM) 0.5μL
下游引物(25μM) 0.5μL
模板DNA 2μL
PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase(1U/μL) 1μL
ddH<sub>2</sub>O 8μL
混匀瞬离后，按以下步骤PCR扩增gBa：95℃预变性30s；95℃变性 15s，60℃退火15s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。反应结束后，以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收约为900bp大小的目的条带。将回收的目的片段与pEASY-Blunt3进行连接，提取质粒。送南京金斯瑞公司测序，测序正确的阳性重组质粒命名为T3-gBa。
(3)原核表达质粒的构建及鉴定
将测序正确的质粒T3-gBa用EcoR I和Xho I双酶切电泳回收约900bp 的目的片段，与用EcoR I和Xho I双酶切的载体质粒pET-32a(+)进行连接，提取质粒，EcoR I和Xho I双酶切鉴定，取条带大小正确的质粒送南京金斯瑞公司测序，阳性质粒为原核表达重组质粒pET32a-gBa的EcoR I+Xho I双酶切鉴定结果如图5所示，其中M：1kbplus DNAladder；1:经EcoR I+Xho I 消化的pET32a-gBa。
(4)目的蛋白的诱导表达及纯化
阳性质粒PET32a-gBa转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取单个菌落于 3-5mlA+LB液体培养基中，37℃220rpm培养过夜作为母液。母液按1:100 的比例接种于6mLA+LB液体培养基中，37℃220rpm培养至OD600＝0.5左右，吸取3mL菌液作为诱导前的对照，剩余菌液加入终浓度为1mmol/L的 IPTG于菌液中，16℃220rpm诱导18h。取诱导前后的菌液8000rpm离心10min，分别弃去上清收集菌体，PBS洗涤后，加500μLPBS重悬菌体。置冰水混合物中进行超声波裂解，裂解5min后离心，分离上清和沉淀，沉淀用500μLPBS重悬。分别取上清液和重悬液与SDS上样缓冲液煮沸10min 制样，用10％的分离胶进行SDS-PAGE电泳，判断蛋白是否表达，以及表达蛋白在上清还是包涵体中。同时设pET-32a(+)转化BL21(DE3)菌作对照。结果显示，PET32a-gBa蛋白以包涵体形式表达，如图6所示，其中M：PageRulerPrestainedProtein Ladder；1:PET32a-gBa转化BL21(DE3)诱导菌液超声裂解后的沉淀(48kDa)；2:PET32a-gBa转化BL21(DE3)诱导菌液超声裂解后的上清；3:PET32a(+)转化BL21(DE3)的诱导全菌(17kDa)。
根据康维世纪公司的包涵体蛋白纯化试剂盒说明书，大量诱导 PET32a-gBa蛋白后(200mL菌液)，进行纯化。
(5)gBa多克隆抗体的制备
将上述纯化后的蛋白分别与等体积的弗氏佐剂混合，乳化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠。免疫程序如下：gBa蛋白一共免疫5只小鼠，首免用弗氏完全佐剂，接下来的2次免疫均使用弗氏不完全佐剂。抗原用量为100μg/ 只，皮下多点注射。每次免疫间隔14d，一共免疫3次。3次免疫后采小鼠血并分离血清，保存于-70℃。
(6)gBa多克隆抗体血清的鉴定
将Gallid herpesvirus 1strain I6E1的CAM病毒研磨液，8000rpm离心 10min，取500μL上清液，感染生长于25cm2细胞瓶单层致密的LMH细胞， 37℃5％CO2培养箱孵育1-2h，补加适量细胞维持液，37℃5％CO2培养箱继续培养。48-72h后，收细胞毒。
间接免疫荧光：将上述细胞毒接种于96孔板的LMH细胞中，并设阴性对照和空白对照。待细胞出现病变后，弃去上清液，PBS洗涤3次，然后加入冷甲醇(-20℃预冷)，4℃作用10min；PBS洗涤3次；加入1:200稀释的鼠抗gBa多克隆抗体血清，37℃水浴锅孵育1.5h；以含0.05％吐温-80的PBS (简称PBST)洗涤3次，每次5min，再加入1:500稀释的羊抗鼠IgG-FITC荧光二抗，37℃水浴锅孵育1h；用PBST洗涤3次，每次5min，拍干后放置在荧光显微镜下观察结果。结果可见，gBa多克隆抗体血清与Gallid herpesvirus 1strain I6E1感染LMH的细胞毒可产生荧光反应。间接免疫荧光鉴定gBa多克隆抗体血清结果如图7所示，其中A：gBa多克隆抗体血清； B：阴性血清对照；C：空白对照。
Western-blot：将上述细胞毒，与SDS上样缓冲液混合煮沸10min制样，使用gBa多抗血清1:1000稀释作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，同时设阴性血清作为对照，进行Western-blot。结果可见，gBa多克隆抗体血清能与Gallidherpesvirus 1strain I6E1感染LMH的细胞毒产生反应，且条带大小与预期一致。Western-blot鉴定gBa多克隆抗体血清结果如图8所示，其中，M：PageRulerPrestainedProtein Ladder；1:gBa；2:阴性对照。
重组鸡痘病毒rFPV282E4-gB的鉴定
(1)PCR鉴定结果
以纯化的rFPV282E4-gB感染CEF，亲本毒株wt-FPV282E4作为对照。出现典型蚀斑后，弃去上清液，收获病变细胞，按常规方法提取病毒基因组 DNA，PCR鉴定gB基因。结果可见rFPV282E4-gB的目的基因已成功插入鸡痘病毒中，rFPV282E4-gB的PCR鉴定结果如图9所示，其中，M：DL2000 Marker；1：p12Ls-gB；2：rFPV282E4-gB；3：wt-FPV282E4。
(2)间接免疫荧光鉴定结果
用0.1MOI的rFPV282E4-gB感染CEF，设亲本毒株wt-FPV282E4作阴性对照。出现典型蚀斑后，弃去上清液，PBS洗涤3次，然后加入冷甲醇(-20℃预冷)，4℃作用10min；PBS洗涤3次；加入1:200稀释的上述制备好的鼠抗gBa多克隆抗体，37℃水浴锅孵育1.5h；以含0.05％吐温-80的PBS(简称PBST)洗涤3次，每次5min，再加入1:500稀释的羊抗鼠IgG-FITC荧光二抗，37℃水浴锅孵育1h；用PBST洗涤3次，每次5min，拍干后放置在荧光显微镜下观察结果。结果可见rFPV282E4-gB有明显的荧光反应，gB 基因在鸡痘病毒中成功表达，间接免疫荧光鉴定rFPV282E4-gB中gB的表达结果如图10，其中，A:rFPV282E4-gB；B:wt-FPV282E4。
