CN102115755A - 酵母表达猪圆环病毒2型orf2蛋白与亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明的主要目的在于提供一种PCV2亚单位疫苗及其制备方法，具体地说是，利用毕赤酵母表达系统在GS 115酵母菌株中大量表达重组ORF2蛋白，研制出具有良好免疫效果的亚单位疫苗。通过仔猪攻毒试验，验证该亚单位疫苗具有良好的免疫保护作用。PCV2-ORF2蛋白还可以用于猪圆环病毒2型引起的相关疾病的诊断。

Description

酵母表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白与亚单位疫苗

技术领域

本发明涉及一种酵母表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白亚单位疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是圆环病毒属的代表种，可将PCV分为猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)两个型。PCV2对猪有致病性，可引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征。PCV2开放阅读框1(ORF1)和开放阅读框2(ORF2)为主要阅读框，ORF2全长702bp，编码病毒的主要结构蛋白及病毒核衣壳蛋白(Cap)。PCV2在细胞上的增殖滴度很低，很难应用传统的灭活疫苗和弱毒疫苗。新型的疫苗如DNA疫苗，免疫效率并不高；而亚单位疫苗比DNA疫苗有更好的免疫力。

猪圆环病毒2型ORF2蛋白亚单位疫苗中已有关于使用原核和杆状病毒表达ORF2蛋白的报道，但原核表达常以包涵体形式存在，涉及到变性、复性等操作繁琐步骤和成本高等不利因素，而杆状病毒则有表达成本高，蛋白纯化困难等缺点。

发明内容

本发明主要目的是提供一种猪圆环病毒2型ORF2蛋白制备方法，包括如下步骤：

1)克隆猪圆环病毒2型ORF2基因，转入酵母表达载体中，获得包含猪圆环病毒2型ORF2基因的酵母表达载体；

2)包含猪圆环病毒2型ORF2基因的酵母表达载体转化入大肠杆菌感受态细胞中，扩增包含猪圆环病毒2型ORF2基因的酵母表达载体；

3)包含猪圆环病毒2型ORF2基因的酵母表达载体酶切线性化，转入酵母中，获得重组酵母；重组酵母发酵培养，添加甲醇诱导表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白；

4)回收并分离纯化猪圆环病毒2型ORF2蛋白。

优选地，本发明所述的步骤1)中猪圆环病毒2型ORF2基因序列包含序列表中的SEQ ID NO1。

优选地，本发明所述的步骤1)中酵母表达载体为pPIC9K。

优选地，本发明所述的步骤3)所述酵母为GS115。

优选地，本发明所述的步骤3)所述重组酵母为GS115/pPIC9K-ORF2。

优选地，本发明所述重组酵母GS115/pPIC9K-ORF2是经过G418抗性平板、PCR与Southern-blot鉴定获得的高拷贝的阳性重组酵母。

更优地，本发明所述重组酵母为Mut⁺表型的重组酵母。

更优地，本发明所述的PCR鉴定的引物为5’AOX₁和3’AOX₁，其序列为5’-GACTGGTTCC AATTGACAAGC-3’和5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。

优选地，本发明所述的步骤1)中猪圆环病毒2型ORF2基因序列为人工合成的、经过毕赤酵母密码子偏爱性优化的猪圆环病毒2型ORF2基因，包含序列表中SEQ ID NO3。

优选地，本发明所述的重组酵母为包含密码子优化的人工合成基因的毕赤酵母GS115/pPIC9K-optiORF2。

优选地，本发明所述重组酵母GS115/pPIC9K-optiORF2是经过G418抗性平板、PCR与Southern-blot鉴定获得的高拷贝的阳性重组酵母。

优选地，本发明所述重组酵母为Mut⁺表型的重组酵母。

更优地，本发明所述的PCR鉴定的引物为5’AOX₁和3’AOX₁，其序列为5’-GACTGGTTCC AATTGACAAGC-3’和5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。

优选地，本发明所述的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白包含下面任意一种多肽：

i)含有序列表中SEQ ID NO2序列的多肽；

ii)与i)所述多肽至少80％同源的多肽；

iii)含i)和ii)所述多肽的免疫原性部分的多肽。

本发明的另一目的在于提供一种由上述方法制备的猪圆环病毒2型ORF2蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种由上述方法制备的重组酵母，该重组酵母可表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白。

