CN101180406A - Pcv2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了回收2型猪圆环病毒开放阅读框2表达的蛋白质的改进方法。该方法通常包括以下步骤：将含有开放阅读框2编码序列的重组病毒转染到培养基中生长的细胞中，使该病毒表达开放阅读框2，回收上清液中表达的蛋白质。应该在感染细胞约5天后开始回收，以表达足量的重组蛋白表达并从细胞分泌到生长培养基中。这种方法避免了分离和回收细胞内重组蛋白所需的昂贵和耗时的提取步骤。

Description

PCV2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法
相关申请
本申请要求2004年12月30日提交的临时申请序列号60/640,510的优先权和2005年1月13日提交的申请序列号11/034,737的优先权，将其内容纳入本文作参考。
序列表
本申请含有纸件形式和计算机可读形式的序列表，将其内容纳入本文作参考。
发明背景
发明领域
本发明一方面涉及回收2型猪圆环病毒(PCV2)的开放阅读框2(ORF2)表达的蛋白质。更具体说，所述蛋白是转染病毒表达的含有2型猪圆环病毒开放阅读框2的重组编码序列的重组蛋白。更具体说，使该转染病毒感染培养生长的细胞，并从上清液中、而非细胞内回收开放阅读框2表达的蛋白质。更具体说，该方法包括以下步骤：扩增2型猪圆环病毒开放阅读框2基因，将此扩增部分克隆入第一种载体，从此第一种载体上切下开放阅读框2部分并将其克隆入转运载体，将该转运载体与病毒载体共同转染入培养生长的细胞中，使该病毒载体感染细胞，表达开放阅读框2，回收上清液中表达的开放阅读框2编码的重组蛋白。
另一方面，本发明涉及有效诱导对PCV2的免疫应答的免疫原性组合物和制备这些免疫原性组合物的方法。更具体说，本发明涉及有效保护接受该组合物的动物和减轻PCV2感染相关临床症状严重程度的免疫应答的免疫组合物。更具体说，本发明涉及对PCV2感染产生有效保护力的基于蛋白质的免疫组合物。更具体说，本发明涉及包含PCV2的ORF2的免疫组合物，其中给予PCV2-ORF2会产生抵抗PCV2感染的保护力。最具体说，本发明涉及能在接受该免疫组合物的猪中有效产生免疫力的免疫组合物，该组合物包含PCV2的ORF2表达的蛋白质。
现有技术的描述
2型猪圆环病毒(PCV2)是一种小的(直径17-22nm)二十面体无包膜DNA病毒，它含有单链环状基因组。PCV2与1型猪圆环病毒(PCV1)的序列相同性约为80％。然而，与通常无毒性的PCV1相反，感染PCV2的猪显示出一种常见综合征，称为断奶后多系统消瘦性综合征(PMWS)。PMWS的临床特征为消瘦、皮肤苍白、不健康、呼吸窘迫、腹泻、黄疸(icterus和jaundice)。在一些患病猪中，可出现所有症状的组合，而另一些猪仅有这些症状中的一种或两种。尸检过程中，许多组织和器官也出现了微观和宏观病损，淋巴器官是最常见的病损部位。观察到PCV2核酸或抗原含量与微观淋巴病损严重性之间强烈相关。感染PCV2的猪的死亡率可达到80％。除了PMWS以外，PCV2与几种其它感染相关，包括伪狂犬病、猪生殖和呼吸道综合征(PRRS)、Glasser病、链球菌性脑膜炎、沙门菌病、断奶后大肠杆菌病、饮食性肝机能障碍和化脓性支气管肺炎。
PCV2的开放阅读框2(ORF2)蛋白在SDS-PAGE凝胶上跑电泳时分子量约为30kDa，过去曾将该蛋白用作PCV2疫苗的抗原性组分。获得用于这种疫苗的ORF2的一般方法通常由以下步骤组成：扩增编码ORF2的PCV2 DNA，用ORF2 DNA转染病毒载体，用含有ORF2 DNA的病毒载体感染细胞，使该病毒在细胞中表达ORF2蛋白，裂解细胞提取细胞中的ORF2蛋白。在病毒载体感染细胞后，这些方法通常需要约4天。然而，这些方法的缺点是，提取步骤昂贵且耗时。此外，从细胞回收的ORF2的量不很高；因此，需要用大量病毒载体感染大量细胞，才能获得疫苗所需足量的重组表达蛋白质等。
PCV2免疫的现有方法包括基于DNA的疫苗，如美国专利6,703,023所述。然而，这种疫苗不能有效产生抵抗PCV2感染和与其相关临床症状的保护性免疫力。
因此，本领域需要一种获得ORF2蛋白的方法，该方法不需要从感染细胞内提取ORF2蛋白。还需要获得足够量的有效制备疫苗组合物的重组ORF2蛋白的方法。还需要不用现有ORF2蛋白提取方法所需的复杂的劳动密集型方法获得ORF2蛋白的方法。最后，关于组合物，本领域需要能产生抵抗PCV2感染的保护性免疫力并降低其严重性或防止其相关临床症状的免疫原性组合物。
发明概述
本发明克服了现有技术的固有问题，提供了优于现有技术水平的显著进步。具体说，本发明一方面提供了产生和/或回收重组PCV2 ORF2蛋白的改进方法，即i)用含有PCV2 ORF2 DNA编码序列的重组病毒载体感染培养的易感细胞，在细胞0中由所述重组病毒载体表达ORF2蛋白，和ii)随后回收上清液中的ORF2。出人意料地发现，如果感染和随后培育感染细胞而不用原先从细胞内提取PCV2 ORF2的经典PCV 2 ORF2回收过程，将会有大量ORF2释放入上清液中。而且，令人惊讶地发现，PCV ORF2蛋白能强烈抵抗原先在生产细胞以外的降解。这两个发现使得能够从用含有PCV2 ORF2 DNA和表达PCV2 ORF2蛋白的重组病毒载体感染的细胞培养物上清液中大量回收PCV2 ORF2蛋白。大量产生PCV2 ORF2蛋白指高于约20μg/mL上清，优选高于约25μg/mL，更优选高于约30μg/mL，更优选高于约40μg/mL，更优选高于约50μg/mL，更优选高于约60μg/mL，更优选高于约80μg/mL，更优选高于约100μg/mL，更优选高于约150μg/mL，最优选高于约190μg/mL。也可通过(例如)实施例1-3所述方法实现这些表达率。
优选所述细胞培养物中的细胞计数约为0.3-2.0×106个细胞/mL，更优选约为0.35-1.9×106个细胞/mL，更优选约为0.4-1.8×106个细胞/mL，更优选约为0.45-1.7×106个细胞/mL，最优选约为0.5-1.5×106个细胞/mL。可由本领域技术人员确定优选细胞。优选细胞是易被含有PCV2 ORF2 DNA和表达PCV2 ORF2蛋白的合适重组病毒载体感染的细胞。细胞优选为昆虫细胞，更优选包括以商标Sf+昆虫细胞出售的昆虫细胞(Protein Sciences Corporation，Meriden，CT)。
本领域技术人员也可确定合适的生长培养基，优选的生长培养基是无血清昆虫细胞培养基，如Excell 420(JRH Biosciences，Inc.，Lenexa，KS)等。优选的病毒载体包括杆状病毒，如BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)，具体说，如果生产细胞是昆虫细胞。虽然优选杆状病毒表达系统，但是本领域技术人员应理解，其它表达系统也可用于本发明目的，即须使PCV2 ORF2表达到细胞培养物上清液中。其它表达系统可能需要采用信号序列，以使ORF2表达到培养基中。令人惊讶地发现，当用杆状病毒表达系统产生ORF2时，不需要任何信号序列或进一步修饰ORF2即能表达到培养基中。故认为，此种蛋白可独立地形成病毒样颗粒(Journal of General Virology，第81卷，第2281-2287页(2000)和分泌入培养物上清液中。用含有PCV2 ORF2 DNA序列的重组病毒载体感染易感细胞时，感染复数(MOI)优选约为0.03-1.5，更优选约为0.05-1.3，更优选约为0.09-1.1，最优选约为0.1-1.0。上述MOI优选指1mL细胞培养液。本文所述方法优选包括感染0.35-1.9×106个细胞/mL，更优选约0.4-1.8×106个细胞/mL，更优选约0.45-1.7×106个细胞/mL，最优选约0.5-1.5×106个细胞/mL，含有PCV2 ORF2 DNA和表达PCV2 ORF蛋白的重组病毒载体的MOI(感染复数)约为0.03-1.5，更优选约为0.05-1.3，更优选约为0.09-1.1，最优选约为0.1-1.0。
然后，培养感染细胞长达10天，优选约2-10天，更优选约4-9天，最优选约5-8天。优选的培养条件包括：温度约22-32℃，更优选约24-30℃，更优选约25-29℃，更优选约26-28℃，最优选约27℃。优选观察接种后Sf+细胞受到杆状病毒诱导的特征性变化。这种观察可包括在感染后期间监测细胞密度的变化趋势和活力降低。发现在感染3-5天后观察到病毒效价达到峰值，第5-8天和/或当细胞活力降低到10％以下时获得细胞向上清液中释放ORF2达到峰值。
因此，本发明一方面提供了产生和/或回收重组PCV2 ORF2蛋白(优选以上述含量)的改进方法，即i)用重组病毒载体以上述MOI感染培养的大量易感细胞(见上)，ii)由所述重组病毒载体表达PCV2 ORF2蛋白，和iii)然后在感染后5-8天和/或细胞活力降低到10％以下时收获细胞上清液中的PCV2 ORF2。所述重组病毒载体优选为含有PCV2 ORF2 DNA编码序列的重组杆状病毒，所述细胞优选Sf+细胞。此外，优选在感染后期间定时监测培养细胞有无宏观和微观污染证据或非典型细胞形态改变。应弃去显示污染的任何培养物。优选细胞将表达的ORF2重组蛋白分泌入维持细胞活力的周围生长培养基中。然后，从细胞周围的上清液中而非细胞本身回收ORF2。
回收过程优选开始于分离步骤，即分离细胞碎片与培养基中表达的ORF2。优选的分离步骤包括过滤、以约20,000×g的转速离心、连续流离心、用离子交换或凝胶过滤进行色谱分离和常规的免疫亲和法。本领域技术人员已知这些方法，例如(Harris和Angel(编)，《蛋白质纯化方法-实践方法》(Protein purification methods-a practicalapproach)，IRL press Oxford 1995)。最优选的分离方法包括以高达约20,000×g的转速离心和过滤。优选的过滤方法包括死封端微量过滤和切向流(或交叉流)过滤，包括中空纤维过滤和死封端微量过滤。在这些方法中，优选死封端微量过滤。死封端微量过滤的孔径优选约为0.30-1.35μm，更优选约为0.35-1.25μm，更优选约为0.40-1.10μm，最优选约为0.45-1.0μm。认为常规滤膜可用于本发明目的，优选聚醚砜膜。此过滤步骤去除了任何低分子量的核酸物质。
因此，本发明另一方面提供了产生和/或回收重组PCV2 ORF2蛋白(优选以上述含量)的改进方法，即i)用重组病毒载体以上述MOI感染培养的大量易感细胞(见上)，ii)使所述重组病毒载体表达PCV ORF2蛋白，iii)回收感染后5-8天和/或细胞活力降低到10％以下时收获的细胞上清液中的PCV2 ORF2，和iv)通过分离步骤分离细胞碎片与表达的PCV2 ORF2。所述重组病毒载体优选含有ORF2 DNA编码序列的杆状病毒，所述细胞优选Sf+细胞。优选的分离步骤如上所述。最优选是用孔径约0.30-1.35μm，更优选约0.35-1.25μm，更优选约0.40-1.10μm，最优选约0.45-1.0μm的膜进行的死封端微量过滤。
为了回收用于免疫原性或免疫组合物如疫苗的PCV2 ORF2，优选包括灭活步骤，以灭活病毒载体。“免疫原性或免疫组合物”指包含至少一种抗原的组合物，所述抗原能在宿主中引发针对感兴趣的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，″免疫应答″包括但不限于以下一种或多种作用：产生或激活抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或yd T细胞，其特异性针对感兴趣组合物或疫苗中包含的抗原。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫应答，而提高对新发感染的抵抗力和/或降低疾病的临床严重程度。可通过感染宿主通常所显示症状的减轻或缺失、恢复时间较短和/或感染宿主中病毒效价降低来表明这种保护作用。因此，本发明也涉及产生和/或回收重组PCV2 ORF2蛋白(优选以上述含量)的方法，即i)用重组病毒载体以上述MOI感染培养的大量易感细胞(见上)，ii)由所述重组病毒载体表达PCV ORF2蛋白，iii)回收感染后5-8天和/或细胞活力降低到10％以下时收获的细胞上清液中的PCV2 ORF2，iv)通过分离步骤分离细胞碎片与表达的PCV2 ORF2，和v)灭活所述重组病毒载体。
优选地，恰好在过滤步骤之前或之后完成此灭活，过滤步骤后是优选的灭活时机。任何常规灭活方法均可用于本发明目的。因此，可通过化学和/或物理处理进行灭活。在优选方式中，测定收获液体的体积，加热使温度提高到约32-42℃，更优选约34-40℃，最优选约35-39℃。优选的灭活方法包括加入环化的双氮丙啶(BEI)，浓度优选约为1-20mM，优选约为2-10mM，更优选约为2-8mM，更优选约为3-7mM，最优选约为5mM。例如，此灭活包括将优选约0.4M的氢溴酸2-溴乙胺溶液(它在0.3N NaOH中环化成0.2M双氮丙啶(BEI))加入该液体中，得到终浓度约为5mM的BEI。优选地，随后连续搅拌该液体72-96小时，可将灭活的收获液体冻存于-40℃或更低，或者保存在约1-7℃。灭活完成后，优选加入1.0M硫代硫酸钠溶液，以中和任何残留的BEI。优选加入与灭活前所加入的BEI等价含量的硫代硫酸钠。例如，在加入的BEI终浓度为5mM的情况下，加入1.0M硫代硫酸钠溶液使其最终最低浓度为5mM，以中和任何残留的BEI。
因此，本发明另一方面涉及产生重组PCV2 ORF2蛋白(优选以上述含量)的方法，即i)用重组病毒载体以上述MOI感染培养的大量易感细胞(见上)，ii)由所述重组病毒载体表达PCV ORF2蛋白，iii)回收感染后5-8天和/或细胞活力降低到10％以下时收获的细胞上清液中的PCV2 ORF2，iv)通过分离步骤分离细胞碎片与表达的PCV2ORF2，和v)灭活所述重组病毒载体。所述重组病毒载体优选为含有ORF2 DNA编码序列的杆状病毒，所述细胞优选为Sf+细胞。优选的分离步骤如上所述，最优选是过滤步骤。优选的灭活步骤如上所述。优选在约35-39℃和2-8mM BEI存在下，更优选在约5mM BEI存在下进行灭活。令人惊讶地发现，较高浓度的BEI会对PCV2ORF2蛋白产生负面影响。
本发明另一方面，上述方法在步骤v)之后还包括中和步骤。此步骤vi)包括加入等价含量的能中和溶液中灭活剂的物质。如果灭活剂是BEI，优选加入等价含量硫代硫酸钠。因此，根据另一方面，步骤vi)包括灭活剂是BEI时，加入终浓度约为1-20mM，优选约为2-10mM，更优选约为2-8mM，更优选约为3-7mM，最优选约为5mM的硫代硫酸钠溶液。
在用于免疫原性组合物如疫苗的优选形式，尤其是重组PCV2 ORF2蛋白形式中，通过在固定的依赖杆状病毒的易感性Sf+细胞中传代监测各批次收获的ORF2的灭活情况。在此测试的优选形式中，用1.0mL灭活的PCV2液接种150cm2合适的单层培养细胞，维持25-29℃14天，至少两代。在该维持末期，检测该单层细胞所受到的PCV2 ORF2杆状病毒细胞病变作用(CPE)。优选地，也采用阳性病毒对照。这种对照包括用未灭活的参比PCV2 ORF2杆状病毒接种一瓶Sf+培养细胞和保持未接种的一瓶Sf+细胞。培育和传代后，BEI处理的病毒液中不存在病毒感染细胞表明灭活测试令人满意。接种参比病毒的对照细胞应显示PCV2 ORF2杆状病毒的典型CPE，未接种的培养瓶应不显示有任何PCV2 ORF2杆状病毒CPE的迹象。或者，在维持培养末期，可收集上清样品接种到加有Sf+细胞的Sf+96孔板上，然后25-29℃维持培育5-6天。然后固定该平板，用偶联FITC的抗PCV2 ORF2抗体染色。用IFA显微镜检测BEI处理的病毒液若没有CPE和ORF2表达表明灭活测试令人满意。接种参比病毒的对照细胞应显示出CPE和IFA活性，未接种的培养瓶应不显示有任何PCV2 ORF2杆状病毒CPE的迹象，并且没有IFA活性。
因此，本发明另一方面涉及一种测定重组病毒载体灭活效果的灭活测试，所述灭活测试包括以下步骤：i)使至少一部分含有该重组病毒载体的培养液接触优选的上述灭活剂，ii)加入中和剂以中和优选的上述灭活剂，和iii)用上述试验检测残留的感染力。
灭活后，可以多种方式测定样品中重组PCV2 ORF2蛋白的相对含量。优选的定量方法包括SDS-PAGE密度测定法、ELISA和使已知量的疫苗与临床效果(血清学等)关联起来的动物疫苗接种研究。当SDS-PAGE用于定量时，在凝胶上电泳含有未知量重组PCV2 ORF2蛋白的样品以及含有不同已知量重组PCV2 ORF2蛋白的样品。然后，可根据已知样品产生标准曲线，可通过与此标准曲线作比较确定未知样品中重组PCV2 ORF2的含量。因为ELISA通常被认为是抗原定量的工业标准，所以优选用ELISA进行定量。
因此，按照另一方面，本发明也涉及用于定量重组PCV2 ORF2蛋白的ELISA。本文提供的优选ELISA法开始时通常从用包被缓冲液以1∶6000或合适的工作稀释度稀释捕获抗体。优选的捕获抗体是纯化的猪抗-PCV2 Pab蛋白G，优选的包被缓冲液是0.05M碳酸盐缓冲液，该缓冲液可将2.93g NaHCO3(Sigma目录号S-6014，或等效物)和1.59g NaCO3(Sigma目录号S-6139，或等效物)混合来制备。将该混合物与蒸馏水或等效物混合，制备pH 9.6±0.1的一升溶液。下一步，用包被缓冲液以1∶6000或任何其它合适的工作稀释度稀释捕获抗体。例如，对于四块平板，一块需要42mL包被缓冲液和7μL捕获抗体。采用反向吸移法，将100μL稀释的捕获抗体加入所有孔中。为了获得均匀包被，应温和拍打各平板的侧面。然后用平板密封条密封该平板，然后叠加平板并用空96孔板加盖。将平板在35-39℃培育过夜(14-24小时)。然后用ultra wash plus微量滴定板洗涤器以洗涤缓冲液洗涤各平板3次，设定为250μL/洗涤、洗涤3次、无浸泡时间。最后一次洗涤后，在纸巾上拍打平板。用反向吸移技术再次将250μL封闭溶液加入所有孔中。应密封测试平板，35-37℃培育约1小时(±5分钟)。优选此步骤后不叠加平板。在封闭步骤期间，应拿出所有测试样品室温解冻。下一步，应准备四个独立的稀释平板，将200μL稀释剂溶液加入除A和H行1-3列以外的所有剩余孔中。下一步，应如下标记六个试管：低效价、中效价、高效价、灭活/过滤(1∶240)、灭活/过滤(1∶480)和内标。在标示的试管中，合适地稀释以下测试样品。应在临用前涡旋振荡解冻的测试样品。在四块平板中，制作以下稀释液：A)不预先稀释的低效价液：3.0mL低效价；B)1∶30稀释的阴性对照(Sf+细胞)：3.77mL稀释剂+130μL阴性对照；C)1∶30稀释的中效价液(8μg/mL)：3.77mL稀释剂+130μL中效价；D)1∶90稀释的高效价液(16μg/mL)：2.967mL稀释剂+33μL高效价；E)1∶240稀释的灭活/过滤液：2.39mL稀释剂+10μL灭活/过滤样品；F)1∶480稀释的灭活/过滤液：1.0mL稀释剂+1.0mL上述E的完整/过滤(1∶240)制备样品；G)1∶30稀释的内标：3.77mL稀释剂+130μL内标。下一步，在1-4号板的稀释平板中将300μL制备样品加入相应的空孔中。然后，将多通道移液器设定为100μL，通过上下吹打至少5次混合A行的内容物，然后用反向吸移技术将100μL转移到B行。应该更换尖头，重复此相同步骤至G行。现在用ultra wash plus微量滴定板洗涤器(设定为250μL/洗涤、洗涤3次、无浸泡时间)以洗涤缓冲液洗涤测试平板3次后，即可将这些稀释平板中的样品转移到测试平板中。最后一次洗涤后，在纸巾上拍打平板。下一步，用简单的转移步骤将稀释平板的内容物转移到测试平板中。更具体说，从H行开始，用反向吸移技术将100μL/孔从稀释平板转移到测试平板的相应孔中。每次转移后，应更换移液器尖头。从G行开始，用反向吸移技术将稀释平板中的100μL/孔转移到测试平板的相应孔中。同组的移液器尖头可用于其余转移。为了保证转移均一的溶液，应上下吹打该溶液至少3次再转移。下一步，密封测试平板并在37℃±2.0℃培育1.0小时±5分钟。也优选不叠加平板。然后用ultrawash plus微量滴定板洗涤器(设定为250μL/洗涤、洗涤3次、无浸泡时间)以洗涤缓冲液洗涤平板3次。最后一次洗涤后，在纸巾上拍打平板。用反向吸移技术将1∶300稀释或合适的工作稀释度稀释的100μL检测抗体加入测试平板的所有孔中。例如，对于四块平板，需要42mL稀释剂溶液和140μL捕获抗体。然后密封测试平板，并在37℃±2.0℃培育1.0小时±5分钟。再用ultrawash plus微量滴定板洗涤器(设定为250μL/洗涤、洗涤3次、无浸泡时间)以洗涤缓冲液洗涤平板3次。最后一次洗涤后，在纸巾上拍打平板。下一步，通过将1％正常兔血清加入稀释剂中制备偶联稀释剂。例如，对于四块平板，将420μL正常兔血清加入42mL稀释剂中。用新鲜制备的偶联抗体稀释溶液在测试平板的所有孔中将偶联抗体稀释至1∶10,000或者其它合适的工作稀释度。用反向吸移技术，将100μL这种稀释的偶联抗体加入所有孔中。然后密封测试平板，37℃±2.0℃培育45±5分钟。优选不叠加平板。用ultra wash plus微量滴定板洗涤器(设定为250μL/洗涤、洗涤3次、无浸泡时间)以洗涤缓冲液洗涤平板3次。最后一次洗涤后，在纸巾上拍打平板。下一步，临用前混合等体积的TMB过氧化物酶底物(试剂A)与过氧化物酶溶液B(试剂B)。混合量取决于平板数量，但每一平板需要10mL+2mL。因此，4块平板需要21mL试剂A+21mL试剂B。用反向吸移技术将100μL底物加入测试平板的所有孔中。然后室温培育该平板15分钟±15秒。用反向吸移技术将100μL1N HCl溶液加入所有孔中终止反应。然后打开ELISA平板阅读器，以常规方式进行诊断和测试。
本发明另一方面涉及构建含有PCV2 ORF2 DNA的重组病毒载体和用其感染易感细胞大量表达PCV2 ORF2蛋白的方法。令人惊讶地发现，本文提供的重组病毒载体在感染易感细胞后可表达大量上述PCV2 ORF2。因此，本发明也涉及产生和/或回收PCV2 ORF2蛋白的改进方法，所述方法优选包括以下步骤：构建含有PCV2 ORF2DNA的重组病毒载体和表达PCV2 ORF2蛋白。所述病毒载体优选重组杆状病毒。本文所述构建含有PCV2 ORF2 DNA的重组病毒载体和表达PCV2 ORF2蛋白的详细方法如下：在优选形式中，用其中克隆有ORF2基因的转运载体转染病毒载体，产生用于感染细胞的含有PCV2 ORF2 DNA的重组病毒载体和表达PCV2 ORF2蛋白。优选地，仅将转运载体中含有的ORF2 DNA部分转染到病毒载体中。术语“转染入病毒载体”指(用作)将异源DNA“引入”或“克隆”入病毒载体，如杆状病毒载体的同义词。所述病毒载体优选(但不必是)杆状病毒。
因此，按照本发明另一方面，通过含有异源PCV2 ORF2 DNA的转运载体和病毒载体(优选杆状病毒，更优选线性化的复制缺陷型杆状病毒(如Baculo Gold DNA))之间重组而产生所述重组病毒载体。“转运载体”指一种DNA分子，其包含至少一个复制起点、异源基因(在本文中是PCV2 ORF2)和允许将所述异源基因克隆入病毒载体的DNA序列。允许将所述异源基因克隆入病毒载体的DNA序列优选侧接于该异源基因。更优选的是，这些侧接序列至少与该病毒载体序列部分同源。这种序列同源性可允许病毒载体和转运载体的分子之间发生重组，而产生含有该异源基因的重组病毒载体。一种优选的转运载体是pVL 1392载体(BD Biosciences Pharmingen)，设计用于与BaculoGold DNA共同转染入优选的Sf+细胞系中。所述转运载体优选包含PCV2 ORF2 DNA。共同转染的构建物的长度约为10,387个碱基对。
在更优选的形式中，本发明方法将从分离PCV2 ORF2 DNA开始。通常，该DNA可来自已知或未知菌株，因为ORF2 DNA似乎在不同分离物中高度保守，序列相同性至少约为95％。本领域已知可表达到上清中的任何PCV2 ORF2基因可用于本发明目的。优选用PCR法扩增PCV ORF2 DNA，更优选与引入的5′侧接Kozak共有序列(CCGCCAUG)(SEQ ID NO 1)和/或3′侧接EcoR1位点(GAATTC)(SEQ ID NO 2)同时扩增。引入5′Kozak共有序列优选去除了PCV2 ORF2中的天然产生的起始密码子AUG。优选将3′EcoR1位点引入PCV2 ORF2终止密码子下游。更优选地，将其引入聚A转录终止序列下游，聚A转录终止序列本身位于PCV2 ORF2终止密码子下游。已发现，采用Kozak共有序列，具体是上述序列，能提高随后PCV2 ORF2的蛋白表达水平。将含有这些额外序列的扩增的PCV2 ORF2 DNA克隆入载体中。用于此初步克隆步骤的优选载体是pGEM-T-Easy载体(Promega，威斯康星州麦迪逊)。优选在NotI限制性位点处从载体上切下含有一些pGEM载体序列(SEQ ID NO：7)的PCV2ORF2 DNA。然后将得到的DNA克隆入转运载体。
因此，本发明一个方面提供了构建含有PCV2 ORF2 DNA的重组病毒载体的方法。此方法包括以下步骤：i)将重组PCV2 ORF2克隆入转运载体；和ii)将含有重组PCV2 ORF2的转运载体部分转染到病毒载体中，产生重组病毒载体。优选地，该转运载体是如上所述的载体，或通过上述方法构建，或如图1所示。因此，按照另一方面，用于构建本文所述重组病毒载体的转运载体含有SEQ ID NO：7序列。
另一方面，此方法在步骤i)之前还包括以下步骤：体外扩增PCV2 ORF2 DNA，其中如上所述修饰PCV2 ORF2 DNA的侧接序列。扩增PCV2 ORF2 DNA和修饰侧接序列、将扩增的PCV2 ORF2 DNA体外克隆入转运载体的体外方法和合适转运载体如上所述，如图1所示，或为本领域技术人员所知。因此，另一方面，本发明涉及构建含有PCV2 ORF2 DNA的重组病毒载体和表达PCV2 ORF2蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：i)体外扩增PCV2 ORF2 DNA，其中包括修饰所述PCV2 ORF2DNA的侧接序列，ii)将扩增PCV2 ORF2 DNA克隆入转运载体中；和iii)将转运载体中含有的重组PCV2 ORF2 DNA部分转染入病毒载体中，产生重组病毒载体。优选如上所述进行PCV2 ORF2 DNA侧接序列的修饰，例如引入5’Kozak序列和/或EcoR1位点，优选如上所述。