(3)Western-blot试验结果
用0.1MOI的rFPV282E4-gB感染生长于25cm2细胞瓶单层致密的CEF，设wt-FPV282E4作对照，待细胞完全病变后收样，与SDS上样缓冲液混合煮沸10min制样，使用上述制备的gBa多抗血清作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，进行Western-blot。结果可见rFPV282E4-gB有明显的反应条带，大小约为110kDa和75kDa，gB基因在鸡痘病毒中成功表达且表达量可观，如图11，图11为Western-blot鉴定rFPV282E4-gB中gB的表达，其中， M：PageRulerPrestainedProtein Ladder；1：rFPV282E4-gB。
实施例2
重组鸡痘病毒rFPV282E4-gB的免疫效力
将28日龄SPF鸡随机分组，每组10只，按105PFU/只的剂量分别免疫 rFPV282E4-gB、鸡痘亲本株wt-FPV282E4，同时设商品化ILTV重组鸡痘病毒基因工程疫苗对照组，剂量为105PFU/只；PBS对照组，剂量为0.2mL/只。免疫后21d，用105EID50/只的ILTV野毒株Gallidherpesvirus 1strain I19进行喉头攻毒，观察各疫苗鸡的发病和死亡情况，并采集喉拭子测定排毒情况。
(1)攻毒后的临床评分、发病率、死亡率
根据观察攻毒后每组鸡的临床症状，进行临床评分，评分标准：正常＝ 0分，轻度＝1分，重度＝2分，死亡＝3分；临床发病判定标准：(1)呼吸时发出湿性啰音、呼吸困难、甩头和喘气；(2)打喷嚏、鼻中流出分泌物； (3)结膜炎、鼻炎或眶下窦肿胀。出现以上症状之一即判为发病。计算临床指数(总得分/总鸡数)、发病率(发病鸡数/总鸡数)、死亡率(死亡鸡数/ 总鸡数)。按上述标准，计算攻毒后各组的临床指数(总得分/总鸡数)、发病率(发病鸡数/总鸡数)和死亡率(死亡鸡数/总鸡数)。
结果显示，wt-FPV282E4和PBS组攻毒后，发病率为100％，临床指数都大于2.4，死亡率大于60％，大部分鸡都表现为急性发病，有严重的呼吸困难、结膜炎和咳血等症状，剖检观察病死鸡，其喉头气管黏膜严重充血、肿胀及高度潮红，剖检病死鸡，可见其喉头黏膜严重出血红肿，气管内有大量的血样栓塞；rFPV282E4-gB组的发病率在30％以下，临床症状表现温和，临床指数仅为0.3，无急性病例和死亡发生；而对照组商品化重组鸡痘基因工程疫苗的鸡发病率在40％，临床指数为0.6，大部分鸡表现温和型症状，有 1只鸡发生急性死亡，不同疫苗组在ILTV攻毒后的临床指数、发病率和死亡率具体见表3。
表3不同疫苗组在ILTV攻毒后的临床指数、发病率和死亡率
(2)rFPV282E4-gB的免疫保护率
计算各疫苗的免疫保护率，疫苗保护指数(Protection Index,PI)的计算公式为：PI＝(攻毒对照组的死亡数-免疫对照组的死亡数)/攻毒对照组的死亡数×100。
结果显示，rFPV282E4-gB组无急性病例和死亡发生，保护指数均为100。商品化rFPV疫苗组1只鸡死亡，保护指数为83.3。相比商品化rFPV疫苗组，rFPV282E4-gB的免疫效力更高，能提供很强的保护力来抵御ILTV野毒株的攻击，是理想的ILTV疫苗候选株，SPF鸡免疫后攻毒保护效力测定具体见表4。
表4 SPF鸡免疫后攻毒保护效力测定
(3)排毒检测
攻毒后第3d、5d和7d采集喉头棉拭子放入1mL四抗PBS中保存，冻融3次，离心取上清，绒毛尿囊膜接种10日龄非免疫鸡胚，每份样品接种2个鸡胚，0.2mL/胚。37℃培养120h后，观察鸡胚CAM上是否出现痘斑、水肿及胚体发育迟缓等病理现象，判断是否为ILTV分离阳性，测定排毒情况。
结果表明，攻毒后第3d时，所有组均无鸡只死亡，wt-FPV282E4和PBS 组的排毒率均为100％，rFPV282E4-gB组的排毒率为70％，对照组商品化rFPV 疫苗组的排毒率为90％；第5d时，rFPV282E4-gB组无鸡只死亡，商品化rFPV 疫苗组、wt-FPV282E4和PBS组均有鸡发生死亡，且所有组别的排毒率均为 100％。所以，rFPV282E4-gB与商品化rFPV疫苗组相比，在第3d时，排毒数量少，且鸡仅表现很轻微的临床症状，是理想的ILTV疫苗候选株。感染ILTV 的鸡胚和健康对照结果如图12，免疫组用攻毒后的排毒情况如表5。
表5免疫组用攻毒后的排毒情况
注：病毒分离率＝喉头病毒分离为阳性的鸡只数/试验鸡总数。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种表达传染性喉气管炎病毒gB基因、其重组鸡痘病毒及构建方法和应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2622
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctagct tgaaaatgct gatctgcgtg tgcgtggcaa tcctgatccc atctacccta 60
tctcaagatt cacacggaat tgctggaata atagaccctc atgatacagc cagcatggat 120
gttggaaaaa tctctttctc cgaagccatt gggtcggggg caccgaaaga accccagatt 180
agaaacagaa tttttgcgtg ctcatctcca actggcgcca gtgttgcgag gcttgcccag 240
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ttcaagcaaa acattgcccc gtacgtcttt aatgtgactc tatactataa acatataacc 360
acagttacta cgtgggcatt attctcaaga ccccaaataa caaatgagta cgtgaccagg 420
gttccaatag actatcatga aattgtcagg attgatcgat cgggagaatg ctcatccaaa 480
gcaacgtatc ataaaaattt catgtttttt gaagcttacg acaatgatga agcagaaaaa 540
aaattgcccc tggttccatc actgttaaga tcaactgtct ccaaggcgtt tcatacaact 600