本发明还提供了一种猪圆环病毒2型ORF2蛋白亚单位疫苗的制备方法，在上述的猪圆环病毒2型ORF2蛋白中，加入佐剂，经过乳化，获得猪圆环病毒2型ORF2蛋白亚单位疫苗。

本发明还提供了一种根据上述的方法制备的猪圆环病毒2型ORF2蛋白亚单位疫苗。

病本发明供一种猪圆环病毒2型相关疾病诊断试剂的制备方法，使用上述的猪圆环病毒2型ORF2蛋白为抗原。

技术效果

首先，本发明选用了表达载体pPIC9K构建的基因工程菌，为Mut⁺表型，具有完整的AOX₁和AOX₂基因，可利用AOX₁和AOX₂基因编码醇氧化酶，但细胞中醇氧化酶活性以AOX₁基因编码的产物为主。甲醇可严格调控和诱导AOX₁基因的表达，AOX₁基因表达水平的调控发生在转录水平，以甲醇为碳源生长的细胞能检测到AOX₁基因的转录，而在其他碳源中生长的细胞则检测不到AOX₁转录的信息，据此可用甲醇诱导毕赤酵母表达外源目的蛋白。而优化蛋白表达的常用的方法就是获得高拷贝的转化菌株，整合高拷贝外源基因的转化菌株，其外源蛋白的表达量高于单拷贝转化菌株。表达盒的拷贝数与抗G418的能力密切相关，经过G418抗性平板、PCR与Southern-blot鉴定获得高拷贝转化菌株，当拷贝数从1个增加到3个时侯，能稳定可靠的表达PCV2-ORF2蛋白，其蛋白分泌表达水平比较高。其表达量显著高于现有技术描述的PCV2-ORF2蛋白表达量。

本发明还充分考虑了毕赤酵母的密码子偏好性以及二级结构情况，并应用pPIC9K载体所携带的抗性G418进行了目的基因高拷贝筛选，表达盒的拷贝数能够达到3个。通过这些措施，密码子改造后的ORF2的表达量可达到115mg/L，相对于未改造前基因表达量的2倍，从而证实选用偏爱密码子对提高表达水平较为有效。

其次，本发明使用用甲醇诱导表达，以甲醇作为碳源，解决了其他原核表达添加IPTG对动物存在毒性问题以及高成本问题。酵母在大量发酵培养条件下，培养物中毕赤酵母的细胞浓度与其分泌的目的蛋白的产量成正比，甲醇的添加量以刚好满足菌细胞生长所需的量，此时，外源基因的转录水平是过量甲醇诱导时的5倍以上。根据细胞氧化甲醇过程中消耗氧的情况，通过测定溶氧的变化可实时监测甲醇的含量，以保证外源基因的正常高效表达。

最后，考虑到蛋白纯化困难的缺点，本发明基因工程菌分泌型表达，可以产生具有天然生物活性的真核蛋白产物，无需复性，纯化工艺简单，能够避免蛋白以包涵体形式存在，省去蛋白纯化复性等繁琐步骤，解决了应用杆状病毒表达猪圆环病毒II型ORF2蛋白所面临的纯化困难的问题。

综上，猪圆环病毒2型ORF2基因在酵母中获得了表达，经SDS-PAGE和Western blotting试验鉴定具有良好的抗原性。因此，该基因工程菌可用于PCV2亚单位疫苗及PCV2诊断试剂等的生产中，生产成本较低，纯化方法简单，疫苗防治效果好，在工业上大规模生产猪圆环病毒2型的疫苗及诊断试剂上具有良好的应用前景。

附图说明

图1为PCV2-ORF2目的片段大小；

图2为重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白SDS-PAGE电泳图；

图3重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白Western blotting图；

图4天然ORF2与密码子优化后的ORF2序列比对；

图5为经密码子优化后的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白SDS-PAGE电泳图；

图6为经密码子优化后的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白Western blotting图。

具体实施方式

本发明实施例中选用的载体是pPIC9K，是一种穿梭型多拷贝质粒，全长9,276bp，含有一个ColE1复制起始位点和两个抗性基因(Amp、Kan)，故它既能在原核细胞中复制，又能在真核细胞中表达。Amp抗性基因用于筛选导入大肠杆菌的重组子，Kan抗性基因在大肠杆菌中是抗卡那霉素的，而在酵母中则抗G418，故用其筛选多拷贝表达盒的重组酵母。而毕赤酵母GS115，它具有组氨酸脱氢酶缺陷型基因His4，可接受His4的载体pPIC9K而具有His+表型以筛选质粒，故在组氨酸缺陷的MD培养基上筛选可得到高拷贝的阳性重组酵母。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例1猪圆环病毒2型ORF2蛋白亚单位疫苗的制备方法