另一方面，本发明提供产生和/或回收PCV2开放阅读框2表达的重组蛋白的方法。该方法通常包括以下步骤：i)将重组PCV2 ORF2克隆入转运载体中；ii)将转运载体中含有重组PCV2 ORF2的部分转染到病毒中；iii)用转染病毒感染培养的细胞；iv)使转染病毒由PCV2 ORF2表达重组蛋白；v)分离上清液与细胞；和vi)从上清液中回收表达的PCV2 ORF2蛋白。
上面描述了如何将重组PCV2 ORF2 DNA克隆入转运载体的方法。该转运载体优选含有序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7。然而，该转运载体可含有任何未修饰或修饰的PCV2 ORF2 DNA，只要转染到重组病毒载体中的该PCV2 ORF2 DNA能在培养细胞中表达。所述重组病毒载体优选包含序列SEQ IDNO：8。而且，上面详细描述了如何用确定量的含有PCV2 ORF2 DNA的重组杆状病毒感染细胞，优选如何感染昆虫细胞和表达PCV2 ORF2蛋白的方法。而且，上面也详细描述了分离上清液与细胞的步骤以及回收表达的PCV2 ORF2蛋白的步骤。本文所述的这些特定加工步骤都是上述产生和/或回收PCV2开放阅读框2表达重组蛋白方法的一部分。所述细胞优选Sf+细胞。更优选地，细胞培养物的细胞数约为0.3-2.0×106个细胞/mL，更优选约为0.35-1.9×106个细胞/mL，更优选约为0.4-1.8×106个细胞/mL，更优选约为0.45-1.7×106个细胞/mL，最优选约为0.5-1.5×106个细胞/mL。优选用含有PCV2 ORF2 DNA的重组病毒载体感染易感细胞，感染复数(MOI)优选约为0.03-1.5，更优选约为0.05-1.3，更优选约为0.09-1.1，更优选约为0.1-1.0，最优选约为0.5。优选回收感染后5-8天和/或细胞活力降低到10％以下时收获的细胞上清液中的PCV2 ORF2蛋白。优选地，产生PCV2 ORF2蛋白时，在25-29℃培养细胞。分离步骤优选为离心或过滤步骤。
任选地，此方法可包括以下步骤：扩增PCV2菌株的PCV2 ORF2 DNA，然后将该PCV2 ORF2 DNA克隆入转运载体。在优选形式中，也可在扩增之前或期间，优选将5′Kozak序列、3′EcoR1位点和其组合加入扩增序列中。优选的5′Kozak序列包含SEQ ID NO：1。优选的3′EcoR1位点包含SEQ ID NO：2。优选的PCV2 ORF2DNA包含核苷酸序列Genbank登录号AF086834(SEQ ID NO：3)和SEQ ID NO：4。优选的重组PCV2 ORF2蛋白包含SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列，SEQ ID NO：5是SEQ ID NO：3(Genbank登录号AF086834)编码的蛋白质，SEQ IDNO：6是SEQ ID NO：4编码的蛋白质。优选培养基包括无血清昆虫细胞培养基，更优选Excell 420培养基。当进行任选的扩增步骤时，优选先将扩增的开放阅读框2克隆入第一载体中，从第一载体上切下开放阅读框2，将切下的开放阅读框克隆入转运载体中。用于共同转染的优选细胞系是SF+细胞系。用于共同转染的优选病毒是杆状病毒。在此方法的优选形式中，转运载体的转染部分包含SEQ ID NO：8。最后，在此方法中，优选在用该病毒感染细胞至少5天后回收细胞培养上清液中的PCV2开放阅读框2(ORF2)编码的蛋白。
因此，本发明另一方面涉及产生和/或回收PCV2开放阅读框2的方法，所述方法包括以下步骤：i)体外扩增PCV2 ORF2 DNA，优选加入5’Kozak序列和/或加入3’EcoR1限制性位点，ii)将扩增的PCV2 ORF2克隆入转运载体中；iii)将转运载体中含有的重组PCV2 ORF2部分转染入病毒中；iv)用转染病毒感染培养的细胞；v)使转染病毒由PCV2 ORF2表达重组蛋白；vi)分离上清液与细胞；和vii)从上清液中回收表达的PCV2 ORF2蛋白。
本发明另一方面涉及制备含有PCV2 ORF2蛋白和灭活病毒载体的组合物的方法。该方法包括以下步骤：i)将扩增的PCV2 ORF2克隆入转运载体中；ii)将转运载体中含有的重组PCV2 ORF2部分转染入病毒中；iii)用转染病毒载体感染培养的细胞；iv)使转染病毒载体由PCV2 ORF2表达重组蛋白；v)分离上清液与细胞；vi)从上清液中回收表达的PCV2 ORF2蛋白；和vii)灭活该重组病毒载体。所述重组病毒载体优选含有ORF2 DNA编码序列的杆状病毒，所述细胞优选Sf+细胞。优选的分离步骤如上所述，最优选过滤步骤。优选的灭活步骤如上所述。优选在约35-39℃和2-8mM BEI存在下，更优选在约5mM BEI存在下进行灭活。令人惊讶地发现，较高浓度的BEI会对PCV2 ORF2蛋白产生负面影响，而较低浓度在24-72小时灭活期间不能有效灭活病毒载体。灭活优选进行至少24小时，更优选进行24-72小时。
另一方面，是上述制备含有PCV2 ORF2蛋白的组合物和灭活病毒载体的方法在步骤vii)之后还包括中和步骤。此步骤viii)包括加入等价含量的能中和溶液中灭活剂的物质。优选地，如果灭活剂是BEI，优选加入等价含量硫代硫酸钠。因此，另一方面，步骤viii)包括灭活剂是BEI时加入硫代硫酸钠溶液，使其终浓度约为1-20mM，优选约为2-10mM，更优选约为2-8mM，更优选约为3-7mM，最优选约为5mM。
另一方面，是上述制备含有PCV2 ORF2蛋白的组合物和灭活病毒载体的方法在步骤i)之前包括以下步骤：体外扩增PCV2 ORF2 DNA，其中如上所述修饰PCV2ORF2 DNA的侧接序列。体外扩增PCV2 ORF2 DNA和修饰侧接序列，将体外扩增的PCV2 ORF2 DNA克隆入转运载体的方法和合适的转运载体如上所述，如图1所示，或为本领域技术人员所知。因此，另一方面，此方法包括以下步骤：i)体外扩增PCV2 ORF2 DNA，其中包括修饰所述PCV2 ORF2 DNA的侧接序列，ii)将扩增的PCV2 ORF2 DNA克隆入转运载体中；和iii)将含有重组PCV2 ORF2 DNA的转运载体或其一部分转染入病毒载体中，产生重组病毒载体，iv)用转染病毒感染培养的细胞；v)使转染病毒由PCV2 ORF2表达重组蛋白；vi)分离上清液与细胞；vii)从上清液中回收表达的PCV2 ORF2蛋白；viii)优选在约1-20mM BEI的存在下，最优选在约5mM BEI的存在下，灭活所述重组病毒载体；和ix)加入等价含量的能中和溶液中灭活剂的物质，灭活剂是BEI时优选加入硫代硫酸钠溶液，使其终浓度约为1-20mM，优选约为5mM。
在本发明另一方面，提供了制备一种用于引发抗PCV2免疫应答的组合物、优选抗原性组合物如疫苗的方法。通常，此方法包括将构建物转染入病毒中的步骤，其中所述构建物包含i)PCV2的ORF2的重组DNA，ii)用转染病毒感染培养生长的细胞，iii)使该病毒由PCV2 ORF2表达重组蛋白，iv)从上清液中回收表达的ORF2蛋白，和v)通过混合回收的蛋白质与合适的佐剂和/或其它药学上可接受的运载体制备该组合物。
本文所用“佐剂”可包括氢氧化铝和磷酸铝，皂苷如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Inc.，Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)，油包水乳液，水包油乳液，水包油包水乳液。具体说，乳液可基于轻质(light liquid)石蜡油(欧洲药典类型)；类异戊二烯油如角鲨烷或角鲨烯；链烯，具体是异丁烯或癸烯硫代寡聚化(theoligomerization)产生的油；含有直链烷基的酸或醇的酯，更具体是植物油、油酸乙酯、二(辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯或二油酸丙二醇酯；支链脂肪酸或醇的酯，具体是异硬脂酸酯。将油与乳化剂联用以形成乳液。乳化剂优选非离子性表面活性剂，具体是山梨聚糖、二缩甘露醇(如油酸脱水甘露醇酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯(任选乙氧基化)，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，具体是普朗尼克产品，尤其是L121。参见Hunter等，《佐剂的理论和实际应用》(The Theory and Practical Application of adjuvants)(Stewart-Tull，D.E.S.编)，John Wiley & Sons，NY，第51-94页(1995)和Todd等，Vaccine15：564-570(1997)。
例如，可采用M.Powell和M.Newman，Plenum Press，1995所编的《疫苗设计，亚基和佐剂方法》(Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach)的第147页所述SPT乳液和该书第183页所述的MF59乳液。
佐剂的另一个例子是选自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物的或者顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物的化合物。佐剂化合物宜为交联的、尤其是与糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。这些化合物称为卡波姆(carbomer)(Phameuropa第8卷，第2期，1996年6月)。本领域技术人员也可参见美国专利2,909,462描述的与含有至少3个羟基，优选不多于8个羟基的多羟基化合物交联的这种丙烯酸聚合物，其至少三个羟基的氢原子被含有至少2个碳原子的不饱和脂族基团取代。优选基团是含有2-4个碳原子的基团，如乙烯基、烯丙基和其它烯键式不饱和基团。不饱和基团本身可含有其它取代基，如甲基。以名称卡巴浦尔(carbopol)出售的产品(BF Goodrich，Ohio，USA)尤其合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基戊赤藓醇交联。其中，可提及的有卡巴浦尔974P、934P和971P。最优选采用卡巴浦尔971P。在马来酸酐和烯基衍生物的共聚物中，共聚物EMA(Monsanto)是马来酸酐和乙烯的共聚物。这些聚合物在水中的溶解产生的酸溶液应予中和，优选中和至生理pH，以产生其中可掺入免疫原性、免疫或疫苗组合物本身的佐剂溶液。
其它合适佐剂包括但不限于：RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、单磷酰基脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、大肠杆菌(E.coli)的热不稳定性肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS1314或胞壁酰二肽等等。
优选每剂量加入约100μg-10mg量的佐剂。更优选每剂量加入约100μg-10mg量的佐剂。更优选每剂量加入约500μg-5mg量的佐剂。更优选每剂量加入约750μg-2.5mg量的佐剂。最优选每剂量加入约1mg量的佐剂。
因此，另一方面，制备用于引发抗PCV2免疫应答的抗原性组合物如疫苗的方法包括：i)制备和回收PCV2 ORF2蛋白，和ii)将其与合适佐剂混合。优选地，该佐剂为卡巴浦尔971P。更优选每剂量加入约500μg-5mg量的卡巴浦尔971P，更优选每剂量加入约750μg-2.5mg量的卡巴浦尔971P，最优选每剂量加入约1mg量的卡巴浦尔971P。优选地，该方法的步骤i)包括制备和回收PCV2 ORF2所述的加工步骤。例如，在此方法的优选形式中，获得转运载体中包含PCV2 ORF2 DNA的构建物。合适的转运载体和制备它们的方法如上所述。任选地，该方法可包括以下步骤：通过PCR扩增PCV2毒株的ORF2，然后将ORF2克隆入转运载体中。优选的开放阅读框序列、Kozak序列、3′EcoR1位点序列、重组蛋白序列、转染的构建序列、培养基、细胞和病毒参见前述方法。用于此方法的另一任选步骤包括将扩增的PCV2 ORF2DNA克隆入第一载体中，从此第一载体上切下ORF2 DNA，将此切下的PCV2 ORF2DNA克隆入转运载体中。如同其它方法那样，优选在用转染的杆状病毒感染细胞后等待至少5天，再从上清液中回收重组ORF2蛋白。优选地，此方法的回收步骤也包括分离培养基与细胞和细胞碎片的步骤。可通过各种容易和方便的方法完成此步骤，优选通过孔径范围约为0.45μM-1.0μM的滤器过滤细胞、细胞碎片和生长培养基。最后，此方法优选在将回收的重组PCV2 ORF2蛋白混合到组合物中之前包括一病毒灭活步骤。可通过各种方法完成此步骤，但优选采用BEI实施本发明。
因此，另一方面，此方法包括以下步骤：i)体外扩增PCV2 ORF2 DNA，其中包括修饰所述PCV2 ORF2 DNA的侧接序列，ii)将扩增的PCV2 ORF2 DNA克隆入转运载体中；和iii)将含有重组PCV2 ORF2 DNA的转运载体或其一部分转染入病毒载体中，产生重组病毒载体，iv)用转染病毒感染培养的细胞；v)使转染病毒由PCV2ORF2表达重组蛋白；vi)分离上清液与细胞；vii)从上清液中回收表达的PCV2 ORF2蛋白；viii)优选在约1-20mM BEI的存在下，最优选在约5mM BEI的存在下，灭活所述重组病毒载体；ix)加入等价含量的能中和溶液中灭活剂的物质，灭活剂是BEI时优选加入硫代硫酸钠溶液，使其终浓度约为1-20mM，优选约为5mM，和x)加入适当量的佐剂，优选加入卡巴浦尔，更优选卡巴浦尔971P，更优选加入上述量(如每剂量约500μg-5mg，更优选每剂量约750μg-2.5mg，最优选每剂量约1mg)的佐剂。
此外，该组合物可包含一种或多种药学上可接受的载体。本文所用术语″药学上可接受的载体″包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。最优选地，本文所述组合物含有从体外培养细胞上清液中回收的PCV2 ORF2蛋白，其中所述细胞已用含有PCV2 ORF2DNA的重组病毒载体感染并表达PCV2 ORF2蛋白，并用约2-8mM BEI，优选约5mM BEI处理所述细胞培养物，以灭活该病毒载体，还加入相同浓度的中和剂、卡巴浦尔和生理盐水；所述中和剂优选硫代硫酸钠溶液，终浓度约为2-8mM，优选约5mM，卡巴浦尔更优选卡巴浦尔971P，其优选用量为每剂量约500μg-5mg，更优选每剂量约750μg-2.5mg，最优选每剂量约1mg；所述生理盐水用量优选约50-90％(v/v)，更优选约60-80％(v/v)，更优选约70％(v/v)。
因此，另一方面涉及制备引发抗PCV2免疫应答的抗原性组合物如疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：i)体外扩增PCV2 ORF2 DNA，其中包括修饰所述PCV2ORF2 DNA的侧接序列，ii)将扩增的PCV2 ORF2 DNA克隆入转运载体中；和iii)将含有重组PCV2 ORF2 DNA的转运载体或其一部分转染入病毒载体中，产生重组病毒载体，iv)用转染病毒感染培养的细胞；v)使转染病毒由PCV2 ORF2表达重组蛋白；vi)分离上清液与细胞；vii)从上清液中回收表达的PCV2 ORF2蛋白；viii)优选在约1-20mM BEI的存在下，最优选在约5mM BEI的存在下，灭活所述重组病毒载体；ix)加入等价含量的能中和溶液中灭活剂的物质，灭活剂是BEI时优选加入硫代硫酸钠溶液，使其终浓度约为0.5-20mM，优选约为5mM，x)加入适当量的佐剂，优选加入卡巴浦尔，更优选卡巴浦尔971P，更优选加入上述量(如每剂量约500μg-5mg，更优选每剂量约750μg-2.5mg，最优选每剂量约1mg)的卡巴浦尔971P；和xi)加入生理盐水，优选以约50-90％(v/v)，更优选约60-80％(v/v)，更优选约70％(v/v)的量加入。任选地，此方法也可包括加入保护剂。本文所用保护剂指抗微生物活性剂，如庆大霉素、硫柳汞等。具体说，在制备多剂量组合物中最优选加入保护剂。加入抗微生物活性剂的浓度应有效防止感兴趣组合物中产生任何微生物污染或抑制感兴趣组合物中的任何微生物生长。
而且，此方法也可包括加入任何稳定剂，如糖、海藻糖、甘露醇、蔗糖等，以增加和/或维持产品的保存期。然而，令人惊讶地发现，产生的制剂在不添加任何其它稳定剂的情况下至少在24个月中免疫有效。
本发明另一方面涉及用上述方法产生的产品。具体说，本发明涉及含有重组表达的PCV2 ORF2蛋白的组合物。而且，本发明也涉及含有从昆虫细胞培养物上清液中回收的重组表达PCV2 ORF2蛋白的组合物。而且，本发明也涉及含有从昆虫细胞培养物上清液中回收的重组表达PCV2 ORF2蛋白的组合物。这种组合物也优选含有适合灭活该病毒载体的物质。所述灭活剂优选BEI。而且，本发明也涉及含有从昆虫细胞培养物上清液中回收的重组表达PCV2 ORF2蛋白、适合灭活该病毒载体的物质(优选BEI)，以及用于中和灭活剂的中和剂的组合物。当BEI用作灭活剂时，所述中和剂优选硫代硫酸钠。
在本发明的另一方面，提供了诱导免疫应答，更优选产生抵抗PCV2感染临床症状的保护性免疫力的免疫原性组合物。该组合物通常包含PCV2的开放阅读框2(ORF2)表达的多肽或其片段，作为该组合物的抗原性组分。
本文中用于制备所述组合物、也可用于本文所述方法的PCV2 ORF2 DNA和蛋白质是PCV2分离物内的高度保守结构域，因此，任何PCV2 ORF2与本文所用的PCVORF2 DNA和/或多肽的来源同样有效。优选的PCV2 ORF2蛋白是SEQ ID NO：11的蛋白。本文提供的优选PCV ORF2多肽是SEQ ID NO：5，但本领域技术人员知道，此序列的序列同源性可改变多至6-10％而仍能保留使其可用于免疫原性组合物的抗原性特征。免疫组合物的这种抗原性特征可以通过(例如)实施例4提供的攻击实验来估计。而且，与多核苷酸序列SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4编码的PCV2 ORF2蛋白相比，当某修饰的抗原产生至少70％，优选80％，更优选90％保护性免疫力时，即仍然保留了该修饰抗原的抗原性特征。本文所用“免疫原性组合物”指在宿主中引发对PCV2 ORF2蛋白的细胞和/或抗体-介导的免疫应答的PCV2 ORF2蛋白。优选此免疫原性组合物能够产生抵抗PCV2感染和与其相关的临床症状的保护性免疫力。在一些形式中，PCV2 ORF2蛋白的免疫原性部分可用作该组合物的抗原性组分。本文所用术语“免疫原性部分”分别指PCV2 ORF2蛋白和/或多核苷酸的截短和/或取代形式，或其片段。优选地，这种截短和/或取代形式或片段将包含全长ORF2多肽的至少6个连续氨基酸。更优选地，截短和/或取代形式，或片段将含有全长ORF2多肽的至少10个，优选至少15个，更优选至少19个连续氨基酸。在这方面，本文提供了两种优选序列，即SEQ ID NO：9和10。还应理解，这些序列可以是较大片段或截短形式的一部分。本文提供的另一优选PCV2 ORF2多肽由核苷酸序列SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4编码。但本领域技术人员应理解，此序列的序列同源性可改变多至6-20％而仍能保留使其可用于免疫原性组合物的抗原性特征。在一些形式中，ORF2的截短或取代形式或其片段用作该组合物中的抗原性组分。这种截短或取代形式或其片段优选包含全长ORF2核苷酸序列，如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的至少18个连续核苷酸。更优选地，该截短或取代形式或其片段将含有全长ORF2核苷酸序列，如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的至少30个，更优选至少45个，更优选至少57个连续核苷酸。
本领域所称“序列相同性”指两条或多条多肽序列或两条或多条多核苷酸序列，即参比序列与给定序列之间与参比序列相比的关系。序列经优化比对产生最高程度的序列相似性后，通过比较给定序列与参比序列之间的匹配程度来确定序列相同性。比对后，根据位置-位置来确定序列相同性，例如，如果在某具体位置上核苷酸或氨基酸残基相同，则称此序列在此具体位置上“相同”。然后，将这种相同位置的数目除以参比序列中的核苷酸或残基总数，得到序列相同性％。不难用已知方法计算序列相同性，所述方法包括但不限于以下文献所述方法：《计算分子生物学》(ComputationalMolecular Biology)，Lesk，A.N.编，Oxford University Press，纽约(1988)，《生物计算：信息学和基因组计划》(Biocomputing：Informatics and Genome Projects)，Smith，D.W.编，Academic Press，纽约(1993)；《序列数据的计算机分析》(Computer Analysis ofSequence data)，第I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana Press，新泽西(1994)；《分子生物学中的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology)，vonHeinge，G.，Academic Press(1987)；《序列分析引物》(Sequence Analysis Primer)，Gribskov，M.和Devereux，J.编，M.Stockton Press，纽约(1991)；Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)，将其内容纳入本文作参考。设计的用于测定序列相同性的优选方法是给出测试序列之间的最大匹配。公众可得的测定给定序列之间序列相同性的计算机程序中编纂了用于测定序列相同性的方法。这些程序的例子包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，Nucleic Acids Research，12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990)。公众可从NCBI和其它来源获得BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCVI NLM NIH Bethesda，MD 20894，Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990)，将其内容纳入本文作参考)。这些程序采用默认的缺口权重最优地比对序列，以产生给定序列与参比序列之间的最高水平序列相同性。例如，当某多核苷酸的核苷酸序列与参比核苷酸序列之间的“序列相同性”至少为(例如)85％、优选90％、更优选95％时，称给定多核苷酸的核苷酸序列与参比序列相同，除了每100个核苷酸中，与参比核苷酸序列相比给定多核苷酸序列可包含多达15个、优选多达10个、更优选多达5个点突变。换言之，多核苷酸的核苷酸序列相对于参比核苷酸序列的相同性至少为85％、优选90％、更优选95％时，参比序列中多达15％、优选10％、更优选5％的核苷酸可缺失或用另一核苷酸取代，或者可将占参比序列核苷酸总数量的15％、优选10％、更优选5％的核苷酸插入该参比序列中。参比序列的这些突变可发生在参比核苷酸序列的5′或3′末端位置，或者这些末端位置之间的任何位置，或单个散布于参比序列的核苷酸中或散布于参比序列的一个或多个毗连基团中。类似地，当某多肽的给定氨基酸序列与参比氨基酸序列的序列相同性至少为(例如)85％、优选90％、更优选95％时，称该多肽的给定氨基酸序列与参比序列相同，除了每100个氨基酸中，与参比氨基酸序列相比给定多肽序列可包含多达15个、优选多达10个、更优选多达5个氨基酸改变。换言之，为了获得与参比氨基酸序列的序列相同性至少为85％、优选90％、更优选95％的给定多肽序列，参比序列中多达15％、优选多达10％、更优选多达5％的氨基酸残基可缺失或用另一核苷酸取代，或者可将占参比序列氨基酸残基总数的15％、优选10％、更优选5％的氨基酸插入参比序列中。参比序列的这些改变可发生在参比氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或者这些末端位置之间的任何位置，或单个散布于参比序列的残基中或散布于参比序列的一个或多个毗连基团中。优选地，不相同的残基位置的区别在于保守性氨基酸取代。然而，测定序列相同性时匹配不包括保守性取代。
本文所用“序列同源性”指测定两条序列相关性的方法。为了测定序列同源性，应最优比对两条或多条序列，如果需要可引入缺口。然而，与“序列相同性”相反，测定序列同源性时将保守性氨基酸取代计为匹配。换言之，为了获得与参比序列的序列同源性为95％的多肽或多核苷酸，参比序列中85％、优选90％、更优选95％的氨基酸残基或核苷酸必须匹配或包含另一种氨基酸或核苷酸的保守性取代，或者可将占参比序列总氨基酸残基或核苷酸(不包括保守性取代)总数的15％、优选10％、更优选5％的氨基酸或核苷酸插入参比序列中。同源序列优选包含至少一段50个、更优选100个、更优选250个、更优选500个核苷酸。
“保守性取代”指用具有相似特征或特性，包括大小、疏水性等的另一氨基酸残基或核苷酸取代某氨基酸残基或核苷酸，以使其整体功能不显著改变。
本文所用术语“分离”指“人工”改变其天然状态，即，如果其天然存在，从其原始环境改变或取得，或二者。例如，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽不是“分离”的，但使其与天然状态共存物质分离得到的同一多核苷酸或多肽则是“分离”的。
因此，本发明另一方面涉及有效减轻PCV2感染相关临床症状严重性的包含PCV2 ORF2蛋白的免疫原性组合物。优选地，该PCV2 ORF2蛋白是上述任何一种蛋白。所述PCV2 ORF2蛋白优选为：
i)包含序列SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的多肽；
ii) 与i)所述多肽至少80％同源的任何多肽；
iii) i)和/或ii)所述多肽的任何免疫原性部分；
iv)  iii)所述的免疫原性部分，包含序列SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中的至少10个毗连氨基酸；
