CN101101296A - 一种可用于检测猪圆环病毒2型抗体的Cap抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种制备可用于检测猪圆环病毒2型抗体的Cap抗原的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)PCR克隆PCV2 ORF2的编码基因；(2)构建重组表达载体rCap；(3)在改良的LB液体培养基中，依次37℃诱导和低温长时间诱导rCap表达；(4)纯化rCap蛋白；其中所述改良的LB液体培养基包含6-9g/L蛋白胨、6-9g/L氯化钠以及2-4g/L酵母提取物；诱导rCap表达所使用的诱导剂为IPTG，其最终浓度为0.05-0.2mol/L；诱导rCap表达的第一诱导温度为37℃，第二诱导温度为16-20℃；诱导rCap表达的第一诱导时间为3-6小时，第二诱导时间为12-20小时。该方法促进了rCap在大肠杆菌中表达产生可溶性rCap蛋白，减少了包涵体的形成，避免了复杂的变性、复性过程，同时分离纯化所得可溶性rCap蛋白的生物学活性接近于PCV2病毒天然蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及Cap抗原的制备方法，更具体地，涉及可用于检测猪圆环病毒2型抗体的可溶性Cap抗原的制备方法。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属圆环病毒科(circoviridae)圆环病毒属，是无囊膜的单股环状负链DNA病毒，是迄今已知的最小的动物病毒之一。Tischer(1974)等首先在猪肾细胞系PK-15中发现了PCV。根据PCV的抗原性及基因组成不同，将其分为两种基因型(或称血清型)，即PCV1和PCV2。PCV1无致病性，广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系；PCV2具有致病性，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(Post-weaningmultisystemic wasting syndrome，PWMS)的主要病原之一。
PCV2是近年来新发现的猪的传染病之一，患病仔猪出现腹泻、发烧、躯体震颤、渐行性消瘦，最后死亡。康复猪常变成僵猪，失去饲养价值。繁殖母猪感染则出现繁殖障碍，产仔出现死胎，严重的失去繁殖能力。该病主要导致猪体的免疫抑制，从而继发或并发其它疾病，如猪繁殖与呼吸道障碍综合征(PRRS)和细小病毒(PPV)病，给养猪业造成巨大的经济损失。
在我国，郎洪武等(2000)采集了来自北京、河北、上海、天津、江西、吉林和河南等7个省(直辖市)22个猪群的559份血清，结果显示PCV2抗体总阳性率为42.9％，并随猪龄的增长而升高，表明我国猪群中存在PCV2感染。曹胜波等(2001)通过对PCV2 DNA序列分析证实，中国的分离株与国外分离株的同源性并不高，由此推断PCV2在我国已经流行多年，且病毒发生了变异。
目前还没有用来预防该病的疫苗，也缺乏有效的治疗药物，给该病的防控造成了很大的困难，因此PCV2的早期诊断就显得尤为重要。PCV2诊断主要采取的方法有病原学方法和血清学方法。其中病原学诊断方面以PCR法为最为常见。PCR法要求苛刻的试验条件，加之费用昂贵，限制了其大规模推广。
鉴于PCV2病毒对养猪业健康发展的巨大危害，开发操作简单、结果可靠、敏感性高、特异性好、方便基层应用的可以产业化生产的血清抗体检测方法是预防PCV2传播的可靠途径之一。
PCV2基因组含有11个阅读框，其中两个较大的阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒复制的相关蛋白(Rep，位于正链)和结构蛋白(Cap，位于负链)。Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳。血清学试验显示，PCV1和PCV2的Cap蛋白没有抗原交叉性，PCV2的Cap蛋白可有效区分PCV1和PCV2感染的血清抗体。
酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)适用于PCV2感染的大规模血清学调查及流行病学调查，为PCV2相关的疾病诊断奠定了基础。Nawagitgul(2002)等报道了两种间接ELISA方法。一种以细胞培养的PCV2全病毒作为抗原(PCV2 ELISA)，另一种以重组杆状病毒表达PCV2 Cap(衣壳蛋白，由病毒基因组中ORF2编码)蛋白作为抗原(Cap ELISA)，分别用于检测PCV2感染后的血清抗体。以PCV2全病毒作为抗原建立的ELISA不能有效区分PCV1与PCV2抗体，并且PCV2病毒培养物滴度低，纯化困难，因此该方法的应用受到了很大限制。
以PCV2 Cap蛋白作为抗原建立的ELISA可将血清中PCV1与PCV2抗体很好地区分开来。大肠杆菌是目前应用最广泛，技术操作最成熟的表达系统，但是外源性蛋白在其中主要以无生物学活性的包涵体形式存在，需要复杂的变性、复性过程以恢复蛋白活性，同时复性率往往低于30％，严重影响了目标蛋白的研究和应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是在大肠杆菌中表达产生生物学活性良好的可溶性rCap蛋白，通过改变常规的诱导表达条件和培养基成分，从而达到减少包涵体的形成的目的，避免复杂的变性、复性过程，进而开发出操作简单、结果可靠、敏感性高、特异性好的血清抗体检测方法及装置。
为解决上述问题，本发明一方面提供了一种制备可用于检测猪圆环病毒2型抗体的Cap抗原的方法，所述方法包括以下步骤：(1).PCR克隆PCV2 ORF2的编码基因；(2).构建重组表达载体rCap；(3).在改良的LB液体培养基中诱导rCap表达；(4).纯化rCap蛋白；其中所述改良的LB液体培养基包含6-9g/L蛋白胨、6-9g/L氯化钠以及2-4g/L酵母提取物。优选改良的LB液体培养基包含8g/L蛋白胨、8g/L氯化钠以及4g/L酵母提取物。
其中步骤(3)诱导rCap表达所使用的诱导剂为IPTG，其最终浓度为0.05-0.2mol/L。优选IPTG的最终浓度为0.1mol/L。
其中步骤(3)诱导rCap表达的第一诱导温度为37℃，第二诱导温度为16-20℃。优选第二诱导温度为16℃。
其中步骤(3)诱导rCap表达的第一诱导时间为3-6小时，第二诱导时间为12-20小时。优选第一诱导时间为4小时，第二诱导时间为18小时。
本发明另一方面提供了一种制备可用于检测猪圆环病毒2型抗体的Cap抗原的方法，所述方法包括以下步骤：(1).PCR克隆PCV2 ORF2的编码基因；(2).构建重组表达载体rCap；(3).在改良的LB液体培养基中，依次37℃诱导和低温长时间诱导rCap表达；(4).纯化rCap蛋白；其中所述改良的LB液体培养基包含6-9g/L蛋白胨、6-9g/L氯化钠以及2-4g/L酵母提取物；诱导rCap表达所使用的诱导剂为IPTG，其最终浓度为0.05-0.2mol/L；诱导rCap表达的第一诱导温度为37℃，第二诱导温度为16-20℃；诱导rCap表达的第一诱导时间为3-6小时，第二诱导时间为12-20小时。优选改良的LB液体培养基包含8g/L蛋白胨、8g/L氯化钠以及4g/L酵母提取物；优选IPTG的最终浓度为0.1mol/L；优选诱导rCap表达的第一诱导温度为37℃，第二诱导温度为16℃；优选诱导rCap表达的第一诱导时间为4小时，第二诱导时间为18小时。
本发明的有益效果在于在大肠杆菌中表达了可溶性rCap蛋白，利用亲和层析纯化的rCap蛋白纯度高，生物学活性接近于PCV2病毒天然蛋白，可替代PCV2全病毒直接作为检测用抗原而建立快速、敏感的间接ELISA血清抗体检测方法，从而为大规模的PCV2流行病学调查提供可靠的技术支持。
具体实施方式
试剂和材料
引物由Takara公司合成并测序；组织总DNA提取试剂盒、扩增用单核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、高保真Taq酶、限制性核酸内切酶(BamHI、XholI)和T4 DNA连接酶购自Takara公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗IgG、TMB、IPTG、核酸电泳和蛋白电泳所用试剂购自Sigma公司；Ni-NTAHis·Bind Resin填料、超滤浓缩管和咪唑购自安玛西亚。
制备方法
1.PCR克隆PCV2 ORF2的编码基因
按照扩增PCV2 ORF2基因的方法，设计一对含有限制性酶切位点的特异性引物PCVf和PCVr(PCVf带有BamHI；PCVr带有XholI)，序列如下：