(1)克隆猪圆环病毒2型ORF2基因到毕赤酵母表达载体pPIC9K中，获得重组酵母表达载体pPIC9K-ORF2。

①引物的设计

以PCV2-ORF2基因序列为参考，应用Oligo6.0引物设计软件设计引物，

P1上游：5′-AGGGGATCCGGCATCTTCAACACC-3′

P2下游：5′-CCGAATTCTTAGGGGTTAAGTGGGG-3′

在上下游引物5′端分别加上BamH I和EcoRI酶切位点，目的片段长约702bp。

②PCV2病毒核酸的提取

1mlDNAzol Reagent加入0.1ml的保藏号CGMCC No.2389的PCV2-SH病毒株样品，将离心管上下颠倒摇匀；室温下静置5min；4℃离心(10,000rpm、10min)后，将上清液移至新离心管；向其中加入0.5ml无水乙醇，上下颠倒混匀后室温下静置5min，4℃离心(4000rpm、2min)后，静置1min，然后吸去管内液体；向试管中加入1ml75％乙醇，上下颠倒混匀5次后，静置1min，吸去乙醇，此步骤重复两次后，让样品在空气中自然干燥(5min)；于离心管中缓慢加入30μl 8mmol/LNaOH溶解DNA，然后在-20℃下贮存备用。

③PCV2-ORF2基因的PCR扩增并连接载体pMD18-T

以PCV2 DNA为模板，用设计的引物将目的基因ORF2进行PCR扩增。将PCV2-ORF2基因连接到pMD18-T载体中，命名为pMD18-T-ORF2质粒。以BamH I与EcoRI双酶切鉴定及M13引物进行测序，鉴定PCR扩增基因的正确性。PCR结果见图1。第1孔为PCV2-ORF2目的片段，大小为702bp，第2孔为DL2000 Marker。由电泳图谱与测序结果可知，重组连接载体中PCV2-ORF2蛋白基因含序列表中的SEQ ID NO1序列。

④表达载体pPIC9K-ORF2质粒构建

用BamH I与EcoRI双酶切pMD 18-T-ORF2质粒，用胶回收试剂盒回收PCV2-ORF2基因片段。与同样经过BamH I与EcoRI双酶切pPIC9K质粒(购自Pharmacia公司)的胶回收目的片段进行连接，构建表达载体pPIC9K-ORF2。用BamH I与EcoRI双酶切及PCR鉴定，采用PCR方法分析，用煮-冻-煮制备模板，以通用引物5’AOX₁和3’AOX₁为引物，其序列为5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’和5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’进行PCR鉴定为阳性重组质粒。

(2)重组阳性质粒pPIC9K-ORF2转化酵母GS115菌株

将鉴定后的阳性重组表达质粒pPIC9K-ORF2线性化后，电转化毕赤酵母GS115，获得阳性基因工程菌GS115/pPIC9K-ORF2。该基因工程菌经过G418抗性平板、PCR与Southern-blot鉴定为含3个拷贝表达盒的重组酵母菌株，用15％甘油进行菌种保存。

(3)毕赤酵母表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白

①阳性菌株的诱导表达及重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白的鉴定

以pPIC9k质粒转化GS115酵母菌的阳性重组酵母菌为阴性对照，同时挑取重组酵母菌株于BMGY(Buffered glycerol-complex medium)培养基中，培养至OD₆₀₀为3时，5000rpm离心15min收集菌体，转至三角锥瓶，加BMMY培养基稀释至OD₆₀₀为1，以8层无菌纱布封口，30℃ 250rpm摇床培养72h。为了维持诱导表达，每隔24h添加100％甲醇至终浓度为0.5％，分别于24h、48h、72h取1.5ml培养物于灭菌离心管中，于12000rpm离心15min，分别收集上清，上清液通过1μm的滤膜进行过滤，过滤后进行SDS-PAGE电泳，结果见图2。第1孔为蛋白质Marker；第2孔为pPIC9K-ORF2重组毕赤酵母24h后收获的培养上清；第3孔为pPIC9K-ORF2重组毕赤酵母48h后收获的培养上清；第4孔为pPIC9K-ORF2重组毕赤酵母72h后收获的培养上清；第5孔为细胞阴性对照。由图可知，重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白大小与预测蛋白一致。经测序可知，重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白序列含序列表中的SEQ ID NO2序列。