v)    包含序列SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的DNA编码的多肽；
vi)   与v)所述多核苷酸至少80％同源的多核苷酸编码的任何多肽；
vii)  v)和/或vi)所述多核苷酸编码的多肽的任何免疫原性部分；
viii) vii)所述的免疫原性部分，其中编码所述免疫原性部分的多核苷酸包含序列SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中的至少30个毗连核苷酸。
优选具有序列SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4编码的PCV2 ORF2蛋白免疫原性特征的任何免疫原性部分。
另一方面，该免疫组合物提供了有效诱导所需免疫应答，即降低PCV2感染所致临床症状的发生率或减轻其严重性的PCV2 ORF2蛋白抗原水平。优选地，包含的PCV2 ORF2蛋白水平至少为0.2μg抗原/ml最终免疫原性组合物(μg/ml)，更优选约0.2-400μg/ml，更优选约0.3-200μg/ml，更优选约0.35-100μg/ml，更优选约0.4-50μg/ml，更优选约0.45-30μg/ml，更优选约0.6-15μg/ml，更优选约0.75-8μg/ml，更优选约1.0-6μg/ml，更优选约1.3-3.0μg/ml，更优选约1.4-2.5μg/ml，更优选约1.5-2.0μg/ml，最优选约1.6μg/ml。
另一方面，包含的ORF2抗原水平至少为每剂量最终抗原性组合物含0.2μg上述PCV2 ORF2蛋白(μg/剂量)，更优选约0.2-400μg/剂量，更优选约0.3-200μg/剂量，更优选约0.35-100μg/剂量，更优选约0.4-50μg/剂量，更优选约0.45-30μg/剂量，更优选约0.6-15μg/剂量，更优选约0.75-8μg/剂量，更优选约1.0-6μg/剂量，更优选约1.3-3.0μg/剂量，更优选约1.4-2.5μg/剂量，更优选约1.5-2.0μg/剂量，最优选约1.6μg/剂量。
可通过任何方式产生本发明免疫原性组合物中所用的PCV2 ORF2多肽，包括分离和纯化PCV2 ORF2、标准的蛋白质合成方法和重组方法。获得PCV2 ORF2多肽的优选方法如上所述，也可参见美国专利申请序列号11/034,797，将其内容纳入本文作参考。简言之，用含有PCV2 ORF2 DNA编码序列的重组病毒载体感染易感细胞，由重组病毒表达PCV2 ORF2多肽，通过过滤从上清液中回收表达的PCV2 ORF2多肽，用任何常规方法、优选用双氮丙啶灭活，然后中和该物质以终止灭活过程。
因此，另一方面，所述免疫原性组合物含有i)任何上述PCV2 ORF2蛋白，浓度优选上述浓度，和ii)至少一部分表达所述PCV2 ORF2蛋白的病毒载体、优选重组杆状病毒。而且，另一方面，所述免疫原性组合物含有i)任何上述PCV2 ORF2蛋白，浓度优选上述浓度，ii)至少一部分表达所述PCV2 ORF2蛋白的病毒载体、优选重组杆状病毒，和iii)一部分细胞培养上清液。
根据PCV2 ORF2蛋白产生和回收方法的一个具体实施方式，通过孔径优选约为0.45-1μm的膜过滤细胞培养上清液。因此，另一方面涉及包含以下组分的免疫原性组合物：i)任何上述PCV2 ORF2蛋白，浓度优选上述浓度，ii)至少一部分表达所述PCV2 ORF2蛋白的病毒载体、优选重组杆状病毒，和iii)一部分细胞培养上清液；其中约90％的组分大小小于1μm。
另一方面，本发明涉及包含以下组分的免疫原性组合物：i)任何上述PCV2 ORF2蛋白，浓度优选上述浓度，ii)至少一部分表达所述PCV2 ORF2蛋白的病毒载体，iii)一部分细胞培养物，和iv)灭活该重组病毒载体的灭活剂，优选BEI，其中i)-iii)所述组分中约90％的大小小于1μm。优选地，BEI存在的浓度能有效灭活杆状病毒。有效浓度如上所述。
另一方面，本发明涉及包含以下组分的免疫原性组合物：i)任何上述PCV2 ORF2蛋白，浓度优选上述浓度，ii)至少一部分表达所述PCV2 ORF2蛋白的病毒载体，iii)一部分细胞培养物，iv)灭活该重组病毒载体的灭活剂，优选BEI，和v)终止灭活剂介导灭活的中和剂，其中i)-iii)所述组分中约90％的大小小于1μm。优选地，如果灭活剂是BEI，所述组合物包含与BEI等价含量的硫代硫酸钠。
将多肽掺入可给予易受PCV2感染的动物的组合物中。在优选形式中，该组合物也可包含本领域技术人员已知的其它组分(也参见《雷明顿药物科学》(Remington′sPharmaceutical Sciences)(1990)，第18版，Mack Publ.，Easton)。此外，该组合物可包含一种或多种兽医可接受的载体。本文所用″兽医可接受的载体″包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。
在一优选实施方式中，该免疫原性组合物包含本文提供的PCV2 ORF2蛋白作为抗原性组分，其浓度优选为上述浓度，将所述组合物与佐剂，优选卡巴浦尔和生理盐水混合。
本领域技术人员应理解，本文所述组合物可制成已知的可注射、生理可接受的无菌溶液。对于制备用于胃肠道外注射或输注的即用型溶液而言，易于获得等渗水溶液，如盐水或相应的血浆蛋白质溶液。此外，本发明的免疫原性和疫苗组合物可包含稀释剂、等渗剂、稳定剂或佐剂。稀释剂可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等渗剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐等。合适的佐剂如上所述。最优选采用卡巴浦尔，具体是采用卡巴浦尔971P，用量优选上述量(如每剂量约500μg-5mg，更优选每剂量约750μg-2.5mg，最优选每剂量约1mg)。
因此，本发明也涉及的免疫原性组合物含有以下组分：i)任何上述PCV2 ORF2蛋白，浓度优选上述浓度，ii)至少一部分表达所述PCV2 ORF2蛋白的病毒载体，iii)一部分细胞培养物，iv)灭活该重组病毒载体的灭活剂，优选BEI，和v)终止灭活剂介导的灭活作用的中和剂，优选与BEI等价含量的硫代硫酸钠；和vi)合适佐剂，优选上述用量的卡巴浦尔971；其中i)-iii)所述组分中约90％的大小小于1μm。另一方面，此免疫原性组合物还含药学上可接受的盐，优选生理可接受浓度的磷酸盐。优选将所述免疫原性组合物的pH调整到生理pH，即约6.5-7.5。
因此，本发明涉及的免疫原性组合物，每1ml也含有i)至少1.6μg上述PCV2ORF2蛋白，ii)至少一部分表达所述PCV2 ORF2蛋白的杆状病毒，iii)一部分细胞培养物，iv)约2-8mM BEI，v)与BEI等价含量的硫代硫酸钠；vi)约1mg卡巴浦尔971，和vii)生理上可接受浓度的磷酸盐；其中i)-iii)所述组分中约90％的大小小于1μm，以及将所述免疫原性组合物的pH调整到约6.5-7.5。
该免疫原性组合物还可包含一种或多种其它免疫调节剂，如白介素、干扰素或其它细胞因子。该免疫原性组合物也可含庆大霉素和硫柳汞。虽然本领域技术人员不难确定用于本发明的佐剂和添加剂的用量和浓度，但本发明考虑的组合物包含约50μg-2000μg佐剂和优选约250μg/ml剂量的疫苗组合物。在另一优选实施方式中，本发明考虑的疫苗组合物含有约1μg/ml-60μg/ml抗生素，更优选低于约30μg/ml抗生素。
因此，本发明也涉及含有以下组分的免疫原性组合物：i)任何上述PCV2 ORF2蛋白，其浓度优选上述浓度，ii)至少一部分表达所述PCV2 ORF2蛋白的病毒载体，iii)一部分细胞培养物，iv)灭活该重组病毒载体的灭活剂，优选BEI，和v)终止灭活剂介导的灭活作用的中和剂，优选与BEI等价含量的硫代硫酸钠；vi)合适佐剂，优选上述用量的卡巴浦尔971；vii)药学上可接受浓度的盐水缓冲液，优选磷酸盐缓冲液，和viii)抗微生物活性剂；其中i)-iii)所述组分中约90％的大小小于1μm。
令人惊讶地发现，本文提供的免疫原性组合物在24个月中非常稳定。也发现本文提供的含有本文所述杆状病毒表达的重组PCV2 ORF2蛋白的免疫原性组合物能非常有效地减轻PCV2感染相关临床症状。令人惊讶地发现，含有本文所述重组杆状病毒表达的PCV2 ORF2蛋白的的免疫原性组合物比含有完整PCV2病毒灭活形式或分离的病毒PCV2 ORF2抗原的免疫原性组合物更有效。具体说，令人惊讶地发现，重组杆状病毒表达的PCV2 ORF2蛋白在极低浓度，即至多0.25μg/剂量时就有效。加入卡巴浦尔还可进一步提高PCV2 ORF2蛋白的这种出乎意料的高免疫原性潜能。
另一方面涉及装有至少一个剂量本文所述PCV2 ORF2蛋白免疫原性组合物的容器，其中一个剂量包含至少2μg PCV2 ORF2蛋白，优选2-16μg PCV2 ORF2蛋白。所述容器可含有1-250剂量的该免疫原性组合物，优选含有1、10、25、50、100、150、200或250剂量的PCV2 ORF2蛋白免疫原性组合物。优选地，每个容器装有一个剂量以上的PCV2 ORF2蛋白免疫原性组合物，还装有抗微生物活性剂。这些活性剂为(例如)抗生素，包括庆大霉素和硫柳汞等。因此，本发明一方面涉及装有1-250剂量的PCV2 ORF2蛋白免疫原性组合物的容器，其中每个剂量包含至少2μg PCV2ORF2蛋白和庆大霉素和/或硫柳汞，优选约1μg/ml-60μg/ml抗生素，更优选低于约30μg/ml。
另一方面涉及一种药盒，其装有上述容器和说明手册，包括将至少一个剂量的PCV2 ORF2蛋白免疫原性组合物经肌肉内注射应用于小猪，以减轻PCV2感染相关临床症状的严重性的信息。而且，另一方面，所述说明手册包括第二次或再次给予至少一个剂量的PCV2 ORF2免疫原性组合物的信息，其中第二次给药或再次给药在初次或前次给药的至少14天后进行。优选地，所述说明手册也包括给予免疫刺激剂的信息。优选地，给予所述免疫刺激剂至少两次。优选地，第一次与第二次或再次给予免疫刺激剂之间间隔至少3天，更优选至少5天，更优选至少7天。优选地，在初次给予PCV2 ORF2蛋白免疫原性组合物至少10天，优选15天，更优选20天，更优选至少22天后给予该免疫刺激剂。优选的免疫刺激剂是(例如)钥孔血蓝素(KLH)，优选用不完全弗氏佐剂(KLH/ICFA)乳化。然而应理解，也可采用本领域技术人员已知的任何其它免疫刺激剂。本文所用“免疫刺激剂”指可触发免疫应答，优选不启动或增强特异性免疫应答，如对某特定病原体的免疫应答的任何物质或组合物。该手册还说明应以合适剂量给予免疫刺激剂。而且，该药盒也可装有容器，包括至少一个剂量的免疫刺激剂，优选一个剂量的KLH或KLH/ICFA。
而且，也令人惊讶地发现，可通过给予IngelVac PRRS MLV疫苗优选与卡巴浦尔组合进一步增强含重组杆状病毒表达的PCV2 ORF2蛋白的该免疫原性组合物的免疫原性潜能(参见实施例5)。PRRS感染存在时，PCV2的临床症状和疾病表现被显著放大。然而，本文所述的免疫原性组合物和疫苗接种方案大大减轻了这种作用，出乎意料。换言之，用本文所述的任何PCV2 ORF2免疫原性组合物和Ingelvac PRRSMLV疫苗(Boehringer Ingelheim)治疗动物、优选猪时，观察到出乎意料的协同作用。
因此，本发明另一方面涉及上述药盒，其装有本文所述的PCV2 ORF2免疫原性组合物和说明手册，该说明手册还包括与含PRRS抗原、优选佐剂化PRRS抗原的免疫原性组合物一起给予PCV2 ORF2免疫原性组合物的信息。PRRS抗原优选为IngelVac
Figure A20058004774100291
PRRS MLV(Boehringer Ingelheim)。
本发明另一方面也涉及一种药盒，其包括i)装有至少一个剂量本文所述PCV2ORF2免疫原性组合物的容器，和ii)装有含PRRS抗原、优选佐剂化PRRS抗原的免疫原性组合物的容器。PRRS抗原优选IngelVac
Figure A20058004774100292
PRRS MLV(Boehringer Ingelheim)。更优选地，该药盒还装有说明手册，包括给予药物组合物的信息。优选装有在含PRRS的组合物之前临时给予含PCV2 ORF2的组合物的信息。
另一方面涉及将本文所述任何组合物用作药物，优选用作兽用药物，更优选用作疫苗的应用。而且，本发明也涉及本文所述任何组合物用于制备能减轻PCV2感染相关性临床症状的严重性的药物的应用。优选地，所述药物用于预防PCV2感染，更优选用于小猪。
另一方面涉及用于(i)预防PCV2感染或再次感染或(ii)减少或消除PCV2所致对象临床症状的方法，所述方法包括将本文所述任何免疫原性组合物给予需要的对象。所述对象优选猪。优选通过肌肉内给予该免疫原性组合物。优选给予一个剂量或两个剂量的该免疫原性组合物，其中一个剂量优选含有至少约2μg PCV2 ORF2蛋白，更优选约2-16μg和至少约0.1-5mg卡巴浦尔，优选约1mg卡巴浦尔。另一方面涉及上述治疗方法，包括第二次给予该免疫原性组合物。优选用含有相同量的PCV2ORF2蛋白的免疫原性组合物进行第二次给药。第二次给药也优选通过肌肉内给予。优选地，在首次给药至少14天后，更优选在首次给药至少4周后完成第二次给药。
另一方面，所述治疗方法也包括给予免疫刺激剂。优选地，至少给予所述免疫刺激剂两次。优选地，第一次和第二次给予免疫刺激剂之间间隔至少3天，更优选至少5天，更优选至少7天。优选地，在初次给予PCV2 ORF2免疫原性组合物至少10天，优选15天，更优选20天，更优选至少22天后给予免疫刺激剂。优选的免疫刺激剂是(例如)钥孔血蓝素(KLH)，优选用不完全弗氏佐剂(KLH/ICFA)乳化。然而应理解，也可采用本领域技术人员已知的任何其它免疫刺激剂。本领域技术人员通常知道给予免疫刺激剂的合适剂量。
另一方面，上述治疗方法也包括给予PRRS抗原。PRRS抗原优选IngelVacPRRS MLV(Boehringer Ingelheim)。优选在给予PCV2 ORF2蛋白免疫原性组合物之前临时给予所述PRRS抗原。
附图简要说明
图1是PCV2 ORF2重组杆状病毒的优选构建过程流程图；和
图2a和2b是如何产生本发明组合物的流程图。
优选实施方式详述
以下实施例列出了本发明的优选材料和方法。然而应理解，仅以说明方式提供这些实施例，不应认为其中有任何内容限制了本发明的整体范围。
实施例1
本实施例比较了用本发明方法与现有技术已知方法获得的ORF2相对产率。在四个1000mL转瓶各接种300mL昆虫无血清培养基Excell 420(JRH Biosciences，Inc.，Lenexa，KS)，含有约1.0×106 Sf+细胞/ml的细胞悬液。该主细胞培养物称为SF+(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))主细胞母液，第19代，批号N112-095W。用于产生该SF+主细胞母液的细胞获自Protein Sciences Corporation，Inc.，Meriden，CT。此实施例的SF+细胞系限定在第19和59代之间。其它代次将用于本发明目的，但为了将该方法扩大为大规模生产，可能需要传代至少19代，超过59代可能影响表达，但并未就此进行研究。更详细说，在无菌转瓶中，用Excell 420培养基悬浮培养从液氮储存取出的初始SF+细胞培养物，其间恒速振荡。在含有25-150mL Excell 420无血清培养基的100mL-250mL转瓶中培养该培养物。当细胞倍增至细胞密度为1.0-8.0×106个细胞/mL时，将它们分接种至新容器中，接种密度为0.5-1.5×106个细胞/mL。在体积高达36升的转瓶或高达300升的不锈钢生物反应器中25-29℃培养基序扩增培养物2-7天。
接种后，27℃培育转瓶4小时。然后，用含有PCV2 ORF2基因(SEQ ID NO：4)的重组杆状病毒接种各转瓶。如下所述产生含有PCV2 ORF2基因的重组杆状病毒：PCR扩增PCV2北美毒株的PCV2 ORF2基因，其含有5′Kozak序列(SEQ ID NO：1)和3′EcoR1位点(SEQ ID NO：2)，将其克隆入pGEM-T-Easy载体(Promega，威斯康星州麦迪逊)。然后，切下该基因并亚克隆入转运载体pVL1392(BD BiosciencesPharmingen，San Diego，CA)中。本文中该亚克隆部分由SEQ ID NO：7代表。将含有PCV2 ORF2基因的pVL1392质粒命名为N47-064Y，然后与BaculoGold
Figure A20058004774100311
(BDBiosciences Pharmingen)杆状病毒DNA共转染入SF+昆虫细胞(Protein Sciences，Meriden，CT)中，产生含有PCV2 ORF2基因的重组杆状病毒。本文所述的新构建物为SEQ ID NO：8。将含有PCV2 ORF2基因的重组杆状病毒经噬斑纯化(plaque-purified)，在SF+细胞系上增殖主种子病毒(MSV)，分成等分，并储存于-70℃。用杆状病毒特异性引物作PCR-RFLP，MSV经鉴定为阳性PCV2 ORF2杆状病毒。经间接荧光抗体试验的多克隆血清或单克隆抗体检测，用PCV2 ORF2杆状病毒感染的昆虫细胞产生的MSV或工作种子病毒表达PCV2 ORF2抗原。此外，通过N-末端氨基酸测序确认了对PCV2 ORF2杆状病毒的鉴定。也按照9C.F.R.113.27(c)、113.28，和113.55检测PCV2 ORF2杆状病毒MSV的纯度。接种到转瓶中的各重组杆状病毒具有不同的感染复数(MOI)。用7.52mL 0.088MOI接种转瓶1；用3.01mL 0.36MOI接种转瓶2；用1.5mL 0.18MOI接种转瓶3；用0.75mL 0.09MOI接种转瓶4。本文提供的图1是说明用于构建PCV2 ORF2重组杆状病毒的基本步骤的流程图。
接种杆状病毒后，27±2℃培育该转瓶7天，该期间也以100rpm振荡。该转瓶采用通风盖子允许空气流动。在接下来的7天中，每24小时各瓶取样。提取后，离心各样品，分离沉淀和上清液，然后通过0.45-1.0μm孔径滤膜进行微量过滤。
得到的样品中所含ORF2量通过ELISA试验定量。用0.05M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)1∶6000稀释经蛋白G纯化的捕获抗体猪抗-PCV2 Pab IgG(用PBS以1∶250稀释)进行ELISA试验。然后，将100μL抗体加入微量滴定板诸孔中，密封，37℃培育过夜。然后用含0.5mL吐温20(Sigma，St.Louis，MO)、100mL 10X D-PBS(Gibco Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)和899.5mL蒸馏水的洗涤溶液洗涤该平板三次。然后，将250μL封闭溶液(用蒸馏水将10mL D-PBS QS稀释至100mL，其中溶解5g Carnation脱脂奶粉(Nestle，Glendale，CA))加入各孔中。下一步骤是洗涤该测试平板，然后加入预先稀释的抗原。通过将200μL稀释剂溶液(999.5mL D-PBS中加入0.5mL吐温20)加入稀释平板上的各孔中，产生预先稀释的抗原。然后，以1∶240和1∶480稀释样品，然后将100μL各稀释样品加入稀释平板上最上面的孔中(即一个最上面孔接受100μL 1∶240稀释样品，其它孔接受100μL 1∶480稀释样品)。然后在该平板的其余部分孔中进行连续稀释：从各孔中取出100μL，连续转入平板的下一个孔中。各孔在先混合再进行下一次转移。测试平板的洗涤包括用洗涤缓冲液洗涤平板三次。然后密封该平板，37℃培育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤三次或更多次。所用检测抗体是PCV ORF2的单克隆抗体。用稀释剂溶液1∶300稀释，然后将100μL稀释的检测抗体加入各孔。然后密封平板，37℃培育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。然后，将正常兔血清(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)加入稀释剂溶液至1％浓度制备偶联物稀释剂。用偶联物稀释剂以1∶10,000稀释偶联抗体山羊抗小鼠(H+1)-HRP(Jackson Immunoresearch)。然后，将100μL稀释的偶联抗体加入各孔中。然后密封该平板，37℃培育45分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。将100μL底物(TMB过氧化物酶底物，Kirkgaard和Perry Laboratories(KPL)，Gaithersberg，MD)与等体积过氧化物酶底物B(KPL)混合，加入各孔中。室温培育该平板15分钟。然后，将100μL 1N HCL溶液加入所有孔中终止反应。然后，通过ELISA阅读器读数。该试验的结果见下表1：
表1
  天   转瓶   沉淀物中的ORF2(μg)   上清液中的ORF2(μg)
  3   1   47.53   12
  3   2   57.46   22
  3   3   53.44   14
  3   4   58.64   12
  4   1   43.01   44
  4   2   65.61   62
  4   3   70.56   32
  4   4   64.97   24
  5   1   31.74   100
  5   2   34.93   142
  5   3   47.84   90
  5   4   55.14   86
  6   1   14.7   158
  6   2   18.13   182
  6   3   34.78   140
  6   4   36.88   146
  7   1   6.54   176
  7   2   12.09   190
  7   3   15.84   158
  7   4   15.19   152
这些结果表明，培育时间延长时，ORF2在离心细胞和培养基后上清液中的表达高于离心细胞和培养基后沉淀物中的表达。因此，与表达少于5天从细胞中回收的ORF2相比，使ORF2表达进行至少5天从上清液中回收能显著提高ORF2产率，与现有方法相比有显著的改进。
实施例2
本实施例提供了本文声称的本发明效果的有关数据。用300mL Excell 420培养基含约1.0×106Sf+细胞/ml的细胞悬液接种1000mL转瓶。然后，27℃培育该转瓶，100rpm振荡。培育24小时后，以0.1MOI的10mL PCV2ORF2/Bac p+6(含有PCV2ORF2基因的重组杆状病毒，在Sf9昆虫细胞中再传代6次)病毒接种该转瓶。
然后，27℃培育该转瓶共6天。培育后，离心该转瓶，收获三个得到的上清液样品并灭活。将温度设置为37±2℃灭活上清液。对于第一个样品，将已在0.3N NaOH中环化成0.2M双氮丙啶(BEI)的0.4M氢溴酸2-溴乙胺(bromoethylene amine)溶液加入该上清液中，使BEI终浓度为5mM。对于第二个样品，将10mM BEI加入上清液。对于第三个样品，不将BEI加入上清液。然后，连续搅拌样品48小时。加入1.0M硫代硫酸钠溶液，使最终最低浓度为5mM，以中和任何残留的BEI。然后，用实施例1所述的同一ELISA试验方法定量各样品中的ORF2含量。此实施例的结果见下表2：
表2
  样品   上清液中的ORF2(μg)
  1   78.71
  2   68.75
  3   83.33
本实施例证明，用BEI中和不会去除或降解大量重组PCV2 ORF2蛋白产品。加入BEI或升高温度时上清液中没有大量损失ORF2证明了这点。本领域技术人员将认识到，回收的ORF2是稳定的蛋白质产物。
实施例3
本实施例证明，本发明的规模可以从小规模生产重组PCV2 ORF2扩大到大规模生产重组PCV2 ORF2。将7000mL ExCell 420培养基含5.0×105个细胞/ml的Sf+细胞接种到20000mL Applikon生物反应器中。然后，在接下来的68个小时中27℃培育该培养基和细胞并以100RPM振荡。在第68小时时，将41.3mLPCV2 ORF2杆状病毒MSV+3加入7000mL ExCell 420培养基中。然后，将得到的混合物加入该生物反应器中。在接下来的7天中，27℃培育该混合物并以100RPM振荡。从感染后第4天开始，每24小时从生物反应器中提取一次样品，离心各样品。保存样品上清液，然后用SDS-PAGE光密度法定量ORF2含量。结果见下表3：
表3
  感染后天数：   上清液中的ORF2(μg/mL)
  4   29.33
  5   41.33
  6   31.33
  7   60.67
实施例4
本实施例测试了七种PCV2候选疫苗的效果，进一步确定了接触PCV2强毒株后的效率参数。将一百零八(108)只剖腹产不喝初乳(CDCD)的9-14日龄小猪随机分成相同大小的9组。表4列出了此实施例的总体研究设计。
表4.总体研究设计
  组别   猪的数量   治疗   治疗天数   第21天和第27天注射KLH/ICFA   第24天用强毒株PCV2攻击   第49天进行尸检
  1   12   PCV2疫苗编号1-(vORF216μg)   0   +   +   +
  2   12   PCV2疫苗编号2-(vORF28μg)   0   +   +   +
  3   12   PCV2疫苗编号3-(vORF24μg)   0   +   +   +
  4   12   PCV2疫苗编号4-(rORF216μg)   0   +   +   +
  5   12   PCV2疫苗编号5-(rORF28μg)   0   +   +   +
  6   12   PCV2疫苗编号6-(rORF24μg)   0   +   +   +
  7   12   PCV2疫苗编号7-(杀死的全细胞病毒)   0   +   +   +
  8   12   无攻击对照   N/A   +   +   +
  9   12   非严谨性阴性对照组   N/A   +   -   +
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