PCVf 5`-GCGGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGTT-3`BamHI
PCVr 5`-GCGCTCGAGTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTT-3`XholI
用组织DNA提取试剂盒提取疑似PCV2感染的病理样品中的组织总DNA作为模板，以PCVf和PCVr作为引物，利用高保真Taq酶进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增ORF2基因。
2.构建重组表达载体rCap
纯化回收ORF2基因，用限制性内切酶分别消化ORF2基因和表达载体pET28a(6×His筛选标记)，分别纯化回收，T4 DNA连接酶连接。用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，在卡那霉素抗性的(80μg/ml)LB平板上筛选阳性重组克隆，酶切，将测序验证的重组质粒命名为rCap。
3.在改良的LB液体培养基中诱导rCap表达
将重组菌接种到cLB(changed LB，卡那霉素抗性的(80μg/ml))液体培养基中，37℃增菌，然后分别在37℃和16-20℃诱导；离心，用缓冲液1×PBS收集菌体，振荡混匀；超声破菌；离心。SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳表明目标蛋白存在于裂解液的上清中，大小约为32 KDa。
4.亲和层析纯化融合蛋白
将离心后的上清液转移到预装有Ni-NTA His·Bind Resin的层析柱中，室温作用15min，然后用25mmol/L的咪唑缓冲液(pH 8.5)洗去未结合的蛋白，用150mmol/L的咪唑缓冲液(pH 8.5)洗脱已结合在层析柱上的rCap蛋白，将收集的洗脱液用超滤浓缩管浓缩。
重组蛋白的鉴定
取1mL重组菌到Ep管中，10000r/min离心1min，弃掉上清，加入100μL Tris.Cl(pH 6.8)，100℃煮5min，10000r/min离心15min。
配制15％的SDS-PAGE蛋白质电泳凝胶，每一个样品加10μL的上清，同时加入标准蛋白Marker 5μL，80v浓缩胶，120v分离胶，电泳完后的胶块用考马斯亮蓝染色，脱色后观察到大小约为32KDa的特异性条带。
生物学活性检验
1.Western blotting
根据汪家政等的方法用Western blotting分析表达的rCap蛋白。用猪抗PCV2高免血清对表达的rCap蛋白进行检测。结果显示，在硝酸纤维膜上仅观察到一条分子量大小与rCap预测大小一致的特异性条带，说明表达的rCap蛋白能够同PCV2抗体特异性结合。
2.间接ELISA
将浓度为0.85μg/mL的rCap蛋白每孔50μL包被ELISA板，分别加入PCV2抗体标准阴阳性血清，应用间接ELISA方法检测。TMB显色后测定吸光度值OD 450，结果表明利用大肠杆菌表达的可溶性rCap蛋白与PCV2阳性血清结合很好，进而说明其具有良好的生物学活性。而复性后的rCap蛋白吸光度值OD 450很低，说明其无法达到作为检测用抗原的要求。
实施例
以下实施例是对本发明的进一步描述，其不对本发明范围构成任何限定。
实施例1
如上所述PCR克隆PCV2 ORF2的编码基因和构建重组表达载体rCap。
将重组菌以1％接种量接种到1L cLB(Kan+80mg/L，2 L三角瓶)液体培养基中，其中cLB液体培养基的组成和配制方法如下：蛋白胨8g；氯化钠8g；酵母提取物4g，加去离子水至1L，用NaOH调pH＝7.0，37℃增菌3h，测得OD600＝0.5～0.6，加入一定量IPTG使其最终浓度为0.1mol/L，在37℃和180r/min转速诱导(第一诱导)4h，然后在16℃继续诱导(第二诱导)18h；5000r/min离心10min，用缓冲液1×PBS收集菌体，振荡混匀；超声破菌(工作4s，间歇6s，50cycles，超声三次，温度控制在4℃)；4℃、15000r/min离心30min。15％的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳表明目标蛋白以可溶物的形式存在于上清中，大小约为32 KDa。