aactttacta agcgacatca aaccctggga taccgaacgt ctacatcggt cgactgtgtt 660
gtggaatatc tacaggctag atctgtatac ccgtatgatt actttggaat ggcgacaggt 720
gatacagtag aaatttctcc tttctatacc aaaaacacga ccggaccaag gcgtcacagt 780
gtctacagag actatagatt tctcgaaatc gcaaattatc aagtcaggga tttggaaacc 840
ggacaaataa gaccccctaa aaaaagaaac tttctaacag atgaacaatt cactataggc 900
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acgttctcgt ccggaaaaca accttttaac atcagcaggc ttcatttggc tgaatgcgtt 1080
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gatactggga ctttaaacta tgatgatgtg gtcagatatc aaaatattta taacaaaagg 2040
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ctcgaatacc cttcgtgggc agaagaaagc gaagacgaat aa 2622
<210> 2
<211> 2622
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<211> 32
<212> DNA
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<400> 3
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<210> 4
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<212> DNA
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<400> 6
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<400> 7
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<400> 9
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tactgtaatc tccttcatcg ccatagtcta tcggattcaa gagtacgggt atatcaaaca 2100
tagaataaaa tagttctata catcatgtta atttagatat ttcttctgga cacgatatct 2160
atcctactaa gtatgtatgg tatttattta tcaattaatc tgcgtatgta gtaactacta 2220
cagaagcttt tttttttttt ttttggcata taaatagctt tttttttttt ttttttggca 2280
tataaatagc ttagatctaa aaaattgaaa aactattcta atttattgca ggatctaaaa 2340
aattgaaaaa ctattctaat ttattgcagg atcctaggct agcctcgaga attcacgcgt 2400
ggtacctcta gagtcgaccc gggggatctg ctagaactag tggatcgatc cagacatgat 2460
aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat 2520
ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt 2580
tccgagtttg tcagaaagca gaccaaacag cggttggaat aatagcgaga acagagaaat 2640
agcggcaaaa ataatacccg tatcactttt gctgatatgg ttgatgtcat gtagccaaat 2700
cgggaaaaac gggaagtagg ctcccatgat aaaaaagtaa aagaaaaaga ataaaccgaa 2760
catccaaaag tttgtgtttt ttaaatagta cataatggat ttccttacgc gaaatacggg 2820
cagacatggc ctgcccggtt attattattt ttgacaccag accaactggt aatggtagcg 2880
accggcgctc agctggaatt ccgccgatac tgacgggctc caggagtcgt cgccaccaat 2940
ccccatatgg aaaccgtcga tattcagcca tgtgccttct tccgcgtgca gcagatggcg 3000
atggctggtt tccatcagtt gctgttgact gtagcggctg atgttgaact ggaagtcgcc 3060
gcgccactgg tgtgggccat aattcaattc gcgcgtcccg cagcgcagac cgttttcgct 3120
cgggaagacg tacggggtat acatgtctga caatggcaga tcccagcggt caaaacaggc 3180
ggcagtaagg cggtcgggat agttttcttg cggccctaat ccgagccagt ttacccgctc 3240
tgctacctgc gccagctggc agttcaggcc aatccgcgcc ggatgcggtg tatcgctcgc 3300
cacttcaaca tcaacggtaa tcgccatttg accactacca tcaatccggt aggttttccg 3360
gctgataaat aaggttttcc cctgatgctg ccacgcgtga gcggtcgtaa tcagcaccgc 3420
atcagcaagt gtatctgccg tgcactgcaa caacgctgct tcggcctggt aatggcccgc 3480