七组(第1-7组)接受某些剂量的PCV2 ORF2多肽，其中一组用作攻击对照，不接受PCV2 ORF2；另一组用作严谨性阴性对照，也不接受PCV2 ORF2。在第0天，用指定疫苗治疗第1-7组。在第14天对第7组的小猪进行加强治疗。在免疫接种后和第19天观察小猪的不良反应和注射部位反应，将小猪转移到第二研究地点。在第二研究地点，在一个建筑物中分组饲养第1-8组，而在另一建筑物中单独饲养第9组。所有猪在第21和27天以及第24天接受钥孔血蓝素(KLH)/不完全弗氏佐剂(ICFA)，用强毒株PCV2攻击第1-8组。
攻击之前和之后，收集血样进行PCV2血清学分析。攻击后，收集用于确定平均每日体重增量(ADWG)和临床症状的体重数据，以及用于测定PCV2鼻排出的鼻拭子样品。在第49天，对所有存活的猪处死后进行尸检，对肺病损进行评分，用福尔马林保存选择的组织，用于随后的免疫组织化学(IHC)检测。
材料和方法
这是在第0天对9-14日龄CDCD猪进行的部分盲法(partially blinded)疫苗接种-攻击可行性研究。该研究所包括的母猪PCV2 IFA效价应≤1∶1000。此外，母猪的血清学状态得自已知的PRRS-阴性畜群。检测了28头母猪的PCV2血清学状态。14头母猪的PCV2效价≤1000，将它们转移到第一研究地点。通过剖腹产手术分娩110只小猪，试验前4天用于此研究。在试验前3天，将第一研究地点的108只CDCD猪称重，用耳标签作标记，根据体重分区，随机分配到1-9组，如表4所示。如果此研究编入了符合标准的任何受试动物但后来因某种原因而排除，则研究者和监测者应进行商议，以确定是否在最终分析中采用从该动物收集的数据。讨论是否排除该编入小猪的数据和排除理由。最初，不排除任何母猪。在试验前3天，将可用的110头猪中共108头随机分配到9组中。不将两头最小的猪(17和19号)分配到任何组中，如果需要，用作额外实验动物。在研究期间，去除了几只动物。攻击前发现以下各猪死亡：试验前1天82号猪(第9组)，第3天56号猪(第6组)，第4天53号猪(第9组)，第8天28号猪(第8组)，第7天69号猪(第8组)，第9天93号猪(第4组)。这六头猪不包括在最终研究结果中。将17号猪(额外猪之一)分配到第9组。研究中排除了另一个额外猪，19号猪。
给予各组的制剂如下：设计给予第1组含有16μg ORF2/ml的1ml病毒ORF2(vORF2)，将10.24ml病毒ORF2(256μg/25μg/ml＝10.24ml vORF2)与3.2ml0.5％卡巴浦尔和2.56ml磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)混合制备此溶液，这产生16ml用于第1组的制剂。设计给予第2组含有8μg vORF2/ml的1ml vORF2，将5.12mlvORF2(128μg/25μg/ml＝5.12ml vORF2)与3.2ml 0.5％卡巴浦尔和7.68ml磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)混合制备此溶液，这产生16ml用于第2组的制剂。设计给予第3组含有4μg vORF2/ml的1ml vORF2，将2.56ml vORF2(64μg/25μg/ml＝2.56ml vORF2)与3.2ml 0.5％卡巴浦尔和10.24ml磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)混合制备此溶液，这产生16ml用于第3组的制剂。设计给予第4组含有16μg rORF2/ml的1ml重组ORF2(rORF2)，将2.23ml rORF2(512μg/230μg/ml＝2.23ml rORF2)与6.4ml 0.5％卡巴浦尔和23.37ml磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)混合制备此溶液，这产生32ml用于第4组的制剂。设计给予第5组含有8μg rORF2/ml的1ml rORF2，将1.11ml rORF2(256μg/230μg/ml＝1.11ml rORF2)与6.4ml 0.5％卡巴浦尔和24.49ml磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)混合制备此溶液，这产生32ml用于第5组的制剂。设计给予第6组含有8μgrORF2/ml的1ml rORF2，将0.56ml rORF2(128μg/230μg/ml＝0.56ml rORF2)与6.4ml0.5％卡巴浦尔和25.04ml磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)混合制备此溶液，这产生32ml用于第6组的制剂。设计给予第7组含有MAX PCV2KV的2ml PCV2杀死的全细胞疫苗(PCV2KV)，将56ml PCV2KV与14ml 0.5％卡巴浦尔混合制备此溶液，这产生70ml用于第7组的制剂。最后，设计给予第8组每2ml剂量0.5μg/ml或1.0μg/ml的KLH，将40.71ml KLH(7.0μg蛋白质/ml，0.5μg/ml＝570ml(7.0μg/ml)(x)＝(0.5)(570ml))、244.29ml磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)和285ml弗氏佐剂混合制备此溶液。表5描述了本实施例关键事项的时间框图。
表5.研究事项
  研究日   研究事项
  -4，0-49   总体观察总体健康状况和临床症状
  -3   称重；随机分组；收集所有猪的血样
  0   体检；分别给予第1-7组IVP编号1-7
  0-7   观察猪的注射部位反应
  14   用PCV2疫苗7加强免疫第7组；收集所有猪的血样
  14-21   观察第7组的注射部位反应
  16-19   用抗体治疗所有猪(数据遗失)
  19   将猪从第一测试地点转移到第二测试地点
  21   用KLH/ICFA治疗第1-9组
  24   收集所有猪的血样和鼻拭子样品；称量所有猪的体重；用PCV2攻击病毒株攻击第1-8组
  25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47   收集所有猪的鼻拭子样品
  27   用KLH/ICFA治疗第1-9组
  31   收集所有猪的血样
  49   收集所有猪的血样和鼻拭子样品；称量所有猪的体重；对所有猪进行尸检；观察总病损，着重观察黄疸和胃溃疡；评价肺病损；保存新鲜的和福尔马林固定的组织样品；存活期研究完成
存活期研究完成后，病理学家用免疫组织化学(IHC)检测福尔马林固定组织中的PCV2抗原，评价血样的PCV2血清学变化，评价鼻拭子样品的PCV2排出，测定第24天-第49天的平均每日体重增量(ADWG)。
在第一研究地点，在五间猪舍中分笼饲养动物，从出生饲养至大约11日龄(大约是研究的第0天)。各猪舍的设计相同，由层叠的单个不锈钢笼组成，该设计可以将加热和过滤的空气单独供应给各分离单元。各猪舍分别有加热和通风装置，从而防止猪舍之间空气的交叉污染。在第二研究地点，在两个不同的建筑物中饲养动物。在改造的配料建筑物(fumisher building)中单独饲养第9组(严谨性阴性对照组)，在改造的养殖建筑物(nursery building)中饲养第1-8组。在单独猪圈中饲养各组(每圈11-12头猪)，各猪圈为每头猪提供约3.0平方英尺空间。各猪圈位于具有塑料漏缝地板的高架平台上。猪圈下的地坑用作粪便和废物的储存罐。各建筑物具有其自身独立的加热和通风系统，建筑物之间空气交叉污染的可能性很小。
在第一研究地点，从出生至约3周龄，给小猪饲喂特制的奶饲料。到第19天(约41/2周龄)，所有小猪都进食特制的固体混合饲料。在第二研究地点，随意给所有小猪饲喂适合其年龄和体重的定制不含药物的市售混合饲料。在两个研究地点，可随意饮水。
在试验前2天用维生素E治疗所有受试猪，在试验前1天注射铁剂，在第16、17、18和19天注射NAXCEL
Figure A20058004774100371
(1.0mL，IM，两侧臀部交替注射)。此外，第3天给52号猪(第9组)注射铁剂，第11天给45号猪(第6组)注射铁剂，第6天用NAXCEL
Figure A20058004774100372
治疗69号猪(第8组)，第14天用地塞米松(dexamethazone)和青霉素治疗74号猪(第3组)，第13天用地塞米松和青霉素治疗51号猪(第1组)，第14天因为各种健康原因用NAXCEL
Figure A20058004774100373
治疗。
在两处研究地点，猪都处在兽医照料下。在第0天进行动物体检，将结果记录于体检记录表中。通过第0天的观察确定，所有动物在疫苗接种前健康和营养状况良好。攻击前观察到所有受试动物的健康和营养状况良好。以归还(rendering)治疗畜体和组织。在动物治疗记录上记载研究动物的最终治疗。
第0天，分配到第1-6组的猪分别接受1.0mL PCV2疫苗1-6，用无菌3.0mLLuer-lock注射器和无菌20g×1/2″针头将其IM注射在左侧颈部。分配到第7组的猪接受2.0mL PCV2疫苗7，用无菌3.0mL Luer-lock注射器和无菌20g×1/2″针头将其IM注射在左侧颈部。第14天，分配到第7组的猪接受2.0mL PCV2疫苗7，用无菌3.0mL Luer-lock注射器和无菌20g×1/2″针头将其IM注射在右侧颈部。
第21天，所有受试猪都接受2.0mL KLH/ICFA，用无菌3.0mL Luer-lock注射器和无菌20g×1″针头将其IM注射在右侧臀部。第27天，所有受试猪都接受2.0mLKLH/ICFA，用无菌3.0mL Luer-lock注射器和无菌20g×1″针头将其注射在左侧臀部。
第24天，分配到第1-8组的猪接受1.0mL PCV2 ISUVDL攻击病毒株(5.11 log10TCID50/mL)，用无菌3.0mL Luer-lock注射器和无菌20g×1″针头将其IM注射在左侧颈部。用无菌3.0mL Luer-lock注射器和鼻导管将另外1.0mL相同病毒株IN给予各猪(每鼻孔0.5mL)。
在试验前4天和第0天至第9天每日观察受试猪的总体健康状况和不良反应。在临床观察记录上记录观察结果。自第0天至第7天观察所有受试猪，还在第14-21天观察第7组的注射部位反应。在试验前3天、第24天和第49天，或在攻击后发现猪死亡的那天用校准天平称取各猪的体重，确定平均每日体重增量。在体重表上记录体重。利用试验前3天的体重将猪分区，然后随机分组。利用第24天和第49天的体重数据确定这些时间点期间各猪的平均每日体重增量(ADWG)。对于攻击后和第49天前死亡的猪，调整ADWG，以代表第24天至死亡日的ADWG。
为了测定PCV2血清学变化，在试验前3天和第14天，从各小猪的眼窝静脉窦收集静脉全血。对于各小猪，通过将无菌毛细管插入一只眼睛的内眼角并将大约3.0mL全血放入4.0mL血清分离管(SST)中，从眼窝静脉窦收集血液。在第24、31和49天，用无菌18g×11/2″Vacutainer针头(Becton Dickinson & Company，Franklin Lakes，新泽西州)、Vacutainer针托和13mL SST从上腔静脉收集各猪的静脉全血。在样品收集记录上记录各时间点的血液收集。使各SST中的血液凝结，然后，离心各SST，收获血清。将收获的血清转移到无菌有盖试管(snap tube)中，储存于-70±10℃，直到将来进行测试。由BIVI-R & D职员检测血清样品中是否存在PCV2抗体。
在第20天至第49天每天观察一次猪的临床症状，在临床观察记录上记录临床观察结果。
为了检测第24天、第25天，和随后直到(包括)第49天的奇数研究日时的PCV2鼻排出，将无菌涤纶拭子以鼻内方式插入各猪的左鼻孔或右鼻孔(每头猪一个拭子)，尽可能无菌绕圈擦拭数秒后取出。然后将各拭子放入一个无菌有盖试管中，其中含有1.0mL EMEM培养基与2％IFBS，500单位/mL青霉素，500μg/mL链霉素和2.5μg/mL两性霉素B。在管中折断该拭子，加盖密封试管，适当标出动物编号、研究编号、收集日期、研究日和“鼻拭子”。将密封试管贮存于-40±10℃，直到用冰过夜转送至BIVI-St.Joseph。在鼻拭子样品收集表上记录鼻拭子收集物。BIVI-R & D对鼻拭子样品上的PCV2进行定量病毒分离(VI)测试。结果表示为log10值。1.3log或更小的值认为是阴性，大于1.3log的任何值认为是阳性。
对第一研究地点死亡的猪(28、52、56、69、82和93号猪)尸检至确定诊断所必需的水平。记录总病损，不保留这些猪的组织。在第二研究地点，对第49天之前死亡的猪(45、23、58、35号猪)，对发现在安乐死之前第49天死亡的猪(2、43号猪)和第49天实施安乐死的猪进行尸检。观察有无任何总病损，在尸检报告表上记录含病损的肺叶百分数。
将第二研究地点尸检的103头猪的扁桃腺、肺、心脏、肝脏、肠系膜淋巴结、肾脏和腹股沟淋巴结的组织样品放入一个装有10％缓冲福尔马林液的容器中；同时将上述同一器官的另一份组织样品放入Whirl-pak(M-Tech Diagnostics Ltd.，Thelwall，UK)中，将各Whirl-pak置于冰上。适当地标记各容器。在尸检报告表上记录样品收集。然后，对福尔马林固定的组织样品和诊断请求表进行IHC测试。按照接受样品、制备样品和玻片以及染色技术的标准ISU实验室步骤进行IHC测试。用冰盒将Whirl-paks中的新鲜组织运输到研究检测处储存(-70±10℃)待用。病理学家用IHC检测福尔马林固定组织中的PCV2，并用以下评分系统评分：0＝无；1＝少量阳性染色，几个位点；2＝中等阳性染色，多个位点；3＝大量阳性染色，散布于整个组织中。由于病理学家不能明确区分腹股沟LN与肠系膜LN，所以将这些组织的结果仅仅标为淋巴结，评分给出了每个动物各两种组织的最高评分。
结果
本实施例的结果见下。应注意，第9组的一头猪在第0天之前死亡，还有5头猪在接种疫苗后死亡(第4组1头；第6组1头；第8组2头；第9组1头)。死后检验表明，所有六头猪都死于与疫苗接种或PMWS无关的感染。此外，在任何组中都没有观察到不良反应或注射部位反应。
平均每日体重增量(ADWG)结果见下表6。严谨性阴性对照组第9组的ADWG最高(1.06±0.17磅/天)，其次是接受一个剂量8μg rORF2的第5组(0.94±0.22磅/天)。接受一个剂量4μg vORF2的第3组的ADWG最低(0.49±0.21磅/天)，其次是接受2次剂量死疫苗的第7组(0.50±0.15磅/天)。
表6.组间平均每日体重增量(ADWG)的小结
组别 治疗 N   ADWG-磅/天(第24天至第49天)或根据第29天前死亡的猪进行调整
  1   vORF2-16μg(1次剂量)   12   0.87±0.29磅/天
  2   vORF2-8μg(1次剂量)   12   0.70±0.32磅/天
  3   vORF2-4μg(1次剂量)   12   0.49±0.21磅/天
  4   rORF2-16μg(1次剂量)   11   0.84±0.30磅/天
  5   rORF2-8μg(1次剂量)   12   0.94±0.22磅/天
  6   rORF2-4μg(1次剂量)   11   0.72±0.25磅/天
  7   KV(2次剂量)   12   0.50±0.15磅/天
  8   攻击对照   10   0.76±0.19磅/天
  9   严谨性阴性对照   11   1.06±0.17磅/天
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
PCV2血清学结果见下表7。在试验前3天所有九组都是PCV2血清阴性。第14天，接受vORF2疫苗的各组效价最高，其范围是187.5-529.2。接受死病毒疫苗的猪效价第二高，其次是接受rORF2疫苗的各组。此时第8组和第9组仍为血清阴性。第24天和第31天，接受vORF2疫苗的猪继续显示出强烈的血清应答，紧随其后的是接受两个剂量死病毒疫苗的小组。接受rORF2疫苗的猪血清学应答较慢，第8组和第9组继续保持血清阴性。第49天，接受vORF2疫苗、2次剂量死病毒疫苗和最低剂量的rORF2的猪显示出最强的血清应答。接受16μg和8μg rORF2疫苗的猪的IFA效价略高于攻击对照。第9组在第49天显示出强烈的血清应答。
表7.组间PCV2 IFA效价的小结
平均IFA效价
  组别   治疗  试验前3天   第14天   第24天   第31天**   第49天***
  1   vORF2-16μg(1次剂量)   50.0   529.2   4400.0   7866.7   11054.5
  2   vORF2-8μg(1次剂量)   50.0   500.0   3466.7   6800.0   10181.8
  3   vORF2-4μg(1次剂量)   50.0   187.5   1133.3   5733.3   9333.3
  4   rORF2-16μg(1次剂量)   50.0   95.5   1550.0   3090.9   8000.0
  5   rORF2-8μg(1次剂量)   50.0   75.0   887.5   2266.7   7416.7
  6   rORF2-4μg(1次剂量)   50.0   50.0   550.0   3118.2   10570.0
  7   KV(2次剂量)   50.0   204.2   3087.5   4620.8   8680.0
  8   攻击对照   50.0   55.0   50.0   50.0   5433.3
  9   严谨性阴性对照   50.0   59.1   59.1   54.5   6136.4
vORE2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
*出于计算目的，将IFA效价≤100指定为效价″50″；将IFA效价≥6400指定为效价“12,800″。
**攻击日
***尸检日
攻击后临床观察的结果见下表8。此结果的小结包括对异常行为、异常呼吸、咳嗽和腹泻的观察。表9包括组间临床症状总体发生率的小结结果，表10包括攻击后组间死亡率的小结结果。本研究中最常见的临床症状是行为异常，该行为被记录为轻微至严重嗜睡。接受2次较低剂量vORF2的猪、接受16μg rORF2的猪和接受2次剂量的KV疫苗的猪发病率≥27.3％。接受8μg rORF2的猪和严谨性阴性对照组没有异常行为。本研究中没有猪显示出任何异常呼吸。所有组中频繁观察到咳嗽(0-25％)以及腹泻(0-20％)。没有发现有PMWS病理性临床症状。
临床症状总体发生率因组而异。接受任何vORF2疫苗的小组、接受16μg rORF2的小组、接受2次剂量KV疫苗的小组和攻击对照组的总体临床症状发生率最高(≥36.4％)。严谨性阴性对照组，接受8μg rORF2的小组和接受4μg rORF2的小组的总体临床症状发生率分别为0％、8.3％和9.1％。
总体死亡率也因组而异。接受2次剂量KV疫苗的小组的死亡率最高(16.7％)；而接受4μg vORF2、16μg rORF2或8μg rORF2的小组和严谨性阴性对照组的死亡率均为0％。
表8.组间异常行为、异常呼吸、咳嗽和腹泻的观察结果小结
  组别   治疗   N   异常行为1   异常行为2   咳嗽3   腹泻4
  1   vORF2-16μg(1次剂量)   12   2/12(16.7％)   0/12(0％)   3/12(25％)   2/12(16/7％)
  2   vORF2-8μg(1次剂量)   12   4/12(33.3％)   0/12(0％)   1/12(8.3％   1/12(8.3％)
  3   vORF2-4μg(1次剂量)   12   8/12(66.7％)   0/12(0％)   2/12(16.7％)   1/12(8.3％)
  4   rORF2-16μg(1次剂量)   11   3/11(27.3％)   0/11(0％)   0/11(0％)   2/11(18.2％)
  5   rORF2-8μg(1次剂量)   12   0/12(0％)   0/12(0％)   1/12(8.3％)   0/12(0％)
  6   rORF2-4μg(1次剂量)   11   1/11(9.1％)   0/11(0％)   0/11(0％)   0/12(0％)
  7   KV(2次剂量)   12   7/12(58.3)   0/12(0％)   0/12(0％)   1/12(8.3％)
  8   攻击对照   10   1/10(10％)   0/10(0％)   2/10(20％)   2/10(20％)
  9   严谨性阴性对照   11   0/11(0％)   0/11(0％)   0/11(0％)   0/11(0％)
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
1各组中显示有任何异常行为至少一天的猪总数
2各组中显示有任何异常呼吸至少一天的猪总数
3各组中显示有咳嗽至少一天的猪总数
4各组中显示有腹泻至少一天的猪总数
表9.组间临床症状总体发生率的小结
  组别   治疗   N   发生临床症状的猪数目1   发生率
  1   vORF2-16μg(1次剂量)   12   5   41.7％
  2   vORF2-8μg(1次剂量)   12   5   41.7％
  3   vORF2-4μg(1次剂量)   12   8   66.7％
  4   rORF2-16μg(1次剂量)   11   4   36.4％
  5   rORF2-8μg(1次剂量)   12   1   8.3％
  6   rORF2-4μg(1次剂量)   11   1   9.1％
  7   KV(2次剂量)   12   7   58.3％
  8   攻击对照   10   4   40％
  9   严谨性阴性对照   11   0   0％
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
1各组中显示有任何临床症状至少一天的猪总数
表10.攻击后组间死亡率的小结
  组别   治疗   N   攻击后死亡数   死亡率
  1   vORF2-16μg(1次剂量)   12   1   8.3％
  2   vORF2-8μg(1次剂量)   12   1   8.3％
  3   vORF2-4μg(1次剂量)   12   0   0％
  4   rORF2-16μg(1次剂量)   11   0   0％
  5   rORF2-8μg(1次剂量)   12   0   0％
  6   rORF2-4μg(1次剂量)   11   1   9.1％
  7   KV(2次剂量)   12   2   16.7％
  8   攻击对照   10   1   10％
  9   严谨性阴性对照   11   0   0％
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
PCV2鼻排出结果见下表11。第24天攻击后，第7组的1头猪在第27天开始排出PCV2。其他组直到第33天才开始排出。从第35天至第45天观察到有大量病毒经鼻排出。接受三种vORF2疫苗之一的小组和接受4或8μg rORF2的小组PCV2鼻排出发生率最低(≤9.1％)。攻击对照组(第8组)的排出率最高(80％)，其次是严谨性阴性对照组(第9组)，其发生率为63.6％。
表11.小组PCV2鼻排出的发生率小结
  组别   治疗   N  排出至少1天的猪的数量   发生率
  1   vORF2-16μg(1次剂量)   12   1   8.3％
  2   vORF2-8μg(1次剂量)   12   1   8.3％
  3   vORF2-4μg(1次剂量)   12   1   8.3％
  4   rORF2-16μg(1次剂量)   11   2   18.2％
  5   rORF2-8μg(1次剂量)   12   1   8.3％
  6   rORF2-4μg(1次剂量)   11   1   9.1％
  7   KV(2次剂量)   12   5   41.7％
  8   攻击对照   10   8   80％
  9   严谨性阴性对照   11   7   63.6％
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
组间黄疸发生率、组间胃溃疡发生率、组间平均肺病损评分和组间肺病损发生率的小结见下表12。本研究疫苗接种后，六头猪在第一测试地点死亡(第4组，N＝1；第6组，N＝1；第8组，N＝2；第9组，N＝2)。六头猪中的四头在一个或多个体腔中有纤维化病灶，一头猪(第6组)的病灶与梭菌病相一致，一头猪(第9组)大体上没有病损。本研究疫苗接种后死亡的猪均没有与PMWS相一致的病损。
对攻击后死亡的猪和第49天实施安乐死的猪进行尸检。在尸检中，任何组中都不存在黄疸和胃溃疡。在平均％肺病损中，第9组的平均％肺病损最低(0％)，其次是第1组的0.40±0.50％和第5组的0.68±1.15％。第2、3、7和8组的平均％肺病损最高(≥7.27％)。这四组中各自有一头猪的肺病损≥71.5％，此猪使这四组的结果变得较高。除了第9组的肺病损为0％以外，其余8组的肺病损≤36％。观察到的几乎所有肺病损都可描述为红色/紫色和紧实。
表12.观察到的组间黄疸发生率、组间胃溃疡发生率、组间平均％肺病损评分和组间肺病损发生率的小结
Figure A20058004774100421
  4   rORF2-16μg(1次剂量)   0/11(0％)   0/11(0％)   1.5±4.74％   4/11(36％)
  5   rORF2-8μg(1次剂量)   0/12(0％)   0/12(0％)   0.68±1.15％   9/12(75％)
  6   rORF2-4μg(1次剂量)   0/11(0％)   0/11(0％)   2.95±5.12％   7/11(64％)
  7   KV(2次剂量)   0/12(0％)   0/12(0％)   7.27±22.9％   9/12(75％)
  8   攻击对照   0/10(0％)   0/10(0％)   9.88±29.2％   8/10(80％)
  9   严谨性阴性对照   0/11(0％)   0/11(0％)   0/11(0％)   0/11(0％)
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；KV或杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