如上所述亲和层析纯化融合蛋白，紫外分光光度计测得浓缩后的蛋白浓度为45.23mg/ml。
利用如上所述的Western blotting和间接ELISA对可溶性rCap蛋白进行表征，所得结果见表1。
实施例2
重复实施例1的方法，只是cLB液体培养基的组成和配制有所差别，具体如下：蛋白胨6g；氯化钠9g；酵母提取物3g，加去离子水至1L，用NaOH调pH＝7.0。
15％的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳表明目标蛋白以可溶物的形式存在于上清中，大小约为32 KDa。
利用如上所述的Westem blotting和间接ELISA对可溶性rCap蛋白进行表征，所得结果见表1。
实施例3
重复实施例1的方法，只是cLB液体培养基的组成和配制有所差别，具体如下：蛋白胨9g；氯化钠6g；酵母提取物2g，加去离子水至1L，用NaOH调pH＝7.0。
15％的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳表明目标蛋白以可溶物的形式存在于上清中，大小约为32 KDa。
利用如上所述的Westem b1otting和间接ELISA对可溶性rCap蛋白进行表征，所得结果见表1。
表1
| 实施例 | 蛋白胨 | 氯化钠 | 酵母提取物 | 蛋白浓度 | Westernblotting* | OD 450 |
| 1 | 8g | 8g | 4g | 45.23mg/ml | 有 | 有 |
| 2 | 6g | 9g | 3g | 无 | 有 | 有 |
| 3 | 9g | 6g | 2g | 无 | 有 | 有 |
*：以是否存在分子量大小与rCap预测大小一致的特异性条带为标准
表1表明在同样的诱导条件下，即IPTG最终浓度、诱导转速、第一诱导时间以及第二诱导温度和第二诱导时间均相同，实施例1的蛋白浓度最大，同时OD 450较大，表明该可溶性rCap蛋白与PCV2阳性血清结合很好。因此，下文利用实施例1的cLB，即包含8g/L蛋白胨、8g/L氯化钠以及4g/L酵母提取物，pH为7.0的改良LB液体培养基，对诱导条件作进一步研究。
实施例4
重复实施例1的方法，只是IPTG最终浓度、诱导转速、第一诱导时间以及第二诱导温度和第二诱导时间有所差别，具体如下：加入一定量IPTG使其最终浓度为0.05mol/L，在37℃和100r/min转速诱导6h，然后在20℃继续诱导12h。
15％的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳表明目标蛋白以可溶物的形式存在于上清中，大小约为32 KDa。
利用如上所述的Western blotting和间接ELISA对可溶性rCap蛋白进行表征，所得结果见表2。
实施例5
重复实施例1的方法，只是IPTG最终浓度、诱导转速、第一诱导时间以及第二诱导温度和第二诱导时间有所差别，具体如下：加入一定量IPTG使其最终浓度为0.2mol/L，在37℃和150r/min转速诱导3h，然后在18℃继续诱导16h。
15％的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳表明目标蛋白以可溶物的形式存在于上清中，大小约为32KDa。
利用如上所述的Western blotting和间接ELISA对可溶性rCap蛋白进行表征，所得结果见表2。
实施例6
重复实施例1的方法，只是IPTG最终浓度、诱导转速、第一诱导时间以及第二诱导温度和第二诱导时间有所差别，具体如下：加入一定量IPTG使其最终浓度为0.1mol/L，在37℃和180r/min转速诱导4h，然后在16℃继续诱导20h。
15％的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳表明目标蛋白以可溶物的形式存在于上清中，大小约为32 KDa。
利用如上所述的Western blotting和间接ELISA对可溶性rCap蛋白进行表征，所得结果见表2。
实施例7
重复实施例1的方法，只是IPTG最终浓度、诱导转速、第一诱导时间以及第二诱导温度和第二诱导时间有所差别，具体如下：加入一定量IPTG使其最终浓度为0.1mol/L，在37℃和100r/min转速诱导6h，然后在20℃继续诱导12h。