cgccttccag cgttcgaccc aggcgttagg gtcaatgcgg gtcgcttcac ttacgccaat 3540
gtcgttatcc agcggtgcac gggtgaactg atcgcgcagc ggcgtcagca gttgtttttt 3600
atcgccaatc cacatctgtg aaagaaagcc tgactggcgg ttaaattgcc aacgcttatt 3660
acccagctcg atgcaaaaat ccatttcgct ggtggtcaga tgcgggatgg cgtgggacgc 3720
ggcggggagc gtcacactga ggttttccgc cagacgccac tgctgccagg cgctgatgtg 3780
cccggcttct gaccatgcgg tcgcgttcgg ttgcactacg cgtactgtga gccagagttg 3840
cccggcgctc tccggctgcg gtagttcagg cagttcaatc aactgtttac cttgtggagc 3900
gacatccaga ggcacttcac cgcttgccag cggcttacca tccagcgcca ccatccagtg 3960
caggagctcg ttatcgctat gacggaacag gtattcgctg gtcacttcga tggtttgccc 4020
ggataaacgg aactggaaaa actgctgctg gtgttttgct tccgtcagcg ctggatgcgg 4080
cgtgcggtcg gcaaagacca gaccgttcat acagaactgg cgatcgttcg gcgtatcgcc 4140
aaaatcaccg ccgtaagccg accacgggtt gccgttttca tcatatttaa tcagcgactg 4200
atccacccag tcccagacga agccgccctg taaacgggga tactgacgaa acgcctgcca 4260
gtatttagcg aaaccgccaa gactgttacc catcgcgtgg gcgtattcgc aaaggatcag 4320
cgggcgcgtc tctccaggta gcgaaagcca ttttttgatg gaccatttcg gcacagccgg 4380
gaagggctgg tcttcatcca cgcgcgcgta catcgggcaa ataatatcgg tggccgtggt 4440
gtcggctccg ccgccttcat actgcaccgg gcgggaagga tcgacagatt tgatccagcg 4500
atacagcgcg tcgtgattag cgccgtggcc tgattcattc cccagcgacc agatgatcac 4560
actcgggtga ttacgatcgc gctgcaccat tcgcgttacg cgttcgctca tcgccggtag 4620
ccagcgcgga tcatcggtca gacgattcat tggcaccatg ccgtgggttt caatattggc 4680
ttcatccacc acatacaggc cgtagcggtc gcacagcgtg taccacagcg gatggttcgg 4740
ataatgcgaa cagcgcacgg cgttaaagtt gttctgcttc atcagcagga tatcctgcac 4800
catcgtctgc tcatccatga cctgaccatg cagaggatga tgctcgtgac ggttaacgcc 4860
tcgaatcagc aacggcttgc cgttcagcag cagcagacca ttttcaatcc gcacctcgcg 4920
gaaaccgaca tcgcaggctt ctgcttcaat cagcgtgccg tcggcggtgt gcagttcaac 4980
caccgcacga tagagattcg ggatttcggc gctccacagt ttcgggtttt cgacgttcag 5040
acgtagtgtg acgcgatcgg cataaccacc acgctcatcg ataatttcac cgccgaaagg 5100
cgcggtgccg ctggcgacct gcgtttcacc ctgccataaa gaaactgtta cccgtaggta 5160
gtcacgcaac tcgccgcaca tctgaacttc agcctccagt acagcgcggc tgaaatcatc 5220
attaaagcga gtggcaacat ggaaatcgct gatttgtgta gtcggtttat gcagcaacga 5280
gacgtcacgg aaaatgccgc tcatccgcca catatcctga tcttccagat aactgccgtc 5340
actccagcgc agcaccatca ccgcgaggcg gttttctccg gcgcgtaaaa atgcgctcag 5400
gtcaaattca gacggcaaac gactgtcctg gccgtaaccg acccagcgcc cgttgcacca 5460
cagatgaaac gccgagttaa cgccatcaaa aataattcgc gtctggcctt cctgtagcca 5520
gctttcatca acattaaatg tgagcgagta acaacccgtc ggattctccg tgggaacaaa 5580
cggcggattg accgtaatgg gataggtcac gttggtgtag atgggcgcat cgtaaccgtg 5640
catctgccag tttgagggga cgacgacagt atcggcctca ggaagatcgc actccagcca 5700
gctttccggc accgcttctg gtgccggaaa ccaggcaaag cgccattcgc cattcaggct 5760
gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 5820
agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 5880
ttgtaaaacg acgggatcga tctcgccata cagcgcgttg aaacgctggg caatatcgcg 5940