组间IHC阳性发生率结果的小结见表13。第1组(vORF2-16μg)和第5组(rORF2-8μg)的IHC阳性结果比率最低(16.7％)。第8组(攻击对照)和第9组(严谨性阴性对照)的IHC阳性结果比率最高，分别为90％和90.9％。
表13.组间IHC阳性发生率的小结
  组别   治疗   N   至少有一种组织为PCV2阳性的猪的数量   发生率
  1   vORF2-16μg(1次剂量)   12   2   16.7％
  2   vORF2-8μg(1次剂量)   12   3   25.0％
  3   vORF2-4μg(1次剂量)   12   8   66.7％
  4   rORF2-16μg(1次剂量)   11   4   36.3％
  5   rORF2-8μg(1次剂量)   12   2   16.7％
  6   rORF2-4μg(1次剂量)   11   4   36.4％
  7   KV(2次剂量)   12   5   41.7％
  8   攻击对照   10   9   90.0％
  9   严谨性阴性对照   11   10   90.9％
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；KV或杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
攻击后，接受一次剂量8μg rORF2抗原的第5组的表现超过了其它6个疫苗组。第5组的ADWG最高(0.94±0.22磅/天)，异常行为发生率最低(0％)，咳嗽发生率第二低(8.3％)，总体临床症状发生率最低(8.3％)，死亡率最低(0％)，PCV2鼻排出比率最低(8.3％)，平均％肺病损第二低(0.68±1.15％)，阳性组织的发生率最低(16.7％)。接受不同水平rORF2抗原的各组的表现全部超过接受不同水平vORF2的小组，接受2次剂量杀死的全细胞PCV2疫苗的小组表现最差。表14和15小结了攻击后组间的数据。
表14.攻击后组间数据小结-第1部分
Figure A20058004774100431
4 11   rORF2-16μg(1次剂量) 0.84±0.30 3/11(27.3％) 0/11(0％)   36.4％
5 12   rORF2-8μg(1次剂量) 0.94±0.22 0/12(0％) 1/12(8.3％ 8.3％
6 11   rORF2-4μg(1次剂量) 0.72±0.25 1/11(9.1％ 0/11(0％) 9.1％
7 12   KV(2次剂量) 0.50±0.15 7/12(58.3) 0/12(0％) 58.3％
  8   10   攻击对照   0.76±0.19   1/10(10％)   2/10(20％   40％
  9   11   严谨性阴性对照   1.06±0.17   0/11(0％)   0/11(0％)   0％
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；KV或杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
表15.攻击后组间数据小结-第2部分
  组别   N   治疗   死亡率   鼻排出   平均％肺病损  经IHC检测至少一种组织为PCV2阳性的发生率
  1   12   vORF2-16μg(1次剂量)   8.3％   8.3％   0.40±0.50％   16.7％
  2   12   vORF2-8μg(1次剂量)   8.3％   8.3％   7.41±20.2％   25.0％
  3   12   vORF2-4μg(1次剂量)   0％   8.3％   9.20±20.9％   66.7％
  4   11   rORF2-16μg(1次剂量)   0％   18.2％   1.50±4.74％   36.3％
  5   12   rORF2-8μg(1次剂量)   0％   8.3％   0.68±1.15％   16.7％
  6   11   rORF2-4μg(1次剂量)   9.1％   9.1％   2.95±5.12％   36.4％
  7   12   KV(2次剂量)   16.7％   41.7％   7.27±22.9％   41.7％
  8   10   攻击对照   10％   80％   9.88±29.2％   90.0％
  9   11   严谨性阴性对照   0％   63.6％   0/11(0％)   90.9％
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；KV或杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
本研究的结果表明，所有有效的疫苗应集中于rORF2疫苗。总体来看，在攻击后都检测到PCV2鼻排出，用PCV2疫苗进行接种导致排出减少。对所选淋巴组织的免疫组织化学检测也是疫苗效果的良好参数，而没有检测到各组之间在ADWG、临床症状和总体病损上有大的差异。如严谨性阴性对照组第9组的PCV2鼻排出、PCV2血清转化和阳性IHC组织证明的那样，由于在该研究期间的某些时间点上引入了外来的PCV2，而使本研究复杂化。
讨论
本研究中评价了七种PCV2疫苗，包括在第0天给予一次三种不同剂量水平的vORF2抗原，在第0天给予一次三种不同剂量水平的rORF2抗原，在第0天和第14天给予一种剂量水平全细胞PCV2死疫苗。总体来看，接受1次剂量含有8μg rORF2抗原的疫苗的第5组获得最佳结果。第5组的ADWG最高，异常行为发生率最低，异常呼吸发生率最低，咳嗽发生率第二低，总体临床症状发生率最低，死亡率最低，PCV2鼻排出比率最低，平均％肺病损比率第二低，阳性IHC组织发生率最低。
令人感兴趣的是，接受比第5组更高剂量的rORF2抗原的第4组的表现不如第5组或不比第5组更好。与第5组相比，第4组的ADWG略低，异常行为发生率较高，总体临床症状发生率较高，PCV2鼻排出比率较高，平均％肺病损比率较高，阳性IHC组织比率较高。没有对这些数据进行统计学分析，统计学分析可能表明这两组之间的差异没有统计学显著性，但观察到第4组的表现不如第5组好的倾向。
免疫接种后，6头猪在第一研究地点死亡。六头猪中四头来自第8组或第9组，没有接受疫苗。六头猪没有一头显示有与PMWS相符的病损，没有报告不良反应，总体来看，所有七种疫苗给予约11日龄的猪时，看起来是安全的。在该研究的接种后期间，在各疫苗组中，接受三种剂量水平vORF2疫苗或全细胞死疫苗的猪的IFAT水平最高，而第5组在攻击前IFAT水平最低。
虽然没有正式证明，但相信PCV2传播给刚断奶不久的小猪的主要途径是口鼻直接接触，能在猪同窝生产过程中减少PCV2鼻排出的有效疫苗将有助于控制感染的传播。接受三种vORF2抗原水平之一的小组和接受8μg rORF2的小组中PCV2鼻排出的发生率最低(8.3％)。不出所料，攻击对照组的病毒鼻排出发生率最高(80％)。
PCV2感染后继发PMWS的猪的总病损通常包括全身性淋巴结病与以下一种或多种疾病：(1)间质性肺炎伴有小叶间水肿、(2)皮肤苍白或黄疸、(3)斑点状肝萎缩、(4)胃溃疡和(5)肾炎。尸检时，在任何小组中都没有观察到黄疸、肝炎、肾炎和胃溃疡，没有专门检测淋巴结病。平均％肺病损评分因组而异。接受16μg vORF2抗原的小组的平均％肺病损评分最低(0.40±0.50％)，其次是接受8μg rORF2的小组(0.68±1.15％)。不出所料，攻击对照组的平均％肺病损评分最高(9.88±29.2％)。在所有四组中，由于各组中一头猪的肺病损评分非常高而使平均％肺病损评分升高。大多数肺病损都可描述为红色/紫色和紧实。一般将与PMWS相关的肺病损描述为棕褐色、非塌陷伴小叶间水肿。本研究观察到的肺病损与PCV2感染无关，或者可能已存在第二种肺感染因子。在本研究内容中，％肺病损评分可能不能真实衡量PCV2引起的肺感染量。
其它研究人员已经用IHC证明了PCV2抗原的存在与组织病理学之间直接相关。此研究没有进行对选择组织的组织病理学分析。第1组(16μg vORF2)和第5组(8μgrORF2)PCV2抗原阳性的猪发生率最低(8.3％)，而第9组(严谨性阴性对照组-90.9％)和第8组(攻击对照组-90.0％)的PCV2抗原阳性的猪发生率最高。由于此测试具有非主观性，IHC结果可能是判断疫苗效力依据的最佳参数之一。
因此，本发明一方面是确定了面对PCV2攻击的CDCD猪模型中最小保护剂量(MPD)是含有提取的PCV2 ORF2(rORF2)抗原的1ml/1次剂量的重组产品。在接受不同水平rORF2抗原的三组中，第5组(8μg rORF2抗原)的保护水平显然最高。在所检测的所有参数中，第5组或者具有最佳结果，或者获得了最想要的结果。将第5组与其它六个疫苗组攻击后作比较时，第5组的ADWG最高(0.94±0.22磅/天)，异常行为发生率最低(0％)，咳嗽发生率第二低(8.3％)，总体临床症状发生率最低(8.3％)，死亡率最低(0％)，PCV2鼻排出比率最低(8.3％)，平均％肺病损第二低(0.68±1.15％)，阳性IHC组织的发生率最低(16.7％)。
本发明另一方面是确定了面对PCV2攻击的CDCD猪模型中常规产品MPD是部分纯化的PCV2 ORF2(vORF2)抗原为1ml/1次剂量。在接受不同水平vORF2抗原的三组中，第1组(16μg vORF2)的保护水平最高。就ADWG、平均％肺病损和IHC而言，第1组的表现超过第2组和第3组。第1组和第2组(8μg vORF2抗原)在总体临床症状发生率方面表现相同，第3组(4μg vORF2抗原)的死亡率最低，所有这三组在病毒鼻排出方面表现相同。总之，vORF疫苗的表现不如rORF疫苗好。
本发明又一方面是确定了面对PCV2攻击的CDCD猪模型中2ml/2次剂量常规PCV2死疫苗最大剂量的效果。在本研究评价的七种疫苗中，全细胞PCV2死疫苗的表现最差。接受两次剂量全细胞PCV2死疫苗的小猪ADWG最低，异常行为比率第二高(58.3％)，总体临床症状发生率第二高(58.3％)，死亡率最高(16.7％)，鼻排出发生率第二高(41.7％)，平均％肺病损最高(9.88±29.2％)，观察到的肺病损发生率高(75％)，组织中IHC发生率中等(41.7％)。然而，它可以是引发免疫应答的有效疫苗。
本发明又一方面，PCV2鼻排出被评价为一种效力参数，再次验证先前研究的前述PCV2效力参数。本研究的结果表明，PCV2鼻排出发生在鼻内攻击后，而PCV2疫苗能减少攻击后的PCV2鼻排出。而且，本研究的结果和文献报道表明，在未来的PCV2疫苗试验中，应继续评价IHC。
本研究产生的一些其它结论是：淋巴结病是PMWS的标志之一。PMWS的另外一种标志是淋巴耗尽和产生多个核/巨大的组织细胞。此外，在7种PCV2疫苗中没有观察到不良反应或注射部位反应，所有7种PCV2疫苗给予小猪时看来都是安全的。
实施例5
本实施例检测了八种PCV2候选疫苗的效果，并再次验证了接触PCV2强毒株后得自早先攻击研究的PCV2攻击参数。将一百五十(150)只剖腹产不喝初乳(CDCD)的6-16日龄小猪以体重分区，并随机分成数目相同的10组。表16列出了此实施例的总体研究设计。
表16.总体研究设计
  组别   猪编号   治疗   治疗日   第22天和第28天注射KLH/ICFA   第25天用强毒株PCV2攻击   第46天PRRSVMLV   第50天尸检
  1   15   PVC2疫苗1 16μgrORF2-IMS 1314   0和14   +   +   +   +
  2   15   PVC2疫苗216μgvORF2-卡巴浦尔   0和14   +   +   +   +
  3   15   PCV2疫苗316μgrORF2-卡巴浦尔   0和14   +   +   +   +
  4   15   PCV2疫苗216μgvORF2-卡巴浦尔   0   +   +   +   +
  5   15   PVC2疫苗34μgrORF2-卡巴浦尔   0和14   +   +   +   +
  6   15   PVC2疫苗3 1μgrORF2-卡巴浦尔   0和14   +   +   +   +
  7   15   PVC2疫苗30.25μgrORF2-卡巴浦尔   0和14   +   +   +   +
  8   15   PVC2疫苗4＞8.0logKV-卡巴浦尔   0和14   +   +   +   +
  9   15   攻击对照   N/A   +   +   +   +
  10   15   非严谨性阴性对照组   N/A   +   -   +   +
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；KV或杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
给予各组的疫苗制剂如下：以1×2ml剂量给予第1组的PCV2疫苗1是以IMS 1314为佐剂的高剂量(16μg/2ml剂量)灭活的重组ORF2抗原(16μg rORF2-IMS 1314)。以1×2ml剂量给予第2组的PCV2疫苗2是以卡巴浦尔为佐剂的高剂量(16μg/2ml剂量)部分纯化的VIDO R-1产生的PCV2 ORF2抗原(16μg vORF2-卡巴浦尔)。以1×2ml剂量给予第3组的PCV2疫苗3是以卡巴浦尔为佐剂的高剂量(16μg/2ml剂量)灭活重组ORF2抗原(16μg rORF2-卡巴浦尔)。以1×1ml剂量给予第4组的PCV2疫苗4是以卡巴浦尔为佐剂的高剂量(16μg/1ml剂量)部分纯化的VIDO R-1产生的PCV2 ORF2抗原(16μgvORF2-卡巴浦尔)。以1×2ml剂量给予第5组的疫苗编号5是以卡巴浦尔为佐剂的4μg/2ml剂量的灭活重组ORF2抗原(4μg rORF2-卡巴浦尔)。以1×2ml剂量给予第6组的PCV2疫苗6是以卡巴浦尔为佐剂的1μg/2ml剂量的灭活重组ORF2抗原(1μg rORF2-卡巴浦尔)。以1×2ml剂量给予第7组的PCV2疫苗7是以卡巴浦尔为佐剂的低剂量(0.25μg/2ml剂量)灭活重组ORF2抗原(0.25μg rORF2-卡巴浦尔)。以1×2ml剂量给予第8组的PCV2疫苗8是以卡巴浦尔为佐剂的高剂量(灭活前效价＞8.0 log/2ml剂量)常规灭活的死VIDO R-1产生的PCV2 Struve抗原(＞8.0log KV-卡巴浦尔)。在第0天，用指定疫苗治疗第1-8组。在第14天第1-3组和第5-8组接受其各自疫苗的加强免疫。在第14天对未接受加强免疫的第4组检测单一剂量16μg vORF2-卡巴浦尔的效果。观察小猪在接受两次疫苗接种后有无不良反应和注射部位反应。第21天，将小猪转移到第二研究地点，在此处的一个建筑物中分组饲养第1-9组，而在另一建筑物中单独饲养第10组。所有猪在第22和28天接受不完全弗氏佐剂乳化的钥孔血蓝素(KLH/ICFA)。第25天，用约4 log强毒株PCV2病毒攻击第1-9组。到第46天，攻击对照组死亡的动物非常少。在尝试免疫攻击猪和提高PCV2攻击病毒的毒力时，在第46天用INGELVAC
Figure A20058004774100481
PRRSV MLV(猪生殖和呼吸道疫苗，修饰的活病毒)治疗所有小组。
收集攻击之前和之后的血样，进行PCV2血清学分析。攻击后，收集用于确定平均每日体重增量(ADWG)和观察临床症状的体重数据。第50天，对所有存活的猪处死后进行尸检，记录总病损，对肺进行病理学评分，用福尔马林保存所选组织，用于随后以免疫组织化学(IHC)检测PCV2抗原。
材料和方法
这是在第0天以6-16日龄CDCD猪进行的部分盲法疫苗接种-攻击可行性研究。此研究所包括的母猪PCV2IFA效价应≤1∶1000。此外，母猪的血清学状态得自已知的PRRS-阴性畜群。检测了十六头(16)母猪的PCV2血清学状态，所有这16头(16)母猪的PCV2效价均≤1000，将它们转移到第一研究地点。通过剖腹产手术分娩150只小猪，在试验前3天可用于此研究。在试验前3天，将第一研究地点的150只CDCD猪称重，用耳标签作标记，根据体重分区，随机分配到1-10组，如表16所示。收集所有猪的血样。如果此研究采用了符合标准的任何受试动物但后来因某种原因而排除，则研究者和监测者应进行商议，以确定最终分析中是否采用从该动物收集的数据。记录编入小猪被排除的日期和排除理由。没有排除符合加入标准、选择用于本研究并转移到第一研究地点的母猪。本研究没有排除任何小猪，在终止前没有从研究中去除任何受试动物。表17描述了本实施例中关键事项的时间框图。
表17.研究事项
Figure A20058004774100482
Figure A20058004774100491
存活期研究完成后，病理学家用免疫组织化学(IHC)检测福尔马林固定组织中的PCV2抗原，评价血样的PCV2血清学变化，测定第25天-第50天的平均每日体重增量(ADWG)。
在第一研究地点，在七间猪舍中分笼饲养动物，从出生饲养至大约11日龄(大约是研究的第0天)。各猪舍的设计相同，由层叠的单个不锈钢笼组成，该设计可以将加热和过滤的空气单独供应给各分离单元。各猪舍分别有加热和通风装置，从而防止猪舍之间空气的交叉污染。在第二研究地点，在两个不同的建筑物中饲养动物。在改造的养殖建筑物中单独饲养第10组(严谨性阴性对照组)，在改造的母猪分娩建筑物(farrowing building)中饲养第1-9组。在单独猪圈中饲养各组(每圈14-15头猪)，各猪圈为每头猪提供约3.0平方英尺空间。第2、4和8组圈养在走道一侧的三个相邻猪圈中，第1、3、5、6、7和9组圈养在走道另一侧的六个相邻猪圈中。由于研究监测者的关心，将各组间分隔开，给予第2、4和8组的疫苗没有完全灭活。各猪圈位于具有塑料漏缝地板的高架平台上。猪圈下的地坑用作粪便和废物的储存罐。各建筑物具有其自身独立的加热和通风系统，建筑物之间空气交叉污染的可能性很小。
在第一研究地点，从出生至约3周龄，给小猪饲喂特制的奶饲料。到第19天(约41/2周龄)，所有小猪都进食特制的固体混合饲料。在第二研究地点，随意给所有小猪饲喂适合其年龄和体重的定制不含药物的市售混合饲料。在两个研究地点，可随意饮水。
在第19、20和21天用1.0mL NAXCEL
Figure A20058004774100501
IM治疗所有受试猪，两侧臀部交替注射。此外，第10天用0.5m LNAXCELIM治疗11号猪(第1组)，第10天用1mL青霉素和1mL PREDEF
Figure A20058004774100503
2X治疗13号猪(第1组0)，第11天用1.0mL NAXCEL
Figure A20058004774100504
IM治疗4号猪(第9组)，第14天因为各种健康原因用1.0mL NAXCEL分别治疗1号猪(第1组)、4号猪和11号猪。
在两处研究地点，猪都处在兽医照料下。在试验前3天进行动物体检，将结果记录于体检记录表中。通过第0天的观察确定，所有动物在疫苗接种前健康和营养状况良好。攻击前观察到所有受试动物的健康和营养状况良好。以归还(rendering)治疗畜体和组织。在动物治疗记录上记载研究动物的最终治疗。
第0天和第14天，分配到第1-3和5-8组的猪分别接受2.0mL指定的PCV2疫苗1-4，分别用无菌3.0mL Luer-lock注射器和无菌20g×1/2″针头将其IM注射于右侧和左侧颈部。分配到第4组的猪仅在第0天接受1.0mL PCV2疫苗2，用无菌3.0mLLuer-lock注射器和无菌20g×1/2″针头将其IM注射在右侧颈部。
第22天，所有受试猪接受2.0mL KLH/ICFA，用无菌3.0mL Luer-lock注射器和无菌20g×1″针头将其IM注射在左侧颈部。第28天，所有受试猪接受2.0mLKLH/ICFA，用无菌3.0mL Luer-lock注射器和无菌20g×1″针头将其IM注射在右侧臀部。
第25天，分配到第1-9组的猪接受1.0mL PCV2ISUVDL攻击病毒株(3.98 log10TCID50/mL)，用无菌3.0mL Luer-lock注射器和无菌20g×1″针头将其IM注射在右侧颈部。用无菌3.0mL Luer-lock注射器和鼻导管将另外1.0mL同一病毒株IN给予各头猪(每鼻孔0.5mL)。
第46天，所有受试猪都接受2.0mL INGELVACPRRS MLV，用无菌3.0mLLuer-lock注射器和无菌20g×1″针头将其IM注射在右侧颈部。给予PRRSV MLV是为了试图提高PCV2攻击病毒株的毒力。
在试验前3天和第0天至第21天每日观察受试猪的总体健康状况和不良反应。对各头猪的正常或异常行为、呼吸或咳嗽进行评分。在临床观察记录上记录观察结果。自第0天至第7天观察所有受试猪，还观察第7组第14-21天的注射部位反应。在试验前3天、第25天和第50天，或在攻击后发现猪死亡的那天用校准天平称取各猪的体重，确定平均每日体重增量。在体重表上记录体重。利用试验前3天的体重将猪分区，然后随机分组。利用第25天和第50天的体重数据确定这些时间点期间各猪的平均每日体重增量(ADWG)。对于攻击后和第50天前死亡的猪，调整ADWG，以代表第25天至死亡日的ADWG。
为了测定PCV2血清学变化，在试验前3天和第14天，从各小猪的眼窝静脉窦收集静脉全血。对于各小猪，通过将无菌毛细管插入一只眼睛的内眼角并将大约3.0mL全血放入4.0mL血清分离管(SST)中，从眼窝静脉窦收集血液。在第25、32和50天，用无菌20g×11/2″Vacutainer
Figure A20058004774100511
针头(Becton Dickinson & Company，FranklinLakes，新泽西州)、Vacutainer
Figure A20058004774100512
针托和13mL SST从上腔静脉收集各猪的静脉全血。在样品收集记录上记录各时间点的血液收集。使各SST中的血液凝结，然后，离心各SST，收获血清。将收获的血清转移到无菌有盖试管(snap tube)中，储存于-70±10℃，直到将来进行测试。由BIVI-R & D职员检测血清样品中是否存在PCV2抗体。
在第22天至第50天每天观察一次猪的临床症状，并对正常或异常行为、呼吸或咳嗽进行评分。在临床观察记录上记录临床观察结果。
46号猪(第1组)和98号猪(第9组)在第一研究地点死亡。二者死亡都被归类为出血性死亡，没有对这两头猪进行尸检。在第二研究地点，对攻击后和第50天之前死亡的猪和第50天实施安乐死的猪进行尸检。观察有无任何总病损发生，在尸检报告表上记录有病损的肺叶百分数。
将第二研究地点尸检的各头猪的扁桃腺、肺、心脏和肠系膜淋巴结的组织样品放入一个装有10％缓冲福尔马林液的容器中；同时将上述同一器官的另一份组织样品放入Whirl-pak
Figure A20058004774100513
(M-Tech Diagnostics Ltd.，Thelwall，UK)中，将各Whirl-pak置于冰上。适当地标记各容器。在尸检报告表上记录样品收集。然后，对福尔马林固定的组织样品和诊断请求表进行IHC测试。按照接受样品、制备样品和玻片以及染色技术的标准实验室步骤进行IHC测试。用冰盒将Whirl-paks
Figure A20058004774100515
中的新鲜组织运输到研究检测处储存(-70±10℃)待用。
病理学家用IHC检测福尔马林固定组织中的PCV2，并用以下评分系统评分：0＝无；1＝少量阳性染色，几个位点；2＝中等阳性染色，多个位点；3＝大量阳性染色，散布于整个组织中。出于分析目的，评分为0认为是“阴性”，评分大于0认为是“阳性”。
结果
本实施例的结果见下。应注意，46和98号猪分别在第14天和第25天死亡。这些死亡归类为出血性死亡。第15天11号猪(第1组)气喘伴呼吸急促。另外，在此观察期间所有猪的行为、呼吸和咳嗽都正常，在任何小组中都没有观察到全身不良反应。第0天接种疫苗后没有观察到注射部位反应。第14天接种疫苗后，第15天第1组14头猪中7头(50.0％)发生肿胀，评分为“2”。第1组14头猪中4头(28.6％)在第16天仍然肿胀，评分为“2”。其他组在疫苗接种后没有发生注射部位反应。
平均每日体重增量(ADWG)结果见表18。将死于出血的46和98号猪排除在小组结果之外。接受一个剂量16μg vORF2-卡巴浦尔的第4组的ADWG最高(1.16±0.26磅/天)，其次是ADWG范围在1.07±0.23磅/天至1.11±0.26磅/天的第1、2、3、5、6和10组。第9组的ADWG最低(0.88±0.29磅/天)，其次是ADWG分别为0.93±0.33磅/天和0.99±0.44磅/天的第8组和第7组。
表18.组间平均每日体重增量(ADWG)的小结
  组别   治疗   N   ADWG-磅/天(第25天-第50天)或根据第50天前死亡的猪进行调整
  1   rORF2-16μg-IMS 13142次剂量   14   1.08±0.30磅/天
  2   vORF2-16μg-卡巴浦尔2次剂量   15   1.11±0.16磅/天
  3   rORF2-16μg-卡巴浦尔2次剂量   15   1.07±0.21磅/天
  4   vORF2-16μg-卡巴浦尔1次剂量   15   1.16±0.26磅/天
  5   rORF2-4μg-卡巴浦尔1次剂量   15   1.07±0.26磅/天
  6   rORF2-1μg-卡巴浦尔2次剂量   15   1.11±0.26磅/天
  7   rORF2-0.25μg-卡巴浦尔2次剂量   15   0.99±0.44磅/天
  8   KV＞8.0log-卡巴浦尔2次剂量   15   0.93±0.33磅/天
  9   攻击对照   14   0.88±0.29磅/天
  10   严谨性阴性对照   15   1.07±0.23磅/天
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；KV或杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
PCV2血清学结果见下表19。在试验前3天所有十组都是PCV2血清阴性。第14天，所有十组的PCV2效价仍然很低(范围是50-113)。第25天，接受全细胞病毒死疫苗的第8组PCV2效价最高(4617)，其次是接受16μg vORF2-卡巴浦尔的第2组，接受一次剂量16μg vORF2-卡巴浦尔的第4组和接受16μg rORF2-卡巴浦尔的第3组，其效价分别为2507、1920和1503。第32天(攻击一周后)，第1-6组和第8组的效价为2360-7619；而第7组(0.25μg rORF2-卡巴浦尔)、第9组(攻击对照)和第10组(严谨性阴性对照)的效价分别为382、129和78。第50天(尸检日)，所有十组都显示出PCV2高效价(≥1257)。