15％的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳表明目标蛋白以可溶物的形式存在于上清中，大小约为32 KDa。
利用如上所述的Western blotting和间接ELISA对可溶性rCap蛋白进行表征，所得结果见表2。
表2
| 实施例 | 诱导转速 | IPTG浓度 | 第一诱导时间 | 第二诱导温度 | 第二诱导时间 | 上清液可溶性蛋白浓度 | Westem blotting* | OD 450# |
| 1 | 180r/min | 0.1mol/L | 4h | 16℃ | 18h | 45.23mg/ml | 有，明显 | ＞1.5 |
| 4 | 100r/min | 0.05mol/L | 6h | 20℃ | 12h | 3.18mg/ml | 有，弱 | ＜1.5 |
| 5 | 150r/min | 0.2mol/L | 3h | 18℃ | 16h | 6.45mg/ml | 有，弱 | ＜0.5 |
| 6 | 180r/min | 0.1mol/L | 4h | 16℃ | 20h | 10.76mg/ml | 有，弱 | ＜1.0 |
| 7 | 100r/min | 0.1mol/L | 6h | 20℃ | 12h | 1.07mg/ml | 有，弱 | ＜0.5 |
*：以是否存在分子量大小与rCap预测大小一致的特异性条带为标准
#：圆环病毒2型标准阳性血清与纯化的rCap在ELISA反应中，在450nm波长条件下吸光度的大小(OD)。
表2表明实施例4-7的可溶性目标蛋白在ELISA实验中都有吸光度值，但作为诊断用抗原，蛋白活性相对较低，即与实施例1比较，在相同抗原包被浓度条件下，OD值相对较低。
Claims (10)
1.一种制备可用于检测猪圆环病毒2型抗体的Cap抗原的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1).PCR克隆PCV2 ORF2的编码基因；
(2).构建重组表达载体rCap；
(3).在改良的LB液体培养基中诱导rCap表达；
(4).纯化rCap蛋白；
其中所述改良的LB液体培养基包含6-9g/L蛋白胨、6-9g/L氯化钠以及2-4g/L酵母提取物。
2.权利要求1的方法，其特征在于，其中所述改良的LB液体培养基包含8g/L蛋白胨、8g/L氯化钠以及4g/L酵母提取物。
3.权利要求1的制备方法，其特征在于，其中所述步骤(3)诱导rCap表达所使用的诱导剂为IPTG，其最终浓度为0.05-0.2mol/L。
4.权利要求3的方法，其特征在于，其中所述IPTG的最终浓度为0.1mol/L。
5.权利要求1的方法，其特征在于，其中所述步骤(3)诱导rCap表达的第一诱导温度为37℃，第二诱导温度为16-20℃。
6.权利要求5的方法，其特征在于，其中所述第二诱导温度为16℃。
7.权利要求1的方法，其特征在于，其中所述步骤(3)诱导rCap表达的第一诱导时间为3-6小时，第二诱导时间为12-20小时。
8.权利要求7的方法，其特征在于，其中所述第一诱导时间为4小时，第二诱导时间为18小时。
9.一种制备可用于检测猪圆环病毒2型抗体的Cap抗原的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1).PCR克隆PCV2 ORF2的编码基因；
(2).构建重组表达载体rCap；
(3).在改良的LB液体培养基中，依次37℃诱导和低温长时间诱导rCap表达；
(4).纯化rCap蛋白；
其中所述改良的LB液体培养基包含6-9g/L蛋白胨、6-9g/L氯化钠以及2-4g/L酵母提取物；诱导rCap表达所使用的诱导剂为IPTG，其最终浓度为0.05-0.2mol/L；诱导rCap表达的第一诱导温度为37℃，第二诱导温度为16-20℃；诱导rCap表达的第一诱导时间为3-6小时，第二诱导时间为12-20小时。
10.权利要求9的方法，其特征在于，其中所述改良的LB液体培养基包含8g/L蛋白胨、8g/L氯化钠以及4g/L酵母提取物；IPTG的最终浓度为0.1mol/L；诱导rCap表达的第一诱导温度为37℃，第二诱导温度为为16℃；诱导rCap表达的第一诱导时间为4小时，第二诱导时间为18小时。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080109 |