gctcagttcg aggtgctgtt tctggtcttc acccaccggt accagaccgc cacggcttac 6000
ggcaataatg cctttccatt gttcagaagg catcagtcgg cttgcgagtt tacgtgcatg 6060
gatctgcaac atgtcccagg tgacgatgta tttttcgctc atgtgaagtg tcccagcctg 6120
tttatctacg gcttaaaaag tgttcgaggg gaaaataggt tgcgcgagat tatagagatc 6180
ccaagctaat tcatttatag catagaaaaa aacaaaatga aattctacta tatttttaca 6240
tacatatatt ctaaatatga aagtggtgat tgtgactagc gtagcatcgc ttctagcgtt 6300
tctaagatca tcatgtccta caattttatt tctttgacgt cgtgtttata tcattttctg 6360
ttttgggata ataattttct ctaatataaa attatatatt aattcttttt ctatattgaa 6420
gtgatttaat taaagaaaat atgtaatctt tatctaatta ggtttttcct tatctaataa 6480
tagaactgta tacctggtga tcttcctact tgatttacgt gacctaatat aattatttag 6540
atatttacct gtttttcgca taaatataat tcctaaaaat attattatta agatattaat 6600
atctattatc catgataata tatagagaaa cattatatta atcgccaatc gaatatgaat 6660
aacatacata gtaataataa agatagcagt taatggcaaa ctaatattat tcatgataac 6720
tgctataaaa gaagataata tagcaagata tattgaagtg tctatcatat cttattttat 6780
ggataaacct ttaacggcaa cttctaagtt acttattttt tggtttatta aactattggt 6840
tttttcgtac ttttcttcca atttttttgt atttttcttt aattttaata tctcattatc 6900
atgaatgtcg tatagtattt tacttatacc ctcagagaag aagccgcttc gtatctgatc 6960
ttcattatca gaaccttttt taagcctcgt gcaataggag ttagaaagat aggagttaag 7020
tatcttggaa aaattaagtg caatactagg aaaaacccaa cagataatat gaggcacgag 7080
atcgatatgc acatatgttc ctacaagttc gtatttatag gcactatttg atgctaatcc 7140
gatttctaaa acggctttat tatagatacc gtttttatag ttcaatgttt ttatgagttt 7200
tttagatgac tctagtctac accactgcct aaagttctta tttccaagat cacatatttt 7260
agtagcattt atatatccgt tgtattttaa catgattact tctatgttcg catagttgat 7320
aaagcaaaag ttctcatcta tatgtttaac ggtgttaggt acaaactcca tattgtaata 7380
ctttcattca gaatagtatt gtttttacat tttttattat aaggaaaaaa ctggtttatt 7440
cattttcttt taaccatgca tacacaattt acaggaactg atacatgttt agtcattaca 7500
gcattatttt caccaagata cattattttt ttaatttctg tgaccgtaga acagtaagat 7560
tcccatcttg actcatcaat gcccttacaa ggagatgtag aattagggaa tcccatgcag 7620
ctaatcattt gaatgtattg tgtgtatcca tctcctttct cagaatatct gcccaaaaat 7680
tctattttac tgacaccagt tccattaaca gggcttactt ctctaatatc tacccatgta 7740
gttactaatt cacaagcggg ttcgtataaa taaacagtag tattatcatt actagatgtc 7800
tgggtatcgt ataatacagc tgcatgatag tactgaaaac atgttagtaa cacaagtata 7860
tgtgtaacgt acataataga aaaaagtata atttatgcct tatttttaca ttatagttaa 7920
aaccataaaa ctatcttaat tacaaataaa atactatgta gttccattat ttttgatcgc 7980
attaaatgaa aggaactatt atattgtttg gtaaaccaaa ttgcccgtta tgtaaatttt 8040
caaacgaaat actttcgaat aaaaagatag ctagtaaata tgaaatcgtt agaataaata 8100
tagctacatt cttcgataaa tcaaaggtcg tagaaatact cggtatggat aagtcttacg 8160
gagctccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattgcg cgcttggcgt aatcatggtc 8220
atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 8280
aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 8340
gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 8400