第25、32和50天，接受两次剂量16μg rORF2-卡巴浦尔的第3组的抗体效价高于接受两次剂量16μg rORF2-IMS 1314的第1组。第25、32和50天，接受两次剂量16μg vORF2的第2组的抗体效价高于仅接受一次剂量同一疫苗的第4组。分别接受16、4、1和0.25μg 水平递减的rORF2-卡巴浦尔的第3、5、6、7组，在第25天和第32天显示出相应地递减的抗体效价。
表19.组间PCV2 IFA效价的小结
组别 治疗 试验前3天   第14天**   第25天*** 第32天   第50天****
  1   rORF2-16μg-IMS 13142次剂量   50   64   646   3326   4314
  2   vORF2-16μg-卡巴浦尔2次剂量   50   110   2507   5627   4005
  3   rORF2-16μg-卡巴浦尔2次剂量   50   80   1503   5120   6720
  4   vORF2-16μg-卡巴浦尔1次剂量   50   113   1920   3720   1257
  5   rORF2-4μg-卡巴浦尔1次剂量   50   61   1867   3933   4533
  6   rORF2-1μg-卡巴浦尔2次剂量   50   70   490   2360   5740
  7   rORF2-0.25μg-卡巴浦尔2次剂量   50   73   63   382   5819
  8   KV＞8.0 log-卡巴浦尔2次剂量   50   97   4617   7619   10817
  9   攻击对照   50   53   50   129   4288
  10   严谨性阴性对照   50   50   50   78   11205
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；KV或杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
*出于计算目的，将IFA效价≤100指定为效价″50″；将IFA效价≥6400指定为效价“12,800″。
**攻击日
***尸检日
攻击后临床观察结果见下。表20包括对异常行为、异常呼吸、咳嗽和腹泻的观察。表21包括组间临床症状总体发生率的小结结果，表22包括攻击后组间死亡率的小结结果。对于接受16μg rORF2-IMS 1314(第1组)、16μg rORF2-卡巴浦尔(第3组)、1μg rORF2-卡巴浦尔(第6组)、0.25μg rORF2-卡巴浦尔(第7组)的猪和攻击对照组(第9组)的猪，攻击后异常行为、呼吸和咳嗽的发生率低。接受16μg vORF2-卡巴浦尔(第2组)、一次剂量16μg vORF2-卡巴浦尔(第4组)、4μg rORF2-卡巴浦尔(第5组)、＞8log KV-卡巴浦尔(第8组)的猪和严谨性阴性对照组(第10组)的猪的攻击后异常行为、呼吸和咳嗽的发生率为零。
临床症状总体发生率因组而异。接受16μg vORF2-卡巴浦尔(第2组)、一次剂量16μg vORF2-卡巴浦尔(第4组)的猪和严谨性阴性对照组(第10组)的猪发生率为0％；接受16μg rORF2-卡巴浦尔(第3组)和1μg rORF2-卡巴浦尔(第6组)的猪发生率为6.7％；接受16μg rORF2-IMS 1314(第1组)的猪总体发生率为7.1％；接受4μgrORF2-卡巴浦尔(第5组)、0.25μg rORF2-卡巴浦尔(第7组)和＞8log KV疫苗的猪发生率为13.3％；攻击对照组(第9组)的猪的发生率为14.3％。
总体死亡率也因组而异。接受2次剂量KV疫苗的第8组死亡率最高，为20.0％；其次是攻击对照组第9组和接受0.25μg rORF2-卡巴浦尔的第7组，其死亡率分别为14.3％和13.3％。接受1次剂量16μg vORF2-卡巴浦尔的第4组的死亡率为6.7％。所有其它组，即第1、2、3、5、6和10组的死亡率为0％。
表20.攻击后组间异常行为、异常呼吸和咳嗽的观察结果小结
Figure A20058004774100541
1各组中显示有任何异常行为至少一天的猪总数
2各组中显示有任何异常呼吸至少一天的猪总数
3各组中显示有咳嗽至少一天的猪总数
表21.攻击后组间临床症状总体发生率的小结
  组别   治疗   N   发生临床症状的猪数目1   发生率
  1   rORF2-16μg-IMS 13142次剂量   14   1   7.1％
  2   vORF2-16μg-卡巴浦尔2次剂量   15   0   0.0％
  3   rORF2-16μg-卡巴浦尔2次剂量   15   1   6.7％
  4   vORF2-16μg-卡巴浦尔1次剂量   15   0   0.0％
  5   rORF2-4μg-卡巴浦尔1次剂量   15   2   13.3％
  6   rORF2-1μg-卡巴浦尔2次剂量   15   1   6.7％
  7   rORF2-0.25μg-卡巴浦尔2次剂量   15   2   13.3％
  8   KV＞8.0log-卡巴浦尔2次剂量   15   2   13.3％
  9   攻击对照   14   2   14.3％
  10   严谨性阴性对照   15   0   0.0％
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；KV或杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
1各组中显示有任何临床症状至少一天的猪总数
表22.攻击后组间死亡率的小结
Figure A20058004774100542
  4   vORF2-16μg-卡巴浦尔1次剂量   15   1   6.7％
  5   rORF2-4μg-卡巴浦尔1次剂量   15   0   0.0％
  6   rORF2-1μg-卡巴浦尔2次剂量   15   0   0.0％
  7   rORF2-0.25μg-卡巴浦尔2次剂量   15   2   13.3％
  8   KV＞8.0log-卡巴浦尔2次剂量   15   3   20.0％
  9   攻击对照   14   2   14.3％
  10   严谨性阴性对照   15   0   0.0％
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；KV或杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
组间平均肺病损百分数和推测诊断的小结见下表23。攻击对照组第9组的肺病损百分数最高，其平均值为10.81±23.27％，其次是接受0.25μg rORF2-卡巴浦尔的第7组，其平均值为6.57±24.74％，接受4μg rORF2-卡巴浦尔的第5组，其平均值为2.88±8.88％，接受KV疫苗的第8组，其平均值为2.01±4.98％。其余六组的平均肺病损百分数较低，范围是0.11±0.38％至0.90±0.15％。
推测诊断为肺炎因组而异。接受两次剂量16μg rORF2-卡巴浦尔的第3组推测诊断为肺炎的最低，为13.3％。攻击对照组第9组50％推测诊断为肺炎，其次是严谨性阴性对照组第10组和接受两次剂量16μg vORF2-卡巴浦尔的第2组，分别有46.7％和40％推测诊断为肺炎。
第1、2、3、5、9和10组中被推测诊断为PCV2感染的占0％；而接受两次剂量KV疫苗的第8组中推测诊断为PCV2感染的比率最高，为20％。接受两次剂量0.25μg rORF2-卡巴浦尔的第7组和接受一次剂量16μg vORF2-卡巴浦尔的第4组中推测诊断为PCV2感染的分别占各组的13.3％和6.7％。
仅有第7组的一头猪(6.7％)诊断为胃溃疡；而另外9组都没有胃溃疡。
表23.组间平均％肺病损和推测诊断的小结
  组别   治疗   N   排出病毒至少一天的猪数目   发生率
  1   rORF2-16μg-IMS 13142次剂量   15   0   0％
  2   vORF2-16μg-卡巴浦尔2次剂量   15   1   6.7％
  3   rORF2-16μg-卡巴浦尔2次剂量   15   3   20.0％
  4   vORF2-16μg-卡巴浦尔1次剂量   15   2   13.3％
  5   rORF2-4μg-卡巴浦尔1次剂量   15   3   20.0％
  6   rORF2-1μg-卡巴浦尔2次剂量   15   6   40.0％
  7   rORF2-0.25μg-卡巴浦尔2次剂量   15   7   46.7％
  8   KV＞8.0log-卡巴浦尔2次剂量   15   12   80％
  9   攻击对照   14   14   100.0％
  10   严谨性阴性对照   15   14   93.3％
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；KV或杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
组间IHC阳性发生率结果的小结见下表24。第1组(16μg rORF2-IMS 1314)的IHC阳性结果比率最低，其中0％的猪为PCV2阳性，其次是第2组(16μg vORF2-卡巴浦尔)和第4组(一次剂量的16μg vORF2-卡巴浦尔)，它们的IHC比率分别为6.7％和13.3％。攻击对照组第9组的IHC阳性发生率最高，其中100％的猪为PCV2阳性，其次是严谨性阴性对照组第10组和第8组(KV疫苗)，分别有93.3％和80％的猪为PCV2阳性。
表24.组间IHC阳性发生率小结
  组别   治疗   N   排出病毒至少1天的猪数目   发生率
  1   rORF2-16μg-IMS 13142次剂量   15   0   0％
  2   vORF2-16μg-卡巴浦尔2次剂量   15   1   6.7％
  3   rORF2-16μg-卡巴浦尔2次剂量   15   3   20.0％
  4   vORF2-16μg-卡巴浦尔1次剂量   15   2   13.3％
  5   rORF2-4μg-卡巴浦尔1次剂量   15   3   20.0％
  6   rORF2-1μg-卡巴浦尔2次剂量   15   6   40.0％
  7   rORF2-0.25μg-卡巴浦尔2次剂量   15   7   46.7％
  8   KV＞8.0log-卡巴浦尔2次剂量   15   12   80％
  9   攻击对照   14   14   100.0％
  10   严谨性阴性对照   15   14   93.3％
vORF2＝分离的病毒ORF2；rORF2＝重组杆状病毒表达的ORF2；KV或杀死的全细胞病毒＝在合适细胞培养物中培养的PCV2病毒
讨论
在本实施例中评价了七种PCV2疫苗，包括以IMS 1314为佐剂的高剂量(16μg)rORF2抗原给予两次，以卡巴浦尔为佐剂的高剂量(16μg)vORF2抗原给予一组猪一次、给予第二组猪两次，以卡巴浦尔为佐剂的高剂量(16μg)rORF2抗原给予两次，以卡巴浦尔为佐剂的4μg剂量的rORF2抗原给予两次，以卡巴浦尔为佐剂的1μg剂量的rORF2抗原给予两次，以卡巴浦尔为佐剂的低剂量(0.25μg)rORF2抗原给予两次，和以卡巴浦尔为佐剂的高剂量(＞8log)全细胞PCV2死疫苗。总体来看，接受两次剂量16μg rORF2-IMS 1314的第1组表现略好于接受含卡巴浦尔佐剂的不同水平vORF2或rORF2抗原的疫苗的第2-7组，比接受两次剂量的全细胞PCV2死疫苗的第8组好得多。第1组的ADWG第三高(1.80±0.30磅/天)，异常行为发生率最低(0％)，异常呼吸发生率最低(0％)，咳嗽发生率低(7.1％)，总体临床症状发生率低(7.1％)，死亡率最低(0％)(与另外三组一致)，平均％肺病损比率第二低(0.15±0.34％)，肺炎比率第二低(21.4％)，阳性IHC组织发生率最低(0％)。然而，第1组是观察到有注射部位反应的唯一一组，包括在第二次免疫接种1天后有50％接种者有注射部位反应。给予第2-7组其它疫苗的表现优于死疫苗，与给予第1组的疫苗几乎同样好。
在所有疫苗组中，接受两次剂量的以卡巴浦尔为佐剂的PCV2死疫苗的第8组结果最差。第8组的ADWG最低(0.93±0.33磅/天)，异常行为比率第二高(6.7％)，异常呼吸比率最高(6.7％)，总体临床症状发生率最高(13.3％)(与另外三组一致)，在所有组中死亡率最高(20％)，在所有疫苗组中阳性IHC比率最高(80％)。要关注的是，全细胞PCV2死疫苗在给予第8组之前可能未完全灭活，这可以解释该组的结果为何差。不幸的是，未能获得明确数据来证实这种考虑。总之，在本实施例内容中，常规PCV2死疫苗不能帮助减轻PCV2相关性疾病。
如前所述，没有与测试疫苗相关的不良反应，除了以IMS 1314为佐剂的疫苗外。用IMS 1314配制的疫苗第二次接种1天后，在50.0％猪中观察到有注射部位反应，第二次接种2天后，在28.6％猪中观察到有注射部位反应。在接受以卡巴浦尔为佐剂的疫苗的任何猪中都没有观察到这种反应。包括用以IMS 1314为佐剂的疫苗接种猪的进一步研究应该继续严密监测猪的注射部位反应。
试验前3天，所有猪都是PCV2血清阴性，第14天仅第2组的效价大于100。第25天(攻击日)，第8组的PCV2抗体效价最高(4619)，其次是第2组(2507)。除第7、9和10组外，所有组到第32天都显示了强烈的抗体应答。到第50天，包括第7、9和10组在内的所有组都显示了强烈的抗体应答。
晚期PCV2感染和随后发生PMWS的标志之一是断奶猪的生长阻滞，在严重的情况下，观察到体重下降。各组的平均每日体重增量是证明生长阻滞或体重下降的定量方法。本实施例中，组间ADWG没有大的差异。第8组的ADWG最低，为0.88±0.29磅/天，而第4组的ADWG最高，为1.16±0.26磅/天。在本研究内容中，各组间没有足够的差异(显示)将来的疫苗效力判断可以ADWG为基础。
除了体重下降以外，呼吸困难、嗜睡、皮肤苍白，有时还有黄疸都是PMWS相关的临床症状。本实施例中，各组未经常观察到异常行为和异常呼吸和咳嗽。如本研究所证明的那样，此攻击模型和攻击毒株不导致压倒性临床症状，故这不是作为疫苗效力基础的主要参数。
总体来看，本实施例中死亡率不高，攻击对照组死亡率不高使此参数作为疫苗效力(判断)基础受到限制。在第46天之前，第4组和第7组的15头猪中，各有一头猪死亡，第9组的15头猪中有两头死亡，第8组的15头猪中有三头死亡。由于攻击对照组第9组并未显示PCV2临床症状到第46天该组仅有两头死亡，所以在第46天将猪呼吸和生殖道综合征病毒(PRRSV)MLV疫苗给予所有猪。较早的研究利用INGELVAC
Figure A20058004774100571
PRRS MLV作为免疫刺激剂来引发PCV2-相关性PMWS疾病，故这些早期研究中死亡率较高。第46天给予PRRS疫苗后不久，发生两例死亡：第46天第4组中一头死亡，第47天第7组中一头死亡，这些死亡可能与给予PRRS疫苗无关。到第50天，接受两次剂量死疫苗的第8组死亡率最高(20％)，其次是第9组(攻击对照)和第7组(0.25μg rORF2-卡巴浦尔)，死亡率分别为14.3％和13.3％。总体来看，在本实施例的攻击后观察期的晚期将PRRS疫苗给予该攻击模型不显著提高死亡率。
PCV2感染后继发PMWS的猪总病损通常包括全身性淋巴结病与以下一种或多种疾病：(1)间质性肺炎伴有小叶间水肿、(2)皮肤苍白或黄疸、(3)斑点状肝萎缩、(4)胃溃疡和(5)肾炎。但尸检时(第50天)，在任何小组中都没有观察到黄疸、肝炎和肾炎。第7组一头猪观察到胃溃疡，但没有专门检查淋巴结病。根据存在与PCV2感染相符的病损，三组中至少有一头猪推测诊断有PCV2(PMWS)感染。接受两次剂量死疫苗的第8组有20％推测诊断有PCV2感染，而第7组和第4组分别有13.3％和6.7％推测诊断有PCV2感染。尸检时平均％肺病损评分因组而异。第1、2、3、4、6和10组的％肺病损评分低，范围是0.11±0.38％至0.90±0.15％。不出所料，攻击对照组第9组的平均％肺病损评分最高(10.81±23.27％)。在这四组中，由于各组中有1-3头猪的肺病损评分非常高，所以提高了平均％肺病损评分。这种肺病损是红色/紫色和紧实的。一般将与PMWS相关的肺病损描述为棕褐色、非塌陷伴小叶间水肿。本研究观察到的肺病损与PCV2感染无关，或者可能已存在第二种肺感染因子。在本研究内容中，％肺病损评分可能不能真实衡量PCV2引起的肺感染量。同样，也可能过度利用了肺炎的推测诊断。用患有肺炎的推测诊断列出了发生肺病损(一些发生率少至0.10％)的猪。本实施例中，就作为疫苗效力判断基础的总病损率和％肺病损而言，各组之间没有足够差异。
IHC结果显示各组之间有最大差异。第1组(16μg rORF2-IMS 1314)的PCV2抗原阳性IHC结果最低(0％)；而第9组和第10组的阳性IHC结果最高，发生率分别为100％和93.3％。分别接受以卡巴浦尔为佐剂的16、4、1或0.25μg rORF2抗原的第3、5、6和7组IHC阳性比率分别为20％、20％、40％和46.7％。接受两次剂量的以卡巴浦尔为佐剂的16μg vORF2的第2组IHC阳性比率为6.7％，仅接受一次剂量同一疫苗的第4组IHC阳性比率为13.3％。事实上，由于此测试具有客观性以及IHC结果与预计结果相关，故IHC检测可能是作为疫苗效力判断基础的最佳参数之一。
因此，本发明一方面是确定了面对PCV2攻击的CDCD猪模型中以卡巴浦尔为佐剂的PCV2 rORF2抗原的最小保护剂量(MPD)。第3、5、6和7组各自接受两次剂量的以卡巴浦尔为佐剂的rORF2抗原，但rORF2抗原水平因组而异。第3、5、6和7组分别各自接受16、4、1或0.25μg rORF2抗原。通常，降低rORF2抗原水平会降低PCV2抗体效价，而提高死亡率、平均％肺病损和IHC阳性组织发生率。在接受不同水平rORF2-卡巴浦尔的四组中，分别接受两次剂量的16或4μg rORF2抗原的第3组和第5组各自的IHC阳性比率仅为20％，各自的抗体效价相似。总体来看，根据IHC阳性结果，给予两次rORF2抗原时最小保护剂量约为4μg。
本发明另一方面评价了重组(rORF2)和VIDO R-1(vORF2)PCV2抗原的抗原性。第2组接受两次剂量16μg vORF2，第3组接受两次剂量16μg rORF2。这两种疫苗皆以卡巴浦尔为佐剂。发现这两种疫苗是安全的，死亡率为0％。第25天第2组的PCV2抗体效价为2507，而第3组的PCV2抗体效价为1503。第3组的平均％肺病损评分低于第2组(0.11±0.38％与0.90±0.15％)，但第2组的IHC阳性发生率低于第3组(6.7％与20％)。总之，两种疫苗的抗原性相似，但vORF2所伴有的IHC结果略好。
本发明又一方面测定了两种不同佐剂(卡巴浦尔和IMS 1314)的合适性。第1组和第3组都接受两次剂量16μg rORF2抗原的疫苗，但第1组接受以IMS 1314为佐剂的抗原，而第3组接受以卡巴浦尔为佐剂的抗原。两组的ADWG基本相同，攻击后临床症状发生率基本相同，死亡率相同，平均％肺病损基本相同；但第1组的IHC阳性比率为0％，而第3组的IHC阳性比率为20％。然而，第25、32和50天，接受以卡巴浦尔为佐剂的抗原的第3组的IFAT PCV2效价高于接受以IMS 1314为佐剂的抗原的第1组。总体来看，虽然以IMS 1314为佐剂的PCV2疫苗提供较佳的IHC结果，但对PCV2感染提供的保护力并非显著更好，而且诱导注射部位反应。而以卡巴浦尔为佐剂的PCV2疫苗表现几乎与以IMS 1314为佐剂的疫苗一样，但不伴有任何不良反应。
在本发明的又一方面，确定了PCV2 ORF2的1个剂量为1ml产品的可行性。在第0天，第2组和第4组都接受以卡巴浦尔为佐剂的16μg vORF2疫苗，但第14天，第2组接受第二个剂量。与第2组相比，第4组的ADWG略高、平均％肺病损较低，但在第25、32和50天第2组的IFAT PCV2效价较高，IHC阳性组织发生率略低。这两组的所有其它结果都相似。总之，以卡巴浦尔为佐剂的一次剂量的vORF2的表现与同一疫苗两次剂量相似。
序列表
<110>Eichmeyer，Mark
     Nitzel，Greg
     Schaeffer，Merrill
<120>PCV2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法
<130>34816-CIP1
<140>未知
<141>2005-01-10
<150>未知
<151>2004-12-30
<160>11
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>8
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>这是修饰的Kozak序列。
<400>1
ccgccatg                                     8
<210>2
<211>6
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>这是重组EcoR1序列。
<400>2
gaattc                                       6
<210>3
<211>713
<212>DNA
<213>猪圆环病毒
<400>3
cagctatgac gtatccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc     60
ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga    120
gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtggaga    180
aggaaaaatg gcatcttcaa cacccgcctc tcccgcacct tcggatatac tgtgacgact    240
ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa    300
gaaaggttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg    360
gctccactgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ggccacagcc ctaacctatg    420
acccatatgt aaactactcc tcccgccata caatccccca acccttctcc taccactccc    480
gttacttcac acccaaacct gttcttgact ccactattga ttacttccaa ccaaataaca    540
aaaggaatca gctttggctg aggctacaaa cctctagaaa tgtggaccac gtaggcctcg    600
gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa tatccgtgta accatgtatg    660
tacaattcag agaatttaat cttaaagacc ccccacttaa accctaaatg aat           713
<210>4
<211>713
<212>DNA
<213>猪圆环病毒
<400>4
ccgccatgac gtatccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc     60
ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga    120
gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtcaagg    180
ctaccacagt cacaacgccc tcctgggcgg tggacatgat gagatttaat attgacgact    240
ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa    300
gaaaggttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg    360
gctccactgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ggccacagcc ctaacctatg    420
acccatatgt aaactactcc tcccgccata caatccccca acccttctcc taccactccc    480
gttacttcac acccaaacct gttcttgact ccactattga ttacttccaa ccaaataaca    540
aaaggaatca gctttggctg aggctacaaa cctctagaaa tgtggaccac gtaggcctcg    600
gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa tatccgtgta accatgtatg    660
tacaattcag agaatttaat cttaaagacc ccccacttga accctaagaa ttc           713
<210>5
<211>233
<212>PRT
<213>猪圆环病毒
<400>5
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1               5                   10                  15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
            20                  25                  30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