②重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白的免疫原性鉴定

SDS-PAGE电泳后，再进行转膜，将凝胶上的收获的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，封闭液封闭后，加上针对猪圆环病毒2型ORF2蛋白的单抗，再加上带有标记物的二抗。然后判定重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白的表达。结果见附图3，其中，第1孔为蓝色预染低分子量蛋白质Marker；第2孔为24h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果；第3孔为48h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果，第4孔为72h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果，第5孔为与阴性血清反应结果。用Western blotting分析表达的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白。用猪的抗猪圆环病毒2型高免血清对重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白进行检测。结果显示，在硝酸纤维素膜上仅观察到一条分子量大小与预期大小一致的特异性条带，说明表达的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白能够同猪圆环病毒2型抗体特异性结合，说明重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白具有特异的猪圆环病毒2型免疫原性。

③收获和纯化重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白

将72h诱导表达的培养物经10000rpm离心20min，分离沉淀和上清液，上清液通过1μm的滤膜进行过滤，然后通过超滤浓缩纯化，纯化后的样品溶液通过紫外分光光度计进行蛋白含量测定，表达量为55mg/L。

(4)利用毕赤酵母表达的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白纯化后经7mmol/L二乙烯亚胺(BEI)灭活重组表达产物，48h后加入等量的硫代硫酸钠中和，然后辅以佐剂，制备猪圆环病毒2型亚单位疫苗。准备不同浓度的抗原稀释物，并与油佐剂ISA206(ISA70M)佐剂混合乳化。ISA70M佐剂经121℃、60min高压湿热灭菌，按照抗原/佐剂体积比例46∶54混合。使用德国产IKA 2000/4型乳化机，先将佐剂加入乳化机料筒内，在搅拌状态下(200rpm)缓缓将抗原水相滴入佐剂中，滴完后，继续搅拌5min。用乳化机7000rpm，循环乳化4min，得到猪圆环病毒2型ORF2蛋白亚单位疫苗成品。

实施例2人工合成PCV2-ORF2序列的酵母表达

根据酵母菌的密码子偏爱性，优化并人工合成PCV2-ORF2全基因。人工合成PCV2-ORF2序列与天然PCV2-ORF2序列的序列比对见图4。本发明用全基因合成的方法使用毕赤酵母嗜好的密码子GCT(Ala)、AGA(Arg)、AAC(Asn)、GAC(Asp)、TGT(Cys)、CAA(Gln)、GGT(Gly)、CAC(His)、ATC(Ile)、TTG(Leu)、AAG(Lys)、TTC(Phe)、CCA(Pro)、TCT(Ser)、ACT(Thr)、TAC(Tyr)、GTT(Val)优化替换稀有的密码子，表达量得到提高。

将合成后的猪圆环病毒2型ORF2基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中，获得重组酵母表达载体pPIC9K-optiORF2。克隆的步骤与实施例1天然PCV2-ORF2序列的克隆、筛选与鉴定的步骤相同。经测序结果可知，重组酵母表达载体pPIC9K-optiORF2中optiORF2基因含序列表中的SEQ ID NO3序列。最后获得含3个拷贝表达盒的重组酵母菌株GS115/pPIC9K-optiORF2。

将重组酵母菌株GS115/pPIC9K-optiORF2于BMGY(Buffered glycerol-complex medium)培养基中，培养至OD₆₀₀为3时，5000rpm离心15min收集菌体，转至三角锥瓶，加BMMY培养基稀释至OD₆₀₀为1，以8层无菌纱布封口，30℃ 250rpm摇床培养72h。为了维持诱导表达，每隔24h添加100％甲醇至终浓度为0.5％，分别于24h、48h、72h取1.5ml培养物于灭菌离心管中，于12000rpm离心15min，分别收集上清，上清液通过1μm的滤膜进行过滤，过滤后进行SDS-PAGE电泳，结果见图5。第1孔为蛋白质Marker；第2孔为pPIC9K-ORF2-2重组毕赤酵母24h后收获的培养上清；第3孔为pPIC9K-ORF2-2重组毕赤酵母48h后收获的培养上清；第4孔为pPIC9K-ORF2-2重组毕赤酵母72h后收获的培养上清；第5孔为细胞阴性对照。由图可知，重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白大小与预测蛋白一致。经测序可知，重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白序列含序列表中的SEQ ID NO2序列。