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 8460
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 8520
acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 8580
aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 8640
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 8700
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 8760
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 8820
acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 8880
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 8940
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 9000
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 9060
gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 9120
ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 9180
gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 9240
cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 9300
cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 9360
gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 9420
tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 9480
gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 9540
agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 9600
tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 9660
agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 9720
gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 9780
catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 9840
ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 9900
atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 9960
tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 10020
cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 10080
cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 10140
atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 10200
aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 10260
ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 10320
aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccac 10367
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gggaattcca tgaaattgtc aggat 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctcgagtgtt gcagaactgt gggta 25

Claims (7)

1.一种传染性喉气管炎病毒gB基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.表达权利要求1所述传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒。
3.权利要求2所述重组鸡痘病毒的构建方法，包括以下步骤：
1)将权利要求1所述传染性喉气管炎病毒gB基因构建到鸡痘病毒转移载体p12LS上，得到p12LS-gB；
2)得到p12LS-gB后，以鸡痘病毒282E4株为亲本毒株，共转染，得到表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒rFPV282E4-gB。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)所述共转染包括脂质体共转染法。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)所述共转染的对象包括无特定病原体的鸡胚成纤维细胞。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)所述共转染后，还包括蓝白斑筛选、纯化。
7.权利要求1所述基因、权利要求2所述重组鸡痘病毒或权利要求3～6任一项所述构建方法得到的重组鸡痘病毒作为传染性喉气管炎疫苗的应用。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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