        35                  40                  45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr
    50                  55                  60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val
65                  70                  75                  80
Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr
                85                  90                  95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
            100                 105                 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
        115                 120                 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
    130                 135                 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
                165                 170                 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn
            180                 185                 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp
        195                 200                 205
Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
    210                 215                 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro
225                 230
<210>6
<211>233
<212>PRT
<213>猪圆环病毒
<400>6
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1               5                   10                  15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
            20                  25                  30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
        35                  40                  45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr
    50                  55                  60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val
65                  70                  75                  80
Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr
                85                  90                  95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
            100                 105                 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
        115                 120                 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
    130                 135                 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
                165                 170                 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn
            180                 185                 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp
        195                 200                 205
Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
    210                 215                 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Glu Pro
225                 230
<210>7
<211>756
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>此序列得自2型猪圆环病毒开放阅读框2，一部分得自pGEM T-easy载体。
<400>7
gcggccgcgg gaattcgatc cgccatgacg tatccaagga ggcgttaccg cagaagaaga     60
caccgccccc gcagccatct tggccagatc ctccgccgcc gcccctggct cgtccacccc    120
cgccaccgct accgttggag aaggaaaaat ggcatcttca acacccgcct ctcccgcacc    180
ttcggatata ctgtcaaggc taccacagtc acaacgccct cctgggcggt ggacatgatg    240
agatttaata ttgacgactt tgttcccccg ggagggggga ccaacaaaat ctctataccc    300
tttgaatact acagaataag aaaggttaag gttgaattct ggccctgctc ccccatcacc    360
cagggtgata ggggagtggg ctccactgct gttattctag atgataactt tgtaacaaag    420
gccacagccc taacctatga cccatatgta aactactcct cccgccatac aatcccccaa    480
cccttctcct accactcccg ttacttcaca cccaaacctg ttcttgactc cactattgat    540
tacttccaac caaataacaa aaggaatcag ctttggctga ggctacaaac ctctagaaat    600
gtggaccacg taggcctcgg cactgcgttc gaaaacagta aatacgacca ggactacaat    660
atccgtgtaa ccatgtatgt acaattcaga gaatttaatc ttaaagaccc cccacttgaa    720
ccctaagaat tctatcacta gtgaattcgc ggccgc                              756
<210>8
<211>10387
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>这是2型猪圆环病毒ORF2构建物，它包括杆状病毒和pGEM T-easy编码序列。
<400>8
aagctttact cgtaaagcga gttgaaggat catatttagt tgcgtttatg agataagatt     60
gaaagcacgt gtaaaatgtt tcccgcgcgt tggcacaact atttacaatg cggccaagtt    120
ataaaagatt ctaatctgat atgttttaaa acacctttgc ggcccgagtt gtttgcgtac    180
gtgactagcg aagaagatgt gtggaccgca gaacagatag taaaacaaaa ccctagtatt    240
ggagcaataa tcgatttaac caacacgtct aaatattatg atggtgtgca ttttttgcgg    300
gcgggcctgt tatacaaaaa aattcaagta cctggccaga ctttgccgcc tgaaagcata    360
gttcaagaat ttattgacac ggtaaaagaa tttacagaaa agtgtcccgg catgttggtg    420
ggcgtgcact gcacacacgg tattaatcgc accggttaca tggtgtgcag atatttaatg    480
cacaccctgg gtattgcgcc gcaggaagcc atagatagat tcgaaaaagc cagaggtcac    540
aaaattgaaa gacaaaatta cgttcaagat ttattaattt aattaatatt atttgcattc    600
tttaacaaat actttatcct attttcaaat tgttgcgctt cttccagcga accaaaacta    660
tgcttcgctt gctccgttta gcttgtagcc gatcagtggc gttgttccaa tcgacggtag    720
gattaggccg gatattctcc accacaatgt tggcaacgtt gatgttacgt ttatgctttt    780
ggttttccac gtacgtcttt tggccggtaa tagccgtaaa cgtagtgccg tcgcgcgtca    840
cgcacaacac cggatgtttg cgcttgtccg cggggtattg aaccgcgcga tccgacaaat    900
ccaccacttt ggcaactaaa tcggtgacct gcgcgtcttt tttctgcatt atttcgtctt    960
tcttttgcat ggtttcctgg aagccggtgt acatgcggtt tagatcagtc atgacgcgcg   1020
tgacctgcaa atctttggcc tcgatctgct tgtccttgat ggcaacgatg cgttcaataa   1080
actcttgttt tttaacaagt tcctcggttt tttgcgccac caccgcttgc agcgcgtttg   1140
tgtgctcggt gaatgtcgca atcagcttag tcaccaactg tttgctctcc tcctcccgtt   1200
gtttgatcgc gggatcgtac ttgccggtgc agagcacttg aggaattact tcttctaaaa   1260
gccattcttg taattctatg gcgtaaggca atttggactt cataatcagc tgaatcacgc   1320
cggatttagt aatgagcact gtatgcggct gcaaatacag cgggtcgccc cttttcacga   1380
cgctgttaga ggtagggccc ccattttgga tggtctgctc aaataacgat ttgtatttat   1440
tgtctacatg aacacgtata gctttatcac aaactgtata ttttaaactg ttagcgacgt   1500
ccttggccac gaaccggacc tgttggtcgc gctctagcac gtaccgcagg ttgaacgtat   1560
cttctccaaa tttaaattct ccaattttaa cgcgagccat tttgatacac gtgtgtcgat   1620
tttgcaacaa ctattgtttt ttaacgcaaa ctaaacttat tgtggtaagc aataattaaa   1680
tatgggggaa catgcgccgc tacaacactc gtcgttatga acgcagacgg cgccggtctc   1740
ggcgcaagcg gctaaaacgt gttgcgcgtt caacgcggca aacatcgcaa aagccaatag   1800
tacagttttg atttgcatat taacggcgat tttttaaatt atcttattta ataaatagtt   1860
atgacgccta caactccccg cccgcgttga ctcgctgcac ctcgagcagt tcgttgacgc   1920
cttcctccgt gtggccgaac acgtcgagcg ggtggtcgat gaccagcggc gtgccgcacg   1980
cgacgcacaa gtatctgtac accgaatgat cgtcgggcga aggcacgtcg gcctccaagt   2040
ggcaatattg gcaaattcga aaatatatac agttgggttg tttgcgcata tctatcgtgg   2100
cgttgggcat gtacgtccga acgttgattt gcatgcaagc cgaaattaaa tcattgcgat   2160
tagtgcgatt aaaacgttgt acatcctcgc ttttaatcat gccgtcgatt aaatcgcgca   2220
atcgagtcaa gtgatcaaag tgtggaataa tgttttcttt gtattcccga gtcaagcgca   2280
gcgcgtattt taacaaacta gccatcttgt aagttagttt catttaatgc aactttatcc   2340
aataatatat tatgtatcgc acgtcaagaa ttaacaatgc gcccgttgtc gcatctcaac   2400
acgactatga tagagatcaa ataaagcgcg aattaaatag cttgcgacgc aacgtgcacg   2460
atctgtgcac gcgttccggc acgagctttg attgtaataa gtttttacga agcgatgaca   2520
tgacccccgt agtgacaacg atcacgccca aaagaactgc cgactacaaa attaccgagt   2580
atgtcggtga cgttaaaact attaagccat ccaatcgacc gttagtcgaa tcaggaccgc   2640
tggtgcgaga agccgcgaag tatggcgaat gcatcgtata acgtgtggag tccgctcatt   2700
agagcgtcat gtttagacaa gaaagctaca tatttaattg atcccgatga ttttattgat   2760
aaattgaccc taactccata cacggtattc tacaatggcg gggttttggt caaaatttcc   2820
ggactgcgat tgtacatgct gttaacggct ccgcccacta ttaatgaaat taaaaattcc   2880
aattttaaaa aacgcagcaa gagaaacatt tgtatgaaag aatgcgtaga aggaaagaaa   2940
aatgtcgtcg acatgctgaa caacaagatt aatatgcctc cgtgtataaa aaaaatattg   3000
aacgatttga aagaaaacaa tgtaccgcgc ggcggtatgt acaggaagag gtttatacta   3060
aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt gccaagtgtg aaaaccgatg tttaatcaag   3120
gctctgacgc atttctacaa ccacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat gcatctttta   3180
atcaaatccc aagatgtgta taaaccacca aactgccaaa aaatgaaaac tgtcgacaag   3240
ctctgtccgt ttgctggcaa ctgcaagggt ctcaatccta tttgtaatta ttgaataata   3300
aaacaattat aaatgctaaa tttgtttttt attaacgata caaaccaaac gcaacaagaa   3360
catttgtagt attatctata attgaaaacg cgtagttata atcgctgagg taatatttaa   3420
aatcattttc aaatgattca cagttaattt gcgacaatat aattttattt tcacataaac   3480
tagacgcctt gtcgtcttct tcttcgtatt ccttctcttt ttcatttttc tcctcataaa   3540
aattaacata gttattatcg tatccatata tgtatctatc gtatagagta aattttttgt   3600
tgtcataaat atatatgtct tttttaatgg ggtgtatagt accgctgcgc atagtttttc   3660
tgtaatttac aacagtgcta ttttctggta gttcttcgga gtgtgttgct ttaattatta   3720
aatttatata atcaatgaat ttgggatcgt cggttttgta caatatgttg ccggcatagt   3780
acgcagcttc ttctagttca attacaccat tttttagcag caccggatta acataacttt   3840
ccaaaatgtt gtacgaaccg ttaaacaaaa acagttcacc tcccttttct atactattgt   3900
ctgcgagcag ttgtttgttg ttaaaaataa cagccattgt aatgagacgc acaaactaat   3960
atcacaaact ggaaatgtct atcaatatat agttgctgat atcatggaga taattaaaat   4020
gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa   4080
aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atcagatctg   4140
cagcggccgc gggaattcga tccgccatga cgtatccaag gaggcgttac cgcagaagaa   4200
gacaccgccc ccgcagccat cttggccaga tcctccgccg ccgcccctgg ctcgtccacc   4260
cccgccaccg ctaccgttgg agaaggaaaa atggcatctt caacacccgc ctctcccgca   4320
ccttcggata tactgtcaag gctaccacag tcacaacgcc ctcctgggcg gtggacatga   4380
tgagatttaa tattgacgac tttgttcccc cgggaggggg gaccaacaaa atctctatac   4440
cctttgaata ctacagaata agaaaggtta aggttgaatt ctggccctgc tcccccatca   4500
cccagggtga taggggagtg ggctccactg ctgttattct agatgataac tttgtaacaa   4560
aggccacagc cctaacctat gacccatatg taaactactc ctcccgccat acaatccccc   4620
aacccttctc ctaccactcc cgttacttca cacccaaacc tgttcttgac tccactattg   4680
attacttcca accaaataac aaaaggaatc agctttggct gaggctacaa acctctagaa   4740
atgtggacca cgtaggcctc ggcactgcgt tcgaaaacag taaatacgac caggactaca   4800
atatccgtgt aaccatgtat gtacaattca gagaatttaa tcttaaagac cccccacttg   4860
aaccctaaga attctatcac tagtgaattc gcggccgccg gccgctccag aattctagaa   4920
ggtacccggg atcctttcct gggacccggc aagaaccaaa aactcactct cttcaaggaa   4980
atccgtaatg ttaaacccga cacgatgaag cttgtcgttg gatggaaagg aaaagagttc   5040
tacagggaaa cttggacccg cttcatggaa gacagcttcc ccattgttaa cgaccaagaa   5100
gtgatggatg ttttccttgt tgtcaacatg cgtcccacta gacccaaccg ttgttacaaa   5160
ttcctggccc aacacgctct gcgttgcgac cccgactatg tacctcatga cgtgattagg   5220
atcgtcgagc cttcatgggt gggcagcaac aacgagtacc gcatcagcct ggctaagaag   5280
ggcggcggct gcccaataat gaaccttcac tctgagtaca ccaactcgtt cgaacagttc   5340
atcgatcgtg tcatctggga gaacttctac aagcccatcg tttacatcgg taccgactct   5400
gctgaagagg aggaaattct ccttgaagtt tccctggtgt tcaaagtaaa ggagtttgca   5460
ccagacgcac ctctgttcac tggtccggcg tattaaaaca cgatacattg ttattagtac   5520
atttattaag cgctagattc tgtgcgttgt tgatttacag acaattgttg tacgtatttt   5580
aataattcat taaatttata atctttaggg tggtatgtta gagcgaaaat caaatgattt   5640
tcagcgtctt tatatctgaa tttaaatatt aaatcctcaa tagatttgta aaataggttt   5700
cgattagttt caaacaaggg ttgtttttcc gaaccgatgg ctggactatc taatggattt   5760
tcgctcaacg ccacaaaact tgccaaatct tgtagcagca atctagcttt gtcgatattc   5820
gtttgtgttt tgttttgtaa taaaggttcg acgtcgttca aaatattatg cgcttttgta   5880
tttctttcat cactgtcgtt agtgtacaat tgactcgacg taaacacgtt aaataaagct   5940
tggacatatt taacatcggg cgtgttagct ttattaggcc gattatcgtc gtcgtcccaa   6000
ccctcgtcgt tagaagttgc ttccgaagac gattttgcca tagccacacg acgcctatta   6060
attgtgtcgg ctaacacgtc cgcgatcaaa tttgtagttg agctttttgg aattatttct   6120
gattgcgggc gtttttgggc gggtttcaat ctaactgtgc ccgattttaa ttcagacaac   6180