重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白的免疫原性鉴定：SDS-PAGE电泳后，再进行转膜，将凝胶上的收获的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，封闭液封闭后，加上针对猪圆环病毒2型ORF2蛋白的单抗，再加上带有标记物的二抗。然后判定重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白的表达。结果见附图6，其中，第1孔为蓝色预染低分子量蛋白质Marker；第2孔为24h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果；第3孔48h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果，第4孔为72h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果，第5孔为与阴性血清反应结果。用Western blotting分析表达的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白。用猪的抗猪圆环病毒2型高免血清对重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白进行检测。结果显示，在硝酸纤维素膜上仅观察到一条分子量大小与预期大小一致的特异性条带，说明表达的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白能够同猪圆环病毒2型抗体特异性结合，说明重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白具有特异的猪圆环病毒2型免疫原性。

收获和纯化重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白：将72h诱导表达的培养物经10000rpm离心20min，分离沉淀和上清液，上清液通过1μm的滤膜进行过滤，然后通过超滤浓缩纯化，纯化后的样品溶液通过紫外分光光度计进行蛋白含量测定，表达量为115mg/L。

利用纯化后的毕赤酵母表达的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白，经7mmol/L二乙烯亚胺(BEI)灭活重组表达产物，48h后加入等量的硫代硫酸钠中和，然后辅以佐剂，制备猪圆环病毒2型亚单位疫苗。准备不同浓度的抗原稀释物，并与油佐剂ISA206(ISA70M)佐剂混合乳化。ISA70M佐剂经121℃、60min高压湿热灭菌，按照抗原/佐剂体积比例46∶54混合。使用德国产IKA 2000/4型乳化机，先将佐剂加入乳化机料筒内，在搅拌状态下(200rpm)缓缓将抗原水相滴入佐剂中，滴完后，继续搅拌5min。用乳化机7000rpm，循环乳化4min，得到猪圆环病毒2型ORF2蛋白亚单位疫苗成品。

实施例3酵母表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白亚单位疫苗的效力与生物学检验

将实施例1和/或2中制备的油乳剂疫苗按照现行兽用生物制品规程要求进行检验。用检验合格的制品进行临床试验——仔猪攻毒试验。

①安全性试验

用PCV2-ORF2亚单位疫苗包含ORF2蛋白40μg/头份肌肉接种25日龄仔猪5头，临床观察28天无异常反应，证明该疫苗制品对本动物是安全的。

②攻毒试验

分别采用包含ORF2蛋白0.5μg/头份、1μg/头份、2μg/头份、4μg/头份、8μg/头份和16μg/头份六种免疫剂量亚单位疫苗免疫25日龄PCV2抗体阴性仔猪(由河南某猪场提供)，每组8头，同时设未接种疫苗不攻毒阴性对照猪8头及未接种疫苗攻毒对照猪8头。免疫组进行两次免疫，间隔两周。第二次免疫后21天对免疫组和攻毒对照进行病毒攻击，毒株选用强毒(PCV2-SH强毒10^6.0TCID₅₀/ml)，每头猪滴鼻1ml，颈部肌肉注射2ml，隔离饲养。攻毒后第4、7天分别在两腋下和两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(4mg/ml，0.5ml)和腹腔注射巯基乙酸培养基10ml。在第11天和19天腹腔注射巯基乙酸培养基10ml。不接种疫苗不攻毒阴性对照组单独隔离饲养。攻毒后28天进行剖杀。所有猪只在第1次免疫前、攻毒前和剖杀前收集血样。

在第1次免疫前、攻毒前和剖杀前对所有猪只收集血样，通过ELISA法进行PCV2血清抗体分析。试验结果见表1。攻毒后28天剖检全部猪只，观察各组织器官病理变化、拍照记录。符合以下3项中的任何2项，即可判为发病。A.临床症状：仔猪体温升高(≥40℃)，应至少持续3日，出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓；B.病理变化：腹股沟和气管淋巴结水肿、肺脏轻度水肿，肾脏发黄或有点状坏死。组织学病变为淋巴结有明显淋巴细胞侵入，或有多核巨细胞；C.病毒检测：用PCR检测淋巴结组织，检测到PCV2。试验结果见表2。