acgttagaaa gcgatggtgc aggcggtggt aacatttcag acggcaaatc tactaatggc   6240
ggcggtggtg gagctgatga taaatctacc atcggtggag gcgcaggcgg ggctggcggc   6300
ggaggcggag gcggaggtgg tggcggtgat gcagacggcg gtttaggctc aaatgtctct   6360
ttaggcaaca cagtcggcac ctcaactatt gtactggttt cgggcgccgt ttttggtttg   6420
accggtctga gacgagtgcg atttttttcg tttctaatag cttccaacaa ttgttgtctg   6480
tcgtctaaag gtgcagcggg ttgaggttcc gtcggcattg gtggagcggg cggcaattca   6540
gacatcgatg gtggtggtgg tggtggaggc gctggaatgt taggcacggg agaaggtggt   6600
ggcggcggtg ccgccggtat aatttgttct ggtttagttt gttcgcgcac gattgtgggc   6660
accggcgcag gcgccgctgg ctgcacaacg gaaggtcgtc tgcttcgagg cagcgcttgg   6720
ggtggtggca attcaatatt ataattggaa tacaaatcgt aaaaatctgc tataagcatt   6780
gtaatttcgc tatcgtttac cgtgccgata tttaacaacc gctcaatgta agcaattgta   6840
ttgtaaagag attgtctcaa gctcgccgca cgccgataac aagccttttc atttttacta   6900
cagcattgta gtggcgagac acttcgctgt cgtcgacgta catgtatgct ttgttgtcaa   6960
aaacgtcgtt ggcaagcttt aaaatattta aaagaacatc tctgttcagc accactgtgt   7020
tgtcgtaaat gttgtttttg ataatttgcg cttccgcagt atcgacacgt tcaaaaaatt   7080
gatgcgcatc aattttgttg ttcctattat tgaataaata agattgtaca gattcatatc   7140
tacgattcgt catggccacc acaaatgcta cgctgcaaac gctggtacaa ttttacgaaa   7200
actgcaaaaa cgtcaaaact cggtataaaa taatcaacgg gcgctttggc aaaatatcta   7260
ttttatcgca caagcccact agcaaattgt atttgcagaa aacaatttcg gcgcacaatt   7320
ttaacgctga cgaaataaaa gttcaccagt taatgagcga ccacccaaat tttataaaaa   7380
tctattttaa tcacggttcc atcaacaacc aagtgatcgt gatggactac attgactgtc   7440
ccgatttatt tgaaacacta caaattaaag gcgagctttc gtaccaactt gttagcaata   7500
ttattagaca gctgtgtgaa gcgctcaacg atttgcacaa gcacaatttc atacacaacg   7560
acataaaact cgaaaatgtc ttatatttcg aagcacttga tcgcgtgtat gtttgcgatt   7620
acggattgtg caaacacgaa aactcactta gcgtgcacga cggcacgttg gagtatttta   7680
gtccggaaaa aattcgacac acaactatgc acgtttcgtt tgactggtac gcggcgtgtt   7740
aacatacaag ttgctaacgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc   7800
gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta   7860
atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa   7920
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat   7980
tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg   8040
agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc   8100
aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt   8160
gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag   8220
tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc   8280
cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc   8340
ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt   8400
cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt   8460
atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc   8520
agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa   8580
gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa   8640
gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg   8700
tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga   8760
agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg   8820
gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg   8880
aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt   8940
aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact   9000
ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat   9060
gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg   9120
aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg   9180
ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat   9240
tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc   9300
ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt   9360
cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc   9420
agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga   9480
gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc   9540
gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa   9600
acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta   9660
acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg   9720
agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg   9780
aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat   9840
gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt   9900
tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa   9960
aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct  10020
ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag  10080
acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc  10140
ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg  10200
cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga  10260
agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc  10320
aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc  10380
cagtgcc                                                        10387
<210>9
<211>20
<212>PRT
<213>猪圆环病毒
<400>9
Ser Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His His Pro Pro Ser
1               5                   10                  15
His Leu Gly Gln
            20
<210>10
<211>19
<212>PRT
<213>猪圆环病毒
<400>10
Pro Arg His His Tyr Arg Pro Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser
<210>11
<211>233
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>这是2型猪圆环病毒开放阅读框2的氨基酸序列。
<400>11
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1               5                   10                  15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
            20                  25                  30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
        35                  40                  45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr
    50                  55                  60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val
65                  70                  75                  80
Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr
                85                  90                  95
Arg Ile Lys Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
            100                 105                 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
        115                 120                 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
    130                 135                 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
                165                 170                 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn
            180                 185                 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
        195                 200                 205
Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
    210                 215                 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro
225                 230

Claims (53)

1.一种回收PCV2的开放阅读框2表达的重组蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
A)将所述PCV2的重组开放阅读框2克隆入转运载体中；
B)将所述转运载体中含有所述重组开放阅读框2的部分转染入病毒中；
C)用所述病毒感染培养基中的细胞；
D)使所述病毒由所述开放阅读框2表达所述蛋白；
E)分离细胞与上清液中的所述载体；和
F)回收所述上清液中所述开放阅读框2表达的蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括由PCV2毒株扩增所述开放阅读框2，然后将所述开放阅读框克隆入所述转运载体的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组开放阅读框2还包含选自5′Kozak序列、3′EcoR1位点的序列或其组合。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述5′Kozak序列包含SEQ ID NO：1。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述3′EcoR1位点包含SEQ ID NO：2。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCV2开放阅读框包含SEQ IDNO：4。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组蛋白包含SEQ ID NO：6。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基包括无血清昆虫细胞培养基。
9.如权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：
i)在步骤A之前，将所述扩增的开放阅读框2克隆入第一载体；
ii)从所述第一载体上切下所述开放阅读框2；和
iii)将所述切下的开放阅读框2用于步骤A。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞包括SF+细胞。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒包括杆状病毒。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转染部分包括SEQ ID NO：4。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用所述病毒感染细胞至少5天后回收所述上清液中的所述开放阅读框2蛋白。
14.一种制备引发对PCV2免疫应答的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)将一构建物转染入病毒中，所述构建物包含PCV2开放阅读框2的重组DNA；
ii)用所述转染的病毒感染细胞，在生长培养基中培养所述细胞；
iii)使所述病毒由所述开放阅读框2表达所述重组蛋白；
iv)回收上清液中所述表达的开放阅读框2蛋白；和
v)将所述回收蛋白与合适佐剂或其它药学上可接受的运载体或赋形剂混合。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括由转运载体中获得所述构建物的步骤。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括由PCV2毒株扩增所述开放阅读框2，然后将所述开放阅读框2克隆入所述转运载体的步骤。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述重组开放阅读框2还包含选自5′Kozak序列、3′EcoR1位点的序列或其组合。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述5′Kozak序列包含SEQ ID NO：1。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述3′EcoR1位点包含SEQ ID NO：2。
20.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述PCV2开放阅读框2包含SEQ ID NO：4。
21.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述重组蛋白包含SEQ ID NO：6。
22.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述培养基包括无血清昆虫细胞培养基。
23.如权利要求16所述的方法，还包括以下步骤：
i)将所述扩增的开放阅读框2克隆入第一载体中；
ii)从所述第一载体上切下所述开放阅读框2；和
iii)用所述切下的开放阅读框2克隆入所述转运载体中。
24.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述细胞包括SF+细胞。
25.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述病毒包括杆状病毒。
26.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述转染构建物包含SEQ ID NO：4。
27.如权利要求14所述的方法，其特征在于，用所述病毒感染所述细胞至少5天后回收所述开放阅读框2蛋白。
28.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述回收步骤还包括使所述培养基与所述细胞和细胞碎片相分离的步骤。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述分离步骤包括通过孔径范围约0.45μM-1.0μM的滤器过滤所述细胞、细胞碎片和生长培养基的步骤。
30.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括灭活所述病毒，然后将所述回收的蛋白质与合适佐剂混合的步骤。
31.一种回收PCV2开放阅读框2表达的蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
i)用含有所述开放阅读框2的重组病毒载体感染培养基中生长的细胞；
ii)使所述载体表达所述蛋白；和
iii)回收上清液中表达的所述蛋白。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述回收在用所述病毒载体感染所述细胞至少5天后进行。
33.一种用权利要求1、14、31所述方法或其组合获得的组合物。
34.权利要求33所述组合物作为药物的应用。
35.权利要求33所述组合物在制备预防PCV2感染的药物中的应用。
36.一种生产检测样品中PCV2感染的诊断试剂盒的方法，所述方法包括：
i)用权利要求1、14、31所述方法或其组合产生重组蛋白；
ii)和将所述重组蛋白包装到合适容器中。
37.如权利要求36所述的方法，还包括在包装所述重组蛋白的容器中加入说明手册的步骤。
38.一种包含PCV2 ORF2蛋白或其免疫原性部分的免疫原性组合物，它能有效降低PCV2感染相关临床症状的严重性，其中，所述免疫原性部分含有PCV2 ORF2蛋白的至少10个毗连氨基酸。
39.如权利要求38所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述PCV2 ORF2蛋白是：
i)含有选自序列SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11序列的多肽；
ii)与i)所述多肽至少80％同源的任何多肽，
iii)i)和/或ii)所述多肽的任何免疫原性部分，
iv)iii)所述的免疫原性部分，其含有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11序列中的至少10个毗连氨基酸
v)由含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4序列的DNA所编码的任何多肽。
vi)由与v)所述多核苷酸至少80％同源的多核苷酸所编码的任何多肽，
vii)由v)和/或vi)所述多核苷酸编码的多肽的任何免疫原性部分，
viii)vii)所述的免疫原性部分，其中编码所述免疫原性部分的多核苷酸包含SEQID NO：3或SEQ ID NO：4序列中所含的至少30个毗连核苷酸。
40.如权利要求38所述的免疫原性组合物，还包含灭活的病毒载体和细胞培养物上清。
41.如权利要求40所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述灭活的病毒载体是编码PCV2 ORF2蛋白的重组杆状病毒。
42.如权利要求40所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包含BEI。
43.如权利要求42所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包含硫代硫酸钠。
44.如权利要求39所述的免疫原性组合物，包含选自下组的其它成分：运载体、佐剂、培养基、病毒灭活剂、稀释剂、等渗剂、免疫调节剂、抗生素和其组合。
45.如权利要求44所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物含有佐剂，优选卡巴浦尔。
46.如权利要求45所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物含有药学上可接受的盐，优选盐水。
47.如权利要求38所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物含有至少0.2mcg/ml PCV2 ORF2蛋白。
48.如权利要求38所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物含有至少2μg PCV2 ORF2蛋白。
49.一种容器，其装有至少一个剂量权利要求38所述免疫原性组合物，其中一个剂量包含至少2μg PCV2 ORF2蛋白。
50.一种容器，其装有10-250个剂量权利要求38所述免疫原性组合物，其中一个剂量包含至少2μg PCV2 ORF2蛋白。
51.如权利要求49所述的容器，还装有抗微生物活性剂。
52.一种药盒，其装有权利要求49所述容器和说明手册，所述说明手册包括将至少一个剂量的所述免疫原性组合物经肌肉内注射应用于小猪，以减轻PCV2感染相关临床症状严重性的信息。
53.如权利要求52所述的药盒，其特征在于，所述说明手册包括第二次或再次给予至少一个剂量的所述免疫原性组合物的信息，所述第二次给药或再次给药在最后一次给药前至少14天进行。
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