表1各组试验猪PCV2血清抗体分析结果

表2.各组试验动物发病判定结果

结果分析：根据试验动物临床症状、剖检病理变化检测和病原的PCR检测判断结果，其中不免疫攻毒对照组仔猪全部发病。0.5μg/头份组试验动物有4只发病，亚单位疫苗保护率为50％；1μg/头份组试验动物有1只发病，保护率为87.5％；其余4组免疫攻毒试验动物均没有发病，保护率均为100％。其中1μg/头份组亚单位疫苗效果明显好于0.5μg/头份组，临床上认为当大约80％或更多的动物被保护时，畜群即获得了保护，可以推断必须包含PCV2重组ORF2蛋白1微克/头份或者更多蛋白的亚单位疫苗可以给动物提供保护，以能有效的保护畜群对抗PCV2。

实施例4毕赤酵母表达PCV2-ORF2蛋白在制备PCV2的检测试剂中的应用。

将实施1或2纯化后PCV2-ORF2蛋白使用最佳包被浓度包被ELISA板37℃作用1h，4℃过夜，PBST洗涤三次后，5％脱脂乳封闭，37℃1h。PBST洗涤三次，加入小鼠ORF2阳性血清及PCV2阳性血清，37℃作用1h。PBST洗涤三次，加入羊抗小鼠IgG-HRP作用1h，加入OPD显色缓冲液，显色15min，2mol/L硫酸终止反应，测定OD₄₉₀值。最后，运用建立的该方法检测来自山东、湖北、四川等地的猪血清，并将检测结果与IFA检测结果进行比较，结果显示两种方法的符合率可达到97％以上。从而证明，PCV2-ORF2蛋白可用于PCV2临床样品的检测。具体比较结果见表3。

表3PCV2-ORF2蛋白ELISA和IFA检测样品结果比较

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (19)

1.一种猪圆环病毒2型ORF2蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)克隆猪圆环病毒2型ORF2基因，转入酵母表达载体中，获得包含猪圆环病毒2型ORF2基因的酵母表达载体；

2)包含猪圆环病毒2型ORF2基因的酵母表达载体转化入大肠杆菌感受态细胞中，扩增包含猪圆环病毒2型ORF2基因的酵母表达载体；

3)包含猪圆环病毒2型ORF2基因的酵母表达载体酶切线性化，转入酵母中，获得重组酵母；重组酵母发酵培养，表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白；

4)回收并分离纯化猪圆环病毒2型ORF2蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中猪圆环病毒2型ORF2基因序列包含序列表中的SEQID NO1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中酵母表达载体为pPIC9K。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3)所述酵母为GS115。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述重组酵母为GS115/pPIC9K-ORF2。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组酵母GS115/pPIC9K-ORF2是经过G418抗性平板、PCR与Southern-blot鉴定获得的高拷贝的阳性重组酵母。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组酵母为Mut⁺表型的重组酵母。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR鉴定的引物为5’AOX₁和3’AOX₁，其序列为5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’和5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中猪圆环病毒2型ORF2基因序列为人工合成的、经过毕赤酵母密码子偏爱性优化的猪圆环病毒2型ORF2基因，包含序列表中SEQ ID NO3。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组酵母为包含密码子优化的人工合成基因的毕赤酵母GS 115/pPIC9K-optiORF2。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述重组酵母GS115/pPIC9K-optiORF2是经过G418抗性平板、PCR与Southern-blot鉴定获得的高拷贝的阳性重组酵母。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述重组酵母为Mut⁺表型的重组酵母。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述PCR鉴定的引物为5’AOX₁和3’AOX₁，其序列为5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’和5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中所述的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白包含下面任意一种多肽：

i)含有序列表中SEQ ID NO2序列的多肽；

ii)与i)所述多肽至少80％同源的多肽；

iii)含i)和ii)所述多肽的免疫原性部分的多肽。

15.一种由权利要求1～14所述方法制备的猪圆环病毒2型ORF2蛋白。

16.一种由权利要求1～14任意一项所述方法制备的重组酵母，其特征在于，所述重组酵母可表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白。

17.一种猪圆环病毒2型ORF2蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，由权利要求15所述的猪圆环病毒2型ORF2蛋白中，加入佐剂，经过乳化，获得猪圆环病毒2型ORF2蛋白亚单位疫苗。

18.一种根据权利要求15所述的方法制备的猪圆环病毒2型ORF2蛋白亚单位疫苗。

19.一种猪圆环病毒2型相关疾病诊断试剂的制备方法，其特征在于，使用权利要求15所述的猪圆环病毒2型ORF2蛋白为抗原。